Синтез, структура и свойства лизинсодержащих полимерных гидрогелей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

г;? с .5. зд

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 541.64:678.7-13

ГАВРИЛЮК Светлана Васильевна

СИНТЕЗ, СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ЛИЗИНСОДЕРЖАЩИХ ПОЛИМЕРНЫХ ГИДРОГЕЛЕЙ

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1992 г.

Работа выполнена в лаборатории химических превращений полимеров кафедры высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Научные руководители: академик Н.А.Платэ,

к.х.н. В.В.Чупов

Официальные оппоненты: д.х.н. проф. И.М.Паписов,

д.б.н. проф. М.А.Розенфельд

Ведущая организация: Научно-производственное объединение

"Биотехнология"

Защита диссертации состоится " JC " ta&Md. 1992 г. в 15 часов на заседании специализировнного Совета Д.053.05.43 при МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу:

II9899 ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус А, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " ■/Г " ¿Muzd. 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат химических наук

Т.К.Бронич

; ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

,: ( ••, ?

'Актуальность проблемы.

Полимерные гидрогели находят широкое применение в раз-шчных областях современной биохимии, медико-биологической амии и медицине не только как модификаторы полимеров, но и ;ак самостоятельные материалы, применяемые в офтальмологии [контактные и интраокулярные линзы), хирургии (дренажи, ка-'втары) и других направлениях. Одним из таких важных направ-шний является гемосорбция - процесс селективного удаления [з крови (или ее плазмы) различных токсинов и патогенных веде ств. В последнее время гемосорбцию проводят с помощью гид-югелевых гемосорбентов, содержащих ковалентно включенные ¡ещества (лиганды), способные связывать (и удалять) требуете соединения. Совершенно очевидно, что использование приняла специфической сорбции может оказаться полезным и при :оздании гидрогелевых сорбентов для селективного выделения га крови или плазмы крови различных плазменных белков.

Одним из ключевых плазменных белков, играющих важную юль в процессах гемостаза и гемокоагуляции,. является плаз-шноген (профибринолизин). Выделение этого белка в чистом шде до сих пор осуществляется рутинными биохимическими ме-•одами (криоосаждение, высаливание и пр.), и лишь недавно [ачали разрабатываться подходы, основанные на биоспецифичес-:ой хроматографии, требующей создания высокоспецифичных к шазминогену и эффективных сорбентов, получаемых достаточно [ростами способами.

Создание таких полимерных гидрогелевых специфических сорбентов может быть осуществлено, в частности, тройной со-голимеризацией гидрофильного мономера, сшивающего агента и нецифических мономеров-лигандов, способных к высокоэффектив-юму и обратимому связыванию с плазминогеном. Такими лиган-[ами для -плазминогена могут служить амины или аминокислоты, |бладающие довольно высоким сродством к плазминогену, в :астности, молекулы ъ-лизша или его производных.

В этой связи целью данной работы явилось создание полимерных лизинсодержащих гидрогелей, изучение особенностей их структуры, свойств и сорбционной активности по отношению к плазминогену, а также проверка возможностей их практического применения.

В качестве матрицеоОразущего мономера в работе использован достаточно широко изученный водорастворимый мономер - акрил амид (АА), в качестве сшиващего агента -^и-метиленбисакриламид (БИС), а в качестве специфических лигандов плазминогена использованы низкомолекулярные ненасыщенные производные ь-лизина: г^-метакрилоил-ъ-лизин .(АЛ) и ые-метакрилоил-Ь-лизин (ЭЛ):

*

Н2С - С -СН3 Н2И - сн - соон

I I

С - О ССН2>4

I I

Н - N N - Н

I* I

н - с -соон о - с

I I

(СН254 Н0С _ С - СН

'24- - ^ ч'п 3

т2

(М) (ЭЛ)

Кроме того, в качестве специфического лиганда плазминогена использовали ненасыщенное производное поли-ь-лизина различной молекулярной массы с метакрилоильными группами, локализованными на 6-аминогрушах полипептида.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

I. Синтезировать специфические мономеры-лиганды и оценить их плазминогенсвязыващую активность;

' 2. Разработать условия получения лизинсодержащих гидрогелей с.удовлетворительными сорбционными и прочностными по-

кйьсипаяямн-

3. Изучить физико-химические и структурные характеристики спитых сополимеров и найги корреляцию между структурой лизинсодержащих гидрогелей и их плазминогенсвязывагацей активностью;

4. Определить оптимальные условия проведения сорбцион-но-десорбционного процесса выделения плазминогена и проверить возможность практического применения сорбентов.

Автор защищает:

-метода синтеза АЛ и ЭЛ;

-особенности процесса структурообразования в полиакрил-амидных гидрогелях, формируемых в присутствии ненасыщенных производных ь-лизина;,

-экспериментально обнаруженный факт разделения оптических изомеров лизина ЭЛ-содержащими гидрогелями;

-влияние химического строения лизинсодержащего лиганда на емкость гидрогелей по плазминогену;

-разработанные на основе обнаруженных закономерностей способы выделения плазминогена и фибриногена из плазмы крови.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В работе впервые изучено влияние ионогенных ненасыщенных производных аминокислот на структуру и свойства полиак-риламидных гидрогелей, а также установлено влияние химического строения лизинсодержащего лиганда на сорбционную активность гидрогеля по отношению к плазминогену. Впервые обнаружена способность АЛ-содержащих полиакриламидных гидрогелей к разделению оптических изомеров лизина. Установлено, что в силу структурных особенностей плазминогена максимальной связывающей способностью к нему обладают ненасыщенные производные поли-ь-лизина. На основании полученных результатов предложена и опробована в условиях станции переливания крови БелНШГПК технология получения препаратов плазминогена и вы-сокоочищенного фибриногена.

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены на конференции молодых ученых МГУ (Москва, 1988), на УШ и IX Всесо-

юзных симпозиумах "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Киев, 1979; Звенигород 1991), П Всесоюзной конференции по интерполимерным комплексам (Рига, 1988), 1У конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1991).

Публикации.

По материалам диссертации получено положительное решение по заявке на авторское свидетельство, опубликовано 3 статьи и 4 доклада в виде тезисов.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из 6 частей: введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и 4 приложений. Объем работы составляет 126 страниц машинописного текста с 32 рисунками, 19 таблицами и 115 наименованиями списка литературы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И Ж ОБСУЖДЕНИЕ.

I.Синтез и реакционная способность ненасыщенных производных ь-лизина.

Ненасыщенные производные Ь-лизина, содержащие метакри-лоильные группы на а- или е-аминогруппах (АЛ и ЭЛ) получали либо непосредственным ацилированием ь-лизина избытком мета-крилоилхлорида (АЛ), либо ацилированием медного комплекса ь-лизина с последующим разрушением ацилированного комплекса. Идентификацию продуктов осуществляли с помощью методов ИК-спектроскопии, элементного анализа и потенциометрического титрования. Характеристики синтезированных мономеров- лиган-дов приведены в табл.1.

Таблица I.

Физико-химические характеристики лизинсодержащих мономеров.

Характеристика Значение

для АЛ ДЛЯ УЛ

Элементный анализ Вычислено для Сюн18м2°з % с = 51.72 % Н = 8.54 % N = 11.96 С = 51-97 Н = 8.74 N = 11.90 С = 51 .75 Н = 8.48 N = 11.90

Оптическое вращение, ?п [а]р , град. +16.5 +12.2

Константа диссоциации соон-группы а-ЙН„-группы е-гга^-группы 2.2 10.5 2.2 8.9

Константа комплексообра-зования с плазминогеном, К х Ю3 Моль-1 6,00-0,09 6,97*0,12

Лизинсодержащие мономеры-лиганды должны обладать двумя типами функциональной активности: образовывать устойчивые обратимые комплексные соединения с молекулами плазминогена и вступать в реакции радикальной сополимеризации с гидрофиль-ныими неионогенными сомономерами. Константы комплексообразо-вания АЛ и ЭЛ приведены в табл.1., а константы их сополимеризации с анриламидом (АА) и параметры, характеризующие структуру сополимеров - в табл.2.

Таблица 2.

Константы сополимеризации и значения средних длин блоков ли-гандов для сополимеров АА с АЛ и ЭЛ.

Состав сополимера, мольн.% Г1 г2 _

АА АЛ АА ЭЛ Р

60.57 40.18 18.59 8.98 39.43 59.82 81 .41 91,.02 0.68-0.09 5.23*0.57 1.09 3-24 6.54 17-54

95.42 86.22 45.40 19.6*4 2.18 4.58 13.78 54.60 80.36 97.82 0.23*0.03 2.35*0.43 1 .02 1 .25 1 .93 3.17 45.50

Лизинсодержащие мономеры действительно вступают в реакции радикальной сополимерйзации с АА, причем в соответствии с константами их сополимеризации составы образующихся сополимеров и распределение звеньев блоков лигандов в них различно: при малых концентрациях АЛ или ЭЛ (до 10 мольн.%) звенья ъ распределены единичным образом, при больших - блочным.

2.Структура и физико-химические свойства лизинсодер-жащих гидрогелей.

Инкубирование водных растворов смесей АА и БИС с АЛ или ЭЛ приводит к получению водонерастворимых, но хорошо набухающих сшитых сополимеров, состав которых по данным .гель-золь анализа близок к составу исходных мономерных смесей. Для получения лизинсодержащих гидрогелей использованы две серии мономерных смесей: с невысоким (до 2 мас.%) и высоким (10-60 мае.Ж) содержанием лигапдов. При этом общее количество сомо-номеров в исходной смеси составляло не более 10 мас.%, а количество БИС не. превышало 5 мас.%. Стандартизованные составы исходных мономэрных смесей приведены в табл.3.

Таблица 3.

Исходные составы реакционных смесей для синтеза лизинсодержащих гидрогелей.

АА, АЛ (ЭЛ), БИС, Вода, Общая концен-

мас.% мас.% мас.% мл трация раст-

вора, мас.%

Серия I

93.Ю 1.94 4.9Ь 10.0 10.7

93.58 1.46 4.96 10.0 10.6

94.06 0.98 4.96 10.0 10.7

94.55 0.49 4.96 10.0 10.6

94.95 0.09 4.96 10.0 10.7

95.04 0.00 4.96 10.0 Ю.7

Серия г

38.09 57.14 4.77 • 2.0 10.4

47.62 47.62 4.76 2.0 10.5

66.66 28.57 4.77 2.0 10.4

80.96 14.28 4.76 2.0 10.4

85.72 9.52 4.76 2.0 10.4

95.24 0.00 4.76 2.0 10.4

Из приведенной на рис.1 зависимости равновесной степени набухания лизинсодержавдх гидрогелей при фиксированном рН видно, что величина sp закономерно возрастает с ростом количества введенного мономера-лиганда ионогенной природа. При варьировании рН (рис.2) зависимость величины зглизинсодержа-щих гелей приобретает экстремальный характер: минимум набухаемости приходится на значения рН (равные 5,6 для ЭЛ и 6,0 для АЛ), являющиеся изоэлектрическими точками соответствующих гомополимеров. При этом по абсолютным значениям величина sr для АЛ- содержащих гелей ниже, чем для ЭЛ-содержащих гелей. Такое поведение может быть связано с различным строением ионогенных лигандов, структура цвиттер-ионных групп которых различна:

СН^ CH-j

) d , d ) г I

с=о с=о с=о с=о с=о с=о

ЙН„ HN ЙН0 NH0 HN

^ ,6нч " сн„ ^

Н2? СНГ

12

2V ГЭ ™2

Н„С сн,

Н„С- СН„ ?Н2

СН

^ соо:..Ъгаэ ™

В структуре ЭЛ ионогенныэ группы более удалены от основной цепи сополимера (что и определяет их большую набухаемость) и более чувствительны к локальному изменению рН. Высокие значения набухаемости лизинсодержащих. гидрогелей определяют их высокую проницаемость по веществам различной молекулярной массы: АЛ и ЭЛ-содержащие гели оказываются диффузионно прозрачными для водорастворимых макромолекул с ММ до Ю6 (голубой декстран).

Помимо высокой набухаемости, определяюцей проницаемость гидрогелей, важным параметром потенциальных адсорбентов является их механическая прочность. Из приведенных в табл.3 деформационно-прочностных характеристик свойств гидрогелей видно, что для гелей серии I модули упругости практически постоянны, тогда как для гелей серии 2 они уменьшаются с

о у

ростом количества лигавда в геле. Расчитанные из модулей упругости параметры II свидетельствуют оО уменьшении частоты сетки геля с ростом количества лиганда и об увеличении гетерогенности гелей. Тем не менее, по комплексу макросвойств лизинсодержащие гидрогели как серии I, так и серии 2, соответствуют типичным гидрогелевым системам, которые могут быть использованы как для статической, так и для динамической сорбции.

30

15 -

Б ГН-О/Г сухого сополимер.

о йГ

—гШ, 60 МАС.%

20

15

10

Рис.1.

Зависимость равновесной степени набухания АЛ (I) и ЭЛ (2) содержащих гелей от количества лиганда при 20 С и рН=7,4. Состав гелей: [АА+Ь]= 95,04 мас.Ж, [БИС1= 4,96 мас.%.

Рис.2.

Зависимость равновесной степени набухания АЛ (I) и ЭЛ (2) содержащих гелей серий I (а) и 2 (0) от рН. Содержание АЛ и ЭЛ в гелях составляет 1,94 мас.% (а) и 28,57 мас.% (б).

Таблица 3.

Деформационно-прочностные свойства и параметры сеток лизин-содержащих гидогелей.

Состав геля мас.% Объемная доля полимера,^ модуль упругое- , ТИ.О-ЛО 4 Н/м ± 5% МС

АА ЭЛ БИС

95-0 0.0 5.0 0.070 2.10 11250±5бО

85-8 9.5 4.7 0.070 2.02 4840^240

76.2 19.1 4.7 0.066 1.46 7950^390

66.7 28.6 4.7 0.065 1.42 9200^460

56.7 за. 6 4.7 0.060 1.05 11380^670

47.6 47.7 4.7 0.054 0.80 18220?910

38.2 57.1 4.7 0.049 0.70 22190-1100

3. Сорбционные свойства лизинсодержащих гидрогелей.

Хорошие механические и водопоглотительные свойства в совокупности с высокой проницаемостью позволили изучить сорбционные свойства лизинсодержащих гидрогелей по отношению к низкомолекулярным аминокислотам (лизину) и к плазминогену (ПГ).

При взаимодействии рацемической смеси Б,ь-лизина с ЭЛ-содержащим гелем было обнаружено, что он способен разделять оптические изомеры (рис.3), тогда как АЛ-гель такой способностью не обладает. То, что Ь-лизин выходит с колонки раньше Б-лизина свидетельствует о более прочном связывании лиганда в геле с оптическим антиподом. Для разделения оптических изомеров, в сорбенты обычно специально вводят заряженные группы, необходимые для осуществления трехточечного взаимодействия. В случае ЭЛ-содержащего геля разделение происходит только на группах лизина, которые оказываются доступными Для осуществления трехточечного взаимодействия вследствие большой гибкости ПАА-цепей в набухшем геле. Этот факт не дает оснований предполагать наличие какого-либо стерео-специфического взаимодействия между ПГ и лизинсодержащими гелями, хотя сам по себе достаточно интересен и может иметь различные последствия.

Сорбцию ПГ лизинсодержащими гелями осуществляли из модельных растворов белка статическим способом в течение времени, необходимого для полного насыщения геля белком (2 часа при 20°С).

Рис.3.

Хроматографическое разделение Б,ъ-лизина на геле, содержащем 10 % ЭЛ. Колонка размерами 10x1,5 см, элюент-0,2 М МаС1, скорость элюции I мл/мин.

Из рис.4 следует, что при малом содержании лиганда в гелях их емкость по ПГ невысока и не зависит от рН. Для гелей серии 2 зависимость емкости от рН носит экстремальный характер, но максимум емкости локализуется не в изоточках АЛ или ЭЛ (равных 5,6 и 6,0), а в более широком интервале рН от 5,6 до 6,6 (изоточка самого ПГ). Это дает основания считать, что связывание ПГ с лизиновыми грушами в гелях носит не только электростатический, но и гидрофобный характер, поскольку в каждой груше лиганда имеется фрагмент -О^-Й^-СН^-С^-. Для гидрофобных взаимодействий лигандов с некоторыми белками характерна экстремальная зависимость емкости сорбента от ко-личеста лиганда в геле, причем максимум связывания приходится на сорбенты с единичным распределением лиганда. Из приведенных на рис.5 кривых следует, что такой характер зависимости имеет место и для лизинсодержащих гелей, однако максимум емкости приходится на те составы сорбента, при которых лиганд распределен не единичным, а блочным образом.

Е,мкг/мл

2 6 10

•Рис.4.

рН-зависимость емкости гелей серий I (а) и 2 (0) при 2СГС Содержание лигандов в гелях составляет 0,49 ыас.% АЛ (I) или ЭЛ (2) и 47,62 мас.% АЛ (3) или ЭЛ (4).

Е-мкг/мл

120-

0 —т-т^—т- [ и ,

10 30 50 МАС-*' Рис.5.

Зависимость емкости гелей при рН=6,0 от количества АЛ (I) или ЭЛ(2) в сополимерах. Состав сополимеров: [АА+Ь] = 95,24 мае.Ж, [БИС]=4,76 мас.%

При повышении температуры от 15 до 40 °С емкость лизин-содержащих гидрогелей несколько уменьшается несмотря на то, что значения Sr в этом ийтервале температур постоянны. Не изменяется также и конформационное состояние ПГ: спектры КД растворов бежа при 15 и 40°С практически идентичны. Все это позволяет предположить, что связывание ПГ с лизинсодержащими гелями происходит не только за счет электростатического и гидрофобного взаимодействий, но имеет более сложную природу. С учетом специфики строения макромолекул ПГ, включающих пять циклических фрагментов с повторяющейся последовательностью аминокислот, четыре из которых способны образовывать комплексы с L-лизином, и данных по константам связывания ПГ с остатками лизина в АЛ и ЭЛ-содержащих гелях (табл.4), можно предложить следующий механизм биоспецифического взаимодействия. Две аминокислоты циклического фрагмента ПГ (Asp-56 и Arg-70), находящиеся на противоположных сторонах цикла и образующие электростатическую "вилку", взаимодействуют с заряженными группами молекулы лизина, а гидрофобное взаимодействие полярных участков молекулы лизина с циклом осуществляется за счет остатка Leu-45, также включенного в этот цикл. Из этой модели становится понятным, почему гели с АЛ имеют более высокую емкость по белку (большая удаленность заряженных сосГ и КНд групп друг от друга по сравнению с ЭЛ), и почему при малых величинах констант связывания (порядка Ю3 М-1 в статическом режиме сорбции и IQ4 М-1 при динамической сорбции) емкость по ПГ оказывается высокой для сорбентов с блочным распределением лиганда: образование комплексов белок -сорбент осуществляется за счет связывания ансамбля звеньев лиганда с четырьмя связываюцими центрами белка. При этом даже не в оптимуме рН, а в области значений 6,5-7,5 емкость сорбентов по ПГ достаточно высока, а смываемый с сорбентов 0,1 М раствором s-аминокапроновой кислоты белок не изменяет своей конформации. Все эти данные дают основания считать, что лизинсодержащие гели действительно являются высокоспецифическими сорбентами к ПГ, а их механические, водопоглоти-тельные и емкостные свойства позволяют использовать их при физиологических значениях рН.

Таблица 4.

Константы комплексообразования ПГ с лизинсодержащими гелями.

Сорбент К стат, 1/Ш. к динам,1/м

АА-АЛ-БИС (I) АА-ЭЛ-БИС (I) АА-АЛ-БИС (2) АА-ЭЛ-БИС (2) (6.22^0.03 (4-74x0.06)^10^ (8.24x0.07)х1СК (6,50-0.06)х10 (1.12±0.09)х10^ (8.70|0.09)Х10Т (2.1 4x0-17 )х1 (1 .Зб^0.09)х10

4.Поли-ь-лизинсодержащие гели и их сорбционные свойства.

Поли-ь-лизин (ПЛ) в растворах сам по себе образует интерполимерные комплексы с ПГ с константой связывания (7,320,12) х Ю4 М-1. Для перевода его в нерастворимое состояние мы использовали реакцию ацилирования ПЛ по свободным ын2-группам хлорангидридом метакриловой кислоты, .применяя такие мольные соотношения полимер : модификатор, при которых число введенных С=С-групп составляет в среднем 1-2 на макромолекулу. В этих условиях макромолекулы АЛЛ сохраняют ту же конформацшо, что и неацилированный ПЛ. Сополимеризацшо ацилированного ПЛ (АЛЛ) с АА и БИС осуществляли в условиях, аналогичных соголимеризации в системах АА-АЛ (ЭЛ)-ЕИС.

АЛЛ образует при сополимеризации-механически прочные и высоконабухащие гидрогели, проницаемые для голубого декст-рана. Набухаемость ПЛ-содержащих гелей линейно зависит от количества введенного ПЛ (рис.6) и также оказывается чувствительной к рН (рис.7), однако в отличие от полиамфолитных сополимеров, сшитые сополимеры Ш1-АА показывают постепенное возрастание параметра зр с ростом рН, что может быть связано со спирализацией макромолекул ПЛ в области рН = 9-10, а также с деструкцией в сильно щелочных средах матрицы сшитого ПАА. Одновременно с этим наблюдается резкое снижение - прочности гидрогелей (особенно при очень высоких степениях набухания), что не позволяет использовать их в указанном рН-ин-тервале для колоночной хроматографии.

Сорбционные характеристики ПЛ-гелей изучены в области рН 4-8. Сорбцию ПГ проводили в течение 2 часов до установления равновесных значений емкости в статическом режиме.

БОН

40

20

в^п^/г

СУХОГО СОПОЛИМЕРЛ

100755025-

1ПЛ1,

МАС.%

-1-1-Г*

О 0-6 1-2 1-8 2/4-Рис.6.

Зависимость равновесной степени набухания ПЛ-гелей от количества лиганда в них при рН=7,4. Состав гелей: [АШШ=95,24 мае.Ж, [БИС]= 4,76 мае.Ж, молекулярная масса ПЛ = 9000.

Б^-г^О/г

СУХОГО СОПОЛИМЕР/

рН

2

—т~ 10

Рис.7.

6

г

и

Зависимость равновесной

степени набухания ПЛ-ге-лей, содержащих О (I),

0,1 (2), 6,5 (3) и 1,0

(4) мае.Ж ПЛ.с ММ=9000 от рН при 20 С.Составы гелей: [М+ШП=95,24 мае.8 [БИС]=4,76 мае.Ж.

Количество сорбированного ПГ также линейно зависит от количества ПЛ в гелях (рис.8), однако не зависит от ММ используемого ПЛ и составляет величину порядка 180-185 мкг ПГ на I мл равновесно набухего геля, содержащего I мас.Ж'ПЛ, для образцов. ПЛ с ММ = 6000, 9000 и 24000. Определенная из сорбционных данных константа связывания ГЕГ-иммобилизованный ПЛ, равная (4,37±0,09)хЮ4 м-1, свидетельствует о том, что происходит более прочное связывание ПГ макромолекулами ПЛ, чем с низкомолекулярными лигандами (при одинаковых мольных количествах лигандов в гелях), и что оно происходит по слабым местам связывания. Емкость ШГ-гелей по ПГ оказывается в несколько раз вше емкости АЛ-гелей, имеющих оптимальное расположение блоков остатков лизина в связывающих центрах. Звено макролиганда содержит 40-70 остатков лизина (связанных полипептидной цепью в одно целое), взаимодействующих с 4 циклическими фрагментами молекулы ПГ. Таким образом, ПЛ-гели оказываются оптимальными сорбентами ПГ.

4.Практическое применение лизинсодержащих гидрогелей.

Оценка возможностей практического использования лизинсодержащих гидрогелей проведена в Белорусском НИИ гематологии и переливания крови

200

Е,мкг/мл ГЕЛЯ

МЗ Республики Беларусь. 100

Полученная в промышленных условиях (НПО "Белмедпре-параты) партия АЛ-содер-жащего геля (сорбент

О 0,5 1,0 1.5 2.0

Рис.8.

"Элесорб") была использована для выделения плаз-

ПЛЬ95,24 мае Л, СБИСЗ=4.76 мас.%.

методом колоночной хроматографии -

Как видно из приведенной на рис.9 хроматографической кривой, при элнировании плазмы физиологическим раствором с колонки выходит фракция с пиком (I ), содержащая большое количество балластного белка, не обладающего фибринолитичес-кой активностью после активации стрептокиназой. При смене элюента на 0,1 М' водный раствор s-аминокацроновой кислоты (конкурентный элюенг) или 0,1 M водный раствор l-лизина, выходит небольшая фракция с пиком (2), имеющая высокую (70-80 мкг тирозина/мг белка в минуту) фибринолитическую активность. Злектрофоретический анализ собранной фракции и стандартных препаратов ПГ (рис.10) показывает наличие двух полос, положение которых позволяет идентифицировать полученный белок как ПГ. Анализ концевых аминокислотных остатков показал, что N-концевой аминокислотой белка является Glu, а С-концевой - Asp, что свидетельствует о выделении той формы нативного ПГ, которая после активации стрептокиназой превращается в высокоактивный плазмин. Данные по использованию других лизинсодержащих гидрогелей приведены в табл.5.

0.06

0.03

Кривая элюции плазмы крови на колонке с АЛ-гелем,состава 66,66 мае.% АА 28,57 мае Л АЛ + 4,77 мас.% БИС.

Рис.10. Электрофореграммы образцов плазминогена фирмы "Serva"(I), выделенного осаждением (2) и полученного на сорбенте "Элесорб"(3).

Таблица 5.

Количества и качество препаратов ПГ, выделенного с лизинсодержащих сорбентов.

помощью

Лиганд Количество Емкость Выход Фибринолитиче екая

лиганда в по бежу, по.ПГ, активность после

геле,.мае.% мкг/ мл %±1% активации, мкг

±2% тирозина/мг в мин

ЭЛ 0,49 11.7 32 28,7

ЭЛ 1.94 13.2 55 37.6

ЭЛ 28.57 55.8 80 .56.0

АЛ 0.49 10.5 25 74.6

АЛ 1.94 13.0 43 76.5

АЛ 47-62 76.7 87 86.8

ПЛ 0.50 160.0 86 132.7

ИЛ 1.00 175.0 85 100.7

ПЛ 2.00 180.5 87 167.5

Проверка качества выделенного на лизинсодержащих сорбентах ПГ, проведенная в НИМ глазных болезней им. Гельмголь-ца показала его высокий терапевтический эффект в лечении тромбозов сетчатки глаза кроликов.

Помимо свойства лизинсодержащих гидрогелей специфично и высокоэффективно связывать ПГ из плазмы крови, они оказались пригодными и для очистки препаратов фибриногена (ФБ).

В нативной плазме эти белки присутствуют совместно и образуют достаточно прочные комплексы, в силу чего выделенные из плазмы препараты ФБ всегда содержат примесь ПГ, что приводит к снижению свертывающей активности ФБ и снижению устойчивости сгустков фибрина , получаемого на основе. ФБ.

Применение лизинсодержащих сорбентов на одной из стадий выделения ФБ из плазмы крови позволило получить препараты высокоочиценного и стабильного белка, свойства которого приведены в табл.6.

Таблица 6.

Характеристики фибриногена, очищенного на лизинсодержащем

гидрогеле.

Состав Объемное Выход ФБ Устойчивость

сорбента, соотношение по количест- сгустка фиб-

ывс% плазма: ву свертыва- рина, час

сорбент ющего белка,%

85АА+10ЭЛ+5БИС 12.5:1 97.7 12

85М+1 0ЭЛ+5БИС 10,0:1 98.9 12

85М+10М+5БИС 12.5:1 99.7 12

85АА+1ОАЛ+5БИС 10.0:1 99.8 14

94-АА+1Ш1+5БИС 12.5:1 99.8 14

94АА+1ШГ+5БИС 10.0:1 99.6 14

Силохром-1-лизин 10.0:1 86.7 Ь,5

Фракционирование 65.7 0.5

Таким образом, лизинсодержащие гидрогели являются высокоемкостными сорбентами плазминогена, и позволяют выделять его из плазмы крови за счет Оиоспецифического взаимодействия остатков лизина со связывающими участками белка и могут быть использованы в службе крови.

.Выводы

¡.Синтезированы ненасыщенные производные ъ-лизина, содержащие метакрилоильные группы в а- и £-положениях, обладающие комплексообразующей способностью по отношению к плазми-ногену и активностью в реакциях радикальной сополимеризации с акриламидом.

2. Изучено поведение ненасыщенных производных ь-лизина в реакциях тройной радикальной сополимеризации и показано, что в силу полиамфолитной природы сополимеров, образующиеся гидрогели имеют высокую набухаемость в воде, зависящую от величины рН, высокую проницаемость для макромолекулярных веществ и удовлетворительные прочностные характеристики.

3. Установлено, что несмотря на невысокие значения констант комплексообразования, сорбционная емкость лизинсодер-жащих гидрогелей с большим содержанием лиганда достаточно высока, причем в силу большего стерического соответствия при многоточечном связывании звенья т^-ме такрилоил-ь-лизина обладают более высоким сродством к молекулам плазминогена, чем звенья г^-метакрилоил-ь-лизина.

4. Показано, что повышение емкости сорбентов по плазми-ногену может быть достигнуто использованием макромолекуляр-ного лиганда- поли-ь-лизина, обладающего более высоким сродством к выделяемому белку.

5. Предложен, разработан и опробован в промышленных условиях способ получения лизинсодержащих полимерных гидрогелей и с их помощью проведено выделение двух плазменных препаратов - высокоактивного плазминогена и высокоочищенного фибриногена.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

• I. В.В.Чупов, В.В.Николайчик, Г.Н.Бычко, С.В.Гаврилюк, Я.М.Осповат, Э.М.Тайц, Л.А.Чупова, Н.А.Платэ. Способ получения фибриногена. //Решение о выдаче АС по заявке Л 4848196 от 30.05.90. Разрешена публикация в открытой печати.

2. С.В.Гаврилюк. Синтез и свойства полимерных гидроге-левых адсорбентов для выделения плазминогена. //Конф. молодых ученых хим. ф-та Московского ун-та.- M.- 1987.- С-101— 104.- Деп. в ВИНИТИ 01.03.88, » 7301-В.

3. С.В.Гаврилюк, В.В.Чупов, Н.А.Платэ. О разделении оптических изомеров лизина L-лизинсодержащими полимерными гидрогелями.// Вестник МГУ.- серия 2-химия,- 1991.- Т. 31.-J6 5.- С.521-522.

4. В.В.Чупов, В.В.Николайчик, С.В.Гаврилюк, Г.Н.Бычко, Н.А.Платэ. ъ-лизин- и поли-ь-лизинсодержащие полимерные гидрогелевые сорбенты.// Высокомолек. соед.- 1992.- Т..А-34.-»2. - С.20-27.

5. В.В.Чупов, С.В.Гаврилюк. Комплексообразование в системе поли-1-лизин - плазминоген.// П Всесоюзн.конф."Интерполимерные комплексы": Тез. докл.- Рига.- 1989.- С.289.

6. С.В'.Гаврилюк, В.В.Чупов. Гидрогели с иммобилизованной бинарной системой х-лизин - трипсин, обладающие повышенной гемосовмесимостью. //УШ Всесоюзн. симп. "Синтетические полимеры медицинского назначения":-Тез. докл.- Киев.- 1989.-С.32-34.

7. С.В.Гаврилюк, В.В.Чупов. Сополимеры акриламида, содержащие фрагменты Х-лизша, и их биомедицинские свойства.-//1У Всесоюзн. симп. "Синтетические полимеры медицинского назначения": Тез. докл.- Звенигород.- 1991.- С.154.

8. В.В.Чупов, С.В.Гаврилюк. Синтез, структура и свойства водорастворимых сополимеров акриламида и ненасыщенных производных (поли)-ь-лизина. //1У Всесоюзн. конф. "Водорастворимые полимеры и их применение": Тез.докл.- Иркутск.-1991С.94.

МГП "Эвтектика" Заказ 350, тир. 100 уч.изд.листов 1,0 печат.лисгоа 1,25