Сканирующая ближнепольная и двухфотонная микроскопия нано- и биообъектов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

Астафьев Артём Александрович

Сканирующая ближнепольная и двухфотонная микроскопия нано-

и биообъектов

Специальность 01.04.17 - химическая физика в том числе физика горения и взрыва

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ии3455807

003455807

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте Химической Физики им. Н.С. Семёнова

доктор физико-математических наук, профессор

Саркисов Олег Михайлович

доктор биологических наук, профессор, академик РАН Островский Михаил Аркадьевич

доктор физико-математических наук, профессор А.Н. Тихонов

доктор физико-математических наук, профессор В.А. Радциг

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук

Центр Фотохимии

Защита состоится 29 Ос. (С <£<^¿2008 г. в/^часов на заседании Специализированного совета Д 002.012.02 при Институте Химической Физики им. Н.С. Семёнова по адресу: 117977, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИХФ РАН Автореферат разослан 2/ <=-/?2008 г.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь

Специализированного совета Д 002.012.02 доктор физико-математических наук

С.М. Фролов

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Возможность детектирования и изучения малых объектов чрезвычайно важна для многих научных дисциплин, включая биологические науки и науки о материалах. Для этих целей традиционно использовались различные методы оптической микроскопии. Тем не менее, во многих случаях пространственное разрешение оптических микроскопов оказывается недостаточным для детектирования субмикронных объектов. В последние годы получили интенсивное развитие две новые методики сканирующей оптической микроскопии. Первая методика, которая называется сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля, позволяет получать пространственное разрешение значительно выше дифракционного предела Вторая методика - это сканирующая многофотонная флуоресцентная микроскопия, развитие которой тесно связано с использованием лазерных импульсов фемтосекундной длительности. Благодаря малому времени импульса можно эффективно осуществить многофотонное поглощение при незначительной энергии светового импульса. Это позволяет избавиться от нежелательного фона и увеличить контрастность изображения. Данная работа посвящена разработке и применению этих методик для изучения двух объектов.

Первым из изучаемых объектов были липофусциновые гранулы из ретинального пигментного эпителия (РПЭ) сетчатки глаза человека. Это структуры субмикронного размера, откладывающиеся в клетках РПЭ с возрастом и состоящие из сложной смеси белков, липидов и неорганических веществ. Известно, что липофусциновые гранулы играют большую роль в фотоокислительных процессах в сетчатке глаза, вызывая под действием света разрушение сетчатки, ведущее к ухудшению и даже потере зрения. Считается, что одним из основных источников фототоксических свойств липофусцина является содержащиеся в нём жёлтые флуорофоры, в частности наиболее известный из них - пиридиновый бис-ретиноид, называемый А2Е и его изомер (строение показано на Рис. 1), которые образуют активные формы кислорода при облучении синим светом. Тем не менее, механизм фототоксического действия липофусцина остаётся не до конца понятным.

Вторым изучаемым объектом являлись композиты, состоящие из наночастиц благородных металлов (золота и серебра), нанесённых на мезопористую плёнку ТЮ2, сформированную из наноразмерных кристаллов ТЮ2. Наноструктуры Ti02/Ag и Ti02/Au обладают плазмонным резонансом в видимой области. Усиление электромагнитного поля вблизи металлических наночастиц в металл-полупроводниковых нанокомпозитах может приводить к образованию «горячих точек», которые обладает значительной флуоресценцией. Механизм фотопроцессов в таких наноструктурах не изучен, хотя усиление электромагнитного поля вблизи металлических наночастиц в этих системах может быть использовано для фотокатализа или для детектирования слабых оптических сигналов.

он он

Рис. 1 Структурная формула молекул А2Е (слева) и изо-А2Е

Цели и задачи работы

1. Разработать и реализовать методики ближнепольной и двухфотонной флуоресцентной оптической микроскопии: собрать оптическую схему экспериментальной установки, обеспечить синхронизацию работы сканирующей платформы с системой регистрации оптического сигнала, создать программное обеспечение для управления сканированием и обработки экспериментальных данных.

2. Методами сканирующей оптической ближнепольной и атомно-силовой микроскопии изучить структуру одиночных липофусциновых гранул и распределение в них различных флуорофоров.

3. Методами двухфотонной сканирующей микроскопии исследовать оптические свойства нанокомпозитных Ti02/Ag и TiCVAu систем в зависимости от параметров возбуждающего импульса (поляризации и длины волны) и характеристик образца, чтобы сделать вывод о механизме усиления поля и появления «горячих точек» в таких системах.

4. Обнаружить усиление рамановского рассеяния для молекул, нанесенных на нанокомпозиты металл-ТЮ2 и проследить влияние концентрации высаженного металла на величину рамановского сигнала.

Научная новизна

1. Создана экспериментальная установка для реализации метода двухфотонной флуоресцентной микроскопии. Разработано программное обеспечение в среде LabView, которое позволяет:

• управлять сканированием и синхронизировать регистрацию спектров и кинетик люминесценции с движением сканирующей платформы

• строить по полученному в процессе сканирования набору спектров и кинетик изображение сканируемой области образца и анализировать изменение спектральных и кинетических характеристик излучения в различных точках области образца.

2. Обнаружена неоднородность строения липофусциновых гранул. Измерены спектры флуоресценции двух типов флуорофоров. Определено распределение флуорофоров в единичной грануле с пространственным разрешением ЮОнм.

3. Установлены внутримолекулярные процессы переноса энергии в А2Е и определены характерные времена жизни электронных синглетных состояний S2 и Si. Дана оценка вероятности образования нефлуоресцентного продукта реакции.

4. Обнаружено влияние поляризации и длины волны возбуждающего излучения на локальное усиление поля в «горячих точках» металл-полупроводниковых нанокомпозитов; установлено влияние количества высаженного металла на концентрацию «горячих точек»

5. Экспериментально продемонстрировано усиление рамановского рассеяния для молекул родамина В, адсорбированных на пористой пленке TÍ02 с фотодепонированными наночастицами золота или серебра.

Практическая значимость работы

Полученные результаты по липофусциновым гранулам из ретиналыюго пигментного эпителия (РПЭ) сетчатки глаза человека, вероятно, будут полезны офтальмологам и фармакологам для выработки методов лечения глазных болезней, связанных с фототоксическим действием липофусцина.

Образование «горячих точек» в наноструктурах Ti02/Ag и ТЮг/Аи, может быть использовано для детектирования слабых оптических сигналов, в частности, для детектирования рамановского сигнала единичных молекул.

Апробация работы

Основные результаты, вошедшие в диссертацию, были представлены в докладах на следующих научных конференциях:

1. А.А.Астафьев, А.Н. Петрухин «Исследование ретинальных липофусциновых гранул методами ближнепольной и атомно-силовой микроскопии», XXVII научная конференция Московского физико-технического института, Москва - Долгопрудный, ноябрь 2004

2. А.А.Астафьев, А.Н. Петрухин «Исследование ретинальных липофусциновых гранул методами ближнепольной и атомно-силовой микроскопии», III Всероссийская Школа-Симпозиум «Динамика и структура в химии и биологии», Москва, апрель 2005

3. Astafiev A.A., Petrukhin A.N., Sarkisov O.M., Dontsov A.E., Feldman T.B., Ostrovsky M.A. «The studies of single human retinal lipofuscin granules using atomic-force and near-filed optical scanning microscopy», ICONO 2005 poster session, St. Petersburg, May 11-15 2005

4. A.B. Айбушев, A.A. Астафьев «Двухфотонная люминесценция комплексов наночастиц диоксида титана с наночастицами золота и серебра», VI

Всероссийская Школа-Сипозиум «Динамика и структура в химии и биологии», Москва, апрель 2008

Публикации.

В основе диссертации лежат результаты, опубликованные в 3 статьях и 2 тезисах докладов на научных конференциях.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из трёх глав, введения, заключения и списка цитируемой литературы.

Содержание диссертации.

Во введении приводится обоснование актуальности выбранной темы, перечисляются основные цели и задачи работы, коротко излагается содержание диссертации.

Первая глава является обзором научной литературы по тематике исследования и состоит из трёх частей.

В первой части главы 1 даётся краткий обзор экспериментальных методов, применявшихся в работе - ближнепольной и двухфотонной флуоресцентной сканирующей микроскопии, даются их основные особенности и перечисляются сравнительные достоинства и недостатки.

Во второй части приводятся результаты исследования ретинального липофусцина и липофусциновых гранул по данным научной литературы. Накопление ретинального липофусцина в клетках ретинального эпителия сетчатки глаза человека имеет сильную корреляцию с развитием дегенерации макулы сетчатки - болезни, вызывающей ухудшение или потерю зрения. Одной из причин этой корреляции является фототоксическое действие липофусцина - в литературе было показано, что при облучении белым светом в присутствии кислорода липофусцин способен генерировать активные формы кислорода. Хотя механизм фототоксического действия липофусцина до сих пор полностью не ясен, одним из его источников считаются содержащиеся в нём флуорофоры, в частности бис-ретиноид А2Е и его изомер. В обзоре приведены результаты исследований оптических свойств А2Е и изо-А2Е, особый упор сделан на процессы, происходящие при поглощении света видимой области спектра. Отдельно рассматриваются результаты исследования структуры отдельных липофусциновых гранул с помощью атомно-силового и ближнепольного оптического микроскопа на момент начала данной работы.

Третья часть главы посвящена свойствами нанокомпозитов металл-ТЮг-Вначале рассматриваются общие вопросы, связанные с взаимодействием излучения оптического диапазона с металлическими наночастицами. Падающее на наночасгицы излучение возбуждает поверхностные плазмоны. Для золота и серебра резонансная длина волны, соответствующая максимальной амплитуде плазмонных колебаний, лежит в оптическом диапазоне и зависит от формы, размера и диэлектрического окружения наночастиц. Возбуждение плазмонов приводит к локальному усилению поля, которое проявляется в оптических свойствах объектов,

содержащих наночастицы, в частности ведёт к появлению гигантского рамановского рассеяния. Для металлических нанокластеров, состоящих из десятков и единиц атомов, появляются особенности, связанные с наличием у них дискретных энергетических уровней. В конце третьей части приведён обзор литературы, посвященной системам наночастиц металлов и диоксида титана. Показано, что явление плазмонного резонанса ведёт к усилению оптических свойств данных систем, в частности поглощения и комбинационного рассеяния, при этом резонансная характеристика испытывает неоднородное уширение в силу того, что положение плазмонного резонанса отличается для различных фракций металлических наночастиц.

Во второй главе приводятся результаты исследования липофусциновых гранул. Первая часть второй главы описывает экспериментальную установку, использовавшуюся в работе. Её общая схема приведена на рисунке 2.

блок

Рис. 2 Схема экспериментальной установки для ближнепольного оптического сканирования.

В качестве источника излучения использовался фемтосекундный титан-сапфировый лазер Tsunami (SpectraPhysics) с длиной волны перестраиваемой в диапазоне 690-1060 нм. Лазер работал в непрерывном и импульсном режиме, длительность импульсов в последнем случае до 50 фс с частотой повторения 80 МГц. Излучение лазера заводилось в блок удвоения частоты, откуда вторая гармоника

лазера с длиной волны лежащей в фиолетовом диапазоне и мощностью до 50 мВт подавалась на микроскоп. Помимо титан-сапфирового лазера в качестве источника света мог использоваться поставленный в комплекте с микроскопом лазер — вторая гармоника Nd:YAG с длиной волны 532 нм и мощностью 10 мВт.

Образец устанавливался на платформе оптического флуоресцентного микроскопа Olympus IX 71, сверху над образцом ставилась сканирующая головка -атомно-силовая или ближнепольная, на которой был укреплён зонд. Сканирование производилось либо перемещением зонда пьезотрубкой сканирующей головки либо перемещением образца с помощью сканирующей платформы, на которой был укреплён образец. Управление сканированием осуществлялось через контролер SPM, подключённый к персональному компьютеру с помощью программного обеспечения, предоставленного производителем микроскопа.

Ближнепольный оптический зонд представлял собой оптическое волокно, заострённое травлением и покрытое слоем алюминия, так что на конце у него оставалась свободная от металла апертура диаметром около 100 нм. При сканировании зонд размещался вблизи поверхности образца, расстояние поддерживалось постоянным с помощью системы обратной связи. Микроскоп мог работать либо в режиме освещения, либо в режиме сбора. В первом случае возбуждающее излучение попадало на образец через апертуру зонда, а люминесценция собиралась объективом микроскопа. Во втором - излучения лазера фокусировалось на образце объективом, закреплённым сбоку от сканирующей головки, а люминесцентный сигнал собирался зондом и попадал на систему регистрации через оптическое волокно. Спектр фотолюминесценции регистрировался с помощью CCD-камеры Pi-Max (Roper Scientific) с многоканальным усилителем, закреплённой на выходе спектрометра Acton SP 300i.

Для атомно-силового сканирования использовалась атомно-силовая сканирующая головка Smena (NT-MDT).

Образец представлял собой суспензию липофусциновых гранул, которая разбавлялась водой, наносилась на предметное стекло микроскопа и высушивалась. В зависимости от концентрации липофусцина в суспензии при высушивании получались либо отдельные липофусциновые гранулы и их агрегаты, лежащие на поверхности стекла, либо сплошной слой липофусцина.

Для исследования А2Е методом фемтосекундной абсорбционной спектроскопии использовалась установка, созданная в лаборатории лазерной спектросокопии ИХФ РАН. Фемтосекундные импульсы генерировались титан-сапфировым лазером Tsunami и усиливались регенеративным усилителем Spitfire, имея на выходе из усилителя длину волны 802 нм, длительность 100 фс и энергию около 1200 мкДж. В качестве возбуждающего импульса использовалась вторая гармоника исходного импульса, полученная в параметрическом усилителе NOPA и имеющая длину волны 400 нм и длительность 23 фс. Зондирующий импульс получался при генерации суперконтинуума в диапазоне от 400 до 900 нм в кювете с водой. Задержка по времени зондирующего импульса относительно возбуждающего осуществлялась с

помощью оптической линии задержки, управляемой шаговым двигателем, в диапазоне до 600 пс с минимальным шагом 3,33 фс. Возбуждающий и зондирующий импульс пересекались в кювете с исследуемым веществом, после чего зондирующий импульс направлялся на полихроматор, где его спектр регистрировался CCD-камерой Roper Scientific SPEC-10. Для получения спектров дифференциального поглощения в ходе эксперимента луч накачки при каждом времени задержки перекрывался механическим затвором, и вычислялась разность оптических плотностей исследуемого раствора при открытом и закрытом затворе. Нуль задержки определялся экспериментально как середина нерезонансного электронного отклика от кюветы с ацетонитрилом в момент перекрывания импульсов накачки и зондирования. Исследуемый раствор А2Е в ацетонитриле помещался в кварцевую кювету толщиной 1 мм. Эксперимент проводился при температуре 295±1 К.

Во второй части главы приведены полученные результаты и их обсуждение.

По данным атомно-силовой микроскопии липофусциновые скопления состояли из отдельных субъединиц (гранул) округлой формы размером около 1-3 мкм. У гранул присутствовала внутренняя структура, особенно хорошо различимая на фазово-контрастном изображении, в частности были заметны складки и небольшие субъединицы размером около 100 нм. Можно предположить, что гранулы образовались при слипании более мелких объектов, образованных при переваривании внешних сегментов зрительных рецепторов в лизосомах клеток ретинального пигментного эпителия. Как в данной работе, так и в литературе на атомно-силовых и оптических изображениях наблюдалось наличие у гранул хорошо различимых ядра и оболочки. Как показало последовательное сканирование образца по мере его высыхания, подобная структура обусловлена неполным высыханием образца, причём «оболочка» представляет собой образовавшиеся вокруг гранул микрокапли воды.

На изображении гранулы, полученных ближнепольным оптическим микроскопом в режиме пропускания, сигналы топографии и пропускания, как правило, хорошо соответствовали друг другу (Рис. ЗА и Б). Исключение составила область в центре гранулы, размером около 200 нм, где наблюдался резкий рост пропускания, не связанный с особенностями топографии (Рис.ЗВ). Такой характер сигнала пропускания свидетельствует о неоднородности строения гранулы и наличии у неё малых областей, отличающихся по составу от основной части гранулы.

Для регистрации люминесценции от отдельной гранулы, она предварительно сканировалась ближнепольным микроскопом с целью получения её профиля высоты, затем зонд устанавливался в различные точки гранулы, в которых снимался спектр излучения (рис. 4).

5 ...

Я ^¡¡Ш^

3 - - г^ * -

4'

в

х ^^

о & 280

О

3

Ш 100

4

ф

X

5

оГ £ Ж

<5

С

О а с

1 г з

X, мкм

3' „ >„ ч4

- 0*"Ч) 1

Рис. 3 Изображение отдельной липофусциновой гранулы, полученное ближнепольным микроскопом. А - изображение топографии, Б — пропускание, В - сравнение сечений профиля топографии и пропускания, проведённых через центр гранулы.

1 2 г3-

V :'1

500

550 600 650 700 750 Длина волны, нм

Рис. 4 Сравнение спектров люминесценции, полученных в различных точках гранулы. Точки, в которых замерялись спектры, помечены цифрами 1-6 на левом изображении.

Как показывают результаты измерений, форма и интенсивность спектров люминесценции значительно отличаются от точки к точке. Интенсивность

флуоресценции в точках, находящихся в центре гранулы, оказалась значительно сильнее, чем на периферии. Кроме того, в точке №4 максимум спектра приходится на 680-700 нм, в сравнении с 580 нм для точек 1-3 и 6. Это свидетельствует о том, что гранула содержит несколько флуорофоров, локализованных в разных её областях. При этом спектр флуоресценции основного флуорофора напоминает спектр макрообъёмов липофусцина и А2Е, что говорит о том, что этим флуорофором был А2Е, в то время как спектр фракции с максимумом на 680 нм отличается от них как положением так формой.

Рис. 5 Кинетическая кривая фотоиндуцированного поглощения А2Е на длине волн 525 в интервале времён задержи 0-3 пс (А) и в интервале 0-30 пс и её аппроксимация затухающей экспонентой (Б).

Исследование А2Е методом фемтосекундной абсорбционной спектроскопии дало следующие результаты. При возбуждении на длине волны 400 нм появлялся сигнал поглощения в диапазоне длин волн 525-700 нм, который достигал максимума за время около 0,8 пс (Рис. 5А). Затем происходило падение поглощения, которое хорошо приближалось затухающей экспонентой с временной константой 10 пс (Рис. 5Б). Большой сдвиг между маскимумами спектров поглощения и флуоресценции А2Е указывает на то, что при поглощении происходит переход во второе синглетное возбуждённое состояние S2, а флуоресценция идёт из первого Si. Анализ кинетических кривых позволил приписать наблюдающийся сигнал поглощению из возбуждённого состояния Si. В этом случае наблюдавшийся на ранних временах рост сигнала поглощения соответствует переходу из возбуждённого состояния S2 в Si, а спад - переходу из Si в лежащие ниже состояния. Согласно литературным данным возбуждённые молекулы А2Е в основном релаксируют в основное синглетное состояние, и только небольшая их часть (около 1%) переходит в триплетное состояние, поэтому мы можем считать, что последний переход представляет собой релаксацию из Si в S0. Эти процессы можно записать в следующем виде:

0) So+hu —» S2

1) s2-+s,

2) S, -» S0

где процессы 1) и 2) происходят за времена 0,8 и 10 пс соответственно.

Флуоресценция происходит из состояния Sb при этом малое время жизни этого состояния указывает на то, что релаксация в So происходит в основном безызлучательно. Считая характерное время флуоресценции равным 1 не, получаем для её квантового выхода оценку 10 пс/1нс = 1%, совпадающую с литературными данными. Установленный механизм процессов при фотовозбуждении А2Е и временные константы находятся в хорошем соответствии с уже имеющимися работами по фотофизике А2Е.

Рис. 6 Падение интенсивности спектра флуоресценции липофусцина со временем при облучении светом лазера на длине волны 400 нм (А) и аппроксимация кинетики падения интегральной интенсивности двойной экспонентой (Б)

При многократном облучении одних и тех же гранул в течение длительного времени наблюдалось падение интенсивности его флуоресценции. Уменьшение флуоресценции облучаемых гранул происходило при облучении на длинах волн 400 (вторая гармоника Ti:sapf лазера) и 532 нм (вторая гармоника Nd:YAG) и хорошо описывалось двойной экспонентой (Рис. 6Б). В работе обсуждаются различные возможные причины падения флуоресценции, и высказывается предположение, что наиболее вероятной из них является фотоиндуцированное превращение флуорофоров липофусцина в неизлучающий продукт. При этом постоянство формы спектра флуоресценции при падении интенсивности (Рис. 6А), указывает на то, что основной вклад во флуоресценцию вносит только один флуорофор (А2Е).

Квантовый выход образования неизлучающего продукта из А2Е оценивался по формуле:

(p=k£f/(Ia),

где к - константа падения флуоресценции, 8f- энергия фотона, I -интегральная интенсивность лазерного излучения, о - сечение поглощения. Для характерных величин сечения о ~10"18 см2, ср составлял Ю'б-Ч0~7. Возможным механизмом превращения является переход А2Е из одного из возбуждённых состояний (Si или S2) в триплетное состояние и последующей реакцией с молекулой кислорода с образованием синглетного кислорода. Затем синглетный кислород атакует одну из двойных связей в молекуле А2Е, образуя эпоксиды. В этом случае наличие двух временных констант в кинетике падения флуоресценции объясняется тем, что молекулы А2Е, находящиеся на поверхности гранулы в контакте с воздухом окисляются быстрее, чем молекулы в глубине гранулы.

В третьей главе представлены результаты исследований фотопроцессов в нанокомпозитах из наночастиц благородных металлов, высаженных на мезопористые плёнки ТЮ2.

В первой части третьей главы описываются экспериментальная установка, методика измерения и обработки экспериментальных данных, а также методика приготовления образцов.

Спектрограф

Диафрагма

]Н—

Объеткив-

Осциллограф

Фемтосекундный Лазер

Рис. 7 Схема экспериментальной установки (двухфотонная сканирующая микроскопия).

Экспериментальная установка для двухфотонного оптического сканирования (Рис. 7) была собрана на базе оптического флуоресцентного микроскопа Olympus IX 71. В качестве источника возбуждения использовалась первая гармоника титан-сапфирового лазера Mai-Tai HP, генерировавшего лазерные импульсы

длительностью около 100 фс в спектральном диапазоне от 690 до 1060 нм и мощностью до 3 Вт. Излучение лазера заводилось в объектив микроскопа через систему зеркал и делительное зеркало 70/30 в объектив микроскопа и фокусировалось на образец, лежащий на предметном столике микроскопа. Для того чтобы, избежать термического повреждения образца мощность излучения предварительно ослаблялась до уровня менее 10 мВт. Для контроля поляризации перед заведением в микроскоп устанавливалась система из полуволновой пластинки и поляризатора. Для сканирования с большим пространственным разрешением использовался масляно-иммерсионный объектив Olympus ЮОх UPLSAPO с числовой апертурой 1,4.

Фотолюминесценция образца собиралась тем же объективом и через систему фильтров, отсекающую возбуждающее излучение, направлялась на систему регистрации. Последняя представляла собой спектрограф Acton SP-300i, на выходах из которого находились CCD-камера Newton АМ с электронным усилением сигнала, предназначенная для регистрации спектра фотолюминесценции, и счётнофотонный ФЭУ (Beckel-Hickel), регистрировавший кинетики затухания люминесценции.

Сканирование осуществлялось при помощи сканирующей платформы производства НИИФП, ЗАО NT MDT, Зеленоград, Москва, установленной на оптическом микроскопе, максимальная область сканирования - 100x100 мкм. Определенную проблему представляли собой организация сканирования и синхронизации передвижения сканера с работой системы регистрации. Для её решения нами была создана программа Microscope в программной среде LabView с использованием DLL-библиотек, предоставленных производителем микроскопа. Программа осуществляла сканирование, последовательно подавая напряжение на пъезоприводы сканирующей платформы через контроллер, подключённый к компьютеру. Область сканирования разбивалась на определённое число пикселей, платформа перемещалась шагами так, что лазерный луч последовательно фокусировался на каждом из пикселей. В момент, когда заканчивался очередной шаг, программа посылала синхронизационный сигнал на систему регистрации через коаксиальный кабель, подключённый к компьютеру. По получению сигнала регистрировался спектр (кинетика) излучения в данном пикселе.

Полученный в результате сканирования набор спектров (кинетик) обрабатывался программой MegaSpec, сводившей их в единое изображение и позволявшей анализировать спектр или кинетику затухания излучения в каждой точке изображения.

Сканирование тестовых образцов (полиэтиленовые шарики, окрашенные флуоресцином) показало, что оптическое разрешение установки в горизонтальной плоскости достигает 400 нм, приближаясь к теоретически возможному.

Для регистрации рамановского рассеяния та же установка была модифицирована. Вместо фемотсекундных импульсов в микроскоп заводилось излучение He:Ne лазера (длина волны 632,8 нм, мощность 1,5 мВт), которое фокусировалось на образце объективом Olympus 40х LCAch с числовой апертурой

0,55. Стоксовская часть рамановского спектра регистрировалась CCD-камерой, возбуждающее излучение отсекалось цветным фильтром КС-17. Побочные линии He:Ne лазера подавлялись с помощью дихроического зеркала Newport 10B20UF-25, установленного перед заведением в микроскоп и поляризатора, находящегося перед системой регистрации.

Мезопористые плёнки изготавливались обжигом при температуре 450° С нанесённой на поверхность стекла пасты, приготовленной из нанокристаллического порошка Ti02 (Degussa), средний размер наночастиц ТЮ2 составлял 25 нм. Металлические наночастицы фотокаталитически высаждались на плёнку из растворов AgN03 и АиНСЮ4 для серебряных и золотых наночастиц соответственно, при облучении раствора светом ртутной лампы через фильтр УФС-5. Типичные значения концентрации высажденого металла составляли 10"7 моль/см2 = 108 атомов/мкм2. Для наблюдения рамановского рассеяния на образец наносилось несколько капель раствора красителя Родамин В в воде концентрации около 2 мМ с добавлением NaCl, после чего он высушивался в темноте.

Во второй части третьей главы приводятся результаты изучения «горячих точек» в мезопористых плёнках ТЮ2 с наночастицами золота и серебра.

400 450 500 550 $00 650 700 ,üu Ju" °üu ,vu

Длина волны, нм Длина волны, нм

Рис. 8 Спектры поглощения металлических наночастиц в образцах Аи-ТЮ2 и А£-ТЮ2. Поглощение растёт с увеличением времени, за которое происходило высаждение металла

Для нахождения поглощения металлических наночастиц из спектра поглощения металл-полупроводникового образца вычитался спектр поглощения полупроводниковой плёнки до депонирования металла. На полученном спектре были отчётливо видны плазмонные пики с максимумом на 540 нм для золотых и 430 нм -для серебряных наночастиц (рис. 8). Положение пиков свидетельствовало о том, что наночастицы металла имели форму близкую к округлой и сравнительно слабо контактировали с подложкой ТЮ2. Высота пиков и интегральное поглощение росли с увеличением времени высаждения металла на плёнку при экспозиции под

ультрафиолетовым светом при приготовлении образца, что говорит об увеличении концентрации депонированного металла.

Рис. 9 Электронно-трансмиссионное изображение наночастиц золота (тёмные

области) на поверхности мезопористой плёнки ТЮ2

По данным электронной микроскопии металлические наночастицы, депонированные на плёнку, имели округлую форму и средний диаметр около 10-20 им (Рис. 9), хотя имелись и более мелкие наночастицы с диаметром 5 нм и меньше. Наночастицы были распределены по поверхности плёнки с плотностью, по порядку величины равной 102/мкм2. Средний размер частиц и плотность росли по мере увеличения времени депонирования металла при приготовлении образца. При этом наблюдались отдельные скопления, состоящие из нескольких близкорасположенных частиц. При обучении светом титан-сапфирового лазера на длине волны около 800 нм металл-полупроводниковые образцы давали сильную фотолюминесценцию со спектром, охватывающим практически весь видимый диапазон (400-750 нм). Интенсивность люминесценции была пропорциональна квадрату мощности возбуждающего излучения, что говорило о том, что она возникает при двухфотонном поглощении. В сравнении с металл-полупроводниковыми нанокомпозитами двухфотонная люминесценция чистых плёнок ТЮ2 имела значительно меньшую интенсивность и более затянутую кинетику затухания (рис. 10), кроме того, её спектр имел вид узкого пика с максимумом на 520 нм. Таким образом, сопоставление спектра, кинетики затухания и характерной интенсивности излучения металл-полупроводниковых образцов с аналогичными характеристиками фотолюминесценции чистых плёнок диоксида титана и металлических наночастиц из коллоидного раствора указывает на то, что источником фотолюминесценции являются наночастицы золота и серебра, депонированные на поверхность плёнки.

1 - Коллоид серебра

2 - Образец Ад-ТЮ,

3 - Плёнка ТЮ2

о

1 - Чистый ТГО2

м о,1 ь

о 0,01

X

ф

зА

400 500 600 700 800

Длина волны, нм

-1 о

2 3 4 5 Время, нс

6

7

Рис. 10 Сравнение спектра и нормированной кинетики затухания люминесценции для высушенного коллоида серебряных наночастиц, образца Ag-Tï02 и плёнки чистого ТЮ2. Возбуждение на 825 нм.

Было обнаружено различие в характере фотолюминесценции золотых и серебряных наночастиц. Для образцов Au-Ti02 форма спектра люминесценции была практически одинакова во всех точках образца. Для образцов Ag-Ti02 спектр излучения состоял из набора отдельных пиков и существенно менялся от точки к точки. Кроме того, люминесценция наночастиц золота отличалась большей стабильностью. Указанные особенности объясняются различием в физической природе люминесценции. Для наночастиц золота излучение происходит при рекомбинации электронов проводимости из sp-зоны с дырками, образовавшимися в d-зоне при поглощении света. Для наночастиц серебра в силу большего расстояния между sp- и d-зонами, излучение при межзонных переходах происходит только в ультрафиолетовом диапазоне. В видимом диапазоне излучают только малые (размером до десятков атомов) нанокластеры серебра, электронная энергетическая структура которых состоит из дискретных энергетических уровней вместо сплошных зон, причём расстояние между уровнями соответствует квантам видимого света. Наблюдающиеся на спектре излучения образцов Ag-Tï02 пики соответствуют межуровневым переходам в серебряных нанокластерах.

Сканирование образцов на двухфотонном оптическом микроскопе показало, что способностью к сильной флуоресценции обладают далеко не все металлические наночастицы на поверхности пленки. Пространственное распределение интенсивности флуоресценции имело вид «звездного неба», с выраженными яркими областями. Пример такого изображения приведён на рисунке 11, длина волны возбуждения составляла 825 нм. Типичные размеры ярких областей («горячих точек») на изображении составляли около 0,5 мкм, что примерно соответствует пространственному разрешению микроскопа. Считая, что наблюдавшиеся «горячие точки» являются изображениями комплексов из нескольких металлических наночастиц и, принимая во внимание, что по данным электронной микроскопии

размер наночастиц составляет около 10 нм, можно предположить, что истинный размер «горячих точек» не разрешается микроскопом и составляет порядка 101 нм.

0,5 мкм

X, мкм

У, мкм

Рис. 11 Изображение участка плёнки Ag-Ti02 размером 9x9 мкм и сечения профиля интенсивности вдоль осей X и У.

Причиной появления «горячих точек» считается локальное усиление электромагнитного поля вблизи металлических наночастиц. На полученных сканах интегральная интенсивность излучения в «горячих точках» превышала фоновое значение в «тёмных» областях в 10-50 раз. Исходя из того, что фоновый сигнал собирался с области размером около 0,5 мкм, много большей размера «горячей точки» равного примерно 20 нм, реальное значение коэффициента усиления интенсивности излучения с единицы площади больше наблюдаемого на величину (Э/ё)2, где Э - диаметр фокальной области объектива, с1 - диаметр горячей точки. Отсюда усиление интенсивности составляет Кр-Ю^Ю4. Поскольку интенсивность двухфотонной люминесценции пропорциональна четвёртой степени напряжённости электрического поля, величина локального усиления поля в «горячей точке» равна Ке=К11/4~5-10 раз на длине волны возбуждения 800 нм.

Как уже отмечалось, предполагается, что «горячие точки» представляют собой не отдельные частицы, а комплексы из нескольких близкорасположенных наночастиц, имеющих специальную конфигурацию, благоприятствующую усилению электромагнитного поля. Примеры подобных комплексов наблюдались на электронных изображениях образца (Рис. 9). Простейшей моделью такой системы является пара металлических наночастиц, лежащих рядом на поверхности полупроводниковой плёнки. Для подобной системы мода плазмонных колебаний, а с

ней и величина локального усиления должны зависеть от поляризации возбуждающего излучения.

1,2 т

Рис. 12 Зависимости интенсивности фотолюминесценции от поляризации

возбуждающего излучения для трёх «горячих точек» на образце Аи-ТЮ2

Измерение интенсивности фотолюминесценции «горячих точек» в зависимости от поляризации возбуждающего излучения показало сильное влияние поляризации на величину интенсивности, см. Рис. 12. Интенсивность достигала максимума при некотором оптимальном значении поляризации, причём это значения было различным для разных «горячих точек». Вдали от максимума, интенсивность падала во много раз.

Результаты компьютерного моделирования методом РОТЭ подтвердили, что для пары металлических наночастиц усиление поля зависит от поляризации, и наибольшее усиление наблюдается для случая вектора электрического поля, направленного вдоль продольной оси пары. Таким образом, изучение влияния поляризации на излучение «горячих точек» хорошо соответствует простейшей модели пары наночастиц.

Измерение зависимости интенсивности излучения горячих точек от длины волны возбуждения показало, что как для образцов Ag-Ti02, так и Аи-ТЮ2 интегральная интенсивность быстро падает при движении в красную область спектра от 780 к 900 нм (Рис. 13). Это падение следует приписать удалению от максимума плазмонного резонанса, который находится в более синей области спектра (см. Рис. 8). Вместе с тем, наклон кривой возбуждения был значительно большим, чем наклон измеренной ранее кривой поглощения металлических наночастиц (Рис. 8) в том же спектральном диапазоне.

40 60 80 100 120 140

Угол поляризации,0

78а 800 320 840 860 880 900

Длина волны, нм

780 800 820 840 860 880 900

Длина волны, нм

Рис. 13 Зависимость интенсивности излучения от длины волны возбуждения для «горячих точек» в нанокомпозитах Ag-Ti02 (А) и Аи-ТЮ2 (Б).

Третья часть третьей главы описывает эксперименты с рамановскоим рассеянием на молекулах красителя, нанесённых на металл-полупроводниковую плёнку.

Рис. 14 Спектры рамановского рассеяния Родамина Б, высаженного на поверхность плёнок ТЮ2. Цифрами обозначены: 1 - чистая плёнка диоксида титана, 2 - плёнка диоксида титана с серебром (время высаждения металла 20 мин).

Измерение рамановского рассеяния родамина В показало, что краситель, нанесенный на металл-полупроводниковую плёнку, даёт значительный рамановский сигнал, в то время как для красителя той же концентрации на стеклянной подложке не удаётся зарегистрировать сколько-нибудь заметного сигнала (Рис. 14). Небольшой пик в районе 1650 см'1 на Рис. 13-1 представляет собой побочную линию гелий-

ю

4-)---1-,-1-,-,-.-

1000 1200 1400 1600 18

Рамановский сдвиг, см'

1800 2000

неонового лазера на 712 нм. Этот эффект объясняется влиянием локального усиления электрического поля вблизи металлических наночастиц на нелинейный оптический отклик. В силу того, что рамановский сигнал красителя на стекле не был зарегистрирован, точно оценить величину усиления не представлялось возможным. Исходя из величины шума, можно сказать, что измеренный рамановский сигнал, по меньшей мере, в 20-25 раз превышает предельную величину сигнала, который мог быть уверено обнаружен в эксперименте. Положение пиков комбинационного рассеяния совпадало с литературными данными для родамина В.

Для красителя, нанесённого на высушенный коллоидный раствор металлических наночастиц на поверхности стекла интенсивность рамановского рассеяния оказалась в несколько раз меньшей, чем для красителя той же концентрации на металл-полупроводниковой плёнке. Это наблюдение указывает на влияние диэлектрической проницаемости подложки на величину локального усиления поля вблизи металлических наночастиц.

Интенсивность пиков рамановского рассеяния быстро возрастала при увеличении концентрации депонированного металла. Рамановский сигнал для нескольких образцов А§-ТЮ2 с разным временем экспозиции под УФ-ламой при приготовлении образца (т.е. временем за которое происходило высаждение металла) и зависимость усреднённой высоты рамановских пиков от времени показаны на рисунке 15.

В

■

я

я "

10 20 30 40 50 Время высаждения, мин.

Рис. 15 Спектр рамановского рассеяния для образцов Ag-Ti02 со временем высаждения металла: 1- 10, 2- 20, 3 - 35, 4-50 мин (А) и зависимость средней высоты пиков рассеяния от времени высаждения (В)

Зависимость интенсивности рамановского сигнала от времени высаждения оказалась нелинейной и близкой к квадратичной. Нелинейность может быть объяснена тем, что для образования «горячей точки» требуется, чтобы несколько металлических наночастиц оказались расположенными вблизи друг друга на поверхности мезопористой плёнки. Следовательно, плотность «горячих точек»

680

690 700 710 Длина волны

должна нелинейно зависеть от концентрации металла на поверхности плёнки, которая монотонно возрастает с увеличением времени высаждения. Сканирование образцов с различным временем экспозиции подтвердило предположение о росте плотности «горячих точек» с увеличением времени экспозиции, хотя сопоставить эту зависимость с зависимостью интенсивности рамановского сигнала от экспозиции не представлялось возможным.

В заключении сформулированы основные результаты диссертационной работы:

1. Развиты методики, основанные на ближнепольной и двухфотонной флуоресцентной сканирующей микроскопии, позволяющие проводить сканирование с регистрацией спектра и кинетики затухания фотолюминесценции. Создано программное обеспечение для управления сканированием и обработки результатов.

2. Методами ближнепольной и атомно-силовой микроскопии наблюдалась неоднородность строения липофусциновых гранул, характерный масштаб которой составляет 100 нм. Неоднородность проявляется в распределении флуорофоров на поверхности единичной гранулы

3. Обнаружены спектры флуоресценции двух флуорофоров липофусцина, имеющих максимум излучения на 550 и 680 нм соответственно. Показано, что основной вклад в фотолюминесценцию вносит первый флуорофор, представляющий собой А2Е и его изомер изо-А2Е.

4. Методом фемтосекундной абсорбционной спектроскопии установлены внутримолекулярные процессы переноса энергии в А2Е и определены характерные времена жизни электронных синглетных состояний S2 и S!. Дана оценка вероятности образования нефлуоресцентного продукта реакции.

5. Обнаружена люминесценция в пористых пленках из нанокристалллов ТЮ2 с фотодепонированными наночасгицами золота (серебра) в видимом диапазоне (400-750 нм) при возбуждении системы фемтосекундными импульсами (100 фс) ближнего ИК диапазона (780-920 нм). Показано, что люминесценция проявляется в виде «горячих пятен» в поле микроскопа. Доказано, что люминесценция возбуждается при двухфотонном поглощении. Получены экспериментальные данные, согласно которым источником фотолюминесценции являются наночастицы металла.

6. Показано, что в «горячих точках» наноструктурированных систем Ti02/Ag и Ti02/Au наблюдается усиление электромагнитного поля, которое проявляется как усиление двуфотонной люминесценции. Это усиление обусловлено эффектом ближнего поля в окрестности наночастицы в силу возбуждения локализованного плазмона-поляритона в металле. Дана оценка размера «горячих точек» (Ю'нм) и усиления поля в «горячих точках» (5-10 раз).

7. Измерена зависимость интенсивности люминесценции «горячих точек» в системах мезопористых плёнок ТЮг с наночастицами золота и серебра от поляризации и длины волны возбуждающего излучения и концентрации высаженного металла. Обосновано предположение, что «горячие точки» представляют собой комплексы из нескольких металлических наночастиц, в которых происходит сильное локальное усиление поля при возбуждении продольной моды плазмонных колебаний.

8. Продемонстрирован эффект усиления рамановского рассеяния для молекул родамина В, адсорбированных на пористой пленке ТЮ2 с фотодепонированными наночастицами золота или серебра.

Материалы диссертации отражены в следующих публикациях:

1. А.А.Астафьев, А.Н. Петрухин Исследование ретинальных липофусциновых гранул методами ближнепольной и атомно-силовой микроскопии. // XXVII научная конференция Московского физико-технического института, Труды конференции, Том. IV, с. 48, ноябрь 2004

2. А.Н. Петрухин, A.A. Астафьев, П.Н. Золотавин, Т.Е. Фельдман, А.Е. Донцов, О.М. Саркисов, М.А. Островский. Неоднородность структуры и флуоресценции одиночной липофусциновой гранулы из пигментного эпителия глаза человека: атомно-силовая микроскопия и микроскопия ближнего поля. // Доклады академии наук, 2005, том 405, № 5, с. 1-6

3. А.Н. Петрухин, A.A. Астафьев, П.Н. Золотавин, О.М. Саркисов. Оптическая микроскопия ближнего поля нано- и биообъектов. // Химическая физика, 2006, том 25, 9, с. 16-25.

4. А. V. Aiboushev, A.A. Astaßev, Yu.E. Lozovik, S.P. Merkulova, V.A. Nadtochenko, O.M. Sarkisov Enhanced luminescence of silver nanoclusters in mesoporous film // Physics Letters A, Volume 372, Issue 31, 28 July 2008, Pages 5193-5197

Подписано в печать 15.11.2008 г. Формат 60x84/16. Заказ №61. Тираж 100 экз. П.л. 1,5 Отпечатано в издательской службе Института Химической Физики им. Н.С. Семёнова РАН с оригинал-макета заказчика. 119991 Москва, ул. Косыгина, 4, к.6

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ.

1.1 Ближнепольная и двухфотонная сканирующая микроскопия.

1.2 Ретинальный липофусцин и его роль в фотоокислительных процессах в организме.

1.3 Оптические свойства металлических наночастиц и нанокомпозитов металл-ТЮ2.

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПОФУСЦИНОВЫХ ГРАНУЛ И А2Е.

2.1 Экспериментальная установка: ближнепольная сканирующая микроскопия.

2.2 Результаты и обсуждение.

2.3 Основные результаты.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ НАНОКОМПОЗИТОВ Au(Ag)-Ti02.

3.1 Экспериментальная установка и приготовление образцов.

3.2 Исследование «горячих точек» в металл-полупроводниковых нанокомпозитах.

3.3 Эксперименты с рамановским рассеянием на молекулах красителя, адсорбированного на нанокомпозитах металл-ТЮг.

3.4 Основные результаты.

Возможность детектирования и изучения малых объектов чрезвычайно важна для многих научных дисциплин, включая биологические науки и науки о материалах. Для этих целей традиционно использовались различные методы оптической микроскопии. Однако во многих случаях пространственное разрешение оптических микроскопов оказывается недостаточным для детектирования субмикронных объектов. Кроме того, существует теоретический предел пространственного разрешения оптических микроскопов (дифракционный предел), который связан с невозможностью сфокусировать излучение в пятно с диаметром, меньшим примерно половины длины волны используемого светового источника. Для видимого диапазона этот предел составляет около 200-300 нм, что является недостаточным для многих приложений. В последние годы получили интенсивное развитие две новых методики сканирующей оптической микроскопии, позволяющих получать изображения с высоким пространственным разрешением и контрастностью. Первая методика, которая называется сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля, использует для построения изображения, сильно локализованные затухающие электромагнитные поля (называемые также ближним полем), возникающие при прохождении излучения через апертуру оптического зонда, имеющую субдлиноволновый размер. Пространственное разрешение при этом определяется диаметром апертуры зонда, причём изготовление апертур с диаметром в сотни и десятки нанометров представляет собой чисто технологическую задачу. Несмотря на некоторую сложность реализации ближнепольная микроскопия позволяет получать пространственное разрешение, лежащее ниже дифракционного предела.

Вторая методика - это сканирующая многофотонная флуоресцентная микроскопия, развитие которой тесно связано с использованием лазерных импульсов фемтосекупдпой длительности. Благодаря малому времени импульса можно эффективно осуществить многофотонное поглощение при незначительной энергии светового импульса. Это позволяет избавиться от нежелательного фона и увеличить контрастность изображения. Пространственное разрешение многофотонной флуоресцентной микроскопии приближается к дифракционному пределу разрешения. Данная работа посвящена разработке и применению этих методик для изучения двух объектов.

Первым из изучаемых объектов были липофусциновые гранулы (ЛГ) из ретинального пигментного эпителия (РПЭ) сетчатки глаза человека. Это структуры микронного размера, накапливающиеся в клетках РПЭ с возрастом, представляют собой, по существу, недопереваренные лизосомальными ферментами фрагменты наружных сегментов палочек и колбочек сетчатки. Помимо остатков белков и липидов ЛГ содержат более десятка флуорофоров и фотосенсибилизаторов, которые, скорее всего, являются продуктами переваривания ретиналя, высвобождающегося из молекулы зрительного пигмента в результате её фотолиза. Установлена химическая природа только двух флуорофоров - это бис-ретинилиден этаноламин (А2Е)[1] и димер ретиналя с фософатидилэтаноамином[2]. Под действием видимого света липофусциновый гранулы образуют активные формы кислорода, которые в свою очередь способны повреждать белки, липиды, ДНК и инициировать апоптоз клеток РПЭ[3]. Обнаружена корреляция между накоплением в клетках РПЭ липофусциновых гранул и развитием дегенеративных заболеваний сетчатки. Причём свет способен оказывать усугубляющее воздействие на развитие этих заболеваний. Считается, что одним из основных источников фототоксических свойств липофусцина является содержащиеся в нём жёлтые флуорофоры, в частности наиболее известный из них - А2К, для которого известно, что он оказывает фототоксическое действие при облучении синим светом. Тем не менее, механизм фототоксического действия липофусцина остаётся не до конца понятным. Поэтому подробное исследование структуры, спектральных и фотохимических свойств липофусциновых гранул из клеток РПЭ является исключительно важным для понимания патогенеза, разработки мер профилактики и, возможно, способов лечения этих тяжелейших глазных заболеваний. Поскольку размер ЛГ составляет ~1 мкм, для изучения их ультраструктуры необходимо использовать методы микроскопии ближнего поля. Кроме того, для понимания механизма фототоксичности ретинального липофусцина необходимо изучения фотофизических свойств составляющих его флуорофоров и в частности А2Е.

Объектом исследования во второй части данной работы были нанокомпозиты, состоящие из нанокристаллов двуокиси титана, с фотокаталитически высаженными на их поверхность наночастицами золота и серебра (Рис.1).

Рис.1 Схематическое изображение нанокомпозитных структур металл-ТЮг

Мезопористые пленки ТЮг благодаря высокой удельной поверхности являются перспективным объектом для применения в фото катализе и фото вол ьтаических элементах[4], В частности благодаря большой ширине запрещённой зоны TiOi, образующиеся при поглощении полупроводником света электрон и дырка имеют потенциалы достаточные для разложения воды в топливных элементах. Однако эффективность фотокатализаторов на основе диоксида титана ограничена двумя факторами[5]. Во-первых, образование электрон-дырочной пары происходит только при поглощении квантов с энергией больше ширины запрещённой зоны ТЮг, равной примерно 3 эВ, что соответствует ближнему УФ-диапазону. Во-вторых, электрон и дырка, как правило, достаточно быстро рекомбинируют, не участвуя в окислительно-восстановительных реакциях. Металлические наночастицы, депонированные на поверхность мезопористых пленок Т1О2, способны улучшить фото каталитические свойства системы[6]. В зоне контакта металл-полупроводник создаётся контакт Шотки, электрическое поле которого способствует разделению образовавшихся в полупроводниковых наночастицах при поглощении света зарядов. Кроме того, металл может служить донором электронов, передавая электроны, возбужденные при поглощении света в зону проводимости ТЮг. В этом случае система металлполупроводник способна проявлять фотокаталитические свойства при поглощении свста видимого диапазона.

Наиболее перспективным представляется применение композитных катализаторов ТЮг с наночастицами благородными металлами в силу большой химической стабильности последних. Подобная система обладает ещё одним, интересным и практически важным свойством. Известно, что для наночастиц золота и серебра под действием излучения оптического диапазона могут возбуждаться так называемые плазмонные колебания — коллективные колебания электронов проводимости под действием электромагнитного поля. Эти колебания обладают наибольшей интенсивностью на определённой частоте, которая называется частотой плазмонного резонанса и для больших сферических наночастиц серебра соответствует длине волны 380 им, а для золота - 520 нм. Плазмонный резонанс приводит к сильному локальному усилению ЭМ поля, и как следствие должен повышать интенсивность рождения электрон-дырочных пар в близлежащих частицах полупроводника а значит и эффективность композитного катализатора.

Плазмонный резонанс и связанное с ним локальное усиление поля создаёт ещё одно возможную область для применения металл-полупроводниковых нанокомпозитов, а именно в качестве систем для наблюдения рамановского рассеяния. Известно, что рамановское рассеяние является оптическим процессом, интенсивность которого имеет свойство усиливаться на много порядков вблизи металлических поверхностей, что, как считается, является следствием локального усиления электромагнитного поля. Спектр рассеяния представляет собой серию пиков, положение и интенсивность которых определяется химическим строением молекул, на которых происходит рассеяние и является весьма индивидуальной характеристикой химического вещества. Таким образом, рамановский спектр может быть эффективно использован для анализа химического состава. Однако, само по себе рамановское рассеяние имеет весьма малое сечение, поэтому для повышения чувствительности используют эффект поверхностного усиления рассеяния, нанося анализируемый препарат на шероховатые металлические поверхности. При этом величина усиления сильно зависит от конфигурации поверхности. Достаточно актуальной задачей является разработка специальных металлических структур для контролируемого усиления рамановского рассеяния. Особенно полезными такие структуры оказались бы для наблюдения рамановского сигнала одиночных молекул, где требуется большая чувствительность [7]. Благодаря большой плотности отдельно расположенных наночастиц, металл-полупроводниковые нанокомпозиты являются перспективными кандидатами на роль таких структур.

Следует заметить, что для системы полупроводниковых и металлических наночастиц, явление плазмоного резонанса носит сложный характер. Известно, что в шероховатых металлических плёнках наблюдаются так называемые «горячие точки» - области очень сильного локального усиления поля, которое возникает при определённой конфигурации поверхности плёнки. Следует ожидать, что подобное же явление должно появляться и в нашей нанокомпозитной системе. Однако «горячие точки» в металл-полупроводниковых комплексах оставалось до недавнего времени не только неизученным, но и напрямую не наблюдались. Для практических применений композитов металл-полупроводник важно понимание явлений, происходящих при взаимодействии электромагнитного поля с наночастицами, в частности формирования «горячих точек». Кроме того, для оценки возможности применения металл-полупроводниковых композитов для детектирования рамановского сигнала необходимо исследовать явление усиления рамановского рассеяния в подобных системах.

Таким образом, данная работа преследовала следующие цели и задачи:

1. Разработать и реализовать методики ближнепольной и * двухфотонной флуоресцентной оптической микроскопии: собрать оптическую схему экспериментальной установки, обеспечить синхронизацию работы сканирующей платформы с системой регистрации оптического сигнала, создать программное обеспечение для управления сканированием и обработки экспериментальных данных.

2. Методами сканирующей оптической ближнепольной и атомно-силовой микроскопии изучить структуру одиночных липофусциновых гранул и распределение в них различных флуорофоров.

3. Методами двухфотонной сканирующей микроскопии исследовать оптические свойства нанокомпозитных Ti02/Ag и ТЮг/Аи систем в зависимости от параметров возбуждающего импульса (поляризации и длины волны) и характеристик образца, чтобы сделать вывод о механизме усиления поля и появления «горячих точек» в таких системах.

4. Обнаружить усиление рамановского рассеяния для молекул, нанесенных на нанокомпозиты металл-ТЮг и проследить влияние концентрации высаженного металла на величину рамановского сигнала.

Диссертация состоит из 3 глав и заключения. Первая часть представляет собой обзор научной литературы по теме работы. В первой части главы 1 приведено общее описание методов двухфотонной флуоресцентной и ближнепольной сканирующей микроскопии и проведён сравнительный анализ их особенностей. Во второй части дан обзор научной литературы по изучению липофусцина и его роли в фототоксических процессах в организме человека. В третьей части главы 1 описываются общие вопросы, касающиеся оптических свойств металлических наночастиц и их связи с процессами плазмонного усиления поля и гигантского рамановского рассеяния, и затем суммируются приводимые в научной работе результаты исследований металл-полупроводниковых нанокомпозитов. Во второй главе излагаются результаты исследования липофусциновых гранул и флуорофора А2Е. В первой её части описывается применявшиеся экспериментальные методики, во второй — результаты изучения структуры липофусциновых гранул с помощью атомно-силового и ближнепольного микроскопов и также результаты изучения фотофизических свойств А2Е и липофусцина. Третья глава посвящена исследованию металл-полупроводниковых нанокомпозитов. В первой её части описывается экспериментальная установка для двухфотонной микроскопии и для наблюдения рамановского рассеяния а также процедура приготовления образцов. Во второй части приведены результаты изучения фотопроцессов в металл-полупроводниковых нанокомпозитах. В третьей части описываются эксперименты с рамановским рассеянием на молекулах красителя, нанесенных на металл-полупроводниковую пленку. В заключении сформулированы основные результаты работы.

3.4 Основные результаты

1. Развита методика, основанная на двухфотонной флуоресцентной сканирующей микроскопии, позволяющая проводить сканирование с регистрацией спектра и кинетики затухания фотолюминесценции. Создано программное обеспечение для управления сканированием и обработки результатов. Показано, что латеральное разрешение микроскопа достигает 400 нм

2 Обнаружена люминесценция в пористых пленках из нанокристалллов ТЮ2 с фотодепонированными наночастицами золота (серебра) в видимом диапазоне (400750 нм) при возбуждении системы фемтосекундными импульсами (100 фс) ближнего ИК диапазона (780-920 нм). Показано, что люминесценция проявляется в виде «горячих пятен» в поле микроскопа. Доказано, что люминесценция возбуждается при двухфотонном поглощении. На основе анализа спектра и кинетики затухание люминесценции сделан вывод, что источником фотолюминесценции являются наночастицы металла.

3. Показано, что в «горячих точках» наноструктурированных систем Ti02/Ag и ТЮг/Аи наблюдается усиление электромагнитного поля, которое проявляется как усиление двуфотонной люминесценции. Это усиление обусловлено эффектом ближнего поля в окрестности наночастицы в силу возбуждения локализованного плазмона-поляритона в металле. Дана оценка размера «горячих точек» (10[нм) и усиления поля в «горячих точках» (5-10 раз).

4. Измерена зависимость интенсивности люминесценции «горячих точек» в системах мезопористых плёнок ТЮг с наночастицами золота и серебра от поляризации и длины волны возбуждающего излучения и концентрации высаженного металла. Обосновано предположение, что «горячие точки» представляют собой комплексы из нескольких металлических наночастиц, в которых происходит сильное локальное усиление поля при возбуждении продольной моды плазмонных колебаний.*

5. Продемонстрирован эффект усиления рамановского рассеяния для молекул родамина В, адсорбированных на пористой пленке ТЮ2 с фотодепонированными наночастицами золота или серебра. Показано, что интенсивность рамановского сигнала нелинейно возрастает с увеличением концентрации высаженного металла. Предположено, что это явление связано с экспериментально наблюдавшейся зависимостью концентрации «горячих точек» от количества высаженного на мезопористую пленку металла.

Заключение.

В заключении повторим в краткой форме основные результаты диссертационной работы:

1. Развиты методики, основанные на ближнепольной и двухфотонной флуоресцентной сканирующей микроскопии, позволяющие проводить сканирование с регистрацией спектра и кинетики затухания фотолюминесценции. Создано программное обеспечение для управления сканированием и обработки результатов.

2. Методами ближнепольной и атомно-силовой микроскопии наблюдалась неоднородность строения липофусциновых гранул, характерный масштаб которой составляет 100 нм. Неоднородность проявляется в распределении флуорофоров на поверхности единичной гранулы

3. Обнаружены спектры флуоресценции двух флуорофоров липофусцина, имеющих максимум излучения на 550 и 680 нм соответственно. Показано, что основной вклад в фотолюминесценцию вносит первый флуорофор, представляющий из себя А2Е и его изомер изо-А2Е.

4. Методом фемтосекундной абсорбционной спектроскопии установлены внутримолекулярные процессы переноса энергии в А2Е и определены характерные времена жизни электронных синглетных состояний S2 и Si. Дана оценка вероятности образования нефлуоресцентного продукта реакции.

5. Обнаружена люминесценция в пористых пленках из нанокристалллов ТЮ2 с фотодепонированными наночастицами золота (серебра) в видимом диапазоне (400-750 пм) при возбуждении системы фемтосекундными импульсами (100 фс) ближнего ИК диапазона (780-920 нм). Показано, что люминесценция проявляется в виде «горячих пятен» в поле микроскопа. Доказано, что люминесценция возбуждается при двухфотонном поглощении. Получены экспериментальные данные, согласно которым источником фотолюминесценции являются наночастицы металла.

6. Показано, что в «горячих точках» наноструктурированных систем Ti02/Ag и

ТЮг/Аи наблюдается усиление электромагнитного поля, которое проявляется как усиление двуфотонной люминесценции. Это усиление обусловлено эффектом ближнего поля в окрестности нанокластера в силу возбуждения локализованного плазмона-поляритона в металле. Дана оценка размера «горячих точек» (Ю'нм ) и усиления поля в «горячих точках» (5-10 раз)

7. Измерена зависимость интенсивности люминесценции «горячих точек» в системах мезопористых плёнок ТЮ2 с наночастицами золота и серебра от поляризации и длины волны возбуждающего излучения и концентрации высажденного металла. Обосновано предположение, что «горячие точки» представляют собой комплексы из нескольких металлических наночастиц, в которых происходит сильное локальное усиление поля при возбуждении продольной моды плазмонных колебаний.

8. Продемонстрирован эффект усиления рамановского рассеяния для молекулы родамина В, адсорбированного на пористой пленке ТЮ2 с фотодепонированными нанокластерами золота или серебра.

1. Lamb L.E., Simon J.D., Photochem.Photobiol. 2004, 79, 2, 127

2. Fishkin N.E., Sparrow J.R., Allikmets R., Nakanishi K., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 2005, 102, 20, 7091

3. Boulton M., Dontsov A., Ostrovsky M., Photochem.Photobiol. 1993, 19, 201

4. Bach U., Lupo D., Comte P., Moser J.E, Weissortel F., Salbeck J., Spreitzer H., Gratzel M., Nature 1998 V. 395. P. 583

5. Baifii X., J.Phys.Chem. В 2005, 109, 2805

6. Hirakawa E., Kamat P., J.Am.Chem.Soc. 2005,127 (11), 3928

7. Gryczynski I., Malicka J.,Shen.Y., J.Phys.Chem.B 2002, 106, 2191

8. G.Binnig, H.Rohrer, Ch.Gerber, E.Weibel, 1983, Appl. Phys. Lett., 40, 178

9. E. H. Synghe, 1928, Phil. Mag. 6, 356

10. C. W. Hollars, R. C. Dunn, 1998, Rev Sci. Instrum. 69, 1747

11. Niek F. van Hulst, Joost-Anne Veeman, Maria F. Garcia-Parajo, L. Kuipers, 2000, J. of Chem. Phys. 112 (18), 7799

12. H. A. Bethe, Phys. Rev. 66, 163 (1944)

13. C. J. Bouwkamp, Philips Res. Rep. 5, 321 (1950)

14. W. Denk, J.H. Strickler, W.W. Webb, Science ,Vol. 248., pp. 73 76, 1990

15. W. Denk, K. Svoboda, Neuron, Vol. 18, pp. 351-357, 1997

16. J. Pawley, ed. (New York: Plenum Press), pp. 445-458, 1995

17. С. Xu, W.W Webb, J. Opt. Soc. Am. B. Vol. 13 (3), pp. 481-491 1996

18. J. Bewersdorf, S.W. Hell, J. of Microscopy, Vol. 191, pp. 28-38, 1998

19. Konig K. J. of Microscopy Vol. 200 pp. 83-104 2000

20. Kny, W., 1937, Pathol Anat (excerpt), 299, 468

21. Goebel H.H. and Braak, H., 1989, Clin Neuropathol, 8(3), 109

22. Kirchhoff A. and Kobe C., 1994, Zentralbl Veterinarmed A, 41(10), 731

23. Timiras, P.S., 1988, "Physiological Basis of Aging and Geriatrics", MacMillan, NY

24. Shutt F, Bergmann M, Holz F.G., Kopitz J.,2002, Graefes Arch Clin Exp Opthalmol, 240, 983

25. Feeney-Burns L., Hilderbrand E., Eldridge S., 1984, Ophtalmol Vis Sci, 25, 295

26. Boulton M., 1991, Progress in retinal research, Pergamon, Oxford, 12527. van der Schaft T.L., 1992, Arch. Ophthalmol, 110(3), 389

27. Boulton M., Dontsov A., Jarvis-Evans J., Ostrovsky M., Svistunenko D., 1993, Photochem Photobiol B, 64,144

28. Wasell J., Davies S., Bardsley W., Boulton M., 1999, Biol. Chem., 274, 23828

29. Davies S, Elliott M.H., Truscott T.G., Zareba M., Sarna Т., Shamsi F.A., Boulton M., 2001, Free Radic. Biol. Med., 31, 256

30. Eldred G.E., Katz M.L., 1993, Exp. Eye Res., 47, 724

31. Sparrow J.R., Parish C.A., Hashimoto M., Nakanishi K., 1999, Investig. Ophtalmolog. Vis. Sci., 40, 2988

32. Harlampus-Grynavski N.M., Lamb L., Clancy C.R., Skumatz S., Burke J.M., Sarna Т., Simon J.D., 2003, PNAS, 100(6), 3179

33. Rosanowska M., Wessels J., Boulton M., Burke J.M., Rodgers M.A.J., Truscott T.G., Sarna Т., 1998, Free Radical Biol. Med., 1998, 24, 1107

34. Lamb L., Tong Y., Harlampus-Grinavsky N.M., Williams T.R., Pawlak A., Sarna Т., Simon J.D., 2001, J. Phys. Chem. B, 105, 11507

35. Cantrell A., McGarvey D.J., Roberts J., Sarna Т., Truscott T.G., 2001, J. Photochem Photobiol. В., 64, 162

36. Ben-Shabat S., Itagaki Y., Jockusch S., Sparrow, J.R., Turro N.J., Nakanishi K., 2002, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 41, 814

37. Pawlak A., Rozanovska M., Zareba M., Lamb L.E., Simon J.D., Sarna Т., 2002, Arch. Biochem. Biophys., 403, 59

38. Shamsi F.A., Boulton M., 2001, Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 42, 3041

39. Sparrow J.R., Nakanishi K., Parish C.A., 2000, Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 41, 1981

40. Sparrow J., Zhou J., Cai В., 2003, 44(5), 2245

41. Sparrow J., Vollmer-Snarr H.R., Zhou J., Jang J.P., Jockush S., Itagaki Y., Nackanishi K., J. Biochem Phys., 278(20), 18207

42. Clancy C.R.C., Krogmeier J.R., Pawalak A., Rozanovcka M., Sarna Т., Dunn R.C., Simon J.D., J. Phys. Chem. B, 2000,104, 12098

43. U. Kreibig, & M. Vollmer, (Springer, 1995).

44. G. Mie, Ann. Phys.(Leipzig), 25, 1908, 377

45. H. Haberland, (ed. Haberland, H.) (Springer-Verlag, 1994).

46. W. A. De Heer, Rev. Mod. Phys., Vol. 65, No.3, 1993

47. R.L. Johnston, London and New York, 2002

48. C. Noguez, J. Phys. Chem. С 2007, 111, 3806-3819

49. R. Kubo, J. Phys. Soc. Jpn., 17, 975, 1962

50. W.D. Knight et al., Phys. Rev. Lett., 52, 2141-2143, 1984

51. H. Uchtmann, K. Rademann, F. Hensel., Ann. Phys, 48, 207-214, 1991

52. W.D. Knight et al., Phys. Rev. Lett., 52, 2141-2143, 1984

53. D.E. Beck, Phys. Rev. B, 30, 6935, 1984

54. W. Ekardt, Phys. Rev. Lett., 52, 1925,1982

55. M.J. Puska, R.M. Niemenen., M. Manninen., Phys. Rev. В., 31, 3486, 1985 '

56. U. Kreibig, P. Zacharias, Z. Phys, 231, 128, 1970

57. U. Kreibig, L. Genzel, Surf. Sci., 156, 678, 1985

58. J. Tiggesbaumker, L. Koller, H.O. Lutz, K.H. Meiwes-Broer, Chem. Phys. Lett., 190, 42, 1992

59. U. Kreibig, Journal of Physics F-metal physics", 4, 999-1014, 1974

60. G.A. Ozin, H. Huber, Inorg. Chem., 17, 155-163, 1978

61. W. Harbich, S. Fedrigo, J. Buttet, D.M, Lindsay, Z. Phys. D-Atoms Mol. Clusters, 19, 157-159, 1991

62. C. Felix et al., Chem. Phys. Lett., 313, 105-109, 1999 64.1. Rabin et al., Chem. Phys. Lett., 320, 59-64, 2000

63. W. Chen, A.G. Joly, J. Roark, Phys. Rev. B, 65, art. no.-245404, 2002

64. J. Zheng, PhD thesis, Georgia Institute of Technology, 2005

65. R. a. S. N. Marcus, edited by P. Jena, B.K. Rao, and S.N. Khanna, New York : Plenum Press, 1987.

66. W. Harbich, S. Fedrigo, J. Buttet, D.M. Lindsay, Z. Phys. D-Atoms Mol. Clusters, 19, 157-159, 1991

67. B.A. Collings, K. Athanassenas, D. Lacombe, D. Rayner, P. A. Hackett, J. Chem. Phys., 101,3506-3513, 1994

68. G. Schmidet al., Chem. Soc. Rev., 28, 179-185 ,1999

69. U. Kreibig, K. Fauth, C.G. Granqvist, G. Schmid, Zeitschrift Fur Physikalische Chemie Neue Folge, 169, 11-28, 1990

70. J.P. Wilcoxon, J.E. Martin, F. Parsapour, B. Wiedenman, D.F. Kelley, J. Chem. Phys., 108,9137-9143, 1998

71. R.L. Whetten, et al., Accounts Chem. ~ """ 1999

72. M. Fleischmann, P.J. Hendra, A.J. McQuillan, Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 80-81, 1973

73. M. Moskivits, Rev. of Mod. Phys., Vol. 57, No.3, 1985

74. M. Moskovits, D.P. DiLella, R.K. Chang and Т.Е. Furtak, Editors, Plenum Press: New York., 243, 1982

75. K. Kneipp, K. et al., Phys. Rev. Lett., Vol.78, 1667-1670, 1997

76. S.M. Nie, S.R. Emory, Science, Vol.275, 1102-1106, 1997

77. A.M. Michaels, J. Jiang, L.E. Brus, J. Phys. Chem. B, 104, 11965, 2000

78. A. Otto, "Light Scattering in Solids IV", M. Cardona and G. Gundtherodt, Editors, Springer-Verlag: Berlin., 289, 1984

79. B.N J. Persson, Chem. Phys. Lett., 82(3), 561, 1981.

80. F.X. Liu, M. Tang, L. Liu, S. Lu, J.Y. Wang, Z. Y. Chen, R. Ji, Phys. Stat. Sol. (a), 179, 437, 2000

81. B. Xin, L. Jing, Zh. Ren, B. Wang, H. Fu, J. Phys. Chem. B, 109, 2805, 2005

82. Akihiro Furube, Luchao Du, Kohijiro Hara, Ryuzi Katoh, Masanori Tachiya, J. Am. Chem. Soc., 129, 48, 14 853, 2007

83. Yang Tian, Tetsu Tatsusima, J Am. Chem. Soc., Vol.127, 20, 7637, 2005

84. Y. Ohko, T. Tatsuma, T. Fujii, K. Naoi, Chisa Niwa, Y. Kubota, A. Fujishima, Nature materials, Vol. 2, Jan. 2003

85. Y. Tiang, T. Tatsumo, J. Am. Chem. Soc., Vol. 127, 20, 7632-7637, 2005

86. K. Kawahara, K. Suzuki, Y. Ohko, T. Tatsuma, Phys. Chem. Chem. Phys., 7, 3851-3855, 2005

87. Островский M.A., Донцов A.E., Сакина H. JI., Сенсорные системы. 1992, Т. 6, 3, с. 51

88. В. Hecht, Н. Bielefeldt, Y. Innoye, D.W. Pohl, L. Novotny,1996, J. Appl. Phys., 81(6), 2492

89. D.V. Palanker, D.M. Simanovsky, P. Huie, Y.I. Smith, 2000, J. Appl. Phys., 88(11), 6808

90. Shklover V., Nazeeruddin M.-K., Zakeeruddin S., Barbe C., Kay A., Haibach Т., Steurer W., Hermann R., Nissen H.-U., Gratzel M., Chem. Mater. 1997, V. 9, P. 430.

91. Kan Fujihara, Sinobu Izumi, Teruhisa Ohno, Michio Matsumara, Journal of Photochemosty and Photobiology A: Chemistry, 132, 99-104, 2000

92. M. Watanabe, T. Hayashi, H. Yagasaki, S. Sasaki, International Journal of Modern Physics B, Vol. 15, 28-29, 3997-4000,2001

93. M.R. Beverslius, A. Bouhelier, L. Novotny, Physical Review B, 68, 115433, 2003

94. J.M. Gunn, M.Evad, M.Dantus , Nano Letters, 6, 12, 2804-2809, 2006

95. Aiboushev A., Lozovik Yu, Nadtochenko V., Sarkisov O., SPIE Proceedings 6727 9S.A.V. Aiboushev, A.A. Astafiev, Yu.E. Lozovik, S.P. Merkulova, V.A. Nadtochenko, O.M.

96. Sarkisov Physics Letters A, Volume 372, Issue 31, 28 July 2008, Pages 5193-5197

97. Rechberger W., Hohenau A., Opt. Comm. 220 (2003) 137-141

98. Chan S., Barteau M., Langmuir. 2005, V. 21, P. 5588

99. A. Mooradian, Physical Review Letters, 22, 5, 1969

100. P. Aprel, R. Monreal, S. Lindqvist, Physical Scripts, 38, 174-179, 1988

101. L. A. Capadona, Ph. D thesis, Georgia Institute of Technology, 2004

102. R. Jin, J.E. Jureller, H.E. Kim, N.F. Sherer, J. Am. Chem. Soc., 127, 36, 2005

103. M. Volny, A. Sengupta, C.B. Wilson, B.D. Swanson, E.J. Davies, F. Turecek, Analytical Chemistry, published on Web 2007.