Сорбционное выделение и концентрирование метилксантинов и их определение различными методами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

АНДРЕЕВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

СОРБЦИОННОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ МЕТИЛКСАНТИНОВ И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2011

4856750

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Дмитриенко Станислава Григорьевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор кафедры

химии, геохимии и космохимии Международного университета природы, общества и человека «Дубна» Басова Елена Михайловна

доктор фармацевтических наук, доцент, заместитель руководителя по учебной работе Обнинского института атомной энергетики Национального исследовательского ядерного университета МИФИ Эпштейн Наталья Борисовна

Ведущая организация: Липецкий государственный технический

университет

Защита состоится 26 октября 2011 года в 15 ч. 00 мин. в аудитории 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 15 сентября 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук /Г~~ И.И. Торочешникова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Метилксантины, важнейшими представителями которых являются кофеин, теофиллин и теобромин, широко распространены в природе и играют важную роль в биологических процессах. Интерес, проявляемый в последние пятнадцать лет к разработке методов определения метилксантинов в различных объектах, объясняется важностью этих соединений для пищевой промышленности, фармакологии, клинической и спортивной медицины, токсикологии, экологического контроля. Кофеин, теофиллин и теобромин часто определяют в продуктах питания, таких как кофе, чай, шоколад, различных тонизирующих напитках. Анализ биологических жидкостей на содержание метилксантинов проводят с целью оценки эффективности терапевтического лечения этими препаратами, поскольку диапазон между лечебной и токсической концентраций для них достаточно узок. Например, теофиллин оказывает лечебный эффект при содержании его в сыворотке крови 10-20 мкг/мл, а уже при его концентрации свыше 20 мкг/мл начинает оказывать токсическое действие. Международный олимпийский комитет считает, что спортсмен употребляет стимулятор, если концентрация кофеина в моче составляет более 12 мкг/мл, а его основного метаболита теофиллина - 5 мкг/мл. Информация о концентрациях метаболитов кофеина и других метилксантинов в организме человека - важное звено в построении метаболомических профилей, позволяющих обнаружить врожденные и наследственные нарушения метаболизма и более точно диагностировать диабет, патологии печени и ряд других заболеваний. Очень важно определять низкие количества кофеина и в водах, поскольку он является своеобразным индикатором, позволяющим следить за качеством коммунально-бытовых сточных вод.

Достоверность идентификации метилксантинов и правильность полученных количественных результатов во многом зависят от выбора метода пробоподготовки и рационального сочетания его с методом последующего определения. Сложная проблема, с которой часто сталкиваются в процессе пробоподготовки объектов, содержащих метилксантины, связана с высокой гидрофильностью этих соединений (^Р = -1.1 -н 0.3), вследствие которой эффективность концентрирования оказывается невысокой. Среди различных методов, предложенных в последнее время для выделения и концентрирования метилксантинов, наиболее перспективным является твердофазная экстракция (ТФЭ), однако большинство опубликованных работ ориентировано на решение чисто прикладных задач, а круг используемых сорбентов невелик и ограничивается в основном силикагелями, модифицированными гидрофобными алкильными группами. Для обоснованного выбора сорбентов для ТФЭ таких полярных соединений, как метилксантины, необходимы количественные данные, характеризующие сорбционный процесс, которые практически отсутствуют. В связи с этим представляется актуальным как расширение круга сорбентов, позволяющих количественно выделять и концентрировать метилксантины, так и поиск новых комбинаций сочетания сорбционного концентрирования этих соединений и их последующего определения.

Цель работы состояла в систематическом изучении сорбции метилксантинов на сорбентах различной природы и разработке методик сорбционного выделения и концентрирования этих соединений для их

последующего определения в элюате методом обращенно-фазовой ВЭЖХ или спектрофотометрии.

Для достижения поставленной цели было необходимо:

• систематически исследовать сорбцию метилксантинов на сверхсшитом полистироле МЫ-200 (ССПС), поверхностно-модифицированном сополимере стирола и дивинилбензола 81га1а-Х, наноуглеродном материале (УНМ) Таунит и Диасорбах (100-С16, ЮО-С^, 100-С8Т, 100-С1бТ) в зависимости от условий извлечения и природы сорбатов; выявить факторы, влияющие на величину коэффициентов распределения; сравнить сорбенты по сорбционной способности и выбрать наиболее эффективный; выбрать условия сорбционного концентрирования метилксантинов в динамическом режиме;

• оптимизировать условия разделения и определения метилксантинов методом ОФ ВЭЖХ; изучить возможность сочетания группового сорбционного концентрирования метилксантинов с последующим определением индивидуальных соединений в элюате методом ВЭЖХ;

• оптимизировать условия щелочного гидролиза метилксантинов и разработать методики их спектрофотометрического определения по реакции с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония;

• разработать методики определения метилксантинов в различных объектах: чае, напитках, лекарственных препаратах, речной воде и моче.

Научная новизна. Выявлены особенности сорбционного поведения метилксантинов на различных по природе сорбентах: ССПС, Э^а-Х, наноуглеродном материале Таунит и Диасорбах (100-С16, ЮО-С1Т, 100-С8Т, 100-С16Т). Оценено влияние рН водного раствора, природы сорбента и строения метилксантинов на их распределение. Установлены взаимосвязи между коэффициентами распределения и гцдрофобностью сорбатов. Обсуждена роль различных типов межмолекулярных взаимодействий в сорбции исследованных веществ. Реализовано сочетание сорбционного концентрирования метилксантинов на ССПС с их определением в элюате методом ОФ ВЭЖХ. Обнаружено, что продукты щелочного гидролиза метилксантинов вступают в реакцию азосочетания с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония.

Практическая значимость работы. Продемонстрированы возможности использования изученных сорбентов для сорбционного извлечения метилксантинов из водных растворов, выбраны условия концентрирования. Разработана методика хроматографического разделения и определения метилксантинов, включающая их сорбционное концентрирование на микроколонке, заполненной ССПС, десорбцию метанолом и раздельное хроматографическое определение со спектрофотометрическим детектированием. Разработаны спектрофотометрические методики определения метилксантинов в виде их окрашенных 4-нитрофенилазопроизводных. Методики апробированы при анализе модельных водных растворов, напитков, лекарственных препаратов, мочи и речной воды.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследования структурных характеристик сорбентов.

2. Результаты исследования и выявленные особенности сорбции метилксантинов на сорбентах различной природы; интерпретация взаимосвязи коэффициентов распределения со строением и свойствами сорбента и сорбируемого

соединения; обоснование возможности использования сверхсшитого полистирола для группового сорбционного концентрирования метилксантинов.

3. Методики сорбционного концентрирования и определения метилксантинов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

4. Методики спектрофотометрического определения метилксантинов по реакции с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония.

5. Результаты определения метилксантинов в лекарственных препаратах, напитках, моче и речной воде.

Апробация работы. Основные результаты доложены на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Всероссийской конференции «Химический анализ» (Москва-Клязьма, 2008), III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2009), Съезде аналитиков России (Москва-Клязьма, 2010), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), 36th International Symposium on Environmental Analytical Chemistry (Rome, Italy, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, выводов и списка литературы (301 наименование). Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков и 34 таблицы. Во введении обосновывается актуальность темы и цель работы, ее новизна и практическая значимость. В литературном обзоре систематизированы данные, опубликованные за последние 10 лет, о методах выделения, концентрирования и определения метилксантинов в различных объектах: продуктах питания, напитках, лекарственных препаратах, биологических жидкостях и водах. Во второй главе описаны реагенты, аппаратура и методика эксперимента. В третьей главе приведены сведения о структурных характеристиках сорбентов и особенностях сорбции метилксантинов на их поверхностях в статическом и динамическом режимах. Четвертая глава посвящена оптимизации условий разделения и определения метилксантинов методом ОФ ВЭЖХ. Там же приведены примеры определения метилксантинов в различных объектах без и после сорбционного концентрирования на ССПС. В пятой главе приведены результаты оптимизации условий щелочного гидролиза метилксантинов и их спектрофотометрического определения по реакции с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объеюы исследования, аппаратура и техника эксперимента

Объектами исследования служили кофеин {Roth, 99.0%), теофиллин (Acros organics, 99.0%), теобромин {Sigma-Aldrich, 99.0%), дипрофиллин (Fluka analytical, 97.0%) и пентоксифиллин (Sigma-Aldrich). Перечень и некоторые физико-химические свойства изученных веществ приведены в табл.1. Исходные растворы метилксантинов (0.001 -0.005 М) готовили растворением их точных навесок в воде. Рабочие растворы.

Таблица 1. Перечень и некоторые физико-химические свойства метилксантинов, изученных в работе____

Соединение Структурная формула Мол. масса lgP* рК." рКь**

Дипрофиллин (7-(2,3-дигидрокси-пропил)теофил-лин, Д) ^он 0 1 / он Хх> 1 chj 254 -1.10 - -

Теобромин (3,7-диметилксан-тин, ТБ) . X г хх> О^ N 1 CHj 180 -0.7 10.0 13.9

Теофиллин (1,3-диметилксан-тин, ТФ) "¿¿ 1 СН» 180 -0.2 8.8 14.2

Кофеин (1,3,7-триметил-ксантин, К) 1 г аХ> 1 CHj 194 -0.1 14.0 14.2

Пентоксифиллин (3,7-диметил-1 -(5-оксогексил)-ксантин, П) О 1 CHj ДААЛД 1 СН, 278 0.3 - -

♦Значения параметров гидрофобности lgP рассчитаны с помощью программы lgP(@ACD, Toronto, Canada); **3начения рКа и рКь взяты из М.С. Gennaro, С. Abrigo, P. Biglino. //Analyst. 1992. V. 117. P. 1071-1074.

соединений готовили разбавлением исходных непосредственно перед использованием.

В качестве сорбентов использовали сверхсшитый полистирол MN-200 (ЗАО «БиоХимМак CT», Sy„= 1020 м2/г, степень сшивки 100%, размер частиц 75-125 мкм), поверхностно-модифицированный сополимер стирола и дивинилбензола Strata-X («Phenomenex», Syj = 800 м2/г, размер частиц 33 мкм), наноуглеродный материал Таунит (ООО «НаноТехЦентр», г. Тамбов, Sva = 120 м2/г) и модифицированные алкильными группами силикагели: Диасорб-100-С16, Диасорб-100-CiT, Диасорб-100-С8Т, Диасорб-100-С1бТ (ЗАО «БиоХимМак CT», Sya = 250 - 330 м2/г, размер частиц 63 - 200 мкм).

Хроматографическую часть работы выполняли на жидкостном хроматографе «Цвет-Яуза-04» со спектрофотометрическим (Х. = 280нм) и амперометрическим (Е = 1.3 В) детекторами. Разделение проводили в

обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ. Использовали хроматографические колонки Luna 5u С18(2) (150 х 3.0 мм, 5 мш) и Диасфер-110-С16 (150 х 4.0 мм, 6 мкм). В качестве подвижной фазы использовали водно-зцетонитрильныс и водно-метанольные смеси с добавлением фосфорной кислоты. Объем пробы составлял 20 мкл, ввод пробы осуществляли с помощью петли дозатора. Скорость потока составляла 0.5 мл/мин. Дистиллированную воду для приготовления элюента дополнительно очищали с помощью системы очистки воды Millipore. Элюент дегазировали в ультразвуковой ванне Bransonic 1510R-DTH (США). Спектры поглощения и оптические плотности растворов регистрировали на спектрофотометре СФ-103 («Аквилон», Россия), значения рН контролировали на иономере «Эксперт 001» (Россия).

Характеристики пористой структуры образцов - удельную поверхность (SJ, объем пор (V„), средний диаметр пор (dn), а также площадь поверхности, приходящуюся на микропоры (Sya мк), и объем микропор (VMK) - определяли методом низкотемпературной адсорбции азота на установке ASAP 2010 N («Micromeritics», США) в лаборатории кинетики и катализа кафедры физической химии МГУ. Исследование микроструктуры образцов сорбентов проводили на сканирующем электронном микроскопе с автоэмиссионным источником LEO SUPRA 50VP («Carlo Zeiss», Германия).

Для изучения сорбции веществ в статическом режиме точные навески сорбентов (0.020 ± 0.001 г) помещали в пробирки с притертыми пробками, добавляли 5 мл раствора исследуемого вещества и встряхивали на электромеханическом вибросмесителе до установления сорбционного равновесия. После этого сорбент отделяли от раствора декантацией, фильтрованием через складчатый бумажный фильтр и определяли концентрацию исследуемого соединения в равновесной водной фазе спектрофотометрическим методом по их собственному поглощению в УФ области. Для изучения сорбции в динамическом режиме использовали концентрирующую микроколонку объемом 0.15 мл (25 х 2.7 мм), заполненную ССПС, и перистальтический насос ЛАБ-НП-1-20М (Россия). Перед использованием колонку промывали 10 мл дистиллированной воды. Скорость пропускания раствора через колонку составила 0.7 мл/мин. После проведения сорбции и десорбции колонку промывали 3 мл этанола и 10 мл воды. Кроме того, использовали картриджи, заполненные 30 мг сорбентов.

Структурные характеристики сорбентов и особенности сорбции метилксантинов

Удельная поверхность и пористость. Методом низкотемпературной адсорбции азота при 77 К на установке ASAP 2010 N проведено исследование пористой структуры и определена удельная поверхность сорбентов (табл. 2). Изотермы сорбции-десорбции азота для изученных сорбентов (рис. 1) существенно различаются друг от друга, на всех изотермах наблюдаются петли гистерезиса. Согласно классификации ИЮПАК по форме изотерм сорбции и петли гистерезиса ССПС (II, Н4-тип) принадлежит к микропористым сорбентам, Strata-X и Диасорб-100-С16Т (IV, Н2-тип) - к мезопористым сорбентам, в составе которых содержатся поры в форме «бутылочного горлышка», а УНМ Таунит (IV, Н3-тип) - к мезопористым сорбентам, содержащим поры по форме ближе к

Таблица 2. Характеристики пористой структуры сорбентов, рассчитанные по

Сорбент ССПС Strata-X Диасорб-100-С,6Т УНМ Таунит

Svfl> м2/г 912 575 204 139

V„, см7г 0.53 1.06 0.49 0.20

d„,A 23.3 73.5 95.5 56.8

SVa мк, М /Г 513 0 0 7

VMK, см7г 0.23 0 0 0.01

Доля, % (Рассматриваемый диаметр пор 1.7 - 300 нм)

макропоры (более 50 нм) 10 7 0.3 21

мезопоры (от 2 до 50 нм) 79 91 99.7 78

микропоры (менее 2 нм) 11 2 0 1

,0 ю о >К 3 а

ш

а. 200

1 юо о

О

О 03 0,4 0 В 0.8 1

Относительное давление (Р/РО)

Рис. 1. Изотермы сорбции-десорбции азота на сорбентах Strata-X (1), ССПС (2), УНМ Таунит (4) и Диасорб-100-С,6Т (3).

щелевидным. Как следует из табл. 2, все исследованные сорбенты заметно отличаются друг от друга и по 8УД, V,, и <!„.

Анализ полученных из изотерм дифференциальных кривых распределения объема пор по диаметрам (рис. 2) показал, что в образцах 81га1а-Х и Диасорб-100-С16Т присутствуют в основном мезопоры (на них приходится 91% и 99.7% от общего объема пор) диаметром около 15 и 7.5 нм соответственно.

В УНМ Таунит присутствуют мезопоры (78%) диаметром около 4 нм и макропоры (21%) разного диаметра. В ССПС, помимо мезо- (79%) и макропор (10%) диаметром около 50 нм, содержится много микропор (11%) с диаметром менее 2 нм.

Рис. 2. Распределение пор по размерам для сорбентов ССПС (а), Strata-X (б), Диасорб-100-С16Т (в) и УНМ Таунит (г).

Данные электронно-микроскопических исследований показали (рис. 3), что частицы ССПС и Э^а-Х имеют правильную сферическую форму и их диаметр составляет около 60 и 30 мкм соответственно. На микрофотографиях ССПС с большим увеличением видно, что ССПС имеет упорядоченную структуру из пористых агломератов полимерных цепей и транспортных пор диаметром 50 - 300 нм между ними. Напротив, у сорбента Бй^а-Х макропоры

ыщшшш

Рис. 3. Электронные микрофотофафии поверхности ССПС (а), 81га1а-Х (б) Диасорб-100-С,6Т (в) и УНМ Таунит (г).

отсутствуют, поверхность однородна и пронизана мезопорами размером около 15 нм. Частицы Диасорб-100-С16Т имеют вид гранул неправильной формы и разных размеров от 10 до 200 мкм. При большем увеличении видны мезопоры размером до 10 нм. Согласно данным производителя и электронной микроскопии, УНМ Таунит представляет собой одномерные наномасштабные нитевидные образования поликристаллического графита. Гранулы УНМ микрометрических размеров имеют структуру спутанных пучков многостенных трубок.

Сорбция в статических условиях. На выбранных сорбентах изучена сорбция метилксантинов в зависимости от времени контакта фаз, рН раствора и концентрации извлекаемых соединений. В качестве примера на рис. 4 приведены экспериментальные зависимости для кофеина. Для остальных метилксантинов они носят аналогичный характер. Установлено, что природа сорбента оказывает существенное влияние как на время установления сорбционного равновесия, так и на эффективность сорбции. Быстрее всего сорбционное равновесие устанавливается на сорбентах, в структуре которых содержатся макропоры: УНМ Таунит (10 мин) и ССПС (30 мин). Для сорбентов БИШ-Х и Диасорб-100-

Рис. 4. Зависимости степеней извлечения кофеина на ССПС (1), УНМ Таунит (2), вМа-Х (3) и Диасорб-100-С16Т (4) от времени контакта фаз (а), рН раствора (б) и концентрации кофеина (в), с = 1 х 10"4 М, V = 5 мл, шсор6 = 0.020 ± 0.001 г, рН ~ 6 (а, в).

СцзТ, в структуре которых макропоры отсутствуют, время установления сорбционного равновесия увеличивается до 60 мин. Характер зависимостей степеней извлечения от рН свидетельствует о том, что метилксантины сорбируются на всех изученных сорбентах в молекулярной форме; максимальная сорбция наблюдается в широком интервале рН 2 - 8. Начальные участки изотерм сорбции линейны до равновесных концентраций метилксантинов 0.3 мМ; в диапазоне 0.1 - 15 мМ равновесных концентраций изотермы описываются уравнением Ленгмюра.

Сопоставление степеней извлечения и коэффициентов распределения (табл. 3, рис. 5) показывает, что в целом сорбция метилксантинов растет по мере увеличения гидрофобности соединений в рядах: дипрофиллин, теобромин < теофиллин < кофеин < пентоксифиллин (ССПС и УНМ Таунит) и теобромин < дипрофиллин, теофиллин < кофеин < пентоксифиллин (БМа-Х и Диасорб 100-

С,6Т).

Таблица 3. Степени извлечения (Я, %) и коэффициенты распределения (ДО) метилксантинов на изученных сорбентах в статических условиях

Соединение ССПС Бй^а-Х Диасорб-100- с16т УНМ

Я, % ДО Я, % ДО Я % № Я,% ДО

Пентоксифиллин 97 ±2 3.9 95 ±6 3.7 80 ±4 3.0 90 ±3 3.4

Кофеин 94 ±3 3.6 70 ±2 2.8 36 ±3 2.1 81 ±6 3.0

Теофиллин 91 ±3 3.4 55 ±6 2.5 27 ±2 2.0 78 ±5 2.9

Теобромин 84 ±2 3.1 20 ±2 1.8 10± 1 1.4 66 ±6 2.7

Дипрофиллин 84 ±3 3.1 40 ±4 2.2 27 ± 1 2.0 61 ±5 2.6

Рис. 5. Значения степеней извлечения пентоксифиллина (1), кофеина (2), теофиллина (3), теобромина (4) и дипрофиллина (5) на сорбентах: ССПС, УНМ Таунит, вШИа-Х и Диасорб-100-С, 6Т. V = 5 мл, рН ~ 6, тсор6 = 0.020 ± 0.001 г, 1 = 60 мин.

Для всех метилксантинов, за исключением дипрофиллина,

наблюдается линейная зависимость -ДО (в скобках указаны значения коэффициентов корреляции, Я2): ССПС: ДО = 0.8 х ДО + 3.6 (0.9723); Лга/а-Х: ДО = 1.9 * ДО + 3.0 (0.9746); УНМ Таунит: ДО = 0.7 х ДО + + 3.1 (0.9811);

Диасорб-100-С,6Т. ДО = 1.5 * ДО + + 2.4 (0.9530).

Расположение и разный наклон этих зависимостей (рис. 6) указывают на то, что наряду с гидрофобными взаимодействиями, которые сильнее всего проявляются на сорбентах Зй^а-Х и Диасорб-100-С 16Т, при сорбции метилксантинов реализуются и специфические взаимодействия.

Уменьшение наклона линейных зависимостей в ряду 8(:га1а-Х > Диасорб-100-С16Т > ССПС > УНМ Таунит

косвенно указывает на то, что в этой последовательности вклад гидрофобных

взаимодействий нивелируется на фоне более сильных специфических: к-к-взаимодействий между сорбируемым соединением и матрицей сорбента и донорно-акцепторных взаимодействий между атомами кислорода и азота в составе метилксантинов и акцепторными фрагментами сорбентов.

Для подтверждения вклада специфических взаимодействий в сорбцию метилксантинов была изучена сорбция кофеина и пентоксифиллина на этих сорбентах из гексана, в котором гидрофобные взаимодействия отсутствуют (табл. 4).

Таблица 4. Степени извлечения (Я, %) пентоксифиллина и кофеина из гексана и воды в статических условиях (с = 1 * 10"" М, V = 5 мл, ш сос6 = 0.020 г, I = 120мин)

Сорбент Я, %

Пентоксифиллин Ко<] >еин

Гексан Вода Гексан Вода

ССПС 92 97 96 94

81ха1а-Х 57 95 31 70

Диасорб-100-С16Т 97 80 86 36

УНМ Таунит 96 90 94 81

Полученные результаты подтвердили, что гидрофобные взаимодействия сильнее всего проявляются при сорбции метилксантинов на 81га1а-Х: из гексана пентоксифиллин и кофеин сорбируются заметно хуже, чем из воды. Значения степеней извлечения пентоксифиллина и кофеина на ССПС оказались примерно одинаковыми и высокими, что, по-видимому, связано с уникальной способностью жесткой ажурной полимерной сетки сверхсшитого полистирола практически одинаково набухать как в воде, так и в неполярных органических растворителях. В случае Диасорба-100-С|6Т и УНМ Таунит оба метилксантина лучше сорбируются из гексана, чем из воды, что, вероятно, связано с активацией поверхности этих сорбентов выбранным растворителем.

Для выяснения вклада в сорбцию остаточных силанольных групп поверхности химически модифицированных кремнеземов (ХМК) проведено сопоставление сорбционного поведения метилксантинов на Диасорбе ЮО-СнГГ, дополнительно силанизированном триметилхлорсиланом, и Диасорбе 100-С16, содержащем остаточные силанольные группы. Из данных, приведенных в табл. 5, видно, что все метилксантины из водных растворов сорбируются на этих двух сорбентах одинаково. На примере Диасорбов серии Т с привитыми гексадецильными (100-С16Т), октальными (100-С8Т) и метальными (100-С,Т) группами изучено влияние на сорбцию длины алкильного радикала. Характер зависимостей сорбции от длины алкильного радикала ХМК, с одной стороны, и от гидрофобности молекул метилксантинов, с другой (табл. 5), указывает на то,

Рис. 6. Зависимости логарифмов коэффициентов распределения метилксантинов (^Р) на ССПС (1), УНМ Таунит (2), 81га1а-Х (3) и Диасорб-100-С16Т (4) от 1ЙР.

что основной вклад при сорбции метилксантинов из воды на ХМК вносят гидрофобные взаимодействия. Сорбция метилксантинов возрастает по мере увеличения длины алкильного радикала, а максимальным сродством ко всем изученным ХМК среди метилксантинов обладает наиболее гидрофобный пентоксифиллин.

Таблица 5. Степени извлечения (И, %) и коэффициенты распределения (^Б) метилксантинов на ХМК в статических условиях (с = 1 х 10"4 М, рН ~ 6, V = 5 мл, ш сор6 = 0.020 ± 0.001 г, I = 60 мин, п = 3, Р = 0.95)_1_

Соединение 100-С16 100-С16Т 100-С8Т 100-С,Т

Е1,% № Я,% № Я, % № II, % №

Пентоксифиллин 83 ±2 3.1 80 ±4 3.0 79 ± 3 3.0 46 ±2 2.3

Кофеин 32 ±2 2.1 36± 3 2.1 22 ± 1 1.8 5 ± 1 1.1

Теофиллин 25 ± 1 1.9 27 ±2 2.0 11± 1 1.5 2 ± 1 0.7

Теобромин 17 ± 1 1.7 10 ± 1 1.4 7 ± 1 1.3 3 ± 1 0.8

Сорбция в динамических условиях. На картриджах, заполненных 30 мг сорбентов, изучена сорбция метилксантинов в динамическом режиме (табл. 6). Из сравнения данных видно, что на ССПС и Бй^а-Х все метилксантины сорбируются и десорбируются метанолом (одним из лучшим из изученных

Таблица 6. Степени извлечения метилксантинов (Ясорб, %) на картриджах, заполненных 30 мг сорбентов, и степени их десорбции (Ядес, %) 0.5 и 1 мл метанола (с = 1 х 10"4 М, V = 5 мл, Ц = 2 мл/мин, п = 3, Р = 0.95)__

Сорбент Ксорб и р Пентоксифиллин Кофеин Теофиллин Теобромин Дипро-филлин

ССПС К<Орб. % 100 ± 1 100 ± 1 100 ± 1 100 ± 1 100 ± 1

Кдес0.5> % 62 ±5 71 ±5 96 ±4 95 ±5 96 ±4

РдесЬ % 92 ±6 95 ±4 100 ±4 100 ±5 100 ±3

БШИа-Х Рсорб> % 100 ± 1 100 ±1 100 ± 1 100 ± 1 100 ± 1

Кдес0.5> % 96 ±6 97 ±3 94 ±3 93 ±5 98 ±4

Кдес1> % 98 ±4 100 ±3 97 ±4 96 ±5 100 ±3

Диасорб-100-С16Т Рсорб> % 92 ±5 95 ±6 66 ±6 47 ±5 78 ±5

Кдес0.5> % 95 ±5 91 ±4 92 ±6 91 ±4 95 ±4

РдесЬ % 97 ± 4 95 ±5 97 ±3 95 ±5 99 ± 3

УНМ Таунит РСОрб5 % 95 ±4 86 ±2 84 ±2 82 ± 3 79 ±4

Рдсс0 51 % 11 ±3 30± 5 22 ±4 19± 3 36 ±4

РдссЬ % 18 ± 4 44 ±5 31 ±5 27 ±4 48 ±4

элюентов) количественно. Степени извлечения метилксантинов на УНМ Таунит высоки, но с этого сорбента метилксантины десорбируются 1 мл метанола всего на 18-48 %. При увеличении объема элюента до 5 мл десорбция возрастает до 75 - 89 %. На Диасорбе 100-С,ЙТ количественно сорбируются лишь кофеин и пентоксифиллин, тогда как другие метилксантины извлекаются в значительно меньшей степени.

Установлено, что на микроколонке, заполненной 0.055 г ССПС, все метилксантины сорбируются на 97 - 100% (V = 25 мл, U = 0.7 мл/мин). На примере кофеина показано, что степень извлечения изменяется незначительно и составляет 95 ± 4% при увеличении объема анализируемой пробы до 100 мл. При осуществлении десорбции в противотоке метилксантины количественно элюируются с микроколонки 1 мл метанола, 1 мл смеси этанол-вода (1:1), 1.5 мл смеси метанол-вода (1:1) или 5 мл смеси ацетонитрил-вода (1:1).

Определение метилксантинов методом обращено-фазовой ВЭЖХ

Оптимизированы условия хроматографического определения и разделения метилксантинов: неподвижная фаза - Luna 5u С18, подвижная фаза -ацетонитрил - вода - Н3Р04 (табл. 7), скорость потока подвижной фазы -0.5 мл/мин, X = 280 нм.

Таблица 7. Выбор подвижной фазы для разделения смесей метилксантинов

№ Смесь метилксанинов Элюент Время анализа

1 Теобромин, теофиллин, кофеин Ацетонитрил - 0.1%-ный водный раствор Н3Р04 (10 : 90, рН 3.5) 10 мин

2 Теобромин, дипрофиллин, кофеин Ацетонитрил - 0.1%-ный водный раствор Н3РО4 (10 : 90, рН 3.5) 10 мин

3 Теобромин, теофиллин, кофеин, пентоксифиллин Ацетонитрил - 0.1%-ный водный раствор Н3РО4 (Ю : 90, рН 3.5) 55 мин

4 Теобромин, теофиллин, дипрофиллин, кофеин Ацетонитрил - 0.1%-ный водный раствор Н3РО4 (5 : 95, рН 3.5) 25 мин

5 Пентоксифиллин Ацетонитрил - 0.1%-ный водный раствор Н3РО4 (30 : 70, рН 3.5) 5 мин

На рис. 7 приведены хроматограммы разделения модельных смесей метилксантинов. Характеристики методик определения соединений приведены в табл. 8. Методика применена для анализа различных образцов чая (табл. 9).

С применением ССПС разработана методика группового сорбционного концентрирования метилксантинов из водных растворов и их последующего хроматографического определения. Концентрирование метилксантинов проводили в динамическом режиме на микроколонке (25x2.7 мм), заполненной 0.055 г ССПС. Скорость пропускания раствора через колонку поддерживали постоянной и равной 0.7 мл/мин. Объем анализируемой пробы варьировали от 25 до 100 мл. Элюирование проводили метанолом в противоточном режиме. Перед элюированием, колонку промывали 1 мл дистиллированной воды. Установлено, что при пропускании через колонку 0.5 мл метанола метилксантины десорбируются на 85 - 90%, а увеличение объема элюента до

а)

0280ну 2

4-

А

б)

5 4 ' » ' I» П 11 Ú »«и Ó : I 4 6 I 10 li ú l't l'| 20 В 14 2Í И „„„

Рис. 7. Хроматограммы разделения модельных смесей метилксантинов на колонке Luna 5u С18. Элюент: а) ацетонитрил - 0.1 %-ный водный раствор Н3Р04 (10 : 90; рН 3.5), с = 0.01мМ, б) ацетонитрил - 0.1%-ный водный раствор Н3Р04 (5 : 95; рН 3.5), с = 0.1мМ. Скорость потока 0.5 мл/мин. 1 - теобромин, 2 -теофиллин, 3 - дипрофиллин, 4 - кофеин.

Таблица 8. Характеристика методик определения метилксантинов методом ВЭЖХ без (I) и после концентрирования (II) из 25 мл на микроколонке,

Определяемый компонент Диапазон определяемых содержаний, мкг/мл Cmin> мкг/мл

I II I II

Дипрофиллин 0.2 - 50 0.005 - 1 0.06 0.002

Теобромин 0.09-50 0.003 - 1 0.03 0.001

Теофиллин 0.1 -50 0.004 -1 0.04 0.001

Кофеин 0.2-50 0.006 -1 0.07 0.002

Пентоксифиллин 0.4-50 0.03 -1 0.1 0.004

Таблица 9. Результаты определения кофеина и теобромина в различных

Образец чая Содержание кофеина, г/100г sr Содержание теобромина, г/100г Sr

Чай черный крупнолистовой «Riston» 4.48 ± 0.08 0.02 0.406 ± 0.009 0.02

Чай зеленый цейлонский «Хэйлис» 3.0 ±0.1 0.04 0.25 ± 0.02 0.06

Чай черный «Золотые реснички» 4.01 ±0.08 0.02 0.227 ± 0.006 0.03

Чай зеленый китайский Оолонг 2.45 ± 0.07 0.03 0.039 ±0.001 0.04

Чай черный «Lipton» в пакетиках 2.7 ±0.1 0.04 0.16±0.01 0.06

Чай черный Greenfield «Golden Ceylon» в пакетиках 3.5 ±0.1 0.03 0.26 ±0.01 0.06

Холодный чай «Nestea» 67 ± 2 мг/л 0.04 6.0 ±0.7 мг/л 0.12

1 мл позволяет десорбировать эти соединения количественно. Характеристики методик определения соединений с предварительным сорбционным концентрированием приведены в табл. 8. Методика применена для анализа модельного раствора, приготовленного на основе мочи (табл. 10). Хроматограмма модельной смеси метилксантинов после концентрирования из 25 мл раствора мочи приведена на рис.8.

На примере модельной смеси, приготовленной на основе речной воды (р. Москва), показана принципиальная возможность определения кофеина в природных водах методом ВЭЖХ после его динамического сорбционного концентрирования на микроколонке, заполненной 0.055 г ССПС. Правильность определения кофеина подтверждена методом «введено - найдено». При определении 2.0 мкг/л кофеина найдено 2.1 ± 0.4 мкг/л кофеина (V = 250 мл, s, = 0.07, п = 3, Р = 0.95).

Таблица 10. Результаты определения метилксантинов в модельных растворах, приготовленных на основе мочи

(рН ~ 6, U = 0.7 мл/мин, V = 25 мл, m Сспс = 0-055 г, п = 3, Р = 0.95)

Соединение Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл Sr

Теобромин 0 0.7 ±0.2 0.08

3.60 4.3 ± 0.3 0.03

Теофиллин 0 0 -

3.60 3.8 ±0.6 0.06

Кофеин 0 0 -

3.90 4.1 ±0.4 0.04

Дипрофиллин 0 0 -

5.10 5.3 ±0.8 0.06

Пентоксифиллин 0 0 -

5.60 5.6 ± 0.7 0.05

шли

25-

wLJ,

о 1 2[ > 4 5 6 7 8 9 10 П 12 13 14 15 16 17 18 мин

Рис. 8. Хроматограмма разделения модельной смеси, полученной после концентрирования соединений на ССПС из 25 мл раствора мочи. 1 - теобромин; 2 - теофиллин; 3 - кофеин. Концентрация каждого компонента в моче составляла 0.02 мМ. Элюент ацетонитрил - 0.1%-ный водный раствор Н3Р04 (7 : 93; рН 3.5).

Спектрофотометрическое определение метилксантинов

В качестве реагента для спектрофотометрнческого определения метилксантинов предложено использовать тетрафторборат 4-нитрофенилдиазония (4-НФД). Установлено, что продукты щелочного гидролиза метилксантинов вступают во взаимодействие с 4-НФД с образованием интенсивно окрашенных соединений в соответствии со схемой, приведенной ниже для теофиллина:

Хх> Л> - ¿хка

СН3 Н Н МОг

При оптимизации условий щелочного гидролиза и проведения спектрофотометрической реакции варьировали температуру, время, концентрации 4-НФД и уксусной кислоты (табл. 11). Установлено, что легче всего гидролиз протекает в случае кофеина и дипрофиллина (30 мин при комнатной температуре). Щелочной гидролиз пентоксифиллина частично протекает при комнатной температуре, однако нагревание на водяной бане в 1.5 раза повышает выход его азопроизводного. Напротив, щелочной гидролиз теофиллина протекает только при нагревании на водяной бане. Для интенсификации щелочного гидролиза теофиллина предложено использовать нагревание в УЗ-ванне при 60° С, при котором в 2 раза повышается выход азопроизводного теофиллина по сравнению с нагреванием при 60° С на водяной бане. Теобромин не вступает в реакцию щелочного гидролиза вследствие депротонирования в щелочной среде имидного атома азота. Для перевода азопроизводных метилксантинов в таугомерные формы, максимум поглощения которых находится в видимой области спектра, предложено после проведения реакции азосочетания вводить в систему уксусную кислоту (рис. 9).

Рис. 9. Спектры поглощения азопроизводных теофиллина (а) и кофеина (б) без (1) и после добавления (2) уксусной кислоты. 1 - скон = 1.27 М; 2 - рН ~ 6 (введено 5.2 МСНзСООН), сто =ск= 1.0 х Ю"4 М, С4.нфд=3.75х Ю"5М.

Таблица 11. Оптимальные условия проведения щелочного гидролиза и реакции азосочетания метилксантинов с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония_

Соединение Оптимальные условия щелочного гидролиза Оптимальные условия азосочетания ^шах» НМ

УЗ Т,°С t, мин Сснзсоон. М С 4-НФД' М

Пентоксифиллин есть 60 30 5.2 2.0 х Ю-4 380

Кофеин нет 25 30 5.2 1.5 х 10"4 375

Теофиллин есть 60 30 5.2 3.75 х 10"5 500

Теофиллин нет 60 30 5.2 3.75 х 10"5 500

Дипрофиллин нет 25 30 5.2 2.0 х Ю"4 380

Различие в условиях проведения щелочного гидролиза и спектральных характеристиках образующихся азосоединений, а также тот факт, что в реакцию щелочного гидролиза не вступает теобромин, позволяют предложить несколько схем спектрофотометрического определения этих соединений. Прежде всего, очевидно, что с помощью 4-НФД можно проводить спектрофотометрическое определение пентоксифиллина, кофеина, теофиллина и дипрофиллина в присутствии теобромина. Во-вторых, поскольку в отличие от теофиллина щелочной гидролиз кофеина и дипрофиллина в заметной степени протекает при комнатной температуре, возможно определение этих метилксантинов в присутствии теофиллина. И, наконец, различия в спектрах поглощения азопроизводных теофиллина, кофеина, дипрофиллина и пентоксифиллина (АХ ~ 125 нм) указывают на возможность определения теофиллина в присутствии этих метилксантинов.

Проведенные исследования послужили основой разработки методик спектрофотометрического определения метилксантинов без и с сорбционным концентрированием на ССПС. Спектрофотометрическая методика определения включала проведение щелочного гидролиза метилксантинов, реакцию азосочетания продуктов щелочного гидролиза с 4-НФД и измерение оптической плотности растворов в максимумах поглощения азопроизводных.

Сорбционно-спектрофотометрическая методика с сорбционным концентрированием на ССПС или Strata-X включала сорбцию исследуемых веществ на микроколонке, заполненной ССПС, или картридже Strata-X, десорбцию их смесью этанол-вода (метанол), проведение щелочного гидролиза и реакции азосочетания продуктов щелочного гидролиза с 4-НФД и измерение оптической плотности в максимумах поглощения. Характеристики спектрофотометрической методики определения метилксантинов без и с предварительным сорбционным концентрированием на ССПС приведены в табл. 12.

Для оценки возможности практического применения методики проведено определение пентоксифиллина, кофеина и теофиллина в лекарственных препаратах «Пентоксифиллин», «Кофеин-бензоат натрия» и «Эуфиллин» соответственно (табл. 13). Полученные результаты согласуются с данными, заявленными производителями.

Спектрофотометрическая методика определения кофеина в сочетании с сорбционным выделением этого соединения на картирдже Strata-X применена для анализа напитка «Кока-кола» (The Coca-Cola Company). Применение картриджа, заполненного 30 мг сорбента Strata-X, позволило выделить кофеин и

удалить мешающие компоненты напитка. Найденное содержание кофеина в напитке (0.55 ± 0.09 мМ, вг= 0.07, п = 3, Р = 0.95) согласуется с результатами хроматографического определения (0.51 ±0.05 мМ, бг = 0.02) и данными производителя (среднее содержание кофеина - 0.493 мМ).

Таблица 12. Характеристики спектрофотометрических методик определения метилксантинов без (I) и с концентрированием (II) из 25 мл на колонке, заполненной ССПС (рН ~ 6, Ц = 0.7 мл/мин, т ССПс = 0-055 г)_

Определяемый компонент Диапазон определяемых содержаний, М (мкг/мл) М (мкг/мл)

I II I II

Дипрофиллин 0.3 х 10"5 — 0.7 х 10"4 (0.7 -19) - 0.9 х Ю-6 (0.2) -

Теофиллин 5.4 х Ю"6- 1.2 х Ю"4 (1-22) 2.2 х Ю-6-5.1 х Ю"5 (0.4-9.2) 1.8 х Ю'6 (0.30) 6 X 10"7 (0.1)

Кофеин 1.8 х 10"5 — 2.5 х 10"4 (3.6-48) 0.9 х Ю-5-1.0 хЮ"4 (1.8-19.5) 0.6 х Ю"5 (1.20) 3 х Ю"6 (0.6)

Пентоксифиллин 1.2 х 10°-2.5 х Ю"4 (3.3-70) - 0.4 х Ю"5 (1)

Таблица 13. Результаты определения пентоксифиллина, кофеина и теофиллина в лекарственных препаратах «Пентоксифиллин», «Кофеин-бензоат натрия» и «Эуфиллин» (п = 3, Р = 0.95) _

Лекарственный препарат Определяемое соединение Содержание в ампуле, мг/мл

По данным производителя Найдено

«Пентоксифиллин» Пентоксифиллин 20 21 ± 1

«Кофеин-бензоат натрия» Кофеин 76-80 76 ± 10

«Эуфиллин» Теофиллин 179.35 180 ± 10

выводы

1. С целью расширения ассортимента сорбентов, пригодных для сорбционного концентрирования метилксантинов, в статическом и динамическом режимах систематически изучена их сорбция на разных по природе сорбентах: сверхсшитом полистироле MN-200, поверхностно-модифицированном сополимере стирола и дивинилбензола Strata-X, углеродном наноматериале Таунит и Диасорбах (100-Ci6, 100-С,Т, 100-С8Т, 100-С16Т).

2. Изучены структурные характеристики и морфология поверхности сорбентов. Показано, что в образцах Strata-X и Диасорб-ЮО-С^Т присутствуют в основном мезопоры диаметром около 15 и 7.5 нм соответственно. В УНМ Таунит присутствуют мезопоры диаметром около 4 нм и макропоры разного диаметра. В ССПС, помимо мезо- и макропор диаметром около 50 нм, содержится много микропор с диаметром меньше 2 нм.

3. Даны объяснения особенностей сорбции метилксантинов в зависимости от кислотности раствора, природы и концентрации соединений, природы растворителя и структурных характеристик сорбентов. Высказаны предположения о характере межмолекулярных взаимодействий сорбент-сорбат.

4. Предложены способы динамического сорбционного концентрирования метилксантинов. Показано, что сверхсшитый полистирол можно использовать для группового концентрирования этих соединений.

5. Выбраны условия разделения и определения метилксантинов методом ОФ ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором. Разработана методика динамического концентрирования метилксантинов на микроколонке, заполненной сверхсшитым полистиролом, с последующим определением соединений в элюате методом ВЭЖХ. Проведено определение метилксантинов в различных образцах чая, моче и речной воде.

6. В качестве реагента для спектрофотометрического определения метилксантинов предложен тетрафторборат 4-нитрофенилдиазония. Показано, что продукты щелочного гидролиза метилксантинов вступают в реакцию азосочетания с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония. Оптимизированы условия проведения щелочного гидролиза и спектрофотометрической реакции. Проведено определение пентоксифиллина, кофеина и теофиллина в лекарственных препаратах «Пентоксифиллин», «Кофеин-бензоат натрия» и «Эуфиллин». Показана возможность спектрофотометрического определения кофеина в напитках после удаления мешающих компонентов с помощью картриджа, заполненного сорбентом Strata-X.

Автор выражает благодарность акад. Ю.А. Золотову за постоянное внимание к работе; к.х.н., доц. E.H. Шаповаловой и к.х.н. В.В. Апяри за помощь в работе.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Андреева Е.Ю., Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А. Спектрофотометрическое определение кофеина и теофиллина по реакции азосочетания с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. Т. 76. № 2. С. 21 - 23.

2. Андреева Е.Ю., Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А. Сорбция кофеина и теофиллина на сверхсшитом полистироле. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2 Химия. 2010.Т.51. № 1. С. 48 - 52.

3. Андреева Е.Ю., Тан Цзянань, Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А. Определение кофеина, теобромина и теофиллина в чае методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. Т. 10. № 6 С 805 -812.

4. Андреева Е.Ю. Спектрофотометрическое определение кофеина и теофиллина с предварительным концентрированием на сверхсшитом полистироле. / Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Химия», Москва, 8-11 апреля 2008. С. 10.

5. Андреева Е.Ю., Перистый A.A., Дмитриенко С.Г. Концентрирование кофеина на сверхсшитом полистироле и его спектрофотометрическое определение. / Тез. докладов Всероссийской конференции «Химический анализ», Москва - Клязьма, 21-25 апреля 2008. С. 37.

6. Андреева Е.Ю., Дмитриенко С.Г. Применение сверхсшитого полистирола для сорбционного концентрирования метилксантинов. / Материалы III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием, Краснодар, 27 сентября - 3 октября 2009 С. 160.

7. Андреева Е.Ю., Тан Цзянань, Шаповалова E.H., Дмитриенко С.Г. Разделение и определение метилксантинов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. / Тез. докладов Съезда аналитиков России, Москва - Клязьма, 26 -30 апреля 2010. С. 25.

8. Андреева Е.Ю., Тан Цзянань, Дмитриенко С.Г. Сорбционное концентрирвание метилксантинов на сверхсшитом полистироле и их последующее хроматографическое определение. / Тез. докладов Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар, 26 сентября - 1 октября 2010 С. 70.

9. Andreeva E.Yu., Jianan Tang, Dmitrienko S.G. Application of solid-phase extraction on hypercrosslinked polystyrene to determination of methylxanthines in urine by HPLC. / 36th International Symposium on Environmental Analytical Chemistry, Rome, Italy, 5-9 October 2010. P. 96.

Подписано в печать 13.09.2011 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1137 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава 1. Методы выделения, концентрирования и определения метил ксантинов

1.1. Общие сведения

1.2. Методы выделения и концентрирования

1.2.1. Жидкостная экстракция из твердых матриц

1.2.2. Жидкость-жидкостная экстракция

1.2.3. Сверхкритическая флюидная экстракция

1.2.4. Твердофазная экстракция и другие сорбционные методы

1.3. Методы определения метилксантинов

1.3.1. Определение в растениях, продуктах питания и напитках

1.3.2. Определение в лекарственных препаратах

1.3.3. Определение в биологических жидкостях и других биологических объектах

1.3.4. Определение в объектах окружающей среды

1.4. Формулирование задач исследования 36 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Объекты исследования, аппаратура и методика эксперимента

2.1. Исходные вещества и реагенты

2.2. Аппаратура и методика эксперимента

2.3. Спектрофотометрическое определение метилксантинов по их собственному поглощению в УФ области

Глава 3. Структурные характеристики сорбентов и особенности сорбции метилксантинов на их поверхностях

3.1. Изучение структурных характеристик сорбентов

3.1.1. Удельная поверхность и пористость

3.1.2. Данные электронной микроскопии

3.2. Сорбция метилксантинов в статических условиях

3.2.1. Влияние времени контакта фаз

3.2.2. Влияние рН водной фазы

3.2.3. Влияние строения метилксантинов

3.2.4. Сравнение сорбционного поведения метилксантинов на различных сорбентах

3.3. Сорбция метилксантинов в динамическом режиме

3.4. Резюме к главе

Глава 4. Концентрирование и определение метилксантинов методом ВЭЖХ

4.1. Выбор условий разделения метилксантинов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ

4.2. Определение метилксантинов в реальных объектах методом ВЭЖХ 85 4.2.1. Определение кофеина и теобромина в чае 87 4:2.2. Определение дипрофиллина в смеси, моделирующей лекарственненные препараты

4.2.3. Определение метилксантинов в моче

4.2.4. Определение кофеина в речной воде

4.3. Резюме к главе

Глава 5. Концентрирование и определение метилксантинов спектрофотометрическим методом

5.1. Спектрофотометрическое определение метилксантинов по реакции азосочетания с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония

5.2.1. Выбор оптимальных условий проведения щелочного гидролиза

5.2.2. Выбор оптимальных условий проведения реакции азосочетания

5.2.Спектрофотометрическое определение метилксантинов

5.2.1. Построение градуировочных зависимостей

5.2.2. Возможности определения метилксантинов при совместном присутствии

5.2.3. Определение кофеина, теофиллина и пентоксифиллина в лекарственных препаратах

5.2.4. Определение кофеина и теофиллина после сорбционного концентрирования на сверхсшитом полистироле

5.2.5. Спектрофотометрическое определение кофеина в напитках после сорбционного выделения на сорбенте Strata-X

Актуальность работы. Метилксантины, важнейшими представителями которых являются кофеин, теофиллин и теобромин, широко распространены в природе и играют важную роль в биологических процессах. Интерес, проявляемый в последние пятнадцать лет к разработке методов определения метилксантинов в различных объектах, объясняется важностью этих соединений для пищевой промышленности, фармакологии, клинической и спортивной медицины, токсикологии, экологического контроля. Кофеин, теофиллин и теобромин часто определяют в продуктах питания, таких как кофе, чай, шоколад, различных тонизирующих напитках. Анализ биологических жидкостей на содержание метилксантинов проводят с целью оценки эффективности терапевтического лечения этими препаратами, поскольку диапазон между лечебной и токсической концентраций для них достаточно узок. Например, теофиллин оказывает лечебный эффект при содержании его в сыворотке крови 10-20 мкг/мл, а уже при его концентрации свыше 20 мкг/мл начинает оказывать токсическое воздействие. Международный олимпийский комитет считает, что спортсмен употребляет стимулятор, если концентрация кофеина в моче больше 12 мкг/мл, а его основного метаболита теофиллина - 5 мкг/мл. Информация о концентрациях метаболитов кофеина и других метилксантинов в организме человека — важное звено в построении метаболомических профилей, позволяющих обнаружить врожденные и наследственные нарушения метаболизма и более точно диагностировать диабет, патологии печени и ряд других заболеваний. Очень важно определять низкие содержания кофеина и в водах, поскольку он является своеобразным индикатором, позволяющим следить за качеством коммунально-бытовых сточных вод.

Достоверность идентификации метилксантинов и правильность полученных количественных результатов во многом зависит от выбора метода пробоподготовки и рационального сочетания его с методом последующего определения. Сложная проблема, с которой часто сталкиваются в процессе пробоподготовки объектов, содержащих метилксантины, связана с высокой гидрофильностью этих соединений (1^Р = -1.1 0.3), вследствие чего эффективность концентрирования оказывается невысокой. Среди различных методов, предложенных в последнее время для выделения и концентрирования метилксантинов, наиболее перспективной является твердофазная экстракция (ТФЭ), однако большинство опубликованных работ ориентировано на решение чисто прикладных задач, а круг используемых сорбентов невелик и ограничивается в основном силикагелями, модифицированными гидрофобными алкильными группами. Для обоснованного выбора сорбентов для ТФЭ таких полярных соединений как метилксантины необходимы количественные данные, характеризующие сорбционный процесс, которые практически отсутствуют. В связи с этим представляется актуальным как расширение круга сорбентов, позволяющих количественно выделять и концентрировать метилксантины, так и поиск новых комбинаций сочетания сорбционного концентрирования этих соединений и их последующего определения.

Цель работы состояла в систематическом изучении сорбции метилксантинов на сорбентах различной природы и разработке методик сорбционного выделения и концентрирования этих соединений для' их последующего определения в элюате методом обращенно-фазовой ВЭЖХ или спектрофотометрии.

Для достижения поставленной цели было необходимо:

• систематически исследовать сорбцию метилксантинов на сверхсшитом полистироле МЫ-200 (ССПС), поверхностно-модифицированном сополимере стирола и дивинилбензола Бй^а-Х, наноуглеродном материале (УНМ) Таунит и Диасорбах (100-С16, ЮО-С1Т, ЮО-СвТ, ЮО-С^Т) в зависимости от условий извлечения и природы сорбатов; выявить факторы, влияющие на величину коэффициентов распределения; сравнить сорбенты по сорбционной способности и выбрать наиболее эффективный; выбрать условия сорбционного концентрирования метилксантинов в динамическом режиме;

• оптимизировать условия разделения и определения метилксантинов методом ОФ ВЭЖХ; изучить возможность сочетания группового сорбционного концентрирования метилксантинов с последующим определением индивидуальных соединений в элюате методом ВЭЖХ;

• оптимизировать условия щелочного гидролиза метилксантинов и разработать методики их спектрофотометрического определения по реакции с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония;

• разработать методики определения метилксантинов в различных объектах: чае, напитках, лекарственных препаратах, речной воде и моче.

Научная новизна. Выявлены особенности сорбционного поведения метилксантинов на различных по природе сорбентах: ССПС, Бй^а-Х, наноуглеродном материале Таунит и Диасорбах (ЮО-С16, ЮО-С1Т, 100-С8Т, 100-С16Т). Оценено влияние рН водного раствора, природы сорбента и строения метилксантинов на их распределение. Установлены взаимосвязи между коэффициентами распределения и гидрофобностью сорбатов. Обсуждена роль различных типов межмолекулярных взаимодействий в сорбции исследованных веществ. Реализовано сочетание сорбционного концентрирования метилксантинов на ССПС с их определением в элюате методом ОФ ВЭЖХ. Обнаружено, что продукты щелочного гидролиза метилксантинов вступают в реакцию азосочетания с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония.

Практическая значимость работы. Продемонстрированы возможности использования изученных сорбентов для сорбционного концентрирования метилксантинов из водных растворов, выбраны условия концентрирования. Разработана методика хроматографического разделения и определения метилксантинов, включающая их сорбционное концентрирование на микроколонке, заполненной ССПС, десорбцию метанолом и раздельное хроматографическое определение со спектрофотометрическим детектированием. Разработаны спектрофотометрические методики определения метиксантинов в виде их окрашенных 4-нитрофенилазопроизводных. Методики апробированы при анализе модельных водных растворов, напитков, лекарственных препаратов, мочи и речной воды.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследования структурных характеристик сорбентов.

2. Результаты исследования и выявленные особенности сорбции метилксантинов на сорбентах различной природы; интерпретация взаимосвязи коэффициентов распределения со строением и свойствами сорбента и сорбируемого соединения; обоснование возможности использования сверхсшитого полистирола для группового сорбционного концентрирования метилксантинов.

3. Методики сорбционного концентрирования и определения метилксантинов методами ОФ ВЭЖХ.

4. Методики спектрофотометрического определения метилксантинов по реакции с тетрафторборатом 4-нитрофенготдиазония.

5. Результаты определения метилксантинов в лекарственных препаратах, напитках, моче и речной воде.

Апробация работы. Основные результаты доложены на XV Международной конференции студентов, аспирантов? и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Всероссийской конференции «Химический; анализ» (Москва-Клязьма, 2008), III Всероссийской конференции. «Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2009); Съезде: аналитиков России. (Москва-Клязьма, 2010), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар« 2010); 36th International Symposium on Environmental Analytical Chemistry (Rome, Italy, 2010);

Публикации. IIo материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов докладов.*

Основное содержание диссертации изложено в; следующих работах:

1. Андреева Е.Ю., Дмитриенко С.Е., Золотов Ю.А. Спектрофотометрическое: определение кофеина, и теофиллина по реакции азосочетания с тетрафторборатом- 4-нитрофенилдиазония. // Заводская лаборатория: Диагностика материалов; 2010. Т. 76; № 2. С. 21-23.

2. Андреева Е.Ю., Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А. Сорбция кофеина и теофиллина на сверхсшитом полистироле. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2010:Т.51. № 1. С. 48 - 52.

3. Андреева Е.Ю., Тан Цзянань, Дмитриенко C.F., Золотов Ю.А. Определение кофеина, теобромина и теофиллина в чае методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. Т. 10. № 6. С. 805 - 812.

4. Андреева Е.Ю. Спектрофотометрическое определение кофеина и теофиллина с предварительным концентрированием на сверхсшитом полистироле. / Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Химия», Москва, 8-11 апреля 2008. С. 10.

5. Андреева Е.Ю., Перистый А.А., Дмитриенко С.Г. Концентрирование кофеина на сверхсшитом полистироле и его спектрофотометрическое определение. / Тез. докладов Всероссийской конференции «Химический анализ», Москва — Клязьма, 21 - 25 апреля 2008. С. 37.

6. Андреева Е.Ю., Дмитриенко С.Г. Применение сверхсшитого полистирола для сорбционного концентрирования метилксантинов. / Материалы III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием, Краснодар, 27 сентября - 3 октября 2009. С. 160.

7. Андреева Е.Ю., Тан Цзянань, Шаповалова Е.Н., Дмитриенко С.Г. Разделение и определение метилксантинов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. / Тез. докладов Съезда аналитиков России, Москва - Клязьма, 26 - 30 апреля 2010. С. 25.

8. Андреева Е.Ю., Тан Цзянань, Дмитриенко С.Г. Сорбционное концентрирвание метилксантинов на сверхсшитом полистироле и их последующее хроматографическое определение. / Тез. докладов Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар, 26 сентября - 1 октября 2010. С. 70.

9. Andreeva. E.Yu., Jianan Tang, Dmitrienko S.G. Application of solid-phase extraction on hypercrosslinked polystyrene to determination of methylxanthines in urine by HPLC. / 36th International Symposium on Environmental Analytical Chemistry, Rome, Italy, 5-9 October 2010. P. 96.

ЛИТЕРАТУРНЫМ ОБЗОР

выводы

1. С целью расширения ассортимента сорбентов, пригодных для сорбционного концентрирования метилксантинов, в статическом и динамическом режимах систематически изучена их сорбция на разных по природе сорбентах: сверхсшитом полистироле М1Ч-200, поверхностно-модифицированном сополимере стирола и дивинилбензола 81га1а-Х, углеродном наноматериале Таунит и Диасорбах (100-С16, ЮО-С^Т, 100-С8Т, ШО-С^Т).

2. Изучены структурные характеристики и морфология поверхности сорбентов. Показано, что в образцах 8^а1а-Х и Диасорб-ЮО-С^Т присутствуют в основном мезопоры диаметром около 15 и 7.5 нм соответственно. В- УНМ Таунит присутствуют мезопоры диаметром около 4 нм и макропоры разного диаметра. В ССПС, помимо мезо- и макропор диаметром около 50 нм, содержится много микропор с диаметром меньше 2 нм.

3. Даны объяснения-особенностей сорбции^ метилксантинов в зависимости от кислотности раствора, природы и концентрации соединений, природы растворителя и структурных характеристик сорбентов. Высказаны предположения о характере межмолекулярных взаимодействий сорбент-сорбат.

4. Предложены способы динамического сорбционного концентрирования г метилксантинов. Показано, что сверхсшитый полистирол можно использовать для группового концентрирования этих соединений.

5. Выбраны условия разделения и определения метилксантинов методом ОФ ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором. Разработана методика динамического концентрирования метилксантинов на микроколонке, заполненной сверхсшитым полистиролом, с последующим определением соединений в элюате методом ВЭЖХ. Проведено определение метилксантинов в различных образцах чая, моче и речной воде.

6. В. качестве реагента для спектрофотометрического определения метилксантинов предложен тетрафторборат 4-нитрофенилдиазония. Показано, что продукты щелочного гидролиза метилксантинов вступают в реакцию азосочетания с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония. Оптимизированы условия проведения щелочного гидролиза и спектрофотометрической реакции.

Проведено определение пентоксифиллина, кофеина и теофиллина в лекарственных препаратах «Пентоксифиллин», «Кофеин-бензоат натрия» и «Эуфиллин». Показана возможность спектрофотометрического определения кофеина в напитках после удаления мешающих компонентов с помощью картриджа, заполненного сорбентом 81та1а-Х.

1. Ashihara Н., Sano Н., Crozier A. Review. Caffeine and related purine alkaloids: Biosynthesis, catabolism, function and genetic engineering. // Phytochemistry. 2008. № 69. P. 841-856.

2. Juliano L. Mi, Griffiths R. R. A critical review of caffeine withdrawal: empirical validation of symptoms and signs, incidence, severity, and associated features. // Psychopharmacology. 2004. V. 176. P: 1-29.

3. Glade MJ; Caffeine -Not just a stimulant. // Nutrition. 2010; № 26. P. 932-938.

4. Глущенко H.H., Плетенева T.B., Попков В.А. Фармацевтическая химия. М.: Академия, 2004. 384 с.

5. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. М:: МЕДпресс-информ, 2007. 624с.

6. Орехов А.П. Химия алкалоидов. M.: Академия наук СССР, 1955. 863 с.

7. Ashihara Н., Zheng X.Q., Katahira R., Morimoto M., Ogita S., Sano H. Caffeine biosynthesis and adenine metabolism in transgenic Coffea canephora. plants with reduced'expression of N-methyltransferase genes. // Phytochemistry. 2006. V. 67. P. 882-886.

8. Mazzafera P. Catabolism of caffeine in plants and microorganisms. // Front. Biosci. 2004. V. 9. P. 1348-1359.

9. Zrenner R:, Stitt M., Sonnewald U., Boldt R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. //Annu. Rev. Plant Biol. 2006. V. 57. P. 805-836.

10. Hollingsworth R.G., Armstrong J:W., Campbell E. Caffeine as a repellent for slugs and snails. // Nature. 2002. V. 417. P; 915-916.

11. Kim Y.-S., Ucfuji H., Ogita: S., Sano H: Transgenic tobacco plants producing caffeine: a potential new strategy for insect pest control. // Transgenic Res. 2006. V. 15. P. 667-672.

12. Anaya A.L., Cruz-Ortega R., Waller G.R. Metabolism and ecology of purine alkaloids. // Front. Biosci. 2006. V. 11. P. 2354-2370.

13. Машковский М.Д. Лекарственные средства. 4.1. M.: Медицина, 1985. 624с.

14. Montandona G., Kinkead R., Bairam A. Adenosinergic modulation of respiratory activity: Developmental plasticity induced by perinatal caffeine administration. // Respiratory Physiology and Neurobiology. 2008. V. 164. P. 87-95.

15. Grosso L.M., Bracken M.B. Caffeine metabolism, genetics, and perinatal outcomes: a review of exposure assessment considerations during pregnancy. // Ann. Epidemiol. 2005. № 15. P. 460-466.

16. MacKenzie T., Comi R., Sluss P., Keisari R., Manwar S., Kim J. Metabolic and hormonal effects of caffeine: randomized, double-blind; placebocontrolled crossover trial. //Metabolism. 2007. V. 56. P. 1694-1698:

17. Labedzki A., Buters J., JabraneW., Fuhr U. Differences in caffeine and paraxanthine metabolism between human and murine CYP1A2. // Biochem. Pharmacol. 2002. V. 63. P. 2159-2167.

18. Kanazawaa H., Atsumia R., Matsushimaa Y., Kizub J: Determination of theophylline and its metabolites in biological samples by liquid chromatography-mass spectrometry. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 870. P. 87-96.

19. Wang A., Li L., Zanga F., Fang Y. Amperometric detection of three purine alkaloids following their separation by micellar electrokinetic capillary chromatography. // Analyt. Chim. Acta. 2000. V. 419. P. 235-242.

20. Emre D., Ozaltin N. Simultaneous determination of paracetamol, caffeine and propyphenazone in ternary mixtures by micellar electrokinetic capillary chromatography. // J. Chromatogr. B. 2007. V. 847. P. 126-132.

21. Regan F., Shakalisava Y. Rapid simultaneous determination of alkylxanthines by CZE and its application in analysis of pharmaceuticals and food samples. // Analyt. Chim. Acta. 2005. V. 540. P. 103-110.

22. Hegde R.N., Hosamani R.R., Nandibewoor S.T. Electrochemical oxidation and determination of theophylline at a carbon paste electrode using cetyltrimethyl ammonium bromide as enhancing agent. // Anal. Lett. 2009. V. 42. P: 2665-2682.

23. Iturriaga H., Єоеііо J.,- Maspoch S., Porcel M. Kinetic-spectrophotometric determination of theophylline, dyphylline, and proxyphylline by use of partial least-squares regression. // Anal; Bioanal. Chem; 2002. V. 374. P. 33-38:

24. Riahi S., Mousavi M:F., Bathaie S.Z*, Shamsipur M. A novel potentiometric sensor for selective determination of theophylline: Theoretical and practical' investigations. // Anal. Chim. Acta. 2005. V. 548. P. 192-198:

25. Власова И.В., Кулакова С.А., Поморцева А.В: Спектрофотометрическое определение кофеина, парацетамола и ацетилсалициловой кислотьг при совместном присутствии. // Заводская^ лаборатория; Диагностика; материалов: 2005. Т. 71. №9. С. 18-20.

26. Ozgiir M.U., Alpodogan G., A§?i В. A rapid spectrophotometric method to resolve ternary mixtures of propyphenazone, caffeine, and acetaminophen in tablets. // Monatshefte fur Chemie. 2002. V. 133; P. 219-223.

27. Chen G., Chu Q., Zhang L., Ye J. Separation of six purine bases by capillary electrophoresis with electrochemical detection. // Analyt. Chim. Acta. 2002. V. 457. P.225-233.

28. Singh D.K., Sahu A. Spectrophotometry determination of caffeine and theophylline in pure alkaloids- and its application in pharmaceutical formulations. // Anal. Biochem. 2006. V. 349. P. 176-180.

29. Голубицкий Г. Б., Иванов* В.М. Количественный анализ некоторых лекарственных препаратов методом ВЭЖХ. // Вестн. МГУ. Сер.2. Химия. 2009. Т. 50. № 4. С. 262-266.

30. Soponar F., Mot A.C., Sarbu C. Quantitative evaluation of paracetamol and caffeine from pharmaceutical preparations using image analysis and RP-TLC. // Chromatographic 2009. V. 69. P. 151-155.

31. Cianchino V., Acosta G., Ortega C., Martirnez L.D., Gomez M.R. Analysis of potential adulteration in herbal medicines and dietary supplements for the weight control by capillary electrophoresis. //Food Chem. 2008. V. 108. P. 1075-1081.

32. Yang X.R., Ye C.X., Xu J.K., Jiang Y.M. Simultaneous analysis of purine alkaloids and catechins in Camellia sinensis, Camellia ptilophylla and Camellia assamica var. kucha by HPLC. // Food Chem. 2007. V. 100. № 3. P. 1132-1136.

33. Horie H., Nesumi A., Ujihara Т., Kohata K. Rapid determination of caffeine in tea leaves. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 942. P. 271-273.

34. Yang D.J., Hwang L.S., Lin J.T. Effects of different steeping methods and storage on caffeine, catechins and gallic acid in bag tea infusions. // J. Chromatogr. A.2007. V. 1156. P. 312-320.

35. Lopes-Martinez L.L., Lopez-de-Alba P.L., Garsia-Campos R., Leon-Rodriguez L.M. Simultaneous determination of methylxantines in coffees and teas by UV-Vis spectrophotometry and partial least squares. // Anal. Chim. Acta. 2003. V. 493. P. 8394.

36. Peng L., Song X., Shi X., Li J., Ye C. An. improved- HPLC method for simultaneous determination of phenolic compounds, purine alkaloids and theanine in Camellia species. // J. Food Compos. Anal. 2008. V. 21. P. 559-563.

37. Wang X., Wan X., Hu S., Pan C. Study on the increase mechanism of the caffeine content during the fermentation' of tea with microorganisms. // Food Chem.2008. V. 107. P. 1086-1091.

38. Fernández P.L., López A., Pablos F., González A.G., Martín M.J. The use of catechins and purine alkaloids as descriptors for the differentiation of tea beverages. // Microchim. Acta. 2003. V. 142. P. 79-84.

39. Карцова JI.A., Алексеева A.B. Использование селективного комплексообразования катехинов с ионами Fe3+ при определении кофеина в чае методом ВЭТХ. // Журн. аналит. химии. 2009. Т. 64. № 9. С. 954-958.

40. Horie Н., Kohata К. Analysis of tea by high-performance liguid chromatography and high-performance capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 881. P. 425-438.

41. Venzie J.L., Castro J. Electron-impact and glow-discharge ionization LC-MS analysis of green tea tincture. // Anal. Bioanal. Chem. 2007. V. 387. P. 321-333.

42. Tian M., Yan H., Row К. H. Solid-phase extraction of caffeine and theophylline from green tea by a new ionic liquid-modified functional polymer sorbent. // Anal. Lett. 2010. V. 43. P. 110-118.

43. Zuo Y., Chen H., Deng Y. Simultaneous determination of catachins, caffeine and gallic acids in green, Oolong, black and pu-erh teas using HPLC with photodiode array detector. // Talanta. 2002. V. 57. P. 307-316.

44. Fernandez P.L., Martin M.J., González A.G., Pablos F. HPLC determination of catechins and caffeine in tea. Differentiation of green, black and instant teas. // Analyst. 2000. V. 125. P. 421-^25.

45. Cardozo J.E.L., Ferrarese-Filho O., Filho L.C., Ferrarese M.L.L., Donaduzzi C.M., Sturion J.A. Methylxanthines and phenolic compounds in mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) progenies grown in Brazil. // J. Food Compos. Anal. 2007. V. 20. P. 553-558.

46. Belay A., Ture K., Redi M., Asfaw A. Measurement of caffeine in coffee beans with UV/vis spectrometer. // Food Chem. 2008. Y. 108: P. 310-315.

47. Perrone D., Donangelo C. M., Farah A. Fast simultaneous analysis of caffeine, trigonelline, nicotinic acid and sucrose in coffee by liquid chromatography-mass spectrometry. //Food Chem. 2008. V. 110. P. 1030-1035.

48. Fujioka K., Shibamoto T. Chlorogenic acid and caffeine contents in various commercial brewed coffees. // Food Chem. 2008. V. 106. P. 217-221.

49. Aklilu M., Tessema M., Redi-Abshiro M. Indirect voltammetric determination of caffeine content in coffee using 1,4-benzoquinone modified carbon paste electrode. // Talanta. 2008. V. 76. P. 742-746.

50. Tzanavaras P.D., Themelis D.G. Development and validation of a high-throughput high-performance liquid chromatographic assay for the determination of caffeine in food samples using a monolithic column. // Anal: Chim. Acta. 2007. V. 581. P. 89-94.

51. Weckerle B., Richling E., Heinrich S., Schreier P. Origin assessment of green coffee (Coffea arabica) by multi-element stable isotope analysis of caffeine. // Anal. Bioanal. Chem. 2002. V. 374. P. 886-890.

52. Гаврилина В.А., Мальцева О.И., Сычев С.Н., Артемова Т.Е. Идентификация фальсифицированных образцов растворимого кофе методом ВЭЖХ. // Завод, лаб. 2005. Т. 71. №9. С. 25-27.

53. Chuan D., Li W.Y., Min S.S. Study on the paper substrate room temperature phosphorescence of theobromine, caffeine and theophylline and analytical application. // Spectrochim. Acta. Part A. 2003. V. 59. P. 1469-1476.

54. Naik J.P. Improved high-performance liquid chromatography method to determine theobromine and caffeine in cocoa products. // J. Agrie. Food. Chem. 2001. V. 49. P. 3579-3583.

55. Tokusoglu Ó., Ünal M.K. Optimized method for simultaneous determination of catechin, gallic acid, and methylxanthine compounds in chocolate using RP-HPLC. // Eur. Food Res. Technol. 2002. V. 215. P. 340-346.

56. Scherer R., Urfer P., Mayo M.R., Belingheri L.D., Marx F., Janssens M.JJ. Inheritance studies of caffeine and theobromine content of Mate (Ilex paraguariensis) in Misiones, Argentina. // Euphytica. 2002. V. 126. P. 203-210.

57. Niemenak N., Onomo P.E., Fotso, Lieberei R., Ndoumou D.O. Purine alkaloids and phenolic compounds in three Cola species and Garcinia kola grown in Cameroon. // S. Afr. J. Bot. 2008. V. 74. P. 629-638.

58. Bogo A., Mantle P.G. Caffeine: also a fungal metabolite. // Phytochem. 2000. V. 54. P. 937-939.

59. Rice S.L., Mitra S. Microwave-assisted solvent extraction of solid matrices and subsequent detection of pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) using gas chromatography-mass spectrometry. // Anal. Chim. Acta. 2007. V. 589. №1. P. 125-132.

60. Ternes T.A., Bonerz M., Herrman N., Loffler D., Keller E., Lacida B'.B'., Alder A.C. Determination of pharmaceuticals, iodinated contrast media and musk fragences in sludge by LC/tandem MS and GC/MS. // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1067. P. 213223.

61. Shrivas K., Wu H.F. Rapid determination of caffeine in one drop of beverages and foods using drop-to-drop solvent microextraction with gas chromatography/mass spectrometry. // J. Chromatogr. A. 2007. V. 1170. P. 9-14.

62. Zambonin C.G., Aresta A., Palmisano F. Determination of methylxanthines in urine by liquid chromatography with diode array UV detection. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2004. V. 36. P. 621-624.

63. Buyiiktuncel E. Simultaneous determination of theobromine, paraxanthine, theophylline, and caffeine in urine by reversed-phase high-performance liquid chromatography with diode array UV detection. // Anal. Lett. 2010. V. 43. P. 2518— 2524.

64. Bendriss E.K., Markoglou N., Wainer I.W. Liquid chromatographic method for the simultaneous determination of caffeine and fourteen caffeine metabolites in urine. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 746. № 2. P: 331-338.

65. Ventura R., Jiménez С., Closas N., Segura J., Torre R.D. Stability studies of selected doping agents in urine: caffeine. // J. Chromatogr. B. 2003. V. 795. № 2. P. 167-177.

66. Thuyne W.V., Delbeke F.T. Distribution of caffeine levels in urine in different sports in relation to doping control before and after the removal of caffeine from the WADA doping list. // Int. J. Sports. Med. 2006. V. 27. № 9. P. 745-750.

67. Thuyne W.V., Roels K., Delbeke F.T. Distribution of caffeine levels in urine in different sports in relation to doping control. // Int. J. Sports. Med. 2005. V. 26. № 9. P. 714-718.

68. Mirfazaelian A., Goudarzi M., Tabatabaiefar M., Mahmoudian M. A quantitative thin layer chromatography method for determination of theophylline in plasma. // J. Pharm. Sci. 2002. V. 5. № 2. P. 131-134.

69. Ramakrishna N.V.S., Vishwottam K.N., Manoj S., Koteshwara M;, Santosh M., Anjaneyulu Y. Rapid liquid chromatographic tandem mass spectrometric method for the quantification of pentoxifylline in-human plasma, // Chromatographia. 2006. V. 63. P. 135-141.

70. Fucci N., Giovanni N., Scarlata S. Sweat, testing in addicts under methadone treatment: an Italian experience. // Forensic Sci. Int. 2008. V. 174. P. 107-110.

71. Harsono Т., Yuwono M., Indrayanto G. Simultaneous determination of some active ingredients in cough and cold preparations by gas chromatography, and method validation. // J. AOAC Int. 2005. V. 88. № 4. P. 1093-1098:

72. Пивовар M.JI., Жебеняев А.И. Определение количественных характеристик экстракции производных ксантина различными органическими растворителями. // Вестник фармации. 2008. Т. 42. № 2'. С. 1-8.

73. Пивовар M.JL, Жебеняев А.И. Изучение экстракции метилпроизводных ксантина бинарными смесями органических растворителей. // Вестник фармации. 2010. Т. 47. № 1. С. 25-33.

74. Park H.S., Choi H.-K., Lee S.J., Park K.W., Choi S.-G., Kim K.H. Effect of mass transfer on the removal of caffeine from green tea by supercritical carbon dioxide. // J. Supercrit. Fluids. 2007. V. 42. P. 205-211.

75. Kim W.J., Kim J.D., Oh S.G. Supercritical carbon dioxide extraction of caffeine from korean green tea. // Sep. Sci. Technol. 2007. V. 42. P. 3229-3242.

76. Kim W.J., Kim J.D., Kim J., Oh S.G., Lee Y.W. Selective caffeine removal from green tea using supercritical carbon dioxide extraction. // J. Food Engr. 2008. V. 89. P. 303-309.

77. Icen H., Guru M. Extraction-of caffeine from tea stalk, and fiber wastes using supercritical carbon dioxide. // J. Supercrit. Fluids. 2009. V. 50. P: 225-228.

78. Tang W.Q., Li D.C., Lv Y.X., Jiang J.G. Extraction and removal of caffeine from green tea by ultrasonic-enhanced supercritical fluid. // J. Food4Sci. 2010. V. 75. №. 4. P. 363-368.

79. Jacques R.A., Santos J.G., Dariva C., Oliveira J.V., Caramao E.B. GC/MS characterization of mate tea leaves extracts obtained from high-pressure C02 extraction. //J. Supercrit. Fluids. 2007. V. 40. P. 354-359:

80. Esmelindro M.C., Toniazzo G., Lopes D., Oliveira D., Dariva C. Effects of processing conditions on the chemical distribution of mate tea leaves extracts obtained from CO2 extraction at high pressures. // J. Food Eng. 2005. V.70. P. 588592.

81. Saldana M.D.A., Zetzl C., Mohamed R.S., Brunner G. Extraction of methylxanthines from guarana seeds, mate leaves and cocoa beans using supercritical carbon dioxide and ethanol. // J. Agric. Food Chem. 2002. V. 50. P. 4820-4826.

82. Saldana M.D.A., Zetzl C., Mohamed R.S., Brunner G. Decaffeination of guarana seeds in a microextraction column using water-saturated C02. // J. Supercrit. Fluids. 2002. V. 22. P. 119-127.

83. Azevedo A.B.A., Kieckbush T.G., Tashima A.K., Mohamed R.S., Mazzafera P., Melo S.A.B.V. Extraction of green coffee oil using supercritical carbon dioxide. // J. Supercrit. Fluids. 2008. V. 44. P. 186-192.

84. Saldana M.D.A., Mohamed R.S., Mazzafera P. Extraction of cocoa butter from Brazilian cocoa beans using supercritical CO2 and ethane. // Fluid Phase Equilib. 2002. V. 194. P. 885-894.

85. Mohamed R.S., Saldana M.D.A., Mazzafera P., Zetzl C., Brunner G. Extraction of caffeine, theobromine, and cocoa butter from Brazilian cocoa beans using supercritical C02 and ethan. // Ind. Eng. Chem. Res. 2002. V. 41. P. 6751-6758.

86. Kopcak U., Mohamed R. S. Caffeine solubility in supercritical carbon dioxide/co-solvent mixtures. // J. Supercrit. Fluids. 2005. V. 34. P. 209-214.

87. Subra P., Laudani C.-G., Vega-Gonzalez A., Reverchon E. Precipitation-and phase behavior of theophylline in solvent-supercritical C02 mixtures. // J. Supercrit. Fluids. 2005. V. 35. P. 95-105.

88. Saka K., Uemura K., Shinti-Ishida K., Yoshida K. Acetic acid improves the sensitivity of theophylline analysis by gas chromatography—mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 2007. V. 846. P. 240-244.

89. Schellen A., Ooms B. Generic solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast determination of drugs in biological fluids. //J. Chromatogr. B. 2003. V. 788. P. 251-259.

90. Khorrami A.R., Rashidpur A. Design of a new cartridge for selective solid phase extraction using molecularly imprinted polymers: Selective extraction of theophylline from human serum samples. // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 25. № 3. P. 647-651.,

91. Zhu T., Row K.H. A weak cation-exchange, monolithic SPE column for extraction and analysis of caffeine and theophylline in human urine. // Chromatographia. 2009: V. 69. № 11-12. P. 1477-1480.

92. Zhang Q.L., Lian H.Z., Wang W.H., Chen H.Y. Separation of caffeine and theophylline in poly(dimethylsiloxane) microchannel electrophoresis with electrochemical detection. // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1098. P. 172-176.

93. Aresta A., Palmisano F., Zambonin C.G. Simultaneous determination of caffeine, theobromine, theophylline, paraxanthine and nicotine in human milk by liquid chromatography with diode array UV detection. // Food Chem. 2005. V. 93. P. 177-181.

94. Armenta S., Garrigues S., Guardia M. Solid-phase FT-Raman determination of caffeine in energy drinks. // Anal. Chim. Acta. 2005. V. 547. P: 197-203 .

95. Farrington K, Magner E., Regan F. Predicting the performance of molecularly imprinted polymers: Selective extraction of caffeine by molecularly imprinted solid phase extraction. // Anal. Chim. Acta. 2006. Y. 566. P.60-68.

96. Gardinalia P.R., Zhao X. Trace determination of caffeine in surface water samples by liquid chromatography-atmospheric pressure' chemicalVionization-mass spectrometry (LC-APCI-MS). //Environ. Int. 2002. Y. 28. P. 521- 528.

97. Weigel S., Kuhlmann J., Hiihnerfuss H. Drugs and personal care products as ubiquitous pollutants: occurrence and distribution of clofibric acid, caffeine and DEET in the North Sea: // Sci. Total Environ. 2002. V. 295. P. 131-141.

98. Verenitch S.S., Lowe Ch.J., Mazumder A. Determination of acidic drugs and caffeine in municipal wastewaters and receiving waters by gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry. // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1116. P. 193-203.

99. Sacher F. Pharmaceuticals in groundwaters. Analytical methods and results of a monitoring program in Baden-Württemberg, Germany. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 938. P. 199-210.

100. Togola A., Budzinski H. Analytical development for analysis of pharmaceuticals in water samples by SPE and GC-MS. // Anal. Bioanal. Chem. 2007. V. 388. P. 627635.

101. Conley J.M., Symes S.J. Rapid* liquid chromatography-tandem. mass spectrometry method for the determination of a-broad mixture of pharmaceuticals in surface water. // J. Chromatogr. A. 2008. V. 1185. 206-215.

102. Santos J.L., Aparicio I., Alonso E., Callejón M. Simultaneous determination of pharmaceuticall active compounds in wastewater samples by SPE and HPLC with diode array and fluorescence detectors. // Anal. Chim. Acta. 2005. V. 550. P. 116-122.

103. Lacey C., McMahon G. An LC-MS method for the determination of pharmaceutical compounds in wastewater treatment plant influent and effluent samples. // Talanta. 2008. V. 75. P. 1089-1097.

104. Sodre F.F., Locatelli M.A.F., Jardim W.F. Occurrence of emerging contaminants in brazilian drinking waters: a sewage-to-tap issue. // Water Air Soil Pollution. 2009. V. 206. № 1^4. p. 57-67.

105. Zhao R., Yan Y., Li M. Selective adsorption of tea polyphenols from aqueous solution of the mixture with caffeine on macroporous crosslinked poly(N-vinyl-2-pyrrolidinone). // React. Funct. Polym. 2008. V. 68. P. 768-774.

106. Ebarvia B.S., Binag C.A., Sevilla F. Biomimetic piezoelectric quartz sensor for caffeine based on a molecularly imprinted polymer. // Anal. Bioanal. Chem. 2004. V. 378. P. 1331-1337.

107. Theodoridis G., Manesiotis P. Selective solid-phase extraction sorbent for caffeine made by molecular imprinting. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 948. P. 163169.

108. Jin Y., Choi D.K., Row K.H. Adsorption isotherms of caffeine on molecular imprinted polymer. // Korean J. Chem. Eng. 2008. V. 25. № 4. P. 816-818.

109. Kobayashi T., Murawaki Y., Reddy P.S., Abe M., Fujii N. Molecular imprinting of caffeine and its recognition assay by quartz-crystal microbalance. // Analyt. Chim. Acta. 2001. V. 435. P. 141-149.

110. Goswami S., Mahapatra A. K., Mukherjee R. Molecular recognition of xanthine alkaloids: First synthetic receptors for theobromine and a series of new receptors for caffeine. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2001. V. 1. P. 2717-2726.

111. Silvestri D., Borrelli C., Giusti P., Cristallini C., Ciardelli G. Polymeric devices containing imprinted nanospheres: a novel approach to improve recognition in water for clinical uses. // Analyt. Chim. Acta. 2005. V. 542. P. 3-13.

112. Ciardelli G., Cioni B.5 Cristallini C., Barbani N., Silvestri D., Giusti P. Acrylic polymeric nanospheres for the release and recognition of molecules of clinical interest. // Biosens. Bioelectron. 2004. V. 20. P. 1083-1090.

113. Ye L., Cormack P.A.G., Mosbach K. Molecular imprinting on microgel spheres. //Analyt. Chim. Acta. 2001. V. 435. P. 187-196.

114. Chronakis I.S., Jakob A., Hagstrom B., Ye L. Encapsulation and selective recognition of molecularly imprinted theophylline and 17a-estradiol nanoparticles within electrospun polymer nanofibers. // Langmuir. 2006. V. 22. P. 8960-8965.

115. Sreenivasan K. Molecularly imprinted polymer as storage medium for an analyte. // Bioseparation. 2002. V. 10. P. 395-398.

116. Li Z., Day M., Ding J., Faid K. Synthesis and characterization of functional methacrylate copolymers and their application in- molecular imprinting: // Macromolecules. 2005. V. 38. P. 2620-2625.

117. Svenson J., Nicholls I.A. On the thermal and chemical stability of molecularly imprinted polymers. // Analyt. Chim. Acta. 2001. V. 435. P. 19-24.

118. Costa S.R.G., Augusto F. Sol-gel molecular imprinted ormosil for. solid-phase extraction of methylxantines. // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1114. P. 216-223.

119. Lin C.I., Joseph A.K., Chang C.K., Wang Y.C., Lee Y.D. Synthesis of molecular imprinted organic-inorganic hybrid polymer binding caffeine. // Analyt. Chim. Acta. 2003. V. 481. P. 175-180.

120. Gill R. S., Marquez M., Larsen G. Molecular imprinting of a cellulose/silica composite with caffeine and its characterization. // Microporous Mesoporous Mater. 2005. V. 85. P. 129-135.

121. Hattori K., Hiwatari M., Iiyama C., Yoshimi Y., Kohori F., Sakai K., Piletsky S. A. Gate effect of theophylline-imprinted polymers grafted to the cellulose by living radical polymerization. // J. Membrane Sci. 2004. V. 233. P. 169-173.

122. Voicu R., Faid K., Farah A.A., Bensebaa F., Barjovanu R., Py C., Tao Y. Nanotemplating for two-dimensional molecular imprinting. // Langmuir. 2007. V. 23. P. 5452-5458.

123. Lee E., Park D.W., Lee J.O., Kim D.S., Lee B.H., Kim B.S. Molecularly imprinted polymers immobilized on carbon nanotube. // Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects. 2008. V. 313-314. P. 202-206.

124. Lee H.-Y., Kim B. S. Grafting of molecularly imprinted polymers on iniferter-modified carbon Nanotube. // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 25. № 3. P. 587-591.

125. Choong C.-L., Bendall J.S., Milne W.I. Carbon nanotube array: A new MIP platform. // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 25. № 3. P. 652-656.

126. Kumazawa T., Seno H., Lee X.-P., Ishii A., Watanatabe-Suzuki K., Sato K., Suzuki O. Extraction of methylxanthines from human body fluids by solid-phase microextraction. //Anal. Chim. Acta. 1999. V. 387. P. 53-60.

127. Lambert J.P., Mullett W.M., Kwong-E., Lubda D. Stir, bar sorptive extraction based on restricted access material for the direct extraction of caffeine and metabolites in biological fluids. // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1075. P. 43-40.

128. Tzanavaras P.D., Zacharis C.K., Themelis D.G. Rapid determination* of methylxanthines in real samples by high-performanceliquid chromatography using the new FastGradient® narrow-bore monolithic column. // Talanta. 2010. V. 81. P. 14941501.

129. Fernández P. L., Martín M. J., González A. G., Pablos F. HPLC determination of catechins and caffeine in tea. Differentiation of green, black and instant, teas. // Analyst. 2000. V. 125. P. 421^125.

130. Danrong Z., Yuqiong C., Dejiang N. Effect of water quality on the nutritional components and antioxidant activity of green tea extracts. // Food Chem. 2009. V. 113. P. 110-114.

131. Couzinet-Mossion A., Balayssac S., Gilard V., Malet-Martino M., Potin-Gautier M., Behra P. Interaction mechanisms between caffeine and polyphenols in infusions of Camellia sinensis leaves. // Food Chem. 2010. V. 119. P. 173-181.

132. He Q., Li Y., Zhou L., Shi B. Simultaneous determination of caffeine and catechins in tea extracts by HPLC. // J. Liq. Chromatogr. Releted Technol. 2010. V. 33. P. 491-498.

133. Robb C.S., Geldart S.E., Seelenbinder J.A., Brown P.R. Analysis of green tea constituents by HPLC-FTIR. // J. Liq. Chromatogr. Releted Technol. 2002. V. 25. P. 787-801.

134. Wu J., Xie W., Pawliszyn J. Automated in-tube solid' phase microextraction coupled with HPLC-ES-MS for the determination of catechins and caffeine in tea. // Analyst. 2000. V. 125. P. 2216-2222.

135. Rio D.Dl, Stewart A. J., Mullen W., Burns J., Lean M.E.J., Brighenti F., Crozier A. HPLC-MSn analysis of phenolic compounds and purine alkaloids in green and black tea. // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. 2807-2815.

136. Sun H.W., Qiao F.X., Liu G.Y. Characteristic of theophylline imprinted monolithic column and its application for determination of xanthine derivatives caffeine and theophylline in green tea. // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1134. P. 194200.

137. Kyung H.Y., Row H. Characteristics of a monolithic molecularly imprinted column and its application for chromatographic separation. // J. Ind. Eng. Chem. 2007. V. 13. № 4. P. 552-557.

138. Yan H., Jin L., Row K.H. Special selectivity of molecularly imprinted monolithic stationary phase. // J. Liq. Chromatogr. Releted Technol. 2005. V. 28. P. 3147-3155.

139. Yan H., Row K.H. Characteristic and molecular recognition mechanism of theophylline monolithic molecularly imprinted polymer. // J. Liq. Chromatogr. Releted Technol. 2006. V. 29. P. 1393-1404.

140. Qing-Chun C., Wang J. Simultaneous determination of artificial sweetners, preservatives, caffeine, theobromine, and theophylline in food and pharmaceutical preparations by ion chromatography. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 937. P. 57-64.

141. Хасанов B.B., Дычко K.A., Кураєва T.T., Рыжова Г.Л., Мальцева. Е.В. Новый способ определения кофеина. // Журн. прикл. химии. 2005. Т. 78. С. 1451-1454.

142. Aucamp J.P., Нага Y., Apostolides Z. Simultaneous analysis of tea catechins, caffeine, gallic acid, theanine and ascorbic acid by micellar electrokinetic capillary chromatography. // J. Cromatogr. A. 2000. V. 876. P. 235-242.

143. Weiss D.J., Anderton C.R. Determination of catechins in matcha green tea by micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1011. P. 173— 180.

144. Llorent-Martinez E. J., Garcia-Reyes J. F., Ortega-Barrales P., Molina-Diaz A. Solid-phase ultraviolet sensing system for determination of methylxanthines. // Anal. Bioanal. Chem. 2005. V. 382. P. 158-163.

145. Chen Q., Zhao J., Huang X., Zhang H., Liu M. Simultaneous determination of total* polyphenols and caffeine contents of green tea by near-infrared reflectance spectroscopy. //Microchemical J. 2006. V. 83. P. 42-47.

146. Luypaert J., Zhang M.H., Massart D.L. Feasibility study for the use of near infrared spectroscopy in the qualitative and quantitative analysis of green tea, Camellia sinensis (L.). // Analyt. Chim. Acta. 2003. V. 478. P. 303-312.

147. Ohnsmann J., Quintâs G., Garrigues S., Guardia M. Determination of caffeine in tea samples by Fourier transform infrared spectrometry. // Anal. Bioanal. Chem. 2002. V. 374. P. 561-565.

148. Paradkar M.M., Irudayaraj J. A rapid FTIR spectroscopic method for estimation of caffeine in soft drinks and total methylxanthines in tea and coffee. // J. Food Sci. 2002. V. 67. P. 2507-2511.

149. Ly L.S.Y., Jung Y.S., Kim M.H., Han I.K., Jung W.W., Kim H.S. Determination of caffeine using a simple graphite pencil electrode with square-wave anodic stripping voltammetry. //Microchim. Acta. 2004. V. 146. P. 207-213.

150. Spataru N., Sarada B.V., Tryk D.A., Fujishima A. Anodic voltammetry of xanthine, theophylline, theobromine and caffeine at conductivediamond electrodes and its analytical application. // Electroanalysis. 2002. V. 14. P. 721-728.

151. Alizadeh Т., Ganjali M.R., Zare M., Norouzi P. Development of a voltammetric sensor based on a molecularly imprinted polymer (MIP) for caffeine measurement. //Electrochim. Acta. 2010. V. 55. P. 1568-1574.

152. Ebarvia B.S., Binag C.A., Sevilla F. Biomimetic piezoelectric quartz sensor for caffeine based on a molecularly imprinted polymer. // Anal. Bioanal. Chem. 2004. V. 378: P. 1331-1337.

153. Ebarvia B.S., Sevilla F. Piezoelectric quartz sensor for caffeine based on molecularly imprinted polymethacrylic acid. // Sens. Actuators. B: 2005. V. 107. P. 782-790.

154. Rodrigues C.I., Marta L., Maia R., Miranda M., Ribeirinho M., Maguas C. Application of solid-phase extraction to brewed coffee caffeine and organic acid determination by UV/HPLC. // J. Food Compos. Anal. 2007. V. 20. P. 440^148.

155. Пилипенко В.П., Бибик O.B., Прихода Н.И. Сравнительная характеристика методов определения кофеина. // Вопросы химии и химической технологии. 2009. №2. С. 89-91.

156. Meinhart A.D., Bizzotto C.S., Ballus С.A., Prado М.А., Bruns R.E., Filho J.T., Godoy H.T. Optimisation of a CE method for caffeine analysis in decaffeinated coffee. //Food Chem. 2010. V. 120. P. 1155-1161.

157. Garrigues J.M., Bouhsain Z., Garrigues S., Guardia M. Fourier transform infrared determination of caffeine in roasted coffee samples. // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. V. 366. P. 319-322.

158. Schmalko M.E., Alzamora S.M. Color, chlorophyll, caffeine, and water content variation during yerba maté processing. // Drying Technol. 2001. V. 19. № 3. P. 599610.

159. Coco F.L., Lanuzza F., Mical G., Cappellana G. Determination of theobromine, theophylline and caffeine in by-products of cupuacu and cacoa seeds by highperformance liquid chromatography. // J. Cromatogr. Sci. 2007. V. 45. P. 273-275.

160. Edwards H.G.M., Villar S.E.J., Oliveira L.F.C., Hyaric M.L. Analytical,Raman spectroscopic study of cocoa seeds and their chemical extracts. // Analyt. Chim. Acta. 2005. V. 538. P. 175-180.

161. Srdjenovic B., Milic V.D., Grujic N., Injac R., Lepojeric Z. Simultaneous HPLC determination of caffeine, theobromine, and theophylline in food, drinks,.and.herbal products. //J. Chromatogr. Sci. 2008. V. 46. P. 144-149.

162. Zou J., Li N. Simple and* environmental friendly procedure for the gas chromatographic-mass spectrometric determination of caffeine in beverages. // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1136. P. 106-110.

163. Lucena R., Cardena S., Gallego M., Valcarcel M. Continuous flow autoanalyzer for the sequential determination of total sugars, colorant and caffeine contents in soft drinks. //Anal. Chim. Acta. 2005. V. 530. P. 283-289.

164. Fernândez-Maestre R., Hill H.H. Ion mobility spectrometry for the rapid analysis of over-the-counter drugs and beverages. // Int. J. Ion. Mobil. Spectrom. 2009. V. 12. № 3. P. 91-102.

165. Grant D.C., Helleur RJ. Simultaneous analysis of vitamins and caffeine in energy drinks by surfactant-mediated matrix-assisted laser desorption/ionization. // Anal. Bioanal. Chem. 2008. V. 391. P. 2811-2818.

166. Martinez-Huitle C.A., Fernandes N.S., Ferro S., Battisti A.D., Quiroz M.A. Fabrication and- application of NafionO-modified boron-doped diamond electrode assensor for detecting caffeine. // Diamond Relat. Mater. 2010. V. 19. P. 1188-1193.

167. Sarath Babu V.R., Patra S., Karanth N.G., Kumar M.A., Thakur M.S. Development of a biosensor for caffeine. // Anal. Chim. Acta. 2007. V. 582. № 2. P. 329-334.

168. Akyilmaz E., Turemis M. An inhibition type alkaline phosphatase biosensor for amperometric determination of caffeine. // Electrochim. Acta. 2010. V. 55. P. 51955199.

169. Sena M.M., Poppi R.J. N-way PLS applied to simultaneous spectrophotometric determination of acetylsalicylic acid, paracetamol and caffeine. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2004. V. 34. P: 27-34.

170. Din? E., Baleanu D., Onur F. Simultaneous spectrophotometric analysis of codeine phosphate, acetylsalicylic acid, and caffeine in tablets by inverse least-squares and principal component regression techniques. // Analyt. Lett. 2002. V. 35. P. 545-558.

171. Culzoni M.J., Zan M.M.D., Robles J.C., Mantovani V.E., Goicoechea H.C. Chemometrics-assisted UV-spectroscopic strategies for the determination of theophylline in syrups. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V. 39: P. 1068-1074.

172. Senturk Z., Erk N., Ozkan S.A., Akay C., Cevheroglu S. Determination of theophylline and ephedrine HCL in tablets by ratio-spectra derivative spectrophotometry and LC. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2002. V. 29. P. 291-298.

173. Zare-Shahabadi V., Shamsipur M., Hemmatenejad B., Akhond M. Simultaneous determination of guaifenesin and theophylline by chemometrics methods. // Analyt. Lett. 2010. V. 43. P. 687-700.

174. Vidal A.D., Reyes J.F.G., Barrales P.O., Diaz A.M. UV spectrophotometric flow-through multiparameter sensor for the simultaneous determination of acetaminophen, acetylsalicylic acid, and caffeine. // Analyt. Lett. 2002. V. 35. N. 15. P. 2433-2447.

175. Vidal A.D., Barrales P.O., Diaz A.M. Simultaneous determination of paracetamol, caffeine and propyphenazone in pharmaceuticalsby means of a single flow-through UV multiparameter sensor. // Microchim. Acta. 2003. V. 141. P. 157— 163.

176. Laasonen M., Harmia-Pulkkinen T., Simard C., Rasanen M., Vuorela H. Development and validation of a near-infrared method for the quantitation of caffeine in intact single tablets. //Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 754-760.

177. Ribeiro-Claro P.J.A., Amado A.M. Comment on vibrational spectral investigation on xanthine and its derivatives—theophylline, caffeine and theobromine. // Spectrochim. Acta. Part A. 2005. V. 61. P. 2796-2797.

178. Liu Y., Lin Z., Zhang S., Yang C., Zhang X. Rapid screening of active ingredients in drugs by mass spectrometry with low-temperature plasma probe. // Anal. Bioanal. Chem. 2009. V. 395. P. 591-599.

179. Qi M.L., Wang P., Lang Y.X., Lang J.L., Fu R.N. Simultaneous determination of caffeine, theophylline, and theobromine by HPLC. // J. Chromatogr. Sci. 2002. V. 40. P. 45-48.

180. Kartal M. LC method for the analysis of paracetamol, caffeine, and codeine phosphate in pharmaceutical preparations. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2001. V. 26. P. 857-864.

181. Altun M.L., Ceyhan Т., Kartal M., Atay Т., Ozdemir N., Cevheroglu S. LG method, for, the analysis of acetylsalicylic acid, caffeine and codeine phosphate in1 pharmaceutical preparations. // J. Pharm. Biomed: Anal; 2001. V. 25. № 1. P: 93-101.

182. Голубицкий Г.Б., Будко E.B., Иванов B.M; Количественный анализ таблеток "Пенталгин IGN" методами градиентной' и изократической высокоэффективною жидкостной; хроматографии: // Журн. аналит. химии. 2005 . Т. 60. С. 1080-1086.

183. Голубицкий Г.Б., Будко Е.В., Иванов В.М. Удерживание компонентов таблеток "Пенталгин Н" в ВЭЖХ, на сорбенте с привитыми нитрильными группами. // Журн. аналит. химии. Г. 60: G. 1267-1272.

184. Голубицкий Г.Б;, Будко Е.В:, Иванов В.М. Количественный анализ таблеток "Пенталгин Н" методами градиентной и изократической высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Журн. аналит. химии. Т. 61. С. 74-79.

185. Ruddy D., Sherma J. Analysis of the caffeine in alertness tablets and caplets by high-performance thin-layer chromatography with ultraviolet absorption densitometry of fluorescence-quenched zones.//Acta Chromatogr. 2002. V. 12. P; 143-150.

186. Sullivan C., Sherma J. Development and validation of an HPTLC-densitometry method for assay of caffeine and acetaminophen in ulticomponent extra strength analgesic tablets; // J; Liq. Chromatogr. Related Technol. 2003; V. 26. № 20. P. 3453-3462.

187. Pucci V., Mandrioli R, Raggir M.A., Fanali S. Reversed-phase: capillary electrochromatography for the simultaneous determination of acetylsalicylic acid, paracetamol, and caff¿ine in analgesic,tablets; // Electrophoresis. 20041 V. 25. P. 615621. .

188. Yang G. J., Wang K., Xu J .J., Chen 11. Y. Determination of theophylline, in drugs and tea on nanosized cobalt phthalocyanine particlesmodified carbon paste.electrode. // Anal; Lett. 2004. V. 37. P. 629-643.

189. Hegde R.N., Nandibewoor S.T. Electrochemical oxidation of pentoxifylline and its analysis in pure and pharmaceutical formulations at a glassy carbon electrode. // Anal. Lett. 2008. V. 41. P. 977-991.

190. Katsu Т., Tsunamoto Y., Hanioka N., Komagoe K., Masuda K., Narimatsu S. A caffeine-sensitive membrane electrode: Previous misleading report and present approach. // Anal; Chim. Acta. 2008. V. 620. P. 50-54.

191. Nirogi R.V.S., Kandikere V.N., Shukla M., Mudigonda K., Ajjala D.R. A simple and rapid HPLC/UV method for the simultaneous quantification of theophylline and etofylline in human plasma. // J. Chromatogr. B. 2007. V. 848. № 2. P. 271-276.

192. Feng C.H., Wu H.L., Lin S.J., Chen S.H. Rapid simultaneous determination of three methylxanthines in human plasma by capillary electrophoresis. // J. Liq. Chromatogr. Related Technol. 2003. V. 26. № 12. P. 1913-1925.

193. Abdel-Hamid M.E., Phillips O.A. LC-MS/MS determination of carbamazepine, pindolol, and theophylline in human serum. // J. Liq. Chromatogr. Related Technol. 2003. V. 26. № 12. P. 1937-1957.

194. Georga K. A., Samanidou V. F., Papadoyannis I. N. Improved micro-method for the HPLC analysis of caffeine and its demethylated metabolites in human biological fluids after SPE. // J. Liq. Chromatogr. Related Technol. 2000. V. 23. № 10. P. 15231537.

195. Martinavarro-Dominguez A. Monitoring bronchodilators with direct injection. // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1073. P. 309-315.

196. Talebpour Z., Bijanzadeh H. R., Haghgoo S., Shamsipur M. H NMR method for simultaneous identification and determination of caffeine and theophylline in human serum and pharmaceutical preparations. // Chem. Anal. (Warsaw) 2004. V. 49. P. 369-382.

197. Talebpour Z., Maesum S., Heravi M. J., Shamsipur M. Simultaneous determination of theophyline and caffeine by proton magnetic resonance using partial least squares regression technique. // Anal. Sci. 2003. V. 19. P. 1079-1082.

198. Garcinuño R.M., Fernández P., Pérez-Conde C., Gutiérrez A.M., Cámara C. Development of a fluoroimmunosensor for theophylline using immobilised antibody. // Talanta. 2000. V. 52. P. 825-832.

199. Ius A., Bacigalupo M.A., Longhi R., Meroni G. Selectively conjugated melittins for liposome time-resolved fluoroimmunoassay of theophylline in serum. // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. V. 366. P. 869-872.

200. Stredansky M., Pizzariello A., Miertus S., Svorc J. Selective and sensitive biosensor for theophylline based on xanthine oxidase electrode. // Anal. Biochem. 2000. V. 285. P. 225-229.

201. Zhao G., Zang S., Liu K., Lin S., Liang J., Guo X., Zhang Z. Determination of trace xanthine by anodic stripping voltammetry with carbon nanotube modified glassy carbon electrode. // Anal. Lett. 2002. V. 35: № 14. P. 2233-2244.

202. Crews H.M., Olivier IV L., Wilson L.A. Urinary biomarkers for assessing dietary exposure to caffeine. // Food Addit. Contam. Part A. 2001. V. 18". № 12. P. 1075-1087.

203. Di-Pietro M.C., Vannoni D., Leoncini R., Liso G., Guerranti R., Marinello E. Determination of urinary methylated, purine pattern' by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 2001. V. 751. P. 87-92.

204. Flenker U., Schánzer W. Caffeine in doping control: Determination of 13 C in urinary excreted caffeine. // Eur. J. Sport Sci. 2001. V. 1. № 2. P. 1-5.

205. Redshaw N., Dickson S.J., Ambrose V., Horswell J. A preliminary investigation into the use of biosensors to screen stomach contents for selected poisons and drugs. // Forensic Sci. Int. 2007. V. 172. P. 106-111.

206. Mari F., Politi L., Bertol E. Nails of newborns in monitoring drug exposure during pregnancy. //Forensic Sci. Int. 2008. V. 179. P. 176-180.

207. Stanley M.R. Screening for basic drugs in equine urine using direct-injection differential-gradient LC-LC coupled to hybrid tandem MS/MS. // J. Chromatogr. B. 2006. V. 836. P. 1-14.

208. Gokulakrishnan S., Chandraraj K., Gummadi S.N. Microbial and enzymatic methods for the removal of caffeine. // Enz. Microbial Technol. 2005. V. 37. P: 225232.

209. Jimenez C., Ventura R., Segura J. Strategies for internal quality control, in antidoping analyses. // J. Chromatogr. B. 2002. V. 767. P. 341-351.

210. Филимонова A.A., Зиганшина Л.Е., Чичирова A.A. Хроматографический метод определения кофеина и его метаболитов в слюне и плазме крови: // Клин, лаб. диагностика. 2008. № 10: С. 34-36.

211. Зиганшин А.У., Зиганшина Л.Е., Филимонова А.А., Чичирова А.А. Возможности фенотипирования пациентов по активности изофермента цитохрома р-450 1а2 с использованием кофеина в качестве тест-субстрата. // Эксперим. клин. фарм. 2009. №>5: С. 61-65.

212. Buerge I.J., Poiger Т., Mtiller M.D., Buser H.R. Caffeine, an anthropogenic marker for wastewater contamination of surface waters. // Environ. Sci. Technol. 2003. V. 37. № 4. P. 691-700.

213. Santos J.L., Aparicio I., Callejyn M., Alonso E. Occurrence of pharmaceutically active compounds during 1-year period* in wastewaters from four wastewater treatment plants in Seville (Spain). // J. Hazard. Mater. 2009. V. 164. P. 1509-1516:

214. Kolpin D.W., Skopec M., Meyer M.T., Furlong' E.T., Zaugg S.D. Urban, contribution of pharmaceuticals and: other* organic wastewater contaminants to streams during differing flow conditions. // Sci. Total Environ. 2004. V. 328. № 1-3. P. 119-130.

215. Lin A.Y.C., Yu T.H., Lateef S.K. Removal of pharmaceuticals in secondary wastewater treatment processes in* Taiwan. // J. Hazard. Mater. 2009. 167. P. 1163-1169.

216. Lin A.Y.C., Yu T.H., Lin C.F. Pharmaceutical * contamination in residential, industrial, and agricultural waste streams: Risk to aqueous environments in Taiwan. // Chemosphere. 2008. V. 74. P. 131-141.

217. Choi K., Kim Y., Park J., Park C.K., Kim M., Kim H.S., Kim P. Seasonal variations of several pharmaceutical residues in surface water and sewage treatment plants of Han River, Korea. // Sci. Total Environ. 2008. V. 405. P. 120-128.

218. Barnes K.K., Kolpin D.W., Furlong E.T., Zaugg S.D., Meyer M.T., Barber L.B. A national reconnaissance of pharmaceuticals and other organic wastewater contaminants in the United States. I) Groundwater. // Sci: Total Environ. 2008. V. 402. P. 192-200.

219. Hummel D., Loffler D., Fink G., Ternes T.A. Simultaneous determination of psychoactive drugs and their metabolites in aqueous matrices by liquid chromatography mass spectrometry. // Environ. Sci. Technol. 2006. Y. 40. P. 73217328.

220. Thomas P.M., Foster G.D. Determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs, caffeine, and triclosan in wastewater by gas chromatography-mass spectrometry. //J. Environ. Sci. Health. 2004'. V. A39. № 8. P. 1969-1978.

221. Loos R., Locoro G., Contini S. Occurrence of polar organic contaminants in the dissolved water phase of the Danube River and its major tributaries using SPE-LC-MS2 analysis. // Water Res. 2010. V. 44. № 7. P. 2325-2335.

222. Carvalho J J., Weller M.G., Panne U., Schneider R.J. A highly sensitive caffeine immunoassay based on a monoclonal antibody. // Anal. Bioanal. Chem. 2010. V. 396. P. 2617-2628.

223. Лохов П.Г., Арчаков А.И. Масс-спектрометрические методы в метаболомике. //Биомедицинская химия. 2008. Т. 54. № 5. С. 497-511.

224. Ryan D., Robards К., Prenzler P.D., Kenda М. Recent and potential developments in the analysis of urine: A review. // Anal. Chim. Acta. 2011. V. 684. P. 17-29.

225. D?bska J., Kot-Wasik A., Namiesnik J. Fate and analysis of pharmaceutical residues in the aquatic environment. // Crit. Rev. Anal. Chem. 2004. V. 34. P. 51-67.

226. Buchberger W.W. Current approaches to trace analysis of pharmaceuticals and personal care products in the environment. // J. Chromatogr. A. 2011. V. 1218. P. 603-618.

227. Даванков B.A., Волынская A.B., Цурюпа М.П. Сорбционные свойства макросетчатых изопористых полимеров стирола типа "Стиросорб". // Высокомол. соед. Серия Б. 1980. Т. 22. № 10. С. 746-748.

228. Хрящевский A.B., Подловченко М.В., Нестеренко П.Н., Шпигун O.A. Применение сверхшитого микросетчатого полистирола для концентрирования фенолов. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1998. Т. 39. № 3. С. 196-204.

229. Пеннер H.A. Сверхсшитые полистирольные сорбенты для высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Автореф. канд: дисс. М.: МГУ. 2000. 22 с.

230. Лисичкин В.Г. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии. М.: Химия, 1986. 248 с.

231. Филиппов O.A., Тихомирова Т.Н., Цизин Г.И., Золотов Ю.А. Динамическое концентрирование органических веществ на неполярных сорбентах. // Журн. аналит. химии. 2003. Т. 58. № 5. С. 454-479.

232. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. М.: Химия, 1970. 334 с.

233. Реутов O.A., Курц А.Л., Бутин К.П. Органическая химия. Ч. 3. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2004. 544 с.

234. Берштейн И.Я., Гинзбург О.Ф. Таутомерия в ряду ароматических соединений. // Успехи химии. 1972. Т. 41. № 2. С. 177-181.

235. Курбансахетов Х.К., Оразмурадов А.О., Зульфигаров О.С. Использование реакций образования диазоаминосоединений для экстракционного концентрирования и определения ароматических аминов в водах. // Укр. хим. ж. 1990. Т. 56. №5. С. 513-518.

236. Hantzsch A., Burawoy А. Uber die Konstitution der p-Amino-azobenzol Salze. // Ber. 1930. V. 63. №7. P. 1760-1774.

237. Hansel M.C., Rowell F.J., London J., Sidki A.M. Single-reagent polarization fluoroimmunoassay for cotinine (a nicotine metabolite) in urine. // Ann. Clin. Biochem. 1986. V. 23. P. 596-602.