Спектрофотометрический анализ неразделенных смесей (лекарственных и витаминных препаратов) с применением хемометрических алгоритмов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

4844843

На правах рукописи

Власова Ирина Васильевна

Спектрофотометрический анализ неразделенных смесей (лекарственных и витаминных препаратов) с применением хемометрических алгоритмов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук 02.00.02 аналитическая химия

2 8 АПР 2011

Томск-2011

4844843

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Омского государственного университета им. Ф.М. Достоевского.

Научный консультант доктор химических наук, профессор

Вершинин Вячеслав Исаакович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Кузнецов Владимир Витальевич

доктор химических наук, профессор Романенко Сергей Владимирович

доктор химических наук, профессор Штыков Сергей Николаевич

Ведущая организация: Пятигорская государственная

фармацевтическая академия

Защита состоится 8 июня 2011 г. В 14.30 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.269.04 при ГОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30, ТПУ, 2 корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Национального исследовательского Томского политехнического университета по адресу: 634050, ул. Белинского, 53

Автореферат разослан...............2011 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.269.04 кандидат химических наук, доцент

Гиндуллина Т.М.

Общая характеристика работы

Актуальность. Спектрофотометрия прочно занимает второе (после хроматографии) место в анализе многокомпонентных смесей органических соединений. Спектрофотометрические методы хорошо обоснованы в теоретическом отношении и широко применяются на практике, обеспечивая достаточно высокие показатели точности и чувствительности. Спектрофо-тометрию все чаще используют для одновременного определения нескольких аналитов без их предварительного разделения. Проблему неселективности светопоглощения решают, применяя алгоритмы обработки данных, созданные в рамках относительно молодой научной дисциплины - хемо-метрики. С помощью хемометрических алгоритмов легко рассчитать содержания всех или некоторых компонентов смеси даже при полном наложении их спектров поглощения. Поэтому многоволновая спектрофотометрия, которая долго была теоретически интересным, но редко применяемым на практике методом, теперь успешно конкурирует с хроматографией. Известно, что хроматографическое разделение смесей органических соединений может приводить к сдвигу равновесия между разными формами аналитов, их деструкции и другим нежелательным эффектам, а само разделение иногда идет слишком долго. В таких случаях выходом становится спектрофотометрический анализ неразделенных смесей с использованием хемометрических алгоритмов, в частности метода Фирордта (МФ), метода множественной линейной регрессии (МЛР) и метода проекции на латентные структуры (ПЛС). Именно эти алгоритмы чаще всего применяют в анализе многокомпонентных лекарственных и поливитаминных препаратов, что особенно перспективно и выгодно в случае массового анализа однотипных проб. В экспрессных методиках, позволяющих одновременно определять содержания ряда аналитов, заинтересованы как заводские лаборатории, так и контролирующие организации, поскольку объем поступающей на рынок фармацевтической продукции непрерывно растет, и немалая ее часть не соответствует заявленному составу.

К сожалению, анализ неразделенных смесей с применением хемометрических алгоритмов слабо подкреплен теоретическими исследованиями. Недостаточно развита общая методология анализа, не сопоставлены возможности разных алгоритмов, неизвестны метрологические характеристики методик. Не ясно, какие обучающие выборки оптимальны для построения многомерных градуировок. Мало внимания уделяется проблеме неаддитивности, хотя отклонения от аддитивности светопоглощения (ОА) отмечались многими авторами и характерны для самых разных смесей органических соединений. Неизвестно, применимы ли те или иные хемометрические алгоритмы в анализе неаддитивных смесей; не изучена зависимость систематических погрешностей анализа от величины ОА. Нет

рекомендаций по способам уменьшения или исключения влияния неаддитивности.

Цель данной работы - исследование аналитических возможностей и оптимизация некоторых хемометрических алгоритмов (МФ, МЛР и ПЛС) при их применении в спектрофотометрическом анализе неразделенных смесей органических веществ (лекарственных и витаминных препаратов), в том числе при неаддитивном светопоглощении.

В ходе данной работы следовало решить ряд частных задач. А именно:

- проверить, встречаются ли в УФ спектрах поглощения бинарных смесей лекарственных веществ (или витаминов) статистически значимые ОА, оценить их величину, выявить связь ОА с составом смеси и условиями регистрации аналитического сигнала;

- оценить систематические погрешности, вызываемые неаддитивностью светопоглощения в ходе анализа смесей разного типа с применением различных хемометрических алгоритмов, а затем предложить способы снижения этих погрешностей;

- изучить способы формирования обучающих выборок при построении многомерных градуировок, установить, зависит ли оптимальный объем обучающей выборки и способ ее формирования от числа аналитов, а также от аддитивности светопоглощения смесей;

- исследовать влияние разных факторов (число одновременно определяемых аналитов, соотношение их концентраций, присутствие посторонних веществ, выбор спектрального интервала или аналитических длин волн) на точность анализа аддитивных и неаддитивных смесей с применением разных хемометрических алгоритмов;

- сопоставить возможности разных хемометрических алгоритмов и выявить те химико-аналитические задачи, для которых целесообразно применять тот или иной алгоритм;

- на основании проведенных исследований разработать экспрессные методики спектрофотометрического анализа многокомпонентных лекарственных и витаминных препаратов, проверить и аттестовать эти методики.

Научная новизна.

1. Впервые разработан способ оценки предельно допустимых ОА, при которых систематические погрешности анализа бинарных смесей с применением МФ не превышают допустимый уровень. Установлена зависимость систематических погрешностей анализа смесей от величины ОА при аналитических длинах волн (МФ).

2. Предложен, теоретически обоснован и программно реализован новый способ выбора аналитических длин волн (АДВ), позволяющий минимизировать погрешности анализа смесей (МФ), связанные с отклонениями от аддитивности. Предложен способ повышения точности такого

анализа - усреднение результатов, полученных с применением нескольких ранее отобранных наборов АДВ.

3. Предложен, теоретически обоснован и программно реализован новый подход к формированию градуировочных наборов для вычисления коэффициентов по УФспектрам поглощения смесей известного состава. Метод основан на минимизации функционала, характеризующего суммарную случайную погрешность результатов. Вычисленные коэффициенты могут быть применены в анализе аддитивных и неаддитивных смесей с использованием МФ и метода МЛР.

4. Установлена связь правильности и воспроизводимости результатов спектрофотометрического анализа смесей методом ПЛС с объемом обучающей выборки и принципами ее формирования. Определено необходимое и достаточное число модельных смесей (оптимальный объем обучающей выборки) для обеспечения максимально возможной точности анализа смесей, имеющих номинальный состав.

5. Сопоставлены аналитические возможности разных хемометриче-ских алгоритмов в анализе неразделенных смесей по светопоглощению в УФ области. Выявлены химико-аналитические задачи, для которых целесообразно использовать тот или иной алгоритм.

Положения, выносимые на защиту.

1. Возможность применения МФ, МЛР и ПЛС для анализа смесей, в спектрах которых имеются статистически значимые отклонения от аддитивности.

2. Алгоритм прогнозирования возможности одновременного определения методом Фирордта компонентов бинарных смесей с требуемой точностью. Способ прогнозирования систематических погрешностей для анализа неаддитивных смесей с применением МФ.

3. Алгоритм оптимизации условий анализа бинарных смесей по методу Фирордта с учетом отклонений от аддитивности (выбор АДВ). Способ повышения точности анализа смесей по методу Фирордта, основанный на совместном использовании нескольких наборов АДВ.

4. Принципы формирования градуировочных наборов (обучающих выборок) для анализа смесей с применением разных хемометрических алгоритмов (МЛР, ПЛС).

5. Оценки необходимого и достаточного объема обучающей выборки для анализа смеси с заданным числом определяемых компонентов методами МЛР и ПЛС.

6. Комплекс экспрессных спектрофотометрических методик анализа лекарственных и витаминных препаратов сложного состава.

Практическая значимость. Выработаны рекомендации по применению хемометрических алгоритмов (МФ, МЛР и ПЛС) в спектрофото-метрнческом анализе неразделенных смесей органических веществ. Разра-

ботана программа для быстрого поиска оптимальных условий анализа двухкомпонентных смесей по методу Фирордта. Разработана программа для формирования градуировочных наборов и вычисления коэффициентов поглощения по спектрам смесей методом MJIP. Разработаны спектрофо-тометрические методики одновременного определения т активных компонентов в серийно выпускаемых лекарственных и витаминных препаратах, а также премиксах, вплоть до т = 6. Некоторые методики прошли официальную метрологическую аттестацию й включены в Федеральный реестр методик выполнения измерений. Разработанные методики готовы к использованию в контроле производства лекарственных и витаминных препаратов, а также при их сертификации.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международном конгрессе по аналитической химии ICAS-2006 (Москва, 2006), на XVI конференции Euroanalysis (Инсбрук, 2009), на VI и VII международных симпозиумах по хемометрике «Современные методы анализа многомерных данных» (Казань, 2008, Санкт-Петербург, 2010), на сессии Научного Совета Национальной академии наук Украины по проблеме «Аналитическая химия» (Харьков, 2007), на Международной конференции «Аналитическая химия и экология Центральной Азии и Казахстана» (Ал-маты, 2010), на Всероссийских конференциях «Аналитика России» (Москва, 2004, Краснодар, 2007 и 2009), на Съезде аналитиков России (Москва, 2010), на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), на Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008), на конференциях «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2004, Томск 2008), на Всероссийской конференции «Менделеевские чтения» (Тюмень, 2005), на 1-м Международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005), на I Всероссийской конференции по анализу фармацевтической продукции (Москва, 2009), а также на некоторых других конференциях и семинарах.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 статьи, в том числе 15 статей - в журналах, входящих в список ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, общего заключения, выводов, списка литературы (281 источник) и приложения. Первая глава содержит обзор литературы по тематике работы. Вторая глава посвящена объектам и методикам исследования. Главы 3, 4 и 5 содержат результаты исследований, проведенных на модельных смесях разной сложности и связанных с методами Фирордта (гл. 3), множественной линейной регрессии (гл. 4) и проекции на латентные структуры (гл. 5). В 6-ой главе изложены разработанные методики анализа реальных объектов и приведены результаты их проверки и практического применения. Работа изложена на 275 страницах текста, содержит 42 рисунка, 67 таблиц.

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве, состоял в формировании направления исследований, постановке и реализации основных задач, личном участии во всех этапах исследования, как экспериментальных, так и теоретических, а также в интерпретации результатов.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность своему научному консультанту, д.х.н., проф. В.И. Вершинину, за постоянный интерес к работе, ценные советы при постановке исследования и обсуждении полученных результатов. Автор считает своим долгом выразить особую признательность к.ф-м.н., доц. H.A. Исаченко, как основному консультанту по математическим расчетам, а также к.ф-м.н., доц. С.М. Добровольскому, за интересные идеи по реализации алгоритма MJ1P. Автор также выражает благодарность д.ф.-м.н. A.J1. Померанцеву, д.ф-м.н. O.E. Родионовой, д.т.н. И.Е. Васильевой за полезное критическое обсуждение материалов диссертации. Автор благодарит своих бывших аспирантов A.B. Шилову, E.H. Масякову, A.C. Шелпакову за непосредственное участие в выполнен™ экспериментов, а студента A.A. Нагаева и своего сына, А.Г. Власова - за участие в написании компьютерных программ. Автор выражает благодарность компании САМО за предоставление лицензионной версии программы Unscrambler.

Исследования проводились при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (единый заказ-наряд, госконтракт П-1103) и ФЦП «Интеграция». Тематика работы зарегистрирована во ВНТИЦ (№ГР 01.200.2 04679).

Основное содержание работы

Современные тенденции использования спектрофотометрнче-скнх методов в анализе смесей органических веществ (на примере лекарственных и витаминных препаратов). Спектрофотометрическое определение органических веществ в их неразделенных смесях по собственному светопоглощению аналитов в УФ-области давно привлекает аналитиков-исследователей, в этой области ежегодно появляются десятки новых публикаций, в частности, посвященных анализу лекарственных и витаминных препаратов. Анализируя эти объекты, приходится решать общие проблемы спектрофотометрии неразделенных смесей - неселективности и неаддитивности аналитических сигналов, необходимости одновременного определения макро- и микрокомпонентов, учета влияния матрицы и т.п. Кроме теоретического интереса, анализ таких смесей представляет и практическую значимость - бурный рост фармацевтической промышленности требует новых, экспрессных и достаточно точных методов контроля качества поступающих на рынок фармпрепаратов. В настоящее время разработано немало методик анализа лекарственных форм и препаратов по их УФ-спектрам поглощения. Наиболее простой способ - определение компонен-

тов по собственному светопоглощению при одной длине волны. Так анализируют препараты, содержащие одно активное вещество. Расширяют возможности спектрофотометрии дифференциальные методы, а также использование производных спектров. Результаты исследований отечественных специалистов в этой области (работы В.Г. Беликова, E.H. Вергейчика и др.) позволили включить производную спектрофотометрию в XII Государственную Фармакопею РФ.

Усложнение состава анализируемых объектов требует перехода к многоволновой спектроскопии и применения для обработки спектральных данных алгоритмов регрессионного анализа. Наиболее простым его вариантом является метод Фирордта (МФ), обычно используемый для анализа смесей, содержащих 2-3 компонента. МФ включен во многие фармакопеи, в том числе и в Государственную Фармакопею РФ. Большой вклад в развитие МФ внесли работы А.И.Гризодуба с соавт. Но наибольший интерес в настоящее время вызывают те варианты анализа, в которых для нахождения концентраций компонентов используют результаты измерений оптической плотности в широком спектральном диапазоне, а обработку данных ведут с применением хемометрических алгоритмов. Наиболее популярными алгоритмами являются методы множественной линейной регрессии (MJIP), главных компонент (РСА), проекции на латентные структуры (ПЛС). Последний является примером анализа с построением многомерных градуировок и достаточно широко представлен в работах зарубежных исследователей. В нашей стране недостаточная распространенность соответствующих компьютерных программ и слабое знакомство аналитиков с возможностями хемометрики пока что препятствуют широкому применению этого метода, в том числе и в фармацевтическом анализе. В этой связи следует отметить работы А.Л.Померанцева и О.Е.Родионовой, в которых авторы одними из первых продемонстрировали возможности хемометрических алгоритмов при выявлении фальсифицированных лекарств. Недостатком методик количественного анализа с применением алгоритма ПЛС является длительная и трудоемкая процедура формирования больших обучающих выборок для построения на их основе многомерных градуировок. В литературе вопрос о том, как оптимизировать стадию предварительной подготовки образцов, каково минимальное количество образцов, необходимое для анализа того или иного объекта, практически не освещен. Между тем, надежность аналитического метода в значительной мере зависит от того, какие данные были использованы для построения и проверки соответствующей модели. Мало в литературных источниках сведений и о метрологических характеристиках разработанных методик. Все это указывает на недостаточно проработанную общую методологию современного спектрофотометрического анализа смесей с применением хемометрических алгоритмов. Ее развитие, как в теоретическом, так и в практическом плане, представляется весьма актуальной

задачей, решение которой позволит более активно и широко внедрять спек-трофотометрию в сочетании с хемометрикой в практику анализа многокомпонентных смесей, в частности, фармпрепаратов.

Объектами анализа в настоящей работе являлись некоторые лекарственные и витаминные препараты сложного состава, а также витаминные добавки к кормам - премиксы. Объекты определения составляли две группы. В первую вошли лекарственные вещества: анальгин (Ан), хинина гидрохлорид (ХГ), кофеин (Кф), парацетамол (Пр), папаверина гидрохлорид (ПГ), дибазол (Дб), ацетилсалициловая кислота (АСК), фенобарбитал (Фб). В состав второй группы вошли водорастворимые витамины: тиа-мингидрохлорид (витамин ВО, рибофлавин (витамин В2), пантотеновая кислота (витамин В3), никотиновая кислота (витамин В5), пиридоксина гидрохлорид (витамин Вв), викасол (витамин К3), аскорбиновая кислота (витамин С). Соединения первой группы являются самостоятельными лекарственными средствами, а также входят в состав различных лекарственных препаратов, как правило, многокомпонентных. Соединения второй группы (витамины) входят в состав многокомпонентных витаминных препаратов, а также добавок к кормам - премиксов. Объектами исследования были модельные смеси лекарственных веществ (2-4 компонента), и смеси витаминов (4-6 компонентов). Рабочие растворы смесей витаминов готовили в среде 0,01М НС1, смесей ПГ-Дб - в среде 0,01М №ОН, остальные смеси - в дистиллированной воде, с добавлением соответствующих буферных растворов (фосфатный, аммиачный); рН среды был подобран с учетом кислотно-основных свойств веществ и обеспечивал устойчивость растворов смесей в течение нескольких дней. Исключение составляли растворы смесей, содержащие Ан, их использовали в течение первых 30 мин после приготовления. Среди смесей обязательно присутствовали такие, в которых соотношение компонентов отвечало составу реальных объектов, т.е. лекарственных или витаминных препаратов (смеси номинального состава). Готовили также модельные смеси, в которых содержания всех или некоторых компонентов отличались от номинальных значений на ±(10-50)%. Часть этих смесей использовали в качестве стандартных для формирования обучающих выборок. По остальным смесям (тестовым) проверяли правильность результатов анализа. По результату определения /-го компонента 7-ой тестовой смеси вычисляли относительную погрешность его определения (далее ¿¡,), а взятые по модулю погрешности определения каждого компонента усредняли по g тестовым смесям данного набора:

Объекты и методики исследований

О)

Кроме тога, рассчитывали обобщенную по т компонентам данной смеси характеристику погрешности анализа:

Все смеси готовили не менее трех раз, спектры поглощения снимали на спектрйфотометре СФ-2000, в кварцевых кюветах толщиной 10,0 мм, в диапазоне 200-500 нм с шагом 0,2 нм. Прецизионность измерений в диапазоне значений оптической плотности 0,1-0,8 характеризуется величиной 5Г порядка 0,005. В качестве примера приведены спектр раствора номинальной 4-компонентной смеси лекарственных веществ и спектры растворов компонентов в тех же концентрациях, что и в смеси (рис. 1,А).

Для оценки аддитивности светопоглощения модельных смесей использовали .^-критерий. Статистически значимыми (а = 0,05) считали те отклонения от аддитивности, для которых выполнялось условие ДА = | 1А\ > 35. Здесь Ле - оптическая плотность смеси, ХА - сумма оптических плотностей компонентов, взятых порознь в тех же концентрациях и в тех же условиях регистрации сигнала. Статистически значимые ДА были выявлены в спектрах бинарных смесей ПГ-Дб и Кф-Ан с разным соотношением компонентов, в спектрах 4-компонентных смесей Ан-Дб-ПГ-Фб (рис. 1,Б), а также в спектрах 5-6-компонентных смесей витаминов. Вероятная причина неаддитивности смесей, содержащих ПГ и Дб, - взаимодействие компонентов между собой с образованием ассоциатов. Неаддитивность смесей на основе Ан обусловлена неустойчивостью растворов Ан и его способностью со временем окисляться, причем скорость окисления зависит от концентрации других компонентов смеси.

(2)

1—Ан, С - 25,0 мсгьп 2-ПГ, С • 2р мкг*л

Э—Д5,ОЗДми**1 4-«б.С-ЗДмсг'ЬЛ

3—~мом1магн>нал смеси

>09

А

Б

Рис. I. А - Спектры поглощения растворов Ан, ПГ, Дб, Фб и их смеси. Б — Проверка аддитивности светопоглощения смеси

Обработку спектральных данных вели с применением программных продуктов (табл. 1).

Таблица 1

Программные продукты и их назначение

Программный продукт Назначение

Microsoft Excel Вычисление коэффициентов поглощения индивидуальных соединений; компьютерное моделирование спектров аддитивных смесей; статистическая обработка результатов измерений и вычислений (Р = 0,95).

Optic-Tablet Расчеты по методу Фирордта: выбор аналитических длин с помощью нового критерия; нахождение концентраций аналитов в модельных растворах и реальных препаратах; вычисление относительных погрешностей определения аналитов; расчет М „,„,„.

Optic-MLR Формирование градуировочных наборов для метода МЛР-2; расчет коэффициентов по спектрам стандартных смесей во всем спектральном диапазоне; вычисление концентраций компонентов в анализируемых смесях методом МЛР.

Unscrambler Построение многомерных градуировок методом ПЛС; вычисление концентраций компонентов в смесях с применением этих градуировок.

Анализ бинарных смесей методом Фирордта Прогнозирование систематических погрешностей по величине отклонения от аддитивноспш. Анализ бинарных смесей методом Фирордта ведут, решая систему линейных уравнений:

\0\-l-С^+^-1-Су =

[а2 ■1-схл-Ъг -1-су ~Аг '

где аи а2, Ьи Ь2 - коэффициенты поглощения веществ X и У, соответственно при /,! и ).ъ сх и Су — концентрации X и У в смеси, / - толщина поглощающего слоя. Выбор АДВ должен обеспечивать хорошую обусловленность матрицы коэффициентов а,, а2, Ь\, Ь2, т.е. значение Г = / (а2 ¿1 - а\ Ь2) должно быть как можно большим. Вычисляют концентрации X и У, решая систему (3), например, методом Крамера:

сх А2~Ь2АХ)^\ (За)

сг =(а2 ~а,А2)(~1. (36)

Если при выбранных АДВ проявляются статистически значимые отклонения от аддитивности АА (А\ = А1 + ДА/; А2' = Л2 +ЛА2), применение МФ должно приводить к неверным результатам анализа. При анализе «не-

аддитивной» смеси расчет содержаний ведут, используя систему уравнений (4):

2 •/•Сх + Ь2 "1'Су = А2

Решение системы (4) приводит к следующим оценкам концентраций компонентов X и У:

СХ =(Ь1А; -Ь2а;)Г\ (4а)

с'у =(а2А; -а1А'2)Г\ (46)

Вычисленные по (3) и (4) концентрации X и У будут отличаться между собой (сх ~ сд + Асх; Су = Су + А су). Это позволяет найти зависимость абсолютных погрешностей Ас от величины отклонений от аддитивности:

Асх=(ЬхАА2-Ь2АА,)Г\ (5а)

А сг = (а2АА1-а1АА2)Г\ (56)

Требования к точности результатов анализа обычно задают в виде предельно допустимых значений относительных (а не абсолютных) погрешностей. В рамках выбранной модели можно определить, к каким относительным погрешностям (5с) могут привести отклонения от аддитивности. По определению,

(6а); (66)

сх Су

Подставляя в (6а) выражения (За) и (5а), а в (66) выражение (36) и (56), получаем:

&х=ЬМг~Ьг^ (7д); (76)

1\А2 ~Ь2Ах а1А2-а2А1

Из (7а) и (76) следует:

1) даже в тех случаях, когда отклонение от аддитивности наблюдается только при одной из АДВ, с систематическими погрешностями должны определяться оба компонента;

2) погрешности анализа будут больше (по модулю), если отклонения при различных АДВ имеют разные знаки;

3) при неизменных значениях АА погрешности Ас, и Ас у должны быть тем больше (по модулю), чем меньше значение I, т.е. хуже обусловленность матрицы коэффициентов;

4) рост АА ведет к увеличению (по модулю) погрешностей анализа.

Указанные следствия из (5а) и (56) соответствуют известным теоретическим рекомендациям по выбору АДВ, но сами эти формулы (оценки систематических погрешностей метода Фирордта) в просмотренной литературе найдены не были - вероятно, они выведены впервые. Приведенные

формулы были проверены и подтверждены в компьютерном, а затем и натурном эксперименте на модельных смесях известного состава. Вышеизложенный способ прогнозирования систематических погрешностей можно использовать и в случае смесей с большим числом компонентов.

Прогнозирование возможности одновременного определения ана-литов с погрешностями, не превышающими заданный предел. Любой набор АДВ можно считать приемлемым, если его использование позволяет определять аналиты с погрешностями, не превышающими некоторый заданный предел 6стах. Однако оценить критические значения отклонений (далее ААкр11М), при превышении которых погрешность определения хотя бы одного из компонентов смеси превысит допустимый предел, алгебраический метод не позволяет. Соответствующие критерии можно найти геометрически, если рассматривать обобщенную погрешность определения обоих аналитов, а не погрешности определения каждого из них в отдельности. На рис.2 показано графическое решение систем (3) и (4). Сплошные прямые заданы уравнениями системы (3). В зависимости от знаков АЛ/ и ЛА2, решением системы уравнений (4) будет точка пересечения одной из четырех пар пунктирных прямых, на рис. 2 это точки К, Ь, М, N. Точки £ и N симметричны относительно £?> то же относится и к точкам М и К. Поэтому в дальнейшем будем считать, что решением системы (4) является либо точка М, что соответствует А' = Л, + АА1 и а'2 ~ А2+ АА2, либо точка что соответствует А[ = А1 +АЛ, и Аг = А2 -ДА2 . Область значений сх* и

су, удовлетворяющих заданной точности анализа, в пространстве концентраций будет представлять собой прямоугольник АВСй с центром в точке Q (рис. 2). Длина диагонали AQ будет обобщенно характеризовать максимально допустимую погрешность определения аналитов ЛГ и У. Ее можно вычислить по теореме Пифагора:

Если компонент У в смеси находится в 2-кратном избытке (су = гсх), а относительные погрешности определения обоих компонентов не должны превышать (по модулю) один и тот же, заранее заданный предел §стах, то верхние пределы абсолютных погрешностей определения X и ¥ должны быть следующими:

+

(8)

Дс%зх = дстах сх (9а), Ас™™ = ¿стах' сх.

Подстановка (9 а) и (9 б) в (8) приводит к выражению:

,тах

(96)

Ай = 8стп- сх-41 + 22 .

.тах

(10)

С*

Рис. 2. Графическое решение системы уравнений для нахождения концентраций компонентов методом Фирордта.

Сплошные линии заданы уравнениями системы (3), пунктирные - системы (4).

Сх, су-истинные концентрации X,Y (координаты точки Q), АСх, Асу-максимально допустимые абсолютные погрешности определения X,Y.

Прямоугольник ABCD - область допустимых концентраций X, Y.

Точки К, L, М, N-решения системы уравнений (4)

Приемлемым решение можно считать только тогда, когда соответствующая ему точка будет принадлежать прямоугольнику ABCD. Обобщенной характеристикой погрешности определения сх и су будут являться длины отрезков QN и QM. Сравнивая их с отрезками AQ и RQ, можно оценить, при каких значениях АА^п на выбранном наборе АДВ решение системы уравнений (4), т.е. точка пересечения прямых, будет лежать в пределах прямоугольника ABCD, а при каких - наверняка окажется за его границами. Формулы для расчета QN (QM) выведем через ЛА, и АА2 и коэффициенты ai, a,, bi, 6j. Вначале решением систем уравнений (3) и (4) и приняв / = 1, найдем координаты точек Q и N (М), а затем по формулам

(5а) и (56) координаты вектора QN (QM), т.е. Асх и Асу. При AAi и ААг одного знака имеем координаты вектора QM , разных знаков - вектора QN. Затем получаем формулы для вычисления длины вектора QM:

(И)

и длины вектора QN:

Допустимые отклонения от аддитивности. Отклонения, позволяющие определять оба компонента с заданной точностью, будем называть допустимыми. Для этого достаточно, чтобы ОЫ < Щ). С учетом (9а) и (12) получаем неравенство:

,/[(АМ +ДАфг)2 +(ДЛ,йг2 + Д^[2а1)2]-|г1| < 6с"™сх . (13)

Если рассматривать ААи ААг как координаты точек на плоскости АЛ ¡ОАЛ2, то неравенство (13) задает на этой плоскости множество, ограниченное эллипсом, причем эллипс расположен так, как показано на рис. 3 (это несложно выяснить, используя методы аналитической геометрии или же методы математического анализа). Областью допустимых значений АА\, ААг является часть этого множества, лежащая в первой четверти, на рис. 3 она заштрихована. Из рис. 3 также видно, что максимально допустимому значению АА\, назовем его АА1крит, соответствует АЛ2= 0, и наоборот.

к

ла2

\ О \ ДА!

Рис. 3. Графическое решение неравенства (13) для нахождения допустимых отклонений от аддитивности. Заштрихована область допустимых значений отклонений от аддитивности

Полагая в (13) АА2= 0, и заменяя знак неравенства равенством, найдем АЛ[крит:

АЛцу„м = , - ,"■ (14)

Аналогично, полагая АЛ1 = 0, находим АЛ^т'

АЛ-

¿С^СуЫ

2крит

(15)

'

Отрезок АА{критАА^ит целиком лежит в заштрихованной области. Поэтому вместо криволинейного треугольника АА^пОАА^,,,,,, одной из сторон которого является дуга эллипса, можно рассматривать прямолинейный треугольник АА^щОАА^т- Это несколько сужает область допус-

тимых значений ДА1 и АА2, зато упрощает вычисления, а именно: допустимыми можно считать такие отклонения от аддитивности, которые удовлетворяют условию:

¿Ц АА2

^1крит Крит

<1. (16)

При выполнении данного условия наличие отклонений от аддитивности не помешает определению компонентов с заданной точностью, независимо от того, являются отклонения случайными или систематическими.

Недопустимыми отклонениями от аддитивности будем считать такие, при которых, по крайней мере, один компонент наверняка будет определяться с погрешностью, превышающей заданный предел. В этом случае обобщенная характеристика погрешности, 0,М, превышает А(), т.е. QM>AQ. Запишем данное неравенство с учетом (10) и (11):

^[(Д/1^2 -Д/^Ь,)2 +(М2а1 -ДЛ1а2)2]-|г1|><5стах - сх-4\ + гг , (17)

и выразим из него ДАг\

АА2 >

2

(а2 + б,2) - АЛ,2 + АЛ, (а, а1+ЬхЬ2)

■(*»?+*?)-■ .(18)

Приравняв подкоренное выражение нулю, решим его относительно ДА;. Это и будет максимально допустимое по модулю значение ЛА,'кр!1т ■

М1,™ = 4и^8с™сх ^ +Ь2, . (19)

Аналогично найдем и ДА2крит :

= Я^7бс™*сх 4а\+Ъгг . (20)

Если хотя бы при одной АДВ АА будет больше АА*кр11т, то обязательно один, а с большой долей вероятности оба компонента будут определяться с погрешностью, превышающей заданный предел. В промежуточных случаях, когда ДАчят<&4 < ЛА^рит, можно ожидать, что, по крайней мере, один компонент определится с относительной погрешностью, меньшей <5с■Гах. Более точного прогноза в этом случае сделать нельзя.

Для проверки сделанных выводов был проведен компьютерный эксперимент: 1) вводили численные значения коэффициентов поглощения компонентов смеси при заданных АДВ, концентрации компонентов и максимально допустимую погрешность, равную 4 % отн.; 2) по формулам (14), (15), (19), (20) для каждой АДВ вычисляли значения ДЛ^иИ АА^ит ;

3) задавали значения ДЛ) и АА2 в долях (а) от ААкрт, (АА*крит), т.е. АА = аАЛфмС АА*крит); 4) для каждого компонента вычисляли относительные погрешности, 5сх и ¿су, используя формулы (7а) и (76). Данные прогноза возможности (или невозможности) одновременного определения компонентов по величинам АА хорошо согласовались с погрешностями, вычисленными при заданных АА с применением выведенных алгебраических формул (7а) и (76). В качестве примера приведем результаты компьютерного эксперимента, выполненные для смеси ХГ-Ан составов 1:1 и 1:4 (табл. 2). Видно, что вывод о необходимости совместно учитывать значения ДА\ и АА2 полностью подтвердился.

Таблица 2

Компьютерный эксперимент прогноза возможности определения

компонентов смесей ХГ-Ан с погрешностью не более 4 %, по величине АА

АА в долях (а) от ААч„т (АЛ кт,т) Условия Прогноз Относительные погрешности, %

1-ая АДВ 2-ая АДВ 1 :1 1 :4

«7 «з ХГ Ан ХГ Ан

0,3 0,5 1 АА, ААг Оба обязательно хорошо 1,7 -2,4 1,7 -0,6

0,5 0.3 2,2 -2,0 2,2 -0,5

1 0 3,6 -1,7 -3,6 0,4

0,7 0,3 -!— +-1—<1 &А\кршп ААгкрит 2,2 0,0 2,9 -0,6

0,5 0,5 1,2 1,1 -2,4 0,7

1 0 -1,2 3,8 -1,2 1.0

2 0,3 2 ААкрит< АА <АА'кри„ Хотя бы один хорошо 3,6 -8,1 3,6 -2,0

1,5 0,5 3,7 -6,5 3,7 -1,6

1,2 0,7 4,0 -5,7 4,0 -1,4

1 0 3 АА^АА'^п Один обязательно плохо 7,7 -3,6 20,5 -2,4

0 1 -2,4 7,4 -7,1 5.4

1 1 4,6 4,4 13,4 3,0

1,3 0,7 0,9 21,7 0.7

Погрешности вычисляли с учетом знаков АА: I и 2 условия - АА разных знаков, 3 условие - АА одного знака.

Установленные в эксперименте АА в спектрах исследованных смесей при АДВ сравнивали с предварительно вычисленными значениями ААкрит и АА'крит, и определяли, какому из 3-х рассмотренных в компьютерном эксперименте условий они соответствуют. После этого находили концентрации компонентов и вычисляли относительные погрешности. Во

всех случаях наблюдалось хорошее согласование прогноза и реальных погрешностей анализа (табл. 3).

Таблица 3

Проверка прогноза возможности определения компонентов модельных

смесей с погрешностью, не превышающей 4 %, по величине АЛ

А налиты Соотношение ДА отвечают Реальные погрешности, 5с, %

Х-У X: У условиям X У

Кф-Пр 1:5 2 1,4 -1,5

1 :20 1,5 0,9

1:6 1 1,9 -0,8

Кф-Ан 1 :10 2 -7,5

8 :1 3 20 -15

ПГ-Дб 1 : 1 1 3,6 0,8

1 :4 2 -6,2 -0,8

ХГ-Ан 1:4 1 0,7 0,2

1 : 10 3 16 5,3

Таким образом, предложенный алгоритм прогнозирования допустимых отклонений от аддитивности при определении компонентов бинарных систем по совокупным измерениям аналитического сигнала нашел свое подтверждение на примере анализа смесей методом Фирордта. Возможность проведения анализа с применением одного набора АДВ зависит от соотношения компонентов.

Способы уменьшения слияния неаддитивности на результаты анализа. Выбор аналитических длин волн. Задачей, которая решалась на данном этапе работы, было упрощение алгоритма поиска общих наборов АДВ для одновременного определения компонентов бинарных смесей, как в отсутствие, так и при наличии значимых отклонений от аддитивности.

Влияние случайных погрешностей мы предлагаем учитывать, используя для выбора АДВ коэффициенты вариации Ш (или значения Бг) при многократном измерении оптической плотности смеси на соответствующих длинах волн. Чем меньше будут значения IV, и тем меньшие (при прочих равных условиях) случайные погрешности следует ожидать при определении X и У . Желательно, чтобы значения и \У2 были близки между собой. Необходимо также учитывать соотношение коэффициентов поглощения компонентов при выбранных АДВ. С этой целью иногда используют критерий Ко:

К0=со*а = ~1Л^+Ь1-Ь2 • (21)

•у/а,2 + 62 + 62

В пространстве концентраций величина К0 соответствует косинусу угла между прямыми (1) и (2), которые описываются уравнениями Фи-

рордта (см. рис. 2). Очевидно, чем ближе к нулю величина К0, тем меньше при прочих постоянных условиях будут погрешности определения концентраций.

Если отклонения от аддитивности статистически незначимы, мы предлагаем выбирать АДВ с помощью критерия К *, который одновременно учитывает величину случайных погрешностей, их соотношение и значения коэффициентов поглощения:

где IV2 — коэффициенты вариации при параллельных измерениях оптических плотностей смеси на соответствующих длинах волн (нумерация длин волн такова, что (V, > IV2). Оптимальными будут те наборы АДВ, которым соответствуют наименьшие значения критерия К*. Отметим, что если при разных АДВ коэффициенты вариации статистически не различимы, второй и третий сомножители в формуле (22) не будут влиять на выбор АДВ, он будет определяться лишь соотношением коэффициентов поглощения компонентов (величиной Ко), что согласуется с известными критериями выбора АДВ.

Выбор АДВ при наличии значимых отклонений от аддитивности. Мы рекомендуем выбирать АДВ с помощью эмпирического критерия К, аналогичного критерию К*. При вычислении К вместо коэффициентов вариации используем относительные отклонения от аддитивности

Индексы расставляют так, чтобы выполнялось условие |<5/li|> \SA2\. Критерий К может иметь как положительные, так и отрицательные значения. Очевидно, чем меньше будут значения SA и чем ближе их отношение к 1, тем меньшими (по модулю) окажутся значения критерия. Именно эти наборы АДВ и следует использовать в анализе. Расчеты по выбору АДВ выполняли с помощью оригинальной компьютерной программы «Optic-Tablet», написанной в пакете Microsoft Excel. В ее основе - последовательный перебор решений системы двух линейных уравнений для разных наборов АДВ. Пользователь вводит действительные концентрации компонентов, длины волн (с шагом 5 нм) и для каждой длины волны - коэффициенты поглощения компонентов, средние значения оптической плотности смеси, а также либо коэффициенты вариации оптической плотности, либо АА. Результатами работы программы являются вычисленные для всех наборов длин волн: значения критерия К* (или К), найденные концентрации (сх и су), а также относительные погрешности определения каждого ком-

(22)

ÔА = ДА/А.

SA,

(23)

понента, ¿с, %. В качестве примера на рис. 4 приведены результаты, полученные для неаддитивной смеси ПГ-Дб (1:1). Как видно, для данной смеси существуют такие наборы АДВ, при которых для обоих компонентов одновременно выполняется условие ¿с ~ 0. Это наборы, характеризующиеся минимальными значениями критерия К по абсолютной величине (К « 0). Обычно количество «подходящих» наборов АДВ было довольно большим (10-20), что обеспечивало возможность дальнейшего выбора АДВ.

6СЛ.К

25 15 5 -5

о - олМ^^

у

Ьед г .......-АлЛ^- -^^Г^^Г-^КГ

О1

о ьаА &'М '<Э 30 40 О 505 ,60

(ЭДМ**« 9 *> СГ 0 Ь

О © О

№ набора

-25

длин волн

А к ОЛ„г •&дб

Рис. 4. Значения критерия К и относительных погрешностей (&, %) определения ПГ и ДБ при использовании разных наборов длин волн (сПГ= Сд6 = .5,0 мкг/мл)

Результаты анализа неаддитивных смесей на АДВ, выбранных с применением критерия (24), приведены в табл. 4. Во всех случаях выбранные АДВ находились вне участков спектра смеси, где отклонения от аддитивности были статистически значимы. Систематические погрешности результатов анализа во всех случаях не превышают 3% отн. и статистически не значимы.

Таблица 4

Анализ неаддитивных смесей на АДВ, выбранных с помощью критерия К

Компоненты Х-У С, мкг/мл АДВ, нм «5с, % &(п=3)

X У X У X У

ХГ-Ан 2,4 14,4 295 / 305 1,0 1,0 0,04 0,04

2,4 18,2 285/310 -1,7 -0,5 0,01 0,02

Кф-Ан 2,4 24,0 250/285 -1,9 -2,2 0,04 0,05

18,2 2,4 250 / 285 1,9 -2,7 0,02 0,08

ПГ-Дб 5,0 5,0 230/270 0,5 -0,5 0,04 0,06

3,0 18,0 235 / 280 -0,4 -1,9 0,03 0,05

Расчеты на всех возможных наборах длин волн позволяют получить большую выборку результатов анализа смеси, не проводя дополнительных

экспериментов. Было изучено статистическое распределение результатов анализа модельных смесей, полученных на разных наборах длин волн. В качестве примера на рис.5 приведены гистограммы распределения результатов анализа модельной смеси ПГ - Дб (1:1). Здесь по оси абсцисс приведены средние значения концентраций аналитов в каждом классе, а по оси ординат - частота повторения результата, что соответствует числу наборов длин волн, на которых получаются значения концентраций, попадающие в один класс. Близость распределения результатов к нормальному характеризовали с помощью х2 -критерия.

Как видно из приведенных данных, распределение результатов определения компонентов данных смесей имеет характер, близкий к нормальному, значение %2-критерия не превышает критический уровень (Р=0,95). Наличие достоверного отклонения от аддитивности не влияет на характер распределения результатов. Аналогичные результаты были получены для всех исследуемых систем. Отметим, что значения концентраций, рассчитанные на выбранных по новому критерию АДВ, во всех случаях попадали в центральные классы гистограмм.

Папаверина гадрсшюрчц

4,38 4,62 4,86 5,09 5,32 5.55 5,79 6,02 Средние концентрации, мкг/ил

4,82 4,94 5,01 5,11 5,21 6,30 5,49 Средние концентрации, миг/мл

5,60

Х2эксп - 5,35 X2 эксп - 2,38

Рис. 5. Гистограммы распределения результатов определения компонентов модельной смеси папаверина гидрохгсорид - дибазол.

ст = Сдд = 5,0 мкг/мл, / ТАБЛ. = 7,78 (Р = 0,95). Объем выборки в обоих случаях - 89

Но близость характера распределения к нормальному еще не является доказательством того, что результаты, полученные на разных наборах длин волн, можно рассматривать как независимые. На самом деле они, безусловно, коррелированы, и следовало выяснить степень их корреляции, в первую очередь, на тех наборах длин волн, которым соответствуют минимальные значения критерия. Для этого был проведен корреляционный анализ результатов определения компонентов, вычисленных не менее чем на 15 наборах длин волн с малыми значениями критерия. Данные по некоторым смесям приведены в таблице 5.

Таблица 5

Коэффициенты корреляции результатов определения компонентов на 15 наборах длин волн с малыми значениями критерия гта6л = 0,51 __ (Р=0,95)_

Компонент Концентрация, мкг/мл Коэффициент корреляции, гЭ1;сп

1 2 1 2 1 2

ХГ Ан 3,2 12,8 0,09 -0,04

Кф Пр 1,6 12,8 0.06 -0,06

Кф Ан 3,2 19,2 0,04 0,09

ПГ Дб 2,4 2,4 -0,01 -0,10

Очевидно, корреляцией результатов можно пренебречь - во всех случаях экспериментальные значения коэффициентов корреляции намного меньше гтабл. Следовательно, с помощью предложенного критерия можно выбирать несколько наборов АДВ, проводить на них определение и считать полученные результаты независимыми. Такой подход позволяет получить большее количество данных, не проводя дополнительных экспериментов, что сокращает время анализа и делает его дешевле. Для каждой смеси были отобраны по три набора АДВ из числа тех, что характеризовались малыми значениями критерия К. Анализ смесей проводили на каждом наборе АДВ трижды. Дисперсии результатов анализа, полученных на каждом го трех наборов АДВ, во всех случаях были однородны по критерию Кохрена. Средние значения трех выборок статистически не различались (по критерию Стьюдента). Результаты анализа смеси ПГ-Дб на трех наборах АДВ представлены в табл. 6.

Таблица 6

Результаты анализа модельной смеси папаверина гидрохлорид - дибазол

с применением трех наборов АДВ (спг = сД( = 5,0 мкг/мл, п=3)

АДВ, нм 6с,% Sr

ПГ Дб ПГ Дб

230 270 0,5 -0,5 0,04 0,06

230 275 -1,5 1,1 0,05 0,02

230 280 0,9 -0,3 0,05 0,07

Средние значения трех выборок -0,1 0,1 0,01 0,01

Сравнивая результаты, полученные на каждом из наборов с усредненными данными, можно видеть, что при усреднении уменьшается погрешность определения компонентов (вплоть до 0,1 %) и улучшается сходимость, т.е. повышается точность анализа в целом.

Наборы АДВ, выбранные для смесей номинального состава, в дальнейшем были использованы в анализе лекарственных препаратов с тем же соотношением активных компонентов. В связи с этим, необходимо было

проверить, возможно ли применение этих наборов АДВ к анализу смесей с другими концентрациями каждого компонента. Оказалось, что даже при изменении содержания каждого компонента в смеси на ±20%, относительная погрешность его определения не превышала 3-4 %. Это позволяет рекомендовать выбранные наборы АДВ для определения содержания активных компонентов в соответствующих лекарственных препаратах. Но при существенных различиях в соотношениях одних и тех же компонентов оптимальные наборы АДВ были разными. Так, Пр и Кф в «Солпадеине» находятся в соотношении 18 : 1, а в «Панадоле» -8:1. Для анализа каждого препарата были подобраны свои наборы АДВ.

Анализ бинарных смесей в присутствии посторонних веществ. В состав таблетированных лекарственных препаратов помимо активных компонентов входят наполнители - гидрокарбонат натрия, крахмал, оксид магния, тальк, глюкоза. Была проведена проверка мешающего влияния этих веществ. Установлено, что в выбранных условиях поглощение водных растворов данных наполнителей при концентрации вплоть до 15мкг/мл находится на уровне 0,003-0,01, и не превышает ЗБ значений оптической плотности. Следовательно, указанные наполнители, присутствующие в таблетках, не будут мешать количественному определению исследуемых веществ, что и было подтверждено в эксперименте. В табл. 7 приведены результаты определения компонентов модельных смесей в присутствии глюкозы с концентрацией 10 мкг/мл.

Таблица 7

Определение компонентов модельных смесей (МФ) в присутствии глюкозы

АДВ, нм Компонент Введено, мкг Навдено, мкг ¿с, %

235/250; 235/255; 235/260 Ан 40,0 40,1 ±0,1 2,5

ХГ 9,7 9,6 ±0,1 -1,0

245/265; 250/265; 255/265 Кф 15,0 15,1 ±0,1 0?7

Пр 15,0 14,8 ±0,3 -2,7

230/270; 230/275; 230/280 пг 30,0 30,3 ± 0,3 1,0

Дб 32,0 32,6 ± 0,2 2,3

Применение метода множественной линейной регрессии

Метод Фирордта позволяет получать хорошие результаты при анализе бинарных смесей, как в отсутствие, так и при наличии в спектрах отклонений от аддитивности. Но его применение может быть ограничено, если:

а) в спектре смеси ДА превышают свои критические значения;

б) коэффициенты поглощения индивидуальных соединений при всех длинах волн близки между собой, что ведет к плохо обусловленной матрице (значение / слишком мало);

в) соотношение компонентов в анализируемых смесях неизвестно или меняется в очень широком диапазоне, а значит, применение одного и того же набора АДВ не может обеспечить одинаковую точность анализа во всем диапазоне соотношений;

г) требуется определять одновременно более 2-3 аналитов.

Альтернативой МФ может быть метод множественной линейной

регрессии (МЛР). Все алгоритмы МЛР основаны на использовании алгебраических уравнений, связывающих оптическую плотность раствора при некоторой длине волны с концентрацией каждого из т определяемых веществ. Используют данные о поглощении компонентов смеси, полученные при р длинах волн (р » т), а затем решают сильно переопределенную систему уравнений вида

т

м

В основе ее решения лежит классический вариант метода наименьших квадратов (МНК). Решением системы будут концентрации, для которых выполняется условие:

р т

Т.(Ук*«пЧтм.у-Ц1'аЦ ■Cj)2~> min • (25)

Коэффициенты щ могут быть вычислены по спектрам растворов индивидуальных соединений (вариант прямой градуировки, далее МЛР-1), либо по спектрам стандартных смесей (вариант непрямой градуировки, далее MJIP-2). Полученные вторым способом коэффициенты а* могут несколько отличаться от молярных или удельных коэффициентов поглощения тех же аналитов при тех же длинах волн. В этом случае о* правильнее называть регрессионными коэффициентами.

Заложенный в пакете Excel алгоритм регрессионного анализа предусматривает решение только линейного варианта множественной регрессии. Для его применения необходимо выполнение основного закона свето-поглощения и аддитивности оптической плотности анализируемой смеси. Но в спектрах части исследованных смесей присутствовали неаддитивные участки. Следовало выяснить: какой может быть точность анализа с применением алгоритма МЛР, особенно при неаддитивном светопоглощении компонентов; сколько аналитов могут быть определены методом МЛР с погрешностью, не превышающей среднюю погрешность спектрофотомет-рического анализа, т.е. порядка 5 % ога.

Применение метода МЛР-1. Вычисление концентраций методом МЛР-1 с применением всего спектрального диапазона для большинства исследованных аддитивных смесей не дало хороших результатов. Исключение

составляли смеси Пр-Кф: при всех соотношениях, вплоть до 20-кратного избытка Пр, оба компонента определяются с погрешностью, не превышающей 5 % отн. В остальных случаях точное определение компонентов бинарных систем оказалось возможным при достаточно узком варьировании соотношений, например, в смесях Кф-Ан определение компонентов с погрешностями менее 5 % отн. возможно только при их соотношении 1:1, в смесях Хг-Ан - от 1 : 1 до 1 :4. С увеличением концентрации одного из компонентов ошибки достигали 15-20%. Анализ 3-компонентных смесей Кф, Пр и АСК позволял определять с погрешностью, не превышающей 5 % отн, как правило, только один из компонентов, чаще всего - Кф. Систематические погрешности определения Пр составляли 6-15 % отн., АСК - 8-20 % отн.

Еще больше были систематические погрешности анализа неаддитивных смесей, как, например, ПГ-Дб, Ан-Дб-ПГ-Фб или 5-6-компонент-ных смесей витаминов. Так, погрешности определения Дб во всех модельных смесях превышали 10-15 % отн. В 4-6 компонентных системах с погрешностью менее 5 % отн. удавалось определить один, реже - два компонента. Как правило, это были компоненты, чей вклад в светопоглощение смеси был основным, например, Ан в системе Ан-Дб-ПГ-Фб, или витамин В5 - в системе B,-B2-Bs-B6-K3. Таким образом, результаты анализа практически всех смесей, как аддитивных, так и неаддитивных, с применением метода МЛР-1 ко всему спектральному диапазону оказались неудовлетворительными. Причиной этого не могли быть эффекты только неаддитивности или нелинейности отклика. Вероятнее всего, причина заключается в использовании слишком широких спектральных интервалов. В этом случае для расчета концентраций используются коэффициенты не только в максимумах поглощения отдельных компонентов, но и в тех областях спектра, где они поглощают слабо, т.е. где их коэффициенты поглощения близки к нулю. При малых значениях коэффициентов случайные погрешности измерений оптической плотности будут вносить существенно больший вклад в общую погрешность анализа. Полученные результата согласуются с известными литературными данными, согласно которым в спектрах многокомпонентных систем могут быть участки, использование которых не только бесполезно, но и вредно, т.к. не позволяет получить достоверные оценки содержания аналитов даже при аддитивности светопо-глощения. Следовательно, для снижения погрешности анализа смесей по методу МЛР необходимо проводить дополнительную оптимизацию спектральных диапазонов, и прежде всего, исключать неаддитивные участки спектра, а также области, где отмечалось слабое поглощение аналитов.

Анализ бинарных смесей методом МЛР-1 с оптимизацией спектральных диапазонов позволил расширить интервал соотношений, при которых возможно одновременно определять оба компонента с погрешностями, не превышающими 5-6 % отн. В табл. 8 приведены результаты анализа адди-

тивных (ХГ-Ан) и неаддитивных (ГГГ-Дб, Кф-Ан) смесей с использованием оптимизированных диапазонов. В некоторых случаях в зависимости от соотношения аналитов это были разные диапазоны (Кф-Ан, ХГ-Ан).

Таблица 8

Относительные погрешности (5, %) определения аналитов в модельных бинарных смесях методом МЛР-1 с применением оптимизированных спектральных диапазонов

Аналиты, X-Y С мкг/мл Спектральный диапазон, нм ёсх.% дсу, %

X Y

ПГ-Дб 3,6 3,6 240-300 0,4 1,2

2,4 ' 24 1,2 -6,5

Кф-Ан 25,6 3,2 220-260 0,0 -2,0

3,2 32 220-265 1,4 -4,2

ХГ-Ан 3,2 3,2 220-320 1,6 2,0

3,2 25,6 250-320 2,9 -2,3

Компьютерное моделирование спектров аддитивных 3-4-компо-неитных смесей и оптимизация спектральных диапазонов. Аддитивность светопоглощения растворов 3-4-компонентных смесей дает возможность провести компьютерное моделирование спектров, с их помощью подобрать и проверить спектральные диапазоны без дополнительных затрат на приготовление большого числа модельных смесей. Вначале, используя найденные в эксперименте коэффициенты поглощения и задавая концентрации компонентов, моделировали «идеальный» спектр смеси, получая значения Avfca, для каждой АДВ. Затем «возмущали» этот спектр, моделируя случайные погрешности по формуле:

т

Лоы = Адеа, +Ta,J -СjP> . (26>

М

где Sj - стандартные отклонения коэффициентов поглощения J-го компонента, которые для каждой длины волны рассчитывали по экспериментальным данным, Р - случайное число в интервале от -1 до 1, получаемое с помощью «Генератора случайных чисел» (использовали опцию пакета Excel «Анализ данных»). Совокупность полученных значений оптической плотности при разных длинах волн представляла единичный «возмущенный» спектр отдельной смеси. Всего для каждой смеси получали по 3-5 таких спектров.

Для трехкомпонентных смесей лекарственных веществ АСК, Кф и Пр оптимальным оказался участок 262-300 нм. Погрешности определения всех трех компонентов, как правило, не превышали 4-6 % отн. С целью проверки выбранных диапазонов были приготовлены несколько реальных смесей того же состава, что и в компьютерном эксперименте. Анализ смесей с использованием выбранного диапазона показал хорошее согласование с прогнозом

(табл. 9). Что касается 4-компонентных смесей витаминов, подобрать один спектральный диапазон, чтобы одновременно минимизировать погрешности определения всех четырех компонентов, не удалось.

Таблица 9

Результаты анализа модельных смесей в компьютерном

эксперименте (Л) и при использовании реальных спектров (Б)

Смесь, № Ана-лит Диапазон, нм С, м кг/мл Отн. погрешность, %

А Б А Б

1 АСК 262-300 10,0 3,7 -2,5 0,02 0,01

Кф 2,0 1,2 2,8 0,02 0.01

Пр 10,0 1,4 -0,1 0,006 0,003

2 В2 282-301,367-375 2,4 3,3 5,5 0,001 0,001

В5 210-232 12,0 -1,6 -2,3 0,03 0,05

В6 200-230,370-375 1,6 -1,6 -2,1 0,001 0,001

В,* 200-230, 363-375 3,4 1?2 2,7 0,01 0,005

* - по разностному спектру

Для каждого витамина был подобран свой оптимальный интервал длин волн. Как правило, эти интервалы находились вблизи максимумов поглощения соответствующих компонентов. Лишь для витамина В3 в компьютерном эксперименте не удалось найти диапазон, позволяющий определять его с погрешностью менее 10 % (В3 дает наименьший вклад в оптическую плотность смесей). Для оптимизации условий его определения применили разностный подход: из оптической плотности смеси вычитали вклад основного компонента - витамина В5. В разностном спектре удалось найти диапазоны длин волн, где В3 определяется с погрешностью, не превышающей 5 % отн. Результаты компьютерного эксперимента, как и в случае трехкомпонентных систем, хорошо согласуются с данными анализа реальных смесей (табл. 9). Это позволяет применять предварительное моделирование не только для выбора аналитических длин волн, но и с целью прогнозирования погрешностей анализа аддитивных смесей.

Таким образом, метод МЛР-1 с применением предварительно вычисленных коэффициентов поглощения дает весьма хорошие результаты при анализе бинарных смесей, независимо от их аддитивности, а также аддитивных смесей, содержащих 3-4 аналита. Однако необходимость подбора спектральных диапазонов, а также применение разностных спектров существенно увеличивают время на проведение анализа.

Анализ неаддитивных 5-6-компонентных смесей витаминов. Неаддитивность светопоглощения не позволяет проводить адекватное моделирование спектров, поэтому оптимизацию спектральных диапазонов в ,этих случаях вели, используя спектры реальных смесей. Примером может быть

подбор спектральных диапазонов для анализа 5-компонентной смеси витаминов: В2, В5, В6, К3 и В1. Результаты анализа одной из смесей после оптимизации условий приведены в табл. 10.

Таблица 10

Результаты определения витаминов методом МЛР-1 в модельной

смеси с использованием узких спектральных диапазонов (п=3)

Витамин Диапазоны длин волн, нм Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл 5,% 8г

в2 220-500 2,2 2,17 -1,5 0,010

В, 10,0 9,99 -0,1 0,005

В6 1,4 1,36 -2,6 0,023

к/ 220-245 0,7 0,71 0,8 0,011

в/ 220-245, 254-265 0,9 0,85 -6,0 0,020

*- по разностному спектру

Три витамина - В2, В5, Вб - можно определять по методу МЛР-1 с использованием одного и того же широкого спектрального диапазона 220500 нм. Еще два витамина - К3 и В | - можно определять с требуемой точностью только по разностному спектру, вычитая вклад витамина В5 из исходного спектра. Аналогичным образом подбирали спектральные диапазоны для 6-компонентных смесей. Однако витамин В3 в этих смесях не удается точно определить даже по разностному спектру. Независимо от выбранного спектрального диапазона, относительная погрешность определения витамина В3 в б-компонентных смесях достигала 20 % и более. Вероятно, это обусловлено наименьшим вкладом данного витамина в суммарное поглощение этой неаддитивной смеси.

Применение метода МЛР-2. Выбор спектрального диапазона -не единственный способ повышения точности регрессионного анализа. Повысить точность анализа можно за счет перехода к варианту непрямой градуировки (МЛР-2). В этом случае вычислять элементы матрицы коэффициентов Л" необходимо по спектрам # стандартных смесей того же качественного состава, что и анализируемые, но с точно известным содержанием каждого компонента:

К ~ АСТ (СТС)~1, (27)

где А - вектор оптических плотностей смесей при заданной длине волны, С - матрица концентраций ТУх т (ЛГ- число стандартных смесей). Расчеты по системе (27) повторяют р раз, т.е. столько, сколько длин волн предполагают в дальнейшем использовать для решения системы (25). Основная проблема в этом случае - формирование хорошо обусловленной матрицы концентраций стандартных смесей (С), используемых в качестве градуи-ровочных. Неудачно сформированные выборки могут существенно ухудшить результаты анализа.

В качестве оценки оптимальности составов градуировочных наборов предлагается использовать минимум функционала случайных погрешностей. Теоретическое обоснование проведем, используя методы матричного анализа. Допустим, что приготовление растворов стандартных смесей и измерение их светопоглощения сопряжено с возникновением только случайных погрешностей. Тогда система уравнений, связывающая состав и свето-поглощение растворов, в матричной форме будет иметь следующий вид:

А = КС + е, (28)

где с - вектор погрешностей, включающих в себя случайные погрешности приготовления растворов индивидуальных соединений и их стандартных смесей, погрешности измерения аналитических сигналов и т.п. Будем считать, что распределение совокупных погрешностей является нормальным, эти по1решности не зависят от концентраций С и не коррелируют с числом приготавливаемых градуировочных смесей N. Тогда ковариационная матрица остатков может быть записана как:

Ъе=321„, (29)

где д2 - неизвестная дисперсия компонент вектора е, а - единичная матрица Л^-го порядка.

МНК основан на минимизации функционала:

<2(К) = ете = (А-КС)Т(А-КС). (30)

Л

Точность оценки К матрицы К определяется ковариационной матрицей:

2Л =£ к

(К-К)Т(К-К)

= (ссг)"1с£(л)сг(ссг)"'.

Заменим ковариационную матрицу регрессионных остатков Е^е' е^ с учетом (29), и в конечном итоге получим:

2Л=^(ССГ)"'. (32)

= £<

ССТ(ССТ) '

т

Т\-1

еС(СС' )"Ч =

(31)

Диагональ этой матрицы есть вектор дисперсий оценок К. При заданной размерности единичной матрицы (/V) и постоянной величине 8г, основным условием максимальной точности оценивания К будет оптимальность матрицы концентраций С. В качестве оценки оптимальности

л

возьмем минимум суммы дисперсий оценок К, или, что эквивалентно,

след (trace) матрицы (ССТ)~'.Тогда сформированный оптимальный план эксперимента обеспечит минимальное суммарное среднеквадратичное от-

Л

клонение оценок К в классе всех планов заданной размерности N:

trace(cTc) ' -» min , (33)

\ ' IbüCinb

где lb, ub - матрицы нижнего {lower bound) и верхнего {upper bound) ограничений.

Реализацию изложенного алгоритма осуществляли с помощью оригинальной программы «Optic-MLR», написанной в пакете MATLAB. Поиск минимума (33) вели с использованием заложенной в MATLAB функции fnüncon.

Программа «Optic-MLR» состоит из трех модулей. Первый модуль, «GENERATE», предназначен для формирования составов градуировочных наборов по вышеизложенному алгоритму. Предусмотрено два плана формирования наборов, обычный и специальный, с учетом взвешенных коэффициентов для каждого компонента. Входными данными обычного плана являются: число компонентов /я; минимальные и максимальные концентрации каждого компонента в градуировочных смесях (ожидаемые содержания компонентов в анализируемых смесях должны находиться в пределах заданных концентрационных уровней), число градуировочных смесей, от N - m до заданного пользователем верхнего предела. В случае формирования наборов по специальному плану, для каждого компонента дополнительно вводят взвешенный коэффициент, численное значение которого пользователь выбирает самостоятельно. Чем меньший вклад в светопо-глощение смеси вносит компонент, тем большее значение коэффициента ему присваивается. Численные значения коэффициентов пользователь задает самостоятельно (пример приведен в табл. 11).

Результатом работы программы являются оптимальные (в указанном выше смысле) концентрации компонентов для каждой стандартной смеси градуировочного набора. Задавая разное число N, пользователь получает в распоряжение несколько градуировочных наборов. В соответствии с рекомендациями программы готовят растворы, и снимают их спектры. Используют полученные результаты для вычисления регрессионных коэффициентов аналитов. Расчеты ведут с применением второго модуля программы «KOEFF_COUNTER». В программу вводят концентрации аналитов и спектры всех градуировочных смесей. Итог работы программы -вычисленные для каждого аналита по всему спектральному диапазону регрессионные коэффициенты.

Третий модуль «CONCENTR COUNTER» позволяет вычислять концентрации аналитов в исследуемых смесях методом MJIP. Для этого в

программу вводят коэффициенты аналитов (поглощения или регрессионные), спектры анализируемых смесей, и задают границы спектрального диапазона, который будет использован программой для расчета содержаний аналитов.

Были проанализированы модельные смеси с разным числом аналитов - от 2 до 6. Для смесей каждого типа формировали рад градуировоч-ных наборов разного объема. Вычисленные по ним коэффициенты применяли к анализу одних и тех же тестовых смесей.

Рис. 6. Зависимость обобщенной погрешности анализа смесей, содержащих 2,3,4 и 5 аналитов, от числа смесей в градуировочных наборах

На рис. 6 показано, как меняется обобщенная погрешность (ф анализа смесей, содержащих 2-5 аналитов, в зависимости от числа смесей, используемых для вычисления коэффициентов, т.е. объема градуировоч-ного набора, N. При расчете £ использовали данные по нескольким (не менее 10) тестовым смесям. Как видно, для бинарных систем в градуировоч-ный набор достаточно включать 2 смеси. Для остальных систем требуется больший объем набора, но не превышающий 2т. При дальнейшем увеличении объема градуировочного набора погрешности определения компонентов оставались примерно на одном уровне.

Новый способ формирования градуировочных наборов позволил повысить точность анализа тестовых смесей по сравнению с методом МЛР-1. Хорошие результаты были получены даже в случае неаддитивных смесей, а также при анализе смесей, содержащих посторонние соединения, поскольку влияние мешающих факторов сходным образом проявлялось в спектрах стандартных и исследуемых смесей.

Рассмотрим результаты, полученные при анализе неаддитивных бинарных смесей. Набор для вычисления коэффициентов системы ПГ-Д был составлен в соответствии с результатами работы программы, и включал

О А 0 0 0 О

0,0 4-1-1-1-1-1-1

2 4 6 8 10 12 14 число смесей в градуировочном наборе

только две смеси, с максимальными соотношениями ПГ и Дб, а именно 3 :1 и 1 :20. Повторный анализ тех же тестовых смесей ПГ и Дб привел к следующим положительным результатам по сравнению с вариантом МЛР-1: во-первых, снизились погрешности определения компонентов; во-вторых, одновременное определение компонентов с погрешностью не более 5 % отн. стало возможным при любых соотношениях ПГ и Дб, от 3 : 1 до 1 : 20 (рис.7); в-третьих, не потребовалась дополнительная оптимизация спектрального диапазона путем исключения неаддитивного участка спектра. Аналогичные результаты получены и для системы Кф-Ан. Составы градуировочных наборов также включали только две смеси, дополнительная оптимизация спектральных диапазонов не потребовалась, погрешности определения аналитов при любых соотношениях (от 5:1 до 1:10) не превышали 5 % отн., 5,- не более 0,03.

•мдно ДО, мкгАм «мдеио ПГ, мхгЛил

Рис. 7. Результаты анализа модельных смесей папаверина гцдрохлорид-дибазол с применением метода МЛР-2

Анализ аддитивных трехкомпонентных смесей АСК-Кф-Пр. содержащих посторонние вещества. Смеси, моделирующие препарат «Цитрамон», содержали, помимо аналитов, лимонную кислоту (ЛК). И хотя поглощение этой кислоты невелико, ее присутствие вело к появлению систематических погрешностей при анализе смесей методом МЛР-1 (табл. 11). При переходе к анализу тех же смесей методом МЛР-2 в стандартные смеси градуировочных наборов добавляли ЛК. Это позволило заметно снизить погрешности. Правда, присутствие ЛК потребовало оптимизации спектрального диапазона для определения Кф. Хорошо воспроизводимые результаты с меньшей погрешностью были получены при использовании для расчета содержания Кф области 240-263 нм. АСК и Пр, как и в отсутствие ЛК, можно было определять, используя весь спектральный диапазон 220-300 нм, без дополнительной его оптимизации.

Таблица 11

Определение АСК, Кф и Пр в смесях, содержащих лимонную кислоту, с применением двух вариантов метода МЛР (п-З)

Аналит С, мкг/мл МЛР-1 МЛР-2

найдено <5% Бг найдено <5% 5г

АСК 10,0 13 23 0,003 9,7 -з,з 0,008

Кф 1,5 1,6 7,2 0,001 1,5 3,4 0,051

Пр 5,0 6,7 34 0,006 4,9 -2,0 0,004

Анализ аддитивных 4-компонентных смесей витаминов. Градуиро-вочный набор включал 8 смесей. На рис. 8 приведены зависимости от длины волны коэффициентов поглощения витаминов (слева), и регрессионных коэффициентов, вычисленных по спектрам растворов смесей (справа). Как видно, в целом характер кривых схож, что может служить косвенным доказательством аддитивности светопоглощения изученных смесей. В табл. 12 приведены результаты анализа некоторых смесей, выполненные методом МЛР с применением тех и других коэффициентов. Усредненные погрешности определения отдельных витаминов и обобщенная погрешность убедительно свидетельствуют о повышении точности анализа в случае использования новых коэффициентов. Для расчетов методом МЛР-1 были использованы оптимизированные для каждого витамина диапазоны, методом МЛР-2 расчеты выполнены в одном спектральном диапазоне, 220-300 нм.

А Б

Рис. 8. Коэффициенты поглощения витаминов (А) и регрессионные коэффициенты, вычисленные по спектрам смесей (Б).

Таблица 12

Относительные погрешности определения витаминов в 4-компонентных смесях с применением двух вариантов метода МЛР

Смесь, № С, мкг/мл Относительные погрешности |<51% отн.

МЛР-1 МЛР-2

в, вг Вц в? В! в2 в5 В* в. Вг в, В6

1 1,0 12 7,0 6,8 7,0 6,3 2,2 2,8 0,5 4,8 2,6

2 1,2 2,3 7,1 1,0 9,0 8,2 5,0 10,0 1,4 2,7 0,5 2,5

3 1,8 4,0 5,6 2,0 10,0 2,4 6,9 5,7 9,2 1,7 0,0 0,6

4 1,4 1,6 7,1 1,0 5,5 11,0 8,4 0,9 0,8 7,1 1,3 6,6

средняя 1% по 4 смесям 7,8 7,1 6,7 4,7 3,6 3,0 1,7 3,0

Обобщенная погрешность, 13,4 5,8

Анализ неаддитивных 4-5-компонентных смесей. В исключительных случаях, как, например, в анализе 4-компонентных смесей лекарственных веществ и 5-компонентных смесей витаминов, даже после оптимизации диапазонов погрешности определения отдельных аналитов оставались недопустимо высокими (см. рис. 6, табл. 13). Для таких систем градуировоч-ные наборы, состоящие из 2т смесей, формировали по специальному плану. Результаты анализа с использованием коэффициентов, вычисленных по обычному и специальному планам, представлены в табл. 13. Видно, что переход к специальному плану формирования градуировочных наборов снизил погрешности определения не только «проблемных», но и всех остальных компонентов.

Таблица 13

Правильность и сходимость определения аналитов с применением

коэффициентов, вычисленных по разным планам (п=3)

Обычный план Специальный план

т Аналит мкг/мл 5,% Взвешенный коэффициент 6,%

Ан 25,0 4,9 0,011 ОД -0,9 0,008

ПГ 2,0 5,0 0,017 1 1,9 0,015

Дб 2,0 -17 0,028 100 2,6 0,010

Фб 2,0 18 0,015 100 6,6 0,011

в, 0,3 24 0,012 100 3,8 0,004

в2 0,3 21 0,009 100 2,9 0,003

5 В5 3,0 -3,9 0,020 1 -1,6 0,010

Вб 0,45 4,5 0,070 10 4,3 0,060

с 11,3 2,9 0,030 0,1 2,9 0,020

Влияние объема спектральных данных на точность анализа методом MJIP-2. При наличии специальной программы, как, например, «Optic-MLR», расчёт коэффициентов аналитов по спектрам смесей не представляет особых трудностей. Если применять стандартный пакет Microsoft Excel, то вычисление коэффициентов, например, в диапазоне 220-300 нм с шагом 0,2 нм может занимать несколько часов. Увеличение шага при регистрации спектров позволит существенно сократить время на данном этапе работы, однако не менее важно оценить, как это отразится на точности анализа. Для выяснения данного вопроса использовали спектры смесей разного состава, зарегистрированные с разным шагом - от 0,2 нм до 16 нм. Оказалось, если компоненты вносят примерно одинаковый вклад в свето-поглощение смеси, как, например, в системах ПГ-Дб или В |-В2-В5-В6, анализ можно вести во всем спектральном диапазоне без предварительной его оптимизации и точность вычисления не ухудшается, даже если увеличивать шаг вплоть до 10 нм. Если вклады компонентов различаются и требуется оптимизация диапазонов, шаг должен быть не более 2 нм. Приведем в качестве примера данные определения витаминов в 6-компонентной смеси, когда содержание слабо поглощающих витаминов В] и В3 определяют с использованием небольших спектральных диапазонов (табл. 14). Видно, что погрешности определения тех витаминов, что ведут с использованием всего спектра, практически не меняются при увеличении шага вплоть до 8 нм, а погрешности определения В3 и В] резко возрастают, начиная уже с шага в 1 и 2 нм соответственно.

Таблица 14

Влияние шага регистрации спектров на точность анализа 6-компонентных смесей витаминов методом МЛР-2

Витамин С, мкг/мл Диапазон, нм Шаг, нм

0,2 1 2 4 8

6 , % отн.

В2 2,6 200-300 3,4 2,7 3,8 4,3 4,9

В, 12,0 0,2 0,5 1,4 1,2 1,9

В6 1,6 1,0 1,9 2,7 2,5 3,5

к3 0,9 4,2 5,7 6,5 6,9 7,1

В, 1,1 200-250 5,3 6,2 14 19 23

щ 4,0 270-300 3,0 8,4 12 13 15

Итак, именно присутствие слабо поглощающих компонентов будет лимитирующим фактором при выборе шага регистрации. В общем случае, чем сложнее состав смеси (по числу компонентов и различий их поглощательной способности), тем меньший шаг требуется при регистрации спектров.

Подведем краткий итог: метод МЛР в варианте непрямой градуировки позволяет одновременно определять от 2 до 5-6 аналитов, независимо от аддитивности светопоглощения. Вычисленные коэффициенты можно применять к анализу смесей, в которых соотношение компонентов меняется в широком интервале, например, для бинарных систем от 8:1 до 1:10, без дополнительной оптимизации диапазонов. Метод позволяет учесть присутствие посторонних веществ. С целью снижения погрешностей можно, во-первых, проводить оптимизацию спектральных диапазонов, во-вторых, при необходимости формировать градуировочные наборы по специальным планам. Предложенный алгоритм составления градуиро-вочных наборов позволяет ограничить их число в пределах от т до 2т. В оптимальных условиях расчета концентраций погрешности определения каждого аналита не превышают 3-5 % отн., относительные стандартные отклонения Бг составляют 0,01-0,06.

Применение метода ПЛС в спектрофотометрическом анализе смесей

Принцип метода ПЛС заключается в установлении максимальной ковариации между экспериментальными исходными данными (в нашем случае - матрицей спектров А) и переменными (матрицей концентраций С), значения которых необходимо в будущем предсказывать, причем как можно точнее. Число строк в матрицах Л и С равно количеству модельных смесей N. Число столбцов в матрице А равно количеству длин волн р, при которых измерена оптическая плотность, в матрице С - количеству компонентов т. Проводится одновременная декомпозиция матриц А и С по формулам:

А = ТР> + Е, (34)

С=ио!+Р, (35)

где Т и II - матрицы счетов, Р н () - матрицы нагрузок, Ей ^ - матрицы остатков.

Для построения градуировочной модели (многомерной градуировки) методом ПЛС используют стандартные смеси, называемые обучающей выборкой. Проверку градуировок ведут с использованием тестовых смесей, по составу однотипных со смесями из обучающей выборки. Если все аналиты, входящие в состав тестовых смесей, можно одновременно определять с погрешностью, не превышающей некоторый заданный предел, то считают, что построена адекватная многомерная градуировка, которая соответствует требованиям точности анализа.

В случае анализа смесей с известным номинальным составом, при формировании обучающих выборок нами были приняты следующие условия:

- для каждого компонента известен диапазон возможных содержаний;

- для каждой смеси определены допустимые соотношения компонентов;

Отбор смесей для формирования обучающих выборок одного и того же объема вели разными способами, сопоставляя следующие принципы:

А - случайный отбор смесей;

В - целенаправленный отбор смесей, в которых содержания компонентов были равномерно распределены в области их возможных соотношений.

С - целенаправленный отбор смесей с учетом номинального состава моделируемого препарата и с обязательным включением в выборки номинальной смеси.

При построении всех многомерных градуировок использовали один спектральный диапазон (220-300 нм), без дополнительной оптимизации, шаг вводимых спектральных данных составлял 0,2 нм. Проверку построенных градуировок вели с использованием тестовых смесей, не менее 10-ти для каждой системы. Результаты анализа тестовых смесей разного типа с использованием выборок, сформированных по трем принципам, представлены в табл. 15.

Таблица 15

Результаты анализа смесей разного Tima с использованием выборок,

сформированных по трем принципам

Число смесей в Число аналитов % отн

выборке А В С

5 2 4,6 3,2 5,1

6 3 16 17 13

11 6 35 25 16

Для бинарных смесей хорошие результаты получены с применением всех трех градуировок - оба компонента определяются с погрешностью меньше 5 % отн. Для 3-й 6-компонентных смесей включение в состав выборки номинальной смеси (принцип С) приводит к заметному снижению относительных погрешностей определения каждого компонента, а, следовательно, и обобщенной погрешности. Таким образом, можно констатировать, что принцип формирования обучающих выборок, действительно, влияет на точность предсказания содержаний компонентов в тестовых смесях, причем большое значение имеет включение в выборки смеси номинального состава. Вторым необходимым условием является объем выборки. Влияние этого фактора оценивали, меняя число смесей в обучающих выборках, но соблюдая принципы их формирования. Примером могут быть результаты анализа тестовых смесей, содержащих три лекарственных вещества АСК-Кф-Пр (рис. 9). Число смесей в обучающих выборках меняли от 3 до 9. Приведены модули погрешностей определения разных веществ, усредненные по результатам анализа 11 тестовых смесей.

Принцип А

Принцип В

Принцип С

) (!) Г I I II

^'АСК

ТТ. РР

М { I 7 I М«

3456789 10

Число смесей в обучающей выборке

Рис. 9. Средние погрешности определения АСК, Кф и Пр в тестовых смесях в зависимости от принципа формирования обучающей выборки и ее объема

Во всех случаях погрешности анализа снижаются по мере увеличения объема выборок и, как правило, нелинейно. Результаты, полученные для разных компонентов, различны. Так, Пр определяется хорошо по всем градуировкам, но наименьшие погрешности достигаются по градуировке типа С. Другие компоненты (АСК и Кф) определяются с погрешностью не более 5% отн. лишь по градуировке типа С, когда обучающая выборка состоит не менее чем из 7 смесей. Дальнейшее увеличение объема выборки уже практически не влияет на результат.

Для других смесей лекарственных веществ и витаминов градуировки строили, формируя выборки уже только по принципу С. Во всех случаях погрешности определения аналитов зависят от объема обучающей выборки, эта зависимость хорошо воспроизводится и имеет одинаковый характер для разных компонентов одной и той же смеси. А именно, с ростом /V погрешности определения любого компонента вначале резко снижаются, а затем перестают меняться. На рис. 10 показаны зависимости вида £ = /(АО для систем с разным числом аналитов, от 2-х до 6-ти.

Положение излома зависит от числа одновременно определяемых аналитов. Так, при одновременном определении 3 компонентов смеси в обучающую выборку достаточно включить 7 модельных смесей, для определения 4 компонентов - 9 смесей, и т.п. Дальнейшее увеличение объема выборки не меняет точности анализа смеси, а, следовательно, - нецелесообразно. Обобщая полученные данные, можно сделать вывод, что объем обучающей выборки (ЛГ*), необходимый и достаточный для минимизации погрешности анализа смеси по методу ПЛС, связан с числом определяемых компонентов (/я) по формуле:

И* = 2т+\. (36)

6 4 2 О

iiiiii

■ ■•••i

О

5 10

15 20 N 25

Рис. 10. Зависимость обобщенной погрешности анализа тестовых смесей от объема обучающей выборки, N. Цифрами указано число определяемых компонентов

Данная закономерность ранее в литературе не описана, поводимому, она установлена впервые. В случае метода МЛР-2 зависимости обобщенной погрешности от объема градуировочного набора имеют аналогичный характер (за исключением бинарных систем, см. рис.б и рис.9). Принципиальное отличие в формировании обучающих выборок ПЛС и градуировочных наборов МЛР заключается в том, что в методе ПЛС обязательным условием является включение в состав выборки смеси номинального состава. В методе МЛР, наоборот, включение такой смеси нежелательно, т.к. ухудшается точность оценки регрессионных коэффициентов, что влечет за собой ухудшение результатов анализа.

С учетом формулы (36), была разработана схема формирования оптимальной обучающей выборки для метода ПЛС. Такая выборка должна состоять из 2т +1 модельной смеси и включать смесь номинального состава, определяющей, по аналогии с полным факторным экспериментом (ПФЭ), центр плана. Оставшиеся 2т смеси отбирают из всех возможных сочетаний концентраций компонентов (факторов), взятых на уровне выше (+) и ниже номинального (-), при этом число отобранных смесей должно быть примерно пропорционально числу возможных комбинаций факторов (табл. 16). Каждый фактор должен встречаться на верхнем и нижнем уровнях одинаково часто, поскольку отличия от номинального состава в реальных объектах носят случайный характер, а значит, появление положительных и отрицательных отклонений равновероятно. Включать в выборки смеси, где все факторы находятся на одном и том же уровне (верхнем или нижнем) не желательно: соотношение компонентов в этих смесях будет таким же, как и в смеси номинального состава, уже включенной в выборку. Интервалы варьирования задаются, исходя из возможных или допустимых отклонений в содержаниях компонентов от номинального состава, и по разным факторам могут не совпадать. Если в состав анализируемых проб будут входить некоторые неопределяемые компоненты, по-

глощающие в той же области спектра, что и аналиты, их необходимо вводить в смеси обучающей выборки.

В табл. 16 приведены схемы формирования выборок для 3-, 4- и 6-компонентных смесей. Как видно, для трехкомпонентных смесей надо приготовить практически все смеси по плану ПФЭ (за исключением двух, в которых все факторы находятся на одном уровне, нижнем и верхнем). В остальных случаях можно ограничиться гораздо меньшим числом смесей, чем 2". Так, для 6-компонентной смеси из 64-х возможных комбинаций сочетания аналитов достаточно отобрать по предложенной схеме всего 12.

Таблица 16

Схема формирования обучающих выборок

для смесей с разным числом аналитов_

Число факторов (аналитов) 3 4 6

Число факторов на верхнем уровне (+) 1 2 1 2 3 1 2 3 4 5

Число факторов на нижнем уровне (-) 2 1 3 2 1 5 4 3 2 1

Число комбинаций факторов 3 3 4 6 4 6 15 20 15 6

Из них включены в обучающую выборку 3 3 2 4 2 1 3 4 3 1

Итого смесей 6+1 8+1 12+1

В качестве примера в табл. 17 приведена одна из возможных комбинаций факторов при формировании обучающей выборки для 6-компонентной смеси витаминов. Составы смесей № 2-7 симметричны составам смесей № 8-13 (попарно, например, смеси 2 и 8, 3 и 9 и т.п.). Это упрощает выполнение условия нахождения каждого фактора на нижнем и верхнем уровнях одинаковое число раз.

Таблица 17

Пример комбинации факторов в обучающей выборке _для 6-компонентной смеси витаминов_

Витамин Смесь, №

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

В, а + + - - + + - - + + - -

В2 Я - + - - + + + - + + - -

В3 § - - + - + - + + - + - +

В5 X а - - + - - + + + - + + -

Вб о о о о4 - - - + - - + + + - + +

К3 - - - + - - + + + - + +

Составленные по данной схеме обучающие выборки были применены для построения многомерных ПЛС-градуировок. Анализировали как

аддитивные, так и неаддитивные смеси, содержащие от 2 до 6 аналитов. Несмотря на относительно небольшой объем обучающих выборок, построенные модели позволяли определять компоненты смесей весьма точно. Так, для анализа трехкомпонентных аддитивных смесей АСК-Кф-Пр, имеющих различные соотношения компонентов, такие же, как в препаратах «Кофицил» и «Цитрамон», были построены разные градуировки. Результаты, анализа модельных смесей методами ПЛС и МЛР-2 приведены в табл. 18.

Таблица 18

Метрологические характеристики методик определения АСК-Кф-Пр в модельных смесях методами МЛР-2 и ПЛС

Модель Ана-лит Диапазон определяемых концентраций, мкг/мл ПЛС МЛР-2

<5% от <5% а,

«Кофицил» АСК 11,0-18,0 <3 0,029 < 1 0,018

Кф 1,7-3,0 <1 0,010 <1 0,011

Пр 3,5 - 6,0 <2 0,021 <3 0,037

«Цитрамон» АСК 6,6 - 11 <4 0,014 <3 0,015

Кф 0,80- 1,5 <5 0,036 <2 0,017

Пр 5,0-8,3 <4 0,017 <2 0,013

Видно, что оба метода позволяют определять все аналиты с одинаковой точностью. Приведем также в качестве примера метрологические характеристики методики определения витаминов, с помощью которой были проанализированы 20 однотипных 6-компонентных смесей (табл. 19).

Таблица 19

Метрологические характеристики методики определения витаминов в однотипных 6 -компонентных модельных смесях методом ПЛС

Витамин Диапазон определяемых концентраций, мкг/мл ПЛС МЛР-2

д% <Гг <5%

В, 0,60- 1,0 <5 0,005 < 10 0,005

в2 2,0 - 3,0 < 1 0,005 <2 0,018

В3 3,0-5,0 <2 0,010 <6 0,020

в5 12,0 - 20,0 < 1 0,088 < 1 0,068

В6 0,90 -1,5 <2 0,005 <2 0,005

к, 0,60-1,0 <2 0,005 <2 0,005

Сравнение результатов анализа одних и тех же смесей, выполненные методами МЛР-2 и ПЛС, позволяют рекомендовать первый из них к

анализу 2-5-компонентных смесей при условии примерно одинаковых вкладов компонентов в оптическую плотность смеси. Для анализа более сложных по составу смесей, а также когда светопоглощение компонентов очень сильно отличается, лучшие результаты дает использование метода ПЛС. Особенно заметно различие результатов по слабо поглощающим витаминам В1 и В3. Точность определения остальных витаминов была примерно одинаковой. Дополнительным преимуществом ПЛС по сравнению с методом МЛР является то, что определение всех аналитов возможно в одном спектральном диапазоне, без его дополнительной оптимизации, независимо от аддитивности, вкладов отдельных компонентов в светопоглощение смесей, а также наличия посторонних веществ. Это существенно сокращает время не только на этапе разработки методики, но и в ходе проведения анализа.

Анализ реальных объектов На основании изученных алгоритмов были разработаны экспрессные спектрофотометрические методики анализа лекарственных и витаминных препаратов, а также витаминных добавок - премиксов. В табл. 20 приведены названия препаратов и указаны хемометрические алгоритмы, использованные в методиках.

Таблица 20

Перечень объектов, для которых разработаны методики спектрофото-

метрического анализа с применением хемометрических алгоритмов

Число определяе- Алгоритм расчета Препарат

мых аналитов содержании

2 МФ* «Солпадеин», «Тетралгин», «Панадол-ЭКСТРА»

МФ', МЛР-2 «Папазол», «Анальгин-хинин»

3 МЛР-2 «Аскофен», «Кофицил», «Цитрамон»

4 МЛР-2, ПЛС «Андипал»

5 МЛР-2, ПЛС «Ундевит»

5-6 ПЛС Премиксы к кормам птиц

'—расчеты ведут с использованием трех наборов АДВ.

Анализ лекарственных и витаминных препаратов. На примере таких препаратов, как «Анальгин-хинин», «Тетралгин» и «Папазол» показано, что использование многоволновой спектрофотометрии (МЛР-2 или МФ с использованием трех наборов АДВ) приводит к снижению погрешности определения компонентов, а в некоторых случаях - к достоверному улучшению воспроизводимости, по сравнению с классическим вариантом МФ, когда расчет ведут на одном наборе АДВ. В качестве примера в

табл. 21 представлены результаты количественного определения активных компонентов препарата «Папазол-УБФ», выполненные по нескольким методикам: методике фармакопейной статьи (ФС 42-1869-82), с применением классического варианта МФ, и по двум разработанным методикам -МФ с использованием трех наборов АДВ, выбранных по предложенному критерию, и методом МЛР-2. Результаты, полученные по разработанным методикам, и по методике ФС совпадают (различие средних значений статистически не значимо: ^г = 0,14; ^ = 0,03; 1табл = 4,30).

Таблица 21

Результаты количественного определения папаверина гидрохлорида и дибазола в препарате «Папазол-УБФ» по разным методикам (п = 3, Р = 0,95)

Методика масса, г

ПГ Дб

ФС 42-1869-82 0,029 ± 0,003 0,030 ± 0,001

МФ ( 1 набор АДВ) 0,026± 0,001 0,036 ± 0,001

МФ (3 набора АДВ) 0,030 ± 0,001 0,030 ±0,001

МЛР-2 0,029 ± 0,004 0,031 ±0,001

допустимые пределы, г 0,027-0,033 0,027 - 0,033

Правильность определения оценивали методом «введено-найдено» (табл. 22). Как видно, предлагаемые методики не уступают по точности аттестованной методике ФС, в отличие от классического варианта МФ, когда добавка Дб определяется с большой систематической погрешностью. По продолжительности разработанные методики являются экспрессными, на анализ требуется не более 30 мин, вместо 60 мин по методике ФС.

Таблица 22

Проверка правильности определения активных компонентов _ препарата «Папазол» _

Методика ПГ, введено 470 мкг Дб, введено 470 мкг

Найдено, мкг 5,% 8г Найдено, мкг 5, % 8г

ФС 42-1869-82 467 -0,5 0,010 475 1,2 0,004

МФ (1 набор АДВ) 452 -3,8 0,010 545 16 0,040

МФ (3 набора АДВ) 466 -0,8 0,013 471 0,3 0,005

МЛР-2 464 -1,4 0,033 468 -0,5 0,013

Анализ более сложных по составу препаратов выполняли методами МЛР-2 и ПЛС. В табл. 23 приведены результаты анализа лекарственных и витаминного препаратов на содержание 3-5 активных компонентов.

Таблица 23

Результаты анализа препаратов методами МЛР-2 и ПЛС

Препарат Компонент Указано на упаковке, мг Допустимые пределы, мг Найдено, мг/табл

МЛР-2 ПЛС

«Цитрамон» АСК 240 228 - 262 227,4 ± 6,0 224,4 ± 4,6

Кф 30 27-33 29,8 ± 3,3 28,0 ± 1,8

Пр 180 171-189 163,3 ± 3,3 165,3 ± 2,3

«Андипал» Ан 250 237 - 263 250,0 ± 1,0 255,0 ± 1,0

ПГ 20 18-22 19,3 ± 0,3 19,8 ± 0,2

Дб 20 18-22 19,9 ±0,2 19,5 ±0,2

Фб 20 18-22 18,7 ±0,6 19,6 ±0,5

«Ундевит» в, 2 . 1,8-2,2 1,8 ±0,3 1,8 ±0,1

в, 2 1,8-2,2 1,8 ±0,2 1,9 ±0,1

В5 20 18-22 19,7 ± 0,5 19,0 ±0,2

Вб 3 2,7 - 3,3 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2

С 75 67-83 77,0 ± 3,0 73,0 ± 2,0

Расхождения с указанными на упаковках массами компонентов практически во всех случаях не превышают допустимых значений (10 % отн.). Результаты проверки правильности представлены в табл. 24. Жирным шрифтом выделены значения 5У и ¿,% тех выборок, где выявлены достоверные различия в сходимости (по критерию Фишера) и/или средних значений (по критерию Стьюдента). Как видно, применение метода ПЛС позволяет достоверно снизить погрешности определения трех компонентов препарата «Андипал», и повысить сходимость результатов определения витамина В5 в препарате «Ундевит».

Таблица 24

Проверка правильности определения активных компонентов (п=б)

Препарат Компонент Введено, мкг Найдено, мкг 5,% sr

МЛР-2 ПЛС МЛР-2 ПЛС МЛР-2 ПЛС

«Цитрамон» АСК 90,3 90,0 93,1 -0,3 3,1 0,014 0,019

Кф 11.1 10,8 10,6 -2,7 -4,5 0,026 0,010

Пр 62.4 65,1 60,9 4,3 -2,4 0,025 0,007

«Андипал» Ан 125,0 122,8 125,9 -1,8 0,7 0,012 0,003

ПГ 10,0 9,3 10,2 -7,0 2,0 0,030 0,008

Дб 10,0 9,4 9,8 -6,0 -2,0 0,034 0,004

Фб 10,0 10,2 10,3 2,0 3,0 0,020 0,016

«Ундевит» В, 10,0 9,8 9,6 -2,1 -3,8 0,043 0,029

В, 10,0 9,9 10,3 -1,2 2,5 0,052 0,017

в, 150,0 148,3 145,3 -1,1 -3,1 0,025 0,005

в6 15,0 14,7 15,4 -1,4 2,9 0,014 0,013

С 500,0 503,4 487,9 0,7 -2,4 0,022 0,017

Построенные ПЛС-градуировки и вычисленные для MJIP-2 коэффициенты могут применяться к анализу препаратов в течение длительного времени. В настоящей работе они использовались без дополнительной корректировки более года.

Две методики прошли официальную метрологическую аттестацию в Томском политехническом университете и в настоящее время зарегистрированы в Федеральном реестре методик измерений. Это «Методика выполнения измерений содержания папаверина гидрохлорида и дибазола в лекарственном препарате спектрофотометрическим методом» (per. код по реестру ФР. 1.31.2010.07919), основанная на применении метода MJIP-2, и «Методика выполнения измерений содержания ацетилсалициловой кислоты, кофеина и парацетамола в лекарственном препарате «Кофицил» спектрофотометрическим методом» (per. код по реестру ФР. 1.31.2010.07920), основанная на применении метода ПЛС. Разработанные методики позволяют вести одновременное определение активных компонентов лекарственных препаратов с погрешностью, не превышающей 5 %, как того требует Государственная Фармакопея. Метрологические характеристики методик представлены соответственно в табл. 25 и 26.

Таблица 25

Метрологические характеристики методики выполнения измерений

содержания компонентов препарата «Папазол» (Р = 0,95)

Определяемый компонент Диапазон содержаний, мг/табл Показатель повторяемости аг, % Показатель воспроизводимости or,0/" Показатель точности, S, %

Дб От 20 до 40 2,0 3,0 7,0

ПГ От 20 до 40 1,5 2,0 6,0

Таблица 26

Метрологические характеристики методики выполнения измерений содержания компонентов препарата «Кофицил-плюс» (Р = 0,95)

Определяемый компонент Диапазон содержаний, мг/табл Показатель повторяемости о>, % Показатель воспроизводимости Од, % Показатель точности б,%

АСК От 250 до 500 в ключ. 1,0 3,0 7,0

Кф От 40 до 80 включ. 2,0 3,0 7,0

Пр От 80 до 150 включ. 1,0 5,0 10,0

Анализ премиксов. Премиксы являются витаминно-минеральными добавками к кормам птиц и животных, и представляют собой однородные смеси наполнителей, витаминов, минеральных и органических добавок. Наполнителями являются мел, отруби, цеолиты и другие материалы. В премиксах одновременно может содержаться до 12 витаминов, 5-6 видов минеральных солей, аминокислоты и другие компоненты. Такой сложный

состав делает анализ премиксов на содержание водорастворимых витаминов весьма непростой задачей. Наборы витаминов во всех этих премиксах примерно одинаковы по качественному составу, но различаются по относительному содержанию разных витаминов. Например, к макрокомпонентам можно отнести витамин В5, к микрокомпонентам - В, и К3. В настоящее время определение витаминов в премиксах ведут по ГОСТу 50929-96 методом ВЭЖХ. Однако методика, изложенная в данном ГОСТе, позволяет определять только три витамина - Вь В2 и В5.

Нами разработаны методики анализа премиксов, включающие извлечение из премиксов суммы водорастворимых витаминов 0,01 М НС1 и анализ полученных экстрактов спектрофотометрическим методом с применением алгоритмов ПЛС и МЛР-2. На этапе пробоподготовки методика требует меньших затрат времени и гораздо проще, чем известные методики извлечения витаминов из премиксов. Для учета влияния других компонентов премиксов были сняты спектры экстрактов минеральных премиксов, в состав которых витамины не входили, а по остальным компонентам составы минеральных и витаминно-минеральных премиксов совпадали. Затем из спектров витаминно-минеральных премиксов вычитали спектры минеральных премиксов, получая таким образом «исправленный» спектр, который и обрабатывали методами МЛР-2 и ПЛС. Спектрофотометрическая методика позволяет определять в премиксах до 6 витаминов, так же как и методика ВЭЖХ, которая прошла межлабораторный контроль и в настоящее время серийно используется в ГНУ СибНИИП Россельхозакадемии.

Приведем результаты анализа премикса на отрубях. Как видно, результаты анализа, полученные методами СФ- и ВЭЖХ-анализа, практически совпадают (табл. 27). Сравнение средних значений, выполненное по критерию Стьюденга, указывает на статистическую незначимость различий для всех витаминов. Для витамина В6 переход к ПЛС обеспечивает достоверное повышение сходимости результатов по сравнению с хроматографической методикой, для остальных витаминов сходимость обеих методик одинакова.

Спектрофотометрический анализ премиксов на содержание водорастворимых витаминов методами МЛР-2 и ПЛС является более экономичным, экспрессным и в ряде случаев может использоваться вместо ВЭЖХ. Несмотря на то, что для каждого соотношения витаминов в премиксах необходимо строить собственную ПЛС-градуировку, метод может служить альтернативой и дополнением методу ВЭЖХ. В тех случаях, когда необходимое программное обеспечение отсутствует, метод ПЛС может быть заменен использованием другого хемометрического алгоритма - метода МЛР в варианте непрямой градуировки. Спектрофотометрическое окончание анализа премиксов с использованием хемомегрических алгоритмов может быть рекомендовано для массового (рутинного) анализа однотипных премиксов, в частности для экспрессного технологического контроля качества премиксов в процессе их производства. Напротив, хроматографическое определение

может быть рекомендовано тем лабораториям, которые проводят разовые анализы премиксов, существенно различающихся по своему составу.

Таблица 27

Результаты анализа премикса на отрубях методами спектрофотометрии и ВЭЖХ

Витамин Содержание по рецептуре, мг/г Найдено, мг/г

СФ (МЛР- 2) СФ (ПЛС) ВЭЖХ

В, 1,2 1,4 ±0,6 1,2 ±0,1 0,9 ± 0,3

в2 4,0 3,8 ± 1,3 4,1 ± 0,4 3,4 ± 0,7

В, 6,0 5,5 ± 1,7 6,2 ± 0,6 6,1 ±0,2

В5 24,0 23 ±4 21 ±4 22 ±3

В6 2,0 2,0 ± 0,4 2,1 ±0,2 1,9 ±0,9

К3 2,0 1,7 ±0,1 2,0 ± 0,2 -

Общее заключение по работе

Спектрофотометрический анализ в сочетании с хемометрическими алгоритмами позволяет определять органические вещества по их собственному светопоглощению в смесях без разделения при полном наложении спектров и при наличии отклонений от аддитивности. В зависимости от сложности состава (число определяемых компонентов, наличие посторонних светопоглощаюхцих компонентов, различные вклады компонентов в светопоглощение смеси) и степени неаддитивности светоплоглощения целесообразно применение одного из алгоритмов - МФ, МЛР и ПЛС.

Метод Фирордта может быть применен к анализу относительно несложных, 2-3-компонентных смесей, в том числе неаддитивных, при условии, что отклонения от аддитивности не превышают своих допустимых значений, которые можно оценить с помощью предложенных в работе алгоритмов. Доказано, что при изменении соотношения компонентов в смеси меняются и наборы АДВ, и данный фактор необходимо учитывать при выборе АДВ. Для снижения влияния неаддитивности на точность анализа предложен новый критерий для выбора АДВ.

Метод МЛР-1 с применением коэффициентов поглощения индивидуальных соединений дает весьма хорошие результаты при анализе бинарных смесей, независимо от их аддитивности (возможно равноточное определение компонентов при 5-6-кратном избытке одного из них), а также при анализе аддитивных 3-4-компонентных смесей. В 6-компонентных смесях точно определить содержания всех компонентов методом МЛР не удается. Оптимизация спектральных диапазонов требуется всегда, независимо от числа аналитов, а также от того, аддитивным или неаддитивным является светопоглощение смеси. Это увеличивает время на поиск оптимальных условий анализа, однако не всегда приводит к желаемой точности результатов.

Переход к методу МЛР-2 позволяет расширить границы применимости МЛР, а именно - анализировать смеси, в которых соотношение ком-

понентов меняется в более широком интервале, например, для бинарных систем от 10:1 до 1:10 и более; одновременно определять от 2 до 5-6 ана-литов, независимо от аддитивности светопоглощения; учесть присутствие других поглощающих компонентов смесей; без дополнительной оптимизации диапазонов анализировать смеси, содержащие до 4-5 компонентов, при условии, что вклады компонентов в оптическую плотность соизмеримы. При необходимости с целью снижения погрешностей можно, во-первых, проводить оптимизацию спектральных диапазонов, во-вторых, формировать градуировочные наборы для вычисления коэффициентов по специальным планам. Вычисленные коэффициенты могут применяться и в расчетах по методу Фирордта.

При усложнении составов наиболее точные результаты обеспечивает применение метода П.ПС. С его помощью удается правильно определить содержание до 6 аналитов, независимо от аддитивности светопоглощения, вкладов отдельных компонентов в оптическую плотность смеси и наличия посторонних веществ. Особое внимание следует уделять принципу формирования обучающих выборок. Для смесей, имеющих номинальный состав, необходимо формировать выборки с учетом такого состава и обязательным включением его в обучающую выборку. Разработанный принцип составления обучающих выборок позволяет ограничить их число и получить градуировочную модель всего за один рабочий день. В дальнейшем применение построенных градуировок и расчет по ним содержаний аналитов занимает не более 10-15 минут.

Спектрофотометрический анализ с применением алгоритмов МФ, МЛР-2 и ПЛС делает возможным одновременное определение компонентов даже в тех случаях, кода содержание одного из них в 6-30 раз меньше, чем содержания других компонентов. Разработанные экспрессные методики СФ-анализа лекарственных препаратов позволяют вести определение активных компонентов с погрешностью, не превышающей 5%, как того требует Государственная Фармакопея. Методика СФ-анализа витаминных добавок - премиксов по точности не уступает методике с применением ВЭЖХ.

Выводы.

1. Доказано, что метод Фирордта может быть применен к спектро-фотометрическому анализу неразделенных смесей даже при наличии в их спектрах поглощения статистически значимых отклонений от аддитивности. Предложены и проверены расчетные алгоритмы для оценки систематических погрешностей метода Фирордта, а также предельного уровня допустимых отклонений от аддитивности, при котором возможно определение компонентов смеси на одном наборе длин волн с погрешностями, не превышающими заданный предел.

2. Для оптимизации анализа смесей по методу Фирордта предложен и программно реализован способ выбора аналитических длин волн (АДВ), учитывающий ряд факторов, в том числе отклонения от аддитивности.

Результаты определения компонентов на разных наборах длин волн, отобранных по предложенному способу, слабо коррелированы, что позволяет рассматривать их как независимые и усреднять результаты, полученные на нескольких наборах АДВ. Это уменьшает влияние случайных погрешностей и повышает точность анализа.

3. Использование метода МЛР в анализе 2-6-компонентных смесей лекарственных веществ и витаминов при достаточно большом объеме спектральных данных приводит к погрешностям порядка 5-20 % отн. в варианте прямой градуировки и 1-5% отн. в варианте непрямой градуировки. Для повышения точности рекомендуется выбирать спектральные интервалы и использовать для вычисления коэффициентов градуировочные наборы, содержащие от т до 2т модельных смесей (т - число аналитов).

4. С целью оптимизации условий анализа смесей методом МЛР в варианте непрямой градуировки предложен, теоретически обоснован и программно реализован новый способ формирования градуировочных наборов для вычисления регрессионных коэффициентов. Использование этого способа, основанного на минимизации функционала погрешностей, позволяет в случае неаддитивных смесей достоверно снизить систематические погрешности результатов анализа.

5. В спектрофотометрическом анализе смесей с применением метода проекции на латентные структуры (ПЛС) способ формирования обучающих выборок (ОВ) влияет на точность определения компонентов. Обучающие выборки желательно формировать с учетом номинального состава объектов анализа, обязательно включая в ОВ смесь номинального состава. Впервые установлено, что в спектрофотометрическом анализе смесей с известным номинальным составом для определения т компонентов методом ПЛС достаточно использовать обучающую выборку, содержащую 2т + 1 модельных смесей. Дальнейшее увеличение числа модельных смесей в ОВ не приводит к достоверному снижению погрешностей определения аналитов.

6. Использование спектрофотометрии в сочетании с методом ПЛС позволяет с той же точностью анализировать более сложные по составу смеси, чем методами МФ и МЛР. Метод ПЛС устойчив к отклонениям от аддитивности и не требует дополнительной оптимизации спектральных диапазонов. В оптимальных случаях погрешности определения аналитов даже в 5-6-компонентных смесях могут составлять 1-2 % отн.

7. С использованием вариантов МФ, МЛР-2 и ПЛС разработаны и метрологически аттестованы экспрессные методики спектрофотометриче-ского анализа лекарственных и витаминных препаратов, содержащих от двух до шести одновременно определяемых активных компонентов. Эти методики характеризуются незначимыми систематическими погрешностями (порядка 3-5 % отн.), не уступают по точности хроматографическим, и могут быть использованы в контрольно-аналитических лабораториях.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах

1. Власова И.В., Шилова A.B., Кулакова С.А. Спектрофотометрическое определение кофеина, парацетамола и ацетилсалициловой кислоты при совместном присутствии // Заводск. лаборатория. Диагностика материалов. - 2005. - Т. 71. - № 9. - С. 18-20.

2. Власова И.В., Шилова A.B., Одинец E.H., Рыжова C.B. Спектрофотометриче-ское определение папаверина гидрохлорида и дибазола в лекарственном препарате «Папазол» // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов (Пятигорская государственная фармацевтическая академия). - Вып. 60. - Пятигорск, 2005. - С. 193-194.

3. Власова И.В., Шилова A.B. Критерий выбора аналитических длин волн при анализе двухкомпонентных смесей с малым содержанием одного из компонентов // Всероссийская конференция «Менделеевские чтения». Труды конференции. Тюмень. - 2005. - С. 427-430.

4. Власова И.В., Шилова A.B. Повышение точности определения компонентов в двухкомпонентных смесях по методу Фирордта // Вестник Омского университета. - 2006. - № 3. - С. 53-55.

5. Власова И.В., Шилова A.B. Новые подходы к спектрофотометрическому анализу многокомпонентных смесей // В ¡сник Харювского Нацюнального Ушверситету. - 2007. - № 770. - Xímí*. - Вип. 15(38). - С. 141-146.

6. Власова И.В., Шилова A.B., Фокина Ю.С. Спектрофотометрическое определение активных компонентов в составе лекарственных препаратов с использованием метода Фирордта. Анализ препаратов «Анальгин-хинин» и «Панадол-ЭКСТРА» // Хим.-фарм. журнал. - 2008. - Т. 42. - № 10. - С. 49-53.

7. Власова И.В., Шилова A.B., Фокина Ю.С. Спектрофотометрическое определение активных компонентов в составе лекарственных препаратов с использованием метода Фирордта. Анализ препаратов «Тетралгин» и «Солпадеин» // Хим.-фарм. журнал. - 2008. - Т. 42. - № 11. - С. 53-56.

8. Богданова JI.A., Масякова E.H., Пермякова Н.Ю., Власова И.В. Хроматогра-фическое определение водорастворимых витаминов в премиксах // Вестник Омского университета. - 2007. - № 1. - С. 26-29.

9. Власова, И.В. Масякова Е.Н, Богданова Л.А, Пермякова НЛО. Определение водорастворимых витаминов в премиксах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Заводск. лаборатория. Диагностика материалов. -2007.-Т. 73.~№9. - С. 25-27.

10. Масякова E.H., Шелпакова A.C., Феллер A.B., Власова И.В. Определение водорастворимых витаминов группы В в неразделенных смесях // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сб. науч. тр. / Пятигорская государственная фармацевтическая академия. - Вып. 63. - Пятигорск, 2008. - С. 303-304.

11. Власова И.В., Шелпакова A.C., Масякова E.H. Спектрофотометрический анализ смесей витаминов с применением метода множественной линейной регрессии // Аналитика и контроль. - 2009. - Т. 13. - № 2. - С. 86-90.

12. Власова И.В., Шелпакова A.C., Добровольский С.М., Фисенко A.B. Новые подходы к применению метода множественной линейной регрессии в спек-трофотометрическом анализе многокомпонентных смесей // Аналитика и контроль.-2009.-Т. 14,-№3,-С. 153-157.

13. Власова И.В., Вершинин В.И. Возможность определения компонентов бинарных смесей методом Фирордта с погрешностями, не превышающими заданный предел // Журн. аналит. химии. - 2009. - Т. 64. - № 6. - С. 571-576.

14. Власова И.В., Масякова E.H., Корягина А.Ю. Спектрофотометрическое определение витаминов в неразделенных смесях с применением метода проекции на латентные структуры (ПЛС) // Заводск. лаборатория. Диагностика материалов.-2010.-Т. 76,-№2.-С. 18-21.

15. Власова И.В., Исаченко H.A., Шилова A.B. Предельно допустимые отклонения от аддитивности при фотометрическом анализе бинарных смесей методом Фирордта // Журн. аналит. химии. - 2010. - Т. 65. - № 5. - С. 481-487.

16. Власова И.В., Шелпакова A.C., Нагаев A.A. Формирование градуировочных наборов для спектрофотометрического анализа многокомпонентных смесей с применением метода множественной линейной регрессии // Вестник Омского университета. - 2010. - № 2. - С. 99-105.

17. Власова И.В., Вершинин В.И., Шелпакова A.C. Хемометрические алгоритмы в спектрофотометрическом анализе неразделенных смесей органических веществ // Вестник Омского университета. - 2010. - № 2. - С. 14-24.

18. Власова И.В., Вершинин В.И., Харькова М.А. Планирование эксперимента как способ изучения отклонений от аддитивности светопоглощения // Вестник Омского университета. - 2010. - № 2. - С. 91-98.

19. Власова И.В., Шилова A.B., Фокина Ю.С. Спектрофотометрические методы в анализе лекарственных препаратов (обзор) // Заводск. лаборатория. Диагностика материалов. - 2011. - Т. 77. - № 1. - С. 21-28.

20. Власова И.В., Вершинин В.И., Цюпко Т.Г. Методология спектрофотометрического анализа смесей органических соединений. Проблема неаддитивности светопоглощения//Журн. аналит. химии.-2011.-Т. 66.-№ 1.-С. 25-33.

21. Вершинин В.И., Власова И.В., Цюпко Т.Г. Выявление отклонений от аддитивности в спектрофотометрическом анализе неразделенных смесей // Методы и объекты химического анализа. -2010.-Т. 5. -№ 4. - С. 226-234.

22. Шелпакова A.C., Власова И.В., Масякова E.H. Анализ витаминных смесей с применением разных вариантов множественной линейной регрессии // Вестник Омского университета. - 2010. -X» 4. - С. 107-111.

Подписано в печать 12.04.2011. Формат бумаги 60x84 1/16. Печ. л. 3,25. Тираж 150 экз. Заказ 161.

Издательство ОмГУ 644077, Омск-77, пр. Мира, 55а Отпечатано на полиграфической базе ОмГУ 644077, Омск-77, пр. Мира, 55а

в) определение суммарного содержания ряда компонентов смеси (£Х), обычно родственных в структурном или функциональном отношениях. Примером может быть определение суммарного содержания антиоксидантов (преимущественно полифенолов) в пищевых продуктах [7]; г) одновременное раздельное определение нескольких групп веществ и т-Д-)з в каждую из которых входят компоненты пробы, объединенные по некоторому признаку (например, родственные по структуре молекулы). Пример: определение структурно-группового состава нефтепродуктов по светопоглощению в ближней ИК области [ 5].

Способы решения задач разного типа. В спектрофотометрии задачи каждого типа решают сходными способами, независимо от природы смеси. Основные проблемы, возникающие при решении задач каждого типа, и способы решения этих проблем можно представить в табличной форме (табл.1). Сложность решения задач растет в ряду а г. Точность результатов анализа при прочих равных условиях падает по мере усложнения состава смеси.

Определение содержания единичного X (задача а). Содержание X обычно находят методом одномерной градуировки, многоволновую спектрофотомет-рию и хемометрические алгоритмы применяют редко. Анализ не вызывает трудностей, если в спектре X есть- участок, где не поглощают остальные компоненты данной смеси. Так как молекулярные спектры органических соединений являются широкополосными, участки специфического поглощения X обнаружить удается далеко не всегда. Неспецифичность поглощения X можно

Таблица 1.1.

Проблемы, возникающие при решении химико-аналитических задач разного типа в спектрофотометрическом анализе неразделенных смесей, и возможные способы решения этих проблем

Тип задачи Что определяют? Основные проблемы Способы решения проблем а X Наложение спектров разных компонентов. Выбор длины волны, подбор раствора сравнения, применение специфических реагентов, маскирование мешающих примесей. б Хь Хг. Хп Наложение спектров, неточность и трудоемкость определения коэффициентов поглощения, неаддитивность светопогло-щения. 1 Выбор аналитических длин волн, производная спектрофо-тометрия, разложение спектров на составляющие, многоволновая спектрофотометрия, расчет коэффициентов поглощения по смесям известного состава, применение хемомет-рических алгоритмов. в IX Внутригрупповые различия коэффициентов поглощения, выбор стандартного вещества, неаддитивность светопогло-щения. Применение неселективных реагентов, выбор длины волны, маскирование примесей, применение хемометрических алгоритмов. г IX, IV, 22. Внутригрупповые различия коэффициентов поглощения, межгрупповые наложения спектров, трудность градуировки, неаддитивность светопо-глощения. Применение хемометрических алгоритмов. преодолеть путем дериватизации, то есть применения реагентов, избирательно переводящих X в соединение, поглощающее свет в другой области длин волн [8], либо путем маскирования мешающих компонентов.

Раздельное определение нескольких аналитов, родственных в структурном и/или функциональном отношениях (задача б). Нередко для всех или хотя бы для некоторых X не удается найти участки спектра, где светопоглощение было бы специфичным для соответствующих аналитов. Как правило, не удается отыскать и фотометрические реагенты, специфичные для каждого X. В этих случаях смесь анализируют методами многоволновой спектрометрии [4]. В самых простых случаях (2-3 аналита, близкие концентрации аналитов, идеальное выполнение закона Бугера-Ламберта-Бера) можно применять классический метод Фирордта, основанный' на решении определенной системы уравнений. В других случаях используют более сложные варианты расчетов, увеличивая число аналитических длин волн и решая переопределнные системы уравнений [10].

Случайные погрешности при оценке множества коэффициентов светопо-глощения, а также трудоемкость соответствующих измерений мешают применению регрессионных методов, которые можно рассматривать как простейшие хемометрические алгоритмы. Выходом может быть разложение спектра смеси на составляющие с выделением вклада каждого компонента [9] или переход к производной спектрофотометрии [6]. Применение вышеперечисленных вариантов многоволновой спектрофотометрии корректно лишь в тех случаях, когда качественный состав смеси и спектры поглощения всех компонентов известны, причем спектры разных компонентов регистрируются в одном и том же диапазоне длин волн, но не совпадают. Разумеется, спектрофотомет-рическим методом можно анализировать и смеси, заведомо не отвечающие этим условиям, однако при этом применяют особые алгоритмы (см., например [4,9]). Проверить аддитивность светопоглощения смесей с не полностью известным составом в принципе невозможно.

Суммарное содержание нескольких структурно-родственных аналитов (задача в) легко найти, если есть длины волн, где молярные (или удельные) коэффициенты поглощения всех аналитов приблизительно равны, а посторонние компоненты не поглощают. Суммарный сигнал можно формировать и с применением неселективных реагентов. Так, для определения суммарного содержания антиоксидантов (как правило, восстановителей) вводят в избытке соль железа(Ш) и орто-фенантролин [11]. Любой активный восстановитель в этих условиях дает один и тот же окрашенный продукт — фенантролинатный комплекс железа(Н). Внутригрупповые различия коэффициентов поглощения аналитов в подобных случаях приводят к систематическим погрешностям [12]. Оптимальный выбор вещества для построения градуировочного графика требует учета индивидуального состава анализируемых проб. Вместо определения суммарного содержания аналитов нередко рассчитывают некоторый интегральный показатель, корреляционно связанный с величиной £X. Пример такого показателя - антиоксидантная активность исследуемого материала в пересчете на некоторое стандартное вещество [7]. Для повышения точности оценки суммарного содержания ряда аналитов варьируют условия формирования и измерения суммарного сигнала, а также применяют хемометрические алгоритмы [2].

Структурно-групповой анализ (задачи типа г). Эти задачи имеют наибольшую сложность. Систематические погрешности возникают не только из-за наложения спектров поглощения соединений разных групп, но и за счет неодинаковости коэффициентов поглощения у соединений одной группы. Единственно надежным средством снижения погрешностей оказывается применение хемометрических алгоритмов. При этом нужны прецизионные спектрофотометры, регистрирующие спектры поглощения в цифровой форме, и соответствующее программное обеспечение. Для оценки суммарных содержаний аналитов рассчитывают многомерные градуировки, используя спектры поглощения модельных смесей известного состава (обучающих выборок).

Отклонения от аддитивности светопоглощения могут приводить к систематическим погрешностям при решении задач любого типа, но они особенно опасны при решении задач типа б. Задачи такого типа часто приходится решать в ходе анализа лекарственных препаратов. Далее этим задачам будет уделено основное внимание. В отдельных случаях будут рассмотрены и работы, в которых решается более простая задача а. С весьма сложными и специфическими задачами типов виг специалисты в области анализа лекарственных препаратов сталкиваются сравнительно редко. Соответствующие исследования в настоящем обзоре не отражены.

1.2. Спектрофотометрический анализ лекарственных и витаминных препаратов

Современные тенденции количественного спектрофотометрического анализа неразделенных смесей органических веществ можно рассмотреть на примере публикаций, посвященных анализу лекарственных и витаминных препаратов. Выбор этих объектов обусловлен следующими соображениями:

• индивидуальные органические соединения, обладающие биологической активностью и входящие в состав многокомпонентных лекарственных и витаминных препаратов, как правило, характеризуются интенсивным собственным светопоглощением в УФ области спектра и могут быть определены спектрофотометрическим методом;

• спектры поглощения многих представителей данной группы соединений сильно перекрываются, что приводит к низкой селективности или неселективности светопоглощения;

• среди индивидуальных соединений, входящих в состав лекарственных и витаминных препаратов, есть множество веществ, обладающих противоположными химическими свойствами (кислоты и основания, окислители и восстановители). Такие вещества нередко входят в состав одних и тех же препаратов, что ведет к взаимодействию компонентов пробы (особенно после ее растворения), отклонениям от аддитивности светопоглощения и, следовательно, к трудно предсказуемым систематическим погрешностям анализа;

• соотношение компонентов в реальных лекарственных и витаминных препаратах колеблется в широком диапазоне, нередко требуется одновременно определять аналиты, являющиеся макро- и микрокомпонентами, а это дополнительно усложняет решаемую задачу;

• практически все таблетированные препараты содержат, помимо анали-тов, другие вещества, присутствие которых может затруднять определение биологически активных компонентов (аналитов). Примером могут быть наполнители, которые нередко влияют на сигналы аналитов. Это обычно вызывается наложением спектров поглощения, реже - другими причинами.

Таким образом, в анализе лекарственных и витаминных препаратов проявляются практически все проблемы спектрофотометрии неразделенных смесей, перечисленные в предыдущем разделе.

С другой стороны, бурный рост фармацевтической промышленности требует новых, экспрессных и достаточно точных методов контроля качества поступающих на рынок фармпрепаратов. Поэтому рассматриваемые объекты интересны не только в теоретическом аспекте, но и весьма актуальны в практическом отношении. Обзор научной и патентной литературы за последние 20-30 лет показывает, что спектрофотометрическое определение органических веществ в неразделенных смесях продолжает привлекать аналитиков-исследователей, в этой области ежегодно появляются десятки новых публикаций.

Известно, что спектрофотометрический анализ неразделенных смесей органических соединений можно проводить несколькими принципиально разными способами [13]. В частности:

1. Измеряют светопоглощение смеси без введения дополнительных реагентов (по собственному поглощению компонентов). При этом используют те аналитические длины волн, на которых светопоглощение единичного аналита специфично [4]. Применяют также методы производной или дифференциальной спектрофотометрии, добиваясь повышения селективности аналитических сигналов и снижения фона [6].

2. Проводят селективные реакции компонентов исследуемой смеси (ана-литов) с подходящими фотометрическими реагентами, а затем измеряют све-топоглощение образующихся дериватов [8].

3. Используют разные варианты многоволновой спектрофотометрии [9] и всевозможные хемометрические алгоритмы обработки больших массивов спектральных данных [3], в частности разные варианты регрессионного анализа, алгоритмы декомпозиции спектров, многомерные градуировки и др.

Все перечисленные способы пригодны для анализа как лекарственных, так и витаминных препаратов. Они могут применяться при определении как единичного аналита, так и нескольких компонентов неразделенной смеси.

1.2.1. Определение единичного аналита

Одноволновая спектрофотометрия в УФ и видимой области. УФспектрофотометрия - простой и широко применяемый метод, пригодный для решения множества химико-аналитических задач. В фармацевтическом анализе с его помощью проводят испытание подлинности, доброкачественности, а также количественное определение активных компонентов лекарственных препаратов. Метод нашел отражение в Фармакопее РФ и аналогичных документах других стран. За последние годы разработано немало новых методик анализа лекарственных форм и препаратов по их УФ спектрам поглощения [13-21]. В смесях, содержащих одно действующее соединение, его содержание обычно определяют по собственному светопоглощению при заранее выбранной аналитической длине волны (АДВ). Так определяют анальгин [14], димедрол, пиридоксина гидрохлорид, новокаин [15], папаверина гидрохлорид [16], и многие другие соединения [17-21]. Расчет концентраций обычно ведут с применением метода внешнего стандарта [13-15, 20]. Соответствующие пределы обнаружения находятся на уровне 10" г/мл, погрешности анализа - до 12 % отн. К сожалению, в большинстве публикаций метрологические характеристики разработанных методик не указываются.

Для анализа витаминных препаратов прямую одноволновую спектрофо-тометрию применяют сравнительно редко. Примером может быть определение содержания витамина В2 и продуктов его фотолиза [22,23] или определение пиридоксина гидрохлорида в таблетках, содержащих меклозина гидрохлорид и кофеин [24]. Тот же способ используют для определения витамина В12 в инъекционном растворе [25]. Твердофазную УФ спектрофотометрию (после сорбции на катионообменной смоле Sephadex СМС-25) применяют для количественного определения витамина В! в моно- и поливитаминных препаратах [26]. Методика очень чувствительна и экспрессна, она позволяет определять Bi в присутствии витаминов В2, Вб и В12.

Спектрофотометрия в видимой области занимает важное место в фармакопейном анализе. Соответствующие методики довольно широко представлены в литературе, хотя данный метод менее универсален и более трудоемок, чем УФ спектрофотометрия. Большинство лекарственных веществ не поглощают в видимой области спектра, поэтому для перевода их в окрашенные соединения проводят соответствующие фотометрические реакции. Используют реакции органического синтеза, ред-окс-реакции, фотохимические или ферментные реакции, а также реакции других типов. Чаще всего получают окрашенный комплекс аналита с реагентом. Последний вариант наиболее исследован и надежен. Получение комплексного соединения реагент — органическое лекарственное вещество (JIB) возможно благодаря тому, что многие JIB являются потенциальными лигандами. Их способность к комплексообразованию объясняется наличием в составе молекул JIB разнообразных функциональных групп и гетероатомов. Остается правильно подобрать реагент. Для этой цели используют красители, ионы различных металлов и некоторые неорганические соединения [27-29].

Фармакопейные спектрофотометрические методики иногда предполагают предварительное разделение и/или концентрирование. В ряде случаев действительно невозможно избежать этой трудоёмкой операции, увеличивающей время анализа, требующей работы аналитика с токсичными растворителями.

Ряд экстракционно-фотометрических методик основаны на способности некоторых JIB образовывать ионные ассоциаты с кислотными и основными красителями [8,30-36]. Так, димедрол реагирует с азокрасителем сульфоназо [30], папаверин - с аминоном [31]. Однако большинство методик не требует экстракционного разделения компонентов пробы [37-42]. Примером может служить методика определения парацетамола в готовых лекарственных формах [38], она характеризуется высокой чувствительностью и простотой выполнения.

В некоторых случаях до фотометрической реакции проводят реакции гидролиза, либо окислительно-восстановительные реакции с участием определяемого вещества [43-47]. Так, определение витамина С предложено вести по методике, основанной на окислительно-восстановительной реакции между аскорбиновой кислотой и аммиачным комплексом меди(П). В результате реакции уменьшается содержание комплекса и светопоглощение раствора [44]. Методика успешно применена для определения витамина С в различных фармацевтических препаратах (поливитаминные драже, сиропы, порошки и шипучие таблетки). Полученные данные хорошо согласуются с данными, полученными методом йодометрического титрования.

В обзоре [45] приведены многочисленные данные о существующих фотометрических способах определения нитроглицерина, в том числе включенных в Фармакопеи разных стран - России, Британии, Японии, а также в Международную фармакопею.

В ряде работ изучено взаимодействие веществ пиразолонового ряда с ионами металлов: Се (IV) [48], Fe (III) [49-51], Си (II) [52]. Ионы железа являются одними из наиболее распространенных комплексообразователей [53,54]. Фотометрическим методом с использованием ионов железа определяют аспирин, а также алендронат (нехромофорное лекарственное вещество группы бисфосфонатов). Кобальт, как и железо, также является одним из часто применяемых комплексообразователей. Он образует комплексы со многими лекарственными веществами, в число которых входят циметидин, фамотидин и ранатидина гидрохлорид [55]. С помощью молибдата аммония определяют индометацин как в чистом виде, так и в фармацевтических препаратах [56]. Метаванадат аммония используют в качестве фотометрического реагента для определения хлорпромазина гидрохлорида последовательным инжекционным анализом [57]. Нередко в качестве реагента используют ионы палладия и золота [58]. Спектрофотометрическим методом в некоторых фармпрепаратах определяют не только активные лекарственные вещества, но и катионы металлов, которые являются, как правило, нежелательными примесями [59,60].

В спектрофотометрическом анализе витаминных препаратов также широко используют химические реакции с получением интенсивно окрашенных продуктов [61]. Обзор методик количественного определения витаминов с образованием окрашенных соединений приведен в работе [62]. Интересна работа [63], в которой показано применение спектрофотометрии для количественного определения С1Ч-В12, никотинамида и витамина РР по реакции с цианобромид-ным или роданидным реактивами. Количественное определение витаминов по поглощению света в видимой области с предварительным проведением фотометрической реакции применяют для определения витамина Вб по реакции образования азокрасителя [63], с диэтилнитроанилином [64], 2,6-дихлорхинон-хлоримидом [65], п-фенилендиамином [66].

Селективность фотометрических реакций, как и селективность светопо-глощения продуктов этих реакций, нередко недостаточны для определения индивидуальных витаминов в их смесях. В таких случаях разрабатывают экс-тракционно-фотометрические либо сорбционно-фотометрические методики, используют различия в скоростях взаимодействия компонентов смеси с некоторым неселективным реагентом, применяют хемометрические алгоритмы. Примером сорбционно-фотометрического определения может быть методика [67] , позволяющая определять витамины С, В1 и Вб с помощью чувствительных элементов на основе целлюлозы и пенополиуретана в статических условиях. Установлены диапазоны концентраций, в которых аналитический сигнал пропорционален содержанию витамина.

Методы, основанные на различии скоростей взаимодействия разных витаминов с одним и тем же реагентом, позволяют проводить анализ многокомпонентных смесей без их предварительного разделения. Такой подход позволил разработать ряд селективных и чувствительных методик. Так, в работе [68] представлены две методики, предназначенные для одновременного спек-трофотометрического определения аскорбиновой кислоты и цистеина. Оба аналита количественно восстанавливают избыток железа (III) до железа (II), а железо (II) образует в растворе окрашенный комплекс с фенантролином. Восстановление железа (III) цистеином и аскорбиновой кислотой проходит с разной скоростью, и это позволяет раздельно находить концентрации этих восстановителей. Расчет проводят по методу двух скоростей или дифференциально-кинетическим методом.

Таким образом, разные варианты классической одноволновой спектрофо-тометрии довольно часто применяют для анализа смесей витаминов; преимущественно - для определения единичного аналита. Одновременное спек-трофотометрическое определение двух и более витаминов в реальных объектах сложного состава проводят довольно редко.

Несмотря на очевидные преимущества классической УФ спектрофото-метрии, она может быть использована далеко не всегда. Считается, что прямая УФ спектрометрия не применима к анализу смесей в тех случаях, когда для компонентов не выполняется закон Бугера-Ламберта-Бера, либо светопо-глощение исследуемой смеси не аддитивно [4]. Отклонения от аддитивности могут быть связаны не только с химическим взаимодействием активных компонентов, но и с влиянием наполнителей, вспомогательных веществ, содержащихся в таблетированных препаратах.

Дифференциальная спектрофотометрия. Дифференциальные методы значительно расширяют возможности спектрофотометрии [69,70]. Использование дифференциальных методов позволяет снизить погрешность спектро-фотометрического анализа до 1 % и расширить интервал определяемых концентраций. Кроме того, этот метод не требует построения градуировочного графика. При определении анальгина в водно-щелочных растворах методом дифференциальной спектрофотометрии достигнуты наиболее точные результаты (отн. погрешности составляют 0,10-0,19 %) [71]. Этим же методом ведут определение парацетамола в таблетках тонизирующего препарата, содержащего кофеин и другие компоненты, без их разделения [72]. Метод дифференциальной спектрофотометрии может быть использован для определения ЛВ в присутствии других компонентов, имеющих некоторое собственное поглощение. В частности, авторами [73,74] были проанализированы двухкомпонент-ные системы: папаверин-дибазол, папаверин-кодеин, амидопирин-фенацетин, кофеин-бензоат натрия, парацетамол-кофеина и др. Встречаются методики, в которых дифференциальную спектрофотометрии) используют для анализа трехкомпонентных смесей [75,76].

Для повышения избирательности метода в некоторых случаях применяют один из вариантов дифференциальной спектрофотометрии, так называемый АЕ-способ [77-79]. Сущность его заключается в том, что измеряют приращение оптической плотности исследуемого раствора смеси, связанной с переходом аналита из одной, например, таутомерной формы, в другую. Обязательным условием является неизменность светопоглощения всех других компонентов смеси, в том числе примесей, наполнителей таблеток.

Результаты исследований отечественных специалистов в области дифференциальной спектрофотометрии явились основой при разработке фармакопейной статьи «Дифференциальная спектрофотометрия и фотоколориметрия», которая была включена в 11-ую Государственную Фармакопею СССР [66].

Производная спектрофотометрия. Переход к производной спектрофотометрии нередко позволяет исключить влияние мешающих компонентов на результаты спектрофотометрического анализа. Основное преимущество производных спектров - уменьшение ширины пиков. Значительное повышение селективности достигается за счет улучшения разрешения отдельных полос и снижение влияния фона [4,80]. Дифференцирование полиномов степени (и+1), характеризующих полосы поглощения аналитов, позволяет исключить влияние п сопутствующих веществ. Вторым существенным преимуществом производных спектров является резкое повышение контраста между полосами разной полуширины. Малохарактерное поглощение при дифференцировании подавляется, а поглощение характерных полос, даже при малой интенсивности, усиливается.

Применение производных спектров первого-третьего и более высоких порядков для определения содержания лекарственных веществ изложено в работах [81-94], витаминов - в работах [95-101]. Отметим, что производная спектрофотометрия включена в фармакопейную статью «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» последнего, 12-го издания ГФ РФ [102]. Описаны простые, экспрессные и чувствительные методики спектрофотомет-рического определения циметидина, фамотидина и хлоргидрата ранитидина в присутствии их Э-оксидных производных [81]. Для определения циметидина и фамотидина в водных растворах пробы используют отношения первых производных спектров светопоглощения, а для определения хлоргидрата ранитидина — прямую спектрофотометрию. Описаны соответствующие методики анализа сырьевых материалов и фармацевтических препаратов.

Часть работ по производной спектрофотометрии посвящена одновременному определению двух компонентов в готовых лекарственных формах (таблетках). Разработаны методики одновременного определения анальгина и парацетамола [82], анальгина и гиосцин-И-бутилбромида [83], парацетамола и аскорбиновой кислоты [84]. Нередко при этом применяют метод отношения производной спектров [85-87]. Использование первой и второй производной спектров поглощения позволяет вести одновременное определение в фармацевтических препаратах гидрохлорида бензаприла и гидрохлортиазида [88], амоксицилина и клавулановой кислоты [89], диазепама и отилоунима бромида [90], гидрохлорида промазина и его сульфоксида [91], анальгина и адамона [92]. Эти методики весьма точны и не требуют разделения компонентов. Реже встречаются работы, где одновременно определяют три лекарственных вещества [93,94].

Производную спектрофотометрию применяют и при анализе смесей витаминов. Так определяют витамин Вб в таблетках, содержащих мелатонин [95]. В отличие от лекарственных веществ, гораздо больше работ посвящено анализу тройных смесей витаминов [96-99] и даже более сложных смесей, содержащих 4 витамина [100,101]. В работе [96] предложена методика спектро-фотометрического определения витаминов Вь Вб и ретинола ацетата в смеси по спектрам второго-пятого порядков. В работе [97] описана методика анализа тройных смесей витаминов Вь В6 и В]2 с использованием производной пятого порядка. Для определения тех же витаминов в смеси предложено использовать спектрофотометрию с применением соотношения интенсивностей первой и третьей производных спектра при пересечении нулевой линии [98]. Еще одна методика, позволяющая одновременно определять Вь Вб и В12 в мультивита-минных препаратах, предложена в работе [99]. Она основана на измерении амплитуды первой производной при фиксированной длине волны -378 нм. Методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и дает правильные результаты даже в присутствии продуктов разложения витаминов.

Для расчета содержания витаминов применяют и другие математические методы обработки спектров. Так, в работе [100] описано применение алгоритма Поттера-Шмидта и фильтра Кальмана для одновременного определения четырех витаминов - Вь В2, Вб и никотинамида в модельных смесях и таблетках. Спектры поглощения компонентов полностью перекрываются, но найденные предложенным методом содержания для всех 4 компонентов составляют 97,0-103,3% от введенных. При анализе таблеток полученные данные хорошо согласуются с содержаниями, указанными на упаковках. Еще одна методика одновременного определения четырех витаминов В], В2, Вб, и РР-амида пантотената в инъекционных растворах изложена в работе [ 101].

Наиболее существенный недостаток производной спектрофотометрии -резкое ухудшение отношения сигнал : шум [4]. Независимо от способа получения производных, процесс дифференцирования сводится к измерению разностей близких величин, и погрешности при регистрации оптической плотности чрезвычайно влияют на производные спектры. Значительное ухудшение сходимости - та цена, которую при переходе к производной спектрофотомет-рии приходится платить за выигрыш в селективности. Выходом может быть использование алгоритмов, созданных на основе регрессионного анализа — прежде всего метода Фирордта и метода множественной линейной регрессии.

1.2.2. Одновременное определение нескольких аналитов с применением разных вариантов регрессионного анализа

Метод Фирордта. Благодаря применению стандартных компьютерных программ, методики спектрофотометрического анализа многокомпонентных лекарственных смесей, основанные на использовании алгоритмов регрессионного анализа, отличаются быстротой и простотой исполнения. Если спектры поглощения индивидуальных соединений (компонентов исследуемой смеси) перекрываются, то для определения их содержаний применяют метод Фирордта (МФ), реже - метод вычитания оптической плотности [103,104].

Наиболее простым вариантом регрессионного анализа является метод, предложенный К. Фирордтом, еще в 1873 г. [4] и основанный на решении определенной системы линейных уравнений. Он включен в Государственную Фармакопею многих стран, в частности, Фармакопею США [22] и РФ [102]. Как правило, МФ применяют для анализа смесей, содержащих 2-3 компонента. К сожалению, точность метода невысока, и погрешности быстро растут с увеличением числа аналитов. Большое значение при реализации данного метода имеет правильный выбор аналитических длин волн. Этот вопрос будет рассмотрен в главе 3.

Для анализа лекарственных и витаминных препаратов метод Фирордта широко испольуют как отечественные [105-111], так и зарубежные специалисты [112-126]. Так, МФ применяли для нахождения концентраций кофеина и парацетамола при исследовании кинетики растворения твёрдых смесей указанных веществ [105]. Разработана методика количественного определения левомицетина и анестезина в присутствии суммы каротиноидов облепихового масла в препарате "Олазоль" [106], методика основана на применении модифицированного МФ. Предложена комплексная методика определения компонентов лекарственной формы, где содержание парацетамола и кофеина определяют по методу Фирордта, аскорбиновой кислоты — йодометрически, а димедрола — методом алкалиметрии. Относительные погрешности определения всех перечисленных веществ менее 1%. [107]. В Омском госуниверситете в последние годы МФ был использован для разработки ряда экспрессных методик одновременного определения двух или трех активных компонентов лекарственных препаратов [108-111] (соответствующие методики будут рассмотрены в главе 6). Определению тех же веществ, но с использованием других способов расчета концентраций посвящены работы [112,113]. Анализ трех различных по составу бинарных смесей,- содержащих гидрохлортиазид в сочетании с беназеприлом, триамтерином и цилазиприлом, изложен в работе [114]. МФ успешно применен для определения парацетамола в смесях с набу-метоном [115], эторикоксибом [116]. Амлодипина безилат определяют в присутствии небиволола [117] и лизиноприла [118]. Спектрофотометрический анализ с применением МФ позволяет одновременно определять гидрохлориды меклизина и пиридоксина [119], левоцетиризин и псевдоэфедрин [120], диацерин и ацеклофенак [121] и другие пары активных компонентов лекарственных препаратов [122-126]. Напротив, методики одновременного определения ряда витаминов с применением - МФ в известной нам литературе отсутствуют.

Метод множественной линейной регрессии. Решение определенной системы уравнений не всегда дает возможность оценить адекватность модели и надежность рассчитанных величин. Эта возможность появляется, когда число измерений функции превышает число искомых параметров, такая система уравнений называется переопределенной. Поэтому в настоящее время больший интерес вызывают те варианты регрессионного анализа, в которых для нахождения концентраций компонентов используют результаты множества измерений оптической плотности во всем исследуемом спектральном диапазоне. Общее назначение множественной линейной регрессии состоит в установлении связи между несколькими независимыми переменными X и зависимой переменной У посредством линейного уравнения вида:

Коэффициенты регрессии Ь, обычно определяют методом наименьших квадратов (МНК), минимизируя сумму квадратов отклонений фактических значений зависимой переменной от соответствующих предсказанных значений [127,128]. На практике используют разные варианты МНК - модифицированный метод наименьших квадратов (ММНК), метод частичных наименьших квадратов (ЧМНК) [129,130], и некоторые другие. Для проведения анализа многокомпонентных смесей с применением алгоритма МЛР пригодны программы, реализующие и другие варианты регрессионного анализа, помимо уже названного МЕЖ, а именно: метод линейного программирования, объединенные методы и др. [131,132].

В спектрофотометрическом анализе концентрации ряда компонентов исследуемой смеси (аналитов) часто определяют, решая сильно переопределенную систему линейных уравнений вида: где А1 — оптическая плотность раствора смеси при г-ой длине волны, ац - коэффициент поглощения у —го компонента при той же длине волны, с, - концентрация этого компонента в растворе, / - толщина кюветы, т - число компонентов. Соответствующие методики относят к двум основным варианта метода множественной линейной регрессии (МЛР). В варианте прямой градуировки (далее МЛР-1) расчет ведут, используя коэффициенты поглощения, предварительно вычисленные по спектрам индивидуальных соединений. В случае непрямой градуировки (МЛР-2) коэффициенты поглощения компонентов (правильнее сказать, коэффициенты регрессии) вычисляют не по спектрам растворов индивидуальных соединений, а по спектрам смесей с точно известным качественным и количественным составом [127]. Однако известно, что МНК позво

Г= а + Ь/Х/ + Ъ2Х2 + . + Ь/рсь ляет получать линейные относительно оптической плотности оценки концентраций с минимальной дисперсией только в том случае, если погрешности в определении коэффициентов поглощения пренебрежимо малы (независимо от того, по какому варианту градуировки - прямому или непрямому, они вычислены), а погрешности измерений аналитического сигнала случайны и нормально распределены [4]. В противном случае решать задачу, используя классический МНК, нельзя.

В статье [133] рассматривается вариант МНК для случая двумерных погрешностей отдельных наблюдений, то есть когда имеются погрешности и во входных, и в выходных переменных. Авторы полагают, что двухпараметри-ческая функциональная зависимость между переменными может быть преобразована к линейной регрессии. Разработанная авторами компьютерная программа С11(Ж позволяет до проведения практической градуировки с реальными эталонами провести математическое (компьютерное) моделирование процедуры градуировки для того, чтобы определить оптимальное число и качество эталонов, а также достигаемую точность градуировки.

Ввиду меньшего влияния случайных погрешностей, метод МЛР позволяет анализировать более сложные смеси, чем МФ. Среди литературных источников, описывающих определение лекарственных веществ и витаминов с применением классического регрессионного анализа, преобладают зарубежные публикации. Приведенные в них методики, основанные на обработке спектральных данных в широком диапазоне, позволяют одновременно определять одно [134], два [135-137], три [138-141] и даже четыре вещества [142144]. Так удается например, определить кофеин, парацетамол и метамизол в таблетках [140], а также витамины Вь Вб, В12 и диклофенак натрия, входящие в состав противоревматического препарата [143].

Заметим, что число публикаций, где описано применение метода МЛР в анализе лекарственных препаратов, значительно уступает числу публикаций, посвященным применению МФ. Меньшая популярность МЛР объясняется осложнениями, которые могут возникнуть при измерении аналитического сигнала (оптической плотности) в широком спектральном диапазоне. Прежде всего, это связано с неаддитивностью светопоглощения при некоторых длинах волн. Алгоритм МЛР предполагает соблюдение условия аддитивности оптической плотности, и если в спектрах смесей есть участки с достоверными отклонениями от аддитивности, это может привести к систематическим погрешностям определения если не всех, то, по крайней мере, некоторых аналитов.

Во-вторых, множественную регрессию может осложнять мультиколлине-арность, т.е. наличие скрытых связей между переменными, тогда как коэффициенты регрессии надежно определяются, если переменные являются независимыми, во всяком случае - относительно некоррелированными. Не всегда ясно, за счет чего возникает эффект мультиколлинеарности. Для его выявления в литературе предлагается ряд эмпирических правил и процедур [145].

Для снижения систематических погрешностей метода МЛР, вызванных перечисленными причинами, предлагались разные подходы. В частности, для определения каждого компонента исследуемой неаддитивной смеси можно использовать свой участок спектра [140]. Однако это увеличивает время на разработку методики и не всегда приводит к желаемому результату [144].

По мнению А.Ф.Васильева, влияние неаддитивности светопоглощения можно устранить, применяя алгоритмы нелинейного программирования [146]. Для реализации этой идеи еще в 1960-е годы была разработана компьютерная программа, ориентированная на количественный анализ многокомпонентных неаддитивных смесей [147]. Для проверки выполнимости закона поглощения с учетом отклонений от аддитивности смеси эта программа рассчитывает регрессионную модель зависимости оптической плотности от концентрации, находит регрессионные коэффициенты и их стандартные отклонения. Автоматически производится выбор оптимальных аналитических полос, которые затем используются при расчете содержаний аналитов. По-видимому, довести эти интересные (вероятно, опередившие свое время!) теоретические разработки до методик анализа реальных объектов не удалось, во всяком случае, соответствующие методики не публиковались и в анализе лекарственных препаратов не использовались.

Чтобы справиться с проблемой мультиколлинеарности, предлагалось использовать только одну переменную из высококоррелированного набора переменных. Для той же цели можно использовать специальные методы, такие как гребневая регрессия и факторный анализ [145,148].

Перспективным вариантом применения регрессионного анализа (в том числе при наличии неаддитивности и/или мультиколлинеарности) является построение многомерных градуировок [2,3,149]. Развитие алгоритмов регрессионного анализа привело к созданию различных методов многомерной градуировки, реализуемых только с помощью компьютерных программ. В некоторых странах применение многомерных градуировок уже стало рутинным способом анализа смесей. Появились и соответствующие методики анализа лекарственных препаратов (см. раздел 1.З.). В нашей стране консерватизм части химиков-аналитиков и фармацевтов, а также недостаточная распространенность и популяризация соответствующих компьютерных программ пока что препятствуют широкому применению этого метода. В отечественных публикациях большее внимание уделяется разработке методик анализа, основанных на применении метода Фирордта, а также поиску селективных фотометрических реагентов.

1.3. Многомерные градуировки в спектрофотометрическом анализе неразделенных смесей

1.3.1. Общая характеристика хемометрических алгоритмов

Появление и быстрое развитие вычислительной техники дало толчок для математизации и компьютеризации химического анализа. Немалую роль в этом сыграла относительно молодая дисциплина - хемометрика, которая зародилась на стыке прикладной математики и химии в середине 70-х годов двадцатого века. Появление этой дисциплины и интерес к ней химикованалитиков связан, прежде всего, с тем, что требовалось устранить несоответствие между непрерывным ростом объемов получаемой информации и устаревшими методами её обработки. Поэтому применительно к аналитической химии хемометрику можно определить как научную дисциплину, использующую компьютерно-ориентированные математические и статистические методы для превращения оптимальными способами потока физической информации об исследуемом веществе в нужные сведения о его составе [145].

Костяк» хемометрики составляют методы теории информации, теории распознавания образов, математической статистики, теории планирования и оптимизации эксперимента [2,3,150]. Д. Массарт определял хемометрику, как химическую дисциплину, применяющую математические, статистические и другие методы, основанные на формальной логике, для построения или отбора оптимальных методов измерения и планов эксперимента, а также для извлечения наиболее важной информации при анализе экспериментальных данных [2]. С другими определениями хемометрики можно ознакомиться на сайте [151].

Обзор литературы показал, что за последнее время наблюдается значительное увеличение публикаций, посвященных хемометрике. В статьях освещаются как теоретические аспекты дисциплины, так и ее практическое применение в различных методах анализа. Наибольшая часть публикаций принадлежит зарубежным авторам. В статьях, посвященных теоретическим аспектам хемометрики, особое внимание уделено методам анализа многомерных данных [152], описанию методов многомерной калибровки, применяемых в различных областях химии [2,153,154]. В других статьях показано развитие хемометрики как подобласти аналитической химии, охарактеризовано ее современное состояние [149,155], отмечены последние тенденции в анализе многомерных данных и перспективы развития хемометрики [2,156,157].

Применение хемометрики в области химического анализа в основном связано с решением двух задач:

1. Классификация химических объектов (образцов, веществ, материалов) согласно их аналитическим характеристикам (спектральным, хроматографи-ческим и др.), что важно для качественного анализа и установления природы объекта.

2. Моделирование взаимосвязей между различными типами аналитических данных и построение градуировочной зависимости для индивидуального компонента или для нескольких компонентов одновременно (многомерная градуировка).

В соответствии с этими задачами наиболее часто применяемые в хемо-метрике алгоритмы можно разделить на две группы, а именно:

1) исследование данных с целью классификации и дискриминации, например, методом главных компонент (РСА), методом формального независимого моделирования аналогии классов (SIMCA) или более сложными методами, такими как искусственные нейронные сети (ANN);

2) предсказание новых значений с помощью предварительно построенной градуировки, например, методом проекции на латентные структуры (ПЛС).

Все перечисленные алгоритмы являются мощным инструментом для выбора оптимальных условий эксперимента и извлечения важной информации из массивов многомерных данных [158-160]. Методы первой группы, как правило, оперируют одним блоком данных, а второй — как минимум двумя блоками (предикторов и откликов). В зависимости от поставленных целей, методы второй группы могут быть направлены на предсказание значений в рамках диапазона условий эксперимента (интерполяция) или за пределами этого диапазона (экстраполяция). Реализацию хемометрических алгоритмов можно осуществлять с помощью специализированных пакетов программ (Unscrambler, SIMCA и др.), статистических (Statistica), математических (Matlab), а также пакетов общего назначения (Microsoft Excel).

Первые работы по хемометрике были посвящены методам анализа спектроскопических данных, построению с их помощью градуировочных моделей методами РСА и ПЛС [2,161]. Многомерную градуировку до сих пор рассматривают как наиболее эффективное применение хемометрики. Наиболее изучены алгоритмы обработки спектральных данных [3,127].

В настоящее время ПЛС - самый популярный метод, применяемый для обработки многомерных экспериментальных данных, известный и под другими названиями (проекционный метод многомерной градуировки, метод дробных или частичных наименьших квадратов). Метод ПЛС позволяет выделять в больших массивах данных скрытые переменные и учитывать внутренние связи, существующие между компонентами в изучаемой системе [3].

Построение многомерной градуировки методом ПЛС заключается в установлении максимальной ковариации между экспериментальными исходными данными X и переменными У, значения которых необходимо в будущем предсказывать, и как можно точнее [162]. При этом проводится одновременная декомпозиция матриц предикторов (X) и откликов (У):

X - ТР' + Е, У = ид'+Г, (1.3) где Т и и представляют матрицы счетов, Р и О — матрицы нагрузок, Е и ^ -матрицы остатков.

Поскольку разложение матриц производится согласованно, то ПЛС гораздо лучше описывает сложные связи, чем МЛР. В том случае, когда имеется несколько откликов У(несколько компонентов), можно построить две проекции исходных данных - ПЛС1 и ПЛС2 [163]. На практике алгоритм ПЛС1 используют с целью вычисления содержания одного компонента в присутствии других. Алгоритм ПЛС2 позволяет построить общую градуировку и таким образом вести определение всех интересующих компонентов. Применительно к спектрофотометрии матрица Г- это матрица концентраций, а матрица X - матрица оптических плотностей смесей, выступающих как градуиро-вочные, или обучающие. В качестве градуировочных образцов используют реальные или модельные смеси определяемых веществ с разным соотношением компонентов. В этом случае нет необходимости определять коэффициенты поглощения каждого вещества, нет необходимости и в строгом выполнении основного закона светопоглощения.

На данный момент метод ПЛС является наиболее устойчивым и надежным методом градуировки, поскольку, например, можно учесть влияние абсолютно всех входящих в состав лекарственных препаратов компонентов - как активных, так и вспомогательных. Для этого вспомогательные компоненты добавляют в градуировочные смеси [164-166]. Многомерные градуировки, построенные методом ПЛС, можно использовать и для оценки общего содержания структурно-родственных соединений [5,167],и для раздельного определения индивидуальных соединений в сложных смесях [168,169] даже тогда, когда содержания компонентов очень сильно различаются [166,170-172].

В отличие от ПЛС, популярные в 1970 - 1980-е годы и теоретически хорошо разработанные алгоритмы разложения сложных спектров на индивидуальные составляющие [9] сейчас для анализа реальных смесей используют относительно редко. Однако и в этой области появляются интересные методики. Примером могут быть публикации саратовских исследователей [173], в которых алгоритмы из семейства методов декомпозиции смесей произвольного состава на статистически независимые компоненты (М1ЬСА, 8№СА) применены для решения практических задач спектрального анализа — восстановления спектров индивидуальных компонентов и их концентраций по спектрам их линейных (аддитивных) смесей. Данные методы использованы для «безэталонного» количественного и качественного анализа смесей по спектрам поглощения в УФ и видимой областях.

Возможности различных методов многомерного статистического анализа применительно к обработке спектральных данных, а также преимущества и ограничения многокомпонентной градуировки при одновременном определении компонентов сложных смесей рассмотрены в статьях [174-176]. Кроме того, подробнее ознакомиться с основными методами, применяемыми для решения задач градуировки можно в обзоре А.Л. Померанцева [163].

Как правило, для анализа многокомпонентных смесей многомерные градуировки строят на основании линейных регрессионных моделей, поскольку они отличаются быстротой и простотой исполнения. Совершенно новым является метод простого интервального оценивания (ПИО), который основан на использовании алгоритма линейного программирования для анализа данных. В работах [177-179] дано простое и понятное объяснение метода ПИО, проиллюстрированное большим количеством примеров; показано, чем отличается данный метод от традиционных регрессионных методов.

1.3.2. Хемометрические алгоритмы в качественном анализе лекарственных препаратов

Качественный фармацевтический анализ предполагает проведение большого числа исследований, включающих, в частности, проверку подлинности лекарственного средства, идентификацию лекарственных веществ, на, полнителей и сырья, проверку качества препаратов, выявление фальсифицированных препаратов и т.д. С этой целью применяют традиционные химико-аналитические методы, требующие порой больших затрат времени, дорогих реактивов. Но иногда эти методы могут быть заменены гораздо более быстрыми и дешевыми косвенными методами. Наиболее ярко эта тенденция проявилась при использовании ИК-спектроскопии, особенно в ближней инфракрасной области (БИК)„ прежде считавшейся малоинформативной из-за высокого и трудно устранимого шума, обусловленного интенсивным поглощением воды и эффектом рассеяния в спектрах отражения. В обзоре [180] показано, что БИК-спектроскопия в комбинации с хемометрическими алгоритмами в определенной степени может заменить медленные лабораторные анализы и десятки тысяч измерений могут быть обработаны за один день.

Для качественного анализа наиболее популярным является метод главных компонент (РСА). Сочетание БИК - спектроскопии с методом РСА можно использовать для контроля качества на стадии гранулирования лекарственных препаратов [181]. В работе [182] для обработки ИК-спектров применяют методы PC А и SIMCA. С их помощью проводят идентификацию органических веществ, которые используются в лечении артрита.

Группа хемометриков из России, Швеции, Дании и Финляндии предложила использовать БИК спектры для выявления фальсификатов лекарств[183]. Авторами для этой цели использовались хорошо известные методы обработки данных -РСА и SIMCA. Идея SIMCA основана на том, что объекты одного класса или группы демонстрируют схожее поведение и это приближение позволяет показать те индивидуальные свойства, которые присущи основным образцам группы. Для каждого типа лекарственных средств формируют, свою группу подлинных образцов и для каждого нового объекта интервальные характеристики могут быть предварительно рассчитаны.

Российскими исследователями показана возможность тестирования фармацевтических препаратов непосредственно на складах [184]. Решение такой задачи очень важно для производства. В данной работе также используют БИК спектры, обработанные методом PCÀ. Авторы статьи [185] для выявления фальсифицированных препаратов по БИК спектрам предлагают использовать другой хемометрический прием - многофакторный анализ.

Но, несмотря на очевидные достоинства, в рутинном качественном фармацевтическом анализе ИК-спектроскопия в сочетании с хемометриче-скими алгоритмами пока не находит широкого применения.

1.3.3. Многомерные градуировки в количественном анализе лекарственных и витаминных препаратов сложного состава

В количественном анализе лекарственных препаратов хемометрические алгоритмы используются более активно, чем при проверке их подлинности. С помощью разных алгоритмов, реализуемых соответствующими компьютерными программами, ведут обработку спектров, снятых в разных областях длин волн - в ИК (включая ближнюю область), УФ и видимой области. Авторы статьи [186] использовали метод ИК спектроскопии с Фурье-преобразованием в сочетании с алгоритмами. ПЛС и нейронных сетей (ANN) для одновременного количественного определения глюкозы (субстрата) и глюкуроновой кислоты (основного продукта). Тот же вариант анализа, но только с использованием одного метода (ГО1С), применен для определения лецитина и соевого масла в диетических добавках [187], для определения гу-миновой кислоты [188], а также интермедиатов эфедрина [189].

ИК-спектроскопия в ближнем диапазоне лежит в основе ряда методик анализа, как, например, методики количественного определения аскорбиновой кислоты в таблетках «Аскорбиновая кислота (с сахаром)», аскорбиновой кислоты и рутина в таблетках «Аскорутин», витамина Е в масляном растворе. В первых двух случаях используют метод диффузного отражения от порошка таблеток, в третьем - метод просвечивания в цилиндрической кювете [190]. Разработан метод количественного определения трех изомеров карагенанов с использованием ИК-спектроскопии в средней области с Фурье- преобразованием в сочетании с ПЛС [191]. Предложенный метод измерения на тонких пленках при комнатной температуре отличается быстротой определений, поскольку позволяет детектировать все три соединения одновременно, является неразрушающим и обеспечивает относительные стандартные отклонения на уровне 0,03-0,04.

Спектрофотометрические методики в УФ и видимой области спектра в сочетании с хемометрическими подходами используют в основном для одновременного количественного определения всех компонентов без предварительного разделения. Обзор публикаций показал, что наиболее распространенным алгоритмом в этом случае является ПЛС 2.

Большая часть статей с использованием многомерных градуировок, построенных методом ПЛС, посвящена определению в смесях 2-3 органических веществ: дексаметазонфосфата Na и витаминов В6, Bî2 [192,193]; дексаметазо-на и полимиксина [194]; ацетилсалициловой кислоты (АСК),парацетамола и кофеина [195,196]; АСК и аскорбиновой кислоты [197]; хлоргидрата трипро-лидина и хлоргидрата псевдоэфедрина [198]; рифамуцина и рифампицина [199]; антипирина, сульфатиазола и риванола в ушных каплях [200]; карбамазепина и фенитоина в плазме [201], аспартама и ацесульфама-К в искусственных подсластителях [202], тетрациклина и окситетрациклина в сыворотке [203] и активных ингредиентов противомикробного препарата для носовой полости [204].

В зависимости от сложности анализируемых объектов (число аналитов, их концентрации, наличие других компонентов, интенсивность светопогло-щения и др.) оптимальными могут быть разные хемометрические алгоритмы. Поэтому во многих работах исследователи проводят анализ с применением не одного, а сразу нескольких способов обработки спектральной информации, с тем, чтобы сопоставить полученные результаты и выбрать лучший вариант. Можно сказать, что в настоящее время идет активное накопление материала, который позволит в дальнейшем провести сравнение аналитических возможностей разных хемометрических алгоритмов. Так, применение комбинации производной спектрофотометрии и метода ПЛС для анализа 2-х и 3-компонентных смесей предложено в работе [205]. Авторы вели одновременное определение перфеназина в смеси с гидрохлоридом амитриптилина и/или гидрохлоридом имизина. Результаты, полученные разными методами, были сопоставлены между собой и показали хорошую согласованность. Показана возможность применения разработанных методик для количественного анализа реальных многокомпонентных смесей.

В статье [206] для анализа смесей, состоящих из хлорталидона с атеноло-лом, или хлорталидона с амилорид гидрохлоридом и атенололом использовали методы РСА и ПЛС. Построенные градуировки позволили с высокой точностью определить состав каждой смеси в трех коммерческих образцах. Этими же методами определяли фенитоин, веронал и кофеин по спектрам поглощения в УФ-области [207], а также смесь антибиотиков [208]. Возможности методов МЛР и ПЛС при определении биологически активных веществ сопоставлены в работе [209].

Сочетание двух методик (спектрофлуориметрической и спектрофотомет-рической), а также методов ПЛС и РСА для одновременного определения пиридоксина и мелатонина использовали авторы статьи [210]. Эмиссионные и абсорбционные спектры этих веществ сильно перекрываются. Проводилась оптимизация условий определения обоих веществ. Соответствующие методики дали хорошие результаты и были успешно применены к анализу сложного фармацевтического препарата.

Для построения моделей методами РСА и ПЛС с использованием первых производных спектра в работе [211] проведена оптимизация спектральных данных по числу и интервалу длин волн. Оба метода дали статистически неразличимые результаты и были успешно применены для определения пирази-намида, изониазида и рифампицина в сложном фармацевтическом препарате. Две методики с применением многомерных градуировок (РСА и ПЛС) использовали для спектрофотометрического анализа 4-компонентной лекарственной смеси парацетамола, кофеина, трипеленамина и салициламида [212].

Изучено одновременное определение парацетамола, ибупрофена и кофеина методом УФ-спектроскопии с использованием трех хемометрических методов: ПЛС, генетического алгоритма в совокупности с ПЛС (ГА-ПЛС) и РСА. Все три метода были успешно применены к анализу фармацевтического препарата [213]. Авторы статьи [214] также использовали в своем исследовании три хемометрических метода - РСА, ПЛС и ANN. С их помощью анализировали смеси, состоящие из парацетамола, пропифеназона, кофеина и тиамина. Для построения градуировок использовались спектры поглощения 22 модельных четырехкомпонентных смесей. Градуировки проверили как на искусственных смесях, так и на реальных фармацевтических препаратах. Спек-трофотометрическое определение глафенина, 2,3-дигидроксипропил-Ы-(7-хлор-4-хинолил) антранилата в лекарственных препаратах также основано на применении хемометрических алгоритмов: МЛР, РСА и ПЛС [215].

В статье [216] для одновременного определения цилазаприла и гидро-хлортиазида в таблетках применили четыре хемометрических метода, а именно классический МНК, инверсионный МНК, методы РСА и ПЛС. Описано применение модифицированного алгоритма ПЛС для определения карбоксигемоглобина в крови по спектрам поглощения в УФ и видимой областях. Исследования выполнены в рамках судебно-медицинской экспертизы [217]. Эти же хемометрические методы использованы в работе [218] для одновременного определения шести соединений: гидрохлорида ципрогептадина, сор-биновой кислоты и витаминов Вь В2,В3,В6. Методы РСА, МНК и ПЛС успешно использованы для количественного определения перечисленных соединений в их смеси по спектрам поглощения соответствующих веществ в диапазоне 250-290 нм. Все эти хемометрические методы дали сопоставимые результаты и были успешно применены для анализа реальных препаратов.