Стационарная оптическая и флуоресцентная спектроскопия биологических тканей желудка с патологией тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

004603773 На правах рукописи

Гираев Камал Магомедович

СТАЦИОНАРНАЯ ОПТИЧЕСКАЯ И ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ ЖЕЛУДКА

С ПАТОЛОГИЕЙ

Специальность 01.04.05 - оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 О Г'ШН ?01Г)

Ульяновск - 2010г.

004603773

Работа выполнена в ГОУ ВПО Дагестанский государственный университет на кафедре физической электроники и НИЛ физики плазмы и спектроскопии.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

Ашурбеков Назир Ашурбекович

Научный консультант: кандидат медицинских наук, доцент кафедры

патологической анатомии Расулов Магомед Тагибович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Горелик Владимир Семенович

кандидат физико-математических наук, доцент кафедры оптики Шапин Александр Сергеевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Оренбургский государственный

университет

Защита состоится « 17 » июня 2010 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.01 при Ульяновском государственном университете по адресу: Университетская набережная, д. 1, ауд. 309.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Ульяновского государственного университета, с авторефератом - на сайте вуза http://www.uni.ulsu.ru

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 432000, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, д. 42, Ульяновский государственный университет, Управление научных исследований.

Автореферат разослан « мая 2010 года

Ученый секретарь диссертационного Совета к. ф.-м. н.

Вострецова Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Возросший в последние годы интерес к различным методам лазерной спектроскопии биообъектов и их патологических состояний, в значительной мере связан со стремительным развитием лучевых методов медицины, а именно лазерной хирургии, терапии и диагностики. В частности, среди множества экспериментальных методов диагностики, к числу которых можно отнести все виды оптической томографии, широкое распространение получили методы, основанные на измерении спектрального распределения и интенсивности диффузных характеристик рассеянного назад света (см., например, [1-3]).

С точки зрения информативности, простоты реализации, отсутствия сложного оборудования и анализа полученных результатов не меньший интерес представляют методы стационарной оптической и флуоресцентной спектроскопии. Данный подход основан на последовательном измерении и комплексном анализе спектров диффузного отражения и лазерно-индуцированной флуоресценции, что позволяет проводить неинвазивные исследования живых систем совместно с лапороскопическими операциями и диагностическими процедурами [1-3]. Известны работы (см., например, [1-4]), в которых спектрально-флуоресцентные исследования использовались для обнаружения различных заболеваний кожи, внутренних органов, сосудов и, пр. Однако результаты подобных исследований часто являются неоднозначными, носят качественный характер и не позволяют достоверно дифференцировать степень и промежуточные стадии патологических процессов. К числу причин неоднозначности результатов могут быть отнесены низкий уровень квантового выхода флуоресценции и значительные искажения спектров, вносимые поглощением и объемным светорассеянием самой биоткани. Учесть факторы, искажающие спектры флуоресценции биосред и повысить информативность полученных результатов можно, рассматривая данные флуоресцентных исследований биообъектов в совокупности с их диффузно-оптическими характеристиками. Кроме того, знание оптических параметров биообъектов дает дополнительную информацию об анатомическом строении биоткани, а также их физиологических, морфологических и биохимических параметрах [13].

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным комплексное исследование излучательных характеристик патологических состояний биотканей как in vivo, так и in vitro с использованием методов стационарной оптической и флуоресцентной спектроскопии, в сочетании с светооптической и флуоресцентной микроскопией.

Целью настоящей работы является исследование спектральных характеристик, а также выявление механизмов и закономерностей формирования стационарных диффузно-оптических и спектрально-флуоресцентных свойств биотканей in vivo в зависимости от вида и степени патологического поражения.

В райках цели работы решались следующие задачи:

1. Проведение экспериментальных исследований спектров флуоресценции к(а) и диффузного отражения биотканей в норме и при различных формах и степени патологического процесса.

2. Проведение спектрофотометрических исследований коэффициентов полного пропускания, полного отражения и коллимированного пропускания биотканей в норме и с патологией в диапазоне длин волн 300-800 нм.

3. Исследование спектров оптических показателей поглощения - ца, рассеяния - ц, и фактора анизотропии - g в диапазоне длин волн 300-800 нм, а также некоторых физиологических и морфологических параметров, характеризующих степень функционального состояния исследуемых биотканей.

4. Исследование квантового выхода и степени искажения спектров аутофлуоресценции, а также проведение спектрального разложения данных флуоресцентных исследований для соответствующих биообъектов с целью количественного восстановления вкладов эндогенных флуорофоров в суммарные спектры свечения.

5. Выполнение гистоморфологических и микрофлуоресцентных исследований с целью изучения динамики структурной организации и пространственного распределения эндогенных флуорофоров в биотканях в процессе развития патологического поражения.

Научная новизна:

1. Характер изменений в экспериментальных спектрах флуоресценции и диффузного отражения биотканей обусловлен, как вкладами эндогенных флуорофоров, так и количественным содержанием в крови, степенью оксигенации и микроструктурой исследуемой среды. По мере развития патологии (от нормы до крайней степени поражения) происходит снижение интенсивности флуоресценции в 5-6 раз, а диффузного отражения до 3 раз во всем исследуемом спектральном интервале.

2. Механизмы и закономерности формирования спектров аутофлуоресценции исследуемых биотканей при различных формах патологического поражения во многом определяются уровнем эффектов их светорассеяния и оптического поглощения, приводящие, как к искажению формы спектрального контура, вследствие изменения вкладов эндогенных флуорофоров, так и к перераспределению интенсивности (до 13 раз) и глубины испускания (в 1.5 раза) спектров аутофлуоресценции.

3. Характер формирования спектральной зависимости аутофлуоресценции и квантового выхода идентичны. Типичное значение квантового выхода для нормальных биотканей составляет примерно 8.5 х 10"4 и уменьшается до 4 раз для высоких стадий поражения, а для крайней стадии — незначительно растет. Рост безызлучательной дезактивации флуоресценции происходит вследствие процессов тушения в патологически измененных биотканях.

4. Спектральный контур аутофлуоресценции исследуемых биотканей образован эмиссией семи групп флуорофоров, из которых основными являются молекулы МАО(Р)'Н, структурные белки, а также производные флавиновых и

порфириновых групп. По мере развития крайних форм поражения наблюдается снижение вклада флуоресценции флавинов и увеличение вклада NAD(P)-H, а также 4-х кратное возгорание коллагеновых и порфириновых групп в результирующем спектре аутофлуоресценции.

5. Оптические спектры поглощения рассеяния /л, и фактора

анизотропии g биотканей in vivo при исследуемых формах патологического поражения во многом определяются физиологическим и структурно-морфологическим состоянием последних. Относительно нормы по мере развития средней и высокой стадии поражения наблюдается уменьшение /г. до 3 раз, снижение кровенаполнения и кислородного насыщения, а так же увеличение плотности оптических неоднородностей до 45%. При развитии крайних форм поражения происходит увеличение до значений, близких к здоровым биотканям, а - приблизительно до 2 раз выше нормы, а также увеличение кровенаполнения и размеров рассеивателей, и уменьшение кислородного насыщения и плотности неоднородностей до 5 раз.

Практическая значимость работы:

1. Предложенный в работе научно-методический подход, основанный на комплексном анализе результатов спектрально-флуоресцентных и диффузно-оптических исследований, позволяет в широком интервале длин волн (300-800 нм) с заданной точностью определить спектры оптических показателей, аутофлуоресценцию и степень ее искажения, а также квантовый выход флуоресценции для биотканей in vivo. Полученные результаты могут быть использованы в качестве метода диагностики и мониторинга патологических состояний различных биообъектов в режиме реального времени.

2. Результаты комплексных исследований с использованием диффузно-оптической и флуоресцентной спектроскопии и микроскопии, позволяют существенно повысить качество и уровень диагностируемого процесса различных стадий развития патологических состояний биотканей.

3. Спектры оптических показателей поглощения, рассеяния и фактора анизотропии, рассчитанные с использованием предложенного в работе методического подхода, могут быть использованы в медицине в дозиметрических целях при планировании лазерно-терапевтических и диагностических процедур.

Положения, выносимые на защиту:

1. Особенности спектров флуоресценции биотканей желудка с патологией обусловлены как вкладами эндогенных флуорофоров, так и количественным содержанием крови, степенью оксигенации и микроструктурой исследуемых сред.

2. Спектральный контур аутофлуоресценции исследуемых биотканей образован эмиссией семи групп флуорофоров, из которых основными являются молекулы NAD(P) H, структурные белки, а также производные флавиновых и порфириновых групп. Формирование спектров аутофлуоресценции определяются уровнем эффектов их светорассеяния и оптического поглощения,

приводящих к искажению формы спектрального контура, вследствие изменения вкладов эндогенных флуорофоров.

3. Патологические изменения в биотканях приводят к росту безызлучательной дезактивации эмиссии аутофлуоресценции, что обусловливает снижение эффективности излучательных процессов.

4. По мере развития патологических процессов наблюдается снижение кровенаполнения и кислородного насыщения, а так же увеличение плотности оптических неоднородностей до 45%, что находит изменение в спектрах диффузного отражения и других оптических характеристиках исследуемых биообъектов.

5. Экспериментальная корреляционная зависимость между спектрально-флуоресцентными и диффузно-оптическими характеристиками биотканей in vivo и степенью их поражения, в том числе процессы малигнизации позволяет ускорить и упростить проведение инвазивных анализов на выявление патологических образований желудка.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на следующих конференциях: «Falk Symposium». Basel, 1999; Съезд МП Международная конференция студентов и аспирантов по фундамгнтальным наукам «Ломоносов-2001». Москва; VII Всероссийской конференции «ВНКСФ-7». С.Петербург, 2001; II Всероссийской конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, 2001; П, III, IV, V Всероссийские конференции «Физическая электроника». Махачкала; Второй Международный конгресс студентов, молодых ученных и специалистов «Молодежь и наука -третье тысячелетие»/У8ТМ'02. Москва; XI; Международная конференция «Фазовые переходы, критические и нелинейные явления и конденсированных средах». Махачкала, 2007.

Достоверность полученных результатов обеспечивалась применением различных независимых теоретических подходов, использованием апробированных экспериментальных методов исследования и современного аттестованного оборудования, а так же сопоставлением полученных результатов с результатами независимых клинических исследований и с известными литературными и справочными данными.

Личный вклад. Все экспериментальные результаты, их обработка и анализ выполнены лично автором. Обсуждение моделей наблюдаемых процессов проводилось совместно с научным руководителем, проф. Ашурбековым H.A. и консультантом Расуловым М.Т.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том числе в зарубежных журналах - 3 статьи и журналгх, рекомендованных ВАК — 4 статьи, в других журналах - 3 статьи; тезисов докладов в материалах конференций -12.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав и заключения. Общий объем диссертации 161 страниц (39 рисунков и 5 таблиц). Список цитируемой литературы содержит 138 наименований.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дано обоснование выбора темы диссертации, определены цель и задачи работы, сформулированы актуальность решаемых проблем и основные положения, выносимые на защиту, а также показана научная новизна полученных результатов.

Первая глава диссертации посвящена аналитическому обзору работ в области оптической и флуоресцентной спектроскопии и микроскопии биотканей. Дано обоснование выбора методов исследования. Показаны возможности их применения с целью проведения дифференцированной диагностики патологических состояний тканей внутренних органов.

Первый параграф обзора содержит литературные данные, посвященные спектрально-флуоресцентным исследованиям различных биотканей. Рассмотрены флуоресцентные свойства и приведены спектральные характеристики основных флуорофоров, участвующих в механизме образования флуоресценции нормальных и патологических биотканей. Отдельно рассмотрены факторы, оказывающие влияние на спектры аутофлуоресценции биотканей, а именно процессы рассеяния фотонов флуоресценции на центрах неоднородностей и их реабсорбции эндогенными хромофорами биотканей.

Во втором параграфе рассматриваются основные положения и методики теоретического описания распространения оптического излучения в биотканях, включающие решение прямой и обратной задачи для уравнения переноса излучения. Обсуждаются пределы применимости теоретических методик. Проведен критический анализ данных по экспериментальным исследованиям оптических свойств различных биотканей в норме и на различных стадиях патологического процесса.

В третьем параграфе обсуждаются принципы и практическое применение существующих методов и техники светооптической и флуоресцентной микроскопии, а также приводится краткое описание результатов современного исследования гистоморфологических и микрофлуоресцентных свойств различных биоструетур и клеток.

Во второй главе диссертации приведены сведения об объектах исследования и методике их приготовления, а также описаны экспериментальные установки и методики исследования оптических и флуоресцентных свойств биотканей.

Первый параграф главы посвящен описанию исследуемых материалов и методики их приготовления. Изучение спектрально-флуоресцентных и диффузно-оптических свойств биотканей в норме и в зависимости степени патологического процесса проводилось на биотканях различными случаями очаговых поражений (язвенные дефекты, полип, рак). При этом исследовались непосредственно сам очаг поражения или его край, участки переходной зоны, находящаяся на расстоянии 4-5 см от видимой границы очага и область, удаленная на расстояние 9-10 см от видимого края очага поражения. Гистоморфологические анализ образцов биотканей с этих участков показал, что

в 80% случаев язвенных дефектов и полипоза (далее - высокая стадия поражения) и в 20% злокачественных новообразований (крайняя стадия поражений) для переходной зоны характерны дефекты хронического атрофического гастрита (средняя стадия поражений). В тоже время для участков биотканей, максимально отстоящих от зоны поражения наблюдались различные поверхностные дефекты (поверхностный гастрит) и функциональные расстройства {норма). Таким образом, из общего числа объектов были отобраны 85 случаев хронического атрофического гастрита, 57 случаев язвенных дефектов, 16 случаев полипа и 83 случая раковой опухоли желудка. Контрольную группу составили 74 образца желудка с наименьшими морфологическими изменениями.

Общая для всех биообъектов схема проведеши эксперимента и получения материалов исследования заключалась в последовательной реализации следующих этапов. На первом этапе исследования проводились измерения спектров флуоресценции F(l) и диффузного отражения Rd{l) биотканей in vivo во время плановых операций, непосредственно перед их удалением. Далее с участков in vivo исследований производилось отсечение кусочков биотканей размером 1-1.5 см2. Сразу же после этого, полученный материал ополаскивали в 0.9% физиологическом растворе для удаления остатков крови и затем при помощи криостатного микротона получали гистологические срезы. Для гистоморфологических исследований использовались поперечные срезы толщиной 10 мкм, дам исследований по флуоресцентной микроскопии - 100 мкм, для спек::рофотометрических измерений коэффициентов пропускания и отражения - 0.5-S, мм.

Во втором параграфе главы содержится описание экспериментальной установки для проведения измерений по стационарной флуоримеггрии, рефлектометрии, спектрофотометрии интегрирующих сфер, а так же светооптической и флуоресцентной микроскопии.

Экспериментальная установка для спектрально-флуоресцентных исследований нормальных и патологических биотканей представляет собой автоматизированный лазерно-спектроскопический комплекс на базе монохроматора/спектрографа MS3504Í сопряженного с CCD-камерой HS-102H-2048/14 (Hamamatsu, Япония) и волоконно-оптической системой доставки и сбора фотосигналов с одинаковой геометрией возбуждения и регистрации сигналов флуоресценции и диффузного отражения. Возбуждение спектров F{x) осуществлялось с использованием азотного лазера марки ЛГИ-505 на длине волны 337.1 нм, а спектров Rd(l) при помощи ксеноновой лампы ДКсШ-150 в интервале 300-800 нм. Измерение спектральных коэффициентов полного пропускания Г,(я) и Д,(я) полного отражения биотканей проводилось по стандартной схеме с одной интегрирующей сферой Avasphere-100 (Avantes, Нидерланды).

Исследование гистоморфологических свойств биотканей проводилось с использованием комплекса аппаратно-программного определения морфометрических параметров биоматериалов «Мекос-Ц2» (ЗАО «Медицинские компьютерные системы», г. Москва). Для проведения

исследований по флуоресцентной микроскопии использовался отечественный люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И2 (ЛОМО; г. Санкт-Петербург) сопряженный с встроенной зеркальной CCD-камерой EOS 450D {Canon, Япония). Возбуждение флуоресценции осуществлялось на длине волны 365±10 нм при общем увеличении изображения до 250х. Анализ флуоресцентных снимков проводился при разложении их в формате RGB.

Третий параграф главы посвящен описанию методик обработки экспериментальных данных - определению спектров оптических показателей поглощения //„, рассеяния nt и фактора анизотропии g для исследуемых биотканей на основе результатов измерений коэффициентов Т,(х), R,(á) и Гс(а). В данной работе определение показателей ц, и g было выполнено на основе решения обратной задачи рассеяния в рамках 3-х потоковой модели переноса излучения [5,6]. В заключение главы приводятся основные источники систематических и случайных погрешностей, методики их устранения и анализ погрешности оптических измерений.

Третья глава посвящена описанию результатов экспериментальных исследований спектральных характеристик стационарных оптических, флуоресцентных и микроскопических свойств биотканей при различных стадиях патологического процесса.

Первый параграф главы посвящен исследованиям спектров лазерно-индуцированной флуоресценции и диффузного отражения нормальных и пораженных биотканей in vivo. Дан качественный анализ полученным результатам и на его основе выдвинут ряд предположений о формировании спектров флуоресценции и диффузного отражения, а так же происходящих в них изменениях по мере развития степени поражения.

Характерные спектры стационарной флуоресценции F(X) и диффузного отражения яДл), усредненные по сериям измерений и видам заболевания, для нормальных и патологически измененных биотканей показаны, соответственно, на рис. 1(a)- 1(d). Как показывает амплитудный анализ флуоресцентных данных, спектры f(ä) и Rd(x) для всех исследуемых патологических состояний характеризуются наличием общих свойств и закономерностей. Так, например, стационарная флуоресценция здоровых биотканей при возбуждении азотным лазером образует спектральный контур с максимумом вблизи 475±10 нм и тремя плечами в области длин волн 405±10, 550±10 и 610±10 нм. По мере развития патологических процессов происходит снижение интенсивности флуоресценции до 2 раз для средней стадии, в 3-4 раза для высоких стадий и в 5-6 раз при крайней стадии поражения, а так же сдвиг главного максимума в коротковолновую область спектра с изменяющимся вкладом спектральных компонент. В сравнении с этим, спектральный контур коэффициента диффузного отражения биотканей в норме характеризуется наличием локальных минимумов на длинах волн 350, 420, 550 и 580 нм, (полосы поглощения Сорэ и смеси окси- и деозксигемоглобина, а так же интенсивным длинноволновым крылом. При этом развитие патологии (от нормы до крайней

степени поражения) приводит к снижению коэффициента диффузного отражения до 3 раз вдоль всего спектрального интервала.

Во втором параграфе главы приводятся результаты расчетов спектрального распределения оптических показателей поглощения, рассеяния и фактора анизотропии для исследуемых биотканей in vitro. Выявлены закономерности и характерные особенности спектргльной зависимости оптических параметров от степени патологии. Обнаружено, что для всех исследуемых форм патологии с ростом длины волны наблюдается уменьшение показателя рассеяния до 2 раз и рост фактора анизотропии. В то же время, спектр показателя поглощения достигает максимума в области длин волн 300400 нм и монотонно снижается в сторону длинноволновой области спектра с минимумом на участке 700-750 нм, где интенсивность поглощения может быть до 100 раз меньше своего максимального значения. Кроме того, обнаружено, что зависимость оптических свойств биотканей от степени их патологического поражения имеет сложный и многообразный характер. Так, например, относительно нормы при хроническом атрофическом гастрите и язвенном дефекте (средняя и высокая форма поражения) на фоне общего незначительного роста показателей рассеяния и фактора анизотропии обнаружено уменьшение показателя поглощения до 3 ра::. В то же время, по мере развития полиповидных и злокачественных новообразований (высокая и крайняя стадия поражения) происходит увеличение ца до значений близких к здоровым биотканям, a ft, - приблизительно до 2 раз выше нормы.

В третьем параграфе главы приведены результаты гистоморфологических и микрофлуоресцентных исследований ткани слизистой оболочки в норме и при различных стадиях поражения. В частности, обнаружено, что относительно нормы развитие патологических процессов средней и высокой формы на фоне общего роста концгнтрации клеточных структур приводит к уменьшению их геометрических размеров в 1.5-2 раза и инфильтрации воспалительными клетками, еще меньшего размера, а так же активному разрастанию соединительной ткани, в виде спирально-скрученных коллагеновых волокон. Однако по мере развития крайних форм поражения происходит увеличение размеров клеток и клеточных ядер до 2 раз при снижении ядерно-цитоплазматического индекса в 1.5 раза, что полностью объясняет характер поведения спектральной зависимости оптических показателей биотканей при исследуемых формах патологии.Сопоставление результатов микрофлуориметрии и гистоморфологии показывают, что исследуемые биоткани могут рассматриваться как однослойные полубесконечные мутные среды, поскольку эпителий, покрывающий слизистую основу не вносит изменений в общую картину флуоресценции, а толщина биоткани при всех формах патологии достаточна, для того чтобы при дальнейших исследованиях не учитывать влияние эффектов отражения и преломления, возникающих на границе раздела более глубоких слоев.

Анализ спектрального rgb-разложения флуоресцентных изображений исследуемых биотканей, показал, что наибольшая концентрация эндогенных

флуорофоров - структурных белков (коллаген) и МАБ(Р)Н, а так же флавопротеидов и порфиринов, представленные, соответственно, «синей», «зеленой» и «красной» компонентами разложения наблюдается в толще биосред и вокруг желез на участках скопления атипичных клеток и фиброзной ткани. По мере развития патологических процессов наблюдается снижение индекса степени энергетического обмена до 2 раз и увеличение индекса накопления порфиринов до 4 раз относительно нормы, что свидетельствует об угнетении флуоресценции флавиновых групп и возгорании КАБ(Р)Н и группы производных порфиринов.

X, им X, нм

Рис. 1. Усредненные спектры флуоресценции диффузного отражения Д,(Хш), аутофлуоресценции А/{х„) и квантового выхода <р{х,т) для биотканей, (а) - норма, (Ь) - средняя стадия поражения, (с) - высокая стадия поражения, (<1) - крайняя стадия поражения. Спектры лДО и <р(Ат) нормированы к максимуму спектра флуоресценции

Четвертая глава диссертации посвящена анализу результатов экспериментального исследования оптических и флуоресцентных свойств нормальных и патологических биотканей.

Первый параграф главы посвящен анализу диффузно-оптических свойств исследуемых биотканей с использованием спе]ггральных данных коэффициентов диффузного отражения и оптических показателей для биотканей in vitro путем внесения поправок на оптические гвойства крови.

Анализ полученных результатов показывает, что наряду с общими характеристиками, спектрам оптических показателей исследуемых форм патологий присуще ярко выраженные индивидуальные особенности. Более наглядно эти различия заметны из таблицы №1. В частности, внесение поправок в спектры оптических показателей in vitro образцов биоткани показывает, что даже незначительное увеличение содержания крови в биотканях приводит к существенному росту показателя поглощения преимущественно, вблизи длин волн 350, 420, 545 и 580 им, что соответствует полосам фундаментального поглощения окси- и дезоксигемоглобина. В сравнении с этим, увеличение содержания крови в биотканях до 15% не оказывает значимого влияния на величину показателя тран спортного рассеяния ц'ХХ), а его спектральная зависимость представляет собой кривую, снисходящую с ростом длины волны и, по-видимому, полностью определяется, концентрацией и размерами оптических неоднородности. В то же время, исследование влияния патологических процессов на оптические свойства биотканей in vivo позволило определить физиологические и структурно-морфологические параметры. В частности, установлено, что по сравнению с нормальными биотканями, развитие средней и высокой стадии поражения приводит к снижению уровня кровенаполнения р и кислородного насыщения а до 15%, тогда как при крайних формах поражения (полиповидные и злокачественные новообразования) наблюдается увеличение параметра р и уменьшение а. Обнаружено и подтверждено ги(геоморфологическими исследованиями, что для нормальных биотканей усргдненная плотность рассеивающих центров составляет 3.3Х105, а их размер близок к рассеивателям Ми и по мере развития средней и высокой стадии поргжения наблюдается увеличение плотности рассеивателей, соответственно, на 20% и 45%, и незначительное уменьшение размеров рассеивающих часгиц. В то же время, развитие опухолевых дефектов приводит к увеличению размеров оптических неоднородностей и к уменьшению их концентрации в 1.6 раз для полипа и до 5 раз для аденокарциномы.

Таблица №1. Значения оптических показателей и параметров физиологических и структурно-морфологических свойств биотканей в норме и при различных патологических состояниях.

Я, нм А,, мм"1 , мм"1 g р'„ мм"1 Р,% а, % а Ь

Нормальная биоткань

300 1.78±0.29 31.5±2.3 0.77 7.15±0.36 8.2±0.4 87.5 3.29 1.85

400 2.1±0.3 29.5±2.2 0.79 5.82±0.36 ±2.0 *105

500 0.34±0.13 27.1±2.2 0.87 3.27±0.31

600 0.14±0.02 24.9±2.0 0.9 2.5±0.3

700 0.05±7е-3 23.3±2.0 0.92 1.87±0.21

800 0.065±7е-3 22.1±2.0 0.92 1.77±0.20

Средняя стадия поражения биоткани

300 1.58±0.27 31.9±2.8 0.8 6.4±0.3 7.6±0.3 81.3 ±3.0 4.1 *105 1.92

400 1.5±0.3 30.7±2.5 0.84 4.8±0.3

500 0.2±0.05 27.2±2.1 0.9 2.7±0.3

600 0.076±0.011 25.8±2.0 0.92 2.0±0.2

700 0.03±4е-3 24.0±2.0 0.94 1.5±0.1

800 0.035±4е-3 22.2±2.0 0.94 1.35±0.17

Высокая стадия поражения (язвенный де( рект)

300 1.32±0.31 33.7±3.0 0.82 6.1±0.3 6.5±0.4 72.4 ±4.0 4.82 хЮ5 1.96

400 1.22±0.25 32.8±3.0 0.85 4.9±0.3

500 0.17±0.02 30.9±3.0 0.91 2.75±0.31

600 0.05±7е-3 26.4±2.1 0.92 2.1±0.2

700 0.017±3е-3 25.2±2.1 0.94 1.5±0.1

800 0.021±3е-3 23.5±2.0 0.94 1.4±0.1

Высокая стадия поражения (полип)

300 1.58±0.29 39.3±3.2 0.85 5.9±0.3 8.0±0.5 82.0 ±3.0 1.97 хЮ5 1.81

400 1.6±0.3 38.9±3.3 0.89 4.5±0.3

500 0.22±0.03 36.5±3.0 0.93 2.56±0.3

600 0.1±0.02 32.8±3.0 0.94 1.95±0.22

700 0.042±5е-3 29.3±2.4 0.95 1.45±0.1

800 0.045±5е-3 28.6±2.0 0.96 1.2±0.1

Крайняя стадия поражения биоткани

300 1.8±0.3 44.6±3.3 0.88 5.35±0.34 9.1±0.3 77.9 ±5.0 6.28 хЮ4 1.66

400 1.95±0.32 43.3±3.3 0.91 3.9±0.3

500 0.26±0.04 41.7±3.1 0.95 2.1 ±0.2

600 0.15±0.025 37.9±3.0 0.95 1.7±0.2

700 0.06±7е-3 35.7±3.0 0.96 1.4±0.2

800 0.07±7е-3 33.5±2.9 0.97 1.0±0.1

Во втором параграфе главы приводится описание методики, используемой для выявления степени искажения измеренных спектров флуоресценции, а так же анализ результатов определения спектров аутофлуоресценции и квантового выхода для биотканей по мере развития патологических процессов. Согласно используемой методики [7,8], проведение спектральных измерений и в едином спектральном интервале

возбуждения к„ и эмиссии Л!т флуоресценции и при одинаковой геометрии возбуждения и регистрации фотосигналов позволило воспользоваться простой аналитической моделью для определения спектра аутофлуоресценции Л/(Лет) биоткани как:

где '/{Кт)=$/>(X,)/д, (Хш) - коэффициент пропорциональности, определяющий длину пробега рассеянных и не рассеянных фотонов, формирующих сигнал флуоресценции и диффузного отражения; Зл{я,т) и Зг(Яет) - средняя глубина проникновения для фотонов флуоресценции и диффузного отражения;

В тоже время, выражение для спектральной зависимости квантового выхода флуоресценции <р(л,т) биостред может быть рассчитано в рамках диффузионного приближения теории переноса излучения как [9]:

4 яВ(р+^е ,_4яС(А„)

' р,J+РЖУ г (2)

где F0 - интенсивность падающего света; ц, и - оптические показатели; А, В и С — общее и частное решение уравнения диффузионного приближения [10].

Характерные спектры аутофлуоресценции Af(Xtm) и квантового выхода <р{Ят) для нормальных и патологически измененных биотканей желудка показаны также, на рис. l(a)-l(d). В ходе проведенных исследований было обнаружено, что влияние оптических эффектов приводит, как к искажению формы, так и к перераспределению интенсивности флуоресценции в биотканях по мере развития патологических процессов. В частности, относительно спектров флуоресценции F(A„J спектральные контуры аутофлуоресценции А/(Лгт) и квантового выхода р{Я,х,Хш) всех исследуемых биотканей характеризуются наличием единственного максимума, сдвинутого в коротковолновую область примерно на 20 нм относительно главного максимума спектров F{Xtn), а так же отсутствием заметных впадин на длинах волн поглощения крови. Кроме того, показано, что для нормальных биотканей интенсивность F{xj) может до 13 раз превышать интенсивность А/(ХШ) и по мере развития крайних форм поражения наблюдается сокращение различия между F(¿,„) и 4/(4») До 4.6±0.2 раз. В результате наименьшая интенсивность Af(xtm) соответствует биотканям с язвенными дефектами, что до 2.6 раз ниже нормы, тогда как для биотканей при средней и крайней стадии поражения интенсивность А/(Л!т) заметно выше, что примерно н 1.68 раз меньше нормального значения. Развитие средней и высокой сгадии поражения в биотканях приводит к увеличению степени искажения ауте флуоресценции rj(x) и, как следствие, к росту глубины ее испускания 1Я(Л) до 1.5 раз, тогда как для крайней стадии наблюдается обратный эффект: уровень r¡(l) и /Да) спадает до значений близких к норме. Обнаруженная зависимость аутофлуоресценции от степени патологического процесса хорошо согласуется с результатами оптических исследований биотканей и подтверждается данными квантового выхода флуоресценции. При этом типичное значение ¡pQrm) для нормальных

биотканей составляет примерно 8.5* 10"4 и уменьшается до 4 раз для высоких стадий поражения, а для крайней стадии - несколько растет.

В третьем параграфе приводятся результаты по спектральному разложению измеренной и скорректированной флуоресценции на вклады потенциальных групп флуорофоров для нормальных и патологических биотканей и дается анализ полученных результатов. Для проведения количественного анализа и получения информации о влиянии эффектов светорассеяния и поглощения на вклады эндогенных флуорофоров было проведено контурное разложение спектров и А/(Яш) методом

Гауссовых-Лоренцевых кривых, заключающимся в итерационном моделировании теоретической кривой Fg,(x) по среднеквадратичному ее отклонению от спектров f(;lm) и Л/СО как: ~

^Дя)=^{я)+(1-г)^(я) (3)

где Fs,(x) - фактор Гаусса-Лоренца, характеризующий относительный вклад в форму линий Гауссовой (Fn для r=1) и Лоренцевой (Fg, для г= 0) составляющих. Качество сходимости кривых определялось методом наименьших квадратов и проверялось по величине подгонки с погрешностью не более 5%.

. В ходе проведения анализа, установлено наличие как минимум 7 групп эндогенных флуорофоров с изменяющимися вкладами в суммарные спектры свечения, из которых наибольший интерес вызывают группы спектрального разложения, соответствующие свечению NAD(P)H и производные флавинов (FAD и FMN), поскольку они функционируют как коферменты дегидрогеназ в окислительно-восстановительных реакциях, выступая акцептором электронов субстрата. Так, например, восстанавливаясь, хромофор NAD(P) накапливает положительно заряженные ионы водорода и приобретает яркую флуоресценцию с небольшим сдвигом в коротковолновую область спектра, одновременно катализируя восстановление флавинового кофермента своей восстановленной формой [1,11]. В силу этого, любые изменения в клеточном метаболизме биотканей могут быть выявлены в динамике соотношений спектральных компонентов этих веществ. Основываясь на методе количественной оценки степени дыхательной активности митохондрий [10], в работе рассматривалось отношение площадей под кривыми 5 - 53!25а и 4 -групп как отношение интенсивности флуоресценции флавинов - Fи NAD(P)'H - FmD(nH для каждого патологического состояния:

•S5 F

у, = s"" =—. По антологии с этим, в работе были введены индексы,

■^460/1 ^"илщеун

характеризующие степень фиброзной активности - кг и накопления порфиринов - къ определяемые нормировкой интенсивности свечения коллагеновой и порфириновой группы к интенсивности флуоресценции

КАО(Р)'Н как отношение площадей под кривыми 2, 7 и 4 группы: С2 р с7 /г

_ °«ОД _ соНа^сп 1Г „ _ "610С _ грогрЫгЫ

К ^ ' ^ — """ 1 и ^ —■ ^ — .

Динамика индексов «г,, кг, к, определенных из результатов разложения спектров флуоресценции р(Ягт) и аутофлуоресценции А/(у.,т) по мере развития процессов малигнизации в исследуемых биотканей приведены в таблице №2. Как видно из таблицы, по мере воздействия патологического поражения происходит снижение вклада флуоресценции флавинов и увеличение вклада ЫАО(Р) Н в суммарный спектр свечения, что свидетельствует об угнетении клеточного дыхания и развитии процесса истощения терм анального окисления [10]. Вместе с этим, для крайних форм поражения наблюдается 4-х кратное возгорание спектральных групп, соответствующих коллагену и производным эндогенных порфиринов. В то же время вследствие наложения полос поглощения крови и эндогенных хромофоров, а так же высокого уровня объемного светорассеяния вклады спектральных компонентов, соответствующих флуоресценции коллагена и эластина могут быть ослаблены до 3 раз, а роль флавиновых и порфириновых групп завышена, соответственно, в 1.5 и 3 раза. Однако общая динамика соотношений :>тих флуорофоров в зависимости от стадии поражения биотканей, как для так и для А/(Хт)

остается неизменной.

Таблица №2. Индексы степени энергетического обмена, фиброзной активности, накопления порфиринов для биотканей при исследуемы;: формах патологии. Данные, помеченные значком * - соответствуют результатам разложения спектров аутофлуоресценции А/(Яет).

Стадии поражения /с,, /С,* * * *3.

Норма 0.6±0.06 0.4±0.04* 0.1±0.01 0.19±0.02* 0.16±0.03 0.08±0.01*

Средняя стадия 0.53±0.06 0.35±0.04* 0.14±0.02 0.26±0.03* 0.22±0.03* 0.1±0.01*

Высокая стадия (язвенный дефект) 0.45±0.05 0.32±0.03* 0.15±0.02 0.32±0.04* 0.25±0.03* 0.12±0.02*

Высокая стадия (полип) 0.4±0.04 0.27±0.03* 0.1Ш.02 0.29±0.02* 0.24±0.02 0.12±0.01*

Крайняя стадия 0.48±0.05 0.33±0.03* 0.08±0.01 0.3±0.03* 0.31±0.02 0.16±0.05*

В заключении приводятся основные результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разработана экспериментальная установка и методики комплексного исследования спектрально-флуоресцентных и диффузно-оптических свойств биотканей в норме и при различных формах патологического процесса на

основе спектров лазерно-индуцированной флуоресценции, диффузного отражения, оптических показателей поглощения, рассеяния и фактора анизотропии, а так же данных светооптической и флуоресцентной микроскопии.

2. Экспериментально обнаружена корреляционная зависимость между спектрально-флуоресцентными и диффузно-оптическими характеристиками биотканей in vivo и степенью их поражения, включая процессы малигнизации. Показано, что по мере развития патологических процессов происходит снижение интенсивности флуоресценции до 2 раз для средней стадии, в 3-4 раза для высоких стадий и в 5-6 раз при крайней стадии поражения.

3. Определены механизмы и закономерности формирования спектров аутофлуоресценции биотканей в процессе развития патологического поражения и установлено, что влияние эффектов множественного светорассеяния и оптического поглощения приводит, как к искажению формы, так и к перераспределению интенсивности аутофлуоресценции. В частности, развитие средней и высокой стадии поражения сопровождается увеличением степени искажения аутофлуоресценции т](х) и, как следствие, ростом глубины ее испускания /Дя) до 1.5 раз, тогда как для крайней стадии наблюдается обратный эффект: уровень ц{х) и 1л{х) спадает до значений близких к норме. В результате интенсивность флуоресценции может до 13 раз превышать интенсивность аутофлуоресценции.

4. Обнаружено, что спектральные распределения аутофлуоресценции и квантового выхода для исследуемых биотканей совпадают с заданной точностью и характеризуются наличием единственного максимума, сдвинутого в коротковолновую область примерно на 20 нм относительно главного максимума спектров флуоресценции. При этом типичное значение кантового выхода для нормальных биотканей составляет примерно 8.5x10"" и уменьшается до 4 раз для высоких стадий поражения, а для крайней стадии -незначительно растет, что достоверно указывает на рост безизлучательной дезактивации флуоресценции вследствие процессов тушения и миграции энергии в патологически измененных биотканях.

5. На основе систематических исследований установлено, что суммарные спектры флуоресценции и аутофлуоресценции определяются, как минимум, излучением 7 групп флуорофоров, из которых основной вклад в суммарные спектры вносят группы NAD(P)H, структурных белков, а так же производные флавинов и эндогенных порфиринов. Показано, что по мере развития крайних форм поражения наблюдается снижение вклада флуоресценции флавинов и увеличение вклада NAD(P)H, а также 4-х кратное возгорание коллагеновых и порфириновых групп в результирующем спектре аутофлуоресценции.

6. При помощи решения обратной задачи уравнения переноса излучения определены спектры оптических показателей поглощения, рассеяния и фактора анизотропии для биотканей при исследуемых формах патологического поражения. Обнаружено, что по сравнению с нормой для средней и высокой стадии поражения наблюдается уменьшение показателя поглощения до 3 раз,

тогда как развитие крайних форм поражения сопровождается увеличением до значений, близких к здоровым биотканям, а цг - приблизительно до 2 раз выше нормы.

7. Выполнен сравнительный анализ спектральной зависимости оптических свойств биотканей и результатов гистоморфологических исследований, что позволило достоверно определить динамику физиологических и структурно-морфологических параметров биотканей в зависимости от степени патологического состояния. В частности:

□ Установлено, что относительно нормы развитие средней и высокой стадии поражения приводит к снижению уровня кровенаполнения р и кислородного насыщения а биотканей, тогда как при крайних формах поражения наблюдается увеличение параметра р и уменьшение а.

□ Обнаружено, что для нормальных биотканей плотность рассеивающих центров составляет З.ЗхЮ5, а их усредненный размер близок к рассеивателям Ми. При этом развития средней и высокой стадии поражения приводит к увеличению плотности рассеивателей, соответственно, на 20% и 45%., тогда как для крайней стадии поражения наблюдается увеличение размеров оптических неоднородностей и уменьшение их концентрации в 1.6 и 5 раз, соответственно, для полипа и злокачественных новообразований.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

Статьи, опубликованные в журналах, включенных в Перечень ВАК:

1. Гираев K.M., Ашурбеков H.A., Меджидов Р.Т. Стационарная спектроскопия биотканей in vivo: флуоресцентные исследования некоторых патологических состояний// Оптика и спектроскопия. 2003. Т.95. №5 С.874-879.

2. Гираев K.M., Ашурбеков H.A., Кобзев О.В. Оптические исследования биотканей: определение коэффициентов поглощения и рассеяния// Письма в ЖТФ. 2003. Т.29, №12 С. 48-54.

3. Гираев K.M., Ашурбеков H.A. и др. Влияние многократного рассеяния на спектры аутофлуоресценции и квантовый выход патологических состояний живых объектов// Известие вузов. Сев.-Кав. регион. Естественные науки. 2007. № 3. С. 33-37.

4. Гираев K.M., Ашурбеков H.A., Меджидов Р.Т. и др. Исследование влияния патологических процессов на диффузно-оптические свойства биообъектов// Известие вузов. Сев.-Кав. регион. Естественные науки. 2007. № 4. С. 26-29.

Статьи, опубликованные в зарубежных журналах:

1. Ashurbekov N.A., Giraev K.M., Medjidov R.T. The Device for Luminescent Laparoscopy// Endoscopic Surgery. 1999. V. 58, P. 258-259.

2. Giraev K.M., Ashurbekov N.A., Medjidov R.T. Fluorescent-spectroscopic research of in vivo tissues' pathological conditions// Int. J. Modem Phys. B. 2004. V.18.P. 899-910.

3. Giraev K.M., Ashurbekov N.A., Kobsev O.V. Optical spectra of some pathological conditions of stomach tissues// Int. J. Modem Phys. B. 2006. V. 20. P. 25-36.

Другие публикации:

1. Гираев K.M., Ашурбеков H.А., Меджидов Р.Т. Исследование влияния патологических процессов на структурные и физиологические свойства ткани печени методом флуоресцентной микроскопии// Вестник ДГУ. Естественные науки. 2007. №3. С. 8-14.

2. Гираев К.М., Ашурбеков Н.А., Турциев Р.Г. Спектрально-флуоресцентные исследования биотканей с эрозивными поражениями// Вестник ДГУ. Естественные науки. 2007. №4. С. 15-20.

3. Гираев К.М. Флуоресцентная микроскопия как метод изучения аутофлуоресценции микроструктур биоткани// Вестник ДГУ. Естественно-технические науки. Выпуск 1.2001. С.25-29.

4. Giraev К.М., Medjidov R.T., Ashurbekov N.A. The Luminescent Laparascopy in Hepatology. International Endoscopy of Hepatology// Falk Symposium №116. Basel. -1999. P.29-32.

5. Гираев К.М, Ашурбеков H.A. Аутофлуоресцентная спектроскопия воспалений стенок желчного пузыря// Материалы П Всероссийской конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». М. 2001. С.195-196.

6. Гираев К.М. Влияние воспалительного процесса на лазерно-индуцированную флуоресценцию ткани печени// Материалы ВНКСФ-7. С.Петербург. 2001. С.107-109.

7. Гираев К.М., Ашурбеков Н.А., Омаров О.А. Флуоресцентная спектроскопия тканей толстого кишечника: количественный анализ и диагностика// Труды Международного форума по проблемам науки, техники и образования. М. 2002. Т.З С.114-118.

8. Гираев К.М., Ашурбеков Н.А., Кобзев О.В. Определение оптических показателей случайно-неоднородных сред. // Материалы П1 всероссийской конференции «Физическая электроника». Махачкала. - 2003. С. 124-130.

9. Гираев КМ., Ашурбеков Н.А., Омаров О.А. Диффузионно-оптические исследования и количественный анализ патологических состояний биообъектов// Материалы IV Всероссийской конференции «ФЭ-2006». Махачкала-2006. С. 122-127.

10. Гираев К.М., Ашурбеков Н.А., Омаров О.А. Исследование квантового выхода и истинных спектров флуоресценции патологических состояний живых объектов// Материалы IV Всероссийской конференции «ФЭ-2006». Махачкала -2006. С. 128-133.

11. Гираев К.М., Ашурбеков Н.А., Омаров О.А. Изучение патологических состояний биообъектов методом стационарной флуоресцентной спектроскопии//

Международная конференция «Фазовые переходы, критические и нелинейные явления в конденсированных средах». Махачкала - 2007. С. 277-280.

12. Гираев K.M., Ашурбеков H.A., Омаров O.A., Исследование влияния процессов малигнизации на оптические и физиологические параметры биообъектов//Международная конференция «Фазовые переходы, критические и нелинейные явления в конденсированных средах». Махачкала - 2007. С. 281284.

13. Гираев K.M., Ашурбеков H.A., Абуев Э.А. Спектрально-флуоресцентные исследования биотканей с предопухолевыми патологическими дефектами// Материалы V Всероссийской конференции «ФЭ-2008». Мгтачкала - 2008. С. 196-202.

14. Гираев K.M., Ашурбеков H.A., Абуев Э.А. Исследование термокоагуляционного воздействия на спектральные и структурные параметры нормальных и опухолевых биотканей методом флуоресцентной микроскопии//. Материалы V Всероссийской конференции «ФЭ-2008». Махачкала - 2008. С. 203-208.

15. Гираев K.M., Ашурбеков H.A., Расулов М.Т. и др. Гистоморфологические исследования структурной термомодификации нормальных и опухолевых биотканей методом светооптической микроскопии// Материалы V Всероссийской конференции «ФЭ-2008». Махачкала - 2008. С. 209-214.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Оптическая биомедицинская диагностика. В 2 том. / Пер. с англ. Под ред. В.В. Тучина. -М.: ФИЗМАТЛИТ, 2007.

2. В.В. Тучин Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. 1998.348 с.

3. В.А. Лисовский, В.В. Щедрунов, И .Я. Барский. Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии. Л.: Наука, 1984. 236 с.

4. N. Ramanujam. Fluorescence Spectroscopy In Vivo. Encyclopedia of Analytical Chemistry. R.A. Meyers (Ed.) John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2000. P. 20-56.

5. Van Gemert M.J.C., Schets G.A.C., Bishop M.S. et al// Laser Life Sei. 1988. V.l. P.l-18.

6. Burger Т., Kuhn J., Caps R. et. al// Appl. Spectrosc. 1997. V.51. P.309-317.

7. D.C.G. de Veld, M. Skurichina, M.J.H. Witjes et. al// Lfisers in Surgeiy and Medicine 2005. V.36, P.356-364.

8. S.K. Chang, D. Arifler, R. Drezek et.al// JBO. 2004. V.9, PP. 511-522

9. А. Исимару. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных средах. М.: Мир, 1981.-280 с.

10. В. Н. Карнаухов.// Цитология. 1976, Т.18, С. 408-412.

11. А. Ленинджер. Биохимия. М.: МИР, 1976. - 958 с.

Формат 60x84.1/16. Печать ризографная. Бумага № 1. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. -1,2 изд. печ. л. -1,2. Заказ - 721 - 03. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Деловой мир» Махачкала, ул. Коркмасова, 35а

ВВЕДЕНИЕ.

1. ГЛАВА ПЕРВАЯ. СТАЦИОНАРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БИОСИСТЕМ

- ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ.

1.1. СПЕКТРАЛЬНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БИООБЪЕКТОВ.

1.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОПТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОСРЕД.

1.3. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

БИОСИСТЕМ.

2. ГЛАВА ВТОРАЯ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКА ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЯ.

2.2. МЕТОДИКА И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.

2.2.1. МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЯ СПЕКТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И ДИФФУЗНОГО ОТРАЖЕНИЯ.

2.2.2. МЕТОДИКА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИХИЗМЕРЕНИЙ БИОТКАНЕЙ.

2.2.3. МЕТОДИКА И ТЕХНИКА МИКРОСКОПИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.3. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ БИОКТАНЕЙ.

2.4. АНАЛИЗ ПОГРЕШНОТИИЗМЕРЕНИЙ.

3. ГЛАВА ТРЕТЬЯ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ ОПТИЧЕСКИХ И 64 ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ СВОЙСТВ БИООБЪЕКТОВ.

3.1. СТАЦИОНАРНЫЕ СПЕКТРЫ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И

ДИФФУЗНОГО ОТРАЖЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ БИОТКАНЕЙ.

3.2. ОПТИЧЕСКИЕ СПЕКТРЫ ПА ТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ БИОТКАНЕЙ.

3.3. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ БИОТКАНЕЙ.

ВЫВОДЫ.

ГЛАВА ЧЕТВЕРТАЯ. АНАЛИЗ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. ВЛИЯНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НАДИФФУЗНО-ОПТИЧЕКИЕ СВОЙСТВА БИООБЪЕКТОВ.

4.2. ВЛИЯНИЕ ОПТИЧЕСКОГО ПОГЛОЩЕНИЯ И

СВЕТОРАССЕЯНИЯ НА ФОРМИРОВАНИЕ СПЕКТРОВ ЛАЗЕРНО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БИООБЪЕКТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКХ СОСТОЯНИЯХ.

4.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕКТРОВ АУТОФЛУОРЕСЦЕНЦИИИ КВАНТОВОГО ВЫХОДА БИОТКАНЕЙ.

4.2.2. КОНТУРНЫЙ АНАЛИЗ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ СПЕКТРОВ БИОТКАНЕЙ.

ВЫВОДЫ.

Актуальность работы:

Высокий интерес, вызванный в последнее время к различным методам лазерной спектроскопии биообъектов и их патологических состояний, в значительной мере связан со стремительным развитием лучевых методов медицины, а именно лазерной хирургии, терапии и диагностики. В частности, среди множества экспериментальных методов диагностики, к числу которых можно отнести все виды оптической томографии, широкое распространение получили методы время-разрешенной, частотно-модулированной и оптико-акустической спектроскопии, основанные на измерении спектрального распределения и интенсивности диффузных характеристик рассеянного назад света (см., например, [1-3]).

С точки зрения информативности, простоты реализации, отсутствия сложного оборудования и анализа полученных результатов не меньший интерес представляют методы стационарной оптической и флуоресцентной спектроскопии. Данный подход основан на последовательном измерении и комплексном анализе спектров диффузного отражения и лазерно-индуцированной флуоресценции, что позволяет проводить неинвазивные исследования живых систем совместно с лапороскопическими операциями и диагностическими процедурами [1-5]. Известны работы (см., например, [532]) в которых спектрально-флуоресцентные исследования использовались для обнаружения различных заболеваний, включая малигнизированные поражения кожных покровов, внутренних органов, сосудов и пр. Однако результаты подобных исследований часто являются неоднозначными, носят качественный характер и не позволяют достоверно дифференцировать степень и промежуточные стадии патологических процессов. К числу причин могут быть отнесены относительная специфичность результатов исследования, низкий уровень квантового выхода флуоресценции и ч значительные искажения спектров, вносимые оптическим поглощением и объемным светорассеянием самой биоткани, вследствие сложной своей структурной организации.

Учесть факторы, оказывающие негативное влияние на механизм образования спектров флуоресценции биосред и повысить информативность полученных результатов можно, рассматривая данные флуоресцентных исследований биообъектов в совокупности с их диффузно-оптическими характеристиками. Кроме того, сочетание результатов диффузной рефлектометрии биотканей in vivo и спектрофотомерии для биотканей in vitro позволяет наиболее полно оценить вероятность поглощения и анизотропию рассеяния, что является необходимой информацией при адекватном описании распространения лазерного излучения в биосредах. В дополнении к этому, знание оптических параметров биотканей само по себе несет важнейшую информацию об анатомическом строении биоткани, а так же их физиологических, морфологических и биохимических параметрах и является ключевым моментом в решении научно-исследовательских проблем, как фундаментального, так и прикладного характера [1-3]. В связи с вышеизложенным, представляется актуальным проведение комплексных исследований излучательных характеристик биотканей как in vivo, так и in vitro при различных патологических состояниях с использованием методов стационарной оптической и флуоресцентной спектроскопии, в сочетании со светооптической и флуоресцентной микроскопией.

Целью настоящей работы является исследование спектральных характеристик, а также установление механизмов и закономерности формирования стационарных диффузно-оптических и спектрально-флуоресцентных свойств биотканей in vivo в зависимости от вида и степени патологического поражения.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Проведение экспериментальных исследований спектральной зависимости стационарной лазерно-индуцированной флуоресценции f(X) и диффузного отражения r(a) для биотканей в норме и при различных формах и степени патологического поражения, включая злокачественные новообразования.

2. Проведение спектрофотометрических исследований коэффициентов полного пропускания, полного отражения и коллимированного пропускания для нормальных и патологически измененных биотканей в диапазоне длин волн 300-800 нм.

3. Определение оптических свойств и сбор статистического материала по спектрам оптических показателей поглощения — jua, рассеяния - jus и фактора анизотропии — g в диапазоне длин волн 300-800 нм, а так же некоторых физиологических и структурно-морфологических параметров, характеризующих степень функционального состояния биотканей по мере развития патологических процессов.

4. Определение спектральной зависимости квантового выхода ^(я), факторов и степени искажения спектров аутофлуоресценции Af(X), а так же проведение спектрального разложения данных флуоресцентных исследований для соответствующих биообъектов с целью количественного восстановления вкладов эндогенных флуорофоров в результирующие спектры свечения.

5. Выполнение гистоморф о логических и микрофлуоресцентных исследований с целью верификации диагноза и изучения динамики структурной организации и пространственного распределения эндогенных флуорофоров в биотканях по мере развития патологических процессов.

Научная новизна:

1. Характер изменений в экспериментальных спектрах флуоресценции и диффузного отражения биотканей обусловлен, как вкладами эндогенных флуорофоров, так и количественным содержанием в крови, степенью оксигенации и микроструктурой исследуемой среды. По мере развития патологии (от нормы до крайней степени поражения) происходит снижение интенсивности флуоресценции в 5-6 раз, а диффузного отражения до 3 раз во всем исследуемом спектральном интервале.

2. Механизмы и закономерности формирования спектров аутофлуоресценции исследуемых биотканей при различных формах патологического поражения во многом определяются уровнем эффектов их светорассеяния и оптического поглощения, приводящие, как к искажению формы спектрального контура, вследствие изменения вкладов эндогенных флуорофоров, так и к перераспределению интенсивности (до 13 раз) и глубины испускания (в 1.5 раза) спектров аутофлуоресценции.

3. Характер формирования спектральной зависимости аутофлуоресценции и квантового выхода идентичны. Типичное значение квантового выхода для нормальных биотканей составляет примерно 8.5х10"4 и уменьшается до 4 раз для высоких стадий поражения, а для крайней стадии - незначительно растет. Рост безызлучательной дезактивации флуоресценции происходит вследствие процессов тушения в патологически измененных биотканях.

4. Спектральный контур аутофлуоресценции исследуемых биотканей образован эмиссией семи групп флуорофоров, из которых основными являются молекулы NAD(P)'H, структурные белки, а также производные флавиновых и порфириновых групп. По мере развития крайних форм поражения наблюдается снижение вклада флуоресценции флавинов и увеличение вклада NAD(P)"H, а также 4-х кратное возгорание коллагеновых и порфириновых групп в результирующем спектре аутофлуоресценции.

5. Оптические спектры поглощения /ла, рассеяния jus и фактора анизотропии g биотканей in vivo при исследуемых формах патологического поражения во многом определяются физиологическим и структурно-морфологическим состоянием последних. Относительно нормы по мере развития средней и высокой стадии поражения наблюдается уменьшение ц до 3 раз, снижение кровенаполнения и кислородного насыщения, а так же увеличение плотности оптических неоднородностей до 45%. При развитии крайних форм поражения происходит увеличение /иа до значений, близких к здоровым биотканям, a /us — приблизительно до 2 раз выше нормы, а также увеличение кровенаполнения и размеров рассеивателей, и уменьшение кислородного насыщения и плотности неоднородности до 5 раз.

Практическая значимость работы:

1. Предложенный в работе научно-методический подход, основанный комплексном анализе результатов спектрально-флуоресцентных и диффузно-оптических исследований позволяет в широком интервале длин волн (300800 нм) с заданной точностью определить спектры оптических показателей, аутофлуоресценцию и степень ее искажения, а так же квантовый выход флуоресценции для биотканей in vivo и может с успехом использоваться в качестве метода диагностики и мониторинга патологических состояний различных биообъектов в режиме реального времени.

2. Результаты, полученные в ходе комплексных исследований с использованием диффузно-оптической и флуоресцентной спектроскопии и микроскопии, позволяют существенно повысить качество и уровень диагностируемого процесса различных стадий развития патологических состояний биотканей.

3. Спектры оптических показателей поглощения, рассеяния и фактора анизотропии, рассчитанные с использованием предложенного в работе методического подхода, могут быть с успехом использованы в дозиметрии при планировании гастродуоденальных лазерно-терапевтических и диагностических процедур различных заболеваний, включая процессы эрозивных дефектов и малигнизации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Особенности спектров флуоресценции биотканей желудка с патологией обусловлены как вкладами эндогенных флуорофоров, так и количественным содержанием крови, степенью оксигенации и микроструктурой исследуемых сред.

2. Спектральный контур аутофлуоресценции исследуемых биотканей образован эмиссией семи групп флуорофоров, из которых основными являются молекулы NAD(P)'H, структурные белки, а также производные флавиновых и порфириновых групп. Формирование спектров аутофлуоресценции биообъектов определяются уровнем эффектов их светорассеяния и оптического поглощения, приводящих к искажению формы спектрального контура, вследствие изменения вкладов эндогенных флуорофоров.

3. Патологические изменения в биотканях приводят к росту безызлучательной дезактивации эмиссии аутофлуоресценции, что обусловливает снижение эффективности излучательных процессов.

4. По мере развития патологических процессов наблюдается снижение кровенаполнения и кислородного насыщения, а так же увеличение плотности оптических неоднородностей до 45%, что находит изменение в спектрах диффузного отражения и других оптических характеристиках исследуемых биообъектов.

5. Экспериментальная корреляционная зависимость между спектрально-флуоресцентными и диффузно-оптическими характеристиками биотканей in vivo и степенью их поражения, процессы малигнизации позволяет ускорить и упростить проведение инвазивных анализов по выявлению патологических образований желудка.

Апробация работы:

Результаты работы докладывались на следующих конференциях: «Falk Symposium». Basel, 1999; Съезд VIII Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001». Москва; VII Всероссийской конференции «ВНКСФ-7». С.-Петербург, 2001; II Всероссийской конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, 2001; II, III, IV, V Всероссийские конференции «Физическая электроника». Махачкала; Второй Международный конгресс студентов, молодых ученных и специалистов «Молодежь и наука - третье тысячелетие»^ STM' 02. Москва; XI; Международная конференция «Фазовые переходы, критические и нелинейные явления в конденсированных средах». Махачкала, 2007.

Достоверность полученных результатов обеспечивалась применением различных независимых теоретических подходов, использованием аттестационных экспериментальных методов исследования и современного апробированного оборудования, а так же сопоставлением полученных результатов с результатами независимых клинических исследований и с известными литературными и справочными данными.

Личный вклад. Все экспериментальные результаты, их обработка и анализ выполнены лично автором. Обсуждение моделей наблюдаемых процессов проводилось совместно с научным руководителем, проф. Ашурбековым Н.А. и консультантом Расуловым М.Т.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том числе в зарубежных журналах - 3 статьи и журналах, рекомендованных ВАК - 4 статьи. В других журналах — 3 статьи и тезисов докладов в материалах конференций - 12. и

Структура и объем диссертационной работы:

Диссертация состоит из введения, 4 глав и заключения. Общий объем диссертации 161 страниц (39 рисунков и 5 таблиц). Список цитируемой литературы содержит 138 наименований.

ВЫВОДЫ

Систематизация сведений, полученных при анализа и обсуждения экспериментальных исследований диффузно-оптических и спектрально-флуоресцентных свойств биотканей в норме и при различных формах патологического поражения, позволила выделить ряд ключевых результатов, из которых наиболее важными являются:

1. Исследование влияния патологических процессов на оптические свойства биотканей in vivo при помощи методики, основанной на совместном анализе спектральных данных коэффициента диффузного отражения и оптических показателей для биотканей in vitro, позволило определить физиологические и структурно-морфологические параметры. В частности:

• По сравнению с нормальными биотканями, развитие средней и высокой стадии поражения приводит к снижению уровня кровенаполнения р и кислородного насыщения а до 15%, тогда как при крайних формах поражения (полиповидные и злокачественные новообразования) наблюдается увеличение параметра р и уменьшение а — на 10%.

• Обнаружено и подтверждено гистоморфологическими исследованиями, что для нормальных биотканей усредненная плотность рассеивающих центров составляет 3.3x105, а их размер близок к рассеивателям Ми и по мере развития средней и высокой стадии поражения наблюдается увеличение плотности рассеивателей, соответственно, на 20% и 45%, и незначительное уменьшение размеров рассеивающих частиц. В то же время, развитие опухолевых дефектов приводит к увеличению размеров оптических неоднородностей на 10% и к уменьшению их концентрации в 1.6 раз для полипа и до 5 раз для аденокарциномы.

2. Использование предложенного в работе научно-методического подхода позволило оценить степень искажения спектров аутофлуоресценции и установить, что влияние оптических эффектов приводит, как к искажению формы, так и к перераспределению интенсивности флуоресценции в биотканях по мере развития патологических процессов. В частности:

• Относительно спектров флуоресценции F(Acm) спектральные контуры аутофлуоресценции А/(Лет) и квантового выхода (р{Лсх,Лст) всех исследуемых биотканей характеризуются наличием единственного максимума, сдвинутого в коротковолновую область примерно на 20 нм относительно главного максимума спектров F{Xem), а так же отсутствием заметных впадин на длинах волн поглощения крови.

• Для нормальных биотканей интенсивность F{Aem) может до 13 раз превышать интенсивность А/(Лет) и по мере развития крайних форм поражения наблюдается сокращение различия между F{Aem) и А/(Лст) до 4.6±0.2 раз. В результате наименьшая интенсивность А/(лет) соответствует биотканям с язвенными дефектами, что до 2.6 раз ниже нормы, тогда как для биотканей при средней и крайней стадии поражения интенсивность А/(Лет) заметно выше, что примерно в 1.68 раз меньше нормального значения.

• Развитие средней и высокой стадии поражения в биотканях приводит к увеличению степени искажения аутофлуоресценции т](л) и, как следствие, к росту глубины ее испускания /Дя) до 1.5 раз, тогда как для крайней стадии наблюдается обратный эффект: уровень г)(Х) и Ijj(a) спадает до значений близких к норме.

• Обнаруженная зависимость аутофлуоресценции от степени патологического процесса хорошо согласуется с результатами оптических исследований биотканей и подтверждается данными квантового выхода флуоресценции. При этом типичное значение <р(Лет) для нормальных биотканей составляет примерно 8.5x10"4 и уменьшается до 4 раз для высоких стадий поражения, а для крайней стадии - несколько растет.

3. В результате проведения контурного анализа спектров F(Xem) и А/(Лет) выявлены потенциальные группы флуорофоров, а так же определена динамика их соотношений и вкладов в результирующие спектры свечения биотканей при исследуемых формах поражения. В частности:

• Суммарный спектр, как г(Лет), так и А/(Лет) определяется, как минимум, излучением 7 групп флуорофоров, из которых основной вклад в суммарные спектры вносят группы NAD(P)'H, структурных белков, а так же производные флавинов и эндогенных порфиринов.

• Обнаружено и подтверждено результатами флуоресцентной микроскопии, что по мере воздействия патологического поражения происходит снижение вклада флуоресценции флавинов и увеличение вклада NAD(P)'H в суммарный спектр свечения, что свидетельствует об угнетении клеточного дыхания и развитии процесса истощения терминального окисления. Вместе с этим, для крайних форм поражения наблюдается 4-х кратное возгорание спектральных групп, соответствующих коллагену и производным эндогенных порфиринов.

• Вследствие наложения полос поглощения крови и эндогенных хромофоров, а так же высокого уровня объемного светорассеяния вклады спектральных компонентов, соответствующих флуоресценции коллагена и эластина могут быть ослаблены до 3 раз, а роль флавиновых и порфириновых групп завышена, соответственно, в 1.5 и 3 раза. В то же время, обнаружено, что динамика соотношений этих флуорофоров в зависимости от стадии поражения биотканей, как для F(Aj, так и для А/(Леп) остается неизменной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Систематизация, анализ и обобщение статистического материала, полученного в ходе проведения комплексных экспериментальных и теоретических исследований биотканей по мере развития патологических процессов, на основе методов диффузно-оптической и лазерно-индуцированной флуоресцентной спектроскопии и микроскопии, позволили сформулировать основные результаты работы, заключающиеся в следующем:

1. Разработана экспериментальная установка и методики комплексного исследования спектрально-флуоресцентных и диффузно-оптических свойств биотканей в норме и при различных формах патологического процесса на основе спектров лазерно-индуцированной флуоресценции, диффузного отражения, оптических показателей поглощения, рассеяния и фактора анизотропии, а так же данных светооптической и флуоресцентной микроскопии.

2. Экспериментально обнаружена корреляционная зависимость между спектрально-флуоресцентными и диффузно-оптическими характеристиками биотканей in vivo и степенью их поражения, включая процессы малигнизации. Показано, что по мере развития патологических процессов происходит снижение интенсивности флуоресценции до 2 раз для средней стадии, в 3-4 раза для высоких стадий и в 5-6 раз при крайней стадии поражения.

3. Определены механизмы и закономерности формирования спектров аутофлуоресценции биотканей в процессе развития патологического поражения и установлено, что влияние эффектов множественного светорассеяния и оптического поглощения приводит, как к искажению формы, так и к перераспределению интенсивности аутофлуоресценции. В частности, развитие средней и высокой стадии поражения сопровождается увеличением степени искажения аутофлуоресценции rj(X) и, как следствие, ростом глубины ее испускания lfl(x) до 1.5 раз, тогда как для крайней стадии наблюдается обратный эффект: уровень т](л) и 1л{я) спадает до значений близких к норме. В результате интенсивность флуоресценции может до 13 раз превышать интенсивность аутофлуоресценции.

4. Обнаружено, что спектральные распределения аутофлуоресценции и квантового выхода для исследуемых биотканей совпадают с заданной точностью и характеризуются наличием единственного максимума, сдвинутого в коротковолновую область примерно на 20 нм относительно главного максимума спектров флуоресценции. При этом типичное значение кантового выхода для нормальных биотканей составляет примерно 8.5x10"4 и уменьшается до 4 раз для высоких стадий поражения, а для крайней стадии -незначительно растет, что достоверно указывает на рост безизлучательной дезактивации флуоресценции вследствие процессов тушения и миграции энергии в патологически измененных биотканях.

5. На основе систематических исследований установлено, что суммарные спектры флуоресценции и аутофлуоресценции определяются, как минимум, излучением 7 групп флуорофоров, из которых основной вклад в суммарные спектры вносят группы NAD(P)-H, структурных белков, а так же производные флавинов и эндогенных порфиринов. Показано, что по мере развития крайних форм поражения наблюдается снижение вклада флуоресценции флавинов и увеличение вклада NAD(P)-H, а также 4-х кратное возгорание коллагеновых и порфириновых групп в результирующем спектре аутофлуоресценции.

6. На основе решения обратной задачи уравнения переноса излучения определены спектры оптических показателей поглощения, рассеяния и фактора анизотропии для биотканей при исследуемых формах патологического поражения. Обнаружено, что по сравнению с нормой для средней и высокой стадии поражения наблюдается уменьшение показателя поглощения до 3 раз, тогда как развитие крайних форм поражения сопровождается увеличением ца до значений, близких к здоровым биотканям, a ps - приблизительно до 2 раз выше нормы.

7. Выполнен сравнительный анализ спектральной зависимости оптических свойств биотканей и результатов гистоморфологических исследований, что позволило достоверно определить динамику физиологических и структурно-морфологических параметров биотканей в зависимости от степени патологического состояния. В частности:

• Установлено, что относительно нормы развитие средней и высокой стадии поражения приводит к снижению уровня кровенаполнения р и кислородного насыщения а биотканей, тогда как при крайних формах поражения наблюдается увеличение параметра р и уменьшение а.

•• Обнаружено, что для нормальных биотканей плотность рассеивающих центров составляет 3.3x105, а их усредненный размер близок к рассеивателям Ми. При этом развития средней и высокой стадии поражения приводит к увеличению плотности рассеивателей, соответственно, на 20% и 45%., тогда как для крайней стадии поражения наблюдается увеличение размеров оптических неоднородностей и уменьшение их концентрации в 1.6 и 5 раз, соответственно, для полипа и злокачественных новообразований.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, д.ф.-м.н., профессору Н.А. Ашурбекову за поддержку диссертационной работы; научному консультанту, к.м.н., доценту кафедры патологической анатомии М.Т. Расулову за сотрудничество и консультации, а так же коллеге и товарищу, н.с. О.В. Кобзеву за помощь в численных расчетах.

1. Оптическая биомедицинская диагностика/ Пер. с англ. под ред. В.В. Тучина. -М.: ФИЗМАТЛИТ, 2007. Т. 1. 560 е., Т. 2. - 368 с.

2. В.В. Тучин Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. — Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998. 384 с.

3. R. Richards-Kortum, Е. Sevick-Muraca. Quantitative Optical Spectroscopy for Tissue Diagnosis// Annu. Rev.Phys. Chem. 1996, V. 47, P. 555-606.

4. N. Ramanujam. Fluorescence Spectroscopy In Vivo. Encyclopedia of Analytical Chemistry. R.A. Meyers (Ed.) John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2000. P. 20-56.

5. B.A. Лисовский, В.В. Щедрунов, И.Я. Барский и др. Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии. Л.: Наука, 1984. 236 с.

6. К.Т. Schomacker, J.K. Frisoli, С.С. Compton et al. Ultraviolet laser-induced fluorescence of colonic tissue: basic biology and diagnostic potential//Lasers Surg. Med. 1992. V. 12, P. 63-78.

7. Z. Huang, W. Zheng, S. Xie et al. Laser-induced autofluorescence microscopy of normal and tumor human colonic tissue// Int. J. Oncology. 2004, V. 24, P. 59-63.

8. B. Li, Z. Zhang, S. Xie. Steady state and time-resolved autofluorescence studies of human colonic tissues// Chinese Optics Lett. 2006, V. 4, P. 348350.

9. I. Georgakoudi, B.C. Jacobson, J. Van Dam et al. Fluorescence, reflectance, and light-scattering spectroscopy for evaluating dysplasia in patients with Barrett's esophagus// Gastroenterology. 2001, V. 120, P. 1620-1629.

10. B.W. Chwirot, S. Chwirot, W. Jendrzejczyk et al. Diagnostic potential of ultraviolet laser-induced autofluorescence of stomach tissues// Proc. SPIE. 2001, V. 4515, P. 79-84.

11. T.J. Pfefer, D.Y. Paithankar, J.M. Poneros et al. Temporally and spectrally resolved fluorescence spectroscopy for the detection of high grade dysplasia in Barrett's esophagus// Lasers Surg. Med. 2003, V. 32, P. 10-16.

12. M. Jordan, T. Horbach, P. Horner et al. Evaluation of in vivo endoscopic autofluorescence spectroscopy in gastric cancer// Gastrointest. Endosc, 2004, V.59,P. 191-198.

13. H. Tajiri. Autofluorescence endoscopy for the gastrointestinal tract// Proc, Japan Academy, B. 2007, V. 83, P. 248-255.

14. R. Drezek, K. Sokolov, U. Utzinger et al. Understanding the contributions of NADH and collagen to cervical tissue fluorescence spectra: Modeling., measurements, and implications// J. Biomed. Opt. 2001, V. 6, P. 385-396.

15. S.K. Chang, Y. N. Mirabal, E. N. Atkinson et al. Combined reflectance and fluorescence spectroscopy for in vivo detection of cervical pre-cancer// J. Biomed. Opt. 2005, V. 10, P. 024031-1-11.

16. S.K. Chang, N. Marin, M. Follen et al. Model-based analysis of clinical fluorescence spectroscopy for in vivo detection of cervical intraepithelial dysplasia// J. Biomed. Opt. 2006, V. 11, P. 024008-19.

17. J. Qu, C. MacAulay, S. Lam et al. Laser induced fluorescence spectroscopy at endoscopy: tissue optics, Monte Carlo modeling, and in vivo measurements// Opt. Eng. 1995, V. 34, P. 3334-3343.

18. B.B. Соколов, E.B. Филоненко, JI.B. Телегина и др. Комбинация флуоресцентного изображения и локальной спектрофотометрии при флуоресцентной диагностике раннего рака гортани и бронхов// Квант. Электрон. 2002, Т. 32, С. 963-969.

19. Т.М. Breslin, F. Xu, G.M. Palmer et al. Autofluorescence and diffuse reflectance properties of malignant and benign breast tissues// Ann. Surg. Oncol. 2003, V. 11, P. 65-70.

20. M.V.P. Chowdary, K.K. Mahato, K.K. Kumar et al. Autofluorescence of breast tissues: evaluation of discriminating algorithms for diagnosis ofnormal, benign, and malignant conditions// Photomedicine and Laser Surgery. 2009, V.27, P. 241-252.

21. H. Chang, J.Y. Qu, P. Yuen et al. Light-induced autofluorescence spectroscopy for detection of nasopharyngeal carcinoma in vivo// Appl. Spectroscopy. 2002, V. 56, P. 1361-1367.

22. D.C.G. de Veld, M. Skurichina, M. J.H. Witjes et al. Clinical study for classification of benign, dysplastic, and malignant oral lesions using autofluorescence spectroscopy// J. Biomed. Opt. 2004, V 9, P. 940-950.

23. D.C.G. de Veld, M. Skurichina, M.J.H. Witjes et al. Autofluorescence and diffuse reflectance spectroscopy for oral oncology// Lasers Surg. Med.2005, V. 36, P. 356-364.

24. S. K. Majumder, A. Gupta, S. Gupta et al. Multi-class classification algorithm for optical diagnosis of oral cancer// J. Photochem. Photobiol., B.2006, V. 85, P. 109-117.

25. M. Keijzer, R. Richard-Kortum, S.L. Jacques et al. Fluorescence spectroscopy of turbid media: autofluorescence of human aorta// Appl. Optics. 19896 V. 28, P. 4286-4298.

26. G. Filippidis, G. Zacharakis, A. Katsamouris et al. Single and double wavelength excitation of laser-induced fluorescence of normal and atherosclerotic peripheral vascular tissue// J. Photochem. and Photobiol. B. 2000, V. 56, P. 163-171.

27. R. Rocha, A.B. Villaverde, L. Silveira et al. Fluorescence and reflectance spectroscopy for identification of atherosclerosis in human carotid arteries using principal components analysis// Photomedicine and Laser Surgery. 2008, V. 26, P. 329-335

28. Синичкин Ю.П., Утц C.P., Меглинский И.В. и др. Спектроскопия кожи человека in vivo. I. Спектры отражения. II. Спектры флуоресценции/Юптика и спектроскопия. 1996, Т. 80, С. 260-268, С. 431-440.

29. G.N. Stamatasi, B.Z. Zmudzka, N. Kolliasi et al. Non-invasive measurements of skin pigmentation in situ// Pigment. Cell Res. 2004, V. 17, P. 618-626.

30. R. Meerwaldt, J.W. Hartog, R. Graaff et al. et al. Skin autofluorescence, a measure of cumulative metabolic stress and advanced glycation end products, predicts mortality in hemodialysis patients// J Am. Soc. Nephrol. 2005, V. 16, P. 3687-3693.

31. I. Bliznakova, E. Borisova, L. Avramov. Laser- and light-induced autofluorescence spectroscopy of human skin in dependence on excitation wavelengths// ActaPhysicaPolonica A. 2007, V. 112, P.l 131-1139.

32. M. Koetsier, H. Lutgers, A. J. Schmidt et al. Skin autofluorescence for the risk assessment of chronic complications in diabetes: a broad excitation range is sufficient// Optics Express 2009, V. 17, P. 509-519.

33. А. Ленинджер. Биохимия. M.: МИР, 1976. 958 с.

34. Официальный сайт орегонского Центра Лазерной Медицины, 2007. Доступно: http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/index.html

35. С. Юденфренд. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине: Пер. с англ. М.: Мир. 1965. 468 с.

36. Д. Лакович. Основы флуоресцентной спектроскопии: Пер. с англ. М.: Мир. 1986.-496 с.

37. Н. Schneckenburger, К Konig. Fluorescence decay kinetics and imagining ofNAD(P)H and flavins as metabolic indicators// Opt. Eng. 1992, V. 31, P.1447-1451.

38. B. Chance, B. Schoener, R. Oshino et al. Oxidation-Reduction Ratio Studies of Mitochondria in Freeze-trapped Samples// J. Biol. Chem. 1979, V. 254, P. 4764-4771.

39. B.H. Карнаухов. Спектральные исследования энергетического аппарата живых нервных клеток//Биофизика. 1973, Т. 13, С. 185-188.

40. В.Н. Карнаухов, В.П. Зинченко. Люминесцентные спектральные исследования путей терминального окисления при изменении клеточной активности одиночной мышечной клетки// Цитология. 1971, Т. 13, С. 1243-1249.

41. В.Н. Карнаухов. Спектральный анализ и изучение внутриклеточной регуляции обмена веществ и энергий/ЯДитология. 1976, С. 622-629.

42. P. Galland, Н. Senger. The role of flavins as photoreceptors// J. Photochem. and Photobiol. B. 1988, V. 1, P. 227-294.

43. В.Ф. Камалов, H.B. Степанов, Е.Б. Черняева и др. Избирательное воздействие лазерного излучения на раковые клетки лазерная спектроскопия клетки (обзор)//Квант. Электрон. 1985, Т. 12, С. 19972023.

44. J.M. Salmon, Е. Kohen, P. Vialet et al. Microspectrofluorimetric approach to the study of free/bound NAD(P)H ratio as metabolic indicator in various cell types// Photochem. Photobiol. 1982, V. 36, P. 585-593.

45. K.A. Horvath, D.F. Torchiana, W.M. Daggett et al. Monitoring myocardial reperfusion injury with NADH fluorimetry// Laser Surg. Med. 19992, V.12, P.2-6.

46. R. Lufit. The development of mitochondrial medicine// Proc. Natl. Acad. USA. 1994, V. 91, P. 8731-8738.

47. D. Fujimoto. The structure of pyridinoline, a collagen crosslink// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. V. 76, P. 1124-1129.

48. Z. Deyl, K. Macek, M.Adam et al. Studies on the chemical nature of elastin fluorescence// Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 625, P. 248-254.

49. D.P. Thornhill. Separation of a series of chromophores and fluorophores present in elastin// Biochem. J. 1975. V. 147, P. 215-219.

50. K. Konig, H. Schneckenburger. Laser-induced autofluorescence for medical diagnosis// J. Fluoresc. 1994. V. 4, P. 17-40.

51. C.M. Gardner, S.L. Jacques, A.J. Welch. Fluorescence spectroscopy of tissue: recovery of intrinsic fluorescence from measured fluorescence// Appl. Optics. 1996, V. 35, P. 1780-1792.

52. S.L. Jacques. Light distributions from point, line and plane sources for photochemical reactions and fluorescence in turbid biological tissues// Photochem. and Photobiol. 1998, V. 67, P. 23-32.

53. G. Panou-Diamandi, N.K. Uzunoglu, G. Zacharakis et al. One layer tissue fluorescence model based on electromagnetic theory// J. Electromag. Waves Appl. 1998, V. 12, P. 1101-1121.

54. A.V. Loschenov, V.I. Konov and A.M. Prokhorov. Photodynamic therapy and fluorescent diagnostic// Laser Physics. 2000, V. 10, P. 1188-1207.

55. A.J. Durkin, R. Richards-Kortum. Comparison of Methods to Determine Chromophore Concentrations from Fluorescence Spectra of Turbid Samples//Lasers Surg. Med. 1996, V. 19, P. 75-89.

56. R. Richards-Kortum, R.P. Rava, M. Fitzmaurice et al. A One-layer Model of Laser-induced Fluorescence for Diagnosis of Disease in Human Tissue: Applications to Atherosclerosis// IEEE Trans. Biomed. Eng. 1989, V. 36, P. 1222-1232.

57. A.J. Durkin, S. Jaikumar, N. Ramanujam et al. Relation Between Fluorescence Spectra of Dilute and Turbid Samples// Appl. Optics. 1994, V. 33, P. 414-423.

58. J. Wu, M.S. Feld, R.P. Rava. Analytical model for extracting intrinsic fluorescence from a turbid media// Appl. Optics. 1993, V. 32, P. 35853595.

59. Q. Zhang, M.G. Muller, J. Wu et al. Turbidity-free fluorescence spectroscopy of biological tissue// Opt. Lett. 2000, V. 25, P. 1451-1453.

60. M.G. Muller, I. Georgakoudi, Q. Zhang et al. Intrinsic fluorescence spectroscopy in turbid media: Disentangling effects of scattering and absorption//Appl. Optics. 2001, V. 40, P. 4633-4646.

61. Т. Wu, J.Y. Qu, T.-H. Cheung et al. Preliminary study of detecting neoplastic growths in vivo with real time calibrated autofluorescence imaging// Optics Express. 2003, V. 11, P. 291-298.

62. H. Zeng, C. MacAulay, B. Palcic et al. A Computerized Autofluorescence and Diffuse Reflectance Spectroanalyzer for In Vivo Skin Studies// Phys.

63. Med. Biol.1993, V. 38, P. 231-240.

64. H. Zeng, C. MacAulay, D. McLean et al. Spectroscopic and microscopic characteristics of human skin autofluorescence emission// Photochem. and

65. Photobiol. 1995, V. 51, P. 639-651.

66. S.R. Utz, P. Knuschke, Yu.P. Sinichkin. In vivo evaluation of sunscreens by spectroscopic methods// Skin Res. Technol. 1996, V. 2, P. 114-121.

67. А. Исимару. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных средах. М.: Мир, 1981. Т. 1. 280 с.

68. М. Keijzer, W.M. Star, P.R.M. Storchi. Optical diffusion in layered media//

69. Appl. Optics. 1988, V. 27, P. 1820-1824.

70. W.H.J. Van Staveren, C.J.M. Moes, J. Van Marie et al. Light scattering in intralipid-10% in the wavelength range of 400-1100 nm// Appl. Optics.1991, V. 30, P. 4507-4514.

71. S.K. Chang, D. Arifler, R. Drezek et al. Analytical model to describe fluorescence spectra of normal and preneoplastic epithelial tissue: comparison with Monte Carlo simulations and clinical measurements// J

72. Biomed. Opt. 2004, V. 9, P. 511-522.

73. S. Avrillier, E. Tinet, D. Ettori, J.M. Tualle et al. Influence of the emission-reception geometry on laser induced fluorescence spectra from turbid media// Appl. Optics. 1998, V. 37, P. 2781-2787.

74. B.W. Pogue, G. Burke. Fiber-optic bundle design for quantitative fluorescence measurements from tissue// Appl. Optics. 1998, V. 37, P. 7429-7436.

75. Лазерная инженерия хрящей/ под ред. В. Н. Баграташвили, Э.Н. Соболя, А.Б. Шехтера. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2006 - 488 с.

76. Прикладная лазерная медицина. Под ред. Х.-П. Берлиена, Г.Й. Мюллера. М.: Интерэксперт. 1997. 340 с.

77. G. Muller, R. Rogan. Laser-induced interstitial thermotherapy. -Bellingham, SPIE. 1995.

78. A.B. Приезжев, B.B. Тучин, Л.П. Шубочкин. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М.: Наука, 1989. 240 с.

79. W.-F. Cheong, S. A. Prahl, A. J. Welch. Review of the Optical Properties of Biological Tissues// IEEE J. Quantum Electron. 1990, V. 26, P. 21662185.

80. Г. Ван де Хюлст. Рассеяние света малыми частицами. М.: ИЛ, 1961. -572 с.

81. В.И. Лопатин, А.В. Приезжев, А.Д. Апонасенко и др. Методы светорассеяния в анализе дисперсных биологических сред. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2004. 384 с.

82. L.O. Reynolds, NJ. McCormick. Approximate two-parameter phase function for light scattering// J. Opt. Soc. Am. 1980, V. 70, P. 1206-1212.

83. J.H. Joseph, W.L. Wiscombe, J. A. Weinman. The 5-Eddington approximation of radiative flux transfer// J. Atm. Sci. 1976, V. 33, P. 24522459.

84. L.G. Henyey, J.L. Greenstein. Diffuse radiation in the galaxy// Astrophys. J. 1941, V. 93, P. 70-81.

85. G. Zonios, L.T. Perelman, V.M. Backman et al. Diffuse reflectance spectroscopy of human adenomatous colon polyps in vivo// Appl. Optics. 1999, V. 38, P. 6628-6637.

86. H.-W. Wang, T.C. Zhu, M.E. Putt et al. In-vivo measurements of optical and physiological properties in human intraperitoneal tissues before and after photodynamic therapy// J. Biomed. Optics. 2005, V. 10, P. 1-13.

87. A. Kienle, L. Ling, M.S. Patterson et al. Spatially resolved absolute diffuse reflectance measurements for noninvasive determination of the optical scattering and absorption coefficient of biological tissue// Appl. Optics. 1996, V. 35,P.2304-2314.

88. E.L. Hull, Т.Н. Foster. Steady-state reflectance spectroscopy in the P3-approximation// J. Opt. Soc. Am A. 2001, V. 18, P. 584-599.

89. D. Boas, H. Lui, M. O'Leary et al. Photon migration within the P3-approximation// Proc. SPIE. 1995, V. 2389, P. 240-247.

90. S.-P. Lin, L.-H. Wang, S. L. Jacques et al. Measurement of tissue optical properties by the use of oblique incidence optical fiber reflectometry// Appl. Optics. 1997, V. 36, P. 136-143.

91. G. Marquez, L.-H. Wang, S.-P. Lin et al. Anisotropy in the absorption and scattering spectra of chicken breast tissue// Appl. Optics. 1998, V. 37, P. 798-804.

92. F. Bevilacqua, D. Piguet, P. Marquet et al. In vivo local determination of tissue optical properties: applications to human brain// Appl. Optics. 1999, V. 38, P. 4939-4950.

93. M. Solonenko, R. Cheung, T.M Busch et al. In vivo reflectance measurement of optical properties, blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels, kidneys and prostates// Phys. Med. Biol. 2002, V. 47, P. 857-873.

94. J.W. Pickering, S.A. Prahl, N. Van Wieringen et al. Double-integrating-spheres system for measuring the optical properties of tissue// Appl. Optics. 1993, V. 32, P. 399-410.

95. S.A. Prahl, M.J.C. Van Gemert, A J. Welch. Determining of the optical properties of turbid media by using the adding-doubling method// Appl. Optics. 1993, V. 32, P. 359-568.

96. F.P. Bolin, L.E. Preuss, R.C. Taylor et al. Refractive index of some mammalian tissues using a fiber optic cladding method// Appl. Optics. 1989, V. 28, P. 2297-2305.

97. M.J.C. Van Gemert, S.L. Jacques, H.J.C.M. Sterenborg et al. Skin Optics// IEEE J. Biomed. Eng. 1989, V. 36, P. 1146-1154.

98. G. Yoon, A.J. Welch, M. Motamedi et al. Development and application of three-dimensional light distribution// IEEE J. Quantum Electron. 1987, V. QE-23, P. 1721-1733.

99. M.J.C. Van Gemert, G.A.C. Schets, M.S. Bishop et al. Optics of tissue in a multi-layer slab geometry// Laser Life Sci. 1988, V. 1, P. 1-18.

100. T. Burger, J. Kuhn, R. Caps et al. Quantitative determination of the scattering and absorption coefficients from diffuse reflectance and transmittance measurements applied pharmaceutical powders// Appl. Spectrosc. 1997, V. 51, P. 309-317.

101. T. Burger, H.J. Ploss, J. Kuhn et al. Diffuse reflectance and transmittance spectroscopy for the quantitative determination of scattering and absorption coefficients in quantitative powder analysis// Appl. Spectrosc. 1997, V. 51, P. 1323-1329.

102. V.V. Tuchin, S.R. Utz, I.V. Yaroslavskii. Tissue optics, light distribution and spectroscopy// Optical Eng. 1994, V. 33, P. 3178-3188.

103. S.A. Prahl. Inverse adding-doubling program. Официальный сайт орегонского Центра Лазерной Медицины, 2007. Доступно: http://omlc.ogi.edu/software/iad/index/html

104. S. A. Prahl, М. Keizer, S.L. Jacques et al. Monte Carlo model of light propagation in tissue// SPIE institute series. 1989, V. IS5, P. 102-111.

105. I.V. Yaroslavskii, V.V. Tucin. Light propagation in multilayer scattering media: modeling by the Monte Carlo method// Opt. Spectrosc. 1992, V. 72, P. 505-509.

106. R. Graaff, M.N. Koelink, F.F.M de Mul et al. Condensed Monte Carlo simulations for the description of light transport// Appl. Optics. 1993, V. 32, P. 426-434.

107. L.-H. Wang, S.L. Jacques, L.-Q. Zheng. MCML Monte Carlo modeling of photon transport in multi-layered tissues// Computer Methods and Programs in Biomedicine. 1995, V. 47, P. 131-146.

108. L.-H. Wang, S.L. Jacques, L.-Q. Zheng. CONV Convolution for responses to a finite diameter photon beam incident on multi-layered tissues// Computer Methods and Programs in Biomedicine. 1997, V. 54, P. 141-150.

109. D. A. Boas, J. P. Culver, J. J. Stott et al. Three dimensional Monte Carlo code for photon migration through complex heterogeneous media including the adult human head// Optics Express. 2002, V. 10, P. 159-170.

110. A.N. Yaroslavskay, I.V. Yaroslavskii, T. Goldbach et al. Inverse hybrid technique for the determination of the optical properties of turbid media// Appl. Optics. 1996, V. 35, P. 6797-6809.

111. C.J. Hourdakis, A. Parris. A Monte Carlo estimation of tissue optical properties for use in laser dosimetry// Phys. Med. Biol. 1995, V. 40, P. 963978.

112. A. Roggan, O. Minet, C. Schroeder et al. Determination of optical tissue properties with doubling integrating spheres technique and Monte Carlo simulation// Proc. SPIE. 1994, V. 2100, P. 42-56.

113. J.L. Karagiannes, Z. Zhang, B. Grossweiner et al. Applications of the 1-D diffusion approximation to the optics of tissues and tissues phantoms// Appl. Optics. 1989, V. 28, P. 2311-2317.

114. P. Parwane, S.L. Jacques, N.S. Nishioka Optical properties of rat liver between 350 and 2200 nm// Appl. Optics. 1989, V. 28, P. 2325-2330.

115. A.M.K. Nilsson, C. Sturesson, D.L. Liu et al. Changes in spectral shape of tissue optical properties in conjunction with laser-induced thermotherapy// Appl. Optics. 1998, V. 37, P. 1256-1267.

116. J. Qu, C. MacAulay, S. Lam et al. Optical properties of normal and carcinomatous bronchial tissue//Appl. Optics. 1994, V. 33, P. 7397-7406.

117. H.J. Scharzmaier, A.N. Yaroslavskay, I.V. Yaroslavskii et al. The optical properties of native and coagulated human brain structures// Proc. SPIE. 1997, V. 2970, P. 492-499.

118. A.N. Yaroslavskay, I.V. Yaroslavskii, T. Goldbach et al. Influence of the scattering phase function approximation on the optical properties of blood determined from the integrating sphere measurements// J. Biomed. Opt. 1999, V. 4, P. 47-53.

119. A. Roggan, M. Friebel, K. Dorchel et al. Optical properties of circulating human blood// Proc. SPIE. 1998, V. 3195, P. 51-63.

120. B. Beauvoit, M. Kimura, B. Chance Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties of rat liver: a theoretical and particle approach//Biophys. J. 1994, V. 67, P. 2501-2510.

121. J.M. Schmitt, G. Kumar Optical scattering properties of soft tissues: a discrete partical model// Appl. Optics. 1998, V. 37, P. 2788-2797.

122. А. Хэм, Д. Кормак. Гистология. М.: Мир, 1983, Т. 1-4.

123. А.П. Авцын, А.И. Струков, Б.Б. Фукс. Принципы и методы гистохимического анализа в патологии. JL: Медицина, 1971. — 274 с.

124. Л.И. Аруин, Л.Л. Капуллер, В.А. Исаков. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. Триада-Х, 1998. 184 с.

125. F.W.D. Rost. Fluorescence microscopy. Cambridge. Cambridge University Press. 1995, V. 1 249 p., V. 2 - 451 p.

126. Основы гистологии и гистологической техники/ Под ред. В.Г. Елисеева, М.Я. Субботина, Ю.И. Афанасьева и др. М.: МИР, 1974. -488 с.

127. Г.А. Меркулов. Курс патологической техники. JL: Медицина, 1969. -424 с.

128. L Cleemann, G. DiMasa, М Morad. Са2+ sparks within 200 nm of sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy// Adv. Exp. Med. Biol. 1997, V. 430, P. 57-65

129. B. Herman, P. Wodnicki, K. Seongwook et al. Recent developments in monitoring calcium and protein interaction in cells using fluorescence lifetime microscopy// J. Fluoresc. 1997, V. 7, P. 85-91.

130. H. Schneckenburger, M.H. Gschwend, К Sailer et al. Time-resolved in situ measurement of mitochondrial malfunction by energy transfer spectroscopy// J. Biomed. Opt. 2000, V. 5, P. 362-366.

131. B.K. Денисов. Трансплантология. Киев: Научная мысль на Украине, 1998.-247 с.

132. Л. Уэбб. Ингибиторы ферментов и метаболизма. Под редакцией В.А. Яковлева. М.: МИР, 1966. 863 с.

133. American national standard for safe use of lasers. ANSI Z136.1, 1993.

134. Общая патология человека/ Под редакцией А.И. Струкова, В.В. Серова, Д.С. Саркисова. -М.: Медицина, 1982. 656 с.

135. A.G. Brovoi, E.I. Naats Scattering of light by red blood cell// J. Biomed. Opt. 1998, V. 3, P. 364-372.

136. A. Roggan, M. Friebel, K. Doershel et al. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm// J. Biomed. Opt. 1999, V. 4, P. 36-46.

137. M.B. Фок. Разделение сложных спектров на индивидуальные полосы при помощи метода Аленцева// Тр. ФИАН СССР. 1972, Т. 59, С. 3-24.

138. А.В. Агронская, М.Г. Гальперн, JI.B. Жорина и др. Фталоцианины, как фотосенсибилизаторы второго поколения для фотодинамической терапии опухолевых заболеваний: спектроскопия флуоресценции и поглощения//Известие АН. СФ. 1995, Т. 59, С. 144-150.

139. Yasunori Saito, Mitsuyoshi Kanoh, Ken-Ichiro Hatake et al. Investigation of Laser-Induced Fluorescence of Several Natural Leaves for Application to Lidar Vegetation Monitoring// Appl. Opt. 1998. V. 37, P. 431-437.