Длительная люминесценция органических красителей в клетках биологических тканей

Маряхина, Валерия Сергеевна

Длительная люминесценция органических красителей в клетках биологических тканей тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

Маряхина, Валерия Сергеевна АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Ульяновск МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

01.04.05 КОД ВАК РФ

Диссертация по физике на тему «Длительная люминесценция органических красителей в клетках биологических тканей»

Автореферат диссертации на тему "Длительная люминесценция органических красителей в клетках биологических тканей"

005009804

Маряхина Валерия Сергеевна

ДЛИТЕЛЬНАЯ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КРАСИТЕЛЕЙ В КЛЕТКАХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ

01.04.05 - Оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 с оев тг

Ульяновск - 2012

005009804

Работа выполнена в Центре коллективного пользования приборным оборудованием «Институт микро- и нанотехнологий» федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет» .

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор

Летута Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор

Салецкий Александр Михайлович

доктор физико-математических наук, профессор

Миков Сергей Николаевич

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Саратовский государственный

университет им. Н.Г. Чернышевского

Защита состоится " 16 " марта 2012 г. в 12 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 212.278.01 при федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» по адресу: г. Ульяновск, Набережная реки Свияги, 106, ауд. 703

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО Ульяновский государственный университет, с авторефератом - на сайте университета www.uni.ulsu.ru и на сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан «{2/ » С/\£/Ь‘ 2012 г.

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42, Ульяновский государственный университет, Управление научных исследований.

Ученый секретарь диссертационного совета к.ф.-м.н.

Вострецова Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Оптические методы диагностики биотканей нашли практическое применение в биологии и медицине, в т.ч. для разработки методов диагностики биотканей. Наиболее распространенные из них: аутофлуоресцентная диагностика, оптическая когерентная томография, спектроскопия диффузного отражения, флуориметрия [1]. Эти методы диагностики основаны на способности некоторых химических соединений (как органических, так и неорганических) селективно накапливаться в патологических тканях. Повышение концентрации флуоресцирующих веществ (эндогенных флуорофоров) в отдельных участках ткани нетрудно зафиксировать экспериментально. Благодаря неинвазивности и высокой чувствительности по отношению к патологии, флуоресцентная диагностика (ФД) получает все более широкое распространение.

Однако перечисленные методы не лишены недостатков. Как правило, они позволяют обнаружить патологию на поздних стадиях, когда опухоли сформировались и возможны необратимые осложнения. Из-за сильного поглощения и рассеяния света внутри соединительной и эпителиальной ткани диагностика их глубоких слоев затруднительна. Интерпретация результатов оптических измерений осложняется присутствием межклеточного вещества, крови, лимфы и других, сильно рассеивающих компонентов, входящих в состав биотканей. Поэтому на этапе разработки методов ФД часто объектами исследований служат клетки, выделенные из различных органов человека или животных. Для обеспечения жизнеспособности клеток и сохранения их естественных биологических функций их культивируют в различных питательных средах.

Для оптической диагностики, как культур клеток, так и тканей, используют и экзогенные флуорофоры - синтетические красители или различные фотосенсибилизаторы [2]. Метод ФД может быть основан на регистрации, спектров поглощения и быстрой флуоресценции флуорофоров, или кинетики их замедленной флуоресценции (ЗФ). При регистрации спектров флуоресценции молекул результаты исследований зависят от интенсивности источника света, анизотропии рассеяния и многих других факторов [3]. В случае регистрации кинетики длительной люминесценции этих недостатков можно избежать.

В настоящей работе представлены результаты исследования кинетики длительной люминесценции молекул ксантеновых красителей - экзогенных флуоресцентных зондов в клетках, выделенных из нормальных и патогенных тканей.

Целью работы является установление закономерностей длительной люминесценции экзогенных молекулярных зондов в клетках, выделенных из нормальных и патологических биотканей, и выработка рекомендаций для разработки метода их оптической диагностики.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать технологию подготовки образцов с клетками биологических тканей для оптических измерений.

2. Установить особенности ЗФ и фосфоресценции молекулярных зондов в опухолевых и нормальных клетках;

3. Изучить закономерности длительной люминесценции молекул органических красителей в бактериальных клетках;

4. Выявить основополагающие процессы с участием триплетных состояний молекул-зондов, влияющих на формирование сигнала длительной люминесценции в образцах с опухолевыми и нормальными клетками.

5. Установить основные факторы, влияющие на длительную люминесценцию органических люминофоров, локализованных в клетках биотканей.

Методы исследования. Основные экспериментальные результаты получены в ходе изучения кинетики затухания ЗФ и фосфоресценции многоатомных молекул-зондов при возбуждении их низкоинтенсивным лазерным излучением в основной полосе поглощения. На разных стадиях исследований использовались методы электронной и ИК-спектроскопии, фотометрии, зондовой сканирующей атомно-силовой и традиционной оптической микроскопии.

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующем:

1. Исследована кинетика ЗФ и фосфоресценции эндогенных флуоро-форов в соматических и бактериальных клетках, культивируемых на поверхности твердой питательной среды - биоматериале «Гиаматрикс». Показано, что при нормальных условиях в клетках доминирующим процессом, определяющим характер длительной люминесценции ксантеновых красителей, является тушение их триплетных состояний молекулярным кислородом с образованием синг-

летного 1Лг(02) кислорода и последующей синглет-триплетной 7^-»'Ае(02)

аннигиляцией.

2. Обнаружены различия в кинетике фотопроцессов с участием триплетных состояний молекул-зондов в клетках нормальных и патогенных тканей. Достоверно регистрируемые различия в кинетике затухания ЗФ и фосфоресценции ксантеновых красителей предложено использовать для разработки альтернативного метода диагностики биотканей, основанного на регистрации излуча-тельного времени жизни экзогенных флуорофоров.

3. Методами кинетической и стационарной спектрометрии определена специфика взаимодействия различных типов красителей с бактериальными клетками. Показано, что при обработке результатов кинетических измерений следует учитывать вклад в общий сигнал от флуорофоров, локализованных в бактериальных клетках.

4. Обнаружена зависимость кинетики длительной люминесценции молекулярных зондов от стадии развития патологического процесса. Установлено, что время жизни ЗФ экзогенных зондов в клетках на ранней стадии развития опухоли короче, чем на поздней стадии. Это объясняется гипоксией онкогенных клеток.

Практическая значимость диссертации состоит в следующем:

1. Установленные закономерности кинетики ЗФ и фосфоресценции ксантеновых красителей в клетках могут быть использованы для разработки нового оптического метода диагностики биотканей, основанного на измерении времени жизни триплетных состояний экзогенных флуорофоров.

2. Разработана технология подготовки клеток биотканей для оптических измерений (Патент №2418067 от 10.05.2011. Приоритет от 03.12.2009. Опубл. БИ № 13, Патент № 2409664 от 20.01.2011. Приоритет 29.04.2009. Опубл. БИ№ 1).

3. Результаты кинетических исследований по взаимодействию органических молекул с клетками биотканей могут найти практическое применение не только при решении диагностических задач, но и для контроля жизнеспособности клеток и лазерной терапии.

Достоверность полученных результатов обеспечена применением современных приборов и оборудования, методов исследования и обработки экспериментальных данных и их хорошей воспроизводимостью. Согласием теоретических моделей и экспериментальных результатов. Положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, теоретически и экспериментально обоснованы и не противоречат общенаучным представлениям о природе длительной люминесценции органических молекул в конденсированных средах.

Личный вклад автора. В основу диссертации положены результаты научных исследований, проведенных автором в 2007-2011 годах. Автором лично разработан способ приготовления образцов для исследования, проведены измерения спектров люминесценции, кинетики ЗФ и фосфоресценции образцов, предложена модель и выполнена математическая обработка результатов. Постановка задачи осуществлялась совместно с научным руководителем, профессором С.Н. Летута.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основным каналом релаксации возбужденных триплетных состояний молекул ксантеновых красителей (экзогенных молекулярных зондов) в клетках, выделенных из биотканей, при нормальных условиях является безыз-лучательный перенос энергии на молекулярный кислород. Кинетика длительной люминесценции молекулярных зондов в клетках при нормальных условиях определяется эффективностью конкурирующих процессов синглет-триплетной 'Ай(02)-Т аннигиляции, термостимулированной замедленной флуоресценции (ТЗФ) и фосфоресценции.

2. Кинетика длительной люминесценции молекул ксантеновых красителей в биоматериале «Гиаматрикс» не зависит от давления воздуха над поверхностью материала. Характер замедленной флуоресценции молекулярных зондов в таком материале определяется эффективностью статической триплет-триплетной аннигиляции и термостимулированного послесвечения.

3. Кинетика ЗФ и фосфоресценции молекул-зондов в клетках, выделенных из злокачественных опухолей и нормальных тканей, различна и зависит от стадии развития опухоли. Излучательное время жизни триплетных зондов в онкогенных клетках больше, чем в нормальных клетках. В клетках, выделенных из капсул злокачественных опухолей, эффективность генерации синглетного кислорода ниже, чем в нормальных клетках.

4. Кинетика длительной люминесценции молекул красителей связанных с бактериями Е-соП при нормальных условиях определяется соотношением

интенсивностей термостимулированного свечения, синглет-триплетной анниги-ляционной флуоресценции и фосфоресценции.

Апробация работы. Изложенные в диссертации результаты обсуждались на семинарах и докладывались на следующих российских и международных конференциях: 14л International School for Young Scientist and Student on Optics, Laser Physics & Biophysics SFM-2010 (2010, Saratov); 52-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (2009, Москва); 53-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (2010, Москва); Всероссийская научнопрактической конференция "Многопрофильный университет как региональный центр образования и науки" (2009, Оренбург); IV Russian-Japanese Seminar «Мо-lecular and Biophysical magnetoscience SMBM» (2009, Orenburg); V Russian-Japanese Seminar «Molecular and Biophysical magnetoscience (SMBM)» (2010, Orenburg); International conférence «Laser applications in life science LALS-2010» (2010, Finland, Oulu); Международный молодежный научный форум «JIOMO-НОСОВ-2010» (2010, Москва, МГУ); Всероссийская молодежная научная конференция ВНКСФ-16 (2010, Волгоград); VI Международная научнотехническая конференция «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии» БФФХ-2010 (2010, Севастополь); IX международная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (2009, Москва, ИБХФ РАН); X международная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (2010, Москва, ИБХФ РАН); Международная школа-конференция «Биофизика сложных систем. Анализ и моделирование» (2011, Пущино), III International symposium «Topical problems of biophotonics». (2011, St.- Peterburg - Nizhny Novgorod); 15* International School for Young Scientist and Student on Optics, Laser Physics & Biophysics SFM-2011 (2011, Saratov).

Публикации

По теме диссертационной работы имеется 22 публикации, из них 2 патента, 4 публикации в реферируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 16 работ в сборниках материалов международных и общероссийских конференций.

Работа поддержана аналитической ведомственной целевой программой «Развитие научного потенциала высшей школы» (2009-2010 годы) «Флуоресцентная диагностика биологических тканей», № 1.1.06, (2009, 2010); «Спектрально-люминесцентная диагностика биологических объектов и материалов», № 1.1.11, 2011; Фондом содействия развития малых форм предприятий в научно-технической сфере, «У.М.Н.И.К.» №14 от 01.02.2010.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы. Объем диссертации составляет 154 страницы, включая 46 рисунков, 9 таблиц и список литературы, состоящий из 196 источников.

Содержание работы

Во введении представлен анализ состояния проблемы и обоснована актуальность темы исследования, сформулированы цели и задачи работы, отмечена новизна и практическое значение полученных результатов, определены основ-

ные положения, выносимые на защиту, приведены сведения об апробации работы и личном участии автора в выполнении работы, а также кратко изложено содержание диссертации.

Первая глава представляет собой литературный обзор и содержит два параграфа. В первом параграфе дается описание и сравнительный анализ экспериментальных методов, используемых в оптической диагностике биологических структур. Во втором параграфе приведены сведения о взаимодействии низкоинтенсивного лазерного излучения с биологическими объектами. Особое внимание уделено взаимодействию низкоинтенсивного лазерного излучения с клетками, выделенными из нормальных и патологических биотканей.

Во второй главе дано описание экспериментальных установок, объектов исследования и методик приготовления образцов.

Основу экспериментальной установки для измерения кинетики затухания ЗФ и фосфоресценции органических молекул в клетках биотканей составлял моноимпульсный твердотельный лазер на иттрий-алюминиевом гранате марки LQ-129, работающий в режиме модулированной добротности, с удвоением основной частоты генерации (А.^ = 532 нм). Это излучение использовалось для возбуждения исследуемых молекул В ДЛИННОВОЛНОВОЙ S0—>Si полосе поглощения. Параметры возбуждающего импульса: длительность тш„ = 10 не, плотность мощности возбуждения, как правило, не превышала 5 МВт/см2. Во всех экспериментах интенсивность излучения контролировалась с помощью фотодиода.

Кинетика затухания длительной люминесценции регистрировалась с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ-84) через монохроматор МДР-41. В момент возбуждения образцов, чувствительность ФЭУ понижалась на несколько порядков путем подачи на управляющий электрод импульса отрицательной полярности. Сбор, накопление и первичная обработка экспериментальных данных осуществлялись на автоматизированной установке, включающей ПЭВМ и крейт КАМАК. Синхронизация запуска лазеров, регистрирующей системы и запирания ФЭУ производилась в автоматическом режиме.

Спектры поглощения и флуоресценции объектов измерялись на спектрофотометре Solar СМ-2203 с техническими характеристиками: рабочая область спектра в режиме спектрофлуориметра 220+820 нм, в режиме спектрофотометра 220+1000 нм; погрешность измерений - 1 нм; выделяемый спектральный интервал 1+10 нм.

Для визуализации поверхности исследуемого биоматериала использовался сканирующий зондовый мультимикроскоп СММ-2000, работающий в режиме контактной атомно-силовой микроскопии в воздушной среде.

Объектами исследования служили клетки, выделенные из опухолевой и нормальной ткани молочной железы мышей линии BYRB. Кусочки исследуемой ткани диаметром около 1 мм помещали в раствор коллагеназы в фосфатном буфере (pH = 7.4) с концентрацией 0.5 мг/мл. Полученную суспензию клеток наносили на твердую питательную среду, в качестве которой использовался материал «Гиаматрикс». Он представлял собой полимерную пластину, изготовленную методом фотохимической сшивки макромолекул в гидрогеле на основе нативной гиалуроновой кислоты с добавлением коллагена и олигонуклеотидов.

В большинстве экспериментов толщина биоматериала составила 0.25 мм, плотность 340.13 кг/м3.

В качестве флуоресцентных зондов использовались ксантеновые (эритро-зин, эозин, бенгальский розовый) и акридиновые (акридиновый оранжевый) красители. Отличительной особенностью перечисленных красителей является высокий квантовый выход фт в триплетное состояние. Кроме того, они хорошо растворимы в воде и обладают яркой ЗФ и фосфоресценцией. Такие спектрально-кинетические свойства позволяют использовать их как триплетные зонды.

В третьей главе приведены результаты исследования кинетики ЗФ органических красителей в клетках, выделенных из опухолевых и здоровых тканей молочной железы мышей линии БУИВ. В первом параграфе главы рассмотрены теоретические основы кинетики длительного послесвечения триплетных молекул-зондов при низкоинтенсивном возбуждении, когда вероятность нелинейного возбуждения мала. При описании фотопроцессов учитывалось, что кинетика послесвечения представляет собой суммарный сигнал от молекул-зондов находящихся в питательной среде и в клетках. В цитоплазме клеток и в питательной среде содержатся различные тушители триплетных состояний, с которыми молекулы-зонды могут эффективно взаимодействовать. Поэтому теоретическое исследование кинетики длительной люминесценции свелось к задаче о возбуждении доноров энергии (молекул-зондов), находящихся в среде акцепторов в условиях ненасыщающего возбуждения.

Эффективным тушителем триплетных состояний доноров является молекулярный кислород. При этом в ходе сенсибилизированного возбуждения в реакции 1] +-3Г8 (02) к‘ >,У0 +'Л8 (02) образуется синглетный ’Де(02) кислород. Здесь Л'0 и Г/ - основные синглетное и триплетное состояния молекулы-зонда соответственно, 3Е~(02) - основное триплетное состояние молекулы кислорода. В работе [4] показано, что возможна аннигиляция оставшихся (непотушенных) триплет-возбужденных молекул красителя с мигрирующими ‘Дк(02) молекулами кислорода, в результате которой образуются синглетные Я/ состояния донора, дающие дополнительный вклад в ЗФ Тх+\{02\ >£,+3£г(02).

Поскольку основное вещество цитоплазмы клеток - вода, то молекулы органических красителей свободно диффундируют. В таких условиях возможна триплет-триплетная аннигиляция частиц, которая также дает вклад в регистрируемый сигнал ЗФ. Таким образом, в присутствии кислорода кинетика ЗФ представляет собой суперпозицию трех различных по своей природе сигналов, каждый из которых содержит информацию о состоянии среды.

Принимая во внимание, что в многоатомных молекулах скорость релаксации по колебательным подуровням синглетных и триплетных состояний существенно превосходит скорость ухода возбуждения с термализованных уровней данного электронного состояния, исходя из баланса описанных процессов, была выписана и численно решена система кинетических уравнений. Иллюстрация развитых представлений приведена на рисунке 1, где показаны теоретические и экспериментальные кривые кинетики ЗФ эритрозина в опухолевых и нормальных клетках молочной железы мышей. Как видно, при нормальных условиях в цитоплазме клеток доминирующим процессом, определяющим характер ЗФ эндогенных флуорофоров, является тушение их триплетных состояний молекулярным кислородом с последующей 7]—>‘Дг(02) аннигиляцией. Из приведенных данных следует, что в условиях наших экспериментов концентрация кислорода в клетках нормальных тканей оказалась выше, чем в патогенных. Эти результаты хорошо согласуются с данными работы [5].

Полагая, что миграция молекул кислорода в клетках достаточно эффективна, для описания наблюдаемых процессов можно использовать формальнокинетический подход. При этом временная зависимость интенсивности ЗФ имеет вид

1ЗФ (0 ~ (РфлР.^Л ХТ (У)^д (0 + (О + каннМгЛ<), (1)

где кТЗФ (С1) - константа скорости первого порядка, определяющая термоактивированную ЗФ, кгТ и каш (слое1) - константы скоростей второго порядка - скорость синглет-триплетной Т’-'Д (02) аннигиляции и триплет-триплетной аннигиляции Т] - возбуждений соответственно. Уравнение (1) удовлетворительно описывает экспериментальные результаты.

Во втором параграфе третьей главы описана технология подготовки образцов с биоматериалом «Гиаматрикс» для оптических измерений, а также результаты исследований его взаимодействия с клетками, выполненные оптическими методами.

В третьем параграфе этой главы представлены результаты исследования кинетики длительной люминесценции экзогенных зондов в клетках, выделенных из нормальных и патогенных тканей, культивируемых на поверхности

а) I, МКС б) Ц МКС

Рис. 1. Экспериментальные (сплошные линии) и теоретические (точки) кривые кинетики ЗФ эритрозина в опухолевых (а) и нормальных клетках (б).

«Гиаматрикса». Отдельно исследовался характер ЗФ флуорофоров в питательной среде и в клетках.

Кинетика ЗФ красителей в биоматериале «Гиаматрикс» не изменяется с увеличением давления воздуха над образцами от 150 мм.рт.ст. до атмосферного, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия кислорода с флуорофорами в пленке. На кинетической кривой ЗФ флуорофоров выделяются два характерных участка. Резкий спад интенсивности свечения в течение 5-7 мкс после окончания возбуждающего импульса, обусловленный, по нашему мнению, статической триплет-триплетной аннигиляцией возбужденных молекул, и последующее моноэкспоненциальное затухание ТЗФ (рис. 2, кривая 3).

Иной характер длительной люминесценции красителей в клетках. С изменением давления воздуха в камере с образцами от 150 мм.рт.ст. до атмосферного изменяется и интенсивность, и время жизни ЗФ красителей (рис. 2, кривые 1 и 2). В клетках содержится кислород, который свободно диффундирует в жидкой среде. В результате фотосенсибилизированного возбуждения образуется синглетный ’Дж(02) кислород. В начальный момент времени концентрация

*Д „ (02) кислорода равна нулю и регистрируется только ТЗФ. Затем получает развитие синглет-триплетная Т-Аг(02) аннигиляция и сигнал ЗФ нарастает в течение некоторого времени, придавая кинетической кривой характерный вид с участком «разгорания». При этом кинетика ЗФ молекул-зондов в клетках, выделенных из опухоли и нормальной ткани молочной железы, различна. Время жизни три-плетных состояний флуорофоров в клетках опухолевой ткани больше, чем в клетках нормальной ткани. Это указывает на то, что концентрация кислорода в опухолевой ткани меньше, чем в нормальной.

В отличие от ЗФ интенсивность фосфоресценции молекул с течением времени монотонно изменяется по амплитуде (рис. 3). Во всех исследованных нами патогенных клетках фосфоресценция тушилась слабее, чем в клетках, выделенных из нормальных тканей, а время жизни триплетных состояний молекул красителей в них оказалось больше. В разных образцах различие во временах жизни триплетных состояний неодинаково, но обнаруженная закономерность всегда сохраняется. В качестве примера на рисунке 3 показаны типичные фрагменты кинетики фосфоресценции эритрозина в образцах с нормальными и патогенными клетками.

Рис. 2. Фрагменты кинетики ЗФ эозина при атмосферном давлении: 1) в клетках опухоли; 2) в клетках нормальной ткани; 3) в биоматериале (диаметр капсулы опухоли 1 см). Сэр=10'3М.

Клетки биологических тканей относятся к объектам со специфической крайне неоднородной структурой. Эффективность фотопревращений, происходящих в молекулярных зондах внутри клеток, определяется составом внутриклеточных структур, строением клеточных мембран и др. Все эти факторы, так или иначе, сказываются на кинетике длительной люминесценции молекулярных зондов. Однако анализ зависимости кинетики ЗФ и фосфоресценции ксантено-

Рис. 3. Фрагменты кинетики фосфоресценции эритрозина: 1) в клетках нормальной ткани; 2) в клетках опухоли.

вых красителей от давления воздуха над поверхностью образцов, позволяет сделать вывод о том, что основным каналом релаксации возбужденных триплетных состояний экзогенных флуорофоров в клетках, выделенных из биотканей, при нормальных условиях является безызлучательный перенос энергии на молекулярный кислород. Кинетика длительной люминесценции молекулярных зондов в клетках при этом определяется эффективностью конкурирующих процессов синглет-триплетной 'Ag(02) - Т аннигиляции, ТЗФ и фосфоресценции.

В четвертой главе описано влияние различных факторов на характер длительной люминесценции органических красителей в клетках биотканей.

В первом параграфе главы приведены результаты исследования кинетики ЗФ ксантеновых красителей в клетках, выделенных из пораженных тканей на разных стадиях развития патологического процесса.

На рисунке 4 показаны фрагменты кинетики ЗФ эритрозина в клетках, выделенных из капсул двух опухолей диаметрами 1 и 3.5 см при атмосферном давлении в камере с образцами. Видно, что характер кинетики ЗФ и длительность свечения различны. В клетках, выделенных из опухоли диаметром 1 см, интенсивность кривой уменьшается в 2 раза за время 5 ± 1 мкс, а в клетках, выделенных из опухоли диаметром 3,5 см за 7 ± 2 мкс.

Мы полагаем, что время жизни триплетных состояний экзогенных молекул-зондов во всех патогенных клетках одинаково. Однако количество самих патогенных клеток в опухолях различное. Во время капсулообразования происходит разрастание опухолевой ткани рядом с окружающей здоровой тканью. В опухоли неизбежно содержатся как здоровые клетки, так и патогенные. На начальной стадии относительное количество патогенных клеток мало. В ходе увеличения опухоли их количество растет. Увеличение времени затухания ЗФ красителей в патогенных клетках по сравнению с клетками здоровой ткани указывает на гипоксию онкогенных клеток. Кроме того, на эффективность диффузионно-контролируемых процессов аннигиляции может оказывать влияние увеличение вязкости цитоплазмы в опухолевых клетках [6].

До сих пор мы анализировали изменения аннигиляционной составляющей кинетики ЗФ экзогенных флуорофоров. Теперь рассмотрим изменения кинетики ЗФ красителей в клетках на больших временах (от 0 до 400 мкс) (рис. 5). В таком масштабе форма начального участка кривой не разрешена. В диапазоне времен от 0 до 50 мкс интенсивность ЗФ определяется, в основном, бимолекулярными процессами: триплет-триплетной Т-Т и синглет-триплетной 7-1Дк(0;) аннигиляцией. Вклад таких процессов в общий сигнал подтверждается наличием нелинейного участка в кинетических кривых, построенных в полулогарифмических координатах. Скорость аннигиляционных процессов кан можно определить из зависимости 1/1(1). Величина кан определяется по тангенсу угла наклона линейного участка кинетических кривых согласно уравнению кап =каннНл(0, где кан - квазимономолекулярная константа скорости аннигиляции. В диапазоне времен от 50 до 150 мкс результирующая кривая представляет собой суперпозицию сигналов бимолекулярных процессов и ТЗФ. Поэтому, анализ характера ТЗФ молекул-зондов в различных клетках наиболее корректно проводить на временах, превышающих 150 мкс. В этом временном диапазоне наблюдается линейная зависимость логарифма интенсивности от времени.

С развитием патологии константа скорости ТЗФ красителей в клетках увеличивается. Так, при атмосферном давлении ктзФ эритрозина в клетках из опухоли диаметром 1 см, в среднем, составляет 0.95-104 с'1, а в клетках из опухоли диаметром 2 см - 0.52-104 с"1. Изменяется и чувствительность ТЗФ молекул-зондов к варьированию давления воздуха над поверхностью окрашенных клеток. При изменении давления воздуха от 150 мм.рт.ст. до 760 мм.рт.ст. кТЗФ в клетках из опухоли диаметром 2 см меняется, в среднем, на 6 %, тогда как в клетках из опухоли диаметром 1 см - на 11 %.

Уменьшение кТзФ с развитием патологии может быть обусловлено гипоксией опухолевых клеток и более быстрым потреблением кислорода в процессах метаболизма [7]. Подтверждением данного вывода служит сравнение кинетики ТЗФ в клетках патогенных и нормальных тканей. Кинетика ТЗФ зондов в клетках, выделенных из нормальной ткани молочной железы, более чувствительна к изменению давления, чем в клетках, выделенных из опухоли.

атмосферном давлении в клетках, выделенных из опухолей диаметром: 1) - 3,5 см; 2) - 1,0 см. Сэр=1(Г3М.

При проведении кинетических измерений большое значение имеет выбор исходной концентрации красителя. При малой концентрации (< 10"5 М) регистрируемый сигнал слишком слаб на фоне рассеянного света, и возрастает ошибка измерения. При концентрации выше 10'3М происходит образовании димеров и более крупных ассоциатов молекул, которые имеют отличный от мономеров коэффициент экстинкции на длине волны возбуждения и квантовый выход в триплетное состояние. Кроме того, имеет место элементарное экранирование возбуждающего излучения и перепо-глощение квантов ЗФ.

Образование ассоциатов ксантено-вых красителей в клетках биотканей нами исследовано по трансформации спектров возбуждения флуоресценции красителей. С увеличением исходной концентрации красителя максимум спектра возбуждения димеров (X = 490 нм) растёт. При этом изменяется соотношение между максимумами возбуждения флуоресценции мономеров (X — 530 нм) и димеров. Обнаружено, что при равной исходной концентрации красителей, образование ассоциатов в образцах с клетками их опухолей более эффективно, чем в клетках из здоровых тканей. Уже при концентрации красителя 5-10'3М в клетках из опухоли наблюдается почти полное исчезновение максимума возбуждения флуоресценции мономеров. Оптимальная концентрация для исследования кинетики длительной люминесценции в клетках биотканей -10’4 - 10"3 М.

Во втором параграфе четвертой главы показано, что при интерпретации результатов экспериментально регистрируемой кинетики длительной люминесценции молекул-зондов в клетках, необходимо учитывать время культивирования клеток на полимерной подложке. Как было отмечено выше, вклад в экспериментально регистрируемый сигнал ЗФ дают молекулы находящиеся как в клетках, так и в питательной среде, на которой они культивируются. В течение первых суток происходит распределение клеток по поверхности биоматериала. Клетки в это время находятся в лагфазе и адаптируются к новым условиям окружающей среды, распределяясь по поверхности материала.

На вторые сутки начинается активное деление клеток и рост их концен-трацш!. Клетки постепенно заполняют поверхность питательной среды, образуя фактически монослой. Концентрация клеток на поверхности биоматериала воз-

а)

б)

Рис. 5. Нормированные фрагменты кинетики ЗФ эритрозина в образцах с опухолевыми (1) и нормальными (2) клетками при давлении над образцами 0.3 атм. и 1 атм. Диаметр капсулы опухоли: а) -1 см, б) - 2 см. Сэр=10-'’ М.

растает, тем самым, увеличивается вклад в общий регистрируемый сигнал от молекул красителей, находящихся в них. Диффузионная составляющая в общем сигнале при этом растет, что и приводит к трансформации кинетики ЗФ на коротких временах. Значение ктзФ в клетках при нормальных условиях почти вдвое больше, чем в биоматериале из-за большей доступности молекул-зондов для кислорода, поэтому и на больших временах наблюдается сокращение излу-чательного времени жизни. Все эти особенности нами были учтены при интерпретации вышеизложенных результатов.

Во время культивирования клеток всегда существует риск бактериального загрязнения культуры, даже при соблюдении стерильных условий. Поэтому данная работа была бы незавершенной без исследования влияния бактерий на спектральные и спектрально-кинетические свойства молекулярных зондов в клеточных культурах. Результаты таких исследований изложены в третьем параграфе четвёртой главы. Взаимодействие ксантеновых и акридиновых красителей с бактериями нами исследовано методами стационарной спектрофлуори-метрии и лазерного флэш-фотолиза.

При повышении давления воздуха в камере с окрашенными бактериями от 150 мм.рт.ст. до атмосферного, происходит трансформация кинетики ЗФ ксантеновых красителей. Качественно, изменения кинетики ЗФ красителей в бактериях совпадают с изменениями в соматических клетках. С ростом концентрации кислорода в бактериальных клетках происходит увеличение аннигиляционной составляющей ЗФ, а интенсивность и длительность термоактивационного свечения уменьшаются. Как и в соматических клетках, в бактериях имеет место процесс синглет-триплетной и триплет-триплетной аннигиляции. Поэтому, при интерпретации результатов измерения кинетики длительной люминесценции молекул-зондов в клетках биотканей необходимо предварительно протестировать культуру клеток на бактериальное загрязнение.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ:

1. Основным каналом релаксации возбужденных триплетных состояний экзогенных молекулярных зондов в клетках, выделенных из тканей животных, при нормальных условиях является безызлучательный перенос энергии на молекулярный кислород. Излучательное время жизни триплетных зондов в он-когенных клетках больше, чем в нормальных клетках. В разных образцах различия составляют от 20 до 50 %. В клетках, выделенных из капсул злокачественных опухолей, эффективность генерации синглетного кислорода ниже, чем в нормальных клетках. Это обусловлено гипоксией онкогенных клеток и повышенным расходом кислорода в них в ходе метаболических процессов.

2. В кинетике ЗФ ксантеновых красителей в клетках биологических тканей, культивируемых на поверхности твердой питательной среды «Гиамат-рикс», качественно прослеживаются основные закономерности, присущие кинетике длительной люминесценции органических молекул в кислородсодержащих средах. Время жизни триплетных состояний экзогенных зондов в клетках, выделенных их биологических тканей, при нормальных условиях, зависит от эффективности протекания взаимосвязанных и конкурирующих между собой процессов их тушения молекулярным кислородом, триплет-триплетной аннигиля-

ции, межмолекулярной синглет-триплетной \(Ог)-Т, аннигиляции, внутримолекулярной излучательной и безызлучательной релаксации. Доминирующий канал энергообмена с окружением в ходе дезактивации 7>состояний предопределяет характер кинетики послесвечения зондов. На коротких временах (до 50 мкс) основной вклад в кинетику длительной люминесценции вносят бимолекулярные реакции (триплет-триплетная и синглет-триплетная аннигиляция), а на больших временах (более 150 мкс)- внутримолекулярная излучательная релаксация.

3. Кинетика длительной люминесценции молекул органических красителей в полимерной пленке «Гиаматрикс» не зависит от давления воздуха над поверхностью пленки и удовлетворительно описывается экспоненциальной функцией. Особенности кинетики люминесценции молекул-зондов в клетках, выделенных из злокачественных опухолей молочной железы мышей линии BYRB и нормальных тканей этих же животных, различны, и зависят от стадии развития опухоли. Увеличение диаметра опухоли от 1 до 3.5 см приводит к уменьшению ктзФ на 50% в случае измерений при атмосферном давлении.

4. Кинетика длительной люминесценции органических красителей в бактериальных и соматических клетках при нормальных условиях имеет качественно схожий характер и определяется соотношением интенсивностей термостимулированного свечения и бимолекулярной аннигиляционной флуоресценции.

5. При интерпретации результатов экспериментально регистрируемой кинетики длительной люминесценции молекул-зондов в клетках, необходимо учитывать время культивирования клеток биотканей на полимерной подложке. Фазе активного деления клеток предшествует период адаптации к условиям окружающей среды и распределения клеток по поверхности материала. Повышение концентрации клеток сопровождается трансформацией кинетики ЗФ, обусловленной увеличением скорости бимолекулярной аннигиляционной флуоресценции кан в регистрируемом сигнале.

Основные материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Летута С.Н., Маряхина B.C.. Рахматуллин P.P., Забиров P.A. Способ получения жизнеспособных клеток молочной железы. Патент №2409664 от 20.01.2011. Приоритет 29.04.2009. Опубл. БИ№1.

2. Маряхина B.C.. Летута С.Н., Рахматуллин P.P., Забиров P.A. Способ культивирования клеток. Патент №2418067 от 10.05.2011. Приоритет от 03.12.2009. Опубл. БИ №13.

3. Летута С.Н., Маряхина B.C.. Пашкевич С.Н., Рахматуллин P.P. Длительная люминесценция органических красителей в клетках биологических тканей// Оптика и спектроскопия.- 2011.- Т. 110.- №1,- с. 72-75.

4. Летута С.Н., Маряхина B.C.. Пашкевич С.Н., Рахматуллин P.P. Кинетика длительной люминесценции молекулярных зондов в клетках биологических тканей// Вестник Оренбургского государственного университета.- 2011.-№1.-с. 182-186.

5. Letuta S.N., Marvakhina V.S. The delayed fluorescence kinetics as a method of biological tissue diagnostics. SPIE.- 2010,- Vol. 7999, doi:10.1117/12.887433

6. Летута C.H., Маряхина B.C.. Рахматуллин P.P. Оптическая диагностика клеток биологических тканей в процессе их культивирования в полимерных средах//Квантовая электроника.- 2011.-Т.41- №4.-с. 314-317.

7. Маряхина B.C. Флуоресцентная диагностика рака молочной железы// Труды 52-й научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук». Часть IV. Молекулярная и биологическая физика. Том 1,- М: МФТИ, 2009, с. 35-37.

8. Letuta S.N., Marvakhina V.S. Fluorescence diagnostics of biological tissues// IV Russian-Japanese Seminar «Molecular and Biophysical magnetoscience SMBM». Orenburg.- 2009.- p.ll.

9. Маряхина B.C. Флуоресцентная диагностика биологических тканей// Труды IX международной конференции ИБХФ PAH-ВУЗы «Биохимическая физика». - М: ИБХФ, 2009, с. 25-26.

10. Letuta S., Marvakhina У. The delayed fluorescence kinetics is method of diagnostics of biological tissue// International conference «Laser applications in life science», 9-11 June 2010.- Finland, Oulu.- p.230.

11. Marvakhina V.S. Fluorescence diagnostics of biological tissues// Труды Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2010» / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев, А.В. Андриянов. [Электронный ресурс] — М.: МАКС Пресс, 2010. — 1 электрон, опт. диск (CD-ROM); 12 см. 12-14 апреля 2010 г.

12. Маряхина B.C. Флуоресцентная диагностика рака молочной железы// Труды Всероссийской молодежной научной конференции ВНКСФ-16, 2629 апреля 2010 г. Волгоград, с. 414-415.

13. Летута С.Н., Маряхина B.C. Кинетика замедленной флуоресценции как метод диагностики рака молочной железы// Труды VI Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии» (БФФХ-2010). 26-30 апреля 2010 г. Севастополь.- Т. 2. Биофизика и биофизическая медицина, с. 222-223.

14. Marvakhina V.S.. Pashkevich S.N., Rakhmatullin R.R., Letuta S.N. Delayed fluorescence of molecular probes in cells of biological tissues// V Russian-Japanese Seminar «Molecular and Biophysical magnetoscience (SMBM)».- September 15-17,2010.- Orenburg, Russia, p. 68

15. Маряхина B.C.. Рахматуллин P.P. Новый биоматериал «Гиамат-рикс»: особенности структуры и физико-химических свойств// Труды X международной конференции ИБХФ PAH-ВУЗы «Биохимическая физика».- М: ИБХФ, 2010, с. 45-46.

16. Маряхина B.C.. Рахматуллин P.P. Новый биоматериал «Гиамат-рикс»: структура и физико-химические свойства// Труды 53-й научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», 2010, с. 17-18

17. Маряхина B.C.. Гуньков В.В. Математическое моделирование процессов взаимодействия флуоресцентных зондов с клетками биологических тка-

ней// Труды 53-й научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», 2010, с. 102-104.

18. Летута С.Н., Маряхина B.C. Флуоресцентная диагностика биологических тканей// Труды Всероссийской научно-практической конференции. "Многопрофильный университет как региональный центр образования и науки". Оренбург: ОГУ, 20-22 мая 2009. - с. 2290-2291.

19. Маряхина B.C.. Летута С.Н, Рахматуллин P.P. Биоматериал «Гиа-матрикс»: структура, свойства и медицинское применение// Труды Международной школы-конференции «Биофизика сложных систем. Анализ и моделирование». 24-29 января 2011, Пущино, с. 106.

20. Marvakhina V.S.. Letuta S.N. The delayed fluorescence kinetics as diagnostic method of biological tissue// 14th International School for Young Scientist and Student on Optics, Laser Physics & Biophysics SFM-2010, Saratov, 2010. http://optics.sgu.ru/SFM/2010/report/l 105.

21. Marvakhina V.S.. Letuta S.N. Optical diagnostics of biotissue cells cultivated in polymer mediums// III International symposium «Topical problems of bio-photonics-2011».- St.- Peterburg - Nizhny Novgorod, Russia, 2011.- P. 79-80.

22. Marvakhina V.S.. Letuta S.N. Features of the influence of cell oxygen status to delayed fluorescence of xanthene dyes// 15th International School for Young Scientist and Student on Optics, Laser Physics & Biophysics SFM-2011, Saratov, 2011. http://sfm.eventry.org/report/16.

Цитируемая литература:

1. Оптическая биомедицинская диагностика. В 2 т. Т. 2/ Пер. с англ. Под ред. Тучина В.В..- М.: Физматлит. 2007.- 368 с.

2. Donchenko V.A., Zemlyanov А.А., Kirienko V.V., Krasilov M.N., Pa-namorev N.S. A decrease in the superluminescence threshold of composites of an organic dye with nanoparticles. Russian physics journal.- 2008.- Vol.51.- № 9.- p. 9651003.

3. Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М.: Мир.- 1972,- 504 с.

4. Кучеренко М.Г., Кецле Г.А., Мельник М.П., Летута С.Н. Изменение кинетики аннигиляционной люминесценции красителей в полимерах под действием лазерного импульса// Оптика и спектроскопия- 1995.- Т.78.- с. 649.

5. Горенков Р.В., Карпов В.Н., Рогаткин Д.А., Шумский В.И. Хроническая гипоксия как один из факторов повышенной флуоресценции эндогенных порфиринов в живых биологических тканях// Биофизика - 2007.- Т.52.- с. 711714.

6. Casciari J.J., Sotirchos S.V. and Sutherland R. M. Variations in tumor cell growth rates and metabolism with oxygen concentration, glucose concentration, and extracellular pH// Journal of Cellular Physiology.- 1992,- Vol. 151.- p. 386-394.

7. Зайко H.H., Быць Ю.В., Атаман A.B. Патологическая физиология. К: Логос,- 1996.- 350 с.

Маряхина Валерия Сергеевна

ДЛИТЕЛЬНАЯ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КРАСИТЕЛЕЙ В КЛЕТКАХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

01.04.05 - Оптика

Отпечатано в типографии «Экспресс-печать»

о.г.р.н.и.п. 310565817900152

Формат 60x84 '/8 Бумага офисная. Уел. печ. л .1,1 Тираж 100 экз. Заказ 218. г. Оренбург, ул. Пролетарская, 30.

Тел. (3532) 25-20-02, (3532) 23-58-41

Текст научной работы диссертации и автореферата по физике, кандидата физико-математических наук, Маряхина, Валерия Сергеевна, Ульяновск

61 12-1/648

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет»

На правах рукописи

Маряхина Валерия Сергеевна

ДЛИТЕЛЬНАЯ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КРАСИТЕЛЕЙ В КЛЕТКАХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ

Специальность 01.04.05 - оптика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель Летута Сергей Николаевич д.ф.-м.н., профессор

Ульяновск - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОПТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР............................................................................................12

1.1 Оптические методы диагностики биологических клеток и тканей. 12

1.2 Физико-химические механизмы взаимодействия низкоинтенсивного лазерного излучения с биотканями.....................................................25

ГЛАВА 2 МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................34

2.1. Установка для измерения кинетики затухания длительной люминесценции молекул.....................................................................34

2.2. Флуориметрические измерения. Микроскопия.................................41

2.2.1. Спектрофлуориметрия..........................................................................41

2.2.2 Атомно-силовой микроскоп.................................................................43

2.3 Объекты исследования и методика приготовления образцов..........46

ГЛАВА 3. КИНЕТИКА ДЛИТЕЛЬНОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

МОЛЕКУЛЯРНЫХ ЗОНДОВ В КЛЕТКАХ БИОТКАНЕЙ............59

3.1. Кинетика длительной люминесценции молекул...............................61

3.2. Культивирование клеток в полимерных средах на основе гиалуроновой кислоты.........................................................................70

3.3. Кинетика длительной люминесценции эндогенных зондов в клетках нормальных и патогенных биотканей................................................84

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА КИНЕТИКУ ЗАМЕДЛЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ КРАСИТЕЛЕЙ..................94

4.1. Зависимость кинетики длительной люминесценции красителей в опухолевых и здоровых клетках от концентрации кислорода........95

4.2. Зависимость кинетики длительной люминесценции молекулярных зондов от времени культивирования клеток....................................113

4.3. Бактериальное загрязнение культуры клеток и его влияние на спектрально-кинетические измерения.............................................120

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ:.....................................................128

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................130

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...........................................132

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Оптические методы диагностики нашли практическое применение в биологии и медицине, в т.ч. для разработки методов диагностики биотканей. В биологии и медицине наибольшее распространение получили: аутофлуоресцентная диагностика, оптическая когерентная томография, спектроскопия диффузного отражения, флуориметрия [1,2]. Эти методы диагностики основаны на способности некоторых химических соединений (как органических, так и неорганических) селективно накапливаться в патологических тканях. Повышение концентрации флуоресцирующих веществ (эндогенных флуорофоров) в отдельных участках ткани нетрудно зафиксировать экспериментально. Благодаря неинвазивности и высокой чувствительности по отношению к патологии, флуоресцентная диагностика (ФД) получает все более широкое распространение.

Для оптической диагностики, как культур клеток, так и тканей, используют и экзогенные флуорофоры - синтетические красители или

различные фотосенсибилизаторы [2]. Метод ФД может быть основан на регистрации спектров поглощения и быстрой флуоресценции флуорофоров, или кинетики их замедленной флуоресценции (ЗФ), При регистрации спектров флуоресценции молекул результаты исследований зависят от интенсивности источника света, анизотропии рассеяния и многих других факторов [4]. В случае регистрации кинетики длительной люминесценции этих недостатков можно избежать.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

Разработать технологию подготовки образцов с клетками биологических тканей для оптических измерений.

Установить особенности ЗФ и фосфоресценции молекулярных зондов в опухолевых и нормальных клетках;

Изучить закономерности длительной люминесценции молекул органических красителей в бактериальных клетках;

Выявить основополагающие процессы с участием триплетных состояний молекул-зондов, влияющих на формирование сигнала длительной люминесценции в образцах с опухолевыми и нормальными клетками.

Установить основные факторы, влияющие на длительную люминесценцию органических люминофоров, локализованных в клетках биотканей.

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующем:

1. Исследована кинетика ЗФ и фосфоресценции экзогенных флуорофоров в соматических и бактериальных клетках, культивируемых на поверхности твердой питательной среды - биоматериале «Гиаматрикс». Показано, что при нормальных условиях в клетках доминирующим процессом, определяющим характер длительной люминесценции ксантеновых красителей, является тушение их триплетных состояний

молекулярным кислородом с образованием синглетного 1А8(02)

кислорода и последующей синглет-триплетной аннигиляцией.

2. Обнаружены различия в кинетике фотопроцессов с участием триплетных состояний молекул-зондов в клетках нормальных и патогенных тканей. Достоверно регистрируемые различия в кинетике затухания ЗФ и фосфоресценции ксантеновых красителей предложено использовать для разработки альтернативного метода диагностики биотканей, основанного на регистрации излучательного времени жизни экзогенных флуорофоров.

кинетических измерений следует учитывать вклад в общий сигнал от флуорофоров, локализованных в бактериальных клетках. 4. Обнаружена зависимость кинетики длительной люминесценции молекулярных зондов от стадии развития патологического процесса. Установлено, что время жизни ЗФ экзогенных зондов в клетках на ранней стадии развития опухоли короче, чем на поздней стадии. Это объясняется гипоксией онкогенных клеток.

Практическая значимость диссертации состоит в следующем:

2. Разработана технология подготовки клеток биотканей для оптических измерений (Патент №2418067 от 10.05.2011. Приоритет от 03.12.2009. Опубл. БИ № 13, Патент №2409664 от 20.01.2011. Приоритет 29.04.2009. Опубл. БИ№ 1).

молекул в конденсированных средах. Личный вклад автора.

В основу диссертации положены результаты научных исследований, проведенных автором в 2007-2011 годах. Автором лично разработан способ приготовления образцов для исследования, проведены измерения спектров люминесценции, кинетики ЗФ и фосфоресценции образцов, предложена модель и выполнена математическая обработка результатов. Постановка задачи осуществлялась совместно с научным руководителем, профессором С.Н. Летута.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основным каналом релаксации возбужденных триплетных состояний молекул ксантеновых красителей (экзогенных молекулярных зондов) в клетках, выделенных из биотканей, при нормальных условиях является безызлучательный перенос энергии на молекулярный кислород. Кинетика длительной люминесценции молекулярных зондов в клетках при нормальных условиях определяется эффективностью

конкурирующих процессов синглет-триплетной 'А 8{Ог)-Т

аннигиляции, термостимулированной замедленной флуоресценции (ТЗФ) и фосфоресценции.

3. Кинетика ЗФ и фосфоресценции молекул-зондов в клетках, выделенных из злокачественных опухолей и нормальных тканей, различна и зависит

от стадии развития опухоли. Излучательное время жизни триплетных зондов в онкогенных клетках больше, чем в нормальных клетках. В клетках, выделенных из капсул злокачественных опухолей, эффективность генерации синглетного кислорода ниже, чем в нормальных клетках.

4. Кинетика длительной люминесценции молекул красителей связанных с бактериями E-coli при нормальных условиях определяется соотношением интенсивностей термостимулированного свечения, синглет-триплетной аннигиляционной флуоресценции и фосфоресценции.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на следующих научных

конференциях:

1. 14th International School for Young Scientist and Student on Optics, Laser Physics & Biophysics SFM-2010, Saratov, 2010.

2. 52-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», Москва, 2009.

3. 53-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», Москва, 2010.

4. Всероссийская научно-практической конференция "Многопрофильный университет как региональный центр образования и науки". Оренбург, 2009.

5. IV Russian-Japanese Seminar «Molecular and Biophysical magnetoscience MBMS». Orenburg, 2009.

6. IX международная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». Москва, 2009.

7. International conference «Laser applications in life science LALS-2010», Finland, Oulu, 2010.

8. Международный молодежный научный форум «ЛОМОНОСОВ-2010», Москва, 2010.

9. Всероссийская молодежная научная конференция ВНКСФ-16, Волгоград, 2010.

10. VI Международная научно-техническая конференция «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии» (БФФХ-2010), Севастополь, 2010.

11. V Russian-Japanese Seminar «Molecular and Biophysical magnetoscience (SMBM)», Orenburg, 2010.

12. X международной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 2010.

13. Международная школа-конференция «Биофизика сложных систем. Анализ и моделирование», Пущино, 2011.

14. Ill International symposium «Topical problems of biophotonics-2011» St.-Peterburg - Nizhny Novgorod, Russia, 2011.

15. 15th International School for Young Scientist and Student on Optics, Laser Physics & Biophysics SFM-2011, Saratov, 2011.

Публикации

По теме диссертационной работы имеется 22 публикации, из них 2 патента, 4 публикации в реферируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ при защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук по тематике работы, 3 статьи в сборниках материалов международных конференций и 13 тезисов докладов общероссийских и международных конференций.

Структура работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы. Объем диссертации составляет 154 страницы, включая 45 рисунков, 9 таблиц и список литературы, состоящий из 196 источников.

ГЛАВА 1. ОПТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ

СТРУКТУР

1.1 Оптические методы диагностики биологических клеток и

тканей

Флуоресцентная диагностика (ФД) - это метод диагностики, в основу которого положены различия спектральных свойств эндогенных или экзогенных флуорофоров в различных участках биологических тканей. В основе метода лежит способность некоторых химических соединений (как органических, так и неорганических) селективно накапливаться в патогенных клетках биотканей. Повышение концентрации флуоресцирующих веществ в отдельных участках ткани не трудно зафиксировать экспериментально, что позволяет уже на ранней стадии обнаруживать возникающую патологию. Метод получил широкое распространение благодаря неинвазивности и высокой чувствительности по отношению к патологии.

Часть веществ, используемых в качестве зондов, при облучении могут выступать в роли фотосенсибилизаторов (ФС), повышая чувствительность организма к действию света. Молекулы этих веществ, поглощая энергию фотонов, переходят в возбужденное состояние. Затем они передают поглощенную энергию молекулам кислорода или других веществ. В результате образуются соединения, повреждающие ткани. На этом явлении основана фотодинамическая терапия (ФДТ) - метод лечения, опухолевых заболеваний, включая онкологию, основанный на применении ФС. Сенсибилизатор вводится в организм чаще всего внутривенно, но может применяться аппликационно или перорально. Поглощение ФС квантов света в присутствии кислорода приводит к фотохимической реакции, в результате которой молекулярный триплетный кислород превращается в синглетный, а также образуется большое количество высокоактивных радикалов.

Синглетный кислород и радикалы вызывают гибель клеток. ФДТ также приводит к нарушению питания и гибели опухоли за счёт повреждения её микрососудов.

Отношение концентраций ФС в опухолевых и здоровых тканях зависит от свойств самого ФС и варьируется от 2:1 до 10:1 [5,6].

Большинство лазероиндуцированных процессов в биологических тканях связано с содержанием в клетках эндогенных или экзогенных флуорофоров [7]. Наибольший интерес для ФД и фотодинамической терапии (ФДТ) представляют процессы, происходящие с участием экзогенных ФС. К ним предъявляется следующие требования [8-10]:

высокая селективность накопления в злокачественных клетках и тканях; высокий квантовый выход флуоресценции; быстрое выведение из организма;

отсутствие побочных эффектов на ткани и на организм в целом; низкий квантовый выход фотоиндуцированной генерации синглетного кислорода.

Наиболее распространёнными ФС являются производные порфирина: Фотогем [11-12], Фотосенс [8,9,13,14], Фотофрин [15], Фотолон [16,17], Аласенс [13,18-22], Хлорин е6 [16,22,24], Гематопорфирин [9,10,25], Радахлорин [6,26,27], Фотодитазин [6,11,26-28]. Поиск новых ФС ведется непрерывно. Так, в работах [29-34] в качестве ФС предложено использовать 4-диметиламинохалкон.

По механизму переноса энергии ФС подразделяются на два типа:

ФС I. Такие реакции происходят с переносом электрона и протона по радикальному механизму и мало зависят от присутствия кислорода. Схематично это можно представить следующим образом:

Sens* + X —► Sens'" + Х*+ Sens'"+ 02 Sens + 02'" [32];

ФС II, сильно зависящие от присутствия кислорода. Передача энергии происходит согласно механизму, приведённому на рис. 1.1. В данном случае имеет место процесс тушения триплетных состояний ФС кислородом. Такой механизм актуален для ФС с высоким выходом в триплетное сост