Новые флюоресцентные порфиразиновые свободные основания и металлокомплексы для применения в фотонике и биофотонике тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

ЛЕРМОНТОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСЕЕВНА

НОВЫЕ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЕ ПОРФИРАЗИНОВЫЕ СВОБОДНЫЕ ОСНОВАНИЯ И МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ФОТОНИКЕ И БИОФОТОНИКЕ

02.00.03 - Органическая химия 02.00.04 - Физическая химия (химические науки)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 3 0КГ 2014

Нижний Новгород - 2014

005553637

005553637

Работа выполнена в лаборатории кремнийорганических соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук» Научные руководители: кандидат химических наук, старший научный

сотрудник ФГБУН «Институт

металлоорганической химии им. Г. А. Разуваева» РАН, Нижний Новгород

Клапшина Лариса Григорьевна доктор химических наук, член — корреспондент РАН Домрачев Георгий Алексеевич Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, главный

научный сотрудник, заведующий лабораторией химической кинетики кафедры химической кинетики, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Москва

Мельников Михаил Яковлевич доктор химических наук, профессор, Институт химии Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург

Боярский Вадим Павлович Ведущая организация: ФГБУН «Институт прикладной физики

Российской академии наук», Нижний Новгород Защита состоится «28» ноября 2014 года в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.05 по химическим наукам при ФГАОУ ВО «Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского» по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23, корп. 2. С диссертацией можно ознакомиться на сайте http://diss.unn.ru/401 и в библиотеке ФГАОУ ВО «Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского».

Автореферат разослан «22» октября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.х.н.

Замышляева О.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность и степень разработанности темы исследования.

Тетрапиррольные красители занимают центральное место в современной органической и биоорганической химии. В течение многих лет они продолжают находиться в фокусе множества междисциплинарных исследований. Повышенный интерес к этому обширному классу красителей связан с особенностями макроциклической ароматической системы, определяющими их уникальные фотофизические, электрохимические и фотохимические свойства. Это в свою очередь обусловило постоянный высокий интерес к этим соединениям с точки зрения их эффективных приложений в разнообразных новейших технологиях, в частности, для создания оптических, оптоэлектронных, фотовольтаических и сенсорных устройств. Многие из тетрапиррольных красителей нашли широкое применение в биомедицине, поскольку они часто обладают яркой флюоресценцией и способны избирательно накапливаться в раковой опухоли, обеспечивая тем самым возможность ее детектирования. Кроме того, под действием света с подходящей длиной волны они способны продуцировать синглетный кислород, который вызывает гибель раковых клеток. Эта концепция лежит в основе фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний. Для повышения эффективности и избирательности воздействия важно, чтобы полосы поглощения фотосенсибилизатора и собственных хромофоров живой ткани перекрывались как можно меньше. Указанному требованию как нельзя лучше отвечают многие порфириновые и тетраазапорфириновые (порфиразиновые) макроциклы и их металлокомплексы, демонстрирующие сильное поглощение и люминесценцию в красной и ближней инфракрасной областях спектра, соответствующих оптическому «окну» относительной прозрачности биоткани.

Ранее научной группой под руководством Клапшиной Л.Г. был разработан новый синтетический подход, позволивший в мягких условиях осуществить темплатную сборку порфиразинового макроцикла, используя молекулы тетрацианоэтилена и трициановинилбензола в качестве его структурных элементов. Этот подход впервые позволил получить октацианопорфиразиновый макроцикл, сконструированный из молекул тетрацианоэтилена, имеющий 8

электроноакцепторных СЫ - групп в периферийном обрамлении макроцикла. Данная диссертационная работа была призвана продемонстрировать широту возможностей разработанного ранее синтетического подхода, позволяющего варьировать периферийное обрамление макроцикла, используя в качестве его структурных единиц разнообразные арильные производные тетрацианоэтилена. Актуальность этой задачи определяется тем, что варьирование периферийного обрамления в значительной степени влияет на фотофизические, фотохимические и электрохимические свойства макроциклов и, помимо развития новых фундаментальных знаний о свойствах тетрапиррольных макроциклов, позволяет также осуществлять подбор их характеристик для конкретных практических приложений.

В данной работе осуществлен синтез серии новых флюоресцентных порфиразиновых хромофоров в виде металлокомплексов и свободных оснований, содержащих в периферийном обрамлении макроцикла циано- и разнообразные ароматические группы. Уникальной для соединений порфиразинового ряда особенностью полученных нами красителей является сочетание их высокой фотодинамической активности с необычно сильной вязкостной чувствительностью флюоресцентных параметров (квантового выхода и времени жизни флюоресценции). Это открывает возможность использовать полученные макроциклы не только как агенты ФДТ, но и в необычном для этого класса соединений качестве зондов локальной вязкости. Проведенные в данной диссертационной работе исследования показали, что новые флюоресцентные тетрапиррольныве соединения и светоизлучающие наноструктурированные полимерные материалы на их основе очень перспективны для применения в медицине в качестве агентов оптической тераностики (т.е. одновременно для целей терапии и диагностики онкологических заболеваний), а также в технологиях фотоники, связанных с преобразованием солнечной энергии.

Диссертационная работа была выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России

на 2009-2013 годы» - соглашение № 14.132.21.1673 и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№13-04-92612_КС)-а, №14-02-00753 А, № 13-02-97114 р_поволжье_а, № 12-03-31489 мол_а, № 14-0331130 мол а).

Цель и задачи работы. Цель данной диссертационной работы - получение новых порфиразиновых красителей, а также проведение расширенных междисциплинарных исследований с целью тестирования полученных соединений в качестве новых материалов для современных технологий фотоники и биомедицины.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

• синтез серии новых тетраарилтетрацианопорфиразиновых хромофоров в виде их металлокомплексов и свободных оснований методом темплатной сборки из молекул разнообразных арилтрицианоэтиленов в качестве структурных единиц макроцикла. Получение водорастворимых биосовместимых форм синтезированных соединений;

• разработка малодефектных оптических полимерных стекол, допированных флюоресцентными тетраарилтетрацианопорфиразиновыми комплексами иттербия, перспективных для использования в люминесцентных солнечных концентраторах;

• изучение фотофизических свойств (квантовый выход и время жизни флюоресценции) серии новых порфиразиновых хромофоров. Определение количественных соотношений между параметрами флюоресценции и вязкостью среды. Доказательство принадлежности полученных флюорофоров к классу флюоресцентных молекулярных роторов;

• оценка новых порфиразиновых красителей как потенциальных фотосенсибилизаторов генерирования синглетного кислорода. Детектирование синглетного кислорода методом время-разрешенной лазерной спектроскопии.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые получен ряд новых флюоресцентных тетраарилтетрацианопорфиразиновых хромофоров в виде

металлокомплексов и свободных оснований с уникальным комплексом фотофизических свойств. Нами впервые показано, что порфиразиновые макроциклы обладают свойствами флюоресцентных молекулярных роторов, т.е. соединений, демонстрирующих высокую вязкостную чувствительность флюоресцентных характеристик (квантового выхода и времени жизни). Важно, что такое уникальное для макроциклов порфиразинового ряда свойство сочетается с высокой фотодинамической активностью, т.е. способностью генерировать синглетный кислород при фотовозбуждении. К настоящему времени аналогичный комплекс фотофизических свойств известен для единственного тетрапиррольного красителя, порфиринового димера сложного строения, содержащего этиниленовые мостики между порфириновыми макроциклами [M.Kuimova et al, Nature Chemistry, 2009,1, 69]. Однако, это соединение малодоступно для широких исследований и возможных практических приложений вследствие высокой сложности его получения и ничтожных выходов синтеза. Важнейшим преимуществом полученных в настоящей работе порфиразиновых фотосенсибилизаторов-роторов является простота их получения, мягкость условий синтеза, а также высокий выход целевых продуктов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Новая серия уникальных макроциклических хромофоров порфиразинового ряда, обладающих свойствами флюоресцентных молекулярных роторов, представляет исключительный интерес в плане развития фундаментальной химии макроциклических соединений, а также фундаментальной и прикладной биомедицины. Высокая вязкостная чувствительность флюоресцентных параметров, которую можно оценить количественно с помощью простых математических уравнений, позволяет, в принципе, проводить измерения локальной вязкости, в том числе, и внутриклеточной. Вязкость является одним из основных параметров, определяющих скорость диффузионных процессов, а, следовательно, и скорость бимолекулярных реакций. Она играет важную роль в таких клеточных процессах, как передача сигналов, массоперенос, включая

направленную доставку соединений, обладающих физиологической активностью. Медицинские исследования показали зависимость между изменениями внутриклеточной вязкости и широким кругом заболеваний.

Кроме того, в последнее время стало известно, что фотодинамическое воздействие на клетки также сопровождается нарастанием внутриклеточной вязкости. Таким образом, полученные нами соединения, сочетающие свойства флюоресцентных молекулярных роторов с фотодинамической активностью могут позволить не только осуществлять флюоресцентную диагностику и фотодинамическую терапию онкологических заболеваний, но, в перспективе, обеспечить возможность контролировать фотодинамическое воздействие в режиме реального времени по изменению внутриклеточной вязкости. Таким образом, полученные соединения перспективны для создания новых технологий оптической тераностики.

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах. Объекты исследования. Серия новых тетраарилтетрацианопорфиразиновых хромофоров в виде меташюкомплексов и свободных оснований. Степень достоверности полученных результатов. Структура и состав всех синтезированных в работе соединений подтверждены современными методами физико-химического анализа: ИК-, ЯМР- спектроскопия, РСА, ЕБАХ, МАЬВ1. Апробация работы. Полученные результаты представлены на XVI, XVII сессиях нижегородских молодых ученых, Естественнонаучные дисциплины (Нижний Новгород, 2011, 2012), XXV Международной Чугаевской конференции по координационной химии (Суздаль, 2011), Третьей всероссийской школе-конференции для молодых ученых «Макромолекулярные нанообъекты и полимерные нанокомпозиты» (Москва, 2011), 8-ой Санкт-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2012).

Личный вклад автора. Анализ литературных данных и экспериментальная часть работы, связанная с синтезом и анализом всех полученных соединений, а также с исследованием их спектральных характеристик и вязкостной

чувствительности флюоресценции методами стационарной спектроскопии и спектрофлюорометрии получены лично автором. Постановка задач, обсуждение и интерпретация результатов, а также подготовка публикаций проводилась совместно с руководителями работы. Поскольку решение задач, связанных с возможными практическими приложениями разработанных в настоящем исследовании уникальных материалов, требовало междисциплинарных подходов, к работе были привлечены специалисты в области биологии и фотофизики. Личный вклад автора в этой части работы заключался в непосредственном участии на всех этапах экспериментов - от подготовки образцов до обсуждения и оформления полученных результатов в виде публикаций.

Изготовление лабораторной модели ЛСК осуществлялось на предприятии НПП «Репер-НН» под руководством В. М. Треушниковым. Измерения КПД устройств ЛСК-ФЭП проведены сотрудникам Нижегородского предприятия ООО «СОЛТЕК» A.M. Томчинским, В.А. Бастрыкиным и А.П. Мажириным. Полимерные щетки были получены в лаборатории проф. А.В. Якиманского, (Институт высокомолекулярных соединений РАН). Исследования методом время-разрешенной спектроскопии и методом флюоресцентного биоимиджинга в том числе, с функцией временного разрешения и использованием конфокального микроскопа (FLIM) осуществлялись совместно с научной группой Химического факультета Империал Колледжа (Лондон) под руководством доктора М. Куимовой. Исследования методом флуоресцентного биоимиджинга in vivo и методом конфокальной флуоресцентной микроскопии ex vivo проведены к.б.н И.В Балалаевой, Н.Ю. Шилягиной (Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского) и к.б.н. М. В. Ширмановой (Нижегородская государственная медицинская академия) Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых российских и иностранных научных журналах и 20 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, выводов, экспериментальной части и списка используемой литературы. Работа изложена на 164 страницах и включает 30 таблиц и 75 рисунков.

Соответствие диссертации паспорту специальности. Диссертационная работа по своим целям, задачам, содержанию, научной новизне и методам исследования соответствует п. 1,3 паспорта специальности 02.00.03 -Органическая химия и п. 10 паспорта специальности 02.00.04 - Физическая химия.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы актуальность темы и практическая значимость диссертационной работы, выбор объектов исследования, сформулированы основные цели и задачи.

Глава 1. Обзор литературы посвящен описанию строения, спектральных свойств и методов синтеза порфиразинов, а также рассмотрены порфиразиновые хромофоры как флуоресцентные маркеры и фотосенсибилизаторы для медицинской диагностики и фотодинамической терапии.

Глава 2. содержит описание и обсуждение результатов синтеза и исследования фотофизических свойств новых тетраарилтетрацианопорфиразиновых хромофоров в виде металлокомплексов и свободных оснований.

Получение ароматических производных тетрацианоэтилена Целью первого этапа исследований являлось получение ряда ароматических производных тетрацианоэтилена (рисунок 1) с тем, чтобы в дальнейшем использовать их в качестве стартовых соединений при темплатной сборке новых порфиразиновых макроциклов. Строение полученных соединений подтверждено ЯМР, ИК-спектроскопией и РСА.

H2CÍ < NH

-H20

,CN R

♦ KCN, HCI \ /

———- CH—CH

■KCI ✓ >

,CN R CN

— <=c

CN-o^jP NC'

R= Q

Рисунок 1 - Получение ароматических производных тетрацианоэтилена

Получение порфиразиноеых комплексов иттербия Для синтеза порфиразиновых металлокомплексов был использован разработанный ранее оригинальный синтетический подход, обеспечивающий одностадийное получение макроцикла в мягких условиях и с высоким выходом. [L.G. Klapshina et al Chemical Communications, 2007, 1942-1944.]

Металлокомплексы получены по реакции соответствующих ароматических производных тетрацианоэтиленов с бис(инденил) иттербием в вакууме при мольном соотношении реагентов 5:1 с образованием ярко окрашенных продуктов стабильных на воздухе, как в твердом виде, так и в растворе (рисунок 2).

F CH,

-хпоо хх

F F

I II III IV V VI VII

Рисунок 2 - Получение порфиразиновых комплексов иттербия

Полученные соединения, тщательно очищенные экстракцией толуолом, имеют типичные для порфиразиновых комплексов электронные спектры поглощения, содержащими полосу Соре и (^-полосу. Все полосы обладают

высокими молярными коэффициентами экстинкции (log s ~ 4), что типично для порфиразиновых красителей. Состав и строение полученных соединений подтверждены спектральными методами, элементным анализом и MALDI.

Изучение люминесцентных свойств порфиразиновых комплексов иттербия в полимерной матрице. Создание лабораторной модели люминесцентного

Отличительной особенностью полученных порфиразиновых комплексов иттербия является яркая люминесценция, которую они демонстрируют, будучи инкорпорированными в прозрачную полимерную матрицу. В частности, стекла на основе олигокарбонатдиметакрилата (ОКМ-2), допированные комплексом I показали сильную красную люминесценцию (630 нм) при возбуждении светом в диапазоне длин волн 530-600 нм. Наблюдаемый при этом сдвиг Стокса не превышает 30-35 нм, и время жизни возбужденного состояния, не превышающее 3-6 не, указывают на типичный для органических красителей флюоресцентный механизм эмиссии, когда реализуется излучательный переход из возбужденного синглетного (Б,) в основное синглетное состояние (Бо) макроциклического лиганда.

Квантовый выход фотолюминесценции такого стекла на длине волны 630 нм (Хех= 600 нм) составляет ~ 65%.

Нами были исследованы люминесцентные свойства комплексов 1-УП в матрице поликарбонатдиметакрилата. Для этой цели методом фотополимеризации были приготовлены тонкие пленки на основе ОКМ-2 (рисунок 3), допированные соединениями 1-УН (концентрация комплекса 0,5 масс.%).

солнечного концентратора на основе комплекса III

-V

О

Рисунок 3 -

Олигокарбонатдиметакрилат (ОКМ-2)

О

Замещение четырех фенильных групп в молекуле порфиразина на четыре moho-, три-, пентафторфенильные группы или на четыре Р-нафтильные, бифенильные, о-метилфенильные группы приводит к сдвигу максимума люминесценции в длинноволновую область (таблица 1).

Таблица 1 - Спектральные свойства порфиразиновых комплексов иттербия = 590 нм)

Комплекс I II III IV V VI VII

R Ph Nph 4-FPh F3Ph FsPh Ph-Ph o-CH3Ph

Максимум эмиссии 630 635 632 637 653 625 628

Q-полоса 598 615 601 606 618 613 600

Сдвиг Стокса 32 20 31 31 35 12 28

Интересно, что спектры эмиссии для комплексов И- VII по характеру мало отличаются от аналогичных спектров фенильного замещенного. Малый сдвиг Стокса, наблюдаемый в этих случаях, также свидетельствует о флуоресцентном механизме эмиссии за счет л—»я* перехода макроцикла из возбужденного синглетного состояния в основное.

Комплекс III, показавший в матрице полимера самую интенсивную эмиссию, был использован в качестве основного светоизлучающего компонента для создания лабораторной модели люминесцентного солнечного концентратора (JICK). JICK, представляет собой волновод в виде оптически прозрачного листа силикатного или органического стекла с инкорпорированным в нем люминесцентным органическим красителем. Последний эффективно поглощает свет на определенной длине волны и излучает его в материал волновода, направленно доставляющего переизлученную энергию на солнечные элементы, прикрепленные по торцам концентратора. Эффект концентрирования солнечного света создается за счет многократной разницы между площадью его сбора и площадью, на которую этот свет переизлучается [MJ Currie et al. Science. 2008. - V. 321. - P. 226-228].

На рисунке 4 приводится фотография модельного образца J1CK, изготовленного из фотоотверждаемого малодефектного органического стекла на основе поликарбонатдиметилметакрилата/уретанодиметакрилата, допированного комплексами III и Eu(BTFA)3-3H20.

Рисунок 4 - Модель одноуровневого ЛСК

1 - поверхностный люминесцентный слой, допированный III и Eu(BTFA)3-3H20.

2 - стандартные кремниевые солнечные элементы производства Нижегородского предприятия ООО «СОЛТЕК»

3 - оптический волновод на основе малодефектного органического стекла (поликарбонатдиметилметакрилат/уретанодиметакрилат) производства НПП «Репер-НН».

Результаты измерений показали, что созданный нами лабораторный прототип ЛСК характеризуется значительно более высоким коэффициентом концентрации солнечной энергии и эффективностью ее превращения в фотовольтаическом устройстве по сравнению с образцами подобных устройств, описанными в литературе [M.J Currie et al. Science. 2008. - V. 321. - P. 226-228].

Получение порфиразиновых хромофоров в виде свободных оснований

Ряд новых порфиразиновых хромофоров был существенно расширен за счет соответствующих макроциклов в виде свободных оснований, не содержащих катион металла. Удаление катиона металла проводилось обработкой соответствующих металлокомплексов трифторуксусной кислотой с последующей тщательной очисткой методом колоночной хроматографии (рисунок 5А).

Интересно отметить, что для свободных оснований наблюдается заметное смещение максимума поглощения Q-полосы в длинноволновую область по сравнению с соответствующими металл окомплексами (рисунок 5В).

Полученные свободные основания охарактеризованы спектральными методами, масс-спектрометрией (МАЫЭ1) и элементным анализом.

CFjCOOH

F F

VIII IX X XI

А

Рисунок 5 - Порфиразиновые хромофоры в виде свободных оснований

длина волны (им)

В

А - получение В - УФ/видимые спектры поглощения

Использование тетраарилтетрацианопорфиразиновых макроциклов в виде свободных оснований открывает принципиальную возможность получения соответствующих металлокомплексов с разнообразными центральными катионами металлов.

Особености фотофизических свойств полученных порфиразинов и их металлокомплексов. Новый тип флюоресцентных молекулярных роторов

Уникальной особенностью структуры полученных нами порфиразиновых красителей является чередование электроно-акцепторных (СЫ) и я-донорных ароматических групп, расположенных по периферии макроцикла и объединенных системой сопряженных двойных связей макроциклической структуры (я-врасег). Известно, что наличие в молекуле красителя донорной и акцепторной групп, включенных в общую систему я-сопряжения (я-врасег), создает предпосылки для внутримолекулярного переноса заряда от донора к акцептору при возбуждении молекулы светом. Это, в свою очередь, может привести к внутримолекулярному движению отдельных фрагментов молекулы (вращению или скручиванию), что и обусловило термин «молекулярные

14

роторы» для такого рода красителей. Индуцированное светом внутримолекулярное движение в значительной степени определяет фотофизические свойства молекулярного ротора, поскольку оказывает сильное влияние на баланс заселенностей излучательного и безызлучательного ("темнового") состояния молекулы: вращение отдельных ее групп или скручивание фрагментов относительно друг друга приводит к увеличению заселенности "темнового" состояния молекул. Возможность безызлучательного расхода энергии возбужденного состояния посредством внутримолекулярного движения облегчается в средах с низкой вязкостью. Таким образом, в низковязких средах мы наблюдаем сильное понижение флюоресцентных свойств красителя. И, напротив, в вязком окружении внутримолекулярное движение затруднено, что приводит к резкому возрастанию флюоресценции, при этом ее квантовый выход и время жизни значительно возрастают. Важно отметить также, что изменения флюоресцентных параметров молекулярного ротора с вязкостью могут быть описаны с помощью простых математических уравнений, полученных теоретически и подтвержденных экспериментально. Известно уравнение Фёрстера-Хоффмана, связывающее квантовый выход флюоресценции с вязкостью растворителя:

Ф = Ща, (1)

где ф-квантовый выход, г|-вязкость, г и а - константы.

Аналогичное уравнение существует и для другого параметра флюоресценции - времени жизни:

т = 1ё(2/кг) + а т\, (2)

где кг - константа скорости излучательного перехода.

Проведенные нами исследования показали сильную зависимость квантового выхода флюоресценции полученных нами

тетраарилтетрацианопорфиразинов от вязкости растворителя (рисунок 6), удовлетворяющую уравнению, полученного для соединений класса флюоресцентных молекулярных роторов Фёрстером и Хоффманом.

порфиразин и

VIII РЬ 0.4

IX ЫрИ 0.4

X 4-РРЬ 0.5

XI Р5РЬ 0.3

XIII о-МеРЬ 0.3

Рисунок 6 - Зависимость квантового выхода порфиразинов УШ-ХШ от вязкости растворителя (спиртово-глицериновые смеси). В таблице приведены значения тангенса угла наклона (а) полученных корреляционных прямых квантовый выход/вязкость

Величина тангенса угла наклона прямых, приведенных на рисунке 6, характеризует «степень» вязкостной чувствительности параметров флюоресценции. Известно, что для молекулярных роторов, эта величина находится в интервале 1/3-2/3. В ряду исследованных нами порфиразиновых макроциклов величина угла наклона меняется в интервале 1/3-1/2, что подтверждает их принадлежность к классу флюоресцентных молекулярных роторов.

Совместно с научной группой Химического факультета Империал Колледжа (Лондон) для ряда новых тетраарилтетрацианопорфиразиновых красителей была исследована зависимость времени жизни флюоресценции от вязкости среды с помощью время-разрешенной импульсной спектроскопии. Было показано, что время жизни флюоресценции полученных порфиразинов также сильно растет с вязкостью окружающей среды.

Для нескольких полученных порфиразиновых красителей нами были получены корреляционные кривые, связывающие среднее время жизни флюоресценции с вязкостью раствора (рисунок 7; таблица 2).

□ рг IX. 25 °С

10 100 1000

Вязкость (сР)

Рисунок 7 - Корреляционные кривые, связывающие среднее время жизни флюоресценции порфиразинов с вязкостью раствора. В качестве растворителя использовались

метанольно-глицериновые смеси

известной вязкости с различным соотношением метанол/глицерин

Из рисунка 7 видно, что зависимость среднего времени жизни флюоресценции от вязкости подчиняется уравнению Фёрстера-Хофмана для всех трех красителей. Из данных таблицы 2 следует, что во всех трех случаях величина тангенса угла наклона полученной прямой (~2/3) соответствует высокой вязкостной чувствительности времени жизни флюоресценции, что подтверждает принадлежность этих порфиразинов к молекулярным роторам.

Таблица 2 - Значения тангенса угла наклона кривых зависимости вязкость/среднее время жизни флюоресценции макроциклов

хромофор Т(°С) tg угла наклона Стандартная ошибка измерения Коэффициент корреляции

IX 25 0.67 0.06 0.976

X 25 0.69 0.04 0.988

III 25 0.63 0.03 0.992

В настоящей работе показана принципиальная возможность использования полученной серии новых порфиразиновых макроциклов для измерения вязкости в живых клетках. Методом флюоресцентного биоимиджинга с функцией временного разрешенного (РЫМ) с использованием конфокального микроскопа было получено пикселированное изображение

живой клетки, окрашенной порфиразиновым красителем X, которое с помощью условных цветов показывает распределения в ней красителя по времени жизни флюоресценции (рисунок 8 е).

Ш Рисунок 8 - Клеточная линия 5К-ОУ-3

! КЦ Я

инкубирована в течение 30 мин с 2 шш ' „ порфиразина X в водном растворе. Изображения получены при двухфотонном возбуждении 800 нм. Детектирование флюоресценции

осуществлялось при 600-800 нм.

(a) - изображение клетки под микроскопом в проходящем свете.

(b) - конфокальное изображение клетки (эмиссия порфиразина условно обозначена зеленым цветом); (с) - наложение изображений (а) и ( Ь).

(с!) - черно-белое конфокальное изображение, показывающее распределение порфиразина в клетке по интенсивности флюоресценции.

(е) -изображение, показывающее распределение флюорофора X в клетке по времени жизни флюоресценции (Цвет каждого пикселя соответствует определенному времени жизни флюоресценции порфиразина)

Графическое распределение времен жизни приведено на цветной гистограмме справа. Используя корреляционную кривую, связывающую т и г| (рисунок 7), можно соотнести среднее время жизни флюоресценции, определенное по гистограмме (рисунок 8), с соответствующей ему величиной внутриклеточной вязкости.

Как правило, при работе с биологическими объектами мы использовали различные солюбилизаторы, то есть нетоксичные водорастворимые полимеры, повышающие растворимость наших соединений в водных средах.

Наибольший интерес представляют водорастворимые полимерные щетки (графт-сополимер, полученный кислотным гидролизом полиимид-графт-поли-1-бутилметакрилата). Будучи добавлены в ничтожных количествах (не более 0.07

масс. %), не способных оказывать значимое влияние на вязкость водного раствора, полимерные щетки позволяют не только растворить флюорофор, но и существенно увеличить его квантовый выход (рисунок 9).

Предполагаемая архитектура супрамолекулярных взаимодействий макроцикла с полимерной щеткой представлена на рисунке 10b. Благодаря супрамолекулярным взаимодействиям молекулы красителя попадают в пространство между боковыми цепями полимерной щетки. Такое предположение хорошо подтверждается наблюдаемой структурой наночастицы полимерной щетки, коньюгированной с порфиразиновым флюорофором, не превышающей по размерам 30-50 нм. На микрофотографии, полученной методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ), мы можем наблюдать хорошо контрастируемые ионами иттербия (рисунок 10с) наноансамбли метаплокомплекса III, включенные в пространство между боковыми цепями полимерной щетки.

Проведенные нами измерения показали, что время жизни флюоресценции порфиразина X, находящегося внутри наночастицы полимерной щетки составляет 6.87 ns, что 5,5 раз превышает эту величину в глицерине. Особенно интересен тот факт, что для такого водного раствора время жизни флюоресценции порфиразина совпадает с тем, которое ранее определяли для аналогичного порфиразина I в твердой полимерной матрице (5-7 не) [Klapshina, L. G. J. Mater. Chem. - 2009. - 19. - P.3668-3676]. Это говорит о максимальной пространственной фиксации порфиразинового флуоресцентного ротора, включеннного в макромолекулу полимерной щетки.

600 620 640 660 680 700 720 740

длина волны (нм)

Рисунок 9 - Спектры флюоресценции порфиразина X (Хех = 600 нм, [X] = 10° моль/л)

1 - в спиртовом растворе,

2 - в 5%-ном водном растворе, полиэтилен-гликоля (ММ=7000),

3 - в водном растворе полимерных щеток (0.07 масс. %)

Рисунок 10 - Архитектура наноконьюгата порфиразинового макроцикла с полимерной щеткой: а - структура полимерной щетки; Ь - предполагаемое строение наноконьюгата; с -микрофография наноконьюгата, полученная

методом ТЕМ.

Новые порфиразиновые красители как потенциальные агенты фотодинамической терапии

Исследование внутриклеточной локализации порфиразиновых хромофоров и зависимости процесса интернализации и распределения в клетке показало, что тип полимерного покрытия и параметры среды оказывают существенное влияние на характер проникновения и распределения порфиразинов и их комплексов в клетке. Данные лазерной сканирующей конфокальной микроскопии позволяют сделать вывод о том, что наиболее эффективно и с наибольшей интенсивностью сигнала в околоядерной области накапливаются порфиразины и их металлокомплексы, солюбилизированные в полимерных щетках (рисунок 11).

Клеточная культура - А431. Время инкубации - 120 мин. Возбуждение люминесценции при 633 нм, регистрация сигнала 650-710 нм. 1 - ядро, 2 - ядерная мембрана Рисунок 11 - Внутриклеточная локализация порфиразина X при введении в среду инкубации в составе наночастиц на основе полимерных щеток.

Результаты измерения цитотоксичности синтезированных порфиразиновых хромофоров в различных водорастворимых формах, как потенциальных фотосенсибилизаторов, с помощью МТТ-теста, позволяющего определить ингибирующую концентрацию (ИК50), показали, что вне зависимости от используемого типа полимерной оболочки темновая токсичность по порядку величины не превышает 0.5x10"4 М и более, что сопоставимо с таковой для клинически одобренных препаратов.

Проведено сравнение фотосенсибилизирующих свойств синтезированных нами макроциклов со свойствами препаратов, используемых в настоящее время в клинике, мы проанализировали фотодинамическую активность порфиразина X, препаратов «Фотосенс» и «Фотодитазин» в отношении одной и той же культуры опухолевых клеток при идентичной схеме воздействия (рисунок 12).

Как видно из приведенных данных, эффективность фотодинамического действия полученного при выполнении проекта порфиразинового основания не уступает таковой для клинически одобренных препаратов как хлориновой, так

Рисунок 12 - Зависимость метаболической активности (выживаемости) клеток А 431 от концентрации в среде порфиразина X в полимерных щетках (черная линия), препарата «Фотосенс» (красная линия) и препарата «Фотодитазин» (синяя линия). Облучение светом 635 нм в дозе 10 Дж/см2

Исследование фармакокинетических свойств полимерных наночастиц, содержащих порфиразиновые соединения, методом флюоресцентного биоимиджинга in vivo показало высокую селективность и быстроту накопления порфиразина в модельной опухоли. Об этом свидетельствует многократное превышение уровня флуоресцентного сигнала в области опухоли по сравнению с окружающими здоровыми тканями (рисунок 13).

и фтапоцианиновой природы.

Изображения получены путем наложения фотографии и флуоресцентного сигнала, показанного в псевдоцветной палитре. Область опухоли указана стрелками.

Кл11;ш1 Kfftck-ncY

. р/я-с/сто^я-pWltwr

Рисунок 13 - Экспериментальное животное до (А) и через 4 часа после введения (Б) наночастиц на основе полимерных щеток, допированных порфиразином

Был выполнен мониторинг уровня флуоресцентного сигнала в течение полутора суток после введения наночастиц, оценено время максимального накопления порфиразина в опухоли (3-5 часов). Необходимо отметить, что в нормальных тканях наблюдалось выведение значительной части порфиразина через сутки после введения, в то время как в опухоли происходило значительно более длительное удержание хромофора.

Для верификации результатов полученных in vivo методом флуоресцентного имиджинга была проведена оценка накопления порфиразина в образцах тканей животных-опухоленосителей методом конфокальной флуоресцентной микроскопии ex vivo. Высокая селективность накопления порфиразина в опухоли подтверждена многократным превышением его концентрации в опухоли по сравнению с мышечной тканью, и практически полное отсутствие флуоресцентного сигнала в коже (рисунок 14).

опухоль Мышцы Кожа

Рисунок 14 - Изображения образцов тканей животных через 4 часа после

введения порфиразина в составе наночастиц на основе полимерных щеток,

полученные методом конфокальной флуоресцентной микроскопии

В рамках настоящей диссертационной работы были получены пилотные данные, показывающие возможность непосредственной регистрации изменений клеточной вязкости в ходе фотоиндуцированной гибели раковых клеток. На рисунке 15 приводятся пикселированные по величине времени жизни конфокальные изображения клеток (БКОУ-З), содержащие порфиразин X, полученные с помощью флуоресцентного биоимиджинга с функцией РЫМ (время-разрешенной флуоресцентной микроскопии). Из рисунка 15 хорошо видно, что распределение пикселей по цвету в облучаемых клетках через 5 минут после фотодинамического воздействия заметно изменилось, что однозначно свидетельствует об изменении времени жизни флуоресценции фотосенсибилизатора в процессе облучения. Это хорошо видно из данных гистограмм до и после 5 минут облучения клеток. Увеличение времени жизни флюоресценции фотосенсибилизатора означает сильное подавление внутримолекулярного вращения в молекуле порфиразина, т.е. увеличение вязкости среды.

облучения 5 минут)

Рисунок 15 - Полученное методом РЫМ конфокальное изображение клеток БКОУ-З в процессе фотодинамического воздействия, сенсибилизированного порфиразином X . Время инкубации 30 минут, концентрация порфиразина X 2 мМ. Возбуждение флуоресценции на длине волны 561 нм, регистрация сигнала флуоресценции в диапазоне 600-800 нм. Размер изображений 256x256 мкм

Таким образом, нами показана принципиальная возможность создания на основе полученной нами уникальных порфиразиновых флюоресцентных

молекулярных роторов новой технологии оптической тераностики, позволяющей осуществлять прямой контроль за процессом фотодинамической терапии в живом организме в режиме реального времени с использованием время-разрешенного флуоресцентного биоимиджинга.

Глава 3. Экспериментальная часть, в которой представлены методики органического и элементорганического синтеза, а также основные методы исследования полученных соединений.

ИК-спектры твердых пленок, сформированных на пластинах КВг, регистрировали на ИК Фурье-спектрометре ФСМ 1201. Спектры в УФ и видимой области - на спектрометре «Perkin Elmer Lambda 25». ЭПР-спектры регистрировали на спектрометре «Bruker ER-200D-SRC». ЯМР-спектры снимали на приборе Bruker Avance DPX-200 (ЯМР 'H 200 МГц) и Bruker Avance III-400 (ЯМР 19F 400 МГц) при 25°С. Химические сдвиги указаны в миллионных долях (м.д.) для ЯМР 'Н относительно тетраметилсилана и для ЯМР 19F относительно CFCI3. Исследования флюоресценции в стационарном режиме были проведены на спектрометре Perkin Elmer LS 55 (диапазон длин волн 300-800 нм).

Рентгеноструктурный анализ проведен на автоматических дифрактометрах Bruker AXS SMART APEX и Oxford Xcalibur Eos (графитовый монохроматор, МоКа-излучение, ю-сканирование, X = 0.71073 Л). Структуры расшифрованы прямым методом с помощью пакета программ SHELXTL и уточнены полноматричным МНК по F2hkl в анизотропном приближении для всех неводородных атомов. Программы SADABS и SCALE3 ABSPACK использованы для введения поправок на поглощение.

Для проведения количественных исследований на культурах клеток использовались проточный цитофлуориметр FACSCalibur с двумя лазерами 488 и 633 нм; проточный клеточный сортер FACSAria III; спектрофотометр Shimadzu, спектрофлуориметр Shimadzu; автоматический фотометр для работы в микропланшетном формате типа Synergy с функциями спектрофото- и

спектрофлуориметрии; система лазерной сканирующей микроскопии (инвертированный микроскоп Axiovert 200М, лазерный модуль Carl Zeiss LSM 510, конфокальный модуль Carl Zeiss 23 МЕТА); фемтосекундный Ti:sapphire лазер (длина волны 800 нм) для реализации многофотонного возбуждения.

Исследования на животных проводились с помощью установки для диффузионной флуоресцентной томографии ДФТ-3 с функциями получения изображения в режимах «на отражение», «на просвет», «томография». Длина волны зондирующего излучения 532 нм, 593 нм, 630 нм. Детектор -охлаждаемая ПЗС-матрица Hamamatsu. При работе в режиме «томография» осуществляется сканирование в конфигурации «на просвет» одной парой источник-детектор (детектор - охлаждаемый ФЭУ Hamamatsu).

Изготовление допированных люминофорами органических стёкол производили с помощью прибора вертикального погружения, скорость погружения в световую зону 10 мм/ч, освещение ртутной лампой низкого давления мощностью 60 ватт, переход от освещенной к темновой зоне 8-12 мкм. Время изготовления одного образца 4 ч. При изготовлении одноуровневого JICK используя метод фронтальной фотополимеризации была получена пленка толщиной 250 мкм, содержащая порфиразиновый комплекс иттербия (0.05 масс. %) и трис(бензоилтрифторацетонат) европия (0.5 масс. %). В последствии пленка была склеена с массивным стеклом толщиной 10 мм (ФПК «Призма») с помощью той же ФПК.

Для определения КПД устройств ЛСК-ФЭП использовалась автоматизированная установка для измерения вольт-амперных характеристик (ВАХ) солнечных элементов типа МИЯР (ООО «СОЛТЕК»). Она состоит из имитатора солнечного света, блока измерения ВАХ и компьютера, снабженного программой расчета. Выводы

1. Получена серия ароматических производных тетрацианоэтилена. Впервые синтезированы 2-(бифенил)-1,1,2-трицианоэтилен и 2-(2,6-диметилфенил)-1,1,2-трицианоэтилен и получены структуры 2-(4-фторфенил)-

1,1,2-трицианоэтилена, 2-(2-нафтил)-1,1,2-трицианоэтилена, 2-(бифенил)-1,1,2-трицианоэтилена, 2-(о-метилфенил)-1Д,2-трицианоэтилена и 2-(2,6-диметилфенил)-1,1,2-трицианоэтилен методом РСА.

2. Получена и охарактеризована серия новых флюоресцентных красителей порфиразинового ряда в виде металлокомплексов и свободных оснований, перспективных для применения в фотонике и биомедицине.

3. Разработаны оптические волноводы на основе бездефектных органических стекол, допированных новым тетра(4-фторфенил)-тетрацианопорфиразиновым комплексом иттербия, способные эффективно поглощать, переизлучать и проводить свет в широком диапазоне спектра. Создана лабораторная модель люминесцентного концентратора солнечной энергии для фотоэлектрических преобразователей, не уступающих по своим характеристикам мировым образцам подобных устройств.

4. Обнаружена необычно сильная зависимость фотофизических параметров (времени жизни, квантового выхода флюоресценции) полученного ряда соединений от вязкости среды.

5. Методами стационарной и время-разрешенной спектроскопии доказано, что высокая вязкостная чувствительность флюоресцентных параметров полученных соединений обусловлена фотоиндуцированным внутримолекулярным движением отдельных фрагментов молекул флюорофора, влияющим на баланс заселенностей безызлучательных и излучательных возбужденных состояний (эффект флюоресцентного «молекулярного ротора»).

6. Показано, что полученные порфиразиновые хромофоры сочетают сильную вязкостную чувствительность флюоресцентных параметров с высокой фотодинамической активностью, то есть способностью генерировать синглетный кислород.

7. На клеточных линиях и модельных животных (ш vivo) показана высокая селективность накопления полученных соединений в клеточных органеллах и раковых опухолях. Проведена оценка темновой и фотоиндуцированной

цитотоксичности, подтверждающая перспективность полученных соединений в качестве сенсибилизаторов фотодинамической терапии.

8. Методом время-разрешенного биоимиджинга и конфокальной микроскопии (FLIM) на клеточных культурах показана принципиальная возможность использования уникальной серии порфиразинов, разработанных в настоящей работе, в качестве зондов внутриклеточной вязкости, а также для мониторинга фотодинамического воздействия на раковые клетки в режиме реального времени.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Григорьев, И.С. Новые тетраарилтетрацианопорфиразиновые комплексы ванадила с повышенными электроноакцепторными свойствами / И.С. Григорьев, С.А. Лермонтова, Л.Г. Клапшина, В.В. Семенов, Б.А. Бушук, У. Дуглас, С. Клеман, Г.А. Домрачев // Доклады АН. - 2012. -Т. 447.-№4.-С. 410-413.

2. Григорьев, И.С. Эффективные люминесцентные солнечные концентраторы на основе малодефектных органических стекол, содержащих новый цианопорфиразиновый комплекс иттербия / И.С. Григорьев, JI. Г. Клапшина, С.А. Лермонтова, В.В. Семенов, В.М. Треушников, В.В. Треушников, Б.А. Бушук, S. Clement, W.E. Douglas // Российские нанотехнологии. - 2012. - Т. 7. - №9-10. - С. 53-59.

3. Yakimansky, A.V. Novel regular polyimide-graft-(polymethacrylic acid) brushes: Synthesis and possible applications as nanocontainers of cyanoporphyrazine agents for photodynamic therapy / A.V. Yakimansky, Т.К. Meleshko, D.M. Ilgach, M.A. Bauman, T.D. Anan'eva, L.G. Klapshina, S.A. Lermontova, I.V. Balalaeva, William E. Douglas // Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry . - 2013. - V. 51. -1. 20. - P. 4267-4281.

4. Лермонтова, С.А. Получение тетраарилтетрацианопорфиразиновых металлокомплексов с использованием ароматических производных трицианоэтиленов / С.А. Лермонтова, И.С. Григорьев, Л.Г. Клапшина //

Сборник тезисов XVI нижегородской сессии молодых ученых. Естественнонаучные дисциплины. - Нижний Новгород 2011. - С. 106.

5. Лермонтова, С.А. Темплатный синтез порфиразиновых метаплокомплексов с использованием ароматических производных тетрацианоэтилена в качестве стартовых соединений / С.А. Лермонтова, И.С. Григорьев, Л.Г. Клапшина, Н.Ю. Леканова // Сборник тезисов XXV Международной Чугаевской конференции по координационной химии. - Суздаль 2011. -С.99-100.

6. Лермонтова, С.А. Новые флюоресцентные цианопорфиразиновые металлокомплексы, инкорпорированные в водорастворимые наночастицы для биомедицинских приложений / С.А. Лермонтова, Л.Г. Клапшина, И. С. Григорьев, Е.Ю. Ладилина, М.В. Ширманова, Н.Ю. Леканова, И.В. Балалаева, С.А. Мысягин, Е.В. Загайнова // Третья всероссийская школа-конференция для молодых ученых «Макромолекулярные нанообъекты и полимерные нанокомпозиты». - МО, пансионат «Союз», 2011 г. - С. 94.

7. Лермонтова, С.А. Эффективные люминесцентные солнечные концентраторы на основе малодефектных органических стекол, содержащих новый цианопорфиразиновый комплекс иттербия / С.А. Лермонтова, И.С. Григорьев, Л.Г. Клапшина // Тезисы докладов XVII нижегородской сессии молодых ученых. Естественнонаучные дисциплины. - Нижний Новгород 2012.-С. 102.

8. Лермонтова, С.А. Эффективные люминесцентные солнечные концентраторы на основе малодефектных органических стекол, содержащих новый цианопорфиразиновый комплекс иттербия / С.А. Лермонтова, И.С. Григорьев, Л.Г. Клапшина, В.В. Семенов, В. М. Треушников, В.В. Треушников // Тезисы докладов 8-ой Санкт-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах». - Санкт-Петербург 2012. - С. 108.

ЛЕРМОНТОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСЕЕВНА

НОВЫЕ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЕ ПОРФИРАЗИНОВЫЕ СВОБОДНЫЕ ОСНОВАНИЯ И МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ФОТОНИКЕ И БИОФОТОНИКЕ

02.00.03 — Органическая химия 02.00.04 - Физическая химия (химические науки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 25.09.14. Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,63. Тираж 100 экз. Заказ № 750.

Отпечатано «Издательский салон» ИП Гладкова О.В. 603022, Нижний Новгород, Окский съезд, 2, оф. 501 тел./факс: (831) 439-45-11; тел.: (831) 416-01-02