Структура и свойства хитозановых пленок и покрытий, получаемых из растворителей на основе диоксида углерода под высоким давлением тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

ЧАЩИН Иван Сергеевич

структура и свойства хитозановых пленок и покрытий, получаемых из растворителей на основе диоксида углерода под высоким давлением

Специальность 02.00.06 — высокомолекулярные соединения

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

3 О МАЙ ¿013

005060246

Москва-2013

005060246

Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук Галлямов Марат Олегович,

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, заведующий лабораторией механики полимеров и композиционных материалов Института Высокомолекулярных Соединений РАН

доктор химических наук, профессор, профессор Московского Государственного Кильдеева Наталия

Университета дизайна и технологий Рустемовна

Ведущая организация: Национальный исследовательский научный центр «Курчатовский институт».

Защита состоится «19» июня 2013 г. в 15 часов 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.002.01 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 2, физический факультет МГУ, Южная физическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в Отделе диссертаций Научной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова (Ломоносовский просп., д.27)

Автореферат разослан « 17 » мая 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.002.01 кандидат физико-математических наук

2

Юдин Владимир Евгеньевич,

Общая характеристика работы

Актуальность темы

В настоящее время интенсивно исследуются закономерности формирования хитозановых покрытий и композитных пленок, в том числе начальный этап этого процесса при осаждении отдельных хитозановых макромолекул на плоскую подложку. Исследовательский интерес связан с возможностью использования хитозановых покрытий в качестве протекторных для придания биосовместимых свойств медицинским устройствам, внедряемым в организм человека. Существует важная частная проблема кальциноза (отложения солей кальция) коллагеновых матриц перикарда биопротезного клапана сердца, который наиболее близок по совокупности физико-химических свойств заменяемому клапану человека, в отличие от механического протеза клапана сердца. Вследствие кальциноза срок службы биопротезного клапана сердца составляет не более 10 лет, что приводит к необходимости повторных операций по замене такого клапана у пациента. Кальциноз биопротезных клапанов сердца происходит вследствие взаимодействия остаточных альдегидных групп глутарового альдегида, которым необходимо сшивать коллагеновые матрицы для хирургического использования, с кровяным потоком в организме человека. Сохранить преимущества биопротезов, но при этом устранить проблему кальциноза, является нетривиальной задачей, решением которой может служить покрытие коллагеновой матрицы хитозановым материалом с целью маскирования свободных альдегидных групп.

Также, хитозановые пленки находят широкое применение в качестве компонентов для тканевой инженерии, например для решения задачи регенерации кожного покрова человека с целью заживления ожогов и ран. Дополнительно, можно усилить антимикробные свойства таких пленок путем внедрения в их матрицу наночастиц серебра, например, при получении методом полива из смешанных растворов хитозана и восстановленных непосредственно in situ в хитозановом растворе наночастиц серебра из растворённого прекурсора.

На данный момент в научной литературе представлены исследования закономерностей формирования хитозановых пленок и покрытий, получаемых с помощью классических растворителей хитозана, в основном, уксусной кислоты. Однако, существует иной, принципиально отличающийся класс растворителей на основе диоксида углерода под высоким давлением, к которому относятся сверхкритический диоксид углерода (ск С02) и угольная кислота: вода, насыщенная С02 под высоким давлением. Их особенности в том что, во-первых, способность растворять хитозан у этих растворителей проявляется при высоких

давлениях. Во-вторых, данные растворители под давлением обладают антимикробной активностью, а по завершении экспозиции и декомпрессии спонтанно и полностью переходят в безопасные для организма человека компоненты: воду и диоксид углерода. Отметим, что одновременное сочетание антимикробной активности и биосовместимости является уникальным, что позволяет рассматривать этот класс растворителей как весьма перспективный с точки зрения биомедицинских приложений. В-третьих, в случае обоих растворителей можно ещё и управлять растворяющей способностью по отношению к хитозану вариацией давления, что позволяет добиваться изменения растворяющей способности одновременно однородно и изотропно во всем объеме раствора в силу свойства давления (Р). Напротив, в традиционных химических растворителях, растворяющая способность управляется вариацией температуры (Т) или концентрации растворителя (с). В этом случае состояние раствора меняется в течение характерного времени установления равновесия и процесс перехода раствора в новое состояние происходит неоднородно в пространстве с возникновением градиентов температуры или концентрации молекул растворителя.

Однако, закономерности осаждения индивидуальных хитозановых макромолекул на подложку и формирования конденсированных пленок и покрытий из растворителей на основе диоксида углерода под высоким давлением, фактически, не изучены и в мировой научно-исследовательской литературе представлены лишь единичные экспериментальные работы по данной задаче. Поэтому, проведённое исследование закономерностей формирования хитозановых композитных пленок и покрытий (в том числе наносимых на коллагеновую матрицу перикарда), полученных с помощью таких растворителей, может послужить заделом для создания научных основ технологии получения нового поколения абсолютно биосовместимых и антимикробных биомедицинских устройств, а также биопротезных клапанов сердца с увеличенным сроком службы.

Цель диссертационной работы

Целью работы является исследование структуры и свойств хитозановых пленок и покрытий, в том числе композитных, получаемых осаждением макромолекул хитозана из растворителей на основе СОг под высоким давлением, а также анализ общих закономерностей их формирования.

Следование этой цели требовало решения следующих задач:

Выявить закономерности осаждения индивидуальных хитозановых макромолекул на модельную подложку из растворителей на основе С02

под высоким давлением, в том числе оценить растворимость и сопоставить её в сравнительном анализе для различных образцов хитозана.

Исследовать структуру и физико-химические свойства хитозанового покрытия, нанесенного из таких растворителей на коллагеновую матрицу перикарда биопротезного клапана сердца, включая анализ механических характеристик модифицированных образцов, а также их сродство к солям кальция, бактериям и клеткам организма.

На основе сравнительного анализа выявить специфику формирования нанокомпозитных хитозановых пленок с внедренными наночастицами серебра, получаемыми из таких растворителей во взаимодействии с макромолекулами хитозана.

Научная новизна работы

Впервые была обнаружена некоторая (ограниченная) растворимость хитозана в ск С02, что позволило осаждать из таких растворов на модельные подложки хитозановые макромолекулы в форме одиночных расправленных цепей и проводить количественный анализ их конформации с помощью метода атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Впервые были получены хитозановые покрытия на коллагеновых матрицах перикарда с помощью метода прямого осаждения из растворов в угольной кислоте, чьи остаточные следы в матрице являются абсолютно биосовместимыми с организмом человека, причем обнаружено, что присутствие хитозанового покрытия приводит к существенному изменению механико-прочностных, биосовместимых свойств коллагеновой матрицы, а также способности связывания с солями кальция и клетками бактерий.

Впервые были получены композитные хитозановые пленки с внедренными наночастицами серебра поливом из угольной кислоты, причем была показана возможность управления размером, концентрацией и монодисперсностью наночастиц в пленках вариацией растворяющей способности этого растворителя.

Научная и практическая значимость

Результаты исследования показывают возможность практического использования растворителей на основе диоксида углерода под высоким давлением

в процессах модифицирования биомедицинских устройств, внедряемых в организм человека, нанесением хитозанового покрытия из растворителей, остаточные следы которых в изделии абсолютно биосовместимы. С помощью комплекса экспериментальных исследований было показано значительное улучшение характеристик коллагеновых матриц перикарда с нанесенным хитозановым покрытием из угольной кислоты, в плане подавления кальцификации, способствования биосовместимости, усиления антимикробных свойств и повышения механико-прочностных характеристик. Эти полученные результаты являются заделом для постановки и проведения дальнейших клинических испытаний, а также последующего практического внедрения развитой сравнительно простой технологии нанесения хитозановых покрытий из угольной кислоты на коллагеновые матрицы перикарда, используемые в биопротезных клапанах сердца.

Также была показана возможность создания композитных хитозановых пленок из растворов в угольной кислоте с внедренными наночастицами серебра контролируемого размера. Этого можно достичь путем варьирования растворяющей способности угольной кислоты, что позволит регулировать антимикробную способность таких пленок, которые могут быть широко использованы в тканевой инженерии (в частности, можно получать пленки с пролонгируемым антимикробным действием).

Проведенный анализ конформации одиночных хитозановых макромолекул, осажденных на подложку из ск С02, впервые, хоть даёт и косвенную информацию о конформации полимерных цепей в ск растворителях, позволяет, тем не менее, в определенной степени верифицировать известные теоретические исследования модели поведения полимерных цепей в ск растворителе, зачастую дающие взаимно противоречивые результаты.

Достоверность результатов

Достоверность результатов диссертации обеспечивается систематической постановкой многочисленных контрольных экспериментов для выявления специфики, привносимой свойствам образцов, именно, влиянием осаждаемого полимера, многочисленными повторными сериями получения образцов при фиксированных параметрах, тестирование характеристик которых показало хорошую воспроизводимость; а также корреляцией результатов, полученных рядом комплементарных методов, друг с другом.

Апробация работы

Результаты различных частей работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях:

«European Polymer Congress EPF09», (12-17 July 2009, Graz, Austria); III International nanotechnology forum RUSNANOTECH 2010, (1-3 November 2010, Moscow, Russia, 2010); международная конференция молодых ученых «Ломоносов-2011», (11-15 апреля 2011, Москва, Россия); международная конференция молодых ученых «Ломоносов-2012», (9-13 апреля 2012, Москва, Россия); «7th International Symposium Molecular Mobility and Order in Polymer», (June 6-10 2011, St. Petersburg, Russia); «XI Конференция студентов и аспирантов НОЦ по физике и химии полимеров и НОЦ по нанотехнологиям МГУ», (9 декабря 2011, Москва, Россия); Всероссийская конференция «Актуальные проблемы физики полимеров и биополимеров», посвященная 100-летию со дня рождения М.В. Волькенштейна и A.A. Тагер», (15-17 октября 2012, Москва, Россия); четвёртая Всероссийская школа-конференция для молодых учёных "Макромолекулярные нанообъекты и полимерные нанокомпозиты", (21-26 октября 2012 Московская область пансионат "Союз", Россия).

Диссертационная работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ (проектов № 10-03-00886-а, 11-03-01062-а, 12-03-31863 «мол_а»).

Личный вклад

Результаты, представленные в работе, были получены либо лично автором, либо при его участии. В частности, автором были отработаны методики получения хитозановых композитных пленок и покрытий из растворителей на основе диоксида углерода, наработаны все образцы, подлежавшие исследованию в рамках работы, а также проведена интерпретация полученных экспериментальных результатов и объяснены наблюдаемые закономерности. Автор лично выполнил все эксперименты по АСМ-визуализации макромолекул и провел последующий статистический анализ их конформации.

Публикации

Основные результаты по теме диссертации были изложены в 12 печатных работах, 4 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ [1-4], 8 — в тезисах докладов.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа изложена на 177 страницах печатного текста и включает 40 рисунков и 18 таблиц. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (170 наименований).

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы работы, сформулированы задачи и цели исследования.

Первая глава содержит обзор литературы по теме работы. В первой части этой главы излагается обзор физико-химических и антимикробных свойств хитозана, анализируется растворимость хитозана в водных растворах кислот. Представлены данные о размерах мономерного звена и персистентной длине макромолекул хитозана. Анализируются данные о конформации хитозановых макромолекул в водных растворах кислот и при их осаждении из этих растворов на плоскую подложку.

Во второй части главы анализируется возможность и перспективы применения ск С02 и угольной кислоты в качестве растворителей хитозана для создания хитозановых пленок и покрытий.

В третьей части главы излагается обзор литературы по получению хитозановых растворов в классическом растворителе хитозана — уксусной кислоте с наночастицами серебра, анализируется механизм формирования наночастиц серебра в этих растворах и закономерности формирования конденсированных композитных хитозановых пленок из таких растворов.

В четвертой части главы излагаются данные о структуре коллагеновой матрицы перикарда биопротезных клапанов сердца и анализируется решение задачи снижения кальцификации матрицы путем её покрытия хитозаном.

В пятой части главы ставятся задачи исследования исходя из текущего фундаментально-научного и научно-технического уровня. Представлены обоснования возможности использования растворителей на основе диоксида углерода под высоким давлением для создания абсолютно биосовместимых хитозановых пленок и покрытий.

Во второй главе представлена экспериментальная часть работы, в которой изложены основные экспериментальные методики и подходы, а также описаны материалы и оборудование, которые были применены для решения задач исследования.

В третьей главе представлены результаты исследования методом АСМ

8

индивидуальных хитозановых макромолекул с различной степенью ацетилирования, осажденных на плоскую подложку слюды из растворов в ск С02 при фиксированных условиях экспозиции (см. рис.1). Был проведен статистический анализ серий многих АСМ изображений для каждого исследуемого полимерного образца, в результате были определены: средняя контурная длина, расстояние между концами макромолекул, фактор полидисперсности, высоты над уровнем подложки и показатель экспоненты v — определяющий корреляцию между концами макромолекул и их контурной длиной, согласно уравнению:

< R2 >= А ■ L2v, (1)

Рис. 1. АСМ изображения макромолекул, нанесенных на подложку слюды непосредственно из растворов в ск С02 (Р=70 МПа, Т=70°С, время экспозиции 2-4 часа) для: образца хитозана со степенью ацетилирования 15% (А,Г); образца хитозана со степенью ацетилирования 15% и комплексованного кальцием (Б,Д); образца хитозана со степенью ацетилирования 50%. Размер области сканирования (А,Б,В): 4x4 мкм2, (Г,Д,Е): 2x2 мкм2. Масштабная линия 500 нм, шкала высот 10 нм

Обнаружено, что для макромолекул хитозана, осажденных из ск С02 на плоскую подложку, характерно наличие высокой степени расправленности макромолекулярного контура как целого, что количественно выражается в высоком значении показателя у=0,78-0,80, что немного выше, чем

характеристическое значение для статистики двумерных случайных блужданий без самопересечений (рис.1, рис.2). Завышение показателя V связано с расправленностью общего макромолекулярного контура в связи со взаимным стерическим отталкиванием локальных компактизованных участков цепи с элементами вторичной структуры, в результате чего происходит увеличение общей эффективной жесткости цепи (рис.1).

—«—Chitosan 0.85

-Slope 1,60+-0,04

—• — Chitosan 0,85 Са ---Slope 1.70+-0.04

Contour lenght, nm

Рис. 2. Корреляции между контурными длинами и средним квадратом расстояния между концами цепи для образцов хитозана со степенью ацетилирования 15% и хитозана комплексованного с кальцием (степень ацетилирования 15%)

Была оценена вероятность макромолекулярных зацеплений в гипотетической пленке, сформированной последовательным нанесением макромолекул хитозана из ск С02 на подложку при таких условиях:

Р =

ф(у?

(2)

где Ф(у) — поверхностная доля полимера в двумерном клубке, определяется выражением:

(3)

Значит, Р~Ь2у_1 и, следовательно, для большего значение V, ожидается большая степень начального взаимного зацепления полимерных цепей в пленочных покрытиях, которые можно потенциально формировать последовательным нанесением макромолекул из ск С02.

Следовательно, то, что макромолекулы исследованных хитозановых образцов осаждаются из растворов в ск С02 в виде расправленных структур со сравнительно большим значением показателем скейлинговой экспоненты (у>3/4), является благоприятным фактором с точки зрения ожидаемой механической стабильности хитозановых покрытий, которые можно потенциально формировать осаждением из

растворов в ск СОг.

Путем определения среднего количества молекул на единицу площади подложки, сканированной АСМ, для каждого из образцов хитозана можно оценить их достижимую концентрацию в растворе ск С02. Считая, что макромолекулы одинаково осаждаются на всю доступную поверхность (включая подложку и стенки автоклава), зная общую поверхность, доступную для их осаждения, и поверхностную плотность на подложке по результатам систематических АСМ наблюдений, можно оценить их количество, содержавшееся в объёме автоклава в растворе, и, следовательно, объем занимаемый всеми растворенными макромолекулами. Форму молекулы в среднем аппроксимировали цилиндром диаметром 2 нм и длиной 300 нм. Тогда объём одной такой молекулы — У Я! ТС* 1нм *300нм а 940 нм . Суммарная площадь внутренней поверхности, на которую осаждаются молекулы, определяется площадью поверхности камеры, имеющей форму цилиндра (радиус цилиндра - 1см, высота - 3 см), и площадью поверхности подложки, что в сумме составляет S~30 см2. Таким образом, оценить достижимую концентрацию исследованных хитозановых образцов в ск С02 можно с помощью сравнительного анализа поверхностной концентрации визуализированных макромолекул этих образцов, согласно формуле (4):

с _ PN71R4.CS/S-) ^

Где р - плотность хитозана, N — среднее число молекул на 1мкм2, R и L— радиус и длина цилиндра, аппроксимирующего усреднённую макромолекулу хитозана, S -площадь суммарной внутренней поверхности камеры, S* - площадь Imkm2, V -объем автоклава, где проводилось осаждение из ск СОг. Полученная оценка достижимой концентрации является оценкой снизу, поскольку учитывается только та часть хитозанового материала, которая была осаждена на внутреннюю поверхность камеры, однако некоторая неизвестная часть материала может уходить вместе с раствором при декомпрессии и не давать вклад в приповерхностную концентрацию макромолекул хитозана. Тем не менее, мы полагаем, что она коррелирует с реальной концентрацией в растворе и может быть использована для сравнительного анализа растворимости различных образцов.

Была обнаружена немонотонная зависимость растворимости хитозановых образцов от степени ацетилирования в ск С02, рассчитанной согласно формуле (4), оценка достижимой концентрации хитозановых образцов составила порядка 10~5 г/л. Несмотря на то, что данная оценка растворимости является оценкой снизу, в целом растворимость невелика, и слишком мала для практического применения метода прямого осаждения хитозана из ск С02 с целью получения покрывающих

всю площадь подложки хитозановых покрытий, однако растворимость хитозана в ск С02 можно улучшить либо повышением давления С02 (>100МПа), либо добавлением сорастворителей (вода, этанол).

Таким образом, в третей главе исследованы закономерности осаждения индивидуальных хитозановых покрытий при прямом осаждении из растворов в ск С02. Было показано, что ограниченная растворимость хитозана в этой среде приводит к специфической конформации хитозановых цепей, осажденных на плоскую подложку, а также, что высокая степень расправленности макромолекулярных контуров позволяет ожидать хорошего качества покрытий, которые можно, потенциально, формировать методом прямого осаждения из растворов в ск С02.

В четвертой главе излагаются результаты исследования структуры и свойств коллагеновой матрицы перикарда теленка (коллаген типа I) с хитозановым покрытием, полученным нанесением из растворов в угольной кислоте. В главе 3 мы отметили, что существуют две стратегии улучшения растворимости хитозана в ск С02 с сохранением биосовместимых свойств растворителя: использование более высоких давлений >100 МПа, или добавление биосовместимых сорастворителей, например воды. Наш экспериментальный поиск мы проводили следуя второй стратегии, а именно, добавляли воду в автоклав и создавали высокое давление диоксида углерода (Р=15-30 МПа, Т=20-25°С, время экспозиции — 2-3 часа,). Мы обнаружили, что гораздо лучшей растворимостью хитозан обладает не в ск С02 с водой в качестве сорастворителя, а в воде занимаемой половину объема автоклава и насыщаемой С02 под высоким давлением, то есть в угольной кислоте. Оказалось, что растворимость хитозана в угольной кислоте составляет порядка 10 г/л, в зависимости от молекулярной массы хитозана и условий экспозиции (давления, температуры). Если прямым осаждением из растворов в ск С02 нам удавалось получать лишь субмономолекулярные покрытия, для исследования которых нужно было привлекать высокочувствительный метод АСМ, то обнаруженная гораздо более высокая растворимость хитозана в угольной кислоте позволяла осаждать существенно более плотные однородные покрытия, присутствие которых на подложке можно было детектировать и с использованием гораздо менее чувствительных методов. Действительно, даже гравиметрически, а также с помощью метода меченых атомов (исследование проведены к.х.н Бадуном Г.А, к.х.н Чернышевой М.Г., химический факультет МГУ), было обнаружено интегральное количество хитозана, осаждаемое из раствора с концентрацией полимера 10 г/л в угольной кислоте на коллагеновую матрицу, что составило (1,0±0,1)% от веса матрицы. Погрешность в приведенном значении получена

методом меченных атомов, гравиметрия даёт существенно большие погрешности. Оказалось, что, несмотря на такие малые количества вводимого хитозана в сравнении с весом матрицы, вся толща матрицы было модифицирована хитозаном, что было подтверждено ПЭМ изображениями её срезов (изображения получены Абрамчуком С.С., к.т.н. с.н.с физического факультета МГУ) (см.рис.З).

а) б)

Рис.3. Сравнительный анализ ПЭМ изображений ультратонких срезов а) коллагеновых матриц с хитозановым покрытием, нанесенным из растворов угольной кислоты (Р=30 МПа, Т=25°С,время экспозиции —3 часа, концентрация хитозана 10 г/л) б) коллагеновой матрицы перикарда с нанесенным хитозановым покрытием из раствора уксусной кислоты (20 г/л). Присутствуют наночастицы серебра в качестве маркера хитозановой фазы

Также была исследована поверхность матрицы с помощью СЭМ (изображения получены Кашиным A.C., аспирант ИОХ РАН), в результате было детектировано изменение особенностей морфологии поверхности, что обусловлено покрытием её хитозаном слоем толщиной порядка несколько десятков нанометров, который обеспечивает ее локальную гладкость (см рис.4). Кроме того, процесс нанесения хитозана из угольной кислоты, в силу высокого давления этого растворителя,

приводил к изменению внутренней структуры матрицы, что проявлялось в схлопывании её пор и связывании их стенок хитозаном, и приводило к детектируемому улучшению механико-прочностных свойств коллагеновой матрицы, несмотря на столь малые количества вводимого хитозана.

Была определена степень адгезии некоторых клинических штаммов бактерий (были выбраны бактерии, чаще всего вызывающие осложнения в организме человека после хирургической операции по замену биопротезного клапана сердца) к коллагеновой матрице перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из угольной кислоты (эксперименты проведены Лютовой И.Г, врачом-бактериологом лаборатории производства биопротезов, Анучиной Н.М, м.н.с. лаборатории микробиологии и антибиотикотерапи в ЦССХ им. А.Н. Бакулева).

Х25000 Х25000

Х50000

Х50000

а) б)

Рис.4. Сравнительный анализ СЭМ изображений поверхности а) коллагеновой матрицы перикарда находившейся в чистой угольной кислоте без хитозана (Р=30 МПа, Т=25°С,время экспозиции —3 часа) и б) коллагеновой матрицы перикарда с нанесенным хитозановым покрытием из раствора угольной кислоты (Р=30 МПа, Т=25°С,время экспозиции —3 часа, концентрация хитозана — Юг/л). Увеличение, сверху вниз:*25000, ><50000

Из анализа полученных результатов, суммированных в табл. 1, можно сделать вывод, что хитозановое покрытие на коллагеновой матрице перикарда, нанесенное из растворов в угольной кислоте, имеет абсолютные антиадгезивные свойства по отношению к грамположительным бактериям. Однако, сохраняется некоторая адгезия грамотрицательных бактерий к поверхности коллагеновой матрицы с хитозановым покрытием, нанесенным из растворов угольной кислоты, хотя и на два порядка меньшая, чем для исходной нативной коллагеновой матрицы перикарда. Такое значительное снижение степени адгезии матриц модифицированных в угольной кислоте, обусловлено возникновением локально более гладкой поверхностью контакта, в сравнении с поверхностью контрольной коллагеновой матрицы, в результате экстракции в угольной кислоте части клеточного материала перикарда. Это приводит к наличию лишь вандерваальсова взаимодействия и водородного связывания между клеткой бактерии и поверхностью матрицы, в то время как лиганд-рецепторное взаимодействие с клеточным материалом перикарда, обусловленное электростатическим взаимодействием, фактически полностью исключается.

Табл. 1. Индекс адгезии и степень адгезии некоторых клинических штаммов бактерий к: 1) образцу перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из угольной кислоты 2) сравнительному образцу перикарда обработанного в чистой угольной кислоте без хитозана 3) образцу сравнения исходного нативного перикарда.

Тестовые культуры, концентрация 10' клеток/мл

Грамположительные Грамотрицательные

S. Aureus (Стафилококк золотистый) S. Haemolyticus (Стафилококк гемолити ческий) Ps. Aeruginosa (Синегнойная палочка) Е.соИ (Кишечная палочка)

ИА, клеток/см2 СтА, % ИА, клеток/с м2 СтА, % ИА, клеток/см2 СтА, % ИА, клеток/см2 СтА, %

Коллагеновые матрицы перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из растворов угольной кислоты без хитозана

0 0 о 0 2,0х103 2,0 3,0* 103 3,0

Коллагеновые мат| шцы перикарда, обработанные в чистой угольной кислоте без хитозана

1,5*103 1,5 5,5X10J 5,5 2,0x102 0,2 3,4* 102 0,34

Контрольные коллагеновые матрицы исходного нативного перикарда

105 100 105 100 10s 100 105 | 100

Детектированное абсолютное отсутствие грамположительных бактерий на коллагеновых матрицах, покрытых хитозаном, по-видимому, объясняется уничтожением адгезированных бактерий, вследствие разрыва клеточной стенки, под действием напряжений, вызываемых водородными связями, непосредственно возникающими между клеточной стенкой и хитозановым покрытием, на фоне

15

возможного дополнительного вклада электростатического взаимодействия заряженных элементов клеточной стенки с остаточными протонированными аминогруппами хитозана.

Присутствие грамотрицательных бактерий на коллагеновых матрицах с хитозановым покрытием, по-видимому, обусловлено адгезией этих бактерий к поверхности хитозана с сохранением нативного состояния. Наличие некоторой адгезии грамотрицательных бактерий к коллагеновой матрице покрытой хитозаном может объясняться возникновением водородных связей между хитозаном и группами О-антигена липополисахарида (ЛПС) грамотрицательных бактерий, имеющим в своем составе большое количество ОН групп, и функциональными группами хитозана -ЫН2 и -ОН. Наличие водородных связей между ЛПС и хитозановым покрытием в этом случае не приводит к разрыву клеточной стенки бактерий в связи с локальной удаленностью ЛПС от основной клеточной стенки, в результате напряжения, вызванные водородными связями, прикладываются к в большей степени гибким цепям ЛПС, что позволяет клеточным стенкам бактерий выдерживать более сильные напряжения.

Был проведен анализ биосовместимых свойств коллагеновой матрицы перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из растворов в угольной кислоте с помощью модельной системы: определения степени реакции клеток фибробластов мыши на экстракты коллагеновых матриц (эксперименты проведены Бакулевой Н. П, к.х.н., заведующей лаборатории производства биопротезов в ЦССХ им. А.Н. Бакулева).

Испытания показали, что экстракты из образцов исходной коллагеновой матрицы нативного перикарда в эксперименте имели небольшое цитотоксическое воздействие, что, вероятно, связано с влиянием глутарового альдегида, с остаточными, непрореагировавшими функциональными группами, экстрагированного из матриц, который вызывает некоторый лизис клеток. Экстракты из образцов коллагеновой матрицы перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из угольной кислоты, не имеют какого-либо цитотоксического воздействия, что, по-видимому, связано с экстрагированием из матриц лишь глутарового альдегида с полностью прореагировавшими группами, например, ковалентно связанными с хитозаном, который не вызывает лизис клеток вследствие биосовместимости хитозана. Таким образом, существенное увеличение биосовместимости коллагеновой матрицы перикарда происходит за счет ковалентного связывания хитозана с цитотоксичными остаточными свободными

группами глутарового альдегида на фоне абсолютной биосовместимости возможных остаточных следов растворителя — угольной кислоты.

Было обнаружено, что хитозановое покрытие, нанесенное на коллагеновую матрицу перикарда методом прямого осаждения хитозана из растворов в угольной кислоте, рекордно подавляет процесс кальцификации коллагеновой матрицы (эксперименты проведены Бакулевой Н. П, к.х.н., заведующей лаборатории производства биопротезов в ЦССХ им. А.Н. Бакулева). Было получено, что ксеноткань перикарда имеет лишь 1,2x10"3 весовых % солей кальция после проведения модельного in vivo эксперимента на крысах (крысам подкожно вшивались по паре образцов контрольных матриц и матриц с хитозановым покрытием) в течение 4 месяцев со специальной кальций-промоутирующей диетой, что моделировало неблагоприятные условия кальцификации клапана сердца в организме человека. Количество кальцинатов у матрицы с покрытием на два порядка ниже, чем у исходной контрольной коллагеновой матрицы нативного перикарда. Кроме того, оказалось, что интенсивность кальцификации перикарда с хитозаном, осажденным из растворов в угольной кислоте, в три раза ниже, чем для образца перикарда с хитозановым покрытием, полученным стандартным путем осаждения хитозана из водного раствора уксусной кислоты.

Такое рекордное снижение интенсивности кальцификации может быть обусловлено следующими факторами. Во-первых, это связано с улучшенной стабильностью хитозанового покрытия, осажденного из угольной кислоты. Действительно, изначально хитозановые цепи протонированы в угольной кислоте (Н2О/СО2 под высоким давлением), но после того как давление Н2О/СО2 смеси снижается до атмосферного давления, хитозановая цепь спонтанно теряет заряд, без какой-либо нейтрализации её щелочью. Незаряженные макромолекулы хитозана в покрытии медицинского изделия, внедряемого в организм, фактически не имеют сродства к воде, поэтому в условиях внутренней водной среды организма, такое хитозановое покрытие является механически стабильным. Напротив, хитозановые цепи в покрытии, полученном стандартным осаждением из растворов уксусной кислоты, сохраняют некоторый остаточный положительный заряд, окруженный ацетат анионами, что снижает механическую стабильность покрытия вследствие взаимодействия с диполями воды и придаёт изделию долговременный характерный запах.

Во-вторых, специфика нанесения хитозана из угольной кислоты как растворителя под высоким давлением, позволяет придать коллагеновой матрицы более монолитную структуру, фактически полностью сжав поры внутри матрицы, стенки которых эффективно связываются хитозаном. Действительно, монолитная

устойчивая структура коллагеновой матрицы приводит к существенному уменьшению вероятности контакта содержащего соли кальция кровяного потока с внутренними областями коллагеновой матрицы, подавляя, тем самым, развитие кальцификации изнутри коллагеновой матрицы. Кроме того, под действием высокого давления раствор хитозановых макромолекул в угольной кислоте может проникать в более мелкие поры коллагеновой матрицы, чем из классического растворителя хитозана — уксусной кислоты, тем самым, увеличивая общую площадь покрытия коллагеновых фибрилл.

В петой главе нами было проведено исследование структуры и свойств нанокомпозитных хитозановых пленок с восстановленными и стабилизированными наночастицами серебра, получаемыми поливом из растворов в угольной кислоте.

Было установлено, что размером, степенью монодисперсности и однородностью распределения металлических наночастиц серебра в матрице хитозана можно управлять вариацией растворяющей способностью угольной кислоты по отношению к хитозану. Изначально, поливом из растворов хитозана с прекурсором серебра (нитрат серебра) в угольной кислоте были получены композитные плёнки. С помощью синтеза результатов РДА (кривые дифракции сняты м.н.с. химического факультета МГУ Э.Е. Левиным) и ПЭМ (изображения получены Абрамчуком С.С., к.т.н., с.н.с физического факультета МГУ) анализа было установлено, что такие хитозановые пленки включают круглые наночастицы металлического серебра относительно большого размера 100-150, сформированные агрегатами из многих, порядка сотен-тысяч единиц, нанокристаллитов серебра кубической модификации (рис. 5а, табл.2). Размеры данных частиц сильно отличались от размеров наночастиц серебра в полученных нами нанокомпозитных хитозановых пленках, политых из растворов уксусной кислоты (около Юнм, что соответствует данным, представленным в научной литературе). Однако, размер нанокристаллитов серебра, определенный по данным РДА, для обоих образцов порядка 10 нм. Поэтому, была предложена гипотеза, что структура хитозановых пленок с наночастицами серебра зависит от способности макромолекул хитозана стабилизировать наночастицы серебра в растворе, что должно определяться конформацией хитозана в растворе. В нашей лаборатории были получены данные, позволяющие считать, что в угольной кислоте макромолекулы хитозана сохраняют локальную степень компактности, поэтому имеют сравнительно малое количество свободных функциональных групп, способных стабилизировать наночастицы серебра, в результате сформированные нанокристаллиты серебра агрегируют с образованием наночастиц крупного размера. По мере увеличения расправленности хитозановых макромолекул, за счет повышения растворяющей способности растворителя, стабилизирующая

способность хитозанового раствора увеличивается, что должно приводить к меньшей агрегации нанокристаллов с образованием наночастиц меньшего размера. Действительно, улучшив растворяющую способность угольной кислоты, добавив уксусную кислоту в малом количестве (концентрация 1,3 г/л), выступающую в качестве промоутера растворимости, мы получили, что концентрация наночастиц в пленке возросла и, в среднем, диаметр наночастиц уменьшился и стал составлять 20-30 нм (рис.5б, табл.2), при этом размер нанокристаллов остался неизменным.

Табл.2. Размер наночастиц серебра и нанокристаллов металлического серебра, в нанокомпозитных хитозановых пленках, полученных поливом из различных растворителей хитозана (концентрация хитозана 10 г/л) при фиксированной концентрации прекурсора серебра (1 г/л)

Растворитель Размер наночастиц, нм Размер нанокристаллов, нм

Угольная кислота (Р=30 МПа, Т=25°С, 3 мол. % растворенного С02 в воде при этих условиях, согласно литературным данным) 240±20 11±1

Смесь угольной (Р=30 МПа, Т=25°С) и уксусной (1,3 г/л) 18±2 12±2

Уксусная кислота (20 г/л) 10±2 10±3

Щ

V

* 9

* » > * •

а)

500 пт а

б)

в)

Рис.5. ПЭМ изображения ультратонких срезов хитозановых пленок с наночастицами серебра политых: а) из раствора в угольной кислоте (Р=30 МПа, Т=25°С, 3 мол. % растворенного С02 в воде, согласно литературным данным), б) из раствора в угольной (Р=30 МПа, Т=25°С) с добавлением уксусной кислоты в качестве промоутера растворимости (С[СНзСООН]=1,3 г/л), в) рентгенограммы хитозановых нанокомпозитных пленок с наночастицами серебра, полученных поливом из растворов в угольной кислоте с различной концентрацией прекурсора (детектировано лишь металлическое серебро, иных кристаллических фаз не обнаружено)

Таким образом, было показано, что вариацией конформации макромолекул хитозана в угольной кислоте можно управлять структурой композитных хитозановых пленок с наночастицами серебра политых из таких растворов.

40-, 38363432302826-

Зависимость размера наночастиц серебра Зависимость размра нанокристаллов серебра]

16 14 12 10

Г

6-

4

6

10

12

Концентрация прекурсора АбЫОЗ, иМ/л

Рис. 6. Зависимости размеров наночастиц и нанокристаллов серебра в хитозановой пленке полученной поливом из растворов раствора угольной (Р=30 МПа, Т=25°С) с добавлением уксусной кислоты в качестве промоутера растворимости (С[СН3СООН]=1,3 г/л) от концентрации прекурсора серебра - А§>ГОз в этих растворах

Для пленок, полученных поливом из растворов в угольной кислоте, характерно наличие порогового значения концентрации прекурсора серебра, при котором наблюдается максимальный размер наночастиц (рис.6) и их минимальная концентрация в пленке. При значениях концентрации прекурсора выше такого порогового значения, наблюдается равномерное распределение наночастиц постоянного размера в пленке. По-видимому, это связано с конкуренцией следующих факторов. С одной стороны, при повышении концентрации прекурсора, ионам серебра, диссоциированным в растворе, энергетически выгоднее образовывать крупные нанокристаллы с меньшей суммарной поверхностью, и меньшей суммарной поверхностной энергией. Но, с другой стороны, будет выигрыш в энтропии в системе «молекулы хитозана в растворе-ионы серебра» при возникновении многих равномерно распределенных нанокристаллов в пленке, полученной поливом из такого раствора, при увеличении концентрации ионов серебра, являющимися потенциальными центрами образования нанокристаллов. Так как количество нанокристаллов в пленке зависит также и от количества функциональных групп, способных контактировать с ионами серебра, то ясно, что

при различной растворимости количество таких групп будет разным, поэтому необходимо большее количество ионов серебра для преобладания энтропийного вклада свободной энергии системы над энергетическим. Следовательно, пороговое значение концентрации будет различным для растворителей с отличающейся растворяющей способностью по отношению к хитозану, в которых конформация хитозановых цепей различается.

Выводы

1) Методом АСМ было обнаружено, что макромолекулы некоторых хитозановых материалов могут быть растворены в ск С02 и осаждены из таких растворов на подложку в форме изолированных одиночных цепей. С помощью анализа АСМ изображений установлено, что как растворимость макромолекул в ск С02, так и их конформация при осаждении из таких растворов на подложку зависят от степени ацетилирования. Для осаждённых макромолекул на подложке характерно наличие высокой степени расправленности макромолекулярного контура как целого, что количественно выражается в высоком значении показателя v=0,78-0,80, близкого к характеристическому значению для статистики двумерных случайных блужданий без самопересечений.

2) Установлено, что, в силу влияния высокого давления угольной кислоты, нанесение хитозана из растворов в этой среде на коллагеновую матрицу перикарда приводит к модификации не только приповерхностного слоя матрицы, но и к внедрению хитозана по всей её толще. Хотя, методом меченых атомов было обнаружено, что при таком нанесении количество привносимого хитозана составляет лишь около 1% процента от веса коллагеновой матрицы, удается детектировать улучшение её механико-прочностных характеристик, что обусловлено схлопыванием пор в объёме матрицы в условиях высокого давления и эффективным связыванием хитозаном их стенок с повышением общей монолитности структуры. В результате изменения структуры коллагеновой матрицы при нанесении хитозана из угольной кислоты и повышенной стабильности получаемого хитозанового покрытия достигается:

• рекордное улучшение характеристик матрицы в плане подавления кальцификации, интенсивность которой снижается на два порядка по сравнению с исходной немодифицированой матрицей;

• существенное снижение степени адгезии грамотрицательных бактерий (на два-три порядка) и полное подавление грамположительных бактерий, за счёт интенсивного взаимодействия их стенки с покрытием;

при этом сохраняется высокая биосовместимость получаемого материала.

3) Поливом из растворов в угольной кислоте получены композитные хитозановые плёнки с наночастицами серебра размером порядка десятков-сотен нанометров. Установлено, что такие наночастицы сформированы агрегатами нанокристаллитов металлического серебра размером около 10 нм, восстановленных хитозаном, причем агрегационное число зависит от конформадии макромолекул хитозана, определяющейся растворяющей способностью угольной кислоты, и составляет порядка сотен-тысяч единиц. Оказалось, что размером, степенью монодисперсности и однородностью распределения наночастиц серебра в хитозановой плёнке можно управлять изменением конформации макромолекул в исходном растворе.

Публикации автора по теме диссертации

1. Marat О. Gallyamov, Ivan S. Chaschin, Arif I. Gamzazade, Alexei R. Khokhlov, Chitosan Molecules Deposited from Supercritical Carbon Dioxide on a Substrate:Visualization and Conformational Analysis //Macromolecular Chemistry and Physics, 2008, v. 209(21), 2204-212.

2. Marina A. Khokhlova, Ivan S. Chaschin, Timofei E. Grigorev, Marat O. Gallyamov, Chitosan Macromolecule on a Substrate: Deposition from Solutions in sc C02 and Reorganisation in Vapours //Macromolecular Symposia,2010, v. 296(1), pp. 531-540.

3. Ivan S. Chaschin, Timofei E. Grigorev, Marat O. Gallyamov, Alexei R. Khokhlov, Direct deposition of chitosan macromolecules on a substrate from solutions insupercritical carbon dioxide: Solubility and conformational analysis //European Polymer Journal, 2012, v. 48(5), pp. 906-18.

4. Лютова И.Г., Анучина H.M., Бакулева Н.П., Костава В.Т., Чащин И.С. Антимикробные свойства биопротезов с покрытиями наноструктурированным низкомолекулярным хитозаном // Бюллетень НЦССХ имени. А. Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания», 2013, т.14(1), стр. 52-57.

5. Marina A. Khokhlova, Ivan S. Chaschin, Timofei E. Grigoriev, Marat O. Gallyamov. Chitosan macromolecules on a substrate: deposition from solutions in sc C02

22

and reorganization in vapours // Book of abstracts, European Polymer Congress EPF09, (12.-17. July 2009, Graz, Austria), p.74

6. Марина А. Хохлова, Иван С. Чащин, Тимофей Е. Григорьев, Марат О. Галлямов. Макромолекулы хитозана на подложке: осаждение из сверхкритического С02 и реорганизация в присутствии воды // Сборник тезисов, "П1 Евразийский конгресс по медицинской физики и инженерии "Медфизика - 2010" (21 - 26 июня

2010, Москва, Россия), Т. 4, стр. 197 - 200.

7. Иван Чащин, Исследование начальной стадии процесса осаждения макромолекул хитозана на подложку из среды сверхкритического диоксида углерода с последующим АСМ анализом поверхности подложки // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2011» (11-15 апрель 2011, Москва, Россия).

8. Иван Чащин. Анализ структуры и свойств нанокомпозитных хитозановых плёнок. // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2012» (9-13 апрель 2011, Москва, Россия).

9. I.S. Chaschin, Т.Е. Grigorev, М.О. Gallyamov. Direct deposition of chitosan macromolecules on a substrate from solutions in supercritical carbon dioxide: conformational analysis // Book of Abstracts 7th International Symposium Molecular Mobility and Order in Polymer Systems (June 6-10, 2011, St. Petersburg, Russia), p.139.

10. И.С. Чащин, М.О. Галлямов. Анализ структуры и свойств нанокомпозитных хитозановых плёнок // Сборник тезисов, XI Конференция студентов и аспирантов НОЦ по физике и химии полимеров и НОЦ по нанотехнологиям МГУ, (9 декабря

2011, Москва, Россия), стр. 33.

11. Чащин И.С, Галлямов М.О, Григорьев Т.Е.. Анализ структуры и свойств нанокомпозитных хитозановых пленок. // Сборник тезисов, Всероссийская конференция «Актуальные проблемы физики полимеров и биополимеров», посвященная 100-летию со дня рождения М.В. Волькенпггейна и А.А. Тагер (15-17 октября 2012, Москва, Россия), стр. 129.

12. Чащин И.С, Галлямов М.О, Григорьев Т.Е. Анализ структуры и свойств нанокомпозитных хитозановых пленок. // Тезисы докладов школы-конференции для молодых ученых "Макромолекулярные нанообъекты и полимерные нанокомпозиты" (21-26 октября 2012, Московская область пансионат "Союз", Россия), стр.89.

Подписана к печати -/7 ЛД.4Д Тираж 100 Заказ <33

Отпс,£пт>но в отделе оперзтнвнон ПСЧЗТН фнэ ннсского факультета МГУ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА"

Физический факультет Кафедра физики полимеров и кристаллов

04201358195

На правах рукописи

Чащин Иван Сергеевич

Структура и свойства хитозановых пленок и покрытий, получаемых из растворителей на основе диоксида углерода под высоким давлением

02.00.06. - Высокомолекулярные соединения

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель:

д.ф.-м.н.,

М. О. Галлямов

Москва-2013

Оглавление.........................................................................................2

Список сокращений................................................................................8

Введение.............................................................................................9

Цель и задачи исследования...................................................................15

Глава 1 Литературный обзор

1.1 Использование хитозана в качестве биосовместимого полимера в биомсдицинских приложениях.........................................................................17

1.1.1 Структура хитозана.....................................................................18

1.1.2 Растворимость хитозана...............................................................19

1.1.3 Конформация макромолекул хитозана.............................................21

1.1.4 Антимикробные свойства хитозана..................................................23

1.1.5 Хитозановые плёнки, получаемые методом полива..............................27

1.2 Анализ возможности применения сверхкритического диоксида углерода в качестве растворителя хитозана........................................................................29

1.2.1 Свойства сверхкритического СО2....................................................29

1.2.2 Применение ск СОг в качестве растворителя при нанесении тонких полимерных пленок на поверхности..................................................................31

1.2.3 Проблема растворимости хитозановых материалов в ск СО2..................33

1.2.4 Теоретические исследования поведения макромолекул при растворении в сверхкритическом растворителе..............................................................................33

1.3 Результаты исследований макромолекул полисахаридов с помощью ССМ...............................................................................................................34

1.4 Анализ использования угольной кислоты в качестве биосовместимого растворителя хитозана...................................................................................38

1.4.1. Угольная кислота...........................................................................38

1.4.2. Возможность растворения хитозана в угольной кислоте..........................41

1.4.3. Антимикробные свойства угольной кислоты........................................42

1.5 Нанокомпозитные хитозановые материалы.............................................43

1.5.1 Исследования биоактивности наночастиц серебра....................................43

1.5.2. Использование хитозана при приготовлении наночастиц серебра...............44

1.5.3 Возможный механизм восстановления металлических наночастиц серебра с помощью хитозана........................................................................................46

1.5.4. Получение хитозановых нанокомпозитных пленок с наночастицами серебра......................................................................................................47

1.6 Решение задачи снижения кальцификации коллагеновой матрицы биопротезного клапана сердца путем покрытия ее хитозаном..................................49

1.6.1 Коллагеновая матрица перикарда биопротезного клапана сердца................49

1.6.2 Ингибирование кальциноза коллагеновой матрицы хитозановым покрытием...................................................................................................50

1.7 Постановка задачи исследования исходя из текущего фундаментально-научного и научно-технического уровня..........................................................................52

Глава 2 Экспериментальная часть

2.1 Материалы

2.1.1 Приготовление хитозановых образцов

56

2.1.2 Приготовление хитозановых материалов для получения нанокомпозитных пленок с наночастицами серебра поливом из водных растворов кислот..............57

2.1.4 Коллагеновые матрицы перикарда биопротезного клапана сердца..............59

2.1.5. Подготовка клеток для проведения исследования биосовместимых свойств коллагеновых матриц перикарда................................................................60

2.1.6. Подготовка коллагеновых матриц перикарда для проведения исследования их биосовместимых свойств........................................................................61

2.1.7. Подготовка экстрактов коллагеновых матриц перикарда для проведения

исследования их биосовместимых свойств...................................................61

2.2. Экспериментальные методики, используемые в работе

2.2.1 Нанесение хитозановых макромолекул на подложку слюды из растворов в ск С02.....................................................................................................62

2.2.2. Приготовление растворов хитозана в кислотах для получения нанокомпозитных хитозановых пленок поливом..........................................63

2.2.3 Получение хитозанового покрытия на коллагеновых матрицах перикарда биологического протеза клапана сердца осаждением из растворов хитозана в угольной кислоте...................................................................................65

2.2.3.1. Приготовление раствора хитозана в воде, насыщенной углекислым газом под высоким давлением (угольной кислоте).................................................65

2.2.3.2. Нанесение хитозанового покрытия на коллагеновые матрицы перикарда биологического протеза клапана сердца методом прямого осаждения из раствора хитозана в угольной кислоте....................................................................66

2.2.4. Исследование структуры нанокомпозитных хитозановых пленок с наночастицами серебра и коллагеновых матриц перикарда...............................66

2.2.5. Исследование механико-прочностных характеристик коллагеновых матриц перикарда с нанесенным хитозановым покрытием........................................68

2.2.6. Исследование адгезии бактерий к контрольным образцам коллагеновых матриц перикарда и к образцам коллагеновых матриц перикарда покрытых хитозаном.............................................................................................69

2.2.7. Исследование биосовместимых свойств коллагеновых матриц перикарда с нанесенным хитозановым покрытием из растворов в угольной кислоты.............71

2.2.7.1 Схема эксперимента......................................................................71

2.2.7.2. Контакт с образцами (экстрактами)..................................................71

2.2.7.3. Метод витальной окраски. Критерии оценки цитотоксичности экстрактов..........................................................................................72

2.2.8. Исследование кальцификации коллагеновых матриц перикарда с хитозановым покрытием, полученным осаждением из растворов в угольной кислоте.............................................................................................73

2.2.9. Исследование структуры межфазной границы и фазового разделения смеси Н2О/СО2 при различном давлении и температуре..........................................74

2.2.10. Определение количества хитозана в коллагеновой матрице методом меченных атомов..................................................................................75

2.3. Обработка экспериментальных данных

2.3.1. Процедура численного анализа ССМ изображений хитозановых макромолекул осажденных на подложку из растворов в ск СОг........................76

2.3.2 Обработка данных, полученных при исследовании механико-прочностных характеристик коллагеновых матриц..........................................................78

Глава 3 Исследование конформации индивидуальных хитозановых макромолекул при прямом осаждении на подложку из растворов в сверхкритическом диоксиде углерода

3.1. Модельная система: прямое осаждение макромолекул хитозана из раствора в сверхкритическом диоксиде углерода на атомарно-гладкую подложку слюды................................................................................................................................79

3.2 Анализ конформаций макромолекул на подложке исследованных образцов хитозана осажденных из растворов в ск СО2................................................82

3.2.1 Конформация макромолекул хитозана с 2% С А, адсорбированных на подложку из растворов в ск СО2................................................................84

3.2.2. Конформация макромолекул хитозана с 15% С А, адсорбированных на подложку из растворов в ск СО2................................................................84

3.2.3. Конформация макромолекул хитозана-0,85-Са (15% СА), адсорбированных на подложку из растворов в ск СО2............................................................90

3.2.4. Конформация макромолекул хитозана-0,50 (50% СА), адсорбированных на подложку из растворов в ск СО2................................................................93

3.2.5. Конформация одиночных полимерных цепей, осажденных на подложку, и ожидаемая механическая стабильность покрытия.........................................93

3.2.6 Сравнительный анализ растворимости исследованных модификаций хитозана в ск С02.............................................................................................96

3.2.7 Краткие выводы

101

Глава 4 Исследование структуры и свойств хитозанового покрытия, нанесенного на коллагеновую матрицу перикарда биопротезного клапана сердца, методом прямого осаждения из растворов в угольной кислоте

4.1 Определение растворимости хитозановых образцов в угольной кислоте.......103

4.2. Исследование структуры межфазных границ и фазового разделения смеси Н2О/СО2 при различном давлении и температуре.........................................105

4.3 Определение количества хитозана, наносимого из растворов в угольной кислоте на коллагеновую матрицу перикарда.........................................................106

4.4 Определение локализации хитозана нанесенного в коллагеновой матрице перикарда методом ИК спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО)...............................................................................107

4.5 Исследование методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) структуры поверхности образца коллагеновой матрицы перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из растворов в угольной кислоте...............................110

4.6 Сравнительный анализ структуры объема коллагеновой матрицы перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из растворов в уксусной кислоте, и в угольной кислоте................................................................................113

4.7 Определение механико-прочностных свойств коллагеновых матриц перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из угольной кислоты..........................116

4.8 Определение степени адгезии некоторых клинических штаммов бактерий к коллагеновым матрицам перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из угольной кислоты...............................................................................119

4.9 Определение биосовместимых свойств коллагеновых матриц перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из растворов в угольной кислоте.............................................................................................125

4.10 Изучение кальцификации коллагеновых матриц перикарда с хитозановым покрытием, нанесенным из растворов в угольной кислоте............................126

4.11 Краткие выводы...........................................................................129

Глава 5 Исследование структуры и свойств нанокомпозитных хитозановых пленок с внедренными наночастицами серебра, полученных поливом из растворов угольной кислоты

5.1 Исследование структуры хитозановых пленок с наночастицами серебра, политых из растворов в угольной кислоте....................................................132

5.2 Исследование структуры и свойств хитозановых пленок с наночастицами серебра, политых из растворов 2% уксусной кислоты....................................136

5.3 Исследование структуры хитозановых пленок с наночастицами серебра политых из растворов в смесях угольной и 0,1% уксусной кислоты..............................138

5.4 Сравнительный анализ структуры нанокомпозитных хитозановых пленок, полученных поливом из растворов в угольной и уксусной кислот, а также угольной с добавлением уксусной в качестве промоутера растворимости........................143

5.5 Краткие выводы...............................................................................149

Заключение.......................................................................................151

Выводы.............................................................................................153

Благодарности....................................................................................156

Список литературы.............................................................................158

Список используемых сокращений

ССМ — сканирующая силовая микроскопия СЭМ — сканирующая электронная микроскопия ПЭМ — просвечивающая электронная микроскопия РДА — рентгенодифракционный анализ ИК — инфракрасная (спектроскопия) ГПХ — гель-проникающая хромотография

ИК НПВО — инфракрасная спектроскопия нарушенного полного внутреннего отражения

СА — степень ацетилирования

СтА —степень адгезии

ИА — индекс адгезии

ДХУК — дихлоруксусная кислота

ГЦК(Р) — гранецентрированная кубическая структура

Введение

В настоящее время с развитием медицины возрастает количество научно-исследовательской литературы, связанной с разработкой методов получения биосовместимых пленок и покрытий [1,2], которые могут находить широкое применение в биомедицинских приложениях. Хитозан активно используется в качестве компонентов таких биосовместимых пленок и покрытий в связи с уникальным сочетанием антимикробных, биосовместимых свойств и поликатионной природы этого полимера [3,4,5].

Действительно, как показывает практика внедрения протезов в организм человека, существует проблема их отторжения. Поэтому для улучшения совместимости с организмом человека протезы покрывают пленками, улучшающими биосовместимость.

Как показали недавние исследования, хитозановые биосовместимые покрытия имеют особый практический интерес, поскольку не только придают биосовместимость устройствам, внедряемым в организм человека, но и позволяют решать частную важную задачу снижения кальцификации биопротезного клапана сердца.

Действительно, в настоящий момент в хирургической практике биологические протезы клапанов сердца являются наиболее перспективной альтернативой заменяемому клапану сердца человека. Биологические протезы клапанов сердца, в отличие от механических протезов клапанов, не требуют пожизненного применения антикоагулянтов пациентом, поскольку их створки сформированы из перикарда животных, в основном свиньи или телёнка, родственного по своему составу заменяемому клапану человека, включая родственность физико-химических свойств поверхности. Биологические протезы клапанов сердца имеют гемодинамические свойства, сходные с показателями нормальных клапанов человека, в результате чего

отмечается гораздо меньшее повреждение эритроцитов и меньший риск тромбообразования. Перикард животных перед использованием в качестве материала для биопротеза клапана сердца должен быть обработан раствором глутарового альдегида с целыо его химической стабилизации и устранения видоспецифичности, способной приводить к иммунному ответу организма человека.

Однако, известно, что наличие привносимой такой обработкой свободных остаточных альдегидных групп, контактирующих с элементами крови, является основным фактором отложения фосфатов кальция на поверхности биологического протеза клапана сердца {калъцификацкя), что приводит к выходу клапана из строя [6,7]. В настоящее время срок службы такого клапана составляет порядка 10 лет [120], это означает необходимость проведения повторных операций по замене клапана с указанным временным интервалом.

В 1994 году Ж.Чандой была предложена идея маскирования свободных остаточных альдегидных групп ковалентным связыванием с аминогруппами хитозановых макромолекул [8].

В дальнейшем данная идея была успешно реализована экспериментально и получила подтверждение [9]. Действительно, было показано, что нанесение хитозана на перикард, стабилизированный глутаровым альдегидом, позволяет увеличить долговечность и биосовместимость таких модифицированных биологических протезов клапанов сердца за счет понижения цитотоксичности и склонности к капьцификации [10,11,12].

Способ подавления кальцификации, представленный в современных

исследованиях с применением хитозановых покрытий, основан на

использовании при их формировании в качестве растворителя хитозана

уксусной кислоты. Однако, использование уксусной кислоты в качестве

растворителя хитозана в некоторых случаях может приводить к

аллергическим реакциям или иным негативным откликам организма на остаточный растворитель в модифицированном нанесением хитозанового покрытия биологическом протезе клапана сердца в силу возможной гиперчувствительности или индивидуальной непереносимости [12,13]. Кроме того, остающиеся в изделии, по завершении процесса нанесения, следы остаточного растворителя и связанные с хитозановыми цепями уксуснокислые анионы не только придают изделию долговременный специфический запах, но и могут приводить к избыточному набуханию и деламинации хитозана при последующем контакте с водной средой организма.

Также для биомедицинских приложений интересны и перспективны хитозановые пленки, в том числе для задач тканевой инженерии, для регенерации кожи человека после ожогов или ран. При этом, можно усилить антимикробные свойства пленок дополнительным внедрением в хитозановую матрицу наночастиц серебра.

В научно-исследовательской литературе представлены работы по изучению структуры и свойств растворов хитозана с восстановленными и стабилизированными, непосредственно в таком растворе in situ, наночастицами серебра и получаемых из таких растворов нанокомпозитных хитозановых пленок с внедренными наночастицами серебра [14,15,16]. Однако, в этих исследованиях в качестве растворителя хито