Структурно-функциональные свойства протаминов осетровых рыб тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИ! ОРДЕНА й^НХНД., 0РД2КА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕЭОЛЮТ',

ПОТСТГЛ <РРЛПГПРПТ'П ТГВАГТТПТ'П г:иА1Ггатт ГПГ'УТТЛГГ'Т'аТЛЛЛТОГ ут^"3'^5^!''^*?

икзки ".В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

Кз правах рукописи

ШБИ1 Владимир Кириллович

УДК 543.544 ; 547.1,962+963); 573.3 ; 577.(112+323).

струт^с^фжциональнье свойства проташов осетровых рьб.

Специальность 02.00.10 - Сиооргашеская химия,

члт п ггя гз ттгм*т\г» тптлг т*

физиологически актив-

хлтчг оаталчч5

ЛИЛ ииЦиО^и«

н2 сс"сх2к1*3 уч9нсй ст81гзк11 доктсрэ

химических наук е форме научного доклада

Москва 1ЭЭ2

Работа вшкшгагз на кафодрэ химии природных ссадив химического факультета НГУ км. М.Б.Ломоносова.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук

-rtHeiftTQ/^VT'Y VI Ct Г TV

доктор химических наук

А.А.БайсоЕ,

ÇT П /VïQ^mryu

А.И.Краполов.

ЕЗДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ТДгтгып-мтгт* »»n »-QVir «с:—>rlty-m*jr»t Т"»

• j A DU.^» k/liUJtUi, мм л «4M •

В.А.Энгельгзрдта РАК

Защита состоится и 6 " /¿¿У/^-7 Î 992 г. в часов

'па заседании Специализированного совета Д 053.05.47 по химическш наукам при Московском государственном университете им. ¡¡.з.ЛачО' юсова по адресу: ГСП 11S399, Москва, В - 234, Ленинские гори ..(ГУ, лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С авторефератом ыохно ознакомиться е библиотеке химическог факультета ЛГУ.

Аето^сСс^зт "сзослан п " 1992 г.

секретарь кандидат хп\Ег;ескпх наук 'у-"'^

Т' "П ГЧг TMJATJO ««•А. (и>1ииииии

í.'.; 5 "дел :сертдций

ЛСТЦОГ V я О í TfTTTT""« Г""'ЛГ * Г * ГГЛ<П.|

i ■ ■ ...^.1, 4 4ul. XUk4 ' '■ »4/ ( >uui Л AUU A U

Актуальность проблем1:.

Протаминн рыб представляют собой небольно, богато основными аминокислотами ядерные бола:, которые, прочно сеязыпэнсь с ДНЯ, /чэстеуют е формировании хроматина половых :слэток. Кахды^ вид рыб ¡тлеет сбой уникалкхый набор проть>линоЕ, представленный 2-4 компонентами. Предполагается, что основной функцией протаминов является компэ" тизация ДНК в голоекв сперлатозсида и перевод еэ е Зпохимически инертное состояния. Интерес к протакипа:.: обусловлен ге только тем, что зтал белкам принадлежит ключевая роль е про-дессах хранения и переноса генетической информации. Протамипы шевт ряд особенностей, открывающих сЗолыаиэ перспективы' для их фактического использования. Было показано, что они обладают ал-ГИбЗКТврл'ЗЛЬНО»! «' протизеопухслззо2 зктизнсстью Способность п^о— гакиов эффективно взаимодействовать с гапарпнои клала ¡троков

j ... а л ¡г... ..

\Хап%»гурт\и tío ттт.тл^ wronfln т/ ттг\г»»п©«1ятгиом тмтМ тэ isanfnfyaman

AAKt WtltW Л. Дам л. W^JW W 4 yiHlXIUltl f ¿-1 ÜUU 4. OlО

гремя достигнут скромный прогресс в их изучении. Удалось выделить зрстамиЕЫ из некоторых еидоз рыб и установить их строение. Изуче-ш некоторые физико-химэте с-та сеойстеэ комплексов прстаминов с

lUTf riTTWovr» n^wnotnro ^/■>ттг*/Угч.т ■ vonnvurrtrana тэгттго погттжа ■ппи./лг'етттт'у

VU«* Uuiiuuuuu , ..........1 ■ i' 1 ■ П I -I - ■ t....... ■" Л MUUi......- "

тротаминов, их строения и.конфорлации, j тагске роли в структурной >рганизации хроматина половых клеток остазтся невыясненными. Изу-гение протаминов и их практическое использование е значительной зтепеки сдерзиЕзится сложностью получения в гомогенном Еиде. 1рехдэ всего это связано о еысоким содержанием оснсвних аминокис-гат - более 703, и наличием протяженных аргининоЕых блоков, что гриЕодит к низкой эффективности классических -методов шделения и ■нализа белков и требует разработки ноеых подходов. По этой принте большая часть работ, посвященных выделению протамчнов, вы-юлнена на суммарных белках. Это усло^шяет понимание структурно-йнкциональных особенностей протаминоЕ.

Цеди и задачи исследов^-Жй*

Целью настоящей работы являлось изучение структурно-функциональна СЕОЙСТВ ГрОТЕМИНОЕ ОСвТрОЕЫХ рыб, ЕЫД0ЛОННЫХ. И! гонад лcipensor etai¡atuG и еыяснокиэ роли этих белков в Сор:,;про-Еакии хроматина половых клеток. Особое внимание удалялось рззра' йоткв новых катодов Еыделенкя-и анализа протаминов, выяснений ме Х2Н1*ЗМЗ КО?ЛЛ£1КТИЗ2Ц15И ДНК HpOT2?£IIi2?id & ТЗКЛ19 ГГрООЛО./S ITCSKTIT46

кого кспользовенйя протамкнов р-3 з качестве анткгепар^нзтов

rott ттпст mrzsn-очу t? n^artrjr п •зет«» т»

«w^iuii, A lukUu а aJ ktjii w w A «aim UI^I

поставлены и решались апедувдаэ задач::: 1. Хрс:датогрг£этбское вы

т»р гтпхгтло у.гцТГ'ЖГУrrntm nitair ттг»т»о»»»*т»г»т5 г»*? TV-itJОп ~ / ~ ^

^■ItUlH.C 4«-¿1,1 I >J»/sj * «AW Л fc р <7 I МЭ «Г ( О k(T • ■ U> «. Ы)

f"Tfttlmrjr»0 т* T\0OT>Clf,<r>»T,t/O ТТГ\ТТ А >гтт<т Л>ГГ»ПТГ1 Г» ТГ? T*»"»T Vf* Trrwvrf} тт*\лой T»c

кия этого процесса. 2. Установление ахшскксдотно.. последозатед! кости стедлиноЕ, изучение их конфору.зции и антигепариновой акти:

*тлг>*т» О. 1тлм?отт"*л л*г\\ггт vavnrvo гтгл/л^о^^гилтг? р' TTUTf t* т»о*«тоттт*а т*лг

зико-химкческах своГ.сте . 4. Установление характера упзкоеки ДКХ

yrv>»*o«»,rTrtJQ ттгч t»r\T5*.TV v na*nnv Ц Г/тишап ггг»т»с тти'чгпт v г»ао тгцлитгЛ mv

aVJW4f«U ' »•' UWW4U Ulift >WIU • IJ« »UW I1441UA WUW^IIuQtUtO М^Л

та:ляаов с иротвоопуходэЕЫ?.! suthOiiotiikom - py бо?.Е5вдном -Нзумная нов:*знз jypcicTi71-!з екзя ценность боты *

В результате проведенного исследования были разработаны hoe способы выделения протаисшов рыб. Предложен оригинальный кет выделения гомогенных протаминов фракционированием отработанно ультразвуком солсвого раствора нуклеопротамина. Разработана » годика определения цротаккнов с помощью пикриновой кислоты г электрофорезе в ШАГ.

■ С02 23тсм2тиз*жр0в£н2*5я ciiwt£i»'2 хс*лпь20у6ри02 0пт2ми321 условий хрзматогра£ического разделения протаманов на основа i слэдовательного симплекс-метода в варианта Колдера-!йда, кото; спзрвкэ позеслиле подобрать условия полного разделения тфогакз методом осреидоннпфазохгоа БЭНС.

.u.- - етелднны А, В и С и установлены их аминокислотные после,

tjn««a ntttA^Tni ТТ > W О OW\ IT TrrgXTtt QfO^^OTQa V p9^JKCil

:тротамино2 р-'О - к да- к грипроталсшач. Впервые выделан протг piiO (стадлпн С), колек^'ла которого на'аназтел кепссредстЕенн

ргининового блока.

Изучены конформацконныэ осоСзнности стеллинов и продуктов их ямической модификации катодом КД. Предложена модель молекулы ротаминоз, согласно которой полипептидная цопь белка mos9¿ быть редставлена в виде левоспиральных сегментов, разделенных ^-поворотами. Прячем я-кокцзезя кн,- группа и с-концевая

ППТТ_тп мгтпта птлч/дттт-т У/чт»очптэ гаио irn<n ттн ттгчЛао ттотгтгт* чтоцп и а мл—

WWü i ^jj lUiU WVüWUU • V \j Л y Í4U 1 UUMtW «ИМ

©кула иротакхна тхрянгмаэт а-спиральнуЕз хонформацвд.

ТТт\л\тза т>ои ттото nT.UT.Tffr виа птяп t> «тжоттпга non Trrrrmtv ffmvTymn0 pq

Ж UM^UkUA UUkMUtU (UMUt ^UlMUl llllifi уш l^U ^/U iJ MU IJ< .

OTTOTwrtrrsmrtn ov«r»rjrow\r»«t»v рта т» "шли ТЭттатлона тгг»точо^> wqtx Лот/*?» о

wMu^Muiwüj W Ш1 ■ *■■ ••■*"' id U «WMotuwM • míw^umu j u* I^ii > л. u u*. >

оста янтигепариноЕой активности протзмкнов от компонентного сос-

ooci TT^r»mrv>pTia **/■> тта ттт. тто'эио ttctvwiг>ст глттотттттэатт, ртт__

U4ÍU • ÜWW I^UCUU Л WtKlV A <HU ЫъиЛ ttiW/^WMtW у UUWWMUHM^ti«» »-» L^W* Ui^U Л. O VÍA

игепаряновую зктиеность протаминов осатроЕых по данным оСрвщен-офазовой ЗЭ5Х.

Получены комплексы индивидуальных стеллинов с ДНК и изучены х фнзико-хж-лесхиз сеойствз. Определено число остатков амино-ислот, приходящееся на один нухлеотид для белок-СЕязыващих об-зстей ДНК. Впервые применено ну:лзазное расщепление для изучения эмплекссш протаминов с ДНК и показано, что стеллины А и В пред-очтительно сеязыеэются с АТ-богатыми областями ДНК и зачищают их г гидролиса формантом. Обнаружена способность протаминов при вязыезник с ДНК кндуциировзть подобнее спектры КД. Получены эказательстЕа, сЕвдетельстЕущив о неодинаковой роли компонентов ротаминов в структурной организации хроматика половых клеток.

Впервые осуществлено протеолитическое расщепление нуклеопро-Еиина термолизином. На осжше анализ? продуктов гидролиза пред-эген механизм кокпактиззщет ДНК стеллинами в нуклеопротамине, з ЗТСрС«Л KJBQ49E2^ рОЛЬ СрИНЗДЛвХИТ К""К0НЦЭ2С»ДУ ир**15*ИК0ВСМу ÓJIQíCy.

Ил,_»чу>тт©игтж t\ox7t»,t™,£íti/-it^t\о.г**)гтг т* гуг\ъатгтхпауттжг>тзгуЪ trtrtfT\rynvryrrmir титрт^огта

mu «U^ut'm л л. wuU* ut^wWuuwM ПК**>j/w W1 >w* « »»«» uuüуши

лт/очоттг» 1Тнуч ттпт* ттлч»п*»тшот) f* TTTJtf гтг\лт*оглттчгт» HSnT»—

MtUWUUU y U^iU UWIaUMIiO^WWW * I «I uyv A v ^iUk U^VUWAU/yil yO^i

т/"\тэаттгжа чл*T»V/> vrv*r»«PCTTTrmmaпхпгт г«|ртмгг/*мгт\ a vrvrrmtw TTTTV tiarn тгтят'г» а

ItUWi^X llllO »y É/y V* * UWWUÁ lU biUXA i»4jl Uf ikU AU^UÁ ¿jylfelW

ТТ/лхгв'э orre» /*тг/-»г»гчЛ-и/-»г»1*т. гтлтошголо 1гппоа яатх. латигь'тчтгтл''*

м I^WÍMNW • i*WikUUUMU WilUWVVMWWiM »4JUW A UlIUUtUU j M^UlMUéAÜ W A j M« j

реализацией лиотройных екдкех кристаллов ДОС в водно-солэвом

ПОР ТТа П^^О^ЭЛ vrwirr Travrwo ТТГ\Г\Н»<Л«кгппт» г» TTHTÍ рл»э TTQTI тзчг»г\—

¡1UA • ¿Ш ÜWUUUU 1УШЧ1 liím .IUWU M^J A wtlauuwfi W Uuu^uu

зчувствктельный 2ядк0крясталлхч8схх£ датчик дая блосексоринх

^ JUMWAUi

Получены ковздектные соединения стеллинов А и 3 с актибиоти-jm рубсмкшшом. Показана принципиальная еозкозиость полу'юния

производных антибиотиков с протаминамп и перспективы их спользо-вэния в медицинских целях.

Разработанная система компьютерной оптимизации хроматографи-ческого рзздолония била успешно использована для нахождения усло-еиЯ препаративной хроматографии гистонов (Научно-исследовательский институт фнзнко- химической биологии га. Л.К. Белозерского МГУ), антибиотиков (Институт по изысканна новых антибиотиков РЛ?.С{), белков молока (^псковский институт прикладкой биотохн'ологии). Гомогенные препарата стелл:пгае и их комплексы с ДНК были использованы в экспериментах, проводимых е Институте молекулярной биологии РАН, Институте по изысканна новых антибиотиков РАЖ, 2е" Московском медицинском институте иг.«..К.И. Пирогова, Институте химической физики РАН.

Апробация -работы.

Результаты работы докладывались на IV Всесоюзном симпозиум; по химии белков и пептадоЕ (Г.^шск, 1977), на V ¡.'.ездународно; симпозиуме по хроматографии (Ялта, 1985), на конференции по высокоэффективной кидкостной хроматографии и электрофоратической технике в биохимии (Шиофок, Венгппя, 1985), на Будапештском хромато-графическом симпозиуме (Венгрия, 1535), на VI Всесоюзной конференции "Применение ионообменных материалов в промышленности : аналитической химии" (Воронеж, 1985), на IV Всесоюзном симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии (Алма-Ата, 1937), на 1 Мегсдунарсдном симпозиуме по колоночной 2£:дксстнсй хроматографа (Амстердам, Нидерланды, 1937), на 6 Дунайском ск/лозиуме по хро матографли (Варна, Болгарин, 1.837), на 12 !/е^народном симпозну мэ по хроматографии (Вашингтон, США., 1933), на 17 Кекдународнс симпозиуме: по хроматографии (Вена, 1937), на Всесоюзном симпозиу ме ~>1;ц,,.п:! белка" (Тбилиси, 1990), на V Все союзном симпозиуме г молекулярной г^дкостной хроматограф::;! (Рига, 1990), на Всесоизнс кок^ореиини "Применение хроматографии в микробиологической и ш Сйвоа промышленности" (Гелендкик, 1990), на 1 Всесоюзном совещ: •ал: по лиотропным гадким кристаллам (Иваново, 1990), на 8 Мзхд народней конференции молодых ученых по органической к Сиооргак ческой химии чРчга, 19Э1), на 10 1Ь,здунсродком симпозиуме по В32 с-элкез, пептидов и полинуклеотидов (Висбаден, С?Г, 1990).

1. Выделение индивидуальных протаминоз из гонад

^letpenspr atollatua.

Одна из наиболее слогагых проблем, которая возникает при изучении протаминов - видолоние их в гомогенном еидо. Это связано не

ТОЛЬКО с ЕЫСОКОЙ ОСНОВНОСТЬЮ ЭТИХ СОЛКОЕ (pl>12 ), но T3ICK0 И С

гем, что отдельные компоненты протаминов jto различаются заметай Есего одной аминокислоты. Кроме того, ео многих случаях методические приема, успешна зарекомендоваЕПип себя для протаминов, выделенных из одного источника, оказываются малоэффективным! для цругой группы белков этого класса. Поэтому первым этапом наиих исследований было применение известных и разработка новых подходов ДЛЯ ПОЛуЧОНИЯ ¡ШДИВИДуаЛЫГЫХ КОМПОКвНТОВ ИЗ Г011йД Acipenaer iioiiatutí. Были использованы различныэ эдектрофоретические и хро-латографичесн»й~ методы.

1.1. Электрофорез стеллина.

На начальном этапе исследований была предпринята попытка ис-юлъзовать электрофорез на бумаге и в 30" полизкриламндном геле-[ПААГ). В обоих случаях не удалось добиться удовлетворительного зазделения белков. Лучший результат был получен при разделении :телл1ша в 30" ПААГ при pF 1,9. Однако, сложности работы с 30% 1ААГ и неполное разделение компонентов делали такой подход мало-герспективным для препаративного выде эния индивидуальных прота-пшов. Высокий положительный заряд протаминов позволил нам уснеп,-[о использовать для проявления зон белков при электрофорезе в НАГ пикриновую кислоту. Эксперименты показали, что пикриновая мслота имеет ряд преимуществ по сравнению, с амидочершы юв я :умасси голубым R-25Ó: быстрая диффузия красителя в матрицу геля, юзможность визуализации зон белков без опсжкп геля, сокращение рамени отмыьки геля. Кроме того, оказалось возможным количес-'Еэнное определение протаминов в пределах 5-100 мкг, что находит-!Я на уровне чувствительности, достигаемой с, примененном амидо-врного 10В II кума С СИ R-250.

1.2. Хроматография стеллина.

Для хрс:латаграфяческого разделения стеллина первоначально к использовали сорбенты, которые применяются для гельфильтраци белков: сефаденсы 0-25, 0-50,биогели Р-2, р-4, Р-б. Все эти сор бенты обнарукивали низкую эффективность и селективность по отно копию к компонентам стеллина..Особенно это проявлялось в случа СпогелеЯ. По-видимому, одна из причин -элоктростатпчос:ссо £зз;г.:о действие протакжов с матрицей сорбентов. Об этом свидетельстзуе более высокое значение эффективности перечисленных сорбентов я отношению к глобулярным белкам с близкой молекулярной массой.Луч юе результаты были достигнуты при использовании ионообкеной хрс матогрьфии на катионитах средней силы:' КБ-4, фосфоцеллюлозы, И сефадексов 0-25 и 6-50, СМ-целлвлозы. Из перечисленных ссрбентс лучшей селективностью к стедлинам обладал СМ-сефадекс С-25, прг менение которого позволило выделить две основные фракции и од*

Рис.1.1.Фракционирование стеллина на СМ-сефадексе а-г5 в 0,05 У фосфатном буфере, рН 6,2

минорную (Рис .1.1).

2.0 г.5

О 30 60 во 120 150

номер фракции

По данным аминокислотного анализа и дискового электрофореза ПЛАТ фракции А1 и В были гомогенны (Гзбл.1.1) и назЕаш сте линьчн А и В соответственно. Что касается фракции А2, то хромат графиеЯ на СМ-сефадексе 6-25 не удалось достичь ее однородности Из р.1с.1.1 вадно, что десорбция стеллинов с колонки происх да? при еысокой концентрации КаСХ (1,8-1,9 Ы). Эта особенное нтх-тькотюз ?илэ использована нами для разработки оригинальной к зодика ьиделошл этих белков фракционированием обработанного уд

ь

тразвуком солевого раствора (1,3 • ■ Nací) нуклоостеллина. При этой концентрации соли происходит полная диссоциация нуклеостеллина на ДНК и протамины , однако белки еще могут бить сорбированы на ка-тконите. Достоинством разработанного метода является то, что одновременно с протаминами он позволяет выделить ДНК. Классические методы выделения протаминов, как правило, приводят к необратимой денатурации ДНК.

Как уже отмечалось еышо,

Табл.1.1

Aí.mho-

Т/т*<~» ттлта Гьлюх.и л UJ

А1 А2

С76ЛЛИН А

г»т»а п гтт

kís IjfS ATg Glu Ihr Ser Gly Pro Ala Ic-u

o ali\

5,1(5) 11,а(12)

1,9(2) 0,9C) 1,10)

2,1(2) 1,0(1)

O Of4l

4,9(5) 11,9(12)

1,3(2) 0,9(1) 1,2(1)

1,6(1-2) 1,0(1)

0,9(1)

19,2(19) 1,0(1)

1,3(2)' 2,1(2) 0,9(1) 1,0(1)

»пИНОрКЗЯ Фр2К1Ц*Я A2 ла неоднородна. Рохрома-

rrrrnnriíflT^fT pQ UO "ПС>13 ТТТПТ —

IUI ^'U^liMi Uu ÍLÍ4 ^UUVUt 'i

ных сорбентах не привела к желаемому результату. Тогда было принято решение использовать для этой цели обращенно-фа-зоеую ВЭЖХ . Ранее ЕЗКХ нэ применялась для разделения цротамиминов, поэтому за основу были взяты условия проведения хроматографии, позволявшие разделять гистоны(0,1% трифторуксусная кислота, колонка Cía, градиент концентрации ацетонит^ила) CGurley L.R. ct. al.,1933, Mazrimae J.A. and Balhorn R.,19833. Учитывая высокую гвдрофильность прстьминов наш была использована такаю колонка на основе Cíe - Zorbaus опз. однако, выбранные условия проведония процесса нэ только нэ позволяли разделить стеллины, но и приводили к значительному необратимому связыванию белков с сорбентом. Проблема в значительной степени осложнялась тем, что из анализа литературных данных нельзя было сделать однозначный еыеод о факторах, влшшщее на разделение основных белков. Учитывая высокую разрешающую способность метода ВЭКХ, а также'принимая во внимание актуальность проблемы выделения индивидуальных протаминов, было решено для нахождения условий полного разделения компонентов стэллина использовать методы оптимизации.

2.Оптимизация ВЭЖХ стеллина.

2.1. Выбор мотода оптимизации.

Оптимизация процесса может быть наиболее эффективно выполнена по его модели. Однако существующие теории мотода ВЭКХ в целом недостаточны для построения надежных моделей .основанных на физико-химических закономерностях. Регрессионные ке модели оказываются полиномами настолько еысокого порядка, что требуют для своей идентификации слишком большого объема экспериментального материала [Bounine J.Р.,19841.

Било принято решение применить последовательный симплекс-метод е варианте Недцера-Мида [Neider J.A. -md. Head R. ,19651-

^-rrti т*гэ tioie^.n ттрр ^/^»fvavwrDtitTY та «э а ттвиот up ттгг1то?*цп 'fr /лггтипгмо omjrrjr

«iU UUUOUMC О . . . 1 ..... A UU^U 1WA ItC^uJlWJillWJt uii*uiuuwu4<i«l •

Достоинствами этого метода являются быстрая сходимость к оптимуму, малая чувствительность к размерности факторного пространства, относительно небольшое число обращений к целевой функции, ускорение поиска вдали от оптимума и высокая точность его локализации. Немаловажным является простота алгоритма Нелдера-Мвдв - он может бить легко реализован на ЭЕ.\! ввиду незначительных требований к оператпькой памяти.

Учет ограничений но интзрьалам варьирования факторов осуществляли следующим образом: ьсли какая-нибудь точка выходила за пределы области допустимых значений хотя бы по одному фактору, онг возвращалась на нарушенную границу. Тем самым устранялся основно! недостаток способов учета ограничений - трудность при поиске оптимума, находящегося в непосредственной близости у границе области допустимых значений или на самой границе области.

2.2. Выбор факторов оптимизации и интервалов их варьирования.

Список факторов, влияющих сколько-нибудь значительно на про-цзсс хрэматографированая. включает параметры колонки, скорост: потока подвижней Фазн и еа состав, температуру колонки, концен i трацню иенпарного реагента и т.д.

"сходя из предварительны» экспершентоз для раздзлэния прот ыгмгц yci шбрдли оорОонт на основе силикате ля, модофицированног

октвдецилсиланом - Zorbax ODS. Оптимизации подлежали : содержание ион-парного рвагепта (трифторуксусная кислота-ТФУ), скорость изменения этанола в Еодно-этанольной подвижной фазе и температура колонки. Выбор этанола в качестве органического растворителя был сделан на основании предварительного эксперимента с использованп-ем метанола, изопропанола и ацетонитрила. Область допустимых значений и начальный уровень оптимизируемых факторов приведены нижо

Фактор

Область допустимых значений

Начальный уровень

Скорость нарастания конце ц- 0,2-2,0 трации этанола,% в минуту

To»mano»mmo илvr<vrvir Ол 9П—ЛЦ

Концентрация ТФУ," 0,05-0,5

1,0

35 0,1

Учитывая незначительное влияние скорости потока подвижной фазы на разделение, ее значение было зафиксировано на уровне 1 мл в минуту.

2.3. Функция хроматографического отклика и целевая функция.

Для оценки качества разделения аналогично [Вегг1<%е .т.е., 19051 выбрали функцию хроматографического отклика сет1 в следующем виде:

п-1 2(1; - 1;.)

СКР - 2 т1л(2, .1*1 . * ) - п (2.1 )

. I {+7 { _

где ^ и -времена удерживания I- и «+г компонентов;'

•п1 и и{+т-ширины пиков компонентов на ураше базовой линии; п - число пиков. ' *

Функция хроматографического отклика (2.1) не учитывает ряд дополнительных ограничений по условиям хроматографировалия, вытекающих из специфики изучаемого обьекта: в кислой среде, особенно

с ростом температуры, происходит отщепление привитой фа?ч сорбента, что лимитирует концентрацию ТФУ и температуру колонки. Кроме того, не догано бить слишком больпза! полное время анализа.

Подобные требования ввиду их нежесткости не могут быть учтены наложением дополнительных ограничений на область факторного пространства. Любое нежесткое ограничение может бить нарушено, йй лшаь при условии, что это обеспечит заметное улучшение качеств? разделения. Разумно поэтому изложить штраф на отклик, получении? е "нежелательных" условиях хроматографирования, жесткость этогс штрафа не должна возрастать по мере приближения к оптимуму! Штрафные функции по каждому из нежестких ограничений были задан1 в виде:

Г О, при х < х*

Р„' = 1 а ( х-х*), при х, > х* (2>2)

гдь Р - величина штрафа по }-ыу показателю, х -текущее значени* показателя, х - пороговое значение, нежестко установленное экспериментатором, а^- коэффициент,Еыбираемый на основе экспертны; оценок. Штрафные функщш приобрели вид:

т> 'фОл^ . п /л1—\

-чч- • *

Р^(С() : 4(о(-0,2) (2.3)

Рз(та) : 0,03(1а-35) ■

Параметр оптимизации {целевая функция) тогда можьи' быть представлен как

У - 2 Р^- СИР (2.4)

где СОТ определяется по формуле (2.1) и штрафы в соответствии (2.3).

2.4. Поиск оптимальных условий разделения протаминов.

Описанные алгоритмы определения оптимальных условий модифиць рванным симплекс-методом и обработки информации хроматограмм бъ роализозанч на ЗВД в шда автоматизированной системы оптимизг

ю

ции условий хроматографического разделения. Для расчета ширшш пика применяли эмпирическое соотношение [Berridge J.c.,19021

wt= 2At/h{ (2.5)

где А.- площадь 1-го пика, hj- Еысота пика.

Описанная процедура была использована для хроматографического разделения протаминов из гонад осетра - стуринов, которые состоят из двух компонентов - А и В. Как показали дальнейшие исследован, я, компоненты А и В стуринов имеют такую а:э аминокислотную последовательность, как и протамины из ларвпввг ateiia-tue. При оптимизации разделения стуринов потребовалось провести 17 хроматографирований, чтобы определить оптимальное сочетание исследуемых Факторов: скорость изменения концентрации этанола 0,36% в минуту, температура колоши - 44,3°, концентрация ТКУ -0.21%.

Оптимальное сочетание факторов получено уже в девятом эксперименте, а далее происходило уточнение оптимума, что свидетельствует о высокой эффективности предполагаемой процедуры оптимизации. Значение crf составило 3,5, что указывает на более чем удовлетворительное разделение ( рис.2.1). '

2,0

1,0

0,0

о 10 20 30 40 SO

1.1СШ

Рис.2.1. ВЗНОС стурина на коле i-cq Zorbax опз : 1-первый 'опыт(0,1%ТОУ,Т-35°С,dCC2H50H/ йт=1Х/мин), 2-разделенив е оптимальных условиях (см. в тексте)..<?-стурин А, а-сту-•рин В

Как показал сравнительный анализ изменения факторов е процес.-' се поиска оптимума, наибольшее влияние на разделение протаминов о помощью обращеннофазовой ВЭЖХ оказывает концентрация ТОУ. Об этом свидетельствовал острый минимум целевой функции по концентрации

ТОУ. По-видимому, это обусловлено тем, что на качество разделения ЕЦсокоосиоЕлих. протзминов оказывает положительное влияние более полное экранирование свободных силанолышх групп сорбента. Нами были проведены дополнительные эксперименты по оптимизации формы градиента этанола. Хотя этот фактор и не оказывает существенного влияния на хроматографию протаминов, однако, следит отметить, что лучшее разделение достигается при использовании экспоненци-алвного градиента.

■2.5. Оптимизация препаративного разделения протаминов.

. При проведении препаративного разделения протампноЕ оказалось, что на разделение оказывают существенное влияние количество белка, нанесенного на колонку и скорость подвижно; фазы. Попытка провести оптимизацию стгплекс-методом с включением этих факторов оказалась неудачной, ток как было получено тривиальное решение, соответствуйте нижней границе по количеству нанесенного белка. Возникшее затруднение удалось преодолеть с применением факторного планирования эксперимента. Удалось построить математическую модель в вида полинома 2-ой степени, которая адекватно описывала зависимость сю? от скорости подвижной фазы(V) и количества протеина, нанесенного на колонку(а). Как видно из графической интерпретации полученной модели, для каждого значения загрузки колоша имеется оптимум по скорости движения подвижной фазы (рис.2.2).

чения CRP при птч>паративном газдэлэшгл ст\тииоз(1-1,25 : Й-1,50 , 3-1.75, 4-2,00,5-2.10)

2,0

Агго А2(2)

1 ,о А2М| Г

0.0 ._J 4 1 . > •

'1_1_i_i_1_

О 10 20 30 40 SO

т.мин

Рис.2.3. ВЭ2Х фрркции А2 на колонке Zcrbax ods в оптимальных условиях.

Резкое уменьшение сиу по мере увеличения количества протемкна свидетельствует о том, что при использовании обрацениофазовой ВЭЖХ для препаратив.гаго разделения этих белков, этот фактор должен находиться под строгим контролем.

Следует отметить, что оптимизацию препаративной ВЭЖХ протами-нов мочою было провести без использования факторного планировать эксперимента, а с помощью описанного выше симплекс-мотода. Однако, в этом случае необходимо было ввести дополнительную штрафную функцию по количеству разделяемого белка, которая бы приводила к уменьшению функции хроматографического отклика при разделении малого количества протамина.

Найденные оптимальные условия разделения протамкиоз были использованы при обращеннофазоЕой ВЭЖХ стеллина и рэхроматографии фракции А2, выделенной при разделении суммарного белка на СМ- со-Еадексе 6-25. Высокоэ£фекиЕная жидкостная хроматография позволила разделить фракцию Л2 на дье подФр^кции А2(1) к АЗ(2) (рис.2.2) , которые отличались ашиокислотяш составом (табл.2.1). Подфракция 12(2), как било потом показано, соответствовала стэллину А. Под-бракция А2(1) содержала на один остаток аланинз меныгэ, чем молекула стеллина А, и была названа нами стеллином С. Таким образом,

Таблица 2.1

1инокис-

та

А2(1) стеллин О

А2(2) стеллин А

сочетание ионообменной хромато-

Н1в 2,8(3) 2,9(3)

Ьуз 5,0(5) 4,9(5)

Aгg 11,7(12) 11,3(12)

ТНг 1,9(2) 1,8(2>

Бег 0,9(1) 0,9(1 )

. АХа 1,1(1) * 2,1(2)

Ьеи 1,0(1) 1,0(1)

01у. 1,1 1 1,2(1)

гт»о/^гт# хта Ги^ло^апртгра Л—ОС тг пГ\—

1 ии^и» к и <>> ^ V 41 ^ Лк чУ

раденнофазОЕОй хроматографии на колонке -ХогЬа= 023 позволило НЕМ . выделись .три компонента стеллина - А, В- и С. Соотношение мозду компонентами А:В:С, оцененное по данным аминокислотного- анализа, [риблизительно составляет 3:1: 0,04. В заключение следует отметать, что предлагаемая процедура оптимизации зсроматогрэфического 1азделэния может быть использована не только для ггоотаминов, но [ для других объектов. Так, например, нам удалось ее успешно пришить для нахождения условий хроматографического разделения про-звсдных антибиотика -ристомицина А, выделения антибиотиков, род-твенных актагардину, белков молока, а тагам гистонов.

3. Аминокислотная последовательность стеллинов.

Високая осноеность стеллинов е сочетании с необычайной простотой аминокислотного состава делает эти белки сложным объектом для структурных исследований. Отсутствие в стелликах. ароматических и серусодержащих аминокислот значительно сужает ьыбор методов селективного расцепления их молекул.

Для фрагментации стеллинов нами были ЕЫбрана два фермента: термолизин и трипсин. Цешшм сеойстеом термолизина является то, что он не расщепляет пептидные связи, образованные аминогруппами лизина и аргинина. Такая особенность фермента позволяет выделять характерные для протаминов блоки осноеных аминокислот в нативном евдэ. При трипсиноЕсм гидролизе можно Ьыясниг расположение нейтральных аминокислот, которые склонны также группироваться блоками. Совокупность данных по строению термолизиновых и трипсинзЕЫх пептидов в большинстве случаев делает возможным реконструировать

полную аминокислотную последовательность протамина.

%

3.1. Аминокислотная последовательность стеллина А.

Для установления первичной структуры стеллина А использовали • чрмолиз1шовый и трипсиновый гидролизы в сочетании с субтрактив-ныы методом Эдмана. Образующуюся ■ в результате термолазиновогс гидролиза смесь высокоосноеных пептидов разделяли на СМ-сефадексе 0-25 (рис.3.1). Удалось еыдзлить десять пептидов '(Т1г(А)1 -Иг(А)Ю), гомогенность которых была доказана электрофорезом нг бумаге при рН 5.6 и дискоеым электрофорезом в 30% ПААГ (рН 1.9).

2,0_2,0

0.0

термолизиновых пептидов стелтина А на СМ-сефздекса ; 0,005 и фосфатном буфере

0,0 _гг £ о

4ПО 700 - • *

номер фракции

Первичную структуру пептидов устанавливала сочетанием извест

них в настоящее время методов. Строоние пептидов ть(А)1-П1(А)с однозначно вытекало из аминокислотного состава, гы.онцевшс. аминокислот и данных по определению с-концевих ашшокислот к последовательностей. Наибольшую сложность представляло изучение пептидов Т)1 (А) 9-ть (л) 1 о. Оба пептида июля н-концевой аминокислотой лейцин и отличались лишь тем, что ТЬ(А)10 содержал дополнительно в качестве с-концевой аминокислоты гистидин. При гидролизе тп(л)9 карбоксипептидазой В била установлена следующая амипс::исдотная последовательность пептида: Ьеи-(Ьуа,лг£)-Аг§-Аг5-А:гб-Лг£-Аг,д-

Для решения Еопросз о строении и-концевой последовательности пептидов использовали субтрактишшй метод Эдмана. Оказалось, что для обоих пептидов за лейцином следует лизин, откуда вытекало строение ть(а)9-ть(а)ю (табл.3.1).

Таблица 3.1

Сфтллогття-о л ^/и и ими

Фк I « М

¿.II / I

( А

та.(л)з

Ф>. / ^ ) -

150 250

тлочатч /ТтОТ/'ТТТГГ*

Рис,3.2- Ср2КЦИОнироЕзн*'э

ТрЗШСКНОЕЙХ ГОЙТИДОВ СТ8ЛЛИ-

ка А на СМ-сефадЗксе С-25 (условия см.рйс.3.1) .

К-У

5-К-К ■

н—о-х—к

фъ / А {а 9 *

.ЬАЬ Л ¿1 А ^ 11 ¿1 11 11

ть. (а ь-х-к-й-к—к-н-к-н

А-АЬ <у<П, / 1 и .ы дь £4 и и А«. «.<■ и

Й1(А}5 Т1г(А)6

тп-. [ А \т

Из тршскнового гидродкзата хроматографией на СМ-сефадзксе а-25. удалось выделить пять гомогенных пептидов (т(л)1тт(А)5) (рис.3.2). Строение пептидов 5(А)1-И(А)2, 1(А)4-Т(А)5 устанавливали на основании данных по определению аминокислотного состава, к-концевых аминокислот, с-концевых аминокислот и с-кснцевых последовательностей (табл.3.2).

Для пептида Т(А)з изучали С-концевую последовательность с помощью карбокскпегггидазы 'В и и-концвву:э последовательность с применением субграктиЕного метода Эдмайа. Полученные результаты находились е хорошем согласии мвзду собой к- давали однозначный

ответ о строении пептида (табл.3.2).

Пептид Т(А)1 ТСАЛ9 Л«!" ж т(А \л л. А Ж \А у

ь-к А-Н К~А~5-Т—К к-с-к К-З—К-К

Совокупность данных по строению термолизиноЕЫх и трипсиноЕы: пептидов стеллина А позволила нам реконструировать полну) аминокислотную последовательность этого протамина.

Й-концевое положение в молекуле белка занимает пептид №(А)7 в составе которого имеется дез остатку аланина, один из которы ы-концевой (табл.3.1). Это следует из.того, что стеллин А содэр кит всего два остатка аланина, причем одиь из них Н-концевой Пептид Иг(А)7 перекрывается по последовательности Н1в-А1з с пеп тидом ть(А)3, что делает возможным продлить к-кондевую последова тельность протамина. с-концевое положение в стеллине А, очоеиднс занимает Шг(А)5, так как белок iLv.eeт с-концевую последователг ность .. .Ьуз-Ьув-Зез>-н18-Ьуо-он. Пептзд ТЬ(А)5 перекшвается пептидом Иг(А)1о с помощью Т(А)4, что позволяет продлить построе ние С-кондевой последовательности протамина. Перечисленные пени да исчерпывают аминокислотной состав стеллина А и дают еозмо: ность однозначно решить Еопрос о его аминокисл тной последов; тельности:

Аминокислотная последовательность стеллина Д

Ь 10 15 20 25

А-Н-Р-К-Р-Н-К-А-З-Т-К-Х^-К-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Е-КЧЗ-К-К-Б-Н-К

ТПТ_ ТП1 ТЫО_, ТЯ5

' ' ' ' ' Т1и ТЬ2 '

' ШГ~ ' ' '' ЙгЗ '

Т2 ' ТЗ 14 ?'4 ' Т5

т-термолизиноше, т-трипсиновые пептиды стеллина А

Стеллин А имеет строению, характерное для протаминов рыб: с иовные аминокислоты группируются блоками, а нейтральные распре; доны неравномерно, концентрируясь в Ы-концевой части молек: белка, имеется блок из двух остатков оксишашокислот; Бег-Т! Однако, следует отметить ряд особенностей стеллина А, выделял его в особую группу протаминов:

а) низкое содержание нейтральных аминокислот (7 аминокислот); как правило, протзмнны рыб содержат 10-13 аминокислот.

б) присутствие, кроме аргинина, таких основных г.мтюкислот, как лизин и гистидин; причем даже тлеется лизиноеый блок (остатки 23-24).

в) отсутствие пролинэ, обнаруженного ео многих протзмкнах рыб.

г) наличие в центральной части молекулы стеллина А блока из 9 остатков основных аминокислот: обычно осноеныэ блоки протами-нов не превышают 4-6 остатков.

д) отсутствие характерного для протаминов рыб с-концевого блока из ос этков аргинина.

3.2 Аминокислотная последовательность стеллина В.

Присутствие в стеллино В таких аминокислот как глицин, серии и'гистидан (табл.1.1) позволило нам успешно применить для деградации этого белка термолизин. Причем оказалось, что первичную структуру стеллина В можно построить лишь на основании строения терлолизиновых пептидов. Условия термолизинового гидролиза стеллина В были такими же, как и стеллина А.

Для получения индивидуальных пептидов использовали фракционирование на СМ-сефадексе 0-25. Удалось выдеишть Еосемь гомогенных пептидов (ТЫВ)1-Т11(В)8,рис.3.3).

г.о

1 ,о

0,0

~220 Na.CL.li

■ ? .

1 У

2 71 4 5 б) • • 8

"* л Г | < К.-

2,0 1 ,5 1 ,0 0,5 0,0

гоо

4ОО бОО

номер фракции

Рт»р /Гшоуттштлипшю

X «и • и • МГ иЛ илл^л^/ь/Л ^

Н'аГУМО ТП*Г)ТЛТТОТ5иЛГ ТТОГГТТ» ТТ/ЛТ5

стеллина В на СМ-сефадексе 0-25 в 0.05 !.! фосфатном буфере рН 6.4.

Первичные структуры пептидов П1(в)1-ть(в)4 однозначно следовали из результатов аминокислотного анализа и определения ии с-концевых аминокислот (табл.3.3)

Лапта

/ ¿ pUUiiJlU

ИбПТИД Th (2) 5 СОДбрЗ'ЭЛ зргк— e:i и гдицпп е соотношении 3:1.

Стт/-\*»г\п11_ 1Л*т17»nvrvuftfi»-"» rnnv\u q Uli q

Th (3)1 G-H-H

Til (В) 2 G—R-R-R-R

Th (B) 3 A-R-R-R-R-R-S

Th(В)4 A-R-R-R-R-R

Th(В)5 G-R-R-R-R-G-R-R

Th(B)6 S-S-R-F-Q-R-R-R-R-P-R-R

Th(B)7 • S-S-R-P-Q-R-R-R-R-R-R-R-H

Til (3)8 S-R-P-C-R-R-R-R-R-R-R-K

анализом водно:

rrq

,. .Gly-Ar¿

с последующим

Лстом Tit* птш mjro

t^UUUl X li^UUrfUiu

что пептид содержит 2 остатка РЛИЦИРЗ 1* 6 0CT2TKQ3 Spr'UMIffJS • При гидролизе Th(B)5 карбокси-

ПОПФИ TT OQArt Ti Ли ПО TfЛФ(|ЦЛО TTÖ-UQ MWiii Л.ЛД1 «J L>uv<u j w А uiiuwwiuÜLi

С - концевая последовательность

T2TC3

Нй CCMOESíimi HOJiy48Iff

iMiplWHV POOir nx.

била определена первичная структура пептида (табл.3.3) Строение Т11(В)6 устанавливали на основании данных по ядролизу карбокси-паптидазой В к трипсином. Из трипсиноЕОго гкдродиззта ТМВ)6 электрофорезом на бумаге при рН 5,6 удалось выделить три вещества (ТС!тЬ(в)ь]1-г[Т)а(В)б]3), аминокислотный состав которых приведен е табл.3.4.

Таблица 3.4

ТТЛТТФТ* п Ф ГФЬ (U \ 1-1 Ж 1 ) J 1 тГто, in Mo fn ГФЪ /OM-J л. «. / Л J

Л'ппратгтда л. j S-3-R P-Q-R Rr

В состав TtTh(B)6l3 входил только аргинин. Строение T(Th(B)63i-T[Th(B)6l2 однозначно вытекало из результатов аминокислотного анализа и определения tí- и С-концевых а^лнокислот. Присутствие в Tta:h(B)6J£ глютамина доказано электрофорезом по ОССорду при рН 6.5. При гидролизе Та(в)6 карбоксипептидазой В отщеплялось семь остатков аргинина. По окончании гидролиза был выделен остаточный пептид, имеющий состав: Ser(2), Рго(1), Gln(l), .vrg(i) с n-концреым серкном. Полученные даннце позволяла определить строение Th(B)6 (табл.3.3).

Аминокислотная последовательно ль Th(B)7 и Th(B)3 была выяснена на основании сравнения аминокислотного состава N- и с-концевых аминокислот этих пьптидов с данными по строении Th(B)6 (тзСд.2.3).

В результате проведенных исследований была шдуч8на информация, необходпяя для построения молекулы с те длина В. Пептид

ТЬ(В)з занимает и-концевсе полсганио, так как стедлин В содержит один остаток злананз, яелящийси гс-копцевым. Дзлое располагается ТЬ(В)7, перекрывающийся с ГЬ.(В)3 по остатку серина. Как ухе ранее отмечалось, С-концевая последовательность стелдина В имеет строение ...01у-Ат5-Аг^ок. Следовательно, пептид ?л(В)5 С-концевоЗ. Перечисленные пептид!! исчерпывают аминокислотный состав стеллипэ В и позволяют установить первичную структуру этого протамина:

Агдшокислоткая последовательность сголлинз В

5 . 10 15 20 25

А-К-Е-Р-й-Р-З-З-Р-Р-О-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Н-О-Н-Р-Н-Р-О-Р-К

№4 ТЬб_, ТЧ1

ТЮ_,__ТЪЗ__;_, __

, ■ . ТЬ.7_,

551-ТерМ0Л23ИН02Ы9 ПеИТИДЫ СТ8ЛЛ2БЗ 5

Аминокисл^тнал последовательность стсллнна в, в отличии от стеллина А, имеет большее сходстео с аминокислотными последовательностями известных протамиков рыб. Сравнение первичных структур птеллкна В и стурина В (протамина из гонад ларепаог' е'лаап-вгааи ),строение которого было установлено нами ранее, показало что они идептичъы. Более того, проведенные впоследствии исследования строения компонентов А, выделенных из гонад ларапзвг е^л-ЛепагаЛИ и Лс1ропззг пиА1ъвп±г1в [БулаНОЕЭ А. К. и др.,1920 ] и коглгонента В из Ла1ротгаог ш«ни(?п1г1з [Г.'.олсез Л.К. и Др., 1982 ] показали, что они имеют такую ке первичную структуру, как стелли-ны А и В соотеэтстезнко. . Однако сказалось, что протамины, выделенные из этих видов рыб, имеют рэзличное: соотношение компонентой А и В . Так, если для стеллинов око составляет 3:1, то для стури-нов и нудивентринов оно равно 2:1 и 10:1 соответственно. Что касается компонента С, то нам удалось ойнзрукит-ь его только з стел-лине. По- видимому, совпадение аминокислотных последовательностей АТиОТмиИНОлЗ 0С57р02**Х ]рЫ(5 МС^КНО ГЭНЭТИ^'ЭСХС** бЛИЗОСТЫЗ

последних.

3.3 Аминокислотная последовательность стеллина С.

Стратегия установления первичной структуры стеллина С была на-

V-: насколько изменена. Во- первых, использовал:: зеток тический мэтодЗдмаыа е сочетании с термолизиновым гидролизом. Зо-вторых, разделение поптадов осуществлялось с яокосыо обрэдеинрфззовоа хрсматогро.;.;:;: на нслошш ¿огьаз ОЗ. Основной причиной изменений являлось незначительное содержании этого компонента в стзллине. Использование гэ СМ-сэфадекса в некоторых случаях сопрягано - со значительными потерями коротких пептидов при их последующем обес-сслиезнин. Для установления строения стелллна С применял:; твердо-фззпый 'вариант автоматического метода Эдман'з. Белок ковалэнтно прЪ:реплял:: к мпнспропплстеклу с помодьа п-фнилдиизотиоцианата.. Рчло проведено 26 циклов отщепления. Выходы .Оенилтиогадантоинрв а:£н;юкислот на каждом саге приведены е -табл.3.5 - •

Таблица 3.5

Ничк

о 'п:1 о ни

» плпч

Цикл

5>*irtjrxJrWTf r*

Q

To 11 12 :3

i-C (145 Arg HO) ArS (10) Are (Ю) Eis (10) Als (13)

Tiir

II!

Zjch (7) Arg (5)

14 ' 15 16

17

18

19

20 21 22

23

24

25 2S .'

Arg 5)

ArC (10) Arg (10) Arg (Ю)

Ser (0.4)

"--копцовая аминокислота оолка, а такз:е остатки. Ш'^лнз: ковалентно ^■псседннялизь к ам^сггрспидетйкду, поэтому s циклах. 1,10,12,22, 23,2С с^рсзултол пропуск:. -копцовув аьашокмелоту стеллица С-опрзд^л.-] -.и методом Эдмана вручную,г а положение остатков дпенна устанавливали, ориентируясь на. строение терколизиновых co.-j-;^. ^снользснаниэ термслизинсвого"гидролиза было сбу-,\':сг..-.-так.:? »усЗхсдимостъе уточнения размеров аргининсных блоков. г.оптиды, подугенные при гидролизе молекулы белка термолизн-разделяли Eна колонке zortar ODS (рис.3.i)

2.0

1.0

о,о

220 1

2

^дл__

3

5

4,6

и

?

ии

Гго-п

10 20

40 50 1, кин

1 'СМ

, )г>(о * \ ^

/ с

I V-. / о ?г:)7

■Н-К

Х-л

-5-Т-Х

•Х-К-Э-

•НЧг-К-

X—Н-К-

х-н-к-

н-х

я

А'

■й-г

-^—-Э-Р

гтттгттл.г» оП^п/^Лттт.а —

цов стеллина С на колонке гогьаг сез: Было выделено восемь терлолизпновы:

"«.IV тгптта поип хз «вЛч С- 'Дт«* ттоттччл апчлпйп«'»"« ■и^чта гпл пттгч Tirvp.fr,..

пзе о том, что з местах пропусков в последовательности, определенной автоматически методом Эдаана, стоят остатки лизина. Созо-«упность пол-., генз'ых данных позволяла установить полную еминок'.с-вотнуа последовательность стеллмнз С:

5 10 15 20 25

н-р-й-Е-л-н-л-з-сг-к-ь-х-Е-р-р-р-н-р.-р-п-а-к-к-с-и-::

ТН6

™14

И15

ТЬЗ

ТЗУ7

ГЬ2 Т111

-термолизиновые пептиды стеллина С

Сравнение аминокислотных последоЕательностей трипротамикоз ¡теллина С и стеллина А показывает, что ;они практически совпадр-зт. Различие заключается лизь в том, что в молекуле стеллина £ »тсу'хствует н-концевой остаток аланина. Представляется маловеро-1ткым, что могло произойти отщепление к-концевого аланина под действием аминопептидаз в процессе выделения бежа, поскольку на ;сех стадиях выделения добавляли ингибитор амшопоптидаз (ЭД'ГА). !отя известно, что некоторые протамины млскопнтзе^днх с;п1т8зиру;с-т-:я в виде предшественников, и протекающий затем протеодиз приносит к появлении белков с "растрепанным" м-кокцсм [Занесите '.,198а], для протаминсЕ рыб это не было показано.-Напротив, ус-•ановлекные последовательности м-РНК протаминов рыб ггря:.:о укьгы-

8

e2k¡? на отсутствие тактовых ÍSal-tal M.,19S1J. Следовательно, tskcî как y млекопитающих путь образования неоднозначного к- конца маловероятен для протамшов рыб. Причину различия ми видим в неоднозначности протекания процесса посттрзнсляционкой модификации белка, когда отцепляется метнонкн, обусловленный ИЕГ"лпруюцим ко-доном. И, наконец, нельзя исключить существование двух.различны: генов исследуемого белка. Тем-более, что для рыб характерна множественность генов прстаминов. Это показано ке только для прота-минов различны?" популяций одного и того ейдз, но и для отдельной особи íKcXay D.J.,1936]. Одной из интересных особенносте: строения стэллпнз С язляотся то, что его молекула начинается аргакиноЕсго блока. В извзсткых протечках рыб к-концевому аргк ниноеому блоку предшествует либо пролай, либо ала^ин. Кедзвно и спермы кальмара [Осгдчук .1.A..Î9SG3 и каракатицы CKartin-Pontiiíe А.-, 1991] были выделены протамины, молекулы которых, как.и стэдлп на 0, начинается непосредственно с аргкшнсвогз блока.

4. КонФсдмЕцион^з особенности етеллизов.

Несмотря на тс, что прстамикы рыб были выделены еще в кош прошлого века, до сих пор неявно в какой конформации они находя! ся в растворе. Большинство авторов считает,'что ~-ти белки имев конвертации неупорядоченного клубка. В качестве основного арг: мента приводятся данные по дейтериевсму обмену, которой в водк растворах протаминоа происходит с еысокой скоростью [Eradbury Е lí.,et ai.,1952]. Проблема в значительной мере осложняется те: что до настоящего времени не удалось получить протамины в кри! таллическом состоял:!::. Для изучения кон^ормацни стеллинов и пользовали метод кругового дихроизма. '

4.1. Спектры КД стеллинов

На piiC.4.1 представлены спектры КД стеллинов Л и В. В облзс 190-250 нм наблюдается две полосы - интенсивная отрицательная п íí им, обусловлен:::..«: г.-х* переходом петяэдюго грсмсфсрз 2 cj 02.л ¡тг-лс^тельне.. прц 218 нм. связанная скорее всего с пег ¿гдом. Как показано ТнК^ни и Криммсм [Tiííasy

,1969,1972] подобные спектры КД следует приписывать конформацни

-8.0

190 21 и 230 250

л, ИЛ

Рис.4.1. Спектры КД стеллпнов А и В: 1,2-е еодв; 3,4-в 96Я этаноле

-а,о

100 210 230 250

Х,нм

Рис.4.2. Спектры КД производных столлина В: 1-ацетилыю-ного; 2-метилового эфира

типа Еытянутая левая спираль, которая в структурно:.; отношении по-

ttO'^xjo птжт>о Т"* ттп Т,_»"»тл/л тгггие» ТТ Р Г* «""по т» тпптгчтэ ог»иг\г>тлт»«

biiiiy'uJu^ uUwu« -¿JIL4 J. J. • ij luw W * 1 UUUbUUllli I^Uit

•nnrvv* тяпгжт\\гу1гюх\ц tiorwrj* nmrno TIT* •

д U^iw<ii j W A u^ iuuiuj^yj и a kO MiC-viui mU„iJ л O^a A X3

О 1ТОУРПЛЛФОФ"»иО WnQ ЛП"РО 1TVTJTt> С»TГТ*Q ГЗ QTiOVClWtir /in!/nr/l!V V\C» H'tf О ТТ/ЛП

x ISA bikWW W * * UiVtJ kJiUUlUtU wuu< U.kW tUiMA •-/ WilUUUiV ^Jurvutuaiuu w ^J

TJ/-\dJ\*T ОШША1Л1П Т»Г\Т» A V О mwrj HOTVITLIV ГГЛППЛ ТТГ>Т7 0»Т>П ПИПЛФрЛ

... I д WA A • AJiUrfiUW . ......... • , ■ ■ ■ - -v w^vjt-iu A W A W

w 4 wwimiuiw«

могут участвовать протяженные блоки оснсеных аминокислот. Если это предположение спраЕед-Т" ю, то ослабление электростатического

трической проницаемости, - должно приЕо/'^ть к разрушению вторичной структуры участков полипептидаой цепи,' имеющих конформзщпэ тпла

тта-ро** рпипд ттту ТЛ»ртт*то тоггтдо о/ТЛэтгпч.т ттоЛпгчтго тюх. йот»»

I III А/и 7 1 «»Оиим ■ X МАМ А «* иини»

при добавлении содзй и органических растворителей. Причем, в 1М ИаСЮд и ЭВ% этиловом спирте спектры КД стэллкюв приобретал:: форму, характерную для а-спирали (рис.4.1). Как показал:! расчеты по методу Гринфельда и Фасмана, болыауа тондзнцпю а-спирализацки имеет сталлин А, что согласуется с теоретическими расчетами на основании аминокислотного состава белков.

Следует отметить, что амплитуды в спектрах КД стеллинов меньше наблвдаемых для конфэрмации вытянутой левой спирали. Очевидно, это могло быть результатом Еклада другие т.шов конфоркацнй поли-

пептидной цепи. Исходя из особенностей строения стеллитов и присутствия в их составе таких аминокислот как Pro, Ser, Gly можно было предположить образование р-поЕоротоЕ. Наличие ^-поворотов'-псдтЕэрздадось статистическими расчетами по методу ©земана к Чоу' tChou r.Y.and TasmaTi G.D.,19771. Фрагменты полипептидной цепи,-для которых, параметр Р+ был больше 1,00 х Ю-4 были предсхьзакы-' как р-поЕороты. Расчеты показали, что наиболее предпочтительным' мостом для р-поворотои являются участки полипепткдкей цепи стел-лшюв,'находящиеся между аргининоЕыми блоками либо на их,концах.' ПрИСУ?СТЕИЗ Р^ИОХЗСрОТОБ Б »/.ЗЛ8КУЛ«Х CTSJUIiiHCE ИОДТЗОр^^ДЗЛОСЬ Т2К— яга моделированием их спектров КД с использованием е качестве ро-наршх спектров для вытянутой левой спирали спектр полилизина: [Drake А.P. et al.,1933] и для р-поЕорота - лгектр циклического гвксапепткдз [Rose G.D.et al., 19З5]. Рассчитанные спектры КД находились в хорошем соответствии с экспериментальными. Исследований клупошов - прот&минов из ciupea paiiasii методсм fiMP [Уеггага" L.,et ai., 19821 показало, что полипептидная цепь этих белков им'зот ограниченную внутреннюю подвижность. Креме того, как показали данные электронной микроскопии в темном поле [Ottensmeyer P.P.,et al.,1975] и флюоресцентного исследования tAnrelano А.,et al.,19333, молекула протеминоЕ укладывается достаточно компактно, „е представить s виде глобулы диаметром 22 2. Ксггпахтагя

фор л а молекулы протаминз может '-:ть объяснена, как отмечалось еы-nt-, образованием нескольких £-п„т-.аистсЕ в ее структуре. Однако,' принимая во внимание электростатичбскса отталкивание гуанидиноЕЫГ груш, маловероятно, что р-повороты является достаточным фактором для стабилизации компактной третичной структуры белка. В данном случки определенная роль может принадлежать также и с-ксацевоа карбокс:1льной группа белка, способной вступать е ионное взаимо-дэйстнпа либо с боковыми группами аргинина, либо с N-концзЕсг струпной. Для проверю? данного предположения катодом КД был! исследованы продукты модификации сгеллинзв А и В.

4.2. Спектры КД модифицированных стеллинов

Нами были порчены метиловые зфиры стэллинов А и В и ацетил: прсизвоз-г.з по к- концевым аминогруппа«. Изучение спектров К,

подученных прокзЕодаых показало, что модификация приводит к увеличению амплитуды спектров КД s районах 196 и 218 нм . Это свидетельствует о возрастании доли левоспиральной структуры. Наблюдаемые изменения спектров КД можно объяснить существованием в стел-лкках внутренней солвеой сеязи между H-концеЕой аминогруппой и С-кокцеЕоЯ карбоксильной группой, что приводит к деформации леЕо-спиральных сегментов. При модификации происходит разрушение солевой связи, сопровождающееся изменением конфорлации стеллинов. С целью проверки этого предположения была проведена модификация стеллина В водорастворимым карбодиимидом. Образовавшиеся в результате реакции продукты были разделены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке zor-ьаз опз. Наряду с даыером и тримером Гфотамина удалось выделить циклический продукт с выходом 5%. Дополнительным подтверждением того, что м-концевая аминогруппа протаминов может быть вовлечена ео взаимодействие с карбоксильное группой служат результаты, полученные нами при изучении влияния рН на степень модификации N-концевой аминогруппы стеллинов янтарным ангидридам. 5ыло установлено , что да:::е при 100-кратном избытке янтарного ангидрида полной модификации N-концэвой аминогруппы стеллинов удается достигнуть лишь при рк вше 9.

Обобщая полученные результаты молекулу, бгелликоз можно представить следующим образом. Арганиновые блоки протамкнов образуют леЕОсшралыше сегменты, которые разделены р-поворотами. Причем, аргининовыэ блоки укладываются друг относительно друга таким образом, что N- и С-концэЕые аминокислоты оказываются пространственно сблшгоны. Учитывая высокую степень гомологии протагяшов рыб и принимая во внимание данные по их физико-химическим иссле-До2з;^1а',!, можно предположить, что отмеченные для стеллинов закономерности пространственной укладки'молекулы свойственны и другим белкам этого класса. -Не исключено, что наблюдаемая закономерность связана с существованием для протаминов рыб общего механизма ком-пактизации ДНК, в котором существенная роль может принадлежать р-поворотам; Предлагаемая модель хорошо согласуется с данными по физико-хическому исследованию протаминов рыб, однако для ее под-тверзденйя,безусловно,необходимы дополнительные эксперименты.

5. Антигопариковая активность стеллинов

Способность протзмииов рфТх^ктивно взаимодействовать с гепарином обусловила их сирокоо применение в медицинской практике для восстановления нормальной коагуляции крови по окончании экстракорпоральной гемоперфузиа. Для этой цел:? в настоян'• о время используются исключительно суммарные препараты протамипов. Учитывая установленные наш особенности строения стеллинов можно было предположить, что индивидуальные компоненты протаминов будут иметь различную антигепариновую активность. Это подтвердили эксперименты по определению антигепариновой активности, проведон-¡••;е чп utíro- и чп viva". В табл.5.1 представлены рэзультаты определения антигепариновой активности стеллинов и их производных с покацыа красителя толуидикового синего.

Таблица 5.1 Более высокую активность

А 1Л rm*T>tS ГТ О TV »

i^WU.ij.Ul

•Miaou Р «ФЛ

VIЛ» rttJOOOUA Г» Y»X.Tm**í

и си л

1 . CTCJJV.VA A

3.СУеллик В

Г*"/» тчи А/1Ш.Ал\

Cil/4 Vviuu«ii л \ Hi.» Л W /

4.Стадлин В(КН-Ао)

5.Стодлин А(СЭО-Ые) г Сгелдий B(COO-LIe)

135 +/-10S 155 +/-10S icq

175 +/-ÍGS 170 +/-10S 17S +/-Í0S

терэсно отметить.

про-

"ТО

гтпшло

по я- и с- концевым группам

Н2 ОхСОл^^со Оолзз ЯХТИЗК^ е чем исходные стелдины. По-видимому. изменение кок^ормации прота\:инов, которое происходит при их модификации, позволяет белкам более э£фектнвно взаимодействовать с гепарином.-

Моделирование удельной антигепариноЕОй активности (А„„ , Е/мг) стеллинов как функции концентрата! компонентов А и В (Са и Сс соответственно, мг/мл) в смеси показало, что ату зависимость можно описать в виде полинсма второй степени:

А,,, =167,4+37,40а-31 ,0CB-.5S,6CaCB-84,9Ca2+33,5CBZ (5.1)

J Л.

Нйк видно из графической интерпретации модели, удельная анти-ransnnnoüsñ активность существенно зависит от концентрации компо— цгитс2(рис.5.1). Пс-чем, для каждого значенил кскцетрацнй к.;ззтся онтамадыюэ сээтно^-иий мэаду компонентами А и В, позволяющее до-

Рис. 5.1. Зависимость удельной актигепариповой активности от концентрации компонентов А и 3

стигать максимальной активности. Возможно, наблюдаемый эффект связан с взаимодействием стеллин А - стеллин В, т.к. при испытании индивидуальных компонентов не удалось обнсруг-мть етатнсти-чески значимого изменения удельной Елтигепаринопой активности при различных концентрациях белков. Из подученного результата можно сделать, по крайней мере, два вывода. Во-первых, е мздщясжх целях лучше использовать индивидуальные протаминк. Во-вторых, при использовании суммарных белков необходимо контролировать на только концентрацию , но и соотношение между компонентами. Мначо возрастает вероятность введения завышенных или зашйкишых доз вротамлкоз, что может привести к послеоперационном осложнениям.

Возможность определения актигепариноЕой активности со концентрации индивидуальных компонентов лрстамяксз бклз иопольаозана на:.'л для зкспресс-сценки качества прсмышле:т1гх препаратов. Концентрации прстзминов определяли методом Е32С. Было прсанглпзира-Еано 12 образцов. СраЕнеше полученных результатов. с данными по определении актатепаркловсг активности классическими мэтодзу-? показало, что различия находятся в пределах дисперсии восг.гронийоди-мостп используемых методов. Использование сс^-гнссэкн.* 5.1 к осчо-с ЕЭГС не только позволяет быстро определить ентпгепзрпг:)--вув активности протестов, ко и одновременно оценить их чистоту.

5. Взаимодействие стеллинов А и В с ДЯК .

Протамины и ДНК составляют осношую массу нуклеопротзмина -и. а

пт-иг»-?* г»п»оттахгг* лттатю по<пт рпл орп^птоо ТТ/лот/->хпг тяттоит/га

ыич ЦП и «4 иниш А СА ЧУ А ии • А Ш иНО

взаимодействия протзмкнов с ДНК имеет большое значение дгя Еыяр-

иатг' гГ-ппдттгтт ттг\'Л'п СШР/ГТГЛТЭ т* пт\т,01гг*о®1гт*тж ■^тлг»моп«тгста ттО—

ловых клеток .

"п лг^мом п тгттоа тг тта ттол тта тгг\т»аит*а т»от«"»т»/1 тщтта Ъ'эотяж^оттоЛ'ПЧ^отуЛ-

когко попользовать как наткЕШй нуклоопротамин, содержащийся в головках сперматозоидов, так и реконструированные комплексы про-тамппэв с ДНК. Однако, изучать натившй нуклеорротамиь очень слозко. Дело б том, что он нерастворим при низкой и умеренной полкой силе. При повышении концентрации соли (>0.6 Я хлористого натрия ) растворимость нуклеопротамина заметно улучшается, но этот процесс сопровождается его диссоциацией на составные компоненты. Эта особенность нуклеопротзмина практически исключает применение для исследований таких £-зико-хпмичбских методов, как круговой дихроизм, УФ-спектроскопия и др.

Волге перспективным оказалось использование реконструированных комплексов протаминов с ДНК, которые при небольших: степенях нейтрализации обладают, как правило, хорошей растворимостью. Кроме того, для них можно направленно менять состав, что позволяет лучзэ проследить за влиянием различных факторов на взашодейст-

"О1" л

Йзучэкпз взаимодействия протаминоЕ с ДНК проводилось многим

.-■п^Г'У-'Г'.*'^* С\тгттс. ггг\ ггг\а ТП-Т тпгпгпго па 1г/-.-оегсп*а 1тст

а тт/) £

сслохпях^а в значительной степени интерпретацию полученных данных. Во-первых, для приготовления комплексов использовались обычно бел;-:::, что затрудняло выяснение роли отдельных компонентов прогг.мпноз. Во-вторых, е экспериментах использовалась ДЕ1, выделенная из других источников ( например, бактериофагов, теленка ). Хотя мало вероятно, что'нуклеог*дная последовательность днк способна существенно влиять на взаимодействие с однако, имеются данные, свидвтельствувдие о том, что некоторые фпзпко-хикичвскао свойства комплексов гастоаов с ДНК зоьпсят от источника выделения ДНК [Ое^евГек! ¿.Ы..е* а!,1972]. Наконоц, все используемые ранее для комплекс^образования протами-

hü"били'чонопротаминами, т.е. содержав из основных аминокислот только аргинин. Еозникзл вопрос, как присутствие у сто.г'.'.гыах гих основных аминокислот, лизина и гпстиднна, будет влиять на взаимодействие с ДКК.

■5.1. Получение комплексов стеллкков А и В с ДИК.

Комплексы протаминов с ДНК обычно получают с помесью градиентного диализа и прямого сменившим. f.'ü использовал! прямое смешивание в 2,5 х 10 М ЭДТА, pH 8, так как комплексы, получе:-2п:о методом градиентного диализа, имели плохую растворимость. Характеризовали комплексы величиной г - числом остатков основных аминокислот на одай нуклеотид ДКК.

6.2. Термическая денатурация комплексов стйллиноз А и 3 с ДКК.

На рис.6.1, представлены дифференциальные кривые плавления комплексов стеллинов А и В с ДНК, которые были практически' едина- ■ коеы при равных г для обоих протаминоЕ.

dhotn/dl ■ .

Рис.6.! Дифференциальные хр:м;о сдавлен-; комплексов стеддн:-! А, 2 - ДНК Е 2,5 х Ю-4.',! ЗДТА pH 8 : г=0(1 ), г=0,2(2;.

г=0,5(3), г=0,8{4).

"'"ЗО ¿'5 ¿><У 75- SO-

Имелось" дйг о&Ййкых- перехода.' Первый происходил при Спл.'. . 4S - 1°, с'сЕПёд'йицеЙ с- Тлл ясходнсЯ ДНК и ссотгегстзовгд тлгы.ж:: областей ДКК', свободных от протампнов. Второй переход прснсхс.-пд лр:! Тдл.2 = 90 - 1° и соответствовал глзглекиЕ областей ДМ1, закных со стелдикгмп. Повышение термостзбнльностн стелдп:;-СЕягывагщи областей ДНК, по-видимому, обусловлено сслаСл^:;.:::.: электростатического расталкивания фосфатов ДНК при нейтрон:;!:;::;: основными группеги протакинсв. Величина Тпл.2 ссзп£Л2 с ангдетнч-

ной для изученных комплексов монопротаминоЕ с ДНК [1поие а1.,1970]. Таким образом, дополнительное присутствие в стеллинах лизина и гистидииа не сказывается существенно на способности этих белков стабилизировать двойную спираль ДНЕ..

При охлатдекм ког,гшексов стеллинов А и 3 с ДКК, видоржанных

ттт,,, СУУ.ОоО

ДНК, связанных с прогамкнамп. Свободные области ДНК ренатурироЕа-ли значительно медленнее и не полностью. Причем, криЕые денатура-V-! к рэнатурации в интервале температур, соответствующем второму переходу, совпали. По-еидимсму, при плавлении комплексов нити ДНК раохедятся неполностью и удерживаются протампнамл на опрзл.лешюм расстоянии друг от друга. 3 пользу этого предположения говорит тот факт, что ео всех экспериментах пдэрхромизм жашлексов был меньсо, чем у свободной ДНК.

Анализ кривых плавления в рамках теории .перехода спираль-клубок для куклеобелксЕ, предложенной Ли [Ы н. <1..,1573] позеолил рассчитать число остатков аминокислот, приходящееся на один нуклеотид в протамнн-СЕЯЗЫЕгкших областях комплексов (р). Оказалось,

гтфг) 77ггс1 т1 л 1* т1 .-» щпг я потэттл 1 ^ п "

1 . О (Ы,^». и к Л .. и О .|1 ^ ^¿ш-мдч^ I «им и^ ии ..

' X. П П9 пплтм'" 'Реп- vt^v п^оптттптл.» А т* ТЗ тлчгатлт пптшп^л«

• и I Ч^ЧД. ^«иищ.и. АЪиь ИШЬ шиккыищ Л Л и 1ипиМ1

еыг1 баланс основных и нейтральных аминокислот , то различное число атйпюмюлот ю один нуклеотид ДНК в белок-связывающих области комплексов свидетельствует о неодинаковой упаковке протаминов при связывании с ДНК.

Кз значений р, используя данные аминокислотного анализа стел-линое (табл.1.1), нетрудно рассчитать, сколько основных аминокислот пр:!Ходится на один нуклеотид в области связывания белков с ДНК. Выло найдено, что для комплексов стеллинов А и В с ДНК эти величины равны 0,93 к 0,91 аминокислотным остатка:,! на нуклеотид ДНК. Таким образом, е протамин-СЕязыЕащщих областях ДНК имеет • мьего практически полная нейтрализация фосфап&х групп.

5.2. Гидролиз комплексов стелхинов А и В с ДНК ДНКазой I.

На кривых плавления комплексов (рис.6.1) разрешалось плечо, соответствующее плавлопиа участков ДШ1С. относительно богатых ГЦ-парами (Тпл.=57°). Причем, по мэре увеличения я это плечо кеня-

лось незначительно. Каблздазмнй эффект било сбьяс:-~;ть' лочт;:те::ьн1:;л ггагизаккеа 'с АТ-бсгатыж участками Дй£. - -

Для проварки зтсгс прздпйлсйекия :/л проводили гидролиз кс:.:-шйкссе ДЫКгзсй 1.ДКК232 I из проявляет ярко ЕырзхзнкоЯ: СПЭЦКфК^-

КС С ти К ССЕОЕЕНИЯ:.! ДНК И рЗС^зплнзт ЕНутрЭНКПЗ подинукдеотидн^з связи. При нуклзгзнс:.: гидро^ое кожно было • огэдзть црздпочти-тельного расцепления областей ДНК, свободных от стелдин^в. Для разделения образующихся е рззудьтгтз реакции фрагментов 52!, свободных и связанных с протамннама, использовали свойство последних не растворяться з 0,14 М хлористом н^рии. Полноты" отделен::;: дос-

Пзученнэ продуктов реакции для комплексов с г=0,75 показало, что в растворе находилась только ДНК и отсутствовал! протЕгскы, которые полностью находились в осадке. Нуклестидный состав ссадкз отличался от нуклеотидкого состава исходной ДНК (табл.6.1).

Таблица 6.1

АТ-состаз (2) ТЛ^УГЧ ттиоа ТТТЛ^ ГФЭП ТГГ/-Л Л _ТТиГиГ V/Л ^ -и. СТСЛЛШГ В~ДК1<

56 63 61

У^ЭЛ^^ЧбЧИб СОДбТЭЗКЗН^'Я АТ—П2"0 Е ОСЗДКЗ ИОДТЗЗГу'ЧДЗ^О прэ^одо*-езнив о предпочтительном связывании стаддиков с АТ-богать::,::: областям: ДНК. Еаблвдазмая избирательность прстаминов кз мс.-'.зт бить объяснена нз основана: только электростатических взаимодействий этих белков с ДНК. Не исключена, что предпочтительнее связывание стзлдинсв о АТ-пзра'.с: .ДНК обусдсзлзко гидрофобным взаимодействие:.: метиленовых щупп боковых радикалов аргинина, лизина и нейтральных аминокислот с :,'.57ндьль2,с: группе:,д тпмидинов. Б пользу гол:! тимидиное говорит тот факт, что Co~.ee гидрсфсб^й стзллн:-: А имеет наиболее вырагеннуз тендвкаиз связываться с АТ-Ссс":г.<и областями ДНК. Нельзя так^з и исключить возможность образования специфических еодобсднкх связей мехду претаминзмп и с гзтзроцкк-лическиг.а осесзз£:1Я:;и ДНК.

Нами С'—?£К2Э подробно изучена кинетика нукдзгзкега р^гл-згг-лбния комплексов. Оказалось (рис.6.2), что кс:<~~.о:-:сн стс-ллнна 3 с

ДНК при одинаков^-г гиДроЛ1зук?ся с-большей начальной скорость»;'

tro»» xsrwrr тчпх/ п^гао Л г» ITVW ТТл^ют* wr»%»rwttr. ■ гат»Л ÓoOoour* •/»' "nao.'

«vi» itwtiuMtutiua «i w ¡««I^WIWVHIJ y JtU WUKWIWIU O ^wú

.слной пространственной организацией комплексов. Конечная ;:е степень расщепления комплексов ео всех экспериментах не превышала дож: ДНК, свободной от протямияов. Тага™ образом, . области ДКК, связанные со сто длинами,' не подвергались действий фермопта.

степень гидролиза

о,Л

0,2

Рис. 6.2. Гидролиз KOVUU'^KCóü С /ОЛДЛН А-ДНК (1 ) и стеллин 3-ДКК(2) ДНКазой I (г = 0Д&)-.

время гидролиза,ч

Т/о r\aotrtíi.T«ci4V'0 rjxrrr na «v*3tx/~ ^r» nar*maTmatrrir<T r¡r-

•iw UU«j A. U «wu, llj iMlU UWUU« W ^UWI^WUWIWtMUt M A UUIIlit IWWlkW«* (ЦШ4М4 4J|

т\о*ттст» о пл ттп * tri>n гтгч r»o/'\fs-nn»tjo»(i

ииц|и1 UWkU^U^IUtfiU y kiW 4«w UUitWlwiJUIII t^MUJU4W ifUllliil IV' flMilll WUUUWtUlilM

ггп»»т-ттгг»т/'/^т.т пфй'птшо Л т* ' /-»но TtTmru© И г» i ГЦ«* u.in ТТпр ППФОО ттст ТТЛ

tbUIIUlVtVlkЬГ* Л *J W * VWWHUlU к/ w UWW^UitMlWUM» Kb/V^W i. UiMWMlW

6/-, тл.т'по'паг' /vrrnci т»о j. рплпааддии тгтж «annr nifi*av"4! f» момлилит/им

JilIblUWit 1M1V j-/" ' \J Sjía^-s ¿¿¡•^«ы* i. AJ 9 tuuun»>w íil» 0lit W^'^VikAlA W UWI^IViiU ÍLiÜwm

£ кача^т^ё метода ясс^довгаия кон&орзацшг ДЖ

б-' тт ту'Т^П'.ЧТТ *т*гчтг\-то».» /ТГТТ \ MoTrnnT.rjnc.ckwa VTT ттпа

£j<-tAA A-m^Jj A. UUUlt / « ItUuWMMWWMUMiW fM^M* ilWO^tW^J

О^ЛСГ^СОТСЛ MC«SV '¿ТО ПрО?2!»ШНИ JíKSIQT 27СЛЗД S

TXVJfCl Т_*ЛЛ* **r ur (

navna o TTTywo%*TrcxcvTir n» v ' с»**ттттт I»WTTO

libituC V M^WJ WINMUWtlHMy 4(4«« УИИ та* A jf (ЦЫ

длинноволновой полосы КД ДНК ( ~275 нм) дает возможность определить, в какой форме находится ДНК. . .

6.4. Круговой дихроизм комплексов стеллинов А и В с ДНК.

Спектры кругового дихроизма комплексов стеллкноЕ А а В с ДНГ' приведены на рис.6.3. Для комплексов стеллин В-ДНК при различных г спектры КД совпадали с аналогичными для ДНК. В случае же комплекса стеллин А-ДНК, по мера увеличения г, возр;. .тала амплитуда положительной полосы в районе 275 нм и уменьшалась амплитуда отрицательной полосы при 245 км. Положительный максимум в области 275 нм сдвигался в сторону коротких волн, и в области 300 нм появлялась отрицательная полоса. Наблюдаемые изменения спектра КД

*eo многом были зналоги'пт тем, которыэ происходят при дегидрата-ции-ДНК;,г9Д s.t.^jhs.v.' зганодз- приводят к переход!' из 2 Сормг-В.A-tlvanov УЛ..et al.,1973].

3-5:-«стедд:5Н А-ДЖ (г= 0,2С. 0,23, 0,60).

Рис.6.3. Спектры КД комплексов стерла: А,В-ДЫХ в 2,5x10*"'!.! ЭДТА, рН 8: 1-Д5{К, 2- ДНК-стзд."ИК В <г=0,1-0,7)

-Î.0

£30 260 290 310 Л..БМ

Тзксй характер спектра КД Kcr.zir.eKca стэллин А-ДК< Си.-. ::зо-п*--анным. Для комплексов лротамлноз с ДНК, как правило. отмечают либо совпадение спектров КД с аналогп/пгым для ДКК. либо уменьшение ' елюлудя положительной полосы при 275 им. (В-С переход) ÎKei-skovits ,Вгайяз J.,1978]. Характерный для А формы ДГСС сп.ктр КД наблюдался лкаь у комплекса фосфорилированного производного КЛУП8ИЕ2 Z С ДНК ir/agr.sr K.G..Jt я1.,197б].

Проведенное нам;? рентгенографическое исследование комплексов стеддлнов с ЯЕ погсазалс. что s обоих еду ганх молекула ДНК находится з В -формо. Этот, результат находится в хоровом согласии с данными других ььтсроз, получекнымп при исследовании как пативно-го нукльопрот£...!Ина , ты: и реконструированных комплексов с ДГХ протзминов, выделенных из различных источников rsuai Р. ,£иЫгапа J.A.,15773. По-Екдимаму, 0+-аодо&:ыя еид спектра КД кс;лт;;ехса стеллина А с ДНК не отрагвэт реального перехода ДЖ в А~Ссрму и является следствием дихроичной активности оСразупдихе.я в розуль-TSTQ КОМПЛеКСООбраЗОЕВНИЯ ЖИДКОКрИСТЗЛЛИЧОСКИХ ф23 ДНК. ïï.'O подтверждало изучение влияния иоиисй силы на спектры КД комплексов столлинов с ДИК . При поЕыиекиа концентра;;;:.: .,'aCL до С.СШ споктр КД комплекса стедлин А-ДГК становился идентичным спектру КЛ "J--:.

Таким образом, изучение фкгико-химичеекпх свойств комллокссв стелликс£ А и В с ДНК псказало, что &тн белка в значителькей сго-

пени стабилизируют двойную спираль ДНК. Причем, стеллпны на только увеличивают температуру плавления ДНК, но и препятствуют полно:,".:-' расхождению нитей ДНК при термической денатурации. Как пока- ■ зало нуклзазное расцепление, стеллины связываются предпочтите .".ьно .с АТ-богетыми областям ДНК, защищая их от действия фермента. Пе-рзчислэккыз свойства протзминоз свидетельствуют о том, что одной кз их основные: функций является предохранение ДНК от различных воздействий. Кроме того, было установлено, что .по многим

свойствам комплексы сте«\лкнов А и 3 с ДНК различаются- Особенно г то проявилось при анализе спектров КД комплексов. /йохно было предположить, что к роль протампнов при компактизации ДНК в головке сперматозоида такхз неодинакова. Однако, результаты, получение при изучекш - комплексов протамшив с ДНК могут, не совсем адекватно отражать ситуацию, которая имеет место в нэтиеном нук-лзопротампнз. Для того, чтобы получить информацию о вкладе компо-пэнтаз 'стеллшз в формирование нзтлгкого нуклеспротаякна , бал проведен гидролиз нуклсостзллкна тсрмолизином.

6.5. Гидролиз нузслеостеллила термолкзинсм. '

Изучение гидролиза куклеостеллина термолизкном показало, что протеолпз прзктиче^с! "заканчивается через 10 ч. Иры этом не удалось добиться полного расщепления протаминов. Детальный анализ продуктов 'реакта:, проведенный с помощью обращеннофазовой ВЗЖХ, позволил обнаружить следующие особе:шости гидролиза ферментом стел-чинов в составе нуклеспротамина. Во-первых, расщеплению под-

Стелла А ■ * * i о. • - *

¿-P.-P-P-P-P-K-A-S-T-r-L-ïI-E-R-E-R-P-P-R-K-G-K-K-S-H-K

Si 3__ Tir! __ gl-i5__

1h2 Th6- _

T'h4

j, - гидролиз свободного стеллика A тесмолизином, Th - твтакышзьноше пептиды стеллкнз Л* выделенные при гидро-шзе нукдеостеллкна тзрмслпзкком

вергается главам образом стедлин А Среда продуктов реакции не удалось обнаругс:ть пептиды, принадлежащие сте длину В. Во-вторых,

характер пептидов, образующихся при расщеплении стеллинз А в составе нуклеопротамина, существенно отличался от аналогичного дл-; свободного болкз. Атаке ферментом в нуклеостеллине подвергается н-концеЕси блок нейтральных аминокислот.

Тот факт, что стеллшш А и В в различной степени подвержены протеолизу, подтверждает полученный ранее результат о неодинаковом характере укладки белков на -галекуле ДНК. Принципиально су-

ЩбСТВуЮТ ДВЭ ВО 3f/.CSuí О С Til CE'iwIiIjSílí »Я Пр0Т2**тИт03 С JvHC 0Д112 1*3 KIIX

- уложиться всей молекуле белка в одну из бороздок ДНК, причем

гчтмп»оо п»г»ст чгфп тт пст рп TTf»-rtT»Tt5i*q ггт-ул*" owtiuno г» TTTJTf tiüq rmr. ттттгиг—

l A W t-ifJi/i £ * UJUi Í4|_/W X Ull^Ulvju W ЛЖ b UÜJlW '.У Ы 1

титсльнсй является малая бороздка ESnxiu p.,subirana j.А., 1977]. Другая возможность - сеязэться либо с различиям молекулами ДНК, либо с отстоящими друг от друга областями одной и той же молекулы ДКК с образованием "мостиков". Теоретическое рассмотрение взаимодействия протаминов с ДНК показывает, что образование "синеок", , по- видимому, яелявтся одним из основных факторов компактизации ■ ДНК под действием этих бэлков ССиволоб A.B. Драпупов С.Н. ,19891. Можно предположить, что для стеллина А более предпочтительно' взаимодействие по второму типу, благодаря чему его молекула ста-,' новится более доступной для расщепления ферментом. Такой еыеод подтверждается данными по строению термолизиновых пептидов , об-разуюцихся в результате гидролиза нуклеостеллина. Как видно из схемы, в стеллине А, находящемся в coctseö нуклеопротамина, гидролизу подвергается лишь последовательность нейтральных акинокис-лот мезду n-ковдевым и центральным аргининовыми блоками.

Взаимодействие стелили А с ДНК можно, по-видимому, представить следующим образом. На первом этапе происходит связывание с ДНК. центрального енсокоосноендгс аргининового блока, состоящего из семи остатков аргинина. Затем происходит связывание с ДНК н-2:онцеЕого аргининового блока. Очевидно, что выбор места взаи- , модейстЕия :г-концеЕого аргининового блока в значительной степени будет определяться свойствами ( протяженность, наличие заряда, способность к образоЕзниг вторичной структура ) последовательности нейтральных аминокислот, находящейся между шел и центральным аргининовым блоком. Известно, что при созревала половых клеток на стадии, предшествующей взаимодействии протаминоа с ДНК, происходит фосфорилированив этих белков по остаткам серинз и треонина-

[Ingles-С.j.,Diion G.К. ,19671. Из схемы видно, что в стеллина А введение фосфатных групп по остаткам серина и треонина создает благоприятные условия для взаимодействия N-концеЕого аргининоЕого блока с соседней молекулой ДНК. Таким образом, дифференцирование участия стеллинов в компактизации нуклеопротамина может дополнительно осуществляться на стадии фосфорилирования белкоЕ. Анализ аминокислотных последовательностей протаминов рыб показывает, что размер N-кондеЕых аргининовых блоков, как правило, колеблется от четырех до шести остатков. Изучение взаимодействуя с ДНК полиаргинина с различной степенью полимеризации (п) показало, что п= 4-6 соответствует граница между обратимым и необратимым связыванием полипептидов С ДНК {Kawashima S.,Ando Т.,1978]. По-ридимому, именно такие размеры К-концевых аргининовых блоков про-тамниоь способствуют ЕЫбору наиболее оптимального взаимодействия с ДНК, приводящего к образованию Еысококомпактных структур.

Из сказанного выше следует, что компактизукщая способность протаминов рыб существенно зависит от присутствия N-концевого аргининового блока. Чтобы проверить это предположение, было проведено сравнительное исследование комплексов с ДНК отеллина А и молекулы стеллина А без и-концевого аргиинового блока- пептида Tiió. В качестве методов исследования были ЕЫбрана термическая денатурация и КД.

Оказалось, что кривые термической денатурации комплексов стеллина 'А и тьб .с ДНК практически совпадают. Другими слоезми, пептид тьб так же, как и стеллин А необратимо связыЕаетсп с молекулой ДКК, защищая области связывания на ней от термической денатурации. Таким образом, если бы функция протвминов в половых клетках сводилась лишь к предохранению ДНК от различных физико-химических возде?ств:й, молекулы этих белков вполне могли бы обходиться без N- концевых аргининовых блоков. Существенные различал в поведения стеллина А и тьб были обнаружены, при изучении спектров КД коплексов. Как ухе отмечалось, спегтр КД комплекса стеллина А с ДКК имел еид, характерный дня A-формы ДНК (рис.6.3). Спектр КД комплекса ThS с ДНК совпадает со спектром КД ДНК. Таким образом, при отщеплении ы-концвеого аргининового блока произошло изменение пространственной организации комплекса.

■ Полученные в результате изучения продуктов гидролиза нуклео-

стеллина .ермолизином данные хорошо согласуются с результата:,я по изучению фигико-химичоских сеойств. комплексов сте: лнов с ДНК. к позволяют высказать предположение о причине многокомдононтности проташшов рыб. По-Еидимому, каждый компонент протаминов играет вполне определенную роль в структурной организации хроматина по-лсеых клеток. То, что для каждого вида организмов икоется свой уникальный набор проташшов, позволяет предполагать, что эти белки способны эффективно комяактизовать еполнэ определенные нуклеотид-ные последовательности ДНК.

7 ■ ИзуЧв2Д1в ВЛИЯНИЯ СТеЛЛЛНОВ 1IS JKjiJ^liOlCpZ'CTBJlJZl'^SCKyiO

упакоЕку ДНК

При анализе спектроЕ КД комплексов стеллина А с ДНК отмечалось, что одной из возможных причин аномальной дихроичной актив-, ности может быть образование жидкокристаллических фаз ДН1С. Следует отметить, что компактное состояние хроматина клеток некоторых . простейших имеет аналогию с жидкокристаллическим ' i4i.il R j.,19853. Для того, чтобы сделать еывод о еозмохкой рост прота-мпное в формировании кидкокристаллической структуры хроматина по-лоеых клеток, было решено использовать способность двухцзпочечных молекул ДНК к образованию лиотропных жидк::х кристаллов.

Двухцепочечные молекулы ДНК образуют при определенных условиях жидкие кристаллы разных типов [YevdokiT.ov Yu.m.,19&3K Принадлежность кристаллов к тому или иному типу зависит как от свойств растворителя, так и свойств молекул нуклеиновых кислот [Ездо1:кмов D.M., 1986, Скуридин С.Г.,1987]. Это означает, что исследование ооразоЕания жидкокристаллических фаз из комплексов ДНК- протампни • может открыть возможность к выяснению механизма компактизации ДНК в условиях клеток. Кроме того, жидкие кристаллы ДНК холестери-ческого типа имеют аномальную оптическую активность tspada G.P., 1988], что в сбою очередь обеспечивает возможность наблюдения за изменением характера упакоЕки молекул ДКК под влиянием различных факторов.

7.1 Получение жидкокристаллических дисперсий на основе комплексов стеллиноЕ с ДНК.

йщкокристалличоские дисперсии формировали в еодно-со.. еом .растворе полиэтиленгликоля из комплексов стеллинов с ДНК при различных соотноиен,.:.,!х г, пользуясь методикой,- подробно описанной в работе [Скуридин С.Г.и др., 1990]. Как видно из рис.7.1 вид спектров КД полученных жидких кристаллов зависит от г. Причем, на кривой зависимости амплитуды отрицатальной полосы в спектрах Щ от величины г мо:кно выделить двэ области: первая - при значениях г от о до 0,15, вторая - при значениях г от 0,15 до 0,6. В тдарвой

Ае

240 270

300 330

Пттахrfprwr Jfrr mwwmanfmi*

»*MTV,DQTJtJT.rV T) ПОЛ—

II' «1 UW »III II». Л^ ЦЦ1М 14 tiV№IUWM wuu

VTF wmrrww Q „ Tnf4QI .'IiШ Ч Лич

aCl + 0,G5M фосфатный буфер,

PtT s 1 Vf~\\rrt ПОТ/РАГ) prpQ IT ТГТТЦ о

11 • fV/ itVI'UMlWitWWiJ WlU«WUiUU

A_TTW 1 щ т» -п. П ПК* n 1 •

Л i » • —wr • ,

0,15; 0,3; 0,4; 0,6 cootest-

CT25KK0*

Т>угг» О ОФ т» о*«гтттт)т'пхгтпт

I • «чу • А О Ох л. г V*

отрицательной полосы при 275 а", в -

Т^ТГ ъл^-Гтупхггмхпгро тт тлю пгпглг т.тлг»^ т^лт^лtrЛ^ гч^^ти/Лггу^тэоггит-^ то

ст8яяин А-ДКК 2 е0дн0-с0д030м раСТЕО-ре ПЭГ

области наблюдается увеличение амплитуда отрицательной полосы в сгзктрах КД, характерной для холестеричзских зкидких кристаллов ДНК. Это увеличение мояко объяснить тем," что молекулы протаминов

Т>4 r"TMrrr«-»wr» т>

ряд фосфатных групп ДНК, что в растЕоре с ионной силой 0,15 при-

за

водит к Слдее эффективной ксмпактизации. При г > о,'5 уменьшение амплитуды отрицательной полосы 2 спектрах КД, по-цмдимому, ос„-сдсгдеко образованием сехесх между молекулами ДНК. Сочетание данных рентгенографического анализа и поляризационной м::крсскс;т:'и показывает, что при значениях г < 0,15, образуете;: холссге^пчзс-:с:е жидкие кристаллы ДНК с расстояниями ме::ду молехудгмн 32 2. При г > 0,15 формируется жидкие кристаллы неспецифического 7:2:2, при чем, расстояние между молекулам: ДНК 26-25 2. Слезет стмз-тита, что тзкое же расстояние между молекулами ДНК было определено з случае нуклеопротаминсз рыб ?.,ЕиЫггпа J.P., 19772 .

Если справедливо предположение, согласно которому изменен:«, наблюдаемые в спектрах КД, а также результаты поляризационной микроскопии и рентгенографического анализа связаны с образованием протамкновых "сшивок" между молекулами ДНК при г > 0,15, то очевидно, что разрыв этих оливок должен приводить к восстановления Т8кого расстояния между молекулами ДНК, которое соответствует использованному нами растворителю. В этих условиях должна восстанавливаться структура жидкокристаллической фазы, которая соответствует свойствам Еодно-полимерного раствора. Для проверки этого предположения было решено воспользоваться ферментатизкы:.. гидроли-з.м протестов.

7.2 Гидролиз жидких кристаллов пз основе комплексов стелдинов с ДКК протеслитическим^ ферментами.

Е-^ли приготовлены частицы жидкокристаллической дисперсии при г = 0,6 из комплексов стэлдинов А и В с ДНК и затем обработаны трипсином при различном фзрмзнт-субстрзтном соотношении. Из Рис.

-50

-т5

-1сс,

1-Е/5-1/5000

2-Е/В- т/юо

0,ь 1.0 1.5 2,0 Бремя гидролиза.

Рис.7.3 Изменение амял отрицательней полосы (275 нм) в спектрах КД глд:иа :-;р::с-т2дд0в, сфсрмироб2вг121. не!

комплексов стелдин А(3)-ДКН

в водно-ссд^ есм рзствср';

7.3 видно, что в результате протеолиза резко возрастает емплиту-

ПО П^'ЛЮКО tTX.TJnf*' ТТГ\ ПГ\П1Т Т> Г»ГГ£ЬТ/Ч»Т>ОТ VTT пио ТТГ\/'»»т*ПОй'Т» «аоТ/ПТПИО ТТТ-Ч/Л —

,14, W W i ¿J-fjXi,!-« A VallUiAVJl ¿¿W*tWWU» UUWttA^UA 9 ^ttu W A «¿-b MW A llIUi.WJUUUaiUUU

го значения через определенное время, зависящее от количества до-

0от> r»Qtrunr»rv Ле»т-\%»огтгт»С1 П тто тпгт» лтматп*т»1. *thv\ »лот/г«т,т\»о ntnnn г>истс\ит*а

W iUl UlliU (»^J W Ж W 'iXÜ CIIIU

ш,шя:туда отрицательной полосы в спектрах КД, получаемое в ре-

j «а .с х л л. О А «»(Ц^иминии у www ivíuj о 4 * j \J i ^SJUi^U

тельной полосы в спектрах КД жидких кристаллов, полученных из

vr\««rrflovnotJ TTlJLf—/"»т»о ti тш rmu ои о « ооипж т» — П 4 С Uorf тттл тт о о » о

IkUllUilIKJItUWM 4-* k UW'l X — W J I ÜUUllllU^UWIIUlW 41UII1U

нения спектров КД можно объяснить следующим образом. Первоначально трипсин разрывает в белке пептидные связи, участвующие образовании cüíheok между моле кулаг,ai ДНК. Подтверждение этому было получено при анализе методом ВЭКХ продуктов гидролиза. Однако, N- и с- концевые фрагменты молекулы протамина остаются связанными с ДНК. В этих условиях структура жидких кристаллов перестраивается - из неспец'кЦической структуры возникает холестеричеекая, т.е. именно та структура жидких кристаллов, к которой "стремятся" линейные молекулы ДНК. Это перестроение сопровождается изменением амплитуды полосы в спектре КД. При более глубоком расщеплении трипсином N- и с- концеьых фрагментов молекулы протамина происходит диссоциация получающихся коротких пептидог от ДНК, что сопровождается умэныгкглем степени нейтрализации отрицательно заряжен-

игт-v т>т-и'тттт TTTTtT *а rrrvvtcir»/-» тгрт-тор ттт*«п v м-птэт»\пгргттг!лм

<у j.' J' 1" ' < ■ ■■ - " ж ^Jj | sj ¿ wж * Л <_• w^Jjf U*w£X*A¿U

первоначально сформированной структуры жидких кристаллов ДНК. Для подтверждения данного объяснения был проведен рентгенографический анализ жидкокристаллических фаз, сформированных в водке-содэеом растворе ПЭГ из молекул комплексов ДНК-стеллин при г = 0,6 до и после обработки трипсином. После обработки трипсином наблюдается не только смещение положения максимума на кривой рассеивания е сторону малых углое, но и уширениэ кривой рассеиЕашя(рис.7.4). I,10'"l2.in/1 О3 С

Puro Л Vmíoiw гчлппаттыа гщггп*—

1 MWl I .*X*f tt^MUJUV ^UMWmilillll ^WÜi

nounumír mrt7iaf> .jo wMiiwnvrn*f»*

Л ..JF SVJ* UU —"'. V i '

таядкческш фагах, сформированных из комплексов стедлкн В-ДКК(г=-0,6) до(1) и пссле(2) об. работки трипсином.

2е, град.

Расчеты показывают, что расстояние г,-.езду молекула:.«: ДКК в фазе при этом .,зелпчл22ется с 25-27 2 до 32-33 2. Наблюдаемые кзмене-кия всех рентгенографических параметров, которые ис эльзуются описании характера упаковки молекул полимеров в ¡жидкокристаллических фазах, ннтерпрэтируются в рамках представления о перестройке структурной организации жидких кристаллов, сфсрм^форакных из комплексов ДНК-стеллин под действием трипсина. В пользу этого свидетельствует анализ оптспеских текстур тонких слоое жидких кристаллов. Как уже отмечалось Еыше, для жидких кристаллов, образованных из комплексов ДНК-стеллин при г = о,б характерна "не-спецнфнческая" структура. После обработки трипсином образуются жидкие кристаллы холестерического типа, для которых характерна текстура "отпечатков пальцэв"(рис.5).Величина шага Р спиральной структуры холестерика ДКК составляет 3 ¡.склона.

1

1

Л

'■:0Г Г

10 мкм

Рис.5 Наблюдаемые е поляризованном сЕете оптические текстуры тонких слоев гомкм) жидкокристаллической фазы из комплекса стеллин В - ДНК(г=о,б) до (1) и после (2) обработки трипсином.

Аналогичная перестройка структурной организации жидких кристаллов наблюдается при использовании _ палата, проназы р, а-химотрипсинз.

Таким образом', протамины можно использоезть для управления структурной организацией жидких кристаллов нз осноев ДНК. Сходная с протаминами ситуация наблюдается при использовании для получения комплексов с ДНК других поллкзтисное, например, поликониднна. Однако, в данном случае, в отличие от протаминов, перестройка хо-лестерической жидкокристаллической структуры сопровождается изменением параметров деойной-спирали ДНК.

земзя перестройка структуры жидких кристаллов под елия-

птлтдттп>пло ттг\«этэл •пс/эт _ _

. .........а . . ъ .. .. .. . — ... . > . , ..... .......... > .

Считается, что после оп-

тт/лгтпт»г)Ат(с1гтт»а стелют/' па»тгт* г,гтп-п»*о'пгю/-\'* ттгмч хгхтоошжо тэ пг*пг\—

шНУ^^и Лии^Ч.х«ии^и^М'и 4 мни 4 иил/!,'»/!« « / Чии * /(V и имиЦ

бпч'гга-и-эт* ТТТЛГ г\гт» гт/-|тигг»иг>т> ТТГОЖХУП 1т »г»т\тггтгчгипттп тгпЛглтм ТТТ>п*РРТГ11««.

за;.". [Ваз II.К.,Ваг1-сег С.,1976]. По-видимому, так же как

и в случае жидких кристаллов, сформированных из комплексов ДНК-протгмин, первоначально гидролизу подвергаются" протаминовые сииеки с образованием рыхлой структуры нуклеопротамина. Это создает благоприятные условия для последующей более полной деградации прота-миков и замены их пистонами.

Следует отметить, что перестройка структуры жидких кристаллов

ишшш. ^ Л.-.Ы....Х ¡^и^тии. и*. ** / , X * ^

было испсльзоезни нами для создания чувствительного датчика для биосенсорных устройств. Особенно перспективным представляется получение протамикопсдобных белков, которые имеют Еполне определенное строение участка молекулы, участвующего е образовании сшивок. Такой подход позволит создать высскоселзктизкые и высокочувствительные датчики, реагирующие либо на определенный тип физико- химически воздействий, либо на определенные химические соединения.,

Таким образом, в ходе проведенного исследования были впервые получены доказательства, свидетельствующие о жидкокристаллической укладке ДНК в комплексе с протакинами. Кроме того, подтвердился предложенный механизм ксмпактизацки ДНК посрздстЕОМ образования сщпеок между эе молекулами. Так как параметры,характеризующие жидкокристаллическую упаковку ДНК г, комплексах соЕпадаг ■ с параметрами нуклеопротвмина, то можно предположить, что в хроматине половых клеток ДНИ также находится в виде жидкого кристалла. Следует отметить, что в жидкокристаллической системе нам не удалось обнаружить различий между комплексами стеллина А к стеллкна В с ДНК. Не исключено, что эти различия находятся в пределах даспер-с;и воспроизводимости применяемых методов. По Еидимому, именно возможностью образования жидкокристаллических с руктур при взаимодействии протаминов с ДНК можно объяснить широкий разброс экспериментальных данных по спектрам КД комплексов: в зависимости от условий эксперимента удается наблюдать спектры КД, характерные как для А. так и для С фэрм ДНК.

8. Под:'чежз koesjigkthhx соединений стзллжоз с рубогдтцттеом. Применение антибиотиков зитрацикдкиоЕогб тзяда пси дочении он-

1ff\ TTOT^fTTCl I 'ТЛМV П О^Л* T1Qt5C»TJT*^>- ТТЛГО'ЗО тгп ТТ»Т>Г> tlOPKAmTia TJO 'Л'РПТ/ПП C.T/fTTf

ikWlUU4 «А ЧУ W^uxn. «-lUW^«.»1-/.!-! Uljj i-J A UUJ VUUUlllVj у 1 A W A4.W Ul'IW A A 41U UiAÜW.kj М/ UltA ¿¿-О

ность, ош! имеют ряд недостатков. В первую очередь это кардиоток-сочность отсу * ctsi1q csj12vm»*t:>,jgct'i ^с 60 v^tto с« * 2 т'^к^'о

развитие резистентности опухолегых клеток ( Sordon А.,et а!.. 1931).0дкн из возможных подходов для преодоления этих затруднений - применение полимерных носителей (Gros L.,et al.,i9Sl).

Мы реашш использовать в качестве носителей антрацикишов стодлины Л и В. По сравнению с другими полимерными носителями стеллины имеют следующие преимущества. Во-первых, как показгли наш; исследования, стеллины сами по себе обладают как антибакте-O^wJIbHO^A TciK ОККОСТЗТИЧ^СУСЛ S^TI*"0КОСТЬЮ В0~В,Т01^Ь»У УЧ7Т"Ч2Я

высокий положительный заряд молекулы протамиков, молно было оги-

тт о тт. Т.ПГ ттпа ттптт тхир rrt_xrnr«r\ гт^погглттгупта т/ nmrvn rrn-ofi» v ttCiuv ом Ttr\r-\\tct

4 XJ IIA. C^lWiiWA W i^UUMiU * U 1t Uli j IWiW X. • IkUUX.W

того, эти белки способны увеличивать проницаемость клеточной мембраны и, следовательно, повышать терапевтический эффект при использовании антибиотиков (Куденко H.H. и др. 1985).

Для получения коЕалентных соединений с протаминам:: был выбран антибиотик антращшлинового ряда - рубомкцин и сукцинпльные производные стеллинов.

8 1 Сукцинилирование стеллинов А и В.

Необходимость использования в синтезе м-сукцккильных (ir-s^o) производных стеллинов определялась несколькими причинами. во-

rro-пттт "О VOTTO »<ОГ>ТО Ттт*ûûй ■-njairia TTTV-\ ФО» г-ГШ О XJ С.**-* ^¡?.Т Г? Г. r-lT/^r«

л у XJ Atu IV SJ А iliVW А АЛ^ЛА WUU, .atilCuJM« 4 ÜUltlJl >VU|I<U WiAW^U

на ш,--группа амниосахара рубомникна, т.к. это позволяет сохрз-

tJT»rnt. Ol/ffnrüVrv^T»!. С|ЦП»Т»Лт*Л»ГТ»Т/0 и а ГТГ'О rnri'-^ —,T'-r\'fTTTT

ДМ А А А/ WA к А HU.j.lWb>i аЭ U4* Л «iWIIW А «А* kW » W А Wltl J ilUWiil UtV Ww W W W^* AA*«t «1»»^ * ^ J ,

в протвминах могло приводить к получению соединений типа прота-

MlJ«. TTrV\»»»©»#T*\I TT О ПО О DDQ ттаггт»0 Vf„.С». «/\_гттгтт»-п.т ТЭ Л »»«О TT TTT*TJT Г

tl^ul А ШМ«4А « W у WWW^UtOiM AI * I < I 4t« А-» Л J •«. W..J'-A w a.

TT/% frtvnvo TTT_tJT.r*t Г) OT-IO TT CTИПГ ^Q T»V/->t> 1]Ч1П P г." 'f С. с. T4 П V _

A^U«A ^Atii « w -' - "» -f W i WW«U IWM | •» * W WiWMHMV A W-^^SW А » A w A «J ~ . - » »

Оитч^Г/ЛТ-П/ЛН

Наконец, Сило показано, что сукцЕКйлиров^ЕКыв Седхтл npcK-i-

K2DT В кдетку (Treue А.,et al.#1S52).

Известно, ' ЧТО реакция СуК1^КИДИрЗ2¿НИЛ ПО CBCwO^HÜM

зл белков протекает с хорошим выходом при рН 7,5-3,5

(ъа 4 ООС N Г\тзал*г\ оиотю ттг\отп/^/ю /мп^ттглх»»ттт\от>оит#о ттпт*

рК 8,5 и 100-кратком избытке янтарного ангидрида показал, что

Результат был неожиданным. Поэтому, для более детального изучения

пй с.гл?т-т--г гчг^тги-тт ттлоочл^о г»п»с п тгггигчо ч* птг»тгмт*'эа*ттгг* отпгп тгпптюппо

уиши^ык ^ j »кцаиамм'^ииым««« О ^^«миихии лл. <Э * их и иии

рЭ1И11Л1'1 ВССЛОЛЬЗСЕЗТЬСЯ ?>«3?0Д2тИ 11Л2И21р022К11Ч ЗКСП8р«1МЗН?2 I* М2—

тематического моделирования. 3 качестве факторов оптимизации были ЕЛбрана рН и молярное отношение янтарный ангидрид/прот&мин (К). ■Кз предварительных- экспериментов следовало, что температура и время рэакции оказывают меньшее влияние на степень ыодифг.сации. Эти факторы были зафиксированы на уровне 20°0 и 60 киа. соответственно. Предполагалась возможность построения математической модели в виде полинома второй степени:

V - -к V V V т тг2 [й 1 \

^ II ,«_ I V. III »- ,

где у-вкход продукта кодификации(й), Х/и Хр - рН и молярное

Стч1л\'гт^итта с«тттжтг.лт*тт /тт/*\'по*1гт*и 1X3 \ /■»пп'роситчэогтил

4 <14.* X иишл<1 Ui.il, * ииаи! / иии 4, •

варьирования: рН 7,4-9,4, К эотБвтстЕйй с планом втотхм

ттг,паТ/ои'птп** и гпс,лгпт>гг,-о тэ о г> т. ттт\п т? о ттт.т и а V »тпчиоу Гтстгоот:

модификации (Уот„гг) стеллинов А и В рассчитывали из данных анализа продуктов модификации методом ВЭКХ.

с.

v - г1 _ \ 1 опк (р « \ *отл>тг -и с: /IчС" ' /

"о

где площади пиков стеллина А (В) до и после сукцинилироЕания

соответственно, отнесенные к одинаковому количеству белка. Для каждого прота-мина по методу наименьших квадратов были построена моделгй вида:

Стеллкн А: УА= 295,8-64,б7рН+0,40К-0,050рЖ+4,611^рН2) (8.3) Стеля« В: Ур=~133,7+41,20рН+О,бО5Е-О,Об24рЕЕ-1,770(рН2) (8.4)

Обе модели согласно 1фитерию Филера адекватно описыеэли экспериментальные данные. Однако, анализ модели, 8.3 для стеллина А,

тгмттъ. гоп^пп-'оо ттггг*г.гглг\гпга *г_т/глиттатз1лт' тл .с—НТО -.тт^гтт

и^и^Ол^^И А. ихии и* X Л* Чм л

показал, .то е выбранном интервале фактороЕ не достигается полной модификации белка. Поэтому для более точной локализации оптимума сукцинилироЕЗКия этого протамина была проведена дополнительная серия экспериментов с изменением интервалов варьирования рК с 7,4-9.4 на 8,4-10,4. После обработки полученных данных для оукци-нилировання стелдинз А была построена новая модель видя:

ya =

-622.0+145,?СрЯ+0,532К-0,С50рК?-5,313(рН)" (8.5)

которая адекватно списывала эксперимент.

Нз рис.8.i представлены графические интерпретации полученных моделей, из которых можно сделать следующие выводы: а) Большее влияние нз степень сукцгнилировгния сказывает рК; б) к-кснцеззя o-sh, группа стурина В значительно легче, чем у стеллинз А подвергается кодификации. По-видимому, это обусловлено особенностью вторичной структуры стеллинз А. Не" исключено, что это связано с возможностей образования в случае этого протамина более прочней внутренней солено.: связи N-кснцеЕой аминогруппы с с-кокцевой карбоксильной группой; в) Оптимальные условия сукцинидирования стеллинз А - рН 9,8- 10,2 и к 150-180, стеллинз Е-рК 8,4-9,4 и Я

i^m-

R стеллик S суеддин А

1ео

pjic.8.1. линии равней степей::

115 \\ ^ г \ \ \ \\ динсв ннт2т"

гнгндридсм

£0

Го, что для сукцинилироЕзния протаминоз необходимо более высокое значение рН, чем для других Сзлков, по-видимому, может служить подтверждением высказанного ранее предположения о внутренней солевой связи. Интересно отметить, что дзге в сигнальных условиях степень модификации • групп лизинг нз препыпалз :С1. Кроме того, ни в одной эксперименте не* удалось получить

8.2. Получение ковадентных соединений стелдин-рубомиция

Для активации ссон групп м-Зио производных стеллина были применены несколько рэагентоЕ: дипентафторфенилкарбонат, N - цик-

тгпг»а^г»т*тт__лт^.%»/-\,гу,Рчл тпипатм тт_т/стЛп птгтж^дт^тт^ттот-ю-.т/г» ттт*тттп/_

логексилкарбодиимид. Лучвий результат был достигнут при использовании водорастворимого карбодпимида. При выделении продуктов реакции возникли значительные сложности, связанные с хроматографией реакционной смеси. Для разделения получашцихся соединений ьа удалось применить ВЭ-ТОС, так как происходила прочная и необратимая сорбция их на колонке. Положительный аффект был достигнут при ис-

ттп пг. п лшшп^ гт»-пг'»о-ит»а Фл>чгг>г» е»»эчг»1 тттмж п п'лтт ттотг»*ои»т»п** Р/^'ТОП—

го этанола, содержащего 0.05 £ ТФУ. Анализ полученных ковалентных соедн*тзний стелдин А(2)—рубсмнцнн показал что удается достигнуть присоединения лишь одной молекулы рубсмицина к молекуле протами-нов. Из табл.8.1 видно, что иммобилизация рубомицина на стеллинах

ттп тог» по от ттл ттлпгт*»пт. иа т.л ттгл/п (^л на о оггтття-огл-то и/л т* »»о

л. тллу чл* хл-1 ни лч/ни^ьи миму ^ Шккичшм , «м «нс««*^ АЧ^ДЪМ-«* т *ши

Таблица 8.1

П.^г» п а т 1

ЛаТОСТЗТИ^'ЗСУЗЯ £ХТИ2Н0С?Ь Токсичность (тгео)

Рубомкцик 0,4т +/-12% 2 мг/кг +/-255

Стелдии А 10,0т +/-173 100 мг/кг +/-203

Стеллин В 9,17 +/-15Г? 150 ыг/хг +. -2055

Рубомицин-стеллин А .. 0,25т +/-10Й 5 мг/кг +/-20Й

0,217+/-155Е 5 МГ/КГ+/-205

*)- доза, Еызавангдая 50% подавление в культуре клеток НК/Ьу

Полученные данные'показывают, что лучпие характеристики имеет препараты, полученные на основе стедлина В-. По-видимому, это связано с более высоким содержанием аргинина в нем. 1.-1 лее того, атот белок содзржат Есвго одну свободную нн,-группу, которая легко подвергается сукцинилироЕаниа. Поэтому стеллин В является более перспективным протемином для получения высокоактивных соединенна с антрациклиноЕыми антибиотиками. •

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны ноеыэ методы Еыделения и ко.^лчестзэнног" определения протаминов рыб.

2. Ьззработана автоматизированная система компьютерной оптимизации условий хроматографиче ского разделения с использованием алгоритма Келдера-Мида. Использование процедуры оптимизации позволило Еперзые осуществить разделение протзминов методом обрэщен-нсфазоЕОй ВЭ'СС.

3. Епервые. Еыделвны индивидуальные компоненты протамина из Г0Н2Д Act pensar atel latus - СТЗЛЛИНЫ А, 3 И С И уСТЕНОВЛеШ ИХ полные аминокиелотныэ последовательности. Показано, что сголлшш имеют ряд особенностей, выделяющих их в особую группу протаминов. Впервые выделен протамин рыб, молекула которого начинается с ар-Г*ИИ1*ЮВ01*0 ЗЛС

A TjTr»/-» го TIADCW Т/Г,П.?'*У1ТЛ»»аТГ'#ГЧТТГЧС1 г\пг\Апътхзг\пт*тя Г»Т»£> Л *Т'ГТ-1П D т» тгг

*х • iiwwiiiw^JubMiu i -rs.** i'x '^fi' • i n i wwwwm^wwAM О А цщлииуц J4 иЛ

производных. Ka ochoeshihi полученных результатов предложена модель молекулы протамикез рыб.

5. 'Впервые установлена зависимость удельной антигепариноЕоЗ. активности протамлков от компонентного состава. Показана возмож-:-ность оценки антигепариноЕсй активности препаратов протаминов о

TTfV»»/-wtTn 7Totra rvriootr**»^ а ттт.- л vívnot/,m£ifi-»»r»*mjrvo ои^гпагготувгтгурпЛ

»'WIUUM^JW ^UiiU Ьиишш iUMWlluai i/Шк! 4 WitiJU wUu^/lUiUuUM

активности индивидуальных компонентов стеллина.

6. Проведено детальное изучение физико-химических сеойств комплексов стечлиноз А и В с ДНК. Показано, что стеллины стабилизируют двойную спираль ДНК, защищая от действия ДНКазы 1 и предпочтительно сйязыезются с АТ-богатыми областями ДНК. Впервые установлено различие фнзпко-хлмическнзС' сеойсте комплексов индивидуальных компонентов протамина о ДНК.-

7. Впервые получены данные, СЕметэльствувщие и неодинаковой роли индивидуальных компонентов прстампкоз е формировании хроматина полоных клеток. Предложен механизм кемпактизации ДНК прота-.гинами рыб.

8. Впервые получены данные, свидетельствующие о жидкокристаллической упаковке ДНК при взаимодействии с протвминами. Показана возможность управления структурной организацией жидких кристаллов на основе ДКК с помощью лротамннсв. На оснсео жидких кристаллов

комплексов стедлпкоЕ с ДНК создан прпн",нпкгдьно новый тип высокочувствительного датчика для биссенссрных устройств.

Э. Впервые получен кс^й т:~ биологически активных соединений " протамин- пнтибпстнк ". Обоснспака принципиальная возможность использования ковалентных соединений стелллпов А и В с ру-бсмицином з мэдп-дп-юких целях.

Список основных

1. ЮлиxcSa Е.П. гЗбсеенка Л.А. .Гибин. Б.К. Изучение пептидов тзр 1,:о.г^з;ц-:оЕого гидоолигз стуоинз В. //Химия исиродн. сседнн. 1275, г; б, с.817-818. *

2. Юл-л-ссва. Е.П. ,Е6св£К1:з Л .К. .Багхпсба. Л. А., Белякова Л.П.,Гыбих B.K..Ciuas5 А .Б. Пег.:::чнгя структура стуоина 3 - пвотамина ::з Каспийского осгтЬа.//Е::ссрггн.хп:,:пя, "1576, т.2, г: is,

с.1513-1517.

3. РУбцн В.К.,Е.':л:с£а Е.П.,Силаев А.Б. Первичная структура стелг-гнов А и в.//Тез.дз.-:л. vi Бсессюзн.симп. по химии белков :: пептидоз.- ¡¿хек, 1277, с.71. •

4. Юл^хда Е.П.,Гибнн В.К. .'..Б. Петзв^чнгя структура стел-лина А.//Еиоорган. :ия, 1Э7Э, т.5, к !, с.5-10/

5. V,vui:c£a Е.П., Рыбач З.Е., Cvjizэд А.Б. ПегзЕпчная структуоа сте.ътжа В.//2Симпя ;:рпрсдк. соедггн., 197Э, 5, с.7СС-704.,~

6. Гийих В.К.. &lv:-:2£ci Е.П. Тевмлческая денатурация :: нукдеазкоз саожгвэнпэ :-;сг/лл£:-:?эв столдиков А и В с ДйК.//Биох2:ям, 1S33. Т.45, С.733-72?.

7. ri^j-jn S.V.. ,:l:vzcß'0. Е.П. Круговой дпхпоизм комплексов стелли-НС2 А и В'С-ЛНК.//Еио:-пг.2К, 1S21, т.45, с. 276-279.

а. Гибну. Б.К. .КзксооЗ K.B. Способ получения пЕСтгмлно2.//Авт. СЕ. II 114470Q.

9. TtüS-Jü Б.К. Б.В. Изучение СЬгзпкс-химических свойств КС:.£ПЛЗКСОЕ 1ПХ!?£МИНОЕ ИЗ ¿sisenasr ateUatua С ДНК ПОИ раз-дичкой ионной силь.//Рукопись деп. в ЕШШ 1934. II 2010-34.

10. Pväw. З.К.,Яглицхая ПЛ. .Полозов И.В. Получениэ гомогенных псотпмняоз йпакциощтаванием нуклеопвотггдша.//Химия природ}:. сЬедлл.,1925, к 3, с*.373-331.

11. рыбин В.К. ,i'£r£2pcS H.B. .EScjghko Л.Я.,Cil/lzsö А.Б. ВЭлОС как ме-/од изучения динамики модификации протампнов осетровых.// Тез. докл. у Международного симпозиума по хво-'.атогвафпи - " Ялта, 1925, с.25.

12. .Чглнцхал H.U.,ThSvh Б.К. Способ опое деления протаминов в молоках ссзтроЕЫХ рыб. // Авт. св.If 42553Э1

13- ir. у.к. .rasiistoya S.S.,НаЬагс-j .v. v. Separation and quantification ei protamines by reversed-phass high. psricnsancs liquid chromatography.//In thesiaec of Int.Conference High-pericsance shrcsiatcgrapliio anü eisctrophcretic techniques in

biccl mistry - Siorck(Hursarî'). 1SS5, p.77.

14- Л;/Ьin. Г.К. .Yacllzimya. i\2?. .¿'aharot; J.'.Y. KPIC thrrnioly1 '.0 peptides ci protamines. //In thesises о Г Budapest chromatographic synposivm - Hurv-ary, 1335, p. 1515. FzZ'xi 3.K. fHsxuzzazz 11.H. ZciszpcS H.Б. Выделение индивидуальных поота:.'.и1;Сз методом высокоэффективной гкдксстнсй хпемз-•rorpa&nî.//Химия природа.создан., 1Э36, "2, с.252-253.*

16. РлСш В.К.,Юр::с-еа. 2.С.,Пси Х.П.,I'o/cczncS Я.В. Цеолиты кзк созбенты для. паздоле:-;::;: основных r.r.eoiiux белкой.//Тез.докл.

I Есесокзн. конф. "Применение ионообменных мзтеохадов в промыиызнностп знадатичоской хну.::::" - Воронеж, 192G, с. 169.

17. Rubln v.l■:. .¿'аЛагои 7. Computer controlled optimisation of îIPLC separation of prota.nines из;"-- simple:: factor design.// In. thesices оi 11 -tb. Symposium or. Column Liquid chromatography Amsterdam, 19S7, p.53.

18. Eybln- V.K. .Katrultha g.s. .georjcpmloa A. r? hpbg study Of protamines and^cuccinic; acid anhydride interaction.//In thssise? ог 12"' Int. e yr.se sins on chromatography. - 7fc£hing-ton, 1SS3, p.46.

19. Рыбин i.Ц. »I'onoscS H.3. Оптимизация разделения белков еысокоз^дктнпксй жидкостной хооматогиафней. //Тез. докл.- 17 Есесо:-:зн.с:г.'л. по молекулярной z-сидкостной хроматографии - Алма-Ата, 1237, с. 115.

20. ДуМя V.K. .Hdkaro-j ::.Y. Study о° organisation of nuclecprota-r.ir.e by RP H?IC.//In thesises of 6 ЕыпаЪа Symposium cn Chromatography - Yarna, 1927, p.211.

21. H;;t>'r; V.H. .C-ri-.c-ï-a L.V. .¿'abarcj . Gradient profile optimization in H?IC.//In thesises ci 17"" Int.Symposium cn chromatography - VYien, 1SS3, p.7?.

22. Fu6vh 3.K., Ястарузз Т.О., . Георгопцлос А. '¿одификация поотгглжоз осетоовых янтавным ангидоидом. // Химия ппиоодн.

• сседаи., 1539, Й.2, с.233-242. ' ' '

23- Fii'jvH В.К. ?оль 2пг;ннп-:оенх блоков лоотаминов в компактиззции хооматинв половах клеток гыб. // Тез. докл.Всесоюзн. симл. "Химия Сел:-:ов" - Тбилиси, Î9S0, с. 150.

21. ГжгсзсЗс. Л.2.,Е$и£05 3.С.,Резких 2..?.Д'акорсб

Я.5. Способ получен::?. пготаминов // 1Голоя.пе-ек::-э по А.З. 4204310/14 от 15.09.50.'

25. PonsopcSa /..3., Fosîzai I.E., Рибин B.C., iГачарсб • Я".3. Сравнительное исследование антигепарикозой активности и сстоой* токсичности стеллинов// Сзомаколзгия и токсикология, 1990, Т.53, 5, с.31-23.

26. dcjvuSvii C.T.,PvSua В.К., ¿елбо ^.Г., ScScsS B.C., Btâa?JurS n.Y. Паоестоойкз стр^-:туонсй опге:п:з2п:з: r-^-o'JC. крнстз-_-сз Л5С под действием ппиооднпх ссел;п-:ен:^ // Докл.АН СССР, "Биофитаа", 1990, т.S'il*, 4, с.920-522.

27. Ведома D.U., CK-J^vh С.Г., Ptii-JH 2.К., Ссилксй ^.Я., Полулёо A.U. создали Сиолатч:п-:ог нз ос:-:с?о кзпотгллоз кукл5:п-:свнх к:слот // Еис<^г:п<а, 19Э0, т.25,

ВЫП.5, С. 731-733.

28. Puüuii B.K., иакаров U.C., Tptizoраба Л.В., Оптимизация условий

0бТ13ЗДНН0ф230ВСЙ вэхзс бЭЛКОВ. // тэз. ДОКЛ. всбсовзп. "имп. по*молекулярной жидкостной хроматографии. Рига. 199С, C.23S.

29. Рыбин В.К., Примекзние хроматографии для выделения i. коли-ттп Qrp-oQT.rjiQT-'Q <пттг>а TTojTQTmçi IT^OТ2*»"*Н02 «Î ИТ#0И320ДНЫХ С SÛTI*

I отккагли. // Тез. докл. Всасовзн. кокф. "Применение ^ромато-гозфии в ыикообислогическсй и пищевой поомыиленности. Геленджик. 1990. с.4-5. ?0. PtiCtoi E.K.. Яглхцхая. E.H., Лазарев А.Д., Нагаров Е.В., Автоматизированная оптимизация разделения - пвотзминов высоко эффективной кздкостной хроматографией П Химия

тт^гпптттт /-»латтт tr 1 QCin г* СС*3_ССО

lluouj^n.uuw^li«! , I Ч « VjWU WOiS «

31. Тыбия B.K. Гидролиз нуклеспсотаминз из гонад ¿с{penser Bteziaiua теталолизгном. // 1'алекулярная биология. 1991,

я. -С1ТТТ /-." СГ11_С:ГТ'-/

л, m f ' ■■ " • » U W« и / W Ulla

32. Рибин B.K., Скурхкм С.Г. Лиотоопныэ жидкие ктзпеталлы ДНК с биогенными пслг.депт'лдз".и // Тез", докл. 1 ВсесоЪзн. совец. по

тг-'о^^^тг-пл»» чпт'чм " ттг1»я !Тсnunrn Ч ОСП г» 1 П1

Mi ni г f ^f "i"""i ""**. V *•**•" tt U44W А инк kuit« • a a »s w* w f w» I W 1 •

33. OwpjSriH Т.е., Pt£-jn B.K., Saùxs3 И.И., Рсзюм 'J.H., ВфилоЗ B.£., Е£0окилав D.". Управлз:-::.? пространственной организацией ••.«г*TTVTTV ЛЛОИ ЛИХ 1ТС*Л0'Ш1 ITOJH'WJIWKA'^OJIIITOS // "скл• АЫ

cccpTi ээТ / т".зТ 6.IfУ,'*с. '¿gg"^

34. E530KLLI0Ö S.iî., С'гуридин С.Г., f^Ötwt Ч.К., Еиодзтчик для опоэделенкл биогенных веществ. // Полож. решение по A.3.N 4745Ü34/13 от 18.C7.Ö9.

35- Рибич З.К., CiQzzjâiïi С.!'.. Уппавлеппе структурой диотлопкых жидких кзггстал-'.св iron помоги * шютамкпов* // Кзв. Л! "СССР, Серия фиьическая, 19S1, т.55, к 9, с.1823-1331.

36. СхуриЗин С.Г., ESöoiXLtoe V.U., Гибин З.К., и др. Синтез нуклеиновых кислот и простианстъэнная организация ДКК в присутствии гепарина и четвертичной аимонийпй соли олигомврз-25 конидаыа // Молекулярная биология. 19э1. т.25, еып.5, с.1303-1315.

37. PtüSiiк В.К., Григорова Л.В., Попоров Е.В. Оптимизация условий обр^еннофазовой высокоэффективной хшматографии белков.// Дури. <у:з. химии. 1991, т.£5, II 10. с.2549-2654.

38. Rybin Y.K.. Kozïova u.V.. Xakarov 1J.Y. Conformational studies о £ individual ami codified protamines irom Ac I pons er 3tellatua //In Thesises oi 8-th Intern. Coni.of Young ecien-tists on organic and aioorganio oheEistry, Riga. 1991. p.239.

39. Ptzöi¡к 3-Х., Козлова Я.В., ûaîœpô H.B. шособ получения прота;.2-иов // Полож. решение по A.B. 4938137/14 от 30.01.92

40. РыЗих В.К., EapcmaSa I.A., Геб una. Л.Ii. Выделение третьего компонента стеллина - ппота1Я2:а из гонад ларвпавг Sieiictu-j.//Химия пр;^одн.ссе"д:щ., 1991, N4,с.590.

41 ."PtiöVH В.К., Григорова Л.В., ХахросаВих T.D., Покоров Н.В., Способ оценки адтстепапиновой активности гоотаминов осетровых с помо'дью обраценнс^азоЕой B3HDC // Полож. решение по