Методы определения протаминов и продуктов их модификации противоопухолевыми антибиотиками тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

всероссийский заочный институт РГО ОД пищевой промышленности

/ о •' ' ■'""'.1

На правах рукописи

Козлова Наталья Владимировна

УДК 577.112.822:577.18:615.33

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТАМИНОВ И ПРОДУКТОВ ИХ МОДИФИКАЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ АНТИБИОТИКАМИ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1993

Работа выполнена на кафедре неорганической и аналитической химии Московского ордена Трудового Красного Знамени института прикладной биотехнологии.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор химических нау! академик Макаров Н.В. доктор химических нау? доиент Рыбин В.К.

доктор химических науя член-корреспондент Шг, Неклвдов А.Д. доктор химических наук профессор Бочкарэв В.Н

Ведущая организация: Московская медицинская

академия

Защита состоится 1993 г. на засе,

нии специализированного совета К 063.45.02 во Всероссийское^) очном институте пищевой промышленности в аул. <£ ' в ча! по адресу: 109803, Москва, Ж-4, ул. Земляной Вал 73, ВЗИПП.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВЗИПП.

Автореферат разослан " ^ " 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук .лй^^ Г.Р.Касьяненко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблегн. Особое место среди имеющихся в при-здэ белков занимают протилшы - основные ядерные белки половик изток ряда организмов. Интерес к протаминам обусловлен не только 5Я, что этим белкам принадлешт ключевая роль в процессах хране-ш и переноса генетической информации. Протамины являются единс-зенными на сегодняшний день препаратами, использующимися в меди-знской практике для нейтрализации гепарина - что является важным зловнем успешного проведения экстракорпоральной гемоперфузии аппарата искусственного кровообращения, гемосорбции, змодиализа). Эти белки также нашли широкое применение в качестве юокоактивных добавок при лечебном питании и пролонгаторов дейс-зия ряда лекарственных препаратов, в частности, инсулина. Кроме эго, протачаны обнаруживают онкостатическую активность, в связи чем особое внимание исследователей в области химиотерапии рака зивлекают препараты на основе ковалентных соединений протаминов противоопухолевыми антибиотиками. Для этих соединений характер-з способность направленного транспорта в злокачественную клетку, го в значительной степени повышает терапевтический эффект. Важно гметить, что вышеуказанные продукты модификации протаминов яв-тотся малотоксичными препаратами. Высокий научный интерес к этим эединенпям обусловлен такге и тем, что детальное их исследование значительной мере облегчит решение многих проблем, связанных с мснением биологической функции протаминов.

Необходима* и ванным этапом в исследовательской и, особенно, клинической практике является быстрое и точное определение со-зрзакия протачаша или его ковалентного соединения с противоопу-элевым антибиотиком в фармацевтических препаратах и индиЕИДуаль-£х лекарственных дозах, поскольку недостаток или избыток прота-ша в организме человека приводит к тяжелым осложнениям, вплоть 5 летального исхода. Однако, следует отметить, что в Государст-знной Фармакопее СССР - ГФ XI на препарат протамин - цинк - ин-/яш и фармакопейной статье на препарат протамииа, используются для нейтрализации гепарина - ФС N 42 - 1256 - 79 предусмот-зны лишь биологические метода определения этих белков. Эти мето-1 трудоемки, недостаточно чувствительны, дают плохо воспроизво-ашэ результаты, длительны, с трудом поддаются метрологической

оценке. Применение до настоящего времени биологических методе определения объясняется отсутствием современных быстрых, надежш и достаточно простых химических и 4изико-химических методов ощх деления протаминов и их производных, удовлетворяющих требованш клинической и исследовательской практики. Для определения ков* лентных соединений протаминов с противоопухолевыми антибиотикам! настоящее время используется метод аминокислотного анализа, коте рый не годится для серийных лабораторных анализов ввиду длитеЛ1 ности и дорогостоящей аппаратуры.

В связи с вышеизложенным разработка экспрессных и надежш методов определения протаминов и их ковалентных соединений с щх тивоопухолевыми антибиотиками в фармацевтических препаратах, г< тока лекарственных формах, а также в индивидуальных дозах яз ляется важной и актуальной.

Цель работы. Целью настоящей диссертационной работы яз ляется разработка экспрессных и надежных методов определения щх таминов и их ковалентных соединений с противоопухолевыми антибю тиками в коммерческих фармацевтических препаратах и готовых л< карственных формах.

Научная новизна работы. Разработан.метод определения щх танинов с помощы) спектрополяриметрии кругового дихроизма; установлены оптимальные условия определения.

Впервые инструментальным методом исследованы фармацевтиче кие препараты протаминов, использущиеся в отечественной клин: ческой практике.

Проведена оптимизация условий электрофоретического разделен препарата ковалентного соединения протамина из гонад ло1рвпв агаИагиз - стеллина В с противоопухолевым антибиотиком рубомиц ном; найдены оптимальные условия разделения. Предложен спектроф тометрический метод определения ковалентного соединения стелли В с рубомицином, для разработки которого использован простой эффективный способ предварительного разделения проб электрофор зом на бумаге в найденных оптимальных условиях.

По данным аминокислотного анализа и УФ-спектров установл состав комплекса стеллин В-рубомицин : 1:1.

Практическое значение работы. . Разработана методика опреде-[ения протаминов в коммерческих фармацевтических препаратах с поганью спектрополярпмвтрии КД. Достоинствами методики являются ростота, зкспрессность ( продолжительность анализа - 20 мин ), озмокность многократного проведения анализа одной и той же про-ы. Методика исключает использование дорогостоящих и токсичных вактивов. Предел обнаружения составил 0,20 мкг/мл.

Исследовано содержание протаминов в фармацевтических препа-атах, использующихся в отечественной клинической практике. Полу-енные достоверные данные представляют практический интерес для ценки качества этих препаратов. По результатам исследований под-отовлена справка в Государственный НИИ по контролю и стандарти-ации лекарственных средств.

Разработана методика спектрофотометрического определения овалентного соединения протамина из гонад дс1рвпавг згвИагив теллина В с противоопухолевым антибиотиком рубомицином с. предва-ительным разделением электрофорезом на бумаге. Предел обнаруже-ня составил 21,2 мкг/мл.

Апробация разработанной методики спектрофотометрического опре-эления ковалентного соединения протамина из гонад дс1рвпзвг ьеНаЬиз - стеллина В с противоопухолевым антибиотиком рубомици-зм с предварительны» разделением электрофорезом на бумаге прове-зна на препаратах, полученных из ВНИИ по изысканию новых анти-ютиков РАМН. На основании полученных данных сделаны заключения чистоте синтезируемых препаратов.

Разработанные методы и методические приемы были успешно ис-зльзованы для анализа коммерческих фармацевтических препаратов эотаминов и препаратов на основе ковалентных соединений прота-шов с противоопухолевыми антибиотиками в НИИ физико-химической гологии ем. А.Н.Бвлозерского МГУ, во ВНИИ по изысканию новых ггпбиотиков РАМН, на кафедре химии природных соединений МГУ.

з защиту выносятся:

- метод определения протаминов в коммерческих фармацевтических юпаратах с помощью спектрополяриметрии КД;

- результаты анализа используемых в отечественной медицинской зактике препаратов протаминов методом спектрополяриметрии КД.

- оптимизация условий электрофоретического разделения препарата

на основе ковалентного соединения протамина из гонад лс1рвпзвг згоЫагиз - стедлина В с противоопухолевым антибиотиком рубомици-ном;

- спектрофотометрический метод определения ковалентного соединения протамина из гонад до1 рвпзег згвИагиз - стеллина В с противоопухолевым антибиотиком рубомицином, включающий стадии разделения и очистки црепарата с применением электрофореза на бумаге и подтверждения правильности идентификации.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на 8-й Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Рига, 1991), на конференции "Применение хроматографы в пищевой, микробиологической и медицинское промышленности" (Краснодар, 1991), на 1-м Европейском Симпозиуме по высокоскоростной жидкостной хроматографии биомолекул (Страсбург, Франция, 1992), на 12-м Международном Симпозиуме по высокоэффективной жидкостной хроматографии белков и полинуклеотидан (Сидней, Австралия, 1992), на кафедре неорганической и аналитической химии ЫИПБ.

По теме диссертации опубликовано Ь работ.

Структура и обьем работы. Диссертационная работа изложен; на /Ь) страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, выводов, списка использованной литературы и приложений; содержит 15 таблиц и 25 рисунков. Список использованной литератур включает 151- наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспериментальная часть.

В работе использовали: протамин - сульфат и протамин - хлорц фирмы "Heroic" (Германия), стеллин В - протамин из гонад Acipense steiiatus, выделенный ш разработанной в нашей лаборатории мето дике, гидрохлорид рубомицина ("Piuka", Швейцария).

В качестве объектов исследования использовали зарубежные отечественные фармацевтические препараты протаминов предоставлен

ные Государственным научно-исследовательским институтом по контролю и стандартизации лекарственных средств и препараты ковалент-ного соединения протамина из гонад Acipenser stellatua - стеллнна В с противоопухолевым антибиотиком рубомицином, предоставленные ВНИИ по изысканию ноеых антибиотиков РАМН.

Использовались следующие сорбенты: хроматографнческая бумага марок : Whatman ЗКМ (Англия), Filtrait FN-12, 7N-14 (Германия), пласпшы для тонкослойной хроматографии Siluíol UV 254.

Реактивы для гель-электрофореза фярмы "Reanal" (Венгрия), для обраценнофазовой ВЭЯХ фирмы "Ыегок" (Германия), Все остальные реагенты - продагные препараты квалификации "х.ч." или "ч.д.а." обьедпнения "Реахим".

pH всех растворов измеряли на приборе "Radioneter ТТТ-1" (Дания). Оптическую плотность и УФ-спектры снимали на саморегистрирующем спектрофотометре Ultrospeo Plus (Pharmacia, Швеция) Спектры кругового дихроизма снимали на спектрополяримвтре Jasoo 500C (Япония). Прибор калибровали при помощи D-io-какфэрсульфоновой кислоты.

Высоко эффективную жидкостную хроматографию проводили на приборе Du Pont модель 8800 (США), снабаэнном УФ- спектрофотомвтри-ческпм детектором с проточной кюветой (длина волны 220 км), используя колонки Zorbai ODS, С-8, с-2. Для элшрования использовали линейный градиент этанола или ацетонитрила (0-30 %) в 0,15 % растворе трифгоруксусной кислоты. Скорость потока подвижной фазы во всех экспериментах равнялась 1 мл/мин. Количественную обработку хроматограмм проводили на интеграторе SP 4100 '(Spectra Physics, США).

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в приборе Reanal (Венгрия), на бумаге - в приборе Дуррума.

Определение аминокислотного состава проводили на аминокислотном анализаторе Hitaohi 835.

Обработку экспериментальных данных проводили на ЭВУ Robotron sc - 1834 и 1ЕУ ps/2. Применяемые программы были составлены на языках программирования Фортран и Бейсик.Для рандомизации экспериментов при фзкторном планировании использовали генератор слу-заЗных чисел ЭВМ IBM PS/2.

Определение протаминов методом спектрополяриметрии кругового дихроизма (КД).

На рис.1 представлен спектр КД водного раствора исследуемог протамина при 20 °С и рН=7, обладающий всеми особенностями, ко торые присуща спектрам КД протаминов рыб и представляющий собо спектр КД конфэрмации левой спирали (структура тип поли-Ь-пролина II).

[91__183-10*

3 3

гьо

-6 -6 Чг /1

-и • -12 Дз// ■

Рис.1. Спектр КД протамина Рис.2. Спектры КД протамина

В 1^0, t 20°С, рН 7,0. В Н^О, t 20°С, ЦИфрЫ У КрИ-

вых - значения рН.

Эта конформация характеризуется интенсивной отрицательной полосой с минимумом при 196 нм, обусловленным тс-к*переходом и слабой положительной полосой с максимумом при 218 нм, связанной либо с Х1-1С либо с и-и:*переходом пептидного хромофора. Из анализе литературных данных следует, что данная конформация сохраняется довольно широком диапазоне условий ( рН, температура, влияние ис нов нейтральных солей), что свидетельствует об отсутствии в прс таминах структур, отличных от конформации поли-Ь-пролина II. Крс ме того, поскольку протамины не содержат ни одной из аминокислот, боковые группы которых могут обладать собственной оптическс

активностью, КД этих белков в области 190-250 нм определяется только конформацией пептидного остова их молекул.

Проведенные ранее эксперименты показали существенную зависимость оптического вращения протамина от длины волны, рН, температуры и присутствия в растворе ионов некоторых нейтральных солей. 1одбор оптимальных условий для аналитического использования спектроскопии КД требовал исследования влияния этих факторов на спектры КД протамина.

Выбор оптимальных условий определения протаминов методом спектрополяриметрии кругового дихроизма.

Выбор длины волны.

Для определения оптимального для анализа спектрального интер ¡ала нами измерены спектры КД водного раствора протамина в об-1эсти рН 3 - 12 - рис.2. Спектры КД протамина характеризуются шумя экстремумами: узким интенсивным отрицательным при 196 нм и шроким менее интенсивным положительным при 220 нм; при рН 7 :е]196 = -13310 и ге]220= 1750. Для дальнейших исследований нами !ыл выбран коротковолновый экстремум ввиду того, что он специфи-ген для протаминов, а также вследствие достаточно большого абсо-потного значения эллиптичности.

Влияние рН на спектры КД протамина.

Влияние рН на спектры КД протамина было изучено в интервале и 3 до 12 при неизменной концентрации протамина и температуре :0°С. - рис.2. Как видно, при вариации рЦ от 3 до 12 левоспираль-[ая конформация протамина не изменяется - сохраняется интенсивная 1трицательная полоса при 196 нм и слабая положительная при 218 и.

На рис.3 представлена зависимость молекулярной эллиптичности теллкна при 196 нм от рН. Как видно из рис.3, на кривой завис« гости наблюдается 3 участка : на участках 1 и 3 происходит рвольно заметное изменение эллиптичности- первое при рН < 4 - этот качок рН соответствует области титрования С-концевой карбоксиль-

ной группы белка, и второе - при 7 < рН > 10 - эта область, соответствующая титрованию ы-концевой аминогруппы. Полученные результаты не противоречат литературным данным. Известно, что для протаминов величины рК ( - СООН) и рК(- Шд) находятся в пределах 2.9 - 3.3 и 7.4 - 8.2 соответственно. Оптимальной областы постоянной и высокой эллиптичности, как видно из рис.3, являете* интервал рН 5 - 7, который и был выбран для последующих измерений.

1961

■Ю

-}

> п

I У,

• \ Ж

/ //

//

» « ~х ж * 1 *

[еЬб-кг

Ю

Рис.3. Зависимость £6]156 протамина от значения рН.

Рис.4. Зависимость (б^дб протамина от температуры

Влияние температуры на спектр КД протамина.

Нами Шли изучены спектры кругового дихроизма протамина п] различных температурах. На рис.4 представлена зависимом! молекулярной эллиптичности протамина при 196 нм от температуры. Мозно видеть, что в достаточно широком температурном интервале • 10-30°С значение [6]196 остается постоянным. Наиболее замета изменение эллиптичности наблюдается лишь при достаточно низкой 3°С и высокой - 75°С температурах. Следует отметить, что измен ние амплитуды спэктров КД, наблюдаемое при этих температурах, происходит в пределах левоспиральной конформации. Таким образ

проведение дальнейших экспериментов по исследованию возможности применения спектроскопии КД в аналитических целях ограничивалось температурным штервалом 10- 30°С.

Влияние ионов нейтральных солей на спектры КД протамина.

Как следует из анализа литературных данных, присутствие в растворе солей НаР, Ifa2S04 и СаС12 в концентрации до IM мало влияет на параметры конформации поли-ь-пролкна II в протаминах при различных значениях pH и температуры. В нашем случае необхо-цимо было изучить влияние NaCl на спектры КД протамина, поскольку фармацевтические препараты протаминов содержат изотонический раствор (0.15 % Nací). В результате экспериментов нами было установлено, что присутствие в растворе этой соли в концентрации до IM не влияет па спектр КД стеллина при различных значениях pli и гешературы.

Таким образом, полученные результаты показывают, что в исследованном наш методом КД протамине в широком интервале условий эсуществляется конформация вытянутой левой спирали типа юли-Ь-пролина II. Установлено, что при следующих условиях: pH -5-7, t - 10-35°С, присутствие NaCl до IM в спектрах КД исследуемого протамина в области коротковолнового экстремума при 196 зм наблюдается постоянное значение эллиптичности. Эти условия быта выбрани нами для аналитического применения хирально-оптичес-шх свойств протамина. Была получена градулровочная характеристика определения протамина с помощью спектрополяриметрии КД, обра-Зотанная методом регрессионного анализа с использованием ЭВМ Robotron ЕС 1834. В интервале концентраций протамина от 5 до 100 жг/мл наблюдается прямолинейная зависимость в19б - í(cnp0T), что юзволнло найтп уравнение градуировочного графика, имещее вид:

у = 0,0026 x + 0,0014

Трэдел обнаружения, рассчитанный по за- критерию с доверительной ззроятностья Р = 0,95, составил 0,20 мкг/мл. Оценку воспроизводимости результатов определения протаминов методом КД проводили в тайденных оптимальных условиях. Расчет показал, что воспроизво-

дикость определения протгмина в интервале его концетраций от 5 дс 100 мкг/мл характеризуется относительным стандартным отклонение!» от 0,0940 до 0,0016..

Предложенный метод определения проташнов по чувствительнося и пределу обнаружения не уступает описанным в литературе, отличается простотой, экспрессностью выполнения анализа (время анализа - 20 минут), документальностью и исключает использование дорогостоящих и токсичных реактивов. Метод можно рекомендовать да экспрессного анализа препаратов протаминов в фармакологически: лабораториях и клинической практике.

Метода определения ковалентного соединения протамина из гонад Дс1рвпзег зЬвИагиз - стеллина В с противоопухолевым антибиотико! рубомицнном.

Как отмечалось ранее, одной из основных проблем, стоящих н; пути исследования и широкого применения в медицинской практике этих перспективных соединений является отсутствие методов их ко личественного определения. Особенно остро проблема количествен ного определения соединений протаминов с противоопухолевыми анти биотиками, в частности, соединения стеллин В - рубомицин встает . процессе их синтеза, когда необходим контроль чистоты препарат на определенных стадиях. Сложность состоит в следующем. Получае мый препарат подвергается многоступенчатой очистке, которая в не которых случаях происходит не совсем эффективно. Кроме того вследствие лабильности связей между белком и антибиотиком, с те чешем времени возможна деструкция соединения стеллин В - рубоми цин ([Б1;-йиЫ):

О

II

о

[51- М

-таким образом, в лекарственном препарате, кроме соединения стел-лш В - рубомицин, может присутствовать некоторое количество свободного антибиотика и свободного белка, в то время как исследователю необходимо точно знать содержание в препарате именно [3-ь-1?иь]. В этом случае метода, не предусматривающие разделения этих соединений оказываются непригодными.

Первым этапом нашей работы явился выбор метода, который можно было бы использовать для количественного определения этих соединений, поскольку подобные данные в литературе отсутствовали.

Первоначально была предпринята попытка использовать для этой цели тонкослойную хроматографию. Однако, несмотря на то, что этот метод широко применяется для определения антибиотиков, он не позволил провести удовлетворительного разделения исследуемого препарата. Лучшее разделение было достигнуто с помощью вксокоэф- -фективной жидкостной хроматографии, но условий, гарантирующих количественное определение ковалентного соединения рубомицина со стеллином В подобрать не удалось из-за необратимого связывания части исследуемого соединения с матрицами сорбентов. В дальнейшем мы решили принять во внимание следующие обстоятельства. Модификация стеллина В рубсмицином происходит по -нн2 -концевым грушам белка, что приводит к снижению заряда всей молекулы. Таким образом, молекулы ковалентного соединения стеллин В -рубомицин, свободного рубомицина и свободного белка имеют различные заряды, что дает основание применить для их разделения метод электрофореза.

Вначале мы предприняли попытку разделения исследуемых соединений в полиакриламидном геле. В 15 % ПААГ полного отделения [51;-КиЬ] от свободного антибиотика достичь не удалось: рагунтче полосы антибиотика мешали идентификации соединений. Лучшего разделения удалось добиться в более сшитом - 30 % геле. Однако, тод нельзя рекомендовать для рутинных анализов в клинической и исследовательской практике, вследствие трудностей экспериментального характера - яспользующиися для разделения 30 % гель при извлечении из трубок крошится. Кроме того, метод трудоемок и длителен.

На основании предварительных экспериментов нами было решено применить для разделения препарата соединения стеллин В - ругсуи-

цен катод электрофореза на бумаге и показать возшхаюсть его применения для последующего определения этого соединения.

Спектрофотометрический метод определения ковалентного соединения стеллина В с рубомициноы с предварительным разделением электрофорезом на бумаге.

Вначале нами были проведены эксперименты по электрофоретичес-кому разделению исследуемых соединений в условиях, обычно использующихся для небольших белков. В ходе исследования наш было установлено неоднозначное влияние различных факторов на процесс электрофорэтического разделения препарата. Достигнуть эффективного разделения простым перебором условий процесса оказалось сложным. Отсутствие литературных даншп: по методам разделения и определения исследуемого препарата, кзудавшиеся попытки разделить его с помощью методов ВЭКХ и ТСХ, неоднозначное влияние различных фактсроз на процесс его элэктрофоретического разделения, привели нас к мысли об оптимизации этого процесса.

Целью оптимизации явилось определение условий, позволящсх достигнуть эффективного разделения исследуемых соединений, достаточного для их последующего количественного определения за приемлемое время. Было решено использовать метод факторного планирования эксперимента. Аргументами в пользу применения факторного планирования эксперимента служило то, что этот метод позволяет провести более детальный анализ влияеия различных факторов на происходящий процесс и избегать сложностей поиска глобального оптимума, возникающих, например, в случае использования симплекс-метода.

Оппшизация условий электрофорэтического разделения препарата ковалентного соединэния стеллина В с ру-

бОШЦИЕО.М.

Как показали предварительные эксперименты, факторами, наиболее влиящпми на процесс являлтся напряжение, значение рН буферной системы и время элэктрофоретического разделения, которнэ к была выбраны в качестве параметров оптсаизаци::.

функция электрофоретического отклика.

Параметр оптимизации в электрофоретическом разделении должен оценить качество разделения и вид электрофореграшы - т.е. является обобщенным параметром. Кроме того, он должен оценивать качество разделения непосредственно из того набора данных, который регистрируется в ЭВМ. Целесообразно было выбрать в качестве критерия разрешения двух соединений ( [З-Ь-йиЬ] и свободный рубомицин) величину:

И® - 2 И^ъ (2)

где: - расстояние от точки нанесения до ценра пятйа

[з^йцЫ ;

1*2 - расстояние от точки нанесения до центра пятна рубошщина ;

я и2 - размеры электрофоретических пятен [Э1;-КиЪ] и свободного рубомицина - рис.5

-ь

Предполагалась возможность построения математической модели в виде полинома второй степени:

еяр = Ь0 + Ьль2х2 + ьэх3 + + Ь13х1х3 + ^э^^з +

+ ь^^х, + ¿»зг^^ + ьъуЧЧ

где: енр - функция электрофоретического отклика; X, - значение рН буферной системы;

- время разделения, час; х^ - напряжение, вольт;

Эксперименты реализовали в соответствии с планом второго порядка, содерзедза 15 экспериментальных точек в области варьирования 3 переменных. Экспериментальные значения фуекции электрофо-рэтического отклика рассчитывали по формуле (2). На основании полученных данных по методу наименьших квадратов была построена мо-

дель вида:

ЁН? = 5,019 - 9,088рН + 0,670т + 0,03би - О.ОЗЗрНХ + 0,00020рни--0,0025Ти + 1,8394(рН)2- 1,117т2 - 0.000062Ц2 (5)

которая адекватно ошсывала экспериментальные данные. Проверка адекватности модели проводилась по критерию Яшгера. Значимость коэффициентов в уравнении регрессии проверяли по критерию Стью-дента. На рис.6 приведена графическая интерпретация полученной модели при % = 1,5 часа. Анализ модели показал, что большее влияние на эффективность разделения исследуемого препарата оказывает значение рН буферной системы. Для нахождения оптимальных условий использовали метод координатных сеток. Было установлено, что наиболее эффективного разделения препарата удается достичь при следующих условиях: рН буферной системы -1,9, напряжение - 310 В, время разделения 2 часа.

Рис.5. Электрофореграмма Рис.6. Зависимость функции

препарата соединения электрофоретического от-

tst-Rub]. клика ERP от значения pH и

напряжения; % = 1,5 час.

Следует отметить, что найденные оптимальные условия позволяют достичь отделения [St-Rub] как от свободного рубомицина, так и от свободного протамина - рис.5.

После проведения электрофореза в найденных оптимальных усло-

виях пятна с ь1 (соответствующие соединению стеллин В - рубомицин) вырезали, элшровали 2 мл 1 М уксусной кислоты и подтверждали строение соединения стеллин В - рубомицин методом аминокислотного анализа. Для идентификации свободного рубомицина электофорети -чес:сие пятна с вырезали, элюировали 2 мл 1 М уксусной кислоты, отбирали аликвоту 20 мкл и вводили в хроматограф. Свободный стеллин определяли, проявляя электрофореграммы нингидрином и реактивом Сакагуши. Были также записаны УФ-спектры соединения стеллина В с рубомицином и определен его максимум : \ = 495 нм. Из данных УФ-спектра был определен коэффициент экстинкции соединения tst-Rub] : = 9700 см~'моль .

Исходя из данных аминокислотного анализа и УФ-спектров нами было определено соотношение стеллин В : рубомицин в исследуемом соединении. Оно оказалось равным 1:1, что позволило подтвердить высокую степень чистоты исследуемого препарата (теоретическое соотношение стеллин В : рубомицин -1:1).

Для определения содержания ковалентного соединения стеллина в с рубомицином была получена градуировочная характеристика ' обработанная методом регрессионного анализа на эвм ibm ps/2. в интервале содержания вышеуказанного соединения от 50 до 300 мкг наблюдается прямолинейная зависимость а495 = f (Cg^j^), что позволило найти уравнение градуировочного трафика, имеющее вид:

Y = 0,00149 X + 0,021

Величина предела обнаружения, рассчитанная по за - критерию с доверительной вероятностью Р = 0,95 составила 21,2 мкг/мл. Воспроизводимость результатов определения соединения стеллин В - рубомицин предлагаемым методом характеризуется относительным стандартным отклонением от 0,05 до 0,11 в интервале содержания вышеуказанного соединения от 50 до 300 мкг.

Предлогенный метод отличается простотой оборудования и методики проведения эксперимента, возможностью проведения анализа нескольких проб в ходе одного определения, характеризуется хорошей чувствительностью, воспроизводимостью и может быть рекомендован для определения соединения стеллин В - рубомицин в исследовательских лабораториях и клинической практике.

Использование определения протаминов методом спектрополяриметрш КД в анализе.

Коммерческие фармацевтические препараты протаминов представляют собой их 1* раствор в воде, содержащей 0,15 % раствор хлорида натрия, который обычно расфасовывается в ампулы объемом 5 мл. Как следует из практики работы с этими препаратами, их концентрация не всегда бывает точной. Зачастую неточное приготовление растворов протамина связано с проведением процесса приготовления на совмещенных технологических схемах - что характерно для заводов, имеющих большую номенклатуру лекарственных средств. Кроме того, причиной могут являться ошибки, возникающие при приготовлении раствора в промышленных условиях - поскольку этот раствор готовится на больше обьекы (порядка 10 л), после чего подвергается расфасовке. Во-вторых, очень часто протамин бывает недостаточно обессолен, а поскольку раствор готовится по навеске порошка протамина, количество собственно белка в таком препарате занижено.

Таким образом, необходимым этапом в клинической практике является быстрое и точное определение содержания протамина в коммерческом препарате перед его применением. Кроме того, возникает необходимость контроля содержания протамина в индивидуальной дозе препарата, предназначенной для введения в организм пациента. Этот момент является очень важным, поскольку неточное определение про-тааина в индивидуальной дозе приводит к передозировке или недостатку протамина в крови больного, результатом чего являются тяжелые осложнения вплоть до летального исхода. Известные химические и физико-химические методы определения протаминов оказываются неудачными для клинической практики ввиду низкой чувствительности , длительности проведения анализа и необходимости в высокой квалификации обслуживающего персонала. Поэтому одной из основных зада* аналитической химии в фармакологии и клинической практике является поиск новых и совершенствование существующих методов анализе для создания наиболее экспрессной и простой системы контроля содержания протаминов в индивидуальных дозах и определения протаминов в коммерческих фармацевтических препаратах.

Одним из наиболее перспективных методов анализа в фармакологии и клинической практике является спектрополярэлэтрия кругово-

го дихроизма. Это универсальный и экономичный метод, характера зущиЗся высокой зкспрессностью, хорошей точностью результатов -анализа, документальностью. В зарубежных фармакопеях метод спектрополяриметрии КД включен во многие частные фармакопейные статьи. Цроведенные в настоящей работе исследования кругового дихроизма протаминов показали возможность применения спектрополяриметрии КД для определения протаминов в фармацевтических препаратах и индивидуальных дозах. Предел обнаружения протамина составил 0,20 мкг/мл. Полученные результаты были положены в основу разработки методики определения протаминов в фармацевтических препаратах методом спектрополярииерии КД.

Нами было проведено определение протаминов в коммерческих фармацевтических препаратах предоставленных Государственным НИИ по стандартизации и контролю лекарственных средств.

Методика определения протамина с помощью спектрополяриметрии КД в коммерческих фармацевтических препаратах.

Определение протамина в коммерческих фармацевтических препаратах проводили после предварительного определения рН раствора. рН растворов всех исследуемых коммерческих препаратов находилось в пределах интервала 6,70-7,00 - оптимального для определения протаминов методом КД. Пробы коммерческого препарата протамина обьемом 25,00 цл переносили в пробирки и доводили до 5 мл 0,15 % раствором хлорида натрия. Затем 1,00 мл пробы помещали в термостатированную кварцевую кювету и снимали спектры КД на спектропо-ляриметре Jasco 500C в области 190-200 ни. Концентрацию протамина находили по предварительно построенному градуировочному графику. Результаты анализа приведены в табл.1. Как следует из данных табл.1 концентрация препаратов производства Бакинского завода эндокринных препаратов и Хабаровского химфармзавода отличается от однопроцентной, что может быть связано, как отмечалось ранее, с проведением процесса приготовления препаратов на совмещенных технологических схемах и с неполным обессоливанием протамина. Очевидно, данное обстоятельство является одной из причин, вследствие которых осложнения после проведения операций с использованием отечественных препаратов возникают гораздо чаще, нежели при при-

мененш импортируемых.

Результаты определения протаминов методом спектропо-ляриметрии КД в коммерческих фармацевтических препаратах.

Таблица 1,

Завод-изготовитель

Содержание по паспорту,%

п + s»

прот,-

S,

Хабаровский

х/ф завод, 1,00

серия С-40981

Хабаровский

х/ф завод, 1,00

серия С-45323

"Galenloa"

Югославия 1,00

Бакинский завод эндокринных преп. 1,00 серия С-050577

Бакинский завод эндокринных преп. 1,00 серия С-010777

"Serva"

Германия 1,00

49,2 + 0,6 * 0,98

52,7 + 0,6 * 1,05

49,6 + 0,8 * 0,99

48,0 + 0,7 * 0,96

48,2 + 0,8 * 0,96

50,0 + 0,5 * 1,00

0,01 0,01 0,01 0,01

0,01 0,01

* - содержание протамина в препарате, Ж.

Правильность полученных результатов подтверждена проведением анализа по методу "введено-найдено" и сравнением с данными высокоэффективной жидкостной хроматографии - таблица 2. Статистическая обработка и оценка правильности результатов по критериям Фишера и Стыодента показали, что методы спектрополяриметрш КД и ВЭНХ не обнаруживает значимых различий в дисперсиях и средних значениях, т.е. обладают сравнительно одинаковой воспроизводимостью.

Таблица 2.

Рассчитанные значения Р и % при сравнении воспроизводимости и средних значений содержания протамина в коммерческих фармацевтических препаратах, полученных методами КД и ВЭЯХ. (п = 5; Р = 0,95)

Завод - И [Я ВЭЯХ S? + S¡ 2

изготовитель X $ X | S2 2 t

Хабаровский х/ф завод, серия С40981 49,17 0,34 49,12 0,71 0,52 0,12

Хабаровский х/ф завод, серия С45323 52,66 0,31 52,68 0,66 0,49 0,05

"Oalenioa" Югославия 49,62 0,44 49,30 0,63 0,54 0,76

Бакинский з/д эндокр.препар. серия С050577 48,00 0,35 48,12 0,53 0,44 0,31

Бакинский з/д эвдокр.препар. серия COI 0777 48,15 0,50 48,12 0,72 0,61 0,07

"Serva" Германия 50,00 0,19 49,94 0,61 0,40 0,16

S2 0,36 0,64

ррасч. Ртабл>(24,24) 1,78 1,98

Однако, при сравнении метода определения протаминов с помощью ВЭЖХ с предлагаемым в данной работе методом спектроголяриметрии КД следует отметить ряд преимуществ последнего. Применение спектроголяриметрии КД позволяет повысить чувствительность определения засчет измерений эллиптичности в более длинных кюветах (100-200 мм). Кроме того, определение протаминов методом ВЭЯХ в каждом случае требует «нательного подбора условий процесса и использования дорогостоящих реактивов и сорбентов, в то время как спектро-поляриметрия КД является простым, экспрессным, менее дорогим, до-

кукентальным и поэтому сзолее перспективным методом для определения протаминов в клинической практике.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод определения протаминов в коммерческих фармацевтических препаратах с помощью спектрополяриметрш КД; найдены оптимальные условия определения. Предел обнаружения составил 0,20 мкг/мл. Воспроизводимость* результатов характеризуется относительным стандартным отклонением от 0,2 до 9,0 % при содержании протамина в образце от 5 до 100 мкг/мл.

2. Предложенный метод определения протаминов использован при анализе препаратов протаминов, использующихся в отечественной медицинской практике при проведении экстракорпоральной гемо-перфузии. Правильность полученных результатов подтверждена проведением анализа по методу "введено-найдено" и сравнением с данными высокоэффективной жидкостной хроматографш. Статистическая обработка и оценка правильности результатов анализа по критериям Фишера и Стыодента показали отсутствие значимых различий и систематической ошибки. Преимуществами предлагаемого метода являются экспрессность (время анализа порядка 20 минут), возможность многократного проведения анализа одной и той £8 пробы, простота в обращении. Метод исключает использование дорогостоящих и токсичных реактивов.

3. Методом факторного планирования эксперимента проведена оптимизация условий электрофоретического разделения препарата на основе коваленткого соединения протамина из гонад яо1рвпзвг згвИагиз - стеллина В с противоопухолевым антибиотиком ру-бомицином.

4. Найденные оптимальные условия влектрофоретического разделения препарата на основе ковалентного соединения протамина из гонад ло1реп5вг вгвИаЬиз - стеллина В с противоопухолевым антибиотиком рубомицином и подтЕериденке правильности его идентификации на электрофорегракме положены в основу разработанного наш спектрофотометрического метода определения ковалентного соединения стеллина В с рубомицином в лекарственных препаратах с пределом обнаружения 21,2 мкг/мл. Воспроизводимость ре-

зультатов характеризуется относительным стандартным отклонением от 5,0 до 11,0 % при содержании вышеуказанного соединения от 50 до 300 мкг.

5. Разработанный метод позволил определить состав ковалентного соединения стеллина В с рубомицином - 1:1, что свидетельствует об эффективности предлагаемого способа предварительного разделения исследуемого препарата.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Rybln V.K., Kozlova N.V., Makarov N.V. Conformational studies of Individual and modified protamines from Acipensar stellar tus.// In Theslses of 8th Intern. Conference of Young Scientists on Organic and Bloorg. Chemistry. Riga, 1991« p.239.

2. Козлова H.B., Рыбин В.К., Григорова Л.В., Макаров Н.В. Определение продуктов модификации протаминов с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. // Матер. Всесовзн. конференции "Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности" - Краснодар, 1991, с.43

3. N.V. Makarov, N.V.Kozlova and V.K.Rybln Isolation of sturgeon protamines by 7PLC // In Theslses of 1st European Symposium on yPLC of Blomoleoules. Strasbourg, Trance, 1992, p.81.

1. N.V. Makarov, N.V.Kozlova, I.O.Smirnova, V.K.Rybln Optimization of RP НРЬС separation of modified protamines from Ac I- ' рвпзвг stellatus // In Theslses of 12th Intemat. Symposium on EPIC of Proteins and Polynucleotides. Sydney. Australia, 1992, p.39.

i. Козлова H.B., Рыбин B.K., Макаров Н.В. Определение продуктов модификации протаминов антибиотиками // Новые методы контроля технологических процессов и качества пищевых продуктов: Сборник научн. трудов / РАСХН. Сиб. отделение. СибНИПТШ. - Новосибирск, 1992. - с.41-43.

|. Рыбин В.К., Козлова Н.В., Макаров Н.В. Определение ковалентного соединения рубомицина со стеллитом В методом электрофореза на бумаге. // X. аналнт. химии, 1993, т. 48, вып. 8

(в печати)

Заказ 92

Тираж 100

Формат 60x84/16 — 1,25 пл. —1,3 уч.-издл.

Предприятие "Полиграфсервис'

109316, г. Москва, ул.Талалихина, 26