Модификация углеводной части противоопухолевых антибиотиков антрациклиновой группы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ТЕВЯШОВА АННА НИКОЛАЕВНА

МОДИФИКАЦИЯ УГЛЕВОДНОЙ ЧАСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АНТИБИОТИКОВ АНТРАЦИКЛИНОВОЙ ГРУППЫ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА, 2005

Работа выполнена в научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор химических наук Олсуфьева Евгения Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Бакиновский Леон Владимирович

доктор химических наук, профессор Юркевич Александр Морисович

Ведущая организация. НИИ физико-химической биологии

им. А.Н Белозерского МГУ им. М.В Ломоносова

Защита состоится «27» июня 2005 г в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212 120 01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им М В Ломоносова по адресу. 119571, Москва, пр Вернадского, д 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им М В Ломоносова

Автореферат разослан « » АХОЗч. 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник а , Лютик А И

Д ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Антрациклиновые антибиотики даунорубицин и доксорубиции широко применяются в современной химиотерапии опухолевых заболеваний человека. Однако антрациклины имеют ряд недостатков, основным из которых является кардиотоксичность. Кроме того, антрациклиновые антибиотики обладают высокой кумулятивной токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью, миело- и иммунодепрессивным действием. Другой важной проблемой является устойчивость опухолевых клеток к применяемым препаратам, в том числе по механизму множественной лекарственной устойчивости. Особого внимания заслуживает оригинальный отечественный антибиотик антрациклииовой группы - карминомицин Этот антибиотик в 70-е годы был открыт в НИИ по изысканию новых антибиотиков АМН СССР и внедрен в практику отечественного здравоохранения. Карминомицин рекомендован для лечения сарком мягких тканей, острых лейкозов и некоторых форм злокачественных опухолей. Его отличает от других антрашшшнов меньшая кардиотоксичность, способность тормозить рост опухолей, устойчивых к доксорубицину и способность всасыва1ься через желудочно-кишечный тракт. В начале 90-х годов по ряду экономических причин производство карминомицина было прекращено. Возобновление производства карминомицина, ценного для практической медицины средства, а также химическая модификация антрациклиновых антибиотиков, направленная на поиск препаратов с улучшенными химиотерапевтическими свойствами, активных в отношении опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью, является актуальной задачей биоорганической и медицинской химии. Работа была выполнена в рамках темы института № 009 "Направленный синтез препаратов нового поколения на основе антибиотиков и других природных соединений, воздействующих на опухолевые и бактериальные клетки с различным типом резистентности к существующим лекарственным средствам".

Цель работы. Целью работы являлась разработка методов синтеза и получение производных антрациклиновых антибиотиков, обладающих преимуществами перед родительскими антибиотиками. Были поставлены задачи: 1) разработать метод препаративного получения карминомицина исходя из даунорубицина; 2) разработать метод и получите новые производные антрациклинов с квадратной кислотой; 3) разработать метод введения по З'-аминогруппе остатка даунозамина гидрофильных фармакофорных групп, а также остатка D-галактозы, присоединенных к З'-аминогруппе остатка даунозамина через гидрофильный или гидрофобный спейсер; 4) разработать метод получения водорастворимых конъюгатов доксорубицина с высокомолекулярным полисахаридом галатоманнаном; 5) для полученных соединений изучить закономерности в опытах in vitro и in vivo.

:?доеу]ИОДф01*МЫЗ«№евая активность БИБЛИОТЕКА |

C.n»rtpJ«nr tm I

09 mo?

II - т

Научная новизна. Разработан новый способ препаративного получения карминомицина исходя из даунорубицина. Получены новые производные - амиды даунорубицина, доксорубицина и карминомицина с квадратной кислотой различного строения Разработан новый метод введения в молекулу антрациклинового антибиотика моно- и дисахаридов реакцией восстановительного алкилирования З'-аминогруппы остатка даунозамина. Впервые получены З'-Ы-алкильные производные антрациклиновых антибиотиков разных типов, среди которых некоторые обладали преимуществами перед родительскими антибиотиками в опытах in vivo. Разработан метод и впервые осуществлен синтез новых водорастворимых депо-форм доксорубицина - конъюгатов с высокомолекулярным полисахаридом галаетоманнаном, отличающихся нагрузкой антибиотика, а также способом его присоединения к галактоманнану.

Практическая ценность работы. Разработанный метод препаративного получения карминомицина рекомендован для реализации в промышленности. Получено и охарактеризовано 35 новых производных Для ряда новых производных антрациклиновых антибиотиков проведены предклинические испытания Показано, что некоторые из синтезированных соединений - 3'-М-(-а-0-галактопиранозил-(1—►6)-0-П-1-дезоксиглюцит-1-ил)доксорубицин и З'-N-ÍD-I -дезоксигалактит-1 -ил)-14-гидроксикарминомицин обладают преимуществами перед исходными антибиотиками и перспективны для дальнейшего изучения в клинике Отработана и осуществлена в препаративном масштабе методика синтеза 3'-М-(-а-0-галактопиранозил-П—»б^О-О-^дезоксиглюцит-Ьил^оксорубицина.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации было опубликовано 12 печатных работ, в том числе, получен 1 патент на изобретение "Способ получения антибиотика карминомицина или его гидрохлорида" № 2004105794 от 27.02.04 Результаты работы были представлены на Конференции молодых ученых института (НИИНА им. Г.Ф.Гаузе РАМН, 2002) (работе присуждена вторая премия), на 8ой Международной конференции по химии антибиотиков и родственных микробных продуктов (ICCA-8, г. Токио, Япония, 2002), на 4-ом Всесоюзном симпозиуме по органическому синтезу "Органическая химия - упадок или возрождение?" (г. Углич, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты" (с. Московский, 2004), на 22-°" Международном углеводном симпозиуме (г. Глазго, Великобритания, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты" (с Московский, 2005), на Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (г. Москва, 2005), на Всероссийской научпо-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье" (г. Суздаль, 2005).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на Ло страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений Диссертация содержит 20 рисунков, 23 схем и 9 таблиц РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Разработка метода препаративного синтеза карминомицина. Разработан метод препаративного получения карминомицина (11) исходя из даунорубицина (1) (Схема 1).

На первом этапе были подобраны оптимальные условия гидролиза даунорубицина (1), обеспечивающие количественное образование агликона дауномицинона (2) и даунозамина (3). В предварительных опытах показано, что нагревание 1 в кипящей смеси 0.2 н H2SO4 в МеОН-НгО (1:1) (условия гидролиза противоопухолевого ангибиотика-гликозида -оливомицина до агликона оливина), приводило к количественному образованию агликона (2), однако, даунозамин (3) образовывался с низким выходом. В подобранных оптимальных условиях гидролиз даунорубицина (0.1 н HCl, 37°С, 20 ч) до дауномицинона (2) и даунозамина (3) протекал с выходами 99% и 94%, соответственно. Деметилирование 2 проводили AICI3 в кипящем дихлорэтане. Полученный карминомицинон (4) по своим характеристикам (Rf, 'Н-ЯМР-спектр) полностью соответствовал образцу карминомицинона, полученному кислотным гидролизом биосинтетического карминомицина. Даунозамин (3) реакцией с этиловым эфиром трифторуксусной кислоты превращали в 3-N-трифторацетилдаунозамин (5) (З-ЫЛТА-дауночамин), гидроксильные группы которого далее ацилировали уксусным ангидридом в пиридине с образованием 1,4-;vf-0-auenui-3-N-TF А-даунозамина (7) в виде смеси а и ß изомеров (a:ß = 1:2 по данным 'Н-ЯМР спектроскопии).

Величина КССВ (JiC2a=2.56 Hz) дублета аномерного протона при 6.22 м.д. указывала на а-конфигурацию гликозида, а величины КССВ (Jia2e—2.38 Hz и ¡¡¿¿¿=9.93 Hz) дублета дублета аномерного протона при 5.70 м.д. - на Р-конфш-урацию гликозида. Методом колоночной хроматографии на силикагеле были выделены также индивидуальные а- и Р-изомеры 7. Исходя из даунозамина (3) реакцией с >Г-(9-флуоренилметоксикарбонилокси)сукцинимидом (FmocOSu) и последующим ацетилированием гидроксильных групп действием уксусного ангидрида в пиридине был получен 1,4-ди-0-ацетил-3-М-Ртос-даунозамин (8) в виде смеси аномеров (сл:(3~ 4:1 то данным 'Н-ЯМР спектроскопии). Гликозилирование карминомицинона (4) М-ди-О-ацетил-З-К-ТКА-даунозамином (7) или 1,4-ди-0-ацетил-3-К-Fmoc-даунозамином (а:Р ~ 4:1) (8) проводили в смеси безводных СН2СЬ - диоксан (41) в присутствии триметилсилилтрифторметансульфоната и молекулярных сит 4Á при температуре не выше 10°С Реакция протекала с образованием исключительно природного а-аномера защищенного карминомицина. Полученный защищенный гликозид (9) или (10) деблокировали действием 0 1 н NaOH в смеси MeOH-HiO. Очистку проводили методом кристаллизации после выделения карминомицина в виде гидрохлорида В 'Н-ЯМР-спектре кармипомицина (11) присутствовал однопротонный синглет при 5.82 м д., указывающий на a-конфигурацию гликозида.

Выход карминомицина (11) после деблокирования 9 или 10 составил 25-28% в расчете на даунорубицин (1). Образцы полусинтетического карминомицина (11) по своим физико-химическим (Т.пл., Rp, Ri и [а]о) и спектральным характеристикам (УФ-, ЯМР-спектры) не отличались от стандартного образца карминомицина гидрохлорида, полученного путем биосинтеза (Рис. 1).

а) 'Н-ЯМР спектр природного карминомицина (Py-d5).

/

!

Á„ I М- L-J-_a i л 1. АЛ.

б) 'Н-ЯМР спектр карминомицина, полученного через З'-К-Ртос-даунозамин (Ру-<15).

Рис.1. Сравнение 'Н-ЯМР спектров образцов природного и полусинтетического карминомицина.

Разработанный способ ("общий выход 25-28% в расчете на даунорубицин) позволяет получать карминомицин в граммовых количествах с чистотой более 90% (по данным ВЭЖХ) без использования хроматографии на каждой из стадий синтеза и может быть реализован в промышленном масштабе.

2. Конъюгаты антрациклиновых антибиотиков с квадратной кислотой.

Реакцией даунорубидина (1), карминомицина (11) и доксорубицина (12) с диметиловым эфиром квадратной кислоты (3,4-диметоксициклобут-3-ен-1,2-дион) (13) при рН 7 после хроматографической очистки были получены моноамиды квадратной кислоты с даунорубицином (14), карминомицином (15) и доксорубицином (16) с выходами 63%, 51% и 48%, соответственно (Схема 2) Данные 'Н и вС-ЯМР-спектроскопии приведены в таблице

(^•Яг^СН» Даунорубицин, (1)

^«Н, Яг^СН) Карминомицин, (11) ^■СН* Яг^СНгОН Доксорубицин, (12)

и ч-г^г СНз

15 р^снз

16 я,-сн3, яг-снгон

Схема 2.

антибиотиками.

Синтез моноамидов квадратной кислоты с антрациклиновыми

Таблица 1. Данные 'Н и '3СЯМР спектроскопии для соединений 14-16

Номер атома Группа Соединение

14 (СОС1з) 15 (СБС1з+0М80=10:1) 16 (ОМвО+СОСЬ)

"С ■н С ■н пс 'Н

1 СН 120.23 8.04 119.92 7.75 120.06 7.92

2 СН 136.21 7.80 137.51 7.65 136.41 7.74

3 СН 118.91 7 41 125.17 7.22 119.36 7 39

4 С 161.5 - 162.8 - 161.48 -

4а с 121.8 - 116.31 - 121.06 -

5 с 187.46 - 190.78 - 187.33 -

5а с (111.82)° - (110.67)° - (111.64)° -

6 с (156.16)" - (157.12)" - (165.65)" -

6а с (134.39)3 - (134.75)а - (134.78)" -

6Ь он - (13.29) - 12.81 - 13.20

7 СН 68.68 5.41 68.76 5.20 68 54 5.23

8 сн2 35.33 2.34/2.18 35.69 2.25/2.05 36.25 2.27/2.09

9 с 77.07 - 76.61 - 76.85 -

10 сн2 34.18 3.28/2.98 33.91 3.09/2.96 34.25 3 12/2.98

10а с (134.94)" - (133 65)а - (134.54)3 -

И с (156.62)" - (157.12)" - (155.91)" -

11а с (111.95)с - (111.51)° - (111.76)° -

11Ь он - 14.05 - 13.36 - 13.97

12 с 187.14 - 186.44 - 187.11 -

12а с 135.88 - 137.44 - 135.66 -

13 с 212.02 - 212.07 - 213.98 -

14 СН3(СН2) 25.18 2.45 25.07 2.34 (СН2) 65.45 4.68

15 СНз 57 1 4 10 - - 57.15 3.95

Г СН 99.45 5.61 100.5 5.42 99.83 5.44

2' СН2 31 33 2.04/1.86 1 30.81 2 08/1.72 30.07 2.05/1.67

3' СН 51.06 4.02 51.66 3.89 51.62 3.88

4' СН 70.09 3.78 69 55 3 58 70.05 3 55

5' СН 67.85 4.17 68.2 4.05 68.22 3.40

6' СНз 17.08 1.38 17.38 1.24 17.45 1.22

7' он - 3.52 - N0 - N0

8' ш - 6.83 - N0 - N0

1" с 170.22 - 172.31 - 172.33 -

2" с 190.03 - 189.46 - 189.46 -

3" с 182.99 - 183.66 - 183.63 -

4" с 178.46 - 177.57 - 177.56 -

5" СНз 61.14 4.33 60.66 4.18 60.64 4.16

*■ = возможно обращение отнесения сигналов N0 = не определено

Полученные моноамиды квадратной кислоты с антрациклиновыми антибиотиками 1416 за счет присутствия реакционноспособной метоксигруипы могут быть использованы для присоединения антрациклинов к различным молекулам, содержащим аминогруппы, в том числе, к антителам, иммуноглобулинам и т.д.

Реакцией производных 14 с даунорубицином (1) или 16 с доксорубицином (12) в ЕЮН при значении рН~8.0 были получены соответствующие симметричные диамиды квадрагной кислоты с даунорубицином (17) и доксорубицином (18) (Схема 3). Соединения 17-18 были также получены реакцией двух эквивалентов даунорубицина (1) или доксорубицина (12) с 13 при значении рН реакционной смеси рН~8 0. Реакцией двух эквивалентов 14 или 16 с 1,6-гексаметилендиамином были получены диамиды квадратной кислоты с даунорубицином (19) и доксорубицином (20), в которых остатки антрациклиновых антибиотиков разделены

Схема 3. Синтез диамидов квадратной кислоты с антрациклиновыми антибиотиками.

14 или 16 + h2n

Схема 4. Синтез диамидов квадратной кислоты с антрациклиновыми антибиотиками

Чистота полученных производных 17-20 была изучена методами ТСХ и ВЭЖХ, структура этих соединений подтверждена методами MALDI масс-спектрометрии и'Нл |3С ЯМР-спектроскопии, с использованием метода COSY.

Антипролиферативная активность полученных производных 14-20 была изучена в Университете медицины им. Земмельвейса (г Будапешт, Венгрия) на культуре опухолевых клеток рака молочной железы линии MCF-7 Исследованные соединения обладали

сниженной антипролиферативной активностью (имели более высокие значения Юзд, где 1С5о - концентрация соединения в нг/мл, вызывающая гибель 50% клеток), чем препарат сравнения карминомицин (11) Наибольшую антипролиферагивную активность среди производных 14-20 обнаруживали симметричный амид квадратной кислоты и даунорубицина (17) (ГС50 108 6 нг/мл), а также амид квадратной кислоты и даунорубицина, в котором остатки даунорубицина разделены гексаметиленовым спейсером (19) (1С50 87 нг/мл). Цитотоксичностъ этих производных ниже, чем у карминомицина (1С50 48 28), однако, существенно выше по сравнению с соответствующим моноамидом 14 (ГС^о >300 нг/мл). Более высокую антипролиферативную активность диамидов 17 и 19 по сравнению с моноамидом 14 можно объяснить тем, что механизм действия соединений 17 и 19 основан на бис-интеркаляции.

3. Получение новых производных антрациклиновых антибиотиков З'-Ы-алкильного типа.

Среди З'-М-алкилъных производных антрациклиновых антибиотиков были описаны соединения, обладающие высокой противоопухолевой активностью, однако, соединения такого типа, содержащие по 3'-аминогруппе даунозамина гидрофильный полигидроксилированный фрагмент, ранее не были изучены Цель работы заключалась во введении по З'-аминогруппе остатка даунозамина гидрофильных полигидроксилированных фрагментов, например, остатков глицеринового альдегида, моносахаридов или дисахаридов.

31 Восстановительное алкширование антрациклиновых антибиотиков глицериновым альдегидом.

На первом этапе работы была изучена возможность прямого алкилирования антрациклиновых антибиотиков I лицериновым альдегидом

Реакция карминомицина (11) с небольшим избытком В1.-глиперинового альдегида в присутствии NaBHзCN приводила к образованию 3'-Ы-(2", 3 "-дигидроксипропил)-13-(Я. дигидрокарминомицина (21) (Схема 5)

снгон

Схема 5. Восстановительное алкилирование карминомицина ОЬ-глицериновым альдегидом.

Чтобы избежать восстановления 13-кетогруппы антибиотика в качестве исходных соединений использовались 13-диметилкеталь-14-бромодаунорубицина (22) или 13-диметилкеталь-14-бромокарминомицина (23), полученные соответственно из даунорубицина (1) или карминомицина (11) описанным методом. Соединения 22 или 23 вводили в реакцию восстановительного алкилирования с ОЬ-глицериновым альдегидом. В результате гидролиза промежуточных алкшшрованных 13-диметилкеталя-14-бромодаунорубицина (24а) или 13-диметилкеталя-14-бромокарминомицина (25а) после хроматографической очистки на силанизированном силикагеле были получены соответствующие производные доксорубицина (24) или 14-гидроксикарминомицина (25) в виде смеси трех изомеров (Схема 6).

Я-СН,, Даунорубицкн, (1) 22 ВДН3

11«Н, Кармкномицин, (11) 231Ч=Н

Схема 6. Восстановительное алкилирование 13-диметилкеталя 14-бромодаунорубицина (22) и 13-диметилкеталя-14-бромокарминомицина (23) ОЬ-глицериновым альдегидом.

3.2 Восстановительное алкилирование антрацикпиновых антибиотиков моносахаридами.

Восстановительное алкилирование даунорубицина (1) в присутствии ЫаВНзСЫ моносахаридами О-глюкоюй или В-галактозой приводило к образованию 3'-(1-дезокси-П-глюцит-1 -ил)-13-(Д,8)-дигидродаунорубицина (26) и 3'-( 1 -дезокси-Э-галактит-1 -ил)-13-(Я,Я)-дигидродаунорубицина (27), соответственно (Схема 7).

Сжема 7. Восстановительное алкилирование даунорубицина моносахаридами О-глюкозой и О-галатозой.

Чтобы избежать восстановления П-кетогруппы антибиотика, в качестве исходных соединений использовались ]3-диметилкеталь-14-бромодаунорубицина (22) или 13-диметилкеталь-14-бромокарминомицина (23) и Б-глюкоза или Э-галактоза.

Схема 8. Восстановительное алкилирование 13-диметилкеталя 14-бромодаунорубицина (22) и 13-диметилкеталя-14-бромокарминомицина (23) моносахаридами.

После гидролиза промежуточных алкилированных 13-диметилкеталей-14-бромодаунорубицина (28а, 29а) или 13-диметилкеталя-14-бромокарминомицина (30а) были выделены соответствующие производные доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина: 3'-N-(0-1 -дезоксиглюцит-1 -ил)доксорубицин (28), 3'-К-(П-1 -дезоксигалактит-1 -

ил)доксорубицин (29) и З'-Ы-ф-1 -дезоксигалактит-1 -ил)-14-гидроксикарминомицин (30) (Схема 8).

Интересно отметить, что в случае использования моносахаридов в реакции восстановительного алкилироваяия происходило образование соответствующих моноалкильных производных 28-30, в то же время алкилирование ОЬ-глицериновым альдегидом в аналогичных условиях приводило к соответствующим диалкильным производным 24, 25. Вероятно, это можно объяснить большей активностью альдегидной группы в ОЬ-глицериновом альдегиде по сравнению с альдегидной группой в О-глкжозе и О-галактозе или меньшим объемом вводимого заместителя в случае ОЬ-глицеринового альдегида.

3.3 Синтез конъюгатов антрациклиновых антибиотиков с й-галактозой

Одним из перепет ивных направлений химической модификации антрациклинов является получение конъюгатов с различными углеводами. Одной из целей нашей работы являлся синтез конъюгатов доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина, содержащих остаток О-галакточы, поскольку имеются литературные данные о наличии на опухолевых клетках галектинов - рецепторов к О-галактозе. Это позволяет рассчитывать па повышение избирательности противоопухолевого действия препаратов, содержащих остаток О-галактозы.

Для синтеза конъюгатов доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина с О-галактозой. в которых остаток Э-галактозы присоединен к З'-аминогруппе даунозамина через гидрофильный полигидроксилированный спейсер, использовали реакцию восстановительного алкилирования бром-кеталей 22 и 23 дисахаридами, содержащими остаток О-галактозы - мелибиозой или лактозой. По схеме, аналогичной Схеме 8, были получены соответствующие производные доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина: 3'-К-(-а-0-галактопиранозил-(1 —>6)-0-0-1-дезоксиглюцит-1-ил)доксорубицин (31), 3'-Ы-(-а-0-галактопиранозил-(1—>6)-0-0-1-дезоксиглюцит-1-ил)-14-гидроксикарминомицин (32) и З'-Ы-(-Р-0-галактопиранозил-(1 —>4)-0-0-1 -дезоксиглюцит-1 -ил)доксорубицин (33) (Рис.2)

Рис.2. Конъюгаты доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина с О-галактозой, в которых остаток О-галактозы присоединен через гидрофильный спейсер

Были получены также конъюгаты доксорубицина с О-галактозой, в которых остаток О-галактозы был присоединен к З'-аминогруппе даунозамина через гидрофобный ароматический спейсер. Предварительно реакцией тетра-О-апетил-а-О-галактопиранозилбромида с ванилином или 4-гидроксибензальдегидом были получены 3-метокси-4-0-[(2,3,4,6-тетра-0-ацетил-Р-0-галактопиранозил)окси]беюальдегид (34) и 4-0-[(2,3,4,6-тетра-0-ацетил-(3-П-галактопираночил)окси]бензальлегид (35). Восстановительное алкилирование аминогруппы 13-диметилкеталя-14-бромодаунорубицина (22) соединениями 34 или 35 в присутствии ЫаВНзСК1 приводило к соответствующим алкипьпым производным 13-диметилкеталя-14-бромодаунорубицина (36) или (37) соответственно. После дезацетилирования остатка О-галактозы в присутствии №ОСН3 и кислотного гидролиза промежуточных интермедиатов 38а и 39а были получены целевые 3'-М-[4"-0-([[3-0-галактопиранозил]окси-3"-метокси)бензил]доксорубицин (38) и 3'-1ч-[4"-0-([Р-0-галактопиранозшфкси)бензил]доксорубицин (39) (Схема 9).

О он.

АсО

38 Я=ОСН3

39 Я=Н

Схема 9. Синтез конъюгатов доксорубицина с О-галактозой, в которых остаток О-галактозы присоединен через ароматический спейсер.

Как и в случае алкилирования моносахаридами, использование в реакции восстановительного алкилирования ароматических альдегидов, содержащих остаток О-галактозы, приводило к соответствующим моноалкильным производным, что возможно, связано со стерическими факторами.

Доказательство структуры соединений 21,24-33,38,39 было проведено методами Е81 и МАШ1 масс-спектрометрии и 'Н-ЯМР-спектроскопии (Таблица 2).

Доказательство структуры полученных соединений осуществлено также кислотным гидролизом и сравнением с заведомыми образцами агликонов методом ТСХ. При кипячении в течение 1 ч в 1 н НС1 соединения 21 образуется 13-(Я, 8)-дигидрокарминомициион,

соединений 26, 27 - 13-(Л,5)-дигидродауномицинон, соединений 24, 28, 29, 31, 33, 38, 39 -адриамицинон, а соединений 25,30,32 - 14-гидроксикарминомицинон.

Таблица 2. Данные 'ЯЯМР спектроскопии для соединений 21, 24—33, 38,39.

Номер атома Соединение

21 24' 25" 26 27 28 29 30 31 32 33 38" 39"

А Б Б В В Б Б в В в В В Б

Антрациклиноноеая часть

1 7.91 7 82 7 76 8 08 8 02 7.90 7.87 7 85 8.05 7.81 8 02 7.85 8.05

2 7.62 (2Н), 7 82 7 72 7 78 7 64 7 62 760 7 73 7 61 7 70 7 60 7 72

3 7 34 764 ОН) 7 39 7 40 7.46 790 790 7 29 N0 731 7.39 7 85 7.40

4 3 99 3 98 3.98 3.98 3.97 3.97 3.98 3 97 3 93

7 5.41 5 33 5 03 5 42 5 37 4.95 4 94 5 13 5 45 5 11 5 40 4 93 5 42

3.02, 2.99, 2 86,

8 2 25/ 2 20- 221- 2 26/ 2 22/ 2 15 2.15 2 48/ 2 84/ 2 48/ 2.83/ 2.18/ 2 75/

2.70, 2.42 1 80 1 85 2.60, 2.42 261, 2 35 2 73 2 54 2 74 251 2 15 2 50

3 58, 3 49,

10 3 60/ 3 73- 3 80- 3.22/ 341/ 3.43 3.43 3 47/ 3 58/ 3 49/ 3 56/ 2 97/ 3 52/

3.37 2.50 2.90 3.48, 3.22 3.06, 306 3 35 3 47 3 37 3 43 2 10 3 38

13 4.17 4.10 4.15

14 1.57 460 460 1 65/ 1.63 1 58/ 1 56 4 57 4.57 5 33 5 45, 5.38 5 35 5 45/ 5 39 4.58 5 32

Остаток Ьаунозамина

1' 5 82 544 5 51 5 84 5 82 5 32 5 32 5 55 5 81 5 61 5 78 5 32 5 82

2' 2.58/ 2 00- 221- 2 68/ 2 70/ 1.85/ 1 85/ 2 60 2 72/ 2 67/ 2.43 1 95/ 2 78/

2.45 1 25 1 85 2 63 2.61 1.97 1 97 2 62 2.64 2 05 2 68

3' 4 83 3603.20 3 28 4 25 4 25 3 39 3 39 4.15 4 36 4 19 3 74 3 45 4 12

4' 4 94 3 70 3 80 N0" 4.69 3.55 3.55 4 37 4 54 4 39 4 13 4.12 N0

5' 4 73 4 09 4.18 4.74 4.74 4.16 4 16 4 63 4 72 4.67 4.64 4.17 4.45

6' 1 63 1 14 1 15 1 53/ 1.50 1 52/ 1.50 1 17 1 17 1.40 1 50 1.41 1 47 1 20 148

Полиольная часть

3.92/

1" 4.08 3 603 20 3 302.70 3 91/ 3.72 3 72, ^етп 12.7 2 98/ 2 93 3 03 3.92 4 04/ 3.84 3.85 3 50

2" 4.27 N0 5 405 28 4.92 3 86 3.87 4 92 5 02 4 82 4 66

3" 3 19 4 92 4.92 4.70 4 504.15 3.65 3 63 4 57 4 54 4 54

4" 4.25- 3 09 3 10 4.15 4.63 4.38 464

5" 4 50 3.75 3.85 4.45 4 643.96 4.12 -

6" 4.23 3 39 3 40 4.63 4.59 4.44

Остаток П-галактозы

1"' 5.15 5 37 5 40 5 57 5.30

2" 4 36 4.54 464 3.88 4.65

3"' - 4.52 4 20

4"' 4.643 96 4.124.59 4.44 4.77 4.68

5"' 4.54 4.12 4.18

6"'а 4.36 4.70 4.32

6"Ъ 4 36 4.80 4 28

' Сигналы в спектрах уширены

" Данные 'Н ЯМР для ароматических спейсеров соединений 54 (3-ОМе-4-окси6ензи/1Ьный спейсер) 3 40 (2Н, СН]}, 7 07 ОН, Н-2"), 3 61 (ЗН. ОМе), 5" (N0), 6" (Ий), 38 (4-оксибензильный спейсер) 3 52 (2Н, СНг), 698 (1Н, Н-2"), 7 44 (¡Н, Н-3"), 7 44 (1Н, Н-5 "), 698 (1Н, Н-6")

А Ру-<1,,Е ЬШО-йьВ Ру-^+СТ]СООО, ЫО не определено

3 4 Изучение антипролиферативной активности полученных производных Изучение антипролиферативной активности производных доксорубицина 31, 33, 38, 39 на культуре опухолевых клеток мышиного лейкоза L1210 проводилось в Институте Pera Католического университета (г Лёвен, Бельгия) Было показано, что эти соединения обладают цитотоксичностью на два порядка меньшей, чем доксорубицин Например, для соединения 31 IC50 составляет 21 цМ, для соединения 33 IC50 составляет 24 цМ, в то время как для доксорубицина 1С5о - 0 213 цМ.

Изучение антипролиферативной активности производных доксорубицина 24, 29, 14-гидроксикарминомицина 25, 30, 32 и 13-(Д,8)-дигидрокарминомицина 21 в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток линии рака молочной железы (MCF-7h MCF-7Dox соответственно) и лейкоза (К562 и K562Í/S9 соответственно) в сравнении с карминомицином (11), 14-гидроксикарминомицином и доксорубицином (12) проводили также в НИИ канцерогенеза ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН (Таблица 3).

Таблица 3. Антипролиферативной активность (1С¡о. нмоль) антрациклинов в отношении чувствительных (МСР-7, К562) и МИЯ-резистентных линий (МСР-7/Оох, К562У89) опухолевых клеток _____

Соединение MCF-7 MCF-7Dox R/S" К562 K562Í/S9 R/S

Доксорубицин и его производные Доксорубицин (12) 300* 3650 12.5 140 1990 14.0

24 12800

29 >32000 ND ND 15650 ND ND

Карминомицин и его производные Карминомицин (11) 90 90 1.0 60 60 1.0

14-Гидрокси-карминомицин 1180 1220 1.03 180 190 1.05

21 100

25 300

30 9170 11380 1.24 1180 1220 1.03

32 ND ND ND 5850 14860 2.53

1С'¡о, нмоль, концентрация соединения, вызывающая гибель 50% клеток R/S, индекс резистентности - отношение IC'so по отношению линий резистентных

опухолевых клеток к 1С ¡о линий чувствительных опухолевых клеток

Введение в молекулу антрациклинового антибиотика гидрофильного фрагмента по 3'-

аминогруппе остатка даунозамина приводило к снижению антипролиферативной активности

по сравнению с родительским антибиотиком. В то же время, в отличие от доксорубицина

(12) и его производных (24, 29), карминомицин (11), 14-гидрокситарминомицин и его

производные 30, 32 были одинаково активны как в отношении чувствительных, так и в

отношении резистентных линий опухолевых клеток линии рака молочной железы (МСР-7 и

МСТ-ТОох. соответственно) и лейкоза (К562 и К5621/Я9. соответственно)

Клетки МСР-7/Оох и К5621/89 обладали резистентностью по механизму типичной

МОЯ, связанной с работой мембранного белка-насоса Рдр. При добавлении в среду

вепарамила, являющегося ингибитором белка резистентные клетки МСР-7/Оох и К5621/89 становились чувствительными к доксорубицину и винкристину.

3.5 Изучение противоопухолевой активности полученных производных в экспериментах на животных.

Синтезированные производные доксорубицина, содержащие остаток О-галактозы, присоединенный через полигидроксилированный (конъюгаты доксорубицина с мелибиозой 31 и лактозой 33) или ароматический спейсер (38, 39) были изучены в лаборатории химиотерапии и фармакокинетики ГУ НИИ но изысканию новых антибиотиков при внутривенном введении мышам с лейкозом Р388 (Таблица 4).

Таблица 4. Противоопухолевая активность соединении 31, 33, 38, 39 в сравнении с доксорубицином [при внутривенном введении мышам (линия ВИР/ С57 х ИВА;>. самцы) с

Соединение Доза (мг/кг) Режим введение (в/в) Токсическая гибель УПЖ (%)*

Контроль - - 0/10 0

Доксорубицин (12) 7 Однокр. 0/6 70

31 20 Однокр. 0/6 79

31 40 Однокр. 0/6 118

33 40 Однокр. 0/6 65

38 60 Однокр 0/6 44

39 60 Однокр. 0/6 59

Доксорубицин (12) 2.3 q2 х 3 4/7

31 20 q2 х 3 0/10 79

31 40 q2 х 3" 0/10 133

* УПЖ - увеличение продочжите1ьнпсти жизни по сравнению с контролем

В проведенных экспериментах наиболее активным оказалось производное доксорубицина 31, которое в эквитоксической дозировке не уступало доксорубицину. Соединение 31 в сравнении с доксорубицином было протестировано также при трехкратном режиме введения. В этих экспериментах конъюгат доксорубицина с мечибиозой (31) обладал меньшей кумулятивной токсичностью по сравнению с доксорубицином. Положительные результаты были получены при изучении в экспериментах in vivo 3'-\',Ы-ди-(2". 3"-дигидроксипропил)доксорубицина (24) и 3'-N-(D-1 -дезоксигалактиг-1 -ил)-14-гидроксикарминомицина Í30) Соединение 24 при однократном введении в дозе 10 мг/кг по своей противоопухолевой активности не уступало доксорубицину (доза 7 мг/кг), увеличивая продолжительность жизни мышей с лейкозом Р388 на 108 1% (УПЖ для доксорубицина составило 108.3%). Однократное внутривенное введение соединения 30 в дозе 12 мг/кг приводило к полному излечению мышей с лейкозом Р388.

Таким образом, модификация антрациклиновых антибиотиков, приводящая к З'-N-алкильным производным, является перспективным направлением для создания препаратов, обладающих преимуществами перед родительскими антибиотиками.

4. Конъюгаты доксорубицина с галактоманнаном.

Одним из современных подходов в создании новых противоопухолевых препаратов является молекулярный дизайн и синтез так называемых веществ — про-лекарств. В этой связи перспективным является получение различных конъюгатов антрациклиновых антибиотиков с полисахаридами. Полисахариды обычно обладают низкой токсичностью и иммуногенностью, являются биологически совместимыми и биологически деградируемыми соединениями. Этот подход может быть эффективен для направленной доставки препарата и улучшения терапевтического индекса.

Целью работы было получение водорастворимых конъюгатов доксорубицина с полисахаридами, которые действовали бы по принципу про-лекарств, высвобождая доксорубицин в условиях m vivo. В качестве полисахарида для конъюгации с доксорубицином был выбран водорастворимый 1,4-р-0-галактоманнан (ГМ) (Фирма ProPharmaceuticals), природный полисахарид растительного происхождения, широко применяемый в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. По сравнению с другими полисахаридами, галактоманнан содержит в боковой цепи множество остатков галактозы, которые могут взаимодействовать с галактоз-специфическими рецепторами опухолевых клеток, такими как, например, галектины

Галактоманнан активировали реакцией периодатного окисления, с последующей очисткой полученного окисленного ГМ методом гель-фильтрации на Сефадексе G-25. Активированный ГМ вводили в реакцию с доксорубицином, при этом происходило образование оснований Шиффа между альдегидными группами окисленного ГМ и 3'-аминогруппой доксорубицина (DOX) На схеме 10 представлены возможные варианты образующихся структур на примере одной из окисленных субъединиц активированного ГМ.

Была проведена серия эксиеримен гов, в которых варьировались степень окисления ГМ и количество вводимого в реакцию доксорубицина Было показано, что конъюгат доксорубицина с ГМ был растворим в воде только при относительно невысоком содержании доксорубицина (~5% весовых, определено на единицу массы высушенного порошка методом УФ спектроскопии при 490 нм) Полученный конъюгат доксорубицина с ГМ очищали от не вступившего в реакцию доксорубицина и низкомолекулярных примесей методом многократного диализа, дополнительную очистку конъюгата осуществляли методом гель-фильтрации на Сефадексе G-25.

Схема 10. Возможные структуры конъюгатов доксорубицин+ГМ и З'-Ы-Ь-лизилдоксорубицин+ГМ.

Чтобы увеличить содержание доксорубицина в конъюгате с галакюманнаном, был использован З'-М-Ь-лизилдоксорубицин - гидрофильное производное доксорубицина, содержащее дополнительную аминогруппу по сравнению с доксорубицином. Синтез З'-Ы-Ь-лизилдоксорубицина осуществлен в 4 стадии исходя из I.-лизина и доксорубицина (12). Аминогруппы -лизина защищали с помощью Ртос-групп, карбоксильную группу активировали реакцией с Ы-гидроксисукцинимидом Реакция доксорубицина с 0-[Ма, Мс-ди-Ртос-Ь-лизил]оксисукцинимидом с последующим удалением Ртос-защитных групп морфолином приводила к З'-Ы-Ь-лизилдоксорубицину с выходом 67% в расчете на доксорубицин. Полученный З'-М-Ь-лизилдоксорубицин вводили в реакцию с активированным ГМ, при этом образование связи между З'-М-Ь-лизилдоксорубицином и окисленным ГМ было возможно как по а-, так и по е-аминогруппе З'-Ы-Ь-лизилдоксорубицина (на схеме 10 не представлено) (Схема 10). Выделение и очистку полученного конъкмата З'-М-Ь-лизилдоксорубицин+ГМ проводили аналогично конъюгату доксорубицин + ГМ (методами диализа и гель-фильтрации). Введение лизинового спейсера между доксорубицином и ГМ позволило повысить нагрузку доксорубицина в конъюгате до 10% (весовых, определено на единицу массы высушенного порошка методом УФ спектроскопии при 490 нм) Молекулярный вес полученных конъюгатов доксорубицин+ГМ и З'-Ы-Ь-лизилдоксорубицин+ГМ был определен методом гель-хроматографии на колонке с Сефадексом С-200, предварительно прокалиброванной пуллуланами - стандартами для гель-хроматографии (М\У 24000 - 100000 Да) Молекулярный вес коньюгата доксорубицин+ГМ, определенный этим методом, составил ~ 95000 Да, конъюгата ЗЧЧ-Г,-лизилдоксорубицин+ГМ ~ 98000 Да, исходного ГМ ~ 92000 Да).

17

Методами ТСХ и ВЭЖХ с использованием стандартных образцов доксорубицина и 3'-М-Ь-лизилдоксорубицина было показано, что в условиях мягкого кислотного гидролиза (0.1 и НС1, 37°С, 20 ч) от конъюгата доксорубицин+ГМ отщеплялся доксорубицин, а от конъюгата З'-М-Ь-лизилдоксорубицин+ГМ - соответственно З'-М-Ь-лизилдоксорубицин.

Данные об антипролиферативной активности полученных конъюгатов доксорубицин+ГМ и З'^-Ь-лизилдоксорубицин+ГМ в отношении трех линий опухолевых клеток: мышиной меланомы В16-Р1, рака молочной железы МС.Р-7 и рака кишечника НТ-29 предоставлены фирмой РгоРЬаппасеиНсаЬ (таблица 5).

Таблица 5. Антипролиферативная активность доксорубицина и конъюгатов доксорубицин+ГМ и З'-Я-Ь-лизилдоксорубицин+ГМ.

Соединение IC50, мг/мл"

B16-F1 MCF-7 НТ-29

Доксорубицин 0.01-0.02 0.08-0.12 0.2-0.3

Доксорубицин+ГМ 0.5-0.8 3.0-4.4 13-20

3'-N-L-JIh3m-доксорубицин+ГМ >50 >50 >50

¡С¡о - концентрация соединения, вызывающая гибель 50% клеток

Как видно из представленных данных, конъютат доксорубицин+ГМ обладал цитотоксичностъю на 1-2 порядка меньшей по сравнению с доксорубицином. Если пересчитать полученные данные с учетом количества содержащегося в конъюгаге доксорубицина, можно сделать вывод о том, что полученный конъюгат действительно представляет собой депо-форму доксорубицина.

Для выявления различий в механизмах действия антрациклиновых антибиотиков и высокоактивного отечественного противоопухолевого углеводсодержащего антибиотика группы ауреловой кислоты оливомицина, а также выяснения роли углеводных остатков, исследовали оливомицин, его агликон оливин в сравнении с доксорубицином. Кислотный гидролиз оливомицина до агликона оливина проводили кипячением антибиотика в смеси 0.2 н H2SO4 в МеОН-НгО (1:1) в течение 2 ч. Оливин был очищен методом кристаллизации, охарактеризован методом 'Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии. Изучение антипролиферативной активности оливомицина и оливина проводилось в НИИ канцерогенеза ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН. Было показано, что оливомицин: 1) вызывает апоптоз опухолевых клеток человека различной тканевой принадлежности, 2) не активен в отношении опухолевых клеток рака молочной железы MCF-7/Dox и лейкоза K562Î/S9, устойчивых к доксорубицину, 3) подавляет генную транскрипцию. Полученные данные позволяют предположить, что механизм действия оливомицина, в отличие от доксорубицина, основан на его способности ингибировать транскрипцию. Агликон оливомицина не вызывал цитотоксичность и не блокировал транскрипцию.

выводы.

1. Разработан новый способ препаративного получения карминомицина исходя из даунорубицина с общим выходом -25-28%, который позволяет получать карминомицин с чистотой более 90% (по данным ВЭЖХ) без использования хроматографии на каждой из стадий синтеза и может быть реализован в промышленном масштабе

2. Получены новые производные - амиды даунорубицина, доксорубицина и карминомицина с квадратной кислотой, симметричные диамиды квадратной кислоты с антрациклиновыми антибиотиками и симметричные диамиды квадратной кислоты с антрациклиновыми антибиотиками, в которых остатки антибиотиков разделены гексаметиленовым спейсером. Среди синтезированных соединепий наибольшей антипролиферативной активностью обладали диамиды антрациклиновых антибиотиков с квадратной кислотой.

3 Разработан новый метод введения в молекулу антрациклинового ангибиогика остатков моно- и дисахаридов реакцией восстановительного алкилирования З'-аминогруппы остатка даунозамина.

4 Впервые осуществлен синтез производных, содержащих по 3'-аминогруппе остатка даунозамина гидрофильный полигидроксилированный фрагмент (остаток глицеринового альдегида или моносахарида), а также получены новые коньюгаты доксорубицина и 14-гидроксикарминомиципа с Э-галакгозой, в которых остаток П-галактозы присоединен через гидрофильный или гидрофобный ароматический спейсср.

5 Показано, что карминомицин и его производные активны в отношении резистентных опухолевых клеток линий МСК-7/Оох и К562№9 Установлено, что некоторые из синтезированных соединений - 3'-М-(-а-Г)-1алактопиранозил-(1—>6)-0-0-1-дезоксиглюцит-1-ил)доксорубицин (31) и 3'-М-(В-1-дезоксигалактит-1-ил)-14-гадрокси карминомицин (30) обладают преимуществами перед исходными антибиотиками в опытах на мышах с лейкозом Р388.

6. Разработан метод и получены новые депо-формы доксорубицина - конъгогаты с высокомолекулярным полисахаридом галактоманнаном, отличающиеся нагрузкой антибиотика, а также способом его присоединения к галактомашгану Показано, что полученные водорастворимые конъюгаты сохраняют антипролиферативную активность в отношении трех линий опухолевых клеток.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Олсуфьева Е.Н., Тевяшова А.Н., Преображенская М.Н. Способ получения антибиотика карминомицина или его гидрохлорида.// Решение о выдаче патента РФ на изобретение № 2004105794 от 27 02.04.

2 Олсуфьева ЕН, Штиль А. А, Тевяшова А.Н., Преображенская М.Н Кармикомицин и его производные// Российский биотерапевтический журнал.- 2004- №1,-С 28

3. Тевяшова А.Н , Олсуфьева Е Н., Штиль А А , Преображенская М Н Получение новых углеводсодержащих производных антрациклиновых антибиотиков.// Российский биотерапевтический журнал.- 2005 - №1,- С 72.

4 Симонова В С., Самусенко А.В., Филиппова Н А., Геняшова А Н, Лынив JI С., Кулик Г И , Чехун В.Ф., Штиль А А Оливомицин вызывает апоптоз опухолевых клеток и подавляет р53-индуцированную транскрипцию// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,- 2005,- №4,- С. 451-455.

5 Olsufyeva E.N., Tevyashova A.N., Treshalin I.D , Preobrazhenskaya M.N , Piatt D , Klvosov A. Synthesis and antitumor activity of new D-galactose containing derivatives of doxorubicin.// Carbohydrate Research - 2003,- V.338 - P. 1359-1367.

6 Tevyashova A N., Shtil A A, Olsufyeva E N., Simonova V S , Samusenko A.V., Preobrazhenskaya MN Carmmomycin, 14-hydroxycarminomycin and its novel carbohydrate derivatives potently kill human tumor cells and their multidrug resistant variants // Journal of Antibiotics - 2004,- V. 57, №2 - P. 143-150.

7 Tevyashova A.N., Sztaricskai F., Batta G, Herczegh P., Jency A. Formation of squanc acid amides of anthracycline antibiotics Synthesis and cytotoxic properties // Bioorg &Med Chem Lett - 2004 - V 14 - P 4783-4789.

8 Olsufyeva E N , Tevyashova A N , Treshalm I D., Treshalin M I, Preobrazhenskaya M N , Klyosov A., Piatt D Synthesis and anticancer activity of new conjugates of D-galactose and doxorubicin // 8thIntermernational Conference on Chemistry of Antibiotic and Related Microbial Products (ICCA-8) - Токио, Япония - 2002 -Тезисы докладов.- Р 44.

9. Олсуфьева Е Н, Тевяшова А.Н, Преображенская М.Н. Получение новых углевод-содержащих аналогов антибиотиков-антрациклинов путем восстановительного алкилирования аминогруппы остатка даупозамипа// 4-ый Всесоюзный симпозиум по органическому синтезу "Органическая химия - упадок или возрождение" - Углич - 2003 -Тезисы докладов - С. 118.

10 Tevyashova AN., Shtil A A, Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N. Novel derivatives of anthracycline antibiotics modified at carbohydrate moiety.// 22nd International Carbohydrate Symposium.// Глазго, Великобритания.- 2004,- Тезисы докладов - Р 30.

11 Тевяшова А Н , Олсуфьева Е.Н . Штиль А А . Преображенская М Н Новые конъюгаты антрациклиновых антибиотиков с моно-, да- и полисахаридами // 3-ий Московский Международный конгресс "Биотехнология- состояние и перспективы развития".- Москва.- 2005.- Тезисы докладов.- Т. 1.- С. 144-145.

12. Олсуфьева Е.Н., Тевяшова А Н., Штиль А.А., Преображенская М.Н Пути создания новых антрациклиновых антибиотиков, преодолевающих резистентность опухолевых клеток.// 3-ий Московский Международный конгресс "Биотехнология, состояние и перспективы развития".- Москва - 2005 - Тезисы докладов - Т 1 - С 174-175

20

Принято к исполнению 18/05/2005 Исполнено 19/05/2005

Заказ № 882 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 \у\у\у.аи1огеГега1 ги

05-1 379 ft

РНБ Русский фонд

20064 8341

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

МОДИФИКАЦИЯ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ, НАПРАВЛЕННАЯ НА ПОВЫШЕНИЕ ИЗБИРАТЕЛЬНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).

выводы

1. Разработан новый способ препаративного получения карминомицина исходя из даунорубицина с общим выходом ~25-28%, который позволяет получать карминомицин с чистотой более 90% (по данным ВЭЖХ) без использования хроматографии на каждой из стадий синтеза, и может быть реализован в промышленном масштабе.

2. Получены новые производные - амиды даунорубицина, доксорубицина и карминомицина с квадратной кислотой, симметричные диамиды квадратной кислоты с антрациклиновыми антибиотиками и симметричные диамиды квадратной кислоты с антрациклиновыми антибиотиками, в которых остатки антибиотиков разделены гексаметиленовым спейсером. Среди синтезированных соединений наибольшей антипролиферативной активностью обладали диамиды антрациклиновых антибиотиков с квадратной кислотой.

3. Разработан новый метод введения в молекулу антрациклинового антибиотика остатков моно- и дисахаридов реакцией восстановительного алкилирования З'-аминогруппы остатка даунозамина.

4. Впервые осуществлен синтез производных, содержащих по 3-аминогруппе остатка даунозамина гидрофильный полигидроксилированный фрагмент (остаток глицеринового альдегида или моносахарида), а также получены новые конъюгаты доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина с D-галактозой, в которых остаток D-галактозы присоединен через гидрофильный или гидрофобный ароматический спейсер.

5. Показано, что карминомицин и его производные активны в отношении резистентных опухолевых клеток линий MCF-7/Dox и K562i/S9. Установлено, что некоторые из синтезированных соединений - 3'-М-(-а-0-галактопиранозил-(1—>6)-0-1-D-дезоксиглюцит-!-ил) доксорубицин (31) и 3 -N-( 1 -D-дезоксигалактит-1 -ил)-14гидроксикарминомицин (30) обладают преимуществами перед исходными антибиотиками в опытах на мышах с лейкозом Р388.

6. Разработан метод и получены новые депо-формы доксорубицина — конъюгаты с высокомолекулярным полисахаридом галактоманнаном, отличающиеся нагрузкой антибиотика, а также способом его присоединения к галактоманнану. Показано, что полученные водорастворимые конъюгаты сохраняют антипролиферативную активность в отношении трех линий опухолевых клеток.

1. Химиотерапия злокачественных опухолей.// Блохин Н.Н.-М.: Медицина.-1977.

2. Arcamone F., Doxorubicin anticancer antibiotics.// Academic Press.-1981.

3. Anthracycline antibiotics.// Khadem El H.S.- Academic Press.-1982.

4. Новые цитостатики в лечении злокачественных опухолей.// Горбунова В.А.-М.-1998.

5. Gewirtz D. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin.// Biochem. Pharmac.-1999.-V. 57.-P. 727-741.

6. Silverman R. Organic chemistry of drug design and drug action.// San Diego: Elsevier Academic Press.-2004.

7. Denny W. Emerging DNA topoisomerase inhibitors as anticancer drugs.// Expert Opinion Emerg. Drugs.-2004.-V. 9.-P. 105-133.

8. Guano F., Pourquier P., Tinelli S., Binaschi M., Bigioni M., Animati F., Manzini S., Zunino F., Kohlhagen G., Pommier Y., Capranico G. Topoisomerase poisoning activity of novel disaccharide anthracyclines.// Mol. Pharmacol.-1999.-V. 56.-P. 77-84.

9. Monneret C. Recent developments in the field of antitumor anthracyclines.// Eur. J. of Med. Chem.-2001.- V. 36.-P. 483-493.

10. Garnier-Suillerot A., Marbeuf-Gueye C., Salerno M., Loetchutinat C., Fokt I., Krawczyk M., Kowalczyk Т., Priebe W. Analysis of drug transport kinetics in multidrug-resistant cells: implications for drug action.// Curr. Med. Chem.-2001.-V. 8.-P.51-64.

11. Олсуфьева E.H. Синтез и противоопухолевая активность новых аналогов антрациклиновых антибиотиков, модифицированных по агликону.// Биоорг. Химия.-1990.-Т. 16.-С. 1445-1463.

12. Олсуфьева Е.Н. Синтез и противоопухолевые свойства антрациклиновых антибиотиков, модифицированных по сахарному остатку.// Биоорг. Химия.-1992.-Т. 8.-С. 149-180.

13. Щекотихин А.Е. Синтез 4,11-диметокси-нафто2,3-1.индол-5,10-диона, исследование его химических свойств и биологической активности.// Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук.- М.-1998.

14. Противоопухолевый антибиотик карминомицин и его применение в клинике// Гаузе Г.Ф.-М.: Онкологический научный центр.-1980.

15. Pratesi G., Monestiroli S.V. Preclinical evaluation of new anthracyclines.// Curr. Med. Chem.-2001.-V. 8.-P. 9-13.

16. Albert A., Selective Toxicity.// London: Chapman and Hall.-1951.

17. Eilat E Arad-Yellin R:W09937634 (1999).

18. Eli Lilly & Co.: US5612474 (1997).

19. Damen E:, de Groot F., Scheeren H. Novel anthracycline prodrugs.// Expert Opinion on Therapeutic Patents.-2001.-V. 1 l.-P. 651-666.

20. Bristol-Myers Co.: EP-0317956 (1989).

21. De Groot F., Damen E., Scheeren H. Anticancer prodrugs for application in monotherapy: targeting hypoxia, tumor-associated enzymes, and receptors.// Curr. Med. Chem.-2001.-V.8.-P. 1093-1122.

22. Fenick D., Taatjes D., Koch T. Doxoform and daunoform: anthracycline — formaldehyde conjugates toxic to resistant tumor cells.// J. .Med. Chem.-1997.-V. 40.-P. 2452-2461.

23. Taatjes D., Fenick D., Koch T. Epidoxoform: a hydrolytically more stable anthracycline — formaldehyde conjugate toxic to resistant tumor cells.// J. Med. Chem.-1998.-V. 41.-P. 1306-1314.

24. Taatjes D., Koch T. Nuclear targeting and retention of anthracycline antitumor drugs in sensitive and resistant tumor cells.// Curr.Med. Chem.-2001.-V.8.-P. 15-29.

25. Burke P., Koch T. Doxorubicin — formaldehyde conjugate, doxo form: induction of apoptosis relative to doxorubicin.// Anticancer Res.-2001.-V. 21.-P. 2753-2760.

26. Burke P., Koch T. Design, synthesis and biological evaluation of doxorubicin — formaldehyde conjugates targeted to breast cancer cells.// J. Med. Chem.-2004.-V. 47.-P. 1193-1206.

27. Swift L., Cutts S., Rephaeli A., Nudelman A., Philips D. Activation of adriamycin by the pH-dependent formaldehyde-releasing prodrug hexamethylentetramine.// Mol. Cancer Therap.-2003.-V.2.-P. 189-198.

28. Ghosh S.; Ellerbroek S., Wu Y., Stack M. Tumor-cell mediated proteolysis: regulatory mechanisms and functional consequences.// Fibrin. Proteol.-2000.-V. 14.-P. 87-97.

29. Lijnen H. Molecular interactions between the plasminogen/plasmin and matrix metalloproteinase.// Fibrin. Proteol.-2000.-V. 14.-P. 175-181.

30. Koblinski J., Ahram M., Sloane B. Unreaveling the role of proteases in cancer.// Clin. Chim. Acta.-2000.-V. 291.-P. 113-135.

31. Dubowchik G., Firestone R. Catepsin B-sensitive dipeptide prodrugs. 1. A model study of structural requirements for efficient release of doxorubicin.// Bioorg. Med. Chem. Lett.-1998.-V. 8.-P. 3341-3346.

32. Dubowchik G., Mosure K., Khipe J., Firestone R. Catepsin B-sensitive dipeptide prodrugs. 2. Models of anticancer drugs paclitaxel (Taxol®), mitomycin С and doxorubicin.//Bioorg. Med. Chem. Lett.-1998.-V. 8.-P. 3347-3352.

33. Chakravarty P., Carl P., Weber M., Katzenellenbogen J. Plasmin-activated prodrugs for cancer chemotherapy. 2. Synthesis and biological activity of peptidyl derivatives of doxorubicin.//J. Med. Chem.-1983.-V. 26.-P. 638-644.

34. Devy L., de Groot F., Blacher S., Hajitou A., Beusker P., Scheeren H., Foidart J., Noel A. Plasmin-activated doxorubicin prodrugs containing a spacer reduce tumor growth and angiogenesis without systemic toxicity.// Faser J.-2004.-V. 18.-P. 565-567.

35. Guang X., McLeod X. Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy.// Clinical Cancer Res.-2001.-V. 7.-P. 3314-3324.

36. Vrudhula V., Svensson H., Senter P. Cephalosporin derivatives of doxorubicin as prodrugs for activation by monoclonal antibody-beta-lactamase conjugates.// J.Med. Chem.-1995.-V. 38.-P.1380-1385.

37. Papot S., Tranoy I., Tillequin F., Florent J.-C., Gesson J.-P. Design of selectively activated anticancer produgs: elimination and cyclization strategies.// Curr. Med. Chem.-2002.-V. 2.-P. 155-185.

38. Bakina E., Wu Z., Robenblum M., Farquhar D. Intensively cytotoxic anthracycline prodrugs: grucuronides.// J. Med. Chem.-1997.-V. 40.-P. 4013-4018.

39. Houba P., Leenders R., Boven E., Scheeren J., Pinedo H., Haisma H. Characterization of novel anthracycline prodrugs activated by human beta-glucuronidase in antibidy-directed enzyme prodrug therapy.// Biohem. Pharmacol.-1996.-V. 52.-P. 455-463.

40. Haisma H., van Muijen M., Pinedo H., Boven E. Comparison of two anthracycline based prodrugs for activation by monoclonal antibody-beta-glucuronidase conjugate in the specific treatment of cancer.// Cell Biophys.-1994.-V. 24-25.-P. 185-192.

41. Houba P., Boven E., van der Meulen-MuilemanL, Leenders R., Scheeren J., Pinedo H., Haisma H. Pronounced antitumor efficacy of doxorubicin when given as the prodrug

42. D0X-GA3 in combination with a monoclonal antibody beta-glucuronidase conjugate.// Int. J. Cancer.-2001.-V. 91.-P. 550-554.

43. Houba P., Boven E., Erkelens C., Leenders R., Scheeren J., Pinedo H., Haisma H. The efficacy of the anthracycline prodrug daunorubicin-GA3 in human ovarian cancer xenografts.// Br. J. Cancer.-1998.-V. 78.-P. 1600-1606.

44. Shabat D., Rader C., List В., Lerner R., Barbas III C. Multiple event action of a generic prodrug trigger by antibody catalysis.// Proc. Natl. Acad. Sci.-1999.-V. 96.-P. 6925-6930.

45. Bakina E., Farquhar D. Intensely cytotoxic anthracycline prodrugs: galactosides.// Anticancer Drug Des.-1999.-V. 14.-P. 507-515.

46. Lu J., Lowe D., Kennedy M., Low P. Folate-target enzyme prodrug cancer therapy utilizing penicillin-V-amidase and a doxorubicin prodrug.// J. Drug Target.-1999.-V. 7.-P. 43-53.

47. Гаузе Г.Ф., Дудник Ю.В. Противоопухолевые антибиотики.// М.: Медицина.-1987.-С. 120.

48. Seymour L. Passive tumor targeting of soluble macromolecules and drug conjugates.// Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.-1992.-V. 9.-P. 135-187.

49. Kopeckova D., Minko Т., Rubinstein A., Kopecek J. Design of a multivalent galactose ligand for selective targeting of HMPA copolymer-doxorubicin conjugates to human colon cancer cells.// Eur. J. Cancer.-2004.-V. 40.-P. 148-157.

50. Langer M., Kratz F., Rothen-Rutishauser В., Wunderli-Allenspach H., Beck-Sickinger A. Novel peptide conjugates for tumor specific chemotherapy.// J. Med. Chem.-2001 .-V. 44.-P.1341-1348.

51. Lutsenko S., Feldman N., Severin S. Cytotoxic and antitumor activity of doxorubicin conjugates with the epidermal growth factor and its receptor-binding fragment.// J. Drug Target.-2002.-V. 10.-P. 567-571.

52. Kratz F., Beyer U., Collery P., Lechenault F., Cazabat A., Schumacher P., Falken U., Unger C. Preparation, characterization and in vitro efficacy of albumin conjugates of doxorubicin.// Biol. Pharm. Bull.-1998.-V. 21.-P. 56-61.

53. Domb A.J., Benita S., Polacheck I., Linden G.: US6011008 (2000).

54. Immunoconjugates. Antibody conjugates in radioimaging and therapy of cancer.// Vogel Carl-Wilhelm.-Oxford: Oxford University Press.-1987.-P.189-217.

55. Hurwitz E., Maron R., Arnon R., Wilcher M., Sela M. Daunomycin-immunoglobulin conjugates, uptake and activity in vitro.// Europ. J. Cancer.-1978.-V. 14.-P. 1213-1220.

56. Harasym Т., Cullis P., Bally M. Intratumor distribution of doxorubicin following i.v. administration of drug encapsulated in egg phosphatidylcholine/cholesterol liposomes.// Cancer Chemother. Pharmacol.-1997.-V. 40.-P. 309-317.

57. Priebe W., Petez-Soler R. Design and tumor targeting of anthracycline able to overcome multidrug resistance: a double-advantage approach.// Pharmac. Ther.-1994.-V. 60.-P. 215-234.

58. Boiardi A., Pozzi A., Salmaggi A., Eoli M., Silvany A. Safety and potentional effectiveness of daunorubicin-containing liposomes in patients with advanced recurrent malignant CNS tumors.// Cancer Chemother. Pharmacol.-1999.-V.43.-P. 178-179.

59. Kattan J., Droz J., Couvreur P. Phase I clinical trial and pharmacokinetic evaluation of doxorubicin carried by polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles.// Invest. New Drugs.-1992.-V. 10.-P. 191-199.

60. Гаузе Г.Ф., Свешникова M.A., Ухолина P.C., Гаврилина Г.В., Филичева В.А., Гладких Е.Г. Образование противоопухолевого антибиотика карминомицина культурой Actinomadura carminata sp. no v.// Антибиотики.-1973.-Т. 18.-C. 675-679.

61. Гаузе Г.Ф., Терехова Л.П., Максимова Т.С., Ольховатова О.Л., Лаврова Н.В., Бражникова М.Г., Константинова Н.В., Мышенцева Т.М., Олсуфьева Е.Н. Новый продуцент карминомицина Streptomyces cremeospinus sp. no v.// Антибиотики.-1975.-Т. 20.-C. 389-393.

62. Бражникова М.Г., Збарский В.Б., Пономаренко В.И., Покрас Л.В. Способ получения карминомицина.// А.с. № 508076 от 11.11.1975.

63. Бражникова М.Г., Збарский В.Б., Пономаренко В.И., Покрас Л.В. Способ получения карминомицина.// А.с. № 543257 от 21.09.1976.

64. Збарский В.Б., Пономаренко В.И., Бражникова М.Г. Способ получения карминомицина I гидрохлорида.// А.с. №1176602 от 21.10.83.

65. Cassinelli G., Grein A., Masi P., Suarato A., Bernardi L., Arcamone F. H. Preparation and biological evaluation of 4-O-demethyldaunorubicin (carminomycin I) and its 13-dihydro derivative.// J. Antibiotics.-1978.-V. 31.-P. 178-184.

66. Берлин Ю.А. Химия антибиотиков группы ауреловой кислоты.// Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук.-М.-1971.

67. Бражникова М.Г., Кругляк Е.Б., Мезенцев А.С., Федорова Г.Б. Продукты кислотного гидролиза антибиотика оливомицина.// Антибиотики.-1964.-Т. 9.-С. 552-553.

68. Олсуфьева Е.Н., Преображенская М.Н. Антибиотики, полученные в НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН.//Химия гетероциклических соединений.-2004.-Т. 11.-С. 1603-1618.

69. Toshima К., Tatsuta К. Recent progress in O-glycosylation methods and its application to natural products synthesis.// Chem. Rev.-1993.-V. 93.-P. 1503-1531.

70. Олсуфьева E.H., Бакиновский Л.В., Преображенская M.H., Де Клерк Э., Бальзарини Д. Новые аналоги антрациклиновых антибиотиков, содержащие 2,3,6-тридезокси-3-амино-З-С-метил-Ь-арабино-гексапиранозу (L-эремозамин).// Биорг. Химия.-1991.-Т. 17.-С. 316-322.

71. Sidorova Т.А., Nigmatov A., Kakpakova E.S. Stavrovskaya A.A., Gerassimova G.K. Effects of isoprene analogues of 3DB-ethyldiamine on multidrug resistant tumor cells.// J. Med. Chem.-2002.- V. 21.-P. 5330-5339.

72. Hoffman D., Bersheid H.D., Bottger D. Structure-activity relationship of anthracyclines in vitro.// J.Med.Chem.-1990.-V. 33, P.166-171.

73. Portugal J., Martin В., Vaquero A., Ferrer N., Villamarin S., Priebe W. Analysis of the effects of daunorubicin and WP631 on transcription.// Curr. Med. Chem.-2001.-V. 8, P. 1-8.

74. Поваров Л.С., Исаева Н.И., Рубашова Л.М., Олсуфьева Е.Н. Необычно протекающая реакция бромирования кетона.// Журнал органической химии.-1979.-Т. 15.-С. 1560-1561.

75. Олсуфьева Е.Н., Розынов Б.В. Получение и масс-спектрометрическое изучение N-циклоалкильных производных карминомицина, даунорубицииа и их аналогов.// Биоорг. химия, 1991, том 16, стр. 476-481.

76. Vasta G.R, Ahmed Н., Odom E.W. Structural and functional diversity of lectin repertoires in invertebrates, protochordates and ectothermic vertebrates.// Curr. Opinion in Struct. Biology.-2004.-V. 14.-P. 616-630.

77. Debray C., Vereecken P., Belot N. Tiellard P., Brion J.-P., Pandolfo M., Pochet R. Multifacted role of galectin-3 . on human gloiblastoma cell motility.// Biochem. and Biophys. Res. Comm.-2004.-V. 325.-P. 1393-1398.

78. Cairo C.W., Gestwicki J.E., Kanai M., Kiessling L.L. Control of multivalent interactions by binding epitope density.//JACS.-2002.-V. 124.-P. 1615-1619.

79. Tong G.L., Wu H.Y., Smith Т.Н., Henry D.W. Adriamycin analogues. Synthesis of N-alkylated anthracyclines with enhaced activity and reduced cardiotoxicity.// J. Med. Chem.-1979.-V. 22.-P. 912-918.

80. Ahmad S., Tester R. Polysaccharides as drug carries.// 22nd International Carbohydrate Symposium.-UK, Glasgow.-2004.-23-27 July.-C37.

81. Anthracycline antibiotics.// Khadem H. S. E.-New York: Academic Press.-1982.-P. 124138.

82. Olsufyeva E.N., Tevyashova A.N., Trestchalin I.D., Preobrazhenskaya M.N., Piatt D., Klyosov A. Synthesis and antitumor activity of new D-galactose-containing derivatives of doxorubicin.// Carbohydrate Res.-2003.-V. 338.-P. 1359-1367.

83. Klyosov A.A., Piatt D., Zomer E. Preclinical studies of anticancer efficacy of 5-fluorouracil when co-administered with the 1,4-P-D-galactomannan.// Preclinica.-2003.-V. l.-P. 175-186.

84. Levin Y., Sela B. Animo acid and peptide derivatives of daunomycin with improved chemotherapeutic activity.// Curr. Chemotherapy and Infections.-1980.-V. 25.-P. 16851687.

85. AnaSpec, Inc., San Jose, CA 95131, cast number 22501.1. БЛАГОДАРНОСТИ

86. Автор выражает глубокую признательность Преображенской Марии Николаевне за научные консультации и плодотворное обсуждение диссертации.