Термическая стабильность коллагена в соединительных тканях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

4858155

Игнатьева Наталия Юрьевна

ТЕРМИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ КОЛЛАГЕНА В СОЕДИНИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук по специальности 02.00.04—физическая химия

2 7 ОКТ 2011

Москва, 2011г.

4858155

Работа выполнена на кафедре физической химии Государственного учебно-научного учреждения Химический факультет Московского государственного университета имени М.В Ломоносова.

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

профессор, доктор физико-математических наук, Баграташвили Виктор Николаевич

профессор, доктор химических наук, Мельников Михаил Яковлевич (Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова)

профессор, доктор химических наук, Ищенко Анатолий Александрович (МГА Тонкой Химической технологии) профессор, доктор физико-математических наук Гончуков Сергей Александрович (Национальный исследовательский ядерный университет "МИФИ»)

Институт химической физики им. Н. Н. Семёнова РАН

Защита диссертации состоится 21 октября 2011 г. в 15 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.90 по химическим наукам при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, аудитория_.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Отзывы на автореферат высылать по адресу: Москва ГСП-1, 119991, Ленинские горы, дом 1, строение 3, Ученому секретарю диссертационного совета Д 501.001.90 Бобылевой М.С.

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 501.001.90, Кандидат химических наук — М.С. Бобылева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Коллаген является основным структурным белком в организмах млекопитающих и составляет каркас матрикса соединительных тканей. Важнейшей функцией соединительных тканей является механическая, во всем своем многообразии: опора, сочленение, объединение, передача нагрузки, защита и другие. Каждой разновидности механической функции соответствует своя структура каркаса матрикса, которая определяется способом укладки коллагена и его взаимодействием с другими макромолекулами внеклеточного матрикса ткани. Даже незначительные нарушения структуры могут приводить к существенному отклонению в функционировании органа. Поэтому существует проблема определения структурных изменений в ткани и подходов к коррекции обнаруженных нарушений и функций.

Выявление взаимосвязи структуры и функции материала является общей естественнонаучной проблемой. При этом стабильность объекта, являясь, с одной стороны, характеристикой структуры, с другой - напрямую определяется его функцией. В физической химии особую роль играет термическая стабильность, которая позволяет для сложных, многокомпонентных, многофазных объектов оценить самые общие термодинамические свойства и дает возможность анализа структурно-функциональных связей в данном объекте. Для выделенного коллагена (в растворе и волокнах) уже установлены количественные термодинамические характеристики перехода из нативной упорядоченной конформации в форму случайного клубка: температура Тд и энтальпия ДНд его денатурации. Информация об этом явлении для коллагена, находящегося в составе реальной ткани, крайне скудна и не систематизирована, хотя преимущества использования Тд и ДНд кажутся очевидными, как в качестве первого шага структурного исследования ткани и ее заменителей, так и для диагностики патологических структурных изменений в ткани.

Значительное место в современных медицинских технологиях занимает метод локальной (в том числе - лазерной) гипертермии, когда в основе структурных изменений лежит денатурация коллагена, либо целевые структурные изменения протекают при температурах, равных или несколько превышающих Тд. При осуществлении локального ИК лазерного нагрева соединительных тканей условия обработки (такие, как время и температура нагрева) зачастую оказываются далеко не оптимальными, а результаты - плохо предсказуемыми, так как в экспериментальных исследований редко принимается во внимание специфическая архитектоника конкретных тканей. Таким образом, актуальной задачей является научное обоснование применения метода локального нагрева для модификации соединительных тканей в клинической практике.

Настоящая работа, направленная на исследование стабильности коллагена в соединительных тканях различного типа, состоит из двух частей. В первой части обосновывается использование термической

стабильности, как структурной и функциональной характеристики матрикса соединительных тканей различного типа, а во второй - исследуется устойчивость этих тканей в условиях неоднородного лазерного нагрева. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, тема «Химические реакции в разрядах и при фотохимическом и лазерном инициировании», № гос. регистрации 01.200.115171. В течение 10 лет исследования осуществлялись при финансовой поддержке РФФИ (99-02-16855-а, 00-02-16263-а, 01-02-17743-а, 02-02-16246-а, 04-02-16743-а, 05-02-16902-а, 06-08-00950-а, 07-02-12080-офи, 07-08-00448-а, 08-02-00583-а, 09-02-00714-а), в том числе проектом № 07-02-00749-а, руководителем которого автор диссертации непосредственно являлся. Работа поддерживалась также грантами АФГИР (1ШР2-2660-М0-05) и МНТЦ (3360).

Цели работы

1. Охарактеризовать состояние коллагена в соединительных тканях и установить взаимосвязь между структурными и термодинамическими параметрами стабильности коллагена в этих тканях с применением современных физико-химических методов.

2. Определить особенности действия локального лазерного нагрева на матрикс соединительных тканей и выявить факторы, определяющие стабильность коллагена в этих условиях.

Научная новизна

- Впервые проведено систематическое исследование термической стабильности коллагена в тканях с разной архитектоникой и химическим составом матрикса. Выявлена взаимосвязь между термодинамическими параметрами денатурации коллагена и свойствами матрикса. Установлено, что иммобилизация фибрилл и волокон коллагена за счет взаимодействия с сеткой протеогликановых агрегатов или внедрения их в более плотную ткань является важнейшим фактором стабильности коллагена в ткани. Нарушение целостности единой структуры органа приводит к значительному уменьшению термической стабильности коллагена.

- Впервые показано, что использование термодинамических характеристик денатурации коллагена в соединительных тканях совместно с химическим анализом и данными оптических методов визуализации, позволяет определять состояние коллагена в тканях и его изменения в результате патологических процессов или целевой модификации. Разработанный в диссертации подход является достаточно эффективным и информативным методом определения структурных и функциональных особенностей матрикса соединительных тканей, а также их изменений при различных воздействиях на ткань.

- Впервые выявлено принципиальное различие в поведения коллагеновой сети в тканях с волокнистой структурой при осуществлении гидротермального и ИК лазерного нагрева умеренной интенсивности. Это

различие обусловлено развитием механической дезорганизации упаковки коллагена в условиях нестационарного и неоднородного в пространстве температурного поля при ИК лазерном воздействии (фототермо-механический эффект). Показано, что при ИК лазерном нагреве денатурация коллагена в тканях возможна при температурах более низких, чем температура денатурации коллагена в калориметрической ячейке. Предложена схема модификации волокнистых структур ИК лазерным излучением умеренной интенсивности.

- Впервые показано, что характер изменений матрикса и его коллагеновой подсистемы зависит от состава и надмолекулярной организации матрикса ткани. В частности, в гиалиновом хряще носовой перегородки дезорганизацию претерпевает главным образом протеогликановая подсистема, а в жировой ткани - подсистема триацилглицеридов.

Практическая значимость

- Разработанная методология комплексного физико-химического анализа соединительных тканей, включающая термический и химический анализы, а также методики оптической диагностики, однозначно характеризует состояние коллагена в тканях, что дает молекулярную основу для разработки новых методов коррекции функции тканей.

- Обнаруженный фототермомеханический эффект воздействия ИК лазерного излучения умеренной интенсивности на соединительные коллагенсодержащие ткани, приводящий к дезорганизации матрикса ткани, необходимо учитывать при разработке клинических методов модификации ткани с использованием лазерных технологий. Выявленная корреляция между составом и архитектоникой ткани и ее откликом на неоднородный нагрев дает важный вклад в разработку научных основ метода локальной гипертермии коллагенсодержащих тканей с патологическими изменениями.

- Полученные в работе данные позволяют предсказать степень деградации соединительной ткани при термическом и ИК лазерном воздействии и дают научную основу выбора режимов ИК лазерного воздействия, обеспечивающего желаемый терапевтический эффект.

Личный вклад автора

В диссертации представлены результаты исследований, выполненных лично автором, при его решающем участии или под его руководством в период с 1998 по 2010 г. на кафедре физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова в рамках дипломных работ студентов и кандидатских диссертаций C.B. Аверкиева и H.A. Данилова, руководителем и со-руководителем которых являлся автор. Личный вклад автора в настоящую работу состоит: в формулировке ее концепции, основных положений и выводов; в разработке экспериментальных методик и проведении экспериментов; обработке, анализе и обобщении результатов. Морфологический анализ выполнен д.м.н., проф. Шехтером А.Б. (МГМУ им. И.М. Сеченова). Часть работы выполнена в соавторстве с сотрудниками

Института проблем лазерных и информационных технологий РАН. Большое влияние на работу оказали академик РАН, д.х.н., проф. В.ВЛунин и научный консультант д.ф.-м.н., проф. Баграташвили В.Н.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на ряде российских и международных конференций, в их числе:

V международная конференция по лазерной физике (2001, Москва), IX, X, XI и XIV международные конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, Украина, 2001, 2002, 2003 и

2007 гг.), международная конференции «Лазеры: применение и технологии» (Москва, 2002 г.), XIII международная конференции по биологической калориметрии (Вюрцбург, Германия, 2003 г.), 4-я всероссийская Каргинская конференция "Наука о полимерах 21-му веку" (Москва, 2007 г.), международная конференция "Применение лазеров в науках о жизни" (Москва, 2007 г.), 15 и 16 международные конференция по современным лазерным технологиям (Леви, Финляндия, 2007 г., Шиофок, Венгрия, 2008г.), XVI и XVII международной конференции по химической термодинамике в России (Суздаль, 2007 г., Казань 2009 г.), конференция «Биомеханика глаза» (Москва, 2007 и 2009 гг.), III конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (Троицк, 2008 г.), 16-й конгресс Европейского общества по биомеханике, (Люцерн, Швейцария,

2008 г.), 12-я и 13-я международные конференции по миопии (Сидней, Австралия, 2008 г., Тьюбинген, Бельгия, 2010 г.), конгресс европейского общества офтальмологов, (Амстердам, Голландия, 2009 г.), II международный симпозиум «Актуальные проблемы биофотоники» (Нижний Новгород, 2009 г.), III евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии (Москва, 2010 г.), и другие престижные российские и международные форумы, конференции и семинары.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 39 статей в рецензируемых российских и международных изданиях и более 30 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Структура диссертации

Работа состоит из введения, 4 глав и общих выводов. Работа изложена на 300 страницах машинописного текста и включает 25 таблиц, 221 рисунок и список литературы из 536 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава посвящена описанию физико-химических свойств основных компонентов внеклеточного матрикса соединительных тканей - коллагена и протеогликанов, а также надмолекулярной организации матрикса.

Макромолекула фибриллярного коллагена представляет собой три полипептидных цепи, закрученных в тройную спираль. Во внеклеточном матриксе эти макромолекулы укладываются в фибриллы, располагаясь параллельно со сдвигом на % молекулы (D-период). Данные по дифракции рентгеновских лучей, электронной и атомно-силовой микроскопии указывают на существование в соединительных тканях упорядоченной укладки коллагеновых макромолекул, фибрилл и волокон в квазикристаллическую структуру. Ко- и пост-трансляционная модификации приводят к образованию специфичных для коллагена гидроксипролина (Hyp) и гидроксилизина (Hyl) и ферментативному окислению лизина до альлизина, после чего протекает их конденсации с NH2 группами боковых цепей и формирование термолабильных внутри- и межмолекулярных ковалентных поперечных связей, превращающихся в термостабильные сшивки. Второй путь образования сшивок связан с накоплением конечных продуктов гликации (КПГ) за счет конденсации азотсодержащих групп остатков лизина, аргинина с альдегидными группами простых Сахаров. С возрастом сшивки накапливаются, что приводит к изменению физико-химических свойств тканей. Общая схема образования коллагеновой подсистемы в ткани представлена на рисунке 1.

ТРАНСЛЯЦИЯ , ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ ПРОНИНА И ЛИЗИНА

ТРОПОКОЛЛАГЕН

Я

'-1-/

300 нм

| ФИБРИЛЛА |

{агой|го1юшш..

У . УКЛАДКА МИКРОФИБРИЛЛ

4(2) п...........

СТАБИЛИЗАЦИЯ ФИБРИЛЛ ЗА СЧЕТ ОБРАЗОВАНИЯ КРОСС-ПОПЕРЕЧНЫХ СШИВОК ПО МЕХАНИЗМУ ФЕРМЕНТАТИВНОМУ (1) И ГЛИКАЦИИ (2)

ИГА

размер до 1 мкм, масса до 107 Д

Рисунок 1. Схема образования коллагеновой подсистемы в матриксе соединительных тканей (слева) и строение протеогликанового агрегата (ПГА, справа).

Протеогликаны (ПГ) состоят из полисахаридных цепей гликозаминогликанов (ГАГ), связанных со стержневым белком О-гликозидными связями, а макромолекулы ПГ могут образовывать протеогликановые агрегаты (ПГА) с другой полисахаридной молекулой -гиалуроновой кислотой. В тканях ПГ, взаимодействуя с поверхностью фибрилл коллагена, задают толщину фибрилл и ориентируют их, формируя

гиалуроновая

стержневой

специфическую организацию матрикса, которая обеспечивает оптимальные механические свойства и функционирование ткани.

Рассмотрены физико-химические основы тепловой денатурации коллагена на базе теории плавления полимеров в рамках модели фазового перехода I рода; такой подход объясняет восстановление структуры коллагена при охлаждении, влияние концентрации растворителя и степени поперечной связанности макромолекул на измеряемую температуру Тд.

Вторая глава посвящена рассмотрению методов исследования свойств матрикса. Химический анализ дает содержание ГАГ и коллагена. Оценка типового состава коллагена основана на разнице мольных соотношений г = Hyp/Hyl {г, - 15±1 для коллагена I и Гц = 4.5±0.5 для коллагена И) и Gly/Ala (2.97 для коллагена I и 3.42 1для коллагена III). Особое место занимает определение устойчивости к трипсину. Этот фермент, катализирует протеолиз всех белков, кроме макромолекул коллагена в конформации тройной спирали, и доля деградированного коллагена ат равна доле Hyp, вымытого трипсином в супернатант т(Нур)$ от общего количества коллагена т(Нур)т: а,= т(Нур)Т / (m(Hyp)s + т(Нур)Т)хШ%.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) дает две основные термодинамические характеристики денатурации коллагена в тканях: температура (Тд) и энтальпия (ДНд) денатурации. Степень денатурации коллагена аДск можно определить, зная тепловой эффект денатурации ДН: аДСк= (7-ДН/ДНд)х100%, где ДНд - энтальпия денатурации коллагена в интактных тканях. Информация о степени сшивания и совершенстве фибриллярной упаковки коллагена может быть получена на основе Тд.

Фибриллы и волокна детектируются с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Поскольку несимметричные макромолекулы коллагена имеют отличную от нуля нелинейную поляризуемость, они способны к генерации второй гармоники (ГВГ) лазерного излучения; сигнал ГВГ усиливается при параллельной упаковке молекул. Укладка фибрилл и волокон охарактеризована с помощью многофотонной микроскопии. Анизотропные свойства и общая архитектоника ткани характеризуются методом кросс-поляризационной оптической когерентной томографии (КПОКТ). Этот метод дает информацию об изменении состояния поляризации обратно рассеянного зондирующего излучения в среде и количественную характеристику анизотропии образца - двулучепреломление Дп, которое может быть рассчитано по периоду модуляции интенсивности интерференционного сигнала zt,: Дп = X /2zb, где X - длина волны зондирующего излучения.

На рис. 2 представлена схема, соотносящая метод исследования с уровнем структурной иерархии коллагена в ткани на примере связки надколенника.

ЙК спектроскопия многофотонная КП ОКТ 3 микроскопия / \ч

,/' устойчивость /\ \

К трипсину гжа4^

полипептедназ_^,.

/

. I К»

-----------ПЭМ

.»■»'"•'фибрилла

^ пучок

тройная спираль макромолекулы

сладчатосчти (кримпи)

Рисунок 2.

Соотнесение метода исследования с уровнем структурной иерархии коллагена на примере ткани связки.

характерный размер, мкм

Часть качественной информации о ткани получена из данных об изменениях сорбционных свойств ткани, ИК спектроскопии и световой микроскопии. Выбор методов исследования диктуется надмолекулярной организацией ткани.

Третья глава посвящена физико-химическому анализу коллагена в различных соединительных тканях. В каждом разделе главы термическая стабильность коллагена в определенной ткани обсуждается в связи с химическим составом, надмолекулярной организацией и механической функцией ткани.

В разделе 3.1 в качестве модельной системы рассматривается ткань связки надколенника, которая подвергается преимущественно одноосному натяжению. Коллаген составляет 86±2% и представлен коллагеном типа I (Нур/Ну1=14.5±0.5 и ау/А1а=2.77±0.4), массовая доля ГАГ- 1.3± 0.2%.

Рисунок 3. Характеристика квазикристаллической структуры коллагена в интактной ткани связки: фибриллы на ПЭМ микрофотографии (а), волокна на ГВГ изображении (б), интерференционная картина на КПОКТ томограмме (в) и переход спираль-клубок (денатурация коллагена) на ДСК термограмме (г).

40 50 60 70 00 90

тпературе, °С

Ткань связки характеризуется упорядоченной одноосной укладкой макромолекул, фибрилл и волокон, что проявляется на ПЭМ микрофотографиях, где видна характерная О-периодичность фибрилл, и ГВГ изображениях, где идентифицируются параллельные волокна и пучки с

волнообразными складчатостями (кримпами) (рис. За, б). Параллельная укладка волокон в пучки обеспечивает анизотропные свойства ткани, обуславливая интерференционную картину на КПОКТ томограммах (Ап = (6,8±0,2)Т0"3) (рис. Зв). Конформационный переход спираль-клубок (денатурация коллагена) регистрируется на ДСК термограммах связки как эндотермический пик с характеристиками: ЛНд = 60±3 Дж/г коллагена, Т0П8еЪ = 63±1.5°С, Тпик = 67±1°С (соответствует температуре плавления фибрилл коллагена Тд) и (рис. Зг). На эндотермах плавления коллагена в ткани всегда наблюдается высокотемпературное плечо.

Денатурация коллагена при гидротермальной обработке связки протекала, начиная с 65°С, и регистрировалась, как уменьшение (вплоть до полного исчезновения) эффекта на ДСК термограммах, искажение волокнистой структуры на ГВГ изображениях и исчезновение двулучепреломления на КПОКТ томограммах. Процесс деградации при однородном нагреве носит пороговый характер и характеризуется одновременным нарушением упорядоченности на всех уровнях структурной иерархии ткани.

Приложение растягивающей силы, направленной вдоль главной оси связки, приводило к существенному увеличению стабильности коллагена.

При 82°С лишь через 2 мин часть макромолекул теряла нативную структуру (адск — 18±3%), при этом укладка волокон и анизотропия ткани сохранялись, хотя и в искаженном виде (рис. 4).

Описание денатурации коллагена как фазового перехода первого рода позволяет

использовать уравнения Тд= ЛНд / АБд для анализа состояния коллагена в тканях. Учитывая постоянство АНд - энергии, необходимой для разрушения системы водородных связей, стабилизирующих тройную спираль, изменение Тд следует связывать только с ЛБд. Предполагая неизменность энтропии коллагена в нативном состоянии, определяемой числом возможных конформаций тройной спирали, изменение Тд будет указывать на изменение энтропии коллагена в состоянии случайного клубка и отражать топологические ограничения, накладываемые на коллагеновую сеть (Д5д 4-=> Тд I) или увеличение свободного объема за счет разрыхления квазикристаллической упаковки фибрилл (А5Л Т=> Тд 4-). Увеличение в коллагеновой сети концентрации поперечных сшивок (с возрастом, за счет

Рисунок 4. Сохранение волокнистых структур коллагена на ГВГ микрофотографии (а), и анизотропии связки на КПОКТ изображении (6) после гидротермального прогрева с нагрузкой 5 Ньютонов (82 "С, 2 мин).

образования конечных продуктов гликации) приводит к уменьшению числа конформаций в состоянии случайного клубка, появлению фракции коллагена с повышенной Тд и, как следствие, наличию высокотемпературного плеча на эндотерме плавления коллагена в ткани. Повышение термической стабильности коллагена в связке при натяжении также обусловлено уменьшением числа допустимых конформаций полипептидных цепей в состоянии случайного клубка (уменьшение

В разделе 3.2. представлены результаты исследования тканей глаза -склеры (кролика) и Теноновой капсулы (человека), в которых выявляются возможности использования данных о термическом поведении коллагена для характеристики состояния ткани.

Показательным оказалось сравнительное изучение физико-химических свойств склеры и соединительной ткани капсул, образованных вокруг склероукрепляющих трансплантатов глаз. Трансплантаты содержали стимулирующий препарат панаксел (СШ) или были без него (08) [1].

Таблица 1. Физико-химические характеристики соединительнотканных капсул.

Показатели Склера (п=15) Капсула 08 (п=7) Капсула ОО (п=7)

_ * •••• Огп ■ 0.410.07 0.8±0.1 0.8±0.2

01у/А1а*" 2.95±0,05 2,91±0.11 2,87±0.09

Нур/НуГ" 15±1,5 16±2 17±1

Коллаген 67±2 83±7 76+5

ГАГ "•"" 1,3±0,2 1,8±0,1 1,9±0,1

ДНд, Дж/г 58,4±1,5 59,6±1,5 59±1,5

т 67,5±1,04 63.9±0.2 64.8+0.8

'на 1000 аминокислотных остатков, " % от сухой массы ткани,"* различие между группами статистически незначимо (р>0.05),""различие между группами статистически значимо (р<0.05).

Химический состав препаратов капсулы оказался близок к составу склеры, хотя содержание коллагена I и ГАГ в капсулах оказалось повышенным (табл. 1). Форма эндотерм плавления была различна для трех групп образцов (рис. 5). В капсулах высокотемпературное плечо денатурации

Рисунок 5. ДСК термограммы склеры и Рисунок 6 ДСК термограмма капсулы 00 соединительнотканных капсул вокруг после восстановления ткани К'аВИ^. трансплантата.

коллагена оказалось значительно менее выражено, а Тд основной фракции ниже, чем в склере; это указывает на меньшую концентрацию термостабильных сшивок и отсутствие КПГ в ткани капсулы, незрелой, по сравнению со склерой. На эндотерме денатурации коллагена в капсуле СШ появлялся низкотемпературный пик (Т„= 60.7±0.2°С), который исчезал после обработки капсул КаВН4 (рис. 6). Это указывало на связь низкотемпературного пика с плавлением фракции коллагена с большим содержанием «незрелых» альдиминовых сшивок, которые после восстановления превращаются в термостабильные связи -С-Ы-. Наличие альдиминовых сшивок характерно для эмбрионов и незрелых особей. Это в совокупности с повышенной концентрацией ГАГ, коллагена и орнитина (Огп) свидетельствует о высокой синтетической активности клеток в капсулах. Определение особенностей состояния коллагена в новообразованной соединительной ткани оказалось весьма перспективным для поиска материалов нового поколения, стимулирующих фибрилогенез в тканях глаза.

Эффективным оказалось и использование сшивающего агента глицеринового альдегида (ГА) для стабилизации ткани склеры. По мере протекания гликации возрастали до предельных значений интенсивность флуоресценции (>Чх/ет =370/435 нм), модуль Юнга, температура денатурации, устойчивость к смеси протеолитических ферментов «Морикраза» (рис. 7).

Флуоресценция, отн.е. Модуль Юнга, МПа

Время гликации, ч

Рисунок 7. Изменения характеристик образцов склеры кролика в ходе сшивания глицериновым альдегидом.

£ -и

Температура, "С

Рисунок 8. Примеры ДСК термограмм образцов склеры на ранних временах обработки глщеральдегидом

На ранних стадиях реакции отмечены локальный минимум протеолитической устойчивости и образование фракции коллагена с Тд ~ 60-62°С, что ниже, чем в исходных образцах (рис. 8). Эти явления, по-видимому, связаны с наличием фракции коллагена, содержащего продукты первичного присоединения ГА к одной М12 группе (т.н. эффект

маскирования).

В результате маскирования имеют место:

-увеличение энтропии

случайного клубка в расплаве за счет появления вращений вокруг новых одинарных связей;

-появление дополнительных объемных групп на концах боковых цепей, нарушающих целостность тройной спирали и, как следствие, кристаллическую молекулярную упаковку в фибриллах;

- изменение зарядового профиля молекулы и сетки водородных связей. Различия Тд для интактной, маскированной и сшитой фракций коллагена можно объяснить изменением энтропии этих фракций, определяемой числом конформационных состояний случайного клубка в предположении незначительного изменения при маскировании и сшивании: скорость ферментной деградации коллагеновых материалов определяется доступностью гидролизуемых полипептидных связей. Наличие локального минимума протеолитической стабильности хорошо согласуется с маскированием аминогрупп. После модификации некоторой части ЫН2 групп устойчивость к протеазам незначительно возрастает; при дальнейшем увеличении числа объемных групп боковых цепей нарушается упорядоченность трехспиральной структуры, доступ фермента облегчается, и стабильность падает.

В дальнейшем влияние эффекта маскирования компенсируется влиянием эффекта сшивания, так как значительная доля продуктов одиночного присоединения превращается в сшивки. Это вызывает значительный рост и термической (за счет уменьшения З^Т") и протеолитической (за счет изменения центров связывания ферментов и стерических затруднений образования фермент-субстратного комплекса) стабильности.

Общее возрастание структурной стабильности коллагена склеры при сшивании обосновывает перспективность клинического использования метода гликации для укрепления склеры при прогрессирующей миопии; при этом следует иметь в виду возможность частичной дезорганизации фибриллярной структуры на ранних стадиях гликации.

Изменение состояния коллагена в тканях при патологиях показано на примере Теноновой капсулы пациентов с прогрессирующей близорукостью по сравнению с группой контроля. Результаты химического, термического, флуоресцентного и морфологического (ПЭМ) анализа образцов Теноновой капсулы суммированы в табл. 2. Более низкое значение уровня флуоресценции для миопической группы связано с низкой долей продуктов гликации в коллагене и более ускоренным его обновлением.

Таблица 2. Изменение физико-химических характеристик Теноновой капсулы человека при прогрессирующей миопии

Параметр Контроль Миопия

Мольное отношение С1у/А1а" 2.61±0.01 (п=3) 2.62±0.20 (п=3)

Мольное отношение Нур/НуГ* 25.20±0.99 (п=3) 22.73±2.57 (п=3)

Коллаген, % от сухой массы" 47.0±2.4 (п=8) 51.0±5.7 (п=8)

ГАГ, % от сухой массы** 0.149±0.035 (п=6), 0.144±0.020 (п=6)

Интенсивность флуоресценции* (Х,хАет=370/438 нм) 0.614±0.354 (п=6) 0.540±0.250 (п=6)

Тд,°С* 65.6±1.0 (п=10) 61.6±1.0 °С(п=5)

АНД, Дж/г коллагена 45±3 (п=10) 49±3 (п=10)

Диаметр фибрилл, нм 89.5±13.2 75.7±7 нм

'различие между группами статистически значимо (р<0.05), " различие между группами статистически незначимо (р>0.05)

Фибриллы коллагена в Теноновых капсулах группы контроля имеют одномодальное распределение по диаметру и плотно упакованы в волокна, ориентированные в различных направлениях, образуя трехмерную сеть (рис. 9а). Такая структура оптимальна для того, чтобы ткань выдерживала разнонаправленные нагрузки. Для образцов миопической группы характерны: дезорганизация волокон и фибрилл в волокнах; лизис фибрилл; уменьшение их диаметра и наличие областей с отсутствием фибрилл, заполненных избытком ПГ (рис. 96). Кроме того, средний диаметр фибрилл уменьшен по сравнению с контрольной группой, причем распределение фибрилл по диаметрам более однородно за счет уменьшения доли фибрилл самых малых диаметров. Это коррелирует с общей деградацией ткани, так как в отсутствие нормального связывания между коллагеном и протеогликанами фибриллы малого диаметра деградируют в первую очередь.

Дезорганизация ткани отражается на термическом поведении образцов. Для контрольной группы эндотерма денатурации коллагена представлена четким эндотермическим пиком и высокотемпературным плечом, связанным

Рисунок 9. ПЭМ микрофотографии образцов Теноновой капсулы из контрольной (а) и миопической (б) групп.

с наличием фракции коллагена, сшитой формирующимися во время старения поперечными связями (гликация), причем это плечо очень слабо выражено у пациентов моложе 15 лет. Кривые ДСК миопических образцов характеризовались переходом спираль клубок при температурах ниже Тд в контрольных образцах, наблюдались и мультипиковые эндотермы (рис. 106).

Рисунок 10. Примеры ДСК термограмм образцов Теноновой капсулы контрольной (а) и миопической (б) групп.

Понижение Тя коллагена в Теноновых капсулах миопической группы связано с наличием фракции незрелого коллагена с термолабильными, альдиминовыми поперечными связями. Структурная дезорганизация фибриллярной упаковки и отделение ПГ от фибрилл также способны понижать Тд: чем более рыхлая упаковка макромолекул и больше энтропия случайного клубка, тем ниже Тд.

Объединенные данные ДСК, ПЭМ и флуоресцентного анализа позволили установить отклонения в структуре коллагена Теноновой капсулы при прогрессирующей миопии. Изменения связаны с понижением уровня поперечного сшивания и ускорением деградации ткани Теноновой капсулы при развитии прогрессирующей миопии. В результате происходит ухудшение биомеханических характеристик и развитие необратимых деформаций даже в диапазоне физиологических нагрузок.

Раздел 3.3 посвящен исследованию термической стабильности коллагена в тканях межпозвонкового диска, состоящего из пульпозного ядра и окружающих его фиброзного кольца и замыкательных пластин (рис. 11). Все они считаются хрящевыми, но отличаются химическим составом и архитектоникой, а также выполняют разные функции. В работе исследованы диски поясничного отдела кролика и хвоста теленка.

Рисунок 11. Схематичное изображение межпозвонкового диска в комплексе позвонок (ТП)-диск -позвонок (ТП). Диск включает внешнее фиброзное кольцо (ФК) с ламеллярной структурой, внутреннее пульпозное ядро (ПЯ) и примыкающую к кости позвонка замыкательную пластину (ЗП). Внизу изображена схема ламеллярного строения фиброзного кольца.

В матриксе фиброзного кольца (ФК) плотно упакованные параллельные волокна образуют ламеллы, угол между направлением волокон в соседних ламеллах составляет 67±2° (рис. 11). Архитектоника ФК идеальна для обеспечения устойчивости к силам натяжения и сдвига. Данные по химическому составу исследуемых объектов приведены в табл. 3.

Таблица 3. Физико-химические характеристики фиброзного кольца и его препаратов после модификации._

Образец Химический состав" ДНд> Дж/г тд,°с Дп

коллаген ГАГ VI

ФК кролика 55.6±5.5 (п=7) 15.5± 5.1 (п=7) 70-74 55.0+0.5" (п=15) 65.5±0.5 (5.3±0.3)10"э (п=25)

ФК теленка 49±6.5 (п=5) 10,3±2,5 (п=7) 72-75 57.5±0.3" (п=7) 65.3±0.5

ФК кролика после гиалуронидазы 63.4±2.5 (п=3) 4.7±2.1 (п=5) 20.0±2.0+ (п=4) 6б.0±1.0 (4.5±0.3)10^ (п=15)

ФК кролика после трипсина 74±2 (п=5) 5.2±1.8 (п=5) 68-71 14±2+ (п=5) 65.0±1.5 (3.2±0.2)-10"3 (п=25)

ФК кролика после глицеральдегида 25.0±2.0+ (п=3) 74.5±1.5 (4.1±0.2)-10"' (п=15)

% от сухой массы ткани, * нормировано на содержание коллагена/ нормировано на

сухую массу.

Коллаген является основным компонентом матрикса и представлен двумя типами -1 и II. Для оценки доли коллагена I в образцах (у^ был разработан простой алгоритм, приводящий к выражению л= г1 (гП -г^Гх (ги где г3 и Гр гп - мольные отношения Нур/Ну1 в образце (э) и коллагенах I и II.

Вьгсокоупорядоченная на всех уровнях иерархии, ламеллярная, анизотропная структура коллагена ФК проявляется на КПОКТ томограммах и ГВГ изображениях (рис. 12). Переход спираль-клубок регистрируется на ДСК термограммах ФК как эндотермический пик при ~ 65.5°С (рис. 13). Для

коллагена этой ткани Тд и ДНд (табл. 3) близки к таковым для ткани связки, то есть при нагреве секвестрированных фрагментов ФК в них происходит полная денатурация коллагена.

55 60 65 70 75 80 В5 температура, С

Рисунок 12. КПОКТ томограмма (а) и ГВГ изображение (б) фиброзного кольца.

Рисунок 13. ДСК термограммы ФК: интактного (1-кролика, 2-теленка) и после гидротермального прогрева диска в комплексе с позвонками (3).

Для изучения влияния состава и структуры матрикса соединительной ткани на состояние коллагеновой компоненты проведены модифицирующие обработки фиброзного кольца кролика гиалуронидазой (распад ПГА и ГАГ), трипсином (разрушение связующих и стержневых белков ПГ и отщепление терминальных доменов макромолекул коллагена) и глицеральдегидом. Химическая модификация матрикса приводила к разупорядоченности укладки коллагена в ткани, причем степень дезорганизации, выраженная как изменение Дп, Тд и Нд (табл. 3), определяется природой модифицирующего агента. Разрушение ГАГ давало минимальные изменения, а образование избытка поперечных сшивок приводило (помимо незначительного искажения анизотропной укладки) к существенной стабилизации матрикса (рост Тд). Полное разрушение ПГ подсистемы трипсином вызывало значительную дезорганизацию коллагеновой подсистемы: деградацию макромолекул коллагена и искажение анизотропной укладки волокон (значения ДНд и Дп значительно уменьшались, табл. 3). Таким образом, сеть ПГ и телопептидные домены коллагена оказывают значительное влияние на состояние матрикса.

Длительный гидротермальный прогрев диска в гибридной структуре позвонок-диск-позвонок (П-Д-П) при температуре 85 °С (>ТД секвестрированных фрагментов!) не приводила к денатурации коллагена; макромолекулы удерживали конформацию тройной спирали (эндотермический пик денатурации оставался на термограммах, рис. 14, кривая 3, ТД=67±2°С и ДНд = 51.2±0.5 Дж/г коллагена), сохранялась волокнистая структура и анизотропные свойства ткани (рис. 14, Дп=(4.2±0.3)Т0"3). Аналогичный результат получен для образцов после химической модификации: их гидротермальная обработка не приводила к изменению термодинамических (Тд и ДНд) и структурных (Дп) параметров. Это указывает на то, что ПГ и телопептиды не являются факторами,

определяющими повышенную термическую стабильность коллагена ФК в

Мы полагаем, что закрепление коллагеновых волокон в костной ткани позвонка, обеспечивающее их одноосную направленность от одного позвонка к другому, создает естественное, внутреннее натяжение и стабилизирует коллаген фиброзного кольца. Таким образом, сама архитектоника фиброзного кольца в костном комплексе предопределяет его устойчивость по отношению к внешним воздействиям. Повышение Тд коллагена ФК в костном комплексе, как и в случае натянутой связки, объясняется уменьшением числа возможных конформаций случайного клубка макромолекулы, а, следовательно, и А8Д.

В отличие от волокнистого фиброзного кольца, пульпозное ядро (ПЯ) характеризуется рыхлой и нерегулярной сетью коллагена и имеет гелеобразную консистенцию. Содержание в матриксе ПЯ коллагена, представленного типом II, удивительно низкое, а ГАГ - очень высокое (табл. 4), при этом ПГ почти не образуют аггрегатов [2]. Макромолекулы коллагена в ткани ПЯ полностью переходят из конформации тройной спирали в случайный клубок при прогреве, а ферментативные обработки, хотя и приводят к уменьшению содержания ГАГ, практически не влияют на

Таблица 4. Физико-химические характеристики пульпозного ядра и его препаратов после модификации._

Образец ПЯ от кролика интактный от теленка интактный от кролика, обработка АВСхондро-итиназой от теленка, обработка АВСхондро-итиназой от кролика, обработка трипсином от теленка, обработка трипсином

Коллаген 4.5± 2.2 (п=7) 35,5±2 (п=3) 9.2+3.8 (п=3) 67.5+7.8 (п=3) 13.9+6.4 (п=3) 53.2+7.8 (п=3)

Нур/Ну1 4.5+0.7 (п=5) 5.3+0.5 (п=3) - - - -

ГАГ* 29+8 40±2 12.5+3.3 8.3+0.3 9.2+1. 9 8.1+0.3

АНЯ> Дж/г коллагена 55,1±4,0 62.4+1.2 58.5+2.5 60.5+3.5 52.6+4.5 53.6+3.0

(п=12) (п=5) (п=3) (п=3) (п=3) (п=3)

Т °Г 1 д, ^ 65.5±1.5 67+1 65.5+3.2 66.3+2.2 64.0+2.0 65.1+2.1

% от сухой массы ткани

термическую стабильность коллагена (табл. 4). Мы полагаем, что отсутствие сетки ПГА и высокоупорядоченной структуры коллагена, предопределяет

целостной системе П-Д-П.

Рисунок 14. КПОКТ томограмма (а) и ГВГ изображение (б) ФК после прогрева диска в комплексе.

отсутствие стерических ограничений на число конформаций молекул коллагена в состоянии случайного клубка.

Замыкательная пластина (ЗП) относится к гиалиновым хрящам, и ее основными компонентами являются коллаген II и ГАГ (табл. 5).

Таблица 5. Физико-химические характеристики замыкательной пластины и ее препаратов после модификации.

Образец ЗП Интактый После ABC хондроитиназы После трипсина Выдержанный в 1,5М NaCI

Коллаген" 44±2 (п=5) 47-50 (п=2) 74

Hyp/Hyl 4.9±0.1 (п=3) 4,9

ГАГ' 23+2 (п=5) 17+3 (п=5) 4±2 (п=4)

ДНд, Дж/г коллагена 8,5+2,5 (п=5) 12,5±1 (п=3) 42±5 (п=5) 12±3 (п=3)

т„ °с 65-82 68-84 66±2 65-80°С

'% от сухой массы ткани

Теплота регистрируемого на ДСК термограммах (рис. 15) перехода коллагена в интактной ЗП в 5-8 раз меньше ДНд коллагена II в ПЯ (табл. 5). После обработки прогретых образцов трипсином в супернатант выходило 12±2% исходного Нур, а при повторном прогреве остатков на термограммах вновь наблюдался эндотермический эффект с температурой пика ~60°С и ДН = 35±5 Дж/г сухого остатка (п=3) (рис. 16). Эти данные указывают, что при первом прогреве ЗП денатурация коллагена в этой ткани не происходит полностью (адск =15%, ат=12± 2%).

темнспагупа. v Рисунок 16. Повторный ДСК скан

Рисунок 15. ДСК термограммы ЗП: интактной трипсинизированного препарата ЗП, (1), обработанный ABC хондроитиназой (2) и полученного после первого прогрева трипсином (3). ЗП.

Тепловой эффект денатурации возрастал после деполимеризации и уменьшения концентрации ГАГ под действием ABC хондроитиназы, оставаясь, однако, меньше ДНд. Лишь после полного разрушения трипсином сети ПГ нагрев препаратов ЗП приводил к полной денатурации коллагена (табл. 5, рис. 16), Отметим, что аналогичные результаты были получены для гиалинового хряща сустава.

Очевидно, что ПГ определяют термическую стабильность коллагена II в гиалиновом хряще ЗП, однако, их роль не связана ни с осмотическим давлением, ни с электростатическими взаимодействиями. Действительно, доля сульфатированных ГАГ в ПЯ выше, чем в ЗП, но коллаген II полностью денатурирует в ткани ПЯ при ее нагреве. Кроме того, увеличение ионной силы в 10 раз практически не изменяет термического поведения коллагена в ткани (табл. 5).

Мы полагаем, что принципиальное значение для термической стабильности коллагенового волокна имеет сетка ПГА, которая находятся в теснейшем механическом переплетении с коллагеновой сетью. Протеогликановые агрегаты иммобилизуют коллагеновые фибриллы, создавая стерические ограничения для движения полипептидных цепей коллагена. В ткани гиалинового хряща число допустимых конформаций для этих цепей в состоянии случайного клубка будет ограничено топологическими препятствиями, следствием чего является уменьшение АБд и увеличение Тд. В препаратах тканей с поврежденной сетью ПГА коллаген II денатурирует лишь частично, а с разрушенной сеткой - полностью. Поскольку в матриксе замыкательной пластины существуют локальные неоднородности, то возможен процесс локальной денатурации коллагена в зонах деградации ПГА. Схема такого процесса представлена на рисунке 17.

Составляющие межпозвонкового диска отличаются по составу, морфологии и, как показано в настоящей работе, термической стабильностью коллагена. Можно считать, что термическая стабильность коллагена отражает морфологию матрикса ткани и, следовательно, ее функцию.

Волокна коллагена в фиброзном кольце, которое выдерживает двустороннее растяжение-сжатие и сдвиги, закреплены в теле позвонка, что и обеспечивает повышенную стабильность коллагена в целостной системе. Пульпозное ядро, окруженное ФК и ЗП, выдерживает высокие компрессионные нагрузки, которые компенсируются осмотическим давлением за счет высокой концентрации ГАГ; для перераспределения нагрузки ПЯ должно легко поддаваться сдвигу, и коллаген в этой ткани не иммобилизован (сеть ПГА отсутствует). В результате коллаген в ПЯ не отличается повышенной термической стабильностью. Замыкательная пластина работает на компрессионное сжатие и сдвиговые деформации, для чего необходима как высокая концентрация ГАГ, так и иммобилизации

трипсин

Рисунок. 17. Схема иммобилизации фибрилл коллагена (КФ), агрегатами ПГ (ПГА), ограничивающими свободный объем для денатурирующих молекул. Разрушение ПГ трипсином снимает ограничения.

коллагеновой сети сетью ПГА. Стабильность коллагена в секвестрированных образцах этой ткани самая высокая из всех тканей диска.

Представленные в разделе 3.4 результаты исследования устойчивости к нагреву коллагена формообразующих хрящей (носовой перегородки и щитовидного хряща гортани коровы и свиньи) обсуждаются в связи с архитектоникой этих тканей. Их характерной морфологической особенностью является окружение плотным соединительнотканным слоем -надхрящницей гиалиновой основы хряща. Отличие химического состава матрикса двух подсистем заключается в большем содержании ГАГ и меньшей доли коллагена в гиалиновой составляющей; кроме того коллаген в ней представлен только коллагеном II (табл. 6).

Таблица 6. Физико-химические характеристики формообразующих хрящей.

Образцы Щитовидный хрящ гортани Хрящ носовой перегородки

надхрящница гиалиновая составляющая надхрящница гиалиновая составляющая

Коллаген" 46±5 (п=5) 25±5 (п=7) 52±4 (п=5) 35±5 (п=15)

П 70 (п=3) 0 (п=5) 80% (п=3) 0 (п=9)

ГАГ' 18±7(п=5) 49±8 (п=12) 22±5 (п=5) 47±9 (п=23)

Дп (4,7±0,2)'Ю"3 (5,1±0,3)'Ю"3

ДНд, Дж/г коллагена 64±2 (п=5) Денатурации нет, п=7 65±1 (п=5) Денатурации нет, п=15

Тд,°С 62±1 63±3

% от сухой массы

Организация коллагена различна в подсистемах, что следует из результатов исследования ГВГ, представленных на рис.18 а, б. Волокна коллагена в надхрящнице уложены в пучки, ориентированные под разными

Рисунок 18. Разные способы укладки коллагена в надхрящнице (Н) и гиалиновой составляющей (X) носовой перегородки (а, в) и щитовидного хряща (б, г) на ГВГ (а, б) и КПОКТ (в,г) изображениях.

углами, но параллельно поверхности, что и вызывает эффект двулучепреломления, проявляющийся на КПОКТ томограммах. В глубокой зоне хряща фибриллы создают подобие слоев, лежащих перпендикулярно поверхности хряща, и материал выглядит изотропным (рис. 18в, г). Группы фибрилл в переходной зоне отклоняются в слоях к горизонтали и конденсируются, а волокна коллагена надхрящницы начинают расщепляться.

19

Здесь происходит взаимопроникновение коллагеновых сетей хряща и надхрящницы, в результате чего и образуется единая коллагеновая система органа (рис. 19).

Рисунок 19. ГВГ изображения переходной зоны хряща носовой перегородки.

Термическое поведение коллагена в гиалиновом хряще и надхрящнице кардинально различается. При прогреве в калориметре ткани надхрящницы все макромолекулы коллагена претерпевают переход спираль - клубок, на термограммах интактной ткани гиалиновой составляющей хрящей эндотермические эффекты, соответствующие денатурации, отсутствовали (рис.20). Прогретые в калориметрической ячейке образцы не растворялись в

О—

температура, С

температура, С

Рисунок 20. Термограммы интактной ткани отделенной надхрящницы (1) и гиалиновой составляющей (2) щитовидного хряща (а) и хряща носовой перегородки (б). Вставка: повторный нагреве образца гиалинового хряща, подвергшегося обработке трипсином после первого прогрева.

трипсине (аТ ~ 6%), а при повторном прогреве после трипсина на термограммах гиалиновой составляющей проявлялся пик денатурации коллагена с тепловым эффектом ЛНд=38±2 (п=3) Дж/г сухого остатка (рис. 20, врезка). Видимых изменений коллагеновой сети на ГВГ изображениях гиалиновой составляющей прогретых образцов не отмечалось (рис.21). Таким образом, денатурация коллагена типа II в интактных образцах тканей гиалиновой составляющей формообразующих хрящей невозможна.

Рисунок 21. ГВГ

изображения гиалиновой части после прогрева: хрящ носовой перегородки (а) и щитовидный хрящ гортани (б).

Данные термического анализа образцов гиалиновой составляющей формообразующих хрящей после модификационных обработок (табл. 7) подтверждают, что коллаген, как и в случае замыкательной пластины, имеет возможность полностью денатурировать при нагреве лишь после дезагрегации всей сетки ПГА матрикса гиалинового хряща трипсином (и а-химотрипсином). При этом ни электростатические взаимодействия (избыток NaCl не влияет на переход), ни сами ГАГ не играют решающей роли; впрочем, деполимеризация цепей ГАГ в присутствии ABC хондроитиназы давала возможность частичной денатурации коллагена.

Таблица 7. Термодинамические характеристики денатурации коллагена в препаратах ткани гиалинового хряща после модифицирующих обработок.

Вид обработки ДНд, Дж/г сухой массы

а-химотрипсин (п=5) 59+1*" 61+2

Трипсин (п=12) 40+5 59±3

Трипсин"(п=3) 42 ±3 60±1

ABC хондроитиназа (п=3) 5+1 65-85

1,5 М NaCl (п=3) 1+1 70-75

'все данные относятся к препаратам хряща носовой перегородки, за исключением помеченных , которые относятся к препаратам щитовидного хряща; Дж/г коллагена.

Если часть коллагена в гиалиновом хряще ЗП претерпевает переход при нагреве, то в формообразующих хрящах такой фракции нет. Это можно объяснить трехкратным превышением степени агрегации ПГ в хрящах носа и гортани по сравнению с суставными хрящами [3]. Именно жесткая сетка ПГА в формообразующих хрящах оказывает необходимое сопротивление движению коллагеновой сетки при сдвиге, обеспечивая устойчивость к сдвиговым деформациям и сохранение формы органа. Очевидно, что чем жестче сетка ПГА, тем больше ограничений наложено на число конформаций для молекул коллагена в состоянии клубка, тем меньше Д8д и выше Тд (рис. 17). Можно сделать заключение, что по мере роста устойчивости ткани к сдвиговым нагрузкам и уменьшения компрессионной нагрузки в ряду «пульпозное ядро - замыкательная пластина - формообразующие хрящи» термостабильность коллагена II в тканях возрастает вследствие агрегации протеогликанов.

т г

£ -12

Денатурация коллагена

надхрящницы в целостной системе протекает при более высоких температурах, чем в отделенной надхрящнице. В случае щитовидного хряща Тд достигает 81-83°С (и=7), для хряща носовой перегородки Тд находится в диапазоне 70-75°С (п = 5) (рис. 22). Эффект уменьшения термической стабильности коллагена надхрящницы при нарушении целостности системы надхрящница-

55 60 65 70 75 80 85 90 95

Температура, "С

Рисунок 22. Примеры термограмм хряща с надхрящницей: носовая перегородка (1) и щитовидный хрящ (2).

хрящ ярко проявлялся при гидротермальной обработке. Например, при 65°С в отделенной надхрящнице за 90 с протекал переход спираль-клубок (аморфизация матрикса и усадка ткани), а матрикс целостной системы оставался неизменным. Даже при 90°С в целостной системе в значительной степени сохранялись и нативные трехспиральные макромолекулы, и волокнистая структура, и анизотропные свойства ткани (рис. 23).

Благодаря взаимному переплетению коллагеновых сетей гиалиновой

Гидротермальная обработка 90°С, 60 с

Целостная система

Система с отделенной надхрящницей

Гидротермальная обработка 85°С, 10 мин

Целостная система

Рисунок 23. Влияние гидротермальной обработки на структуру коллагена в целостной и отделенной системе хрящ-надхрящница.

зоны и надхрящницы возникает целостная система формообразующего хряща. Эта система выдерживает высокие сдвиговые деформации (за счет гиалиновой составляющей) и способна к торсионным движениям (за счет надхрящницы). Стабилизация коллагеновой подсистемы надхрящницы осуществляется за счет интегрирования фибрилл коллагена в гиалиновую часть.

Раздел 3.5. посвящен исследованию термической стабильности коллагена в менисках, выполняющих ряд функций, важнейшей из которых является перераспределение компрессионной нагрузки, так, что значительная ее часть (до 70%) переходит в давление на окружную периферию мениска.

Матрикс мениска состоит из коллагена (59-66%), который представлен типами I и II (Нур/Ну1=8-9.8, уг ~ 66%); содержание ГАГ незначительно (2.2±0.3%). Анизотропные свойства мениска проявляются на КПОКТ томограммах, полученных при сканировании поверхности и продольных срезов (Дп~2.5'10"3, рис. 246). Действительно на ГВГ изображениях поверхности визуализуются преимущественно параллельно лежащие волокна, а на продольных срезах более глубоких слоев - круговые пучки волокон с характерными складчатыми структурами - кримпами (рис. 24в, г). На поперечных срезах проявляются поперечные стяжки, выходящие из приповерхностных слоев и оплетающие круговые пучки (рис. 24д).

Рисунок 24. Визуализация структуры матрикса мениска на разных срезах (а) с помощью КПОКТ (б) и многофотонной микроскопии (в-д).

На ДСК термограммах образцов из центральной части мениска (рис. 25) наблюдался переход с температурой пика 71± 3°С и ДН = 18.7± 4.8 Дж/г коллагена (п=18). Образцы не растворяются в трипсине, но в супернатант переходит около 1/3 от всего Hyp (аТ = 34 ±3%). При повторном прогреве в ячейке калориметра остатка в диапазоне 40-80°С происходит денатурация коллагена с ДН]=25±4 коллагена (п=3). В совокупности эти результаты показывают, что коллаген в мениске претерпевает лишь частичную денатурацию при первом нагреве.

После трипсинизации мениска на ГВГ изображениях наблюдалось разрыхление и появление складчатостей в поверхностном слое и поперечных стяжках при сохранении тонкой волокнистой структуры круговых пучков (рис. 26). Известно, что именно вокруг поперечных стяжек ПГ образуют сеть ПГА [4], которая разрушалась в присутствии трипсина, что и приводило к ослаблению внутренних напряжений и нарушению интактной организации этих структур. Денатурация коллагена при нагреве трипсинизированных образцов мениска в ячейке калориметра протекала полностью (ТД=69±0.5°С, ДНд = 50± 5 Дж/г коллагена (рис. 25, кривая 2).

Рисунок 25. ДСК термограммы образцов центральной части мениска интактного (1) и подвергнутого обработке трипсином (2). На врезке - повторный прогрев образца после обработки трипсином.

температура

Рисунок 26. Влияние трипсина на структуру мениска. ГВГ изображения поперечных (а, б) и продольных (в) срезов.

Для определения особенностей неполной денатурации коллагена в мениске было выполнено исследование образцов мениска, подвергнутых гидротермальной обработке (83°С и 73°С, 3 мин). После прогрева тонкая волокнистая структура от поверхности и поперечных стяжек сохранялась, но коллаген круговых пучков явно претерпел изменения (рис. 27). На ГВГ изображениях продольных срезов пучки стали малоразличимы, а на продольных срезах в них наблюдалось исчезновение кримпов и появление локальных аморфных областей. Деградация структур, обеспечивающих двулучепреломление среды, подтвердило и уменьшение Дп до 1-1.5'10"3 (на основе данных КПОКТ).

Рисунок 27. Влияние гидротермальной обработки (83 'С, 3 мин) на структуру мениска. ГВГ изображения поверхности (а) поперечного (б) и продольных (в) срезов.

Обработка трипсином прогретых образцов дает три фракции: супернатант, дисперсию и остаток. Результаты аминокислотного и

24

термического анализа фракций (табл. 8) подтвердили сохранение трехспиральной конформации значительной части макромолекул после прогрева. На термограммах остатка и дисперсии наблюдался эндотермический переход денатурации, и ат составляла не более 41%. Супернатант оказался обогащенным коллагеном I, а остаток и дисперсия -коллагеном II. Поскольку коллаген I концентрируется в круговых пучках, а коллаген II - в поперечных стяжках [5], то данные химического анализа подтвердили повышенную стабильность поперечных стяжек и меньшую -круговых пучков.

Таблица 8. Результаты анализа фракций мениска, полученных в результате трипсинизации прогретых образцов.

Тип образцов Мениск после гидротермальнй обработки при 73°С (п=4) Мениск после гидротермальной обработки при 83°С (п=4)

Супернатант Дисперсия Остаток Супернатант Дисперсия Остаток

аТ, % 28.5±2.5 14.5±0.5 57±2 41±1 20±2 40±2

Нур/Ну1 10.9±0.8 8.5±0.2 8.6±0.2 10.1±0.2 8.2±0.1 8.4±0.4

% у, 92-80 76-70 76-70 84-79 72-67.5 71.5-68

32 14 54 45 19 36

Гп"",% 17 17 66 28 24 48

ТЯ,°С 69±1 69.5±1.5 67.5±0.5 70±0.5

ДНд, Дж/г коллагена 28±2 26.5±1.5 22.5±0.5 23.5±0.5

доля коллагена в каждой фракции от общего количества; доля коллагена типа I в данной фракции по отношению к общему содержанию коллагена в данной фракции

доля коллагена типа I во фракции от всего коллагена типа I в исходных образцах доля коллагена типа II во фракции от всего коллагена типа II в исходных образцах

В случае мениска повышение термической стабильности коллагена поперечных стяжек связано с энтропийными затруднениями образования случайных клубков макромолекул. Ограничения обусловлены наличием вокруг этой подсистемы сетки ПГА [4], в свою очередь поперечные стяжки переплетают круговые пучки, ограничивая их свободный объем. Дополнительные ограничения на величину ДБд вносит натяжение фибрилл в неповрежденных областях, связанное с усадкой волокон в зонах аморфизации. Исчезновение складчатостей в круговых пучках подтверждает их натяжение. Принцип стабилизации коллагена в приповерхностной зоне основан на внедрении проходящих волокон и фибрилл в более жесткую матрицу поперечных стяжек (аналогично системе «хрящ-надхрящница»).

Необычное термическое поведение подсистем каркаса матрикса мениска можно связать с их функциями. Круговые пучки, характеризующиеся меньшей устойчивостью к термическому воздействию, противостоят растягивающим силам. Термическая стабильность коллагена на поверхности является отражением его способности нести компрессионную нагрузку. Это же можно сказать о поперечных стяжках, по которым компрессионная нагрузка диссипирует в радиальном направлении.

25

Поперечные стяжки, ограничивая круговые пучки, препятствуют их выталкиванию из рабочей зоны и обеспечивают целостность мениска, препятствуя сдвиговым деформациям.

На основе изложенных в третьей главе данных можно сделать заключение о том, что величина Тл коллагена в тканях всегда коррелирует с морфологией и составом матрикса. Наличие ограничений на движение макромолекул в фибрилле и случайном клубке, связанных либо с взаимодействием с другими компонентами, либо с иммобилизацией проходящих фибрилл в матриксе более жесткой ткани, неизбежно приводит к увеличению Тд, вплоть до полной невозможности денатурации в ячейке калориметра. Изменение вида эндотермы и температуры денатурации коллагена в тканях с патологическими изменениями позволяет, во-первых, детектировать наличие дефектов в коллагеновой подсистеме, а, во-вторых, позволяет ограничить направление поиска причин заболевания на молекулярном уровне. Второй, на наш взгляд более фундаментальный, аспект изменения характеристик стабильности коллагена в ткани, связан с ее функцией. Обобщая наши результаты, можно утверждать: в ряду тканей, работающих на растяжение, компрессию, сдвиг, величина Тд возрастает. По-видимому, это возрастание отражает общее увеличение стабильности матрикса, связанное с вариациями архитектоники и состава, обеспечивающими комплексное функционирование ткани.

Четвертая глава посвящена анализу устойчивость матрикса в условиях лазерного нагрева. В разделе 4.1 описаны принципы взаимодействия лазерного излучения с биологическими тканями. В настоящей работе воздействие на ткани осуществляли с помощью излучения эрбиевого волоконного лазера (длина волны Л.=1.56 мкм), все более широко используемого в современной лазерной медицине. В экспериментах варьировались мощность (0.25-5 Вт), режимы (импульсный или непрерывный) и способ (контактное или дистанционное) облучения. Нагрев вызван поглощением фотонов внутритканевой водой в области первого обертона валентного колебания ОН (коэффициент поглощения ца= 9,65 см"1). Эффективная глубина проникновения излучения в ткань (аеа) определяется эффективным коэффициентом ослабления |iefr, aefi=l/|Vr. В свою очередь ¡iefr зависит от ца, а также коэффициента и анизотропии рассеяния (|is и g): n,g = {Ma + (1 - g)) Для лазерного излучения с Х=1,56 мкм и коллагенсодержащих тканей ц„=60 см"1, g=0,97 получаем |aeff»13 см'1 и ® 0,8 мм [6].

В разделе 4.2 кратко даны основы ИК радиометрии, как современного и удобного метода определения пространственно-временных температурных полей. В разделе 4.3 приведены результаты исследования изменений, происходящих в матриксе соединительных тканей при неоднородном нагреве.

Для определения специфики лазеро-индуцированных превращений коллагеновой системы использовали модельную ткань связки надколенника (раздел 4.3. П. Нагрев осуществляли дистанционно в присутствии растягивающей силы вдоль главной оси связки и без нагрузки; достигаемые температуры в центре облучаемой зоны Тма]сс соответствовали Тд коллагена в ткани связки, а также были и ниже, и выше. Данные об условиях облучения сведены в таблице 9. Временные и пространственные профили температур приведены на рис. 28.

Таблица 9. Условия ИК лазерной обработки образцов связок и термодинамические параметры денатурации коллагена в этих образцах.

Образцы* Характеристики облучения (мощность, Вт/ длительность облучения, с/ пауза, с Тмакс, О аДСК. %

Л1 (17/7) 0.5 /4/0 - режим 1, без нагрузки 59±1 0

Л2 (15/6) 1/2/0 - режим 2, без нагрузки 65±1 57+3

ЛЗ (7/4) 2/0.5/0.5- режим 3„ без нагрузки 70±2 <2

ЛТ1 (11/5/) 0,5 /4/0 - режим 1, нагрузка 5 Н 59±1 27±5

ЛТ2 (9/5) 1/2/0 - режим 2, нагрузка 5 Н 65±1 62±5

ЛТЗ (5/4) 2/0.5/0.5 - режим 3, нагрузка 5 Н 70±2 46+3

'общее число облученных образцов / число образцов, для которых выполнен ДСК анализ максимальная температура в центре облучаемой зоны на сухую массу препарата

Время, с г, и к

Рисунок 28. Динамика приповерхностной температуры ткани в центре облучаемой области при лазерном нагреве в режимах 1-3 (а) и изменение радиального температурного поля во времени в режиме 1 (б).

Анализ полученных КПОКТ и ГВГ изображений, на которых четко визуализуется зона облучения, а также данных термического анализа (табл.9) позволил определить особенности лазеро-индуцированных изменений волокнистых структур матрикса ткани связки:

- несимметричная форма области изменений, которая оказалась вытянутой поперек основной оси связки (рис. 29);

- появление екладчатостей (кримпов) в областях, граничащих с зоной непосредственного воздействия лазерного излучения, где температуры не превышают 30°С (рис. 30, 32);

- специфическая модификация ткани в области облучения, происходящая до денатурации коллагена (рис. 29а, 31);

- увеличение степени деградации коллагена на всех уровнях структурной иерархии в присутствии одноосного натяжения (табл. 9, рис. 32).

направление главной оси связки «..... »

Рисунок 29. Примеры ГВГ (а, б) и КПОКТ (в, г) изображений ткани связок после лазерного воздействия (а — режим 1; б - режим 2; в, г -режим 3, сканирование вдоль (в) и поперек (г) основной оси связки.

40 45 50 65 60 66 70 75

Рисунок 30. Модификация коллагена в образцах Л1 на ГВГ изображениях.

температура,°С

Рисунок 31. ДСК термограммы образцов после лазерной обработки.

Специфическая модификация надмолекулярной организации без денатурации (йгДСк = 0) заключалась в дезорганизации упаковки коллагена -расщепление пучков на волокна и волокон на фибриллы, хаотичные направления хода волокон в пучках (рис. 30), что приводило к нарушению анизотропной структуры и уменьшению двулучепреломления (Л1: Дп=2.5±1.0Т0"3, ЛЗ: Дп=3.9±0.5'Ю"3, рис. 29, 32). Подобные изменения выглядят как механические повреждения под действием разнонаправленных сил и не наблюдались при гидротермальной обработке. Термическое поведение модифицированной системы менялось по сравнению с интактной тканью: Т0Пзе1 уменьшалась на 4-5°С, а для образцов Л1 и ЛЗ, в дополнение к главному, наблюдался низкотемпературный пик денатурации Тп= 61±1 °С

(рис. 31). Разрыхление плотной упаковки волокон приводит к увеличению свободного объема, конформационной энтропии денатурирующих цепей коллагена и, как следствие, к падению Тд.

Денатурация коллагена происходила в тех случаях, когда и Тшкс превышала Тд, и время воздействия является достаточным для раскручивания тройных спиралей макромолекул, переплетения полипептидных цепей случайным образом и аморфизации матрикса. Эти условия соблюдались в режиме 2; в результате центр зоны облучения образцов Л2 выглядел изотропным на ГВГ и КПОКТ изображениях (рис. 296, 32), Одск=43±3%.

Облучение в присутствие растягивающей силы вдоль главной оси связки приводило к денатурации во всех режимах облучения, а в режиме 2 к росту «дек (табл. 9, рис. 32). Эти результаты противоположны полученному увеличению устойчивости к деградации коллагена в растянутых связках при гидротермальной обработке (рис. 5).

Рисунок 32. Влияние натяжения на изменение структуры связки при лазерном нагреве. Слева - на КПОКТ томограммах образцов J1T в зоне воздействия выявляются изотропные области; справа — ГВГ изображение образца JIT1 показывает наличие обширной зоны с отсутствием волокнистой структуры (ср. с рис. 29 и 30).

Наблюдаемое различие результатов гидротермального и лазерного нагревов, очевидно, связано с неравновесным характером последнего. В условиях неоднородного в пространстве и времени температурного поля развиваются градиенты давлений, которые инициируют потоки тепла и воды, а также деформацию коллагеновых фибрилл, которой способствует распад термолабильных сшивок. Для тканей с одноосной упаковкой коллагена гидравлическая проницаемость очень мала, причем в продольном направлении ее величина составляет ~10"15м4-Н" -с"1, а в поперечном почти в 50 раз меньше [7]. В результате в ткани развиваются механические напряжения, которые и способствуют расщеплению структуры на разных иерархических уровнях вплоть до разрывов. Поскольку сопротивление потоку в поперечном направлении больше, чем в продольном, и градиенты давлений в этом направлении значительнее, то, в результате повреждения в направлении, перпендикулярном направлению волокон, носят более

серьезный характер. Если условия высокой температуры и механического воздействия сохраняются в течение некоторого времени, то локальная денатурация и разрывы фибрилл продолжаются, повреждения происходят на более высоком уровне иерархической организации коллагена (волокна, пучки), и денатурация может носить каскадный характер, приобретая черты объемного плавления. На макромолекулы в поврежденных волокнах уже не накладывается условие ограничения числа возможных конформаций в состоянии случайного клубка, и денатурация может протекать и при более низкой температуре. После охлаждения происходит релаксация напряжений; в результате появляются кримпы, образование которых всегда имеет место при релаксации коллагенового волокна. Так проявляется фототермомеханический эффект неабляционного воздействия лазерного излучения умеренной интенсивности.

На основании полученных результатов нами предложена феноменологическая модель взаимодействия «лазерное излучение -волокнистый матрикс соединительной ткани». Модель основана на предположении, что денатурация коллагена вторична по отношению к термомеханическим повреждениям. Блок-схема процессов представлена на рис. 33. Каждая стадия схемы обусловлена фототермическим или фототермомеханическим эффектом лазерного воздействия, либо их совместным влиянием.

Рисунок 33. Блок-схема лазеро-индуцироаннъа превращений коллагена в соединительных тканях с волокнистой структурой.

Результаты экспериментального исследования лазеро-индуцированных изменений структуры матрикса склеры кролика представлены в разделе 4.3.2. Контактное облучение длительностью 200 мс проводили при мощности 1,7 Вт, Тмакс достигала 75°С. В центре облученной области происходила денатурация коллагена, которая проявляется на КПОКТ томограммах как исчезновение двулучепреломления (рис. 346). После растворения деградированного коллагена в присутствие трипсина в зоне воздействия образовывалась полость («г =100%, рис. 34в). Тем не менее, на КПОКТ изображениях наблюдались локальные зоны, обладающие двулучепреломляющими свойствами, а на микрофотографиях полостей -пучки волокон, направленные к центру (рис. 34). Существование таких пучков связано с возникающими в результате денатурации силами натяжения, которые смещают неповрежденные части в зону деструкции.

Рис. 34. КПОКТ изображения интактной склеры (а) и после ИК лазерного облучения (б). Стрелками указано наличие в зоне воздействия двулучепреломляющих структур. Микрофотография облученной зоны склеры после обработки трипсином (в).

Лазеро-индуцированная деградация коллагена в тканях межпозвонкового диска обсуждается в разделе 4.3.3. Изменения коллагена фиброзного кольца и пульпозго ядра были определены в комплексе «позвонок-диск-позвонок» при контактном непрерывном и импульсном лазерном воздействии (табл. 10).

Таблица 10. Характеристики режимов лазерной обработки фиброзного кольца.

Режим Образец' мощность, Вт Тклш, мс ^возд> сек т °г 1 макс, ^ адск >%

А ФКА(10/3) 0.25 - 20 56±2 0

1 ФК1 (10/5) 0.5 - 5 64±2 63+4

1 ФК1Р (5/3) 0.5 - 5 64±2 0

2 ФК2 (4/2) 0.5 - 15 75±1 80±3

2 ФК2Р (4/2) 0.5 - 15 75±1 30±5

3 ФКЗ(8/5) 1 - 5 85±2 92+5

3 ФКЗр (4/2) 1 - 5 85±2 52±11

4 ФК4(10/3) 5 10 100 37±2 ~0

5 ФК5 (10/4) 5 50 20 76±2 60±20

общее число облученных образцов / число образцов, для которых выполнен ДСК анализ. Образцы с подрезанными внешними волокнами отмечены знаком Р.

- время импульса при частоте 1 Гц, - общее время воздействия.

Анализ КПОКТ и ГВГ изображений (рис. 35, 36) и данных термического анализа (табл. 10) выявил особенности изменения волокнистых структур коллагена при лазерной обработке ФК в комплексе П-Д-П:

- дезорганизация упаковки и переход спираль-клубок при Тмакс<Тд (режим 1);

- появление зон аморфизации матрикса в глубине ткани, где температура существенно ниже Тд (рис. 35);

- возрастание устойчивости коллагена ФК к лазерному нагреву после нарушения закрепления волокон внешней трети ФК в костной ткани;

- зависимость от скорости нагрева специфического характера модификации матрикса при Тмакс < Тд (рис. 36).

Внутреннее натяжение и закрепление волокон в костной ткани позвонка уменьшают стабильность структуры при ИК лазерном воздействии. В отличие от гидротермального нагрева, после облучения ФК в комплексе П-Д-П в режиме 1 (Тмакс<85°С) коллаген денатурирует (адсж~65%), зоны

Рисунок 35. КПОКТ изображения фиброзного кольца (интактного и с подрезанными внешними волокнами Р) после лазерного воздействия.

аморфизации

томограммах).

нарушения

волокнистой

устойчивость

на

КПОКТ После целостности структуры ее к лазерному

нагреву возрастала и оказалась сравнимой с термической стабильностью секвестрированных образцов. Переход спираль-клубок протекал лишь при Тмакс > Тд (режимы 2 и 3, рис. 35). Отсюда следует, что на развитие повреждений коллагена ФК, инициируемых ИК лазерным излучением умеренной интенсивности, оказывают значительное влияние механические процессы, связанные с потоками внутритканевой воды и деформацией сетки коллагена. Таким образом, предложенная схема лазеро-индуцироанных превращений коллагена в соединительных тканях с волокнистой структурой (рис. 33) применима и к ткани фиброзного кольца.

Влияние фототермического и фототермомеханического эффектов на модификацию матрикса зависит от соотношения между длительностью воздействия ?вюй и характерным временем температурной релаксации

которое составляло 0.1-1 с с учетом значений коэффициента температуропроводности к ~1.3' 10 7 м2 с"1 [8] и линейных размеров Ь нагретой зоны с радиусом ~ 0.2 мм и глубиной ~ 0.8 мм. Для режима А в

*гр

системе устанавливается температурное поле, близкое к стационарному {1возд>ттр)- Неравновесные явления, а следовательно, и фототермо-механический эффект минимальны: модификация волокнистых структур выглядит как плавные искажения пучков в ламеллах и волокон в пучках (рис. 36), а поскольку Тмакс < Тд, переходы спираль-клубок не детектируются («дек =0).

Рисунок 36. КПОКТ и ГВГ изображения фиброзного кольца после лазерного воздействия в режимах А, 4 и 5.

В режиме 4 нагрев приближается к адиабатическому {хиш,«хр ), и при облучении происходит распространение волн расширения-сжатия из зоны облучения в окружающую ткань. Потокам воды из зоны нагрева препятствует плотная упаковка коллагена, развиваются локальные перенапряжения и деформация сетки коллагена с последующей дезорганизацией: разволокнения фиброзных структур, прерывание и искажение хода волокон и ламелл. Все изменения вызваны фототермомеханическим эффектом воздействия, так как проявление фототермического эффекта практически исключено (Тмакс ~37°С, «дСк =0%). В полном объеме оба эффекта взаимодействия ИК лазерного излучения с тканью проявлялись при увеличении т,™„ до 50 мс (режим 5). Температура в центральной части пятна превышала Тд, и денатурация коллагена в сетке, деформированной и ослабленной за счет фототермомеханического действия лазерного излучения, носила объемный характер.

Лазеро-индуцированные изменения матрикса ФК после модификаций гиалуронидазой, трипсином и глицериновым альдегидом, моделирующих патологические и возрастные изменения, несколько отличались от превращений в интактных образцах (табл. 11, рис. 37).

После деструкции гликозаминогликанов гиалуронидазой деградация коллагена в образцах ФК1н оказалась меньше, чем в интактных образцах, что

связано с пятикратным увеличением гидравлической проницаемости [9], более свободным движением воды и ослаблением фототермомеханического эффекта лазерного воздействия. Образцы группы ФКЮ являются примером,

Таблица 11. Характеристика модифицированных образцов фиброзного кольца после лазерного воздействия.

Группа Химическая обработка Режим лазерной обработки адск,%

ФК1н Гиалуронидаза 1 (0.5Вт, 5с; Тмакс= 65 °С) -10(п=3)

ФКЗН Гиапуронидаза 3 (1Вт, 5с; Тмакс= 85 °С) -20 (п=3)

ФК1Т Трипсин 0.5Вт, 5с; Тмакс= 65 °С 55±5/50±5*(п=3)

ФКЗТ Трипсин 1Вт, 5с; Тшкс= 85 °С ~100(п=3)

ФКЮ Глицеральдегид 0.5Вт, 5с; Тмакс= 65 °С 25±2(п=3)

ФКЗй Глицеральдегид 1Вт, 5с; Т„акс= 85 °С 64±4(п=3)

'значения вычислено относительно ДНд коллагена в интактной/трипсинизированной ткани фиброзного кольца (табл. 3).

Рисунок 37. КПОКТ томограммы модифицированной ткани ФК после лазерного воздействия.

когда фототермомеханический эффект лазерного воздействия оказывается решающим для деградации коллагеновой сетки, так как термическая денатурация макромолекул невозможна вплоть до 75СС. После обработки сшивающими агентами эластичность ткани ФК уменьшается, и частота механических повреждений в материалах возрастает [10]. Действительно огдск достигала 25%, и на КПОКТ томограммах детектировались нарушения в анизотропной укладке. Очевидно, что переходы спираль-клубок протекали в механически поврежденных фибриллах и волокнах. При повышении температуры обработки до 85°С денатурация в образцах ФКЗй протекала достаточно активно (йцск=64%), однако, без полной потери двулучепреломления и образования аморфных областей. Это объясняется уменьшением подвижности полипептидных цепей после сшивки и сохранением макромолекулой своего положения в фибриллах. Максимальные повреждения (высокое значение аДСК и обширные изотропные области) отмечались у образцов, предварительно обработанных

трипсином. Этот фермент не только полностью разрушает ПГ подсистему, но и ослабляет коллагеновую сеть за счет разрушения телопептидных доменов коллагена и уменьшения взаимодействия коллагена с ПГ; в результате в образцах ФКТ при лазерном воздействии интенсивно наблюдались как повреждения коллагеновой сети, так и последующая денатурация макромолекул.

Достигаемая при ИК лазерном воздействии температура не является решающим фактором, определяющим полноту деградации коллагена в пульпозном ядре при его облучении через пункционный прокол в фиброзном кольце (табл. 12). Окружение облучаемой области тканями ФК и замыкательной пластины препятствует движению внутритканевой воды и испарению воды с поверхности образца и способствует развитию напряжений. Весьма вероятно, что именно эти отличительные особенности материальных свойств ПЯ имеют решающее значение для механических повреждений фибрилл коллагеновой сети. Самые высокие значения характерны для режимов первой группы, где изменения температуры не превышали 10°С, но благодаря высокой скорости нагрева при значительной мощности излучения, фототермомеханический эффект проявлялся наиболее ярко. Значения оказались существенно ниже при более низкой скорости нагрева во второй группе. Денатурация коллагена в образцах третьей группы является результатом воздействия, главным образом, фототермомеханического эффекта (Тмакс>Тд).

Таблица 12. Режимы облучения пулъпозного ядра в комплексе позвонок-диск-позвонок и данные о деградации коллагена в образцах.

Группа режимов 1 группа ш,= 10мс 2 группа „„ = 100 мс 3 группа = 1000 мс

Мощность излучения, Вт г 5 5 1.5 1.5 1.5 0.6

Время облучения/интервал между цугами импульсов, с 20 20 40 10/10 40 5/10 20/15

Число цугов импульсов 1 1 1 3 1 4 2

Частота, Гц 1 1 1 1 0,5 2 0,4

Тмакс» С 29±1 32±2 33±1 56±1 51±1 47±2 70±1

аДСК,% 70±3 (п=5) 74±4 (п=5) 94±4 (п=5) 25±5 (п=3) 20±5 (п=3) 27±3 (п=3) 92±5 (п=3)

Инициируемая лазерным нагревом модификация матрикса гиалиновой составляющей хряща носовой перегородки (данные представлены в разделе 4.3.4) отличается по своему характеру от термомеханической деградации коллагеновой подсистемы волокнистых тканей. Установлено, что денатурация коллагена в гиалиновом хряще незначительна. Если Тмакс не

превышала 55-60°С, то при временах облучения 1еозд до 1 минуты степень деградации коллагена ат, определенная по количеству коллагена, подверженного действию трипсина, составляла 2-5%, что соответствует ат в интактных образцах. При достижении Тмакс~70°С и выше, ат возрастала с увеличением 1возд, но не превышала 15-16% (рис. 38а). Доказательством сохранения интактных макромолекул коллагена стали данные ДСК анализа облученных и затем подвергнутых обработке трипсином образцов, на термограммах которых проявлялся эндотермический эффект денатурации коллагена (рис. 386). Сохранение в облученных образцах коллагеновой сетки, хотя и измененной, со слипшимися фибриллами, подтвердилось морфологическими исследованиями, (рис. 38в).

Е в Рисунок 38. Сохранение структуры коллагена в гиалиновом хряще носовой перегородки после ИК , лазерного воздействия: устойчивость к действию трипсина облученных образцов (а); эффект денатурации на ДСК термограммах (б) и волокнистые структуры коллагена на микрофотографии (в, окраска /. пикрофуксином, *40) облученных и затем трипсинизированных образцов.

Незначительная степень деградации коллагена в гиалиновом хр^че при ИК лазерном воздействии связана, с тем, что фототермомеханиче б 1 эффект в этой ткани не столь существенен. Иммобилизация фибрилл коллагена ПГ агрегатами предотвращает их механическую деформацию, а сопротивление потокам воды меньше, чем в волокнистых тканях (из-за более высокого значения гидравлической проницаемости ~3.0-10"им4-Н"'-с"1 [9]). В результате механические повреждения фибрилл оказываются менее значительными.

Определенная дезорганизация матрикса гиалинового хряща при лазерном нагреве, тем не менее, происходила. Ее проявления регистрировались на облученных препаратах и сводились к следующему: - уменьшение метахромазии анионных красителей (рис. 39);

36

- увеличение скорости вымывания ГАГ из хрящевой ткани в буферный раствор (табл. 13);

- изменение спектров KP (рис. 40);

- уменьшение в облученных препаратах хряща сорбционной емкости монослоя X , полученной из изотерм сорбции воды, обработанных в рамках модели БЭТ и ГАБ1 (табл. 13).

Все эти данные указывают на изменение подсистемы протеогликанов. Уменьшение метохромазии обусловлено уменьшением степени связывания анионного красителя (толуидинового синего) и указывает на дезагрегацию протеогликановых агрегатов. Это коррелирует с эффективным вымыванием ГАГ из облученных препаратов в буферный раствор.

Важная информация об изменениях компонентов

матрикса гиалинового хряща получена с помощью анализа KP спектров. Все основные характеристические частоты сохраняли свои значения, в том числе и дублет 1245-1263 см"1, связанный со сложным колебательным движением в плоскости пептидной связи (Амид III) и характеризующий трехспиральную конформацию коллагена. Изменения отмечены в широкой полосе 1000-1200 см"1, однозначно связанной с колебаниями пиранозного кольца и SOj групп ГАГ. В облученных образцах меняется соотношение интенсивностей пиков 1063 см"1 и 1046 см"1, весьма чувствительных к конформации полисахаридной цепи и взаимодействиям ГАГ-вода [10]. Эти изменения, в совокупности с уменьшением Хт, характеризующей количество доступных для молекул воды полярных групп, позволяют сделать предположение о нарушении в облученных образцах взаимодействия

б

Рисунок 39. Уменьшение метохромазии анионного красителя в облученных образцах хряща носовой перегородки (б) по сравнению с контролем (а) (окраска толуидиновым синим, *40).

Рисунок 40. Спектры КР гиалинового хряща носовой перегородки после облучения Тшкс= 70°С, /^=10 с (1)и Тмакс=80'С, ^=15 с (2).

1 Изотерма ГАБ - изотерма Гуггенгейма, Андерсона и де Бора, при выводе которой учитывает разность химических потенциалов адсорбата в толще воды и не только в первом (как в БЭТ), но и последующих адсорбционных слоях.

полярных групп биополимеров с водой, вызванного конформационными изменениями ГАГ.

Таблица 13. Изменение свойств гиалинового хряща носовой перегородки после ИК лазерного нагрева.

Образец сорбционная емкость монослоя Содержание ГАГ в буферном растворе , мг/г

ХщБЭТ ХтГАБ

Контроль 0,070±0,01 0,083±0.01 20,8±2.8

После лазерного воздействия, Т„акс=70°С, ¡тзЛ = 40 с 0.058±0,02б" 0,058±0.01б" 53,5±7.5 •

После лазерного воздействия, Т„акс=50°С, (возд= 30с 0.060±0,012" 0,064±0.01 • 34,9±8.4 •

вымывание из сухих препаратов, анализ через 26 часов после выдерживания в растворе;

статистически значимое различие от группы контроля (р<0.05);

статистически значимое различие между группами облученных образцов (р<0.05).

Высокая концентрация гликозаминогликанов, наличие ПГА, низкая доля коллагена, не образующего волокон, и более высокая гидравлическая проницаемость предопределяют гораздо меньший уровень повреждений в коллагеновой сети при лазерном нагреве гиалинового хряща, чем в случае тканей с волокнистой структурой. Однако, препятствуя потокам воды из зоны нагрева (а в тканях гиалинового хряща именно ПГА выполняет эту роль), протеогликановая подсистема претерпевает модификацию. Очевидно, что эта модификация приводит к нарушению взаимодействия протеогликановой и коллагеновой подсистем, после чего коллаген становится способен к частичной денатурации. При этом, поскольку после дезорганизации сети ПГА гидравлическая проницаемость, как правило, возрастает, то и фототермомеханический эффект ослабевает; в результате развития повреждения коллагеновой сети гиалинового хряща при умеренном лазерном нагреве не происходит. При дальнейшем повышении мощности излучения деградация коллагена носит значительно более серьезный характер.

В разделе 4.3.5 обсуждаются превращения, инициируемые ИК лазерным нагревом в жировой ткани. Основным по массе компонентом этой ткани являются жиры - триацилглицериды (ТГ), которые существуют в виде огромных капель в клетках; клетки организованы в группы - дольки, разделенные перегородками из волокон коллагена и аморфного эластина. Из-за повышенного содержания в ТГ остатков ненасыщенных кислот фазовое состояние жира человека (ЖЧ) является расплавом при температуре 20°С, в отличие от жиров запаса свиньи (ЖС) или коровы, которые представлены аморфной и не менее чем одной кристаллической фазами. При лазерном нагреве тканей поглощенная энергия расходовалась на плавление ТГ, а ткани ЖС нагревались медленнее, чем ЖЧ, и на

радиометрических кривых лазерного нагрева этих жировых тканей появлялись особенности, включая изотермическое плато (рис. 41).

1

выключение лазера

Рисунок 41. Сравнение динамики температуры поверхности при ИК лазерном нагреве (1.5 Вт) жира человека (1) и свиньи (2).

20 40 ВО SO 100 120 140 160

температура, С

Рисунок 42. Влияние лазерной обработки на термическое поведение ЖЧ: (1-3) охлаждение; (4-6) — нагрев; интактные образцы (1, 4), после лазерной обработки: Тмакс = JOT, tm3d =90 с (2,5), Тмшх~70'€, и*>=90 с (3,6).

Таблица 14. Изменение термических характеристик жировой ткани после лазерной обработки

т, Ттях Охлаждение 25°=>-30°С, 5К/мин TVC Нагрев -30°=>90°С, 10К/мин адск > % (белок)

Экзотермический переход Эндотермический переход

Т, °С Q. Дж/г Т "С Imi ^ Ош,Дж/г

Жировая ткань человека (ЖЧ)

Интактная -7.5±1.5 Отсутствует 10б±8 0

30 с, 50°С, -8,5±0,5 -20,3±0,2 3,2±0, 5 -0,б±0,3 95±10 30

90 с, 50'С, -10.9 -20,3 4,7 -1 100 48

270 с, 50°С, -14.2 -20,3 4,4 -1,8 86 78

30 с, 70°С -16±1 -20,3±0,1 4,8±1, 2 -3,5 68±8 94

Жировая ткань свиньи (ЖС)

Интактная -2,2±0,8; -13,5+1 нет 0±0,7; 29,4±0,5 95±10 0

30 с, 70°С -2,8; -14,5 нет 3±0,2; 30+0,5 93±10 56

ИК лазерное воздействие мощностью 3 и 3,5 Вт и временах до 270 с приводило к достижению максимального значения Ттах (50 или 70°С) за 2025 с, после чего температура не менялась, так как скорости отвода и

выделения тепла были равны. Анализ ИК спектров облученных образцов показал, что разрывы и образования ковалентных связей при этом не происходили. Термическое поведение ЖС после облучения не менялось, а термограммы облученных образцов ЖЧ отличались от исходных (рис. 42). С увеличением Т„акСили <воза температура кристаллизации Ткр снижалась при охлаждении в первом периоде цикла термического анализа (нагрев -охлаждение), а при нагреве второго периода цикла температура и теплота плавления (Т,ш и (^щ,) монотонно уменьшались (табл. 14). Кроме того, на кривых плавления облученных образцов ЖЧ непосредственно перед плавлением проявлялся экзотермический переход.

В общем случае при одинаковых параметрах лазерного воздействия, ТГ в жировой ткани человека претерпевали более сильный перегрев над температурой плавления по сравнению с ЖС. Такой перегрев приводил к разрушению остатков кристаллической структуры и молекулярных ассоциатов, служащих зародышами при кристаллизации. В ЖС кристаллическая фаза в соответствии с данными ДСК сохраняется до 45°С, а кратковременный локальный лазерный нагрев до 70°С не приводит к разрушению ассоциатов ТГ и остатков кристаллической структуры. В результате образующаяся при охлаждении кристаллическая модификация соответствовала исходной форме (Р'). Лазерная обработка ЖЧ до 50-70°С приводила к значительному перегреву расплава ТГ по сравнению с Тпл и, как следствие, к уменьшению размеров и разрушению ассоциатов. Заметное понижение Ткр с увеличением и Тмакс свидетельствовало о возрастающих затруднениях в образовании зародышей кристаллической фазы. При быстром охлаждении жидкого жира образовалась метастабильная а кристаллическая модификация ТГ, которая при последующем нагреве переходила в более устойчивую Р' модификацию. Уменьшение Тпл и с ростом (т3д и Тшкс свидетельствовало об уменьшении стабильности кристаллической фазы, полученной при охлаждении жировой ткани, подвергнутой лазерной обработке; это связано с увеличением доли ТГ, остающихся в жидком состоянии при переохлаждении.

Лазеро-индуцированную модификацию белков жировой ткани человека и свиньи исследовали после ее обезжиривания, обезвоживания и выделения протеиновой фракции, основным компонентов которой является коллаген. Удаление пластификаторов приводило к уменьшению сегментальной подвижности полипептидных цепей и к увеличению наблюдаемой Тд до 124°С. После лазерной обработки ДНд коллагена в протеиновой фракции уменьшалась (рис. 43), а Одск возрастала (табл. 14). Важной особенностью ДСК кривых протеиновой компоненты облученных образцов оказалось наличие аномалии в виде скачка теплоемкости при 106°С, соответствующего расстеклованию аморфных полимеров. В случае интактных (квазикристаллических) сухих белков расстеклование не проявлялось.

Рисунок 43. ДСК термограммы полипептидной фракции ЖЧ. 1 - из интактного образца, 2 -4- из образцов после лазерного нагрева: 2- 50 "С, 90 с; 3 -50°С, 270 с; 4-70 °С, 30с.

80 90 100 110 120 130

температура,°С

После лазерного облучения длительностью свыше 60 с в режиме интенсивного воздействия (мощность свыше 4 Вт, Тмакс ~ 100-130°С) происходила перестройка углеводородного скелета компонентов жировой ткани. В ИК спектре образцов отмечалось уменьшение относительной интенсивности максимума пика 3006 см"1, относящегося к валентному колебанию у.сн, и появление новых пиков с максимумами 1070 см"1 и 883см"1, относящихся, наиболее вероятно, к колебаниям эфирной и эпоксигрупп соответственно (рис. 44). Интенсивный лазерный нагрев открытых участков жировой ткани, по-видимому, приводил к окислению двойной связи кислородом воздуха. Резкое уменьшение интенсивности полосы 1655 см'1 (Амид I) указывает на значительную деградацию белковой компоненты.

Рисунок 44. Спектр ИК поглощения жировой ткани человека (1 - интактный и после лазерной обработки до температуры 7(РС; 2 - после лазерной обработки до 12СРС).

В заключение следует отметить, что характер лазеро-индуцированных превращений матрикса в значительной степени зависит от состава и архитектоники ткани. Для получения целевого эффекта лазерной обработки, следует учитывать не только термические, но и термомеханические эффекты, возникающие даже при умеренном лазерном нагреве.

Выводы:

1. Предложен подход определения состояния коллагена в соединительных тканях на всех уровнях структурной иерархии, включающий в себя:

- определение содержания основных компонентов матрикса, а именно, коллагена с оценкой его типового состав и гликозаминогликанов;

- определение конформации (тройная спираль, случайный клубок) макромолекул коллагена (методы дифференциальной сканирующей калориметрии, спектроскопии комбинационного рассеяния, устойчивость к неспецифическим протеолитическим ферментам);

- определение упаковки макромолекул в фибриллы и фибрилл в волокна (метод электронной микроскопии);

- определение укладки фибрилл в волокна и волокон в пучки и/или ламеллы (методы многофотонной микроскопии с регистрацией генерации второй гармоники, световой микроскопии);

- определение общей анизотропии ткани (методом кросс-поляризационной оптической когерентной томографии);

- определение температуры перехода Тд (температура денатурации) макромолекул коллагена из конформации тройной спирали в случайный клубок (метод дифференциальной сканирующей калориметрии).

2. На примерах тканей глаза (склера, Тенонова капсула) показана связь между отклонениями физико-химических характеристик матрикса соединительных тканей от контроля и направлением патологических изменений коллагенового каркаса ткани. Предложен и охарактеризован метод стабилизации матрикса за счет действия сшивающих агентов на коллагеновую сеть.

3. Установлено, что температура денатурации является характеристикой состояния коллагена, а ее отклонение от Тд выделенного фибриллярного коллагена определяется архитектоникой ткани, а именно:

- иммобилизацией (полной или частичной) фибрилл коллагена сеткой протеогликановых агрегатов в ткани гиалинового хряща;

- закреплением волокон коллагена фиброзного кольца в костной ткани;

- закреплением волокон коллагена надхрящницы формообразующих хрящей в зонах гиалинового хряща.

Факторы закрепления и иммобилизации влияют на энтропию случайного клубка полипептидных цепей коллагена, определяя температуру денатурации Тд=ДНд/Д8д.

4. Установлена закономерность последовательного увеличения термической стабильности коллагена в тканях, работающих преимущественно на растяжение, сжатие и сдвиг. В матриксе мениска обнаружено две подсистемы коллагена с разной термической стабильностью - круговые пучки и поперечные стяжки. Согласно установленной закономерности для этих подсистем выполнено отнесение

функций: круговые пучки противостоят растяжению, а поперечные стяжки - сдвиговым деформациям.

5. Показано, что неоднородный нагрев волокнистых тканей под действием ИК лазерного излучения приводит к повреждениям термомеханического характера. При этом деградация коллагеновой сети на всех уровнях структурной иерархии происходит при температурах, существенно более низких, чем при гидротермальном нагреве. Фактор натяжения волокон, стабилизирующий коллаген при гидротермальном нагреве, оказывает противоположное дестабилизирующее действие.

6. Предложена схема модификации коллагена в соединительной ткани с волокнистой структурой в условиях нагрева ткани ИК лазерным излучением умеренной интенсивности. Эта схема включает последовательно следующие стадии:

- локальные конформационные переходы макромолекул коллагена из тройной спирали в случайный клубок;

- локальная деформация и разрывы в фибриллярной структуре;

- перераспределение натяжения по соседним макромолекулам и разрыв ослабленных фибрилл и волокон;

- объемное плавление коллагена.

Каждая стадия предложенной схемы обусловлена фототермическим или фототермомеханическим эффектом лазерного воздействия, либо их совместным влиянием.

7. Показано, что лазеро-индуцированные превращения матрикса соединительной ткани зависят от химического состава, морфологии и материальных свойств (в том числе гидравлической проницаемости) матрикса. Наименее стабильная подсистема подвергается деградации в первую очередь и определяет непосредственный отклик матрикса. В волокнистых тканях (связка, фиброзное кольцо) дезорганизация начинается с механической деструкции коллагеновой сети, в ткани гиалинового хряща-с разрушения протеогликановой подсистемы, в жировой ткани - с плавления, разрушения ассоциатов и окисления липидов. Химические (возрастные и патологические) изменения компонентов и состава матрикса приводят к изменению механических свойств ткани, тем самым специфически влияя на первичный отклик ткани к неоднородному лазерному нагреву. Найденные закономерности дают научную основу выбора оптимального режима ИК лазерного воздействия на соединительные ткань разных типов с целью получения желаемого терапевтического эффекта.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ

ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Ignatieva N.Yu., Lunin V.V., Majorova A.F., Mudretsova S.N., , Bagratashvili V.N., Sobol E.N., Sviridov A.P. Thermoanalytical study of cartilaginous tissue // Mendeleev Communication. 2000. N 4. P. 223-224.

2. Bagratashvili N.V., Ignatieva N.Yu, Kharlanov A.N., Lunin V.V. FTIR spectroscopy of main components of cartilage // Proceedings of SPIE. 2000. V. 4241. P. 268-271.

3. Баграташвили H.B., Игнатьева Н.Ю., Лунин B.B., Свиридов А.П., Харланов А.Н. Исследование системы хондроитинсульфат - вода методом ИК-Фурье-спектроскопии // Вестник Московского Университета. Сер. 2, Химия. 2001. Т. 42. № 6. С. 373-375.

4. Игнатьева Н.Ю., Гроховская Т.Е., Лунин В.В., Баграташвили В.Н., Свиридов А.П., Махмутова Г.Ш. Лазерно-индуцированные структурные и химические изменения жировой ткани // Журнал физической химии. 2002. Т. 76. №8. С. 1357-1364.

5. Соболь Э.Н., Большунов А.В., Воробьева Н.Н., Омельченко А.И., Захаркина О.Л., Игнатьева Н.Ю., Гроховская Т.Е., Лунин В.В. Коррекция рефракции глаза путем неабляционного лазерного воздействия на термомеханические свойства роговицы и склеры // Квантовая электроника. 2002. Т. 32. № 10. С. 909-912.

6. Баграташвили В.Н., Баграташвили Н.В., Игнатьева Н.Ю., Лунин В.В., Гроховская Т.Е., Аверкиев С.В., Свиридов А.П., Шах Г.Ш. Структурные изменения в соединительных тканях при умеренном лазерном нагреве // Квантовая электроника. 2002. Т. 32. № 10. С. 913-916.

7. Ignatyeva N.Yu., Sobol E.N., Lunin V.V., Averkiev S.V., Bagratashvili V.N., Sviridov A.P., Korobov M.V. Modification of Collagen-Containing Tissues by IR Laser Radiation // Laser Physics. 2003. V. 13. N 1. P. 1-6.

8. Аверкиев C.B., Игнатьева Н.Ю., Лунин B.B., Соболь Э.Н. Влияние лазерного излучения на адсорбцию воды сухими препаратами хрящевой ткани и коллагена//Биофизика. 2003. Т. 48. №3. С. 505-510.

9. Шах Г.Ш., Свиридов А.П., Шехтер А.Б., Косминкова И.Н., Игнатьева Н.Ю., Баграташвили В.Н. Разработка методики лазерного лифтинга поверхостно-мышечной фасциальной системы // Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии. 2003. № 3. С. 25-35.

Ю.Игнатьева Н.Ю., Соболь Э.Н., Аверкиев С.В., Лунин В.В., Гроховская Т.Е., Баграташвили В.Н., Янцен Е.С. Термическая стабильность коллагена II в хряще // Доклады Академии Наук. 2004. Т. 395. № 5. С. 696-698.

11. Ignatieva N.Yu., Lunin V.V., Averkiev S.V., Maiorova A.F., Bagratashvili V.N., Sobol E.N. DSC investigation of connective tissues treated by IR-laser radiation // Thermochimica Acta. 2004. V. 422. N 1-2. P. 43-48.

12. Аверкиев C.B., Игнатьева Н.Ю., Соболь Э.Н., Лунин В.В., Баграташвили В.Н. Диагностика состояния соединительных тканей при ИК лазерном

воздействии с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния // Вестник Московского Университета. Сер. 2, Химия. 2005. Т. 46. № 1. С. 24-28.

13.Игнатьева Н.Ю., Аверкиев C.B., Соболь Э.Н., Лунин В.В. Денатурация коллагена II в хрящевой ткани при термическом и лазерном нагреве // Журнал физической химии. 2005. Т. 79. № 8. С. 1505-1513.

14. Игнатьева Н.Ю. Коллаген - основной белок соединительной ткани (обзор). // Эстетическая медицина. 2005. T. VI. № 3. С. 247-256.

15. Yansen E.S., Ignatieva N.Yu., Averkiev S.V., Shekhter A.B., Lunin V.V., and Sobol E.N. Changes in proteoglycan subsystem of cartilage as a result of infrared-laser treatment//Laser Physics. 2005. V. 15. N 12. P. 1660-1663.

16. Sobol' E.N., Baum O.I., Bol'shunov A.V, Siplivy V.l., Ignat'eva N.Y., Zakharkina O.L., Lunin V.V., Omelchenko A.I., Kamensky V.A., and Mjakov

A.V. Eye tissue structure and refraction variations upon nondestructive laser action // Laser Physics. 2006. V. 16, N 5. P. 1-6.

17.Zimnyakov D.A., Sviridov A.P., Kuznetsova L.V., Baranov S.A., Ignatieva N.Y. Monitoring of tissue thermal modification with a bundle-based full-field speckle analyzer//Applied Optics. 2006. V. 45. N 18. P. 4480-4490.

18. Игнатьева Н.Ю., Аверкиев C.B., Лунин В.В., Гроховская Т.Е., Обрезкова М.В. Влияние надмолекулярной организации хрящевой ткани на термическую стабильность коллагена // Журнал физической химии. 2006. Т. 80. № 8. С. 1336-1341.

19. Аверкиев C.B., Игнатьева Н.Ю., Соболь Э.Н., Шехтер А.Б., Баранов С.А., Обрезкова М.В., Лунин В.В. Модификация коллагеновых волокон при лазерной обработке хрящевой ткани // Вестник Московского Университета. Сер. 2, Химия. 2006. Т. 47. № 5. С. 367-373.

20. Игнатьева Н.Ю., Данилов H.A., Аверкиев C.B., Обрезкова М.В., Лунин

B.В., Соболь Э.Н. Определение гидроксипролина в тканях и оценка содержания в них коллагена // Журнал аналитической химии. 2007. Т. 62. № 1.С. 51-57.

21. Игнатьева Н.Ю., Аверкиев C.B., Иомдина E.H., Иващенко Ж.Н., Баратова Л.А., Лукашина Е.В., Лунин В.В. Изменение физико-химических характеристик склеры в результате склероукрепляющего вмешательства // Биофизика. 2007. Т. 52. № 2. С. 324-331.

22. Андреева И.В., Игнатьева Н.Ю., Аверкиев C.B., Лунин В.В., Захаркина О.Л., Обрезкова М.В. Термическая стабильность коллагена в тканях межпозвонкового диска // Вестник Московского Университета. Сер. 2, Химия. 2007. Т. 48. № 1 С. 3-8.

23.Игнатьева Н.Ю., Данилов H.A., Лунин В.В., Обрезкова М.В., Аверкиев

C.B., Чайковский Т.И. Изменение термодинамических характеристик денатурации коллагена тканей глаз в результате неферментативной гликации // Вестник Московского Университета. Сер. 2, Химия. 2007. Т. 48. № 2. С. 75-79.

24.3имняков Д.А., Свиридов А.П., Кузнецова JI.B., Баранов С.А., Игнатьева Н.Ю., Лунин В.В. Спекл-коррелометричеекий анализ кинетики термической модификации биотканей // Журнал физической химии.

2007. Т. 81. №4. С. 626-631.

25. Игнатьева Н.Ю., Захаркина О.Л., Соболь Э.Н., Лунин В.В., Каменский В.А., Андреева И.В., Аверкиев С.В., Мяков А.В. Изменение структуры коллагена фиброзного кольца при термическом и ИК лазерном воздействии. Доклады Академии Наук И 2007. Т. 413. № 6. С. 845-847.

26. Sobol E.N., Milner Т.Е., Shekhter А.В., Baum O.I., Guller A.E., Ignatieva N.Y., Omelchenko A.I., and Zakharkina O.L. Laser reshaping and regeneration of cartilage // Laser Physics Letters. 2007. V. 4. N 7. P. 488-502.

27. Ignatieva N.Yu., Zakharkina O.L., Andreeva I.V., Sobol E.N., Kamensky V.A., Myakov A.V., Averkiev S.V., and Lunin V.V. IR laser and heat-induced changes in annulus fibrosus collagen structure // Photochemistry and Photobiology. 2007. V. 83. P. 675-685.

28. Ignatieva N., Zakharkina O., Leroy G., Sobol E., Vorobieva N., and Mordon S. Molecular processes and structural alterations in laser reshaping of cartilage // Laser Physics Letters. 2007. V. 4. N 10. P. 749-753.

29. Логунова M.A., Шахова M.A., Андреева И.В., Игнатьева Н.Ю., Каменский В.А., Баграташвили В.Н. Эффект уменьшения термостабильности коллагена при нарушении целостности ткани щитовидного хряща гортани // Биофизика. 2008, Т. 53. № 5. С. 202-210.

30. Андреева И.В., Захаркина О.Л., Игнатьева Н.Ю., Каменский В.А. Эффект взаимодействия лазерного излучения с биотканями межпозвонкового диска // Альманах клинической медицины. 2008. Т. XVII. Часть 1. С. 5-8.

31.Danilov N.A., Ignatieva N.Yu., Iomdina E.N., Semenova S.A., Rudenskaya

G.N., Grokhovskaya Т.Е., Lunin V.V. Stabilization of scleral collagen by glycerol aldehyde cross-linking // Biochimica et Biophysica Acta. 2008. V. 1780. N 5. P. 764-772.

32. Ignatieva N., Zakharkina O., Andreeva I., Sobol E., Kamensky V., and Lunin V. Effects of laser irradiation on collagen organization in chemically induced degenerative annulus fibrosus of lumbar intervertebral disc // Lasers in Surgery and Medicine. 2008. V. 40. P. 422-432.

33. Ignatieva N., Zakharkina O. The role of in situ tissue constraint in collagen stability under non- and homogeneous heating // Journal of Biomechanics.

2008. V. 41. Suppl. l.P. 505.

34. Иомдина E.H., Тарутта Е.П., Игнатьева Н.Ю., Костанян И.А., Минкевич

H.И., Шехтер А.Б., Данилов Н.А., Кваацхелия Н.Г., Чернышева С.Г. Современные достижения фундаментальных исследований патогенеза прогрессирующей миопии // Российский офтальмологический журнал. 2008. Т. 1. № 3. С. 7-12.

35. Захаркина О.Л., Игнатьева Н.Ю., Иксанов P.P., Каменский В.А., Соболь Э.Н., Лунин В.В. Влияние одноосного натяжение на стабильность

коллагеновых волокон в условиях неоднородного лазерного нагрева // Журнал физической химии. 2009. Т. 83. № 2. С. 383-390.

36. Андреева И.В., Игнатьева Н.Ю., Захаркина О.Л., Лунин В.В. Лазероиндуцированная модификация коллагена в геле пульпозного ядра //Журнал физической химии. 2009. Т. 83. № 3. С. 590-592.

37. Голубятников Г.Ю., Шахова М.А., Снопова Л.Б., Терентьева А.Б., Игнатьева Н.Ю., Каменский В.А. Сравнительные исследования инфракрасного лазерного и высокочастотного воздействия на биоткани in vitro методом поляризационно-чувстительной оптической когерентной томографии // Известия высших учебных заведений. Радиофизика. 2010. Т. 53. № 1.С. 41-50.

38. Данилов H.A., Игнатьева Н.Ю. Стабилизация склеры при гликации // Вестник Казанского технологического университета. 2010. № 2. С. 11-17.

39. Данилов H.A., Игнатьева Н.Ю., Иомдина E.H., Гроховская Т.Е., Обрезкова М.В., Руденская Г.Н., Лунин В.В. Увеличение стабильность склерального коллагена в ходе гликодимирования треозой in vitro // Журнал физической химии. 2010. Т. 84. № 1. С. 131-137.

40. Ignatieva N.Y., Guller А.Е., Zakharkina O.L., Sandnes В., Shekhter A.B., Kamensky V.A., Zvyagin A.V. Laser-induced modification of the patellar ligament tissue: comparative study of structural and optical changes // Lasers in Medical Science. 2011. V. 26. N 3. P. 401-413.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность Лунину В.В. за выбор направления исследований, Баграташвили В.Н. за помощь и поддержку на всех стадиях работы, и Захаркиной О.Л. за помощь и поддержку на ключевых стадиях работы.

Автор выражает благодарность Иомдиной E.H. за помощь в постановке и решении проблемы структурных изменений тканей глаза и Соболю Э.Н. за полезные консультации. За помощь в проведении термического анализа автор благодарит Гроховскую Т.Е, аминокислотного анализа - Баратову Л.А., морфологического анализа - Шехтера А.Б., и спекл-коррелометрического анализа - Зимнякова Д.А.

Автор благодарит сотрудников ИПФ РАН Каменского В.А., Голубятникова Г.Ю., Сергееву Е.С. и Балалаеву И.В. за помощь в исследованиях методами оптической когерентной томографии и многофотонной микроскопии. Автор благодарит соавторов своих публикаций, в том числе Аверкиева C.B., Данилова H.A., Свиридова А.П. и Логунову М.А.

Автор выражает глубокую благодарность своим первым наставникам в научной работе Егоровой Г.В., Житневу Ю.Н. и Тимофееву В.В. и всем сотрудникам лаборатории КГЭ кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Список цитированной литературы

1. Иомдина Е.Н., Тарутта Е.П., Андреева Л.Д., Иващенко Ж.Н., Маркосян Г.А., Шкуренко С.И. // Рефракционная хирургия и офтальмология. 2005. №4. с. 19-23.

2. Buckwalter J.A. Aging and degeneration of the human intervertebral disc. Review// Spine. 1995. V. 20.N 11. P. 1307-1314.

3. Buckwalter J.A., Roughley P.I., Rosenberg L.C. Age-related changes in cartilage proteoglycans: quantitative electron microscopic studies // Microscopy Res. Techn. 1994. V. 28. P. 398-408.

4. Valiyaveettil M., Mort J.S., McDevitt C.A. The concentration, gene expression, and spatial distribution of aggrecan in canine articular cartilage, meniscus, and anterior and posterior cruciate ligaments // Connective Tissue Res. 2005. V. 46. P. 83-91.

5. Kambic H.E., McDevitt C.A. Spatial organization of types I and II collagen in the canine meniscus //J. Orthop. Res. 2005. V. 23. P. 142-149.

6. Лазерная инженерия хрящей. / Под ред. В.Н. Баграташвили, Э.Н. Соболя, А.Б. Шехтера. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2006. С. 342

7. Weiss J.A., Maakestad B.J. Permeability of human medial collateral ligament in compression transverse to the collagen fiber direction // J. Biomech. 2006. V.39.P. 276-283.

8. Jacques S.L. Laser-tissue interactions. Photochemical, photothermal, and photomechanical // Surg. Clin. North. Am. 1992. V. 72. P. 531-558.

9. Perie D.S., Maclean J.J., Owen J.P., Iatridis J.C. Correlating material properties with tissue composition in enzymatically digested bovine annulus fibrosus and nucleus pulposus tissue // Ann. Biomed. Eng. 2006. V. 34. P. 769-777.

10. Iatridis J.C. and ap Gwynn I. Mechanisms for mechanical damage in the intervertebral disc annulus fibrosus // J. Biomech. 2004. V. 37. P. 1165-1175.

11. Rotter N., Tobias G., Lebl M. Age-related changes in the composition and mechanical properties of human nasal cartilage // Arch. Biochem. Biophys. 2002. V. 403. P. 132-140.

12. Servaty R., Schiller J., Binder II., Arnold K. Hydration of polymeric components of cartilage - an infrared spectroscopic study on hyaluronic acid and chondroitin sulfate // Int. J. Biol. Macromol. 2001. V. 28. P. 121-127.

Список сокращений

Химические соединения: Ну1 - гидроксипролин, специфичная для коллагена аминокислота; Hyp - гидроксипролин, специфичная для коллагена аминокислота; Gly - глицин, аминокислота; Ala - аланин, аминокислота; ГА - глицериновый альдегид;

КПГ - конечные продукты гликации. Гликация начинается с реакции между альдегидными группами простых Сахаров и их метаболитов и аминогруппами боковых цепей белка и, в конечном итоге, приводит к образованию поперечных сшивок между макромолекулами белка; ГАГ - гликозаминогликаны, сульфатированные и карбоксилированные полисахариды, содержащие N - ацетильную группу в каждом втором мономерном звене;

ПГ - протеогликаны, состоящие из белкового стержня и присоединенных к нему гликозиднымй связями гликозаминогликанов;

ПГА - протеогликановые агрегаты, в которых протеогликаны присоединены нековалентными связями к стержню гиалуроновой кислоты с помощью связующего белка.

Методы:

ГВГ - генерация второй гармоники;

КПОКТ - кросс-поляризационная оптическая когерентная томография; ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия; ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия.

Ткани:

ФК - фиброзное кольцо межпозвонкового диска;

ПЯ - пульпозное ядро межпозвонкового диска;

ЗП - замыкательная пластина межпозвонкового диска;

П-Д-П - позвонок-диск-позвонок, комплекс, включающий два костных тела

позвонков и межпозвонковый диск;

ЖЧ - жировая ткань человека;

ЖС - жировая ткань свиньи.

Ведение.

Глава 1. Основные компоненты и надмолекулярная организация соединительных тканей

1.1. Коллаген. Химический состав и иерархическая организация.

1.2. Гликозаминогликаны, протеогликаны и протегликановые агрегаты.

1.3. Взаимодействие коллагена и протеогликанов. Надмолекулярная организация матрикса.

1.4. Физико-химическое описание денатурации коллагена.

Глава 2. Методы контроля состояния матрикса соединительных тканей.

2.1. Количественное определение основных компонентов соединительных ткани.

2.1.1. Определение содержания коллагена.

2.1.2. Определение содержания гликозаминогликанов.

2.2. Протеолитические ферменты как зонды нативной конформации коллагена.

2.3. Дифференциальная сканирующая калориметрия.

2.4. ИК и КР спектроскопия.

2.5. Многофотонная микроскопия с регистрацией генерации второй гармоники.

2.6. Поляризационно-чувствительная оптическая когерентная томография.

2.7. Сорбция паров воды биологическими объектами.

2.8. Морфологический анализ с помощью световой и электронной микроскопии.

2.9. Спекл-коррелометрия.

Выявление взаимосвязи структуры и функции материала является общей-естественнонаучной проблемой. При этом стабильность объекта, являясь, с одной стороны, характеристикой структуры, с другой - напрямую определяется его функцией. Таким образом, возникает триада функция — структура - стабильность. В этой триаде стабильность является понятием достаточно общим, включающим в себя устойчивость к термическому, механическому, химическому и другим воздействиям. Не умаляя значение остальных аспектов, отметим, что для физической химии термическая стабильность играет особую роль, так как на основе именно этой характеристики мы определяем (или оцениваем) основные термодинамические функции (или их изменение) и, как следствие, используем аппарат термодинамики для описания состояния системы и ее изменения.

В определении физической химии как науки, «объясняющей на основании положений и опытов физики то, что происходит в смешанных телах при химических операциях» (М.В. Ломоносов), не содержится ограничений на выбор объекта физико-химического исследования. Однако мы понимаем, что строгое количественное описание в рамках общепризнанных моделей применяется для простых систем. Для сложных, многокомпонентных, многофазных объектов количественная характеристика затруднительна. Это не означает, что такие объекты не подчиняются основным физико-химическим законам. Первым этапом для описания сложных систем является выявление качественных закономерностей поведения и оценка самых общих термодинамических свойств, что дает возможность анализа структурно-функциональной связи в объекте. К таким свойствам относится термическая стабильность.

Соединительные ткани в организме выполняют одну функцию - механическую, но в разных вариантах: защита, опора, сочленение, объединение, передача нагрузки и прочее. Главным компонентом соединительных тканей является коллаген, который составляет треть от всех белков у млекопитающих. Все вариации надмолекулярной организации, архитектоники и функций соединительных тканей от твердой кости и прочной связки до прозрачной роговицы или гелеобразного пульпозного ядра определяются способом укладки этого белка и его взаимодействием с другими макромолекулами внеклеточного матрикса. Решение вопроса о том, как термическая стабильность коллагена отражает структуру и функцию ткани представляется, на наш взгляд, интересным аспектом освещения проблемы функция - структура - стабильность. Физико-химические исследования соединительных тканей в некоторой степени облегчаются тем, что доля клеток по массе и объему невелика (-10%), а большая часть представлена внеклеточным матриксом.

Данные о термостабильности выделенного коллагена (в растворе и волокнах) широко освещены в литературе и количественные термодинамические характеристики перехода макромолекул белка из нативной упорядоченной конформации в форму случайного клубка - температура и энтальпия денатурации (Тд и ДНд) установлены. Такая информация для коллагена в ткани крайне скудна и не систематизирована, хотя получение ее методом дифференциальной сканирующей калориметрии не представляет труда. Рассматривая же триаду структура-функция-стабильность Тд и ДНд могут быть использованы для характеристики состояния коллагена в ткани, в том числе и для тканей с измененной структурой, а следовательно, и функцией. Практическая выгода такого подхода очевидна. Во-первых, это диагностика патологических изменений в ткани, которые приводят к отклонениям от оптимального функционирования. Во-вторых, это первый шаг структурного исследования заменителей ткани (т.н. коллагенсодержащих биопротезов и скаффолдов). Наконец, это метод определения, состояния коллагена, в ткани, подвергнутой целевой модификации. Разработка подходов модификации соединительных тканей для изменения ее механических свойств в настоящее время не только обсуждается в литературе, но и внедряется в медицинскую практику.

Значительное место в современных медицинских технологиях отводится методу локальной гипертермии, когда первичный эффект либо напрямую связан с денатурацией коллагена, либо достигается при нагреве выбранного участка ткани до температуры, соответствующей или несколько превышающей начало денатурации. Локальный нагрев разных тканей осуществляется с помощью либо ИК лазера, либо СВЧ поля, либо электрическим током. К сожалению, условия воздействия (такие как, например, температура и время нагрева) устанавливаются на основе небольшой выборки экспериментальных данных, и результаты обработок зачастую оказываются непредсказуемы и субоптимальны. Таким образом, существует насущная потребность научного обоснования применения метода локального нагрева в клинической практике.

Лазерная медицина как научное направление является частью биофотоники — междисциплинарного раздела о взаимодействии света с живыми системами. Физическую основу биофотоники составляют оптика и спектроскопия. Однако описание результатов лазерной модификации биологических систем в научном сообществе, естественно, дается на основе аппарата химической термодинамики или кинетики, и, заметим, не всегда корректно. При анализе экспериментальных исследований редко принимается во внимание отличительные черты состава и архитектоники ткани. Однако специалисты-химики зачастую не участвуют в обсуждении результатов и разработке научных основ локальной гипертермии соединительных тканей.

Настоящая работа, направленная на исследование стабильности коллагена в соединительных тканях различного типа, состоит из двух частей. В первой части обосновывается использование термической стабильности, как структурной и функциональной характеристики матрикса соединительных тканей различного типа, а во второй - исследуется устойчивость этих тканей в условиях неоднородного лазерного нагрева. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, тема «Химические реакции в разрядах и при фотохимическом и лазерном инициировании», № гос. регистрации 01.200.115171. В течение 10 лет исследования осуществлялись при финансовой поддержке РФФИ (проекты №№ 99-02- 16855-а, 00-02-16263-а, 01-02-17743-а, 02-02-16246-а, 04-02-16743-а, 05-02-16902-а, 06-08-00950-а, 07-02-12080-офи, 07-08-00448-а, 08-02-00583-а, 09-02-00714-а), в том числе проектом № 07-02-00749-а, руководителем которого автор диссертации непосредственно являлся. Работа поддерживалась также грантами АФГИР (1ШР2-2660-М0-05) и МНТЦ (3360). Цели работы

1. Охарактеризовать состояние коллагена в соединительных тканях и установить взаимосвязь между структурными и термодинамическими параметрами стабильности коллагена в этих тканях с применением современных физико-химических методов.

2. Определить особенности действия локального лазерного нагрева на матрикс соединительных тканей и выявить факторы, определяющие стабильность коллагена в этих условиях.

Научная новизна

- Впервые проведено систематическое исследование термической стабильности коллагена в тканях с разной архитектоникой и химическим составом матрикса. Выявлена взаимосвязь между термодинамическими параметрами денатурации коллагена и свойствами матрикса. Установлено, что иммобилизация фибрилл и волокон коллагена за счет взаимодействия с сеткой протеогликановых агрегатов или внедрения их в более плотную ткань является важнейшим фактором стабильности коллагена в ткани. Нарушение целостности единой структуры органа приводит к значительному уменьшению термической стабильности коллагена.

- Впервые показано, что использование термодинамических характеристик денатурации коллагена в соединительных тканях совместно с химическим анализом и данными оптических методов визуализации, позволяет определять состояние коллагена в тканях и его изменения в результате патологических процессов или целевой модификации.

Разработанный в диссертации подход является достаточно эффективным и информативным методом определения структурных и функциональных особенностей матрикса соединительных тканей, а также их изменений при различных воздействиях на ткань.

- Впервые выявлено принципиальное различие в поведения коллагеновой сети в тканях с волокнистой структурой при осуществлении гидротермального и ИК лазерного нагрева умеренной интенсивности. Это различие обусловлено развитием механической дезорганизации упаковки коллагена в условиях нестационарного и неоднородного в пространстве температурного поля при ИК лазерном воздействии (фототермомеханический эффект). Показано, что при ИК лазерном нагреве денатурация коллагена в тканях возможна при температурах более низких, чем температура денатурации коллагена в калориметрической ячейке. Предложена схема модификации волокнистых структур ИК лазерным излучением умеренной интенсивности.

- Впервые показано, что характер изменений матрикса и его коллагеновой подсистемы зависит от состава и надмолекулярной организации матрикса ткани. В частности, в гиалиновом хряще носовой перегородки. дезорганизацию претерпевает главным образом протеогликановая подсистема, а в жировой ткани — подсистема триацилглицеридов. Практическая значимость

- Разработанная методология комплексного физико-химического анализа соединительных тканей, включающая термический и химический анализы, а также методики оптической диагностики, однозначно характеризует состояние коллагена в тканях, что дает молекулярную основу для разработки новых методов коррекции функции тканей.

- Обнаруженный фототермомеханический эффект воздействия - ИК лазерного излучения умеренной интенсивности на соединительные коллагенсодержащие ткани, приводящий к дезорганизации матрикса ткани, необходимо учитывать при разработке клинических методов модификации ткани с использованием лазерных технологий. Выявленная корреляция между составом и архитектоникой ткани и ее откликом на неоднородный нагрев дает важный вклад в разработку научных основ метода локальной гипертермии коллагенсодержащих тканей с патологическими изменениями.

Полученные в работе данные позволяют предсказать степень деградации соединительной ткани при термическом и ИК лазерном воздействии и дают научную основу выбора режимов ИК лазерного воздействия, обеспечивающего желаемый терапевтический эффект.

259 Выводы

1. Предложен подход определения состояния коллагена в соединительных тканях на всех уровнях структурной иерархии, включающий в себя:

- определение содержания основных компонентов матрикса, а именно, коллагена с оценкой его типового состав и гликозаминогликанов;

- определение конформации (тройная спираль, случайный клубок) макромолекул коллагена (методы дифференциальной сканирующей калориметрии, спектроскопии комбинационного рассеяния, устойчивость к неспецифическим протеолитическим ферментам);

- определение упаковки макромолекул в фибриллы и фибрилл в волокна (метод электронной микроскопии);

- определение укладки фибрилл в волокна и волокон в пучки и/или ламеллы (методы многофотонной микроскопии с регистрацией генерации второй гармоники, световой микроскопии);

- определение общей анизотропии ткани (методом кросс-поляризационной оптической когерентной томографии);

- определение температуры перехода Тд (температура денатурации) макромолекул коллагена из конформации тройной спирали в случайный клубок (метод дифференциальной сканирующей калориметрии).

2. На примерах тканей глаза (склера, Тенонова капсула) показана связь между отклонениями физико-химических характеристик» матрикса соединительных тканей от контроля и направлением патологических изменений коллагенового каркаса ткани. Предложен и охарактеризован метод стабилизации матрикса за счет действия сшивающих агентов на коллагеновую сеть.

3. Установлено, что температура денатурации является характеристикой состояния коллагена, а ее отклонение от Тд выделенного фибриллярного коллагена определяется архитектоникой ткани, а именно:

- иммобилизацией (полной или частичной) фибрилл коллагена сеткой протеогликановых агрегатов в ткани гиалинового хряща;

- закреплением волокон коллагена фиброзного кольца в костной ткани;

- закреплением волокон коллагена надхрящницы формообразующих хрящей в зонах гиалинового хряща.

Факторы закрепления и иммобилизации влияют на энтропию случайного клубка полипептидных цепей коллагена, определяя температуру денатурации Тд=ДНд/Д8д.

4. Установлена закономерность последовательного увеличения термической стабильности коллагена в тканях, работающих преимущественно на растяжение, сжатие и сдвиг. В матриксе мениска обнаружено две подсистемы коллагена с разной термической стабильностью - круговые пучки и поперечные стяжки. Согласно установленной закономерности для этих подсистем выполнено отнесение функций: круговые пучки противостоят растяжению, а поперечные стяжки — сдвиговым деформациям.

5. Показано, что неоднородный нагрев волокнистых тканей под действием ИК лазерного излучения приводит к повреждениям термомеханического характера. При этом деградация коллагеновой сети на всех уровнях структурной иерархии происходит при температурах, существенно более низких, чем при гидротермальном нагреве. Фактор натяжения волокон, стабилизирующий коллаген при гидротермальном нагреве, оказывает противоположное дестабилизирующее действие.

6. Предложена схема модификации коллагена в соединительной' ткани- с волокнистой структурой в условиях нагрева ткани ИК лазерным излучением умеренной интенсивности. Эта схема включает последовательно следующие стадии:

- локальные конформационные переходы макромолекул коллагена из тройной спирали в случайный клубок;

- локальная деформация и разрывы в фибриллярной структуре;

- перераспределение натяжения по соседним макромолекулам и разрыв ослабленных фибрилл и волокон;

- объемное плавление коллагена.

Каждая стадия предложенной схемы обусловлена фототермическим или фототермомеханическим эффектом лазерного воздействия, либо их совместным влиянием.

7. Показано, что лазеро-индуцированные превращения матрикса соединительной ткани зависят от химического состава, морфологии и материальных свойств (в том числе гидравлической проницаемости) матрикса. Наименее стабильная подсистема подвергается деградации в первую очередь и определяет непосредственный отклик матрикса. В волокнистых тканях (связка, фиброзное кольцо) дезорганизация начинается с механической деструкции коллагеновой сети, в ткани гиалинового хряща - с разрушения протеогликановой подсистемы, в жировой ткани - с плавления, разрушения ассоциатов и окисления липидов. Химические (возрастные и патологические) изменения компонентов и состава матрикса приводят к изменению механических свойств ткани, тем самым специфически влияя на первичный отклик ткани к неоднородному лазерному нагреву. Найденные закономерности дают научную основу выбора оптимального режима ИК лазерного воздействия на соединительные ткань разных типов с целью получения желаемого терапевтического эффекта.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность Лунину В.В. за выбор направления исследований, Баграташвили В.Н. за помощь и поддержку на всех стадиях работы и Захаркиной О.Л. за помощь и поддержку на ключевых стадиях работы. Автор выражает благодарность Иомдиной E.H. за помощь в постановке и решении проблемы структурных изменений тканей глаза и Соболю Э.Н. за полезные консультации. За помощь в проведении термического анализа автор благодарит Гроховскую Т.Е, аминокислотного анализа - Баратову Л.А., морфологического анализа - Шехтера А.Б., и спекл-коррелометрического анализа - Зимнякова Д.А.

Автор благодарит сотрудников ИПФ РАН Каменского В.А., Голубятникова Г.Ю., Сергееву Е.С. и Балалаеву И.В. за помощь в исследованиях методами оптической когерентной томографии и многофотонной микроскопии.

Автор благодарит соавторов своих публикаций, в том числе Аверкиева C.B., Данилова H.A., Свиридова А.П. и Логунову М.А.

Автор выражает глубокую благодарность своим первым наставникам в научной работе Егоровой Г.В., Житневу Ю.Н. и Тимофееву В.В. и всем сотрудникам лаборатории КГЭ кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. I !

1. Павлова В.Н., Копьева Т.П., Слуцкий Л.И., Павлов Г.Г. Хрящ. М.: Наука, 1988. 325 с.

2. Михайлов А.Н. Коллаген кожного покрова и основы его переработки. М.: Легкая индустрия, 1971. 527 с.

3. Степанов В.М. Молекулярная биология. М.: Высшая школа. 1996. 337 с.

4. Fratzl P., ed. Collagen structure and mechanics. New York: Springer. 2008.

5. Van der Rest M. and Garrone R. Collagen family of proteins. FASEB J. 1991; 5:28142823.

6. Prockop D.J. and Fertal A. The collagen fFibril: the almost crystalline structure J. Struct. Biol. 1998; 122:111-118.

7. Ottani V., Raspanti M., Ruggeri A. Collagen structure and functional implications Micron 2001;32:251-260.

8. Holmes D.F., Graham H.K., Trotter J. A., Kadler K.E. STEM/TEM studies of collagen fibril assembly. Micron 2001; 32(3):273-285.

9. Ottani V., Martini D., Franchi D., Ruggeri D., Raspanti M. Hierarchical structures in fibrillar collagens. Micron 2002; 33:587-596.

10. Gelse К., РшсЫ E., Aigner T. Collagens structure, function, and biosynthesis. Adv. Drug Deliv. Rev. 2003; 55:1531-1546.

11. Wess T.J. Collagen fibril form and function. Adv. Protein. Chem. 2005; 70:341-374.'

12. Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 2003; 31:3784-3788.

13. Herbage D., Bouillet J., Bernengo J-C. Biochemical and physicochemical characterization of pepsin-solubfllzed type-II collagen from bovine articular cartilage, Biochem, J. 1977; 161:303-312.

14. Blumenkrantz N., Asboe-Hansen G. Hydroxyproline to hydroxy lysine molar ratio indicates collagen type. Acta Derm. Venereol. 1978; 58:111-115.

15. Eyre D.R., Wu J.J. Collagen of fibrocartilage: A distinctive molecular phenotype in bovine meniscus, FEBS Lett. 1983; 158:265-270.

16. Eyre D.R., Muir H. The distrbution of different molecular species of collagen in fibrous, elastic and hyaline cartilages of the pig. Biochem. J. 1975; 151:595-602.

17. Burgeson R.E., Hebda P.A., Morris N.P., Hollister D.W. Human cartilage collagens. Comparison of cartilage collagens with human type V collagen. J. Biol. Chem. 1982; 257(13):7852-7856.

18. Cetta G., Tenni R., Castellani A.A. A simple method for quantitative estimation of collagen type III to type I ratio in soft tissues. Ital. J. Biochem. 1979; 28(3): 163-172.

19. Rich A., Crick F.H.C. The structure of collagen. Nature 1955; 176:915-916.

20. Cowan P.M., McGavin S., North A.C.T. The polypeptide chain configuration of collagen. Nature 1955; 176:1062-1064.

21. Мильчевский Ю.В., Жоров B.C., Есипова Н.Г., Туманян В.Г. Структура коллагена с новой сеткой водородных связей. Биоорг. Химия 1999; 25(5):348-357.

22. Ramachandran G.N., Bansal М., Bhatnagar R.S. A hypothesis on the role of hydroxyproline in stabilizing collagen structure. Biochim. Biophys. Acta 1973; 322:166-171.

23. Бурджанадзе T.B. Термодинамическое обоснование водно-мостиковой структуры коллагена. Биофизика 1992; 37(2):231-237.

24. Bella J., Brodsky В., Berman Н.М. Hydration structure of a collagen peptide. Structure 1995; 3:893-906.

25. Doyle B.B., Bendit E.G., Blout E.R. Infrared spectroscopy of collagen and collagen-like polypeptides. Biopolymers 1975; 14:937-957.

26. Lazarev Yu.A., Grishkovsky B.A., Khromova T.B. Bound water in the collagen-like triple-helical structure. Biopolymers 1992; 32:189-195.

27. Leikin S., Parsegian V.A., Yang W.-H. Raman spectral evidence for hydration forces between collagen triple helices. PNAS 1997; 94: 11312-11317.

28. Lazarev Yu.A., Grishkovskii B.A., Khromova T.B. Amide I band of IR spectrum and structure of collagen and related polypeptides. Biopolymers 1985; 24:1449.

29. Susi H. Ard J.S., Carroll R.J. The infrared spectrum and water binding of collagen as a function of relative humidity. Biopolymers 1971; 10:1597-1604.

30. Lafleur M., Pigeon M., Pizolet M. Raman spectrum of interstitial water in biological system. J. Phys. Chem. 1989; 93:1522-1526.

31. Shibata Т., Tonan K., Yasuda Т., Ikawa Sh.-I. FT-IR study of water desorption from collagen films. Appl. Spectrosc. 1997; 51(3): 337-339.

32. Wallace D.G., Thompson A. Description of collagen fibril formation by a theory of polymer crystallization. Biopolymers 1983; 22:1793-1811.

33. Kuznetsova N., Leikin S. Does the triple helical domain of type I collagen encode molecular recognition and fiber assembly while telopeptides serve as catalytic domains? J. Biol. Chem. 1999; 274(51):36083-36088.

34. Malone J.P., George A., Veis A. Type I collagen N-telopeptides adopt an ordered structure when docked to their helix receptor during fibrillogenesis. Proteins 2004; 54:206-215.

35. Orgel J.P., Wess T.J., Miller A. The in situ conformation and axial location of the intermolecular cross-linked non-helical telopeptides of type I collagen. Structure 2000; 8(2): 137-142.

36. Манделькерн JI. Кристаллизация полимеров. М.-Л.: Химия. 1966. 336 с.

37. Baer Е., Hiltner A., Keith H.D. Hierarchical structure in polymeric materials. Science 1987; 235(4792): 1015-1022.

38. Raspanti M., Congiu Т., Guizzardi S. Structural aspects of the extracellular matrix of the tendon: an atomic force and scanning electron microscopy study. Arch. Histol. Cytol. 2002; 65(l):37-43.

39. Raspanti M., Alessandrini A., Ottani V., Ruggeri A. Direct visualization of collagen-bound proteoglycans by tapping-mode atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 1997; 119(2):118-122.

40. Piez K.A. Structure and assembly of the native collagen fibril. Connect. Tissue Res. 1982; 10:25-33.

41. Meek K.M., Chapman J.A., Hardcastle R.A. The staining pattern of collagen fibrils. Improved correlation with sequence data. J. Biol. Chem. 1979; 254(21):10710-10714.

42. Meek K.M., Quantock A.J. The use of X-ray scattering techniques to determine corneal ultrastructure. Prog. Retin. Eye Res. 2001; 20(1):95-137.

43. Bigi A., Cojazzi G., Roveri N., Koch M.H.J. Differential scanning calorimetry and X-ray diffraction study of tendon collagen thermal denaturation Int. J. Biol. Macromol. 1987; 9:363367.

44. Parry D.A. The molecular and fibrillar structure of collagen and its relationship to the mechanical properties of connective tissue. Biophys. Chem. 1988; 29(l-2):195-209.

45. Silver F.H., Kato Y.P., Ohno M., Wasserman A.J. Analysis of mammalian connective tissue: relationship between hierarchical structures and mechanical properties. J. Long Term. Eff. Med. Implants 1992; 2(2-3): 165-198.

46. Sander E.A., Nauman E.A. Permeability of musculoskeletal tissues and scaffolding materials: experimental results and theoretical predictions. Crit. Rev. Biomed. Eng. 2003; 31(1-2):l-26.

47. Hansen U., Masouros S., Amis A. A. Material properties of biological tissues related to joint surgery. Curr. Orthop. 2006; 20:16-22.

48. Bailey A. J., Paul R.G., Knott L. Mechanisms of maturation and ageing of collagen. Mech. Ageing Dev. 1998; 106(l-2):l-56.

49. Reiser K., McCormick R.J., Rucker R.B. Enzymatic and nonenzymatic cross-linking of collagen and elastin. FASEB J. 1992; 6(7):2439-2449.

50. Paul R.G., Bailey A.J. Glycation of collagen: the basis of its central role in the late complications of ageing and diabetes. Int. J. Biochem. Cell Bid. 1996; 28( 12): 1297-1310.

51. Muir H., Hardingham T.E. MTP International review of science. Series 1. ed. W.J. Whelan. London: Butterworths. 1975; 5:153.

52. Bansil R., Yannas I.V., Stanley H. Raman spectroscopy: a structural probe of glycosaminoglycans. Biochim. Biophys. Acta 1978; 541(4):535-542.

53. Cael J.J., Isaac D.H., Blackwell J., Koenig J.L. Polarized infrared spectra of crystalline glycosaminoglycans. Carbohydr. Res. 1976; 50(2): 169-179.

54. Potter K., Kidder L.H., Levin I.W., Lewis E.N., Spencer R.G.S. Imaging of collagen and proteoglycan in cartilage sections using Fourier transform infrared spectral imaging. Arthritis&Rheumatism 2001; 44(4):846-855.

55. Servaty R., Schiller J., Binder H., Arnold K. Hydration of polymeric components of cartilage—an infrared spectroscopic study on hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Int. J. Biol. Macromol. 2001; 28(2):121-127.

56. Kaufmann J., Mohle K., Hofmann H.J., Arnold K. Molecular dynamics of a tetrasaccharide subunit of Chondroitin 4-sulfate in water. Carbohydr. Res. 1999; 318:1-9.

57. Bathe M., Rutledge G.C., Grodzinsky A.J., Tidor B. Molecular modeling of GAGs: investigating the relationship between chemical composition, molecular structure, and in vivo aggrecan structure and function. ORS 50th Annual Meeting 2004; Paper No 0049K.

58. Schneiderman R., Maroudas A., Parker K.H., Winlove C.P., Ehrlich S., Wolff N. The osmotic pressure of chondroitin sulphate solutions: Experimental measurements and theoretical analysis. Bioreology 1998; 35(6):383-397.

59. Heinegard D., Sommarin Y. Proteoglycans: an overview. Methods Enzymol. 1987; 144:305-319.

60. Poole A.R. Proteoglycans in health and disease: structures and functions. Biochem J. 1986; 236(1): 1—14.

61. Vogel K.G. Glycosaminoglycans and proteoglycans. In: Yurchenco P.D., Birk D.E., Mecham R.P., eds. Extracellular matrix assembly and structure. San Diego-New York-Boston: Academic Press, Inc. 1994:243-280.

62. Scott J.E. Extracellular matrix, supramolecular organisation and shape. J. Anat. 1995; 187(2):259-269.

63. Svensson L., Oldberg A., Heinegard D. Collagen binding proteins. Osteoarthritis Cartilage 2001; 9(Suppl A):S23-28.

64. Hardingham T.E. Cartilage: aggrecan-hyaluronan-link protein aggregates. In: Hascall V.C. and Yanagishita M., eds. Science of hyaluronan today. 1998. Available at: http://www.glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA05/HA05E.html.

65. Campacho N.P., West P., Torzilli P.A., Mendelson R. FTIR microscopic imaging of collagen and proteoglycan in bovine cartilage. Biopolymers (Biospectroscopy) 2001; 62:1-8.

66. Hardingham T.E., Ewins R.J.F., Muir H. Cartilage proteoglycans. Structure and heterogeneity of the protein core and the effects of specific protein modifications on the binding to hyaluronate. Biochem. J. 1976; 157:127-143.

67. Muir H. The chondrocyte, architect of cartilage. Biomechanics, structure, function and molecular biology of cartilage matrix macromolecules. BioEssays 1995; 17(12):1039-1048.

68. Jamieson A.M., Blackwell J., Reihanian H., Ohno H., Gupta R. Thermal and solvent stability of proteoglycan aggregates by qasielastic laser light-scattering. Carbohydrate Res. 1987; 160: 329-341.

69. Ng L., Grodzinsky A.J., Patwari P., Sandy J., Plaas A., Ortizd Ch. Individual cartilage aggrecan macromolecules and their constituent glycosaminoglycans visualized via atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 2003; 143:242-257.

70. Buckwalter J.A., Roughley P.J., Rosenberg L.C. Age-related changes in cartilage croteoglycans: quantitative electron microscopic studies. Microsc. Res. Tech. 1994; 28:398408.

71. Veis A., George A. Fundamentals of interstitial collagen assembly. In: Yurchenco P.D., Birk D.E., Mecham R.P., eds. Extracellular matrix assembly and structure. San Diego-New York-Boston: Academic Press, Inc. 1994:15-47.

72. Heinegard D., Paulsson M. Cartilage. Methods Enzymol. 1987; 144:336-363.

73. Viola M., Bartolini B., Sonaggere M., Giudici C., Tenni R., Tira M.E. Fibromodulin interactions with type I and II collagens. Connect. Tissue Res. 2007; 48(3): 141-148.

74. Scott J.E. Proteoglycan-fibrillar collagen interaction. Biochem. J. 1988; 252:313-323.

75. Scott J.E. Proteoglycan: collagen interactions and subfibrillar structure in collagen fibrils. Implications in the development and ageing of connective tissues J. Anat. 1990; 169:23-35.

76. Junqueira L.C., Montes G.S. Biology of collagen-proteoglycan interaction. Arch. Histol. Jpn. 1983; 46(5):589-629.

77. Parry D.A.D., Flint M.H., Gillardt G.C., Craig A.S. A role for glycosaminoglycans in the development of collagen fibrils. Hypothesis. FEBS Lett. 1982; 149(1): 1-7.

78. Mbller LJ, Pels E, Schurmans LR, Vrensen GF A new three-dimensional model of the organization of proteoglycans and collagen fibrils in the human corneal stroma. Exp. Eye Res. 2004; 78(3):493-501.

79. Fratzl P., Daxer A. Structural transformation of collagen fibrils in corneal stroma during drying an x-ray scattering study. Biophys. J. 1993; 64:1210-1214.

80. Young R.D. The ultrastructural oOrganization of proteoglycans and collagen in human and rabbit scleral matrix. J. Cell Sci. 1985; 74:95-104.

81. Watson P.G., Young R.D. Scleral structure, organisation and disease. Exp. Eye Res. 2004; 78:609-623.

82. Poole A.R., Pidoux I., Reiner A., and Rosenberg L. An immunoelectron microscope study of the organizationof proteoglycan monomer, link protein, and collagen in the matrix of articular cartilage. J.Cell Biol. 1982; 93:921-937.

83. Mow V.C., Ratcliffe A., Poole A.R. Cartilage and diarthrodial joints as paradigms for hierarchical materials and structures. Biomaterials 1992; 13(2):67-97.

84. Broom N.D., Marra D.L. New structural concepts of articular cartilage demonstrated with a physical model. Connect. Tissue Res. 1985; 14(1): 1-8.

85. Akizuki S., Mow V.C., Muller F., Pita J.C., Howell D.S., Manicourt D.H. Tensile properties of human knee joint cartilage: I. Influence of ionic conditions, weight bearing, and fibrillation on the tensile modulus. J. Orthop. Res. 1986; 4(4):379-392.

86. Bank R.A., Krikken M., Beekman В., Stoop R., Maroudas A., Lafeber F.P.J.G., Koppele J.M. A simplified measurement of degradated collagen in tissues: application in healthy, fibrillated and osteoarthritic cartilage. Matrix Biol. 1997; 16:233-243.

87. Mow Y.C., Holmes M.H., Lai W.M. Fluid transport and mechanical properties of articular cartilage.J. Biomech. 1984; 17(5):377-394.

88. Жоли M. Физическая химия денатурации белков. М.: Мир. 1968. 364 с.

89. Wallace D., Condell R.A., Donovan J.W., Paivinen A., Rhee W.M., Wade S.B. Multiple denaturational transitions in fibrillar collagen. Biopolymers 1986; 25:1875-1893.

90. Miles C.A., Burjanadze T.V. Thermal stability of collagen fibers in ethylene glycol. Biophys. J. 2001; 80:1480-1486.

91. Miles C.A., Sims T.J., Camacho N.P., Bailey A.J. The role of the alpha2 chain in the stabilization of the collagen type I heterotrimer: a study of the type I homotrimer in oim mouse tissues. J. Мої. Biol. 2002; 321(5):797-805.

92. Mu С., Li D., Lin W., Ding Y., Zhang G. Temperature induced denaturation of collagen in acidic solution. Biopolymers 2007; 86(4):282-287.

93. McClain P.E., Wiley E.R. Differential scanning calorimeter studies of the thermal transitions of cCollagen implication on structure and stability. J. Biol. Chem. 1972; 247(3):692-697.

94. Церетели Г.И. Тепловая денатурация коллагена в растворе и фибриллах. Биофизика 1982; 27(5):780-784.

95. Tiktopulo E.I., Kajava A.V. Denaturation of type I collagen fibrils is an endothermic process accompanied by noticeable change in the partial heat capacity. Biochemistry 1998; 37:8174-8152.

96. Leikina E., Merits M. V., Kuznetsova N., Leikin S. Type I collagen is thermally unstable at body temperature. PNAS 2002; 99(3): 1314-1318.

97. Giraud-Guille M.-M., Besseau L., Chopin C., Durand P., Herbage D. Structural aspects of fish skin collagen which forms ordered arrays via liquid crystalline states. Biomaterials 2000; 21:899-906.

98. Vyazovkin S., Vincent L., Sbirrazzuoli N. Thermal denaturation of collagen analyzed by isoconversional method. Macromol. Biosci. 2007; 7(11):1181-1186.

99. Бурджанадзе T.B., Тиктопуло Е.И. Энтальпия денатурации коллагена нелинейная затухающая функция 4-оксипролина. Биофизика 2001; 46(4):607-611.

100. Flory P.J., Garrett R.R. Phase transition in collagen and gelatin systems. J. Am. Chem. Soc. 1958; 80:4836-4845.

101. Flory P.J., Spurr Jr. O.K. Melting equilibrium for collagen fibers under stress. Elasticity in the amorphous state. J. Amer. Chem. Soc. 1961; 83(3):1308-1316.

102. Церетели Г.И., Белопольская T.B. Тепловые свойства системы коллаген-вода. Часть I. Биофизика 1997; 42(1):68-74.

103. Церетели Г.И., Белопольская Т.В. Тепловые свойства системы коллаген-вода. Часть И. Биофизика 1997; 42(3):584-590.

104. Miles С.A., Ghelashvili М. Polymer-in-a-box mechanism for the thermal stabilization of collagen molecules in fibers. Biophys. J. 1999; 76:3243-3252.

105. Chen S.S., Wright N.T., Humphrey J.D. Heat-induced changes in the mechanics of a collagenous tissue: isothermal, isotonic shrinkage. J. Biomech. Eng. 1998; 120:382-388.

106. Wells P.B., Thomsen Sh., Jones M.A., Baek S., Humphrey J.D. Histological evidence for the role of mechanical stress in modulating thermal denaturation of collagen. Biomech. Model. Mechanobiol. 2005; 4(4):201-210.

107. VerzSr F., Nagy I.Z. Electronmicroscopic analysis of thermal collagen denaturation in rat tail tendons. Gerontology 1970; 16(2):77-82.

108. Kronick P., Maleeff B.Y., Carroll R. The locations of collagens with different thermal stabilities in fibrils of bovine reticular dermis. Connect. Tissue Res. 1988; 18:123-134.

109. Maitland D.J., Walsh J.T. Quantitative measurements of linear birefringence during heating of native collagen. Lasers Surg. Med. 1997; 20:310-318.

110. Pearce J., Thomsen S. Rate process analysis of thermal damage. In: Welch A.J. and Gemert M.J.C., eds. Optical-thermal response of laser-irradiated tissue. New York: Plenum Press. 1995.

111. Thomsen S. Pathologic analysis of photothermal and photomechanical effects of laser-tissue interactions. Photochem. Photobiol. 1991; 53:825-835.

112. Engel J., Bachinger H.P. Cooperative equilibrium transitions coupled with a slow annealing step explain the sharpness and hysteresis of collagen folding. Matrix Biol. 2000; 19(3):235-244.

113. Bruckner P., Prockop D.J. Proteolytic enzymes as probes for the triple helix. Anal. Biochem. 1981; 110(2):360-368.

114. Renugopalakrishnan V., Carreira L.A., Collette T.V. Helical structure in chick sSkine type I collagen on thermal denaturation Raman spectroscopic study. Z. Naturforsch. 1998; 53: 383-388.

115. Friess W., Lee G. Basic thermoanalitical studies of insoluble collagen matrices. Biomaterials 1996; 17(23):2289-2294.

116. Slatter D.A., Miles C.A., Bailey A.J. Asymmetry in the triple helix of collagen-like heterotrimers confirms that external bonds stabilize collagen structure. J. Mol. Biol. 2003; 329(1):175-183.

117. Miles C.A., Bailey A.J. Studies of the collagen-like peptide (Pro-Pro-Gly)lO confirm that the shape and position of the type I collagen denaturation endotherm is governed by the rate of helix unfolding. J. Mol. Biol. 2004; 337:917-931.

118. Miles C.A. Kinetics of the helix/coil transition of the collagen-like peptide (Pro-Hyp

119. Gly)i0. Biopolymers 2007; 87(l):51-67.

120. Gornall J.L., Terentjev E.M. Concentration-temperature superposition of helix folding rates in gelatin. Phys. Rev. Lett. 2007; 99(2):028304.

121. Ми C., Li D., Lin W., Ding Y., Zhang G. Temperature induced denaturatuion of collagen in acidic solution. Biopolymers 2007; 86(4):282-287.

122. Miles C.A., Burjanadze T.V., Bailey A.J. The kinetics of the thermal denaturation of collagen in unrestrained rat tail tendon determined by differential scanning calorimetry. J. Мої. Biol. 1995; 245(4):437-446.

123. Flory P.J. Principles of polymer chemistry. Ithaca, N.Y.: Cornell University Press. 1953 -508 p.

124. Henriques F.C., Moritz A.R. Studies of thermal injury in the conduction of heat to and through skin and the temperatures attained therin: A theoretical and experimental investigation. Am. J. Pathol. 1947; 23:695-720.

125. Jacques S. L. Laser-tissue interactions. Photochemical, photothermal, and photomechanical. Surg. Clin. North Am. 1992; 72:531-558.

126. Aksan A., McGrath J.J., Nielubowicz D.S., Jr. Thermal damage prediction for collagenous tissues. Part I: a clinically relevant numerical simulation incorporating heating rate dependent denaturation. J. Biomech. Eng. 2005; 127(l):85-89.

127. Bischof J.C., He X. Thermal stability of proteins. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006; 1066:12-33.

128. Diaz S.H., Nelson J. S., Wong B.J.F. Rate process analysis of thermal damage in cartilage. Phys. Med. Biol. 2003; 48:19-29.

129. Milardi D., La Rosa C., Domenico Grass Extended theoretical analysis of irreversible protein thermal unfolding. Biophys. Chem. 1994; 52:183-189.

130. Usha R., Ramasami T. Infuence of hydrogen bond, hydrophobic and electrovalent salt linkages on the transition temperature, enthalpy and activationenergy in rat tail tendon (RTT) collagen fibre. Thermochimica Acta 1999; 338:17-25.

131. Дой M., Эдварде С. Динамическая теория полимеров. М.: Мир. 1998. 444 с.

132. Miles С. A. Kinetics of collagen denaturation in mammalian lens capsules studied by differential scanning calorimetry. Int. J. Biol. Macromol. 1993; 15(5):265-271.

133. Miles C.A., Bailey A.J. Response to Engel and Bachinger's critique of collagen denaturation as a rate process. Matrix Biol. 2001; 20:263-265.

134. Moran K., Anderson P., Hutcheson J., Flock S. Thermally induced shrinkage of joint capsule. Clin. Orthop. 2000; (381):248-255.

135. Vyazovkin S., Wight C. Model-free and model-fitting approaches to kinetic analysis of isothermal and nonisothermal data. Thermochimica Acta. 2007; 340-341:53-68.

136. Shimazaki N., Hayashi Т., Kunio M., Arai T. Collagen thermal denaturation study for thermal angioplasty based on modified kinetic model: Relation between the artery mechanical properties and collagen denaturation rate. Proc. SPIE 2010; 7562:1-7.

137. Финкельштейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка: курс лекций. М.: Книжный дом «Университет». 2002. 376 с.

138. Baer Е., Hiltner A., Keith H.D. Hierarchical structure in polymeric materials, (molecular, nano-, micro-, macrolevels). Science 1987; 235:1015-1018.

139. Cheung H.S. Distribution of type I, II, III and V in the pepsin solubilized collagens in bovine menisci. Connect. Tissue Res. 1987; 16(4):343-356.

140. BillinghurstR.C., Buxton E.M., Edwards G.M. Use of an antineoepitope antibody for identification of type-II collagen degradation in equine articular cartilage. Am. J. Vet. Res. 2001;62:1031-1039.

141. Hollander A.P., Heathfield T.F., Iwata Y., Bourne R., Rorabeck C. Increased damage to type II collagen in osteoarthritic articular cartilage detected by a new immunoassay. Clin. Invest. J. 1994; 93:1722-1732.

142. Visconti C., Kavalkovich K, Niyibizi C. Biochemical analysis of collagens at the ligament-bone interface reveals presence of cartilage-specific collagens. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 328(1):135-142.

143. Aycock R.S., Seyer J.M. Collagens of normal and cirrhotic human liver. Connect. Tissue Res. 1989; 23(1): 19-31.

144. Sykes В., Puddle В., Francis M., Smith R.The estimation of two collagens from human dermis by interrupted gel electrophoresis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976; 72(4): 14721480.

145. Hayashi Т., Nagai Y. Separation of the alpha chains of type I and III collagens by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biochem. 1979; 86(2):453-459.

146. Hurst D.J., Kilburn K.H., Baker W.M. Normal newborn and adult human lung collagen-analysis of types. Connect. Tissue Res. 1977; 5(2):117-125.

147. Di Cesare P.E., Cheung D.T., Perelman N., Libaw E., Peng L., Nimni M.E. Alteration of collagen composition and cross-linking in keloid tissues. Matrix 1990; 10(3): 172-178.

148. Eyre D.R., Muir H. Quantitative analysis of types I and II collagens in human intervertebral discs at various ages. Biochim. Biophys. Acta. 1977; 492(l):29-42.

149. Reiser K.M., Last J. A. Anomalous electrophoretic behavior of a cyanogen bromide peptide from type III collagen. Connect. Tissue Res. 1983; 12(1):1-16.

150. Cheung D.T., DiCesare P., Benya P.D., Libaw E., Nimni M.E. The pPresence of intermolecular disulfide cross-links in type III collagen. J. Biol. Chem. 1983; 258(12):7774-7778.

151. Laurent G.J., Cockerill P., McAnulty R.J., Hastings J.R. A simplified method for quantitation of the relative amounts of type I and type III collagen in small tissue samples. Anal. Biochem. 1981; 113(2):301-312.

152. Light N.D. Estimation of pes I and III collagens in whole tissue by quanitation of CNBr peptides on SDS-polyacrylamide gels. Biochim. Biophys. Acta 1982; 702:30-36.

153. Eyre D.R., Muir H. Collagen polymorphism: two molecular species in pig intervertebral disc. FEBS Lett. 1974; 42(2): 192-196.

154. Zhang G., Sun A., Li W., Liu Т., Su Zh. Mass spectrometric analysis of enzymatic digestion of denatured collagen for identification of collagen type. J. Chromatography A, 2006; 1114:274-277.

155. Bergman I., Loxley R. New spectrophotometric method for the determination of proline in tissue hydrolyzates. Anal. Chem. 1970; 42(7):702-706.

156. Neuman R.E., Logan M. The determination of hydroxyproline. J. Biol. Chem. 1950; 184:299-306.

157. Blumenkrantz N., Asboe-Hansen G. An assay for total hexosamine and a differential assay for glucosamine and galactosamine. Clin. Biochem. 1976; 9(6):269-274.

158. Юровская M.A. Методы синтеза и химические свойства ароматических гетероциклических соединений. М.: Мир. 1998. 227 с.

159. Woessner J.F. Jr. The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch. Biochem. Biophys. 1961; 93:440-447.

160. Edwards C.A., O'Brien W.D. Jr. Modified assay for determination of hydroxyproline in a tissue hydrolyzate. Clin. Chim. Acta 1980; 104:161-167.

161. Schwartz D.E., Sandell L.J., Hanson W.R. Quantitative analysis of collagen, protein and DNA in fixed, paraffin-embedded and sectioned tissue. Histochem. J. 1985; 17(6):655-663.

162. Reddy K., Enwemeka C.S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clin. Biochem. 1996; 29:225-229.

163. Ohara R., Tanaka A., Ohara O. Automated fluorescent DNA sequencing by a simplified solid-phase chemical sequencing method. BioTechniques 1997; 22(4):653-656.

164. Studelska D.R., Giljum K., McDowell L.M., Zhan L. Quantification of glycosaminoglycans by reversed-phase HPLC separation of fluorescent isoindole derivatives. Glycobiology 2006; 16(l):65-72.

165. Досон P., Эллиот Д., ЭллиотУ., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991.-544 с.

166. Bitter Т., Muir Н.М. A modified uronic acid carbazole reaction. Anal. Biochem. 1962; 4:330-334.

167. Rosenthal H.G., Bentley J.P., Albin E.E. A Sensitive automated procedure for the determination of glucuronic acid. Connect. Tissue Res. 1976; 4(3): 155-161.

168. Keiser H.D. The immunology of proteoglycans. Connect. Tissue Res. 1982; 10(1):101-108.

169. Thornton D.J., Morris H.G., Cockin G.H., Huckerby T.N., Nieduszynski I.A., Carlstedt I., Hardingham Т.Е., Ratcliffe A. Structural and immunological studies of keratan sulphates from mature bovine articular cartilage. Biochem. J. 1989; 260(l):277-82.

170. Farndale R.W., Sayers Ch.A. Barett A.J. A direct spectrophotometric microassay for sulfated glycosaminoghlycans in cartilage culture. Connect. Tissue Res. 1982; 9:247-248.

171. Farndale R.W., Buttle D.J., Barrett A.J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim. Biophys. Acta 1986; 883(2):173-177.

172. Templeton D.M. The basis and applicability of the dimethylmethylene blue binding assay for sulfated glycosaminoglycans. Connect. Tissue Res. 1988; 17(l):23-32.

173. Goldberg R.L., Kolibas L.M. An improved method for determining proteoglycans synthesized by chondrocytes in culture. Connect. Tissue Res. 1990; 24:265-275.

174. Dey P., Saphos C.A., McDonnell J. Moore V.L. Studies on the quantification of proteoglycans by the dimethylmethylene blue dye-Binding method specificity, quantitation in synovial lavage fluid, and automation. Connect. Tissue Res. 1992; 28(4):317:324.

175. Handley C.J., Buttle D.J. Assay of proteoglycan degradation. Methods Enzymol. 1995; 248: 47-58.

176. Stone J.E., AkhtarN., Botchway S., Pennock C.A. Interaction of 1,9-dimethylmethylene blue with glycosaminoglycans. Ann. Clin. Biochem. 1994; 31(Pt 2):147-152.

177. Mbller G. Hanschke M. Quantitative and qualitative analyses of proteoglycans in cartilage extracts by precipitation with 1,9-dimethylmethylene blue. Connect. Tissue Res. 1996; 33(4):243-248.

178. Rosenberg L. Chemical basis for the histological use of safranin-O in the study of articular cartilage. J. Bone Joint Surg. Am. 1971; 53:69-82.

179. Kirivanta I., Jurvelin J., Tammi M., Saamanen A.-M., Helminen J.H. Microspectrophotometric quntitation of glycosaminoglycans in articular cartilage sections stained with Safranin-O. Histochemistry 1985; 82:249-255.

180. Kiraly K., Lammy M., Arokoski J. Safranin-O reduces loss of glycosaminoglycans from bovine articular cartilage during histological specimen preparation. Histochem. J. 1996; 28:99107.

181. Bashir A., Gray M.L., Hartke J., Burstein D. Nondestructive imaging of human cartilage glycosaminoglycan concentration by MRI. Magn. Reson. Med. 1999; 41(5):857-865.

182. Xia Y., Ramakrishnan N., Bidthanapally A. The depth-dependent anisotropy of articular cartilageby Fourier-transform infrared imaging (FTIRI). Osteoarthritis Cartilage 2007; 15:780788.

183. Potter K., Kidder L.H., Levin I.W., Lewis E.N., Spencer R.G.S. Imaging of collagen and proteoglycan in cartilage sections using Fourier transform infrared spectral imaging. Arthritis&Rheumatism 2001; 44(4):846-855.

184. Ryh^nen L., Zaragoza E.J., Uitto J. Conformational stability of type I collagen triple helix: evidence for temporary and local relaxation of the protein conformation using a proteolytic probe Arch. Biochem. Biophys. 1983; 223(2):562-571.

185. Birkedal-Hansen H., Taylor R.E., Bhown A.S., Katz J., Lin H.Y., Wells B.R. Cleavage of bovine skin type III collagen by proteolytic enzymes. J. Biol. Chem. 1985; 260(30):16411-16417.

186. Hayashi K., Peters D.M., Thabit G., Hecht P., Vanderby R. Jr., FantonG.S., Markel M.D. The mechanism of joint capsule thermal modification in an in vitro sheep model. Clin. Orthop. 2000; l(370):236-249.

187. Willett T.L., Labow R.S., Avery N.C., Lee J.M. Increased proteolysis of collagen in an in vitro tensile overload tendon model. Ann. Biomed. Eng. 2007; 35(11): 1961-1972.

188. Yao H., Justiz M.A., Flagler D., Gu W.Y. Effects of swelling pressure and hydraulic permeability on dynamic compressive behavior of lumbar annulus fibrosus. Ann. Biomed. Eng. 2002; 30(10): 1234-1241.

189. Репе D.S., Maclean J. J., Owen J.P., Iatridis J.C. Correlating material properties with tissue composition in enzymatically digested bovine annulus fibrosus and nucleus pulposus tissue. Ann Biomed. Eng. 2006; 34:769-777.

190. Best B.A., Guilak F., Setton L.A., Zhu W., Saed-Nejad F., Ratcliffe A., Weidenbaum M., Mow V.C. Compressive mechanical properties of the human anulus fibrosus and their relationship to biochemical composition. Spine 1994; 19(2):212-221.

191. Schmidt M.B., Mow V.C., Chun L.E., Eyre D.R.Effects of proteoglycan extraction on the tensile behavior of articular cartilage. J. Orthop. Res. 1990; 8:353-363.

192. Lyyra Т., Arokoski J.P., OksalaN., Vihko A., Hyttinen M., Jurvelin J.S., Kiviranta I. Experimental validation of arthroscopic cartilage stiffness measurement using enzymatically degraded cartilage samples. Phys. Med. Biol. 1999; 44(2):525-535.

193. Brown C.P., Hughes S.W., Crawford R.W., Oloyede A. Ultrasound assessment of articular cartilage: analysis of the frequency profile of reflected signals from naturally and artificially degraded samples. Connect. Tissue. Res. 2007; 48(6):277-285.

194. Gu W., Justiz M.A., Yao H. Electrical conductivity of lumbar anulus fibrosis: effects of porosity and fixed charge density. Spine 2002; 27(21):2390-2395.

195. Frank E.H., Grodzinsky A.J., Koob T.J., Eyre D.R. Streaming potentials: a sensitive index of enzymatic degradation in articular cartilage. J. Orthop. Res. 1987; 5(4):497-508.

196. Эткинс П., де Паула Дж. Физическая химия. Ч. 1: Равновесная термодинамика. М.:Мир. 2007.-494 с.

197. Hatakeyama Т., Quinn F.X. Thermal analysis: fundamentals and applications to polymer science. —2nd ed. John Wiley & Sons, Inc. 1994. 180 p.

198. Wunderlich B. Thermal analysis of polymeric materials. Berlin Heidelberg: SpringerVerlag. 2005. - 894 p.

199. Willett T.L., Labow R.S., Lee J.M. Mechanical overload decreases the thermal stability of collagen in an in vitro tensile overload tendon model. J. Orthop. Res. 2008; 26(12):1605-1610.

200. Шау Ю. Анализ и интерпретация температур пиков на кривых ДСК. Часть 1 . Основные принципы. 2007; 2: 6-9.

201. Шау Ю. Обработка и интерпретация температур пиков на кривых ДСК. Часть 2 . Примеры. Thermal Analysis UserCom. (Mettler-Toledo) 2008; 24:6-9

202. KuznetsovaN.V., McBride D.J. Jr, Leikin S. Changes in thermal stability and microunfolding pattern of collagen helix resulting from the loss of a2(I) chain in osteogenesis imperfecta murine. J. Mol. Biol. 2003; 331:191-200.

203. KuznetsovaN.V., Forlino A., Cabral W.A., Marini J.C., Leikin S. Structure, stability and interactions of type I collagen with GLY349-CYS substitution in al(I) chain in a murine osteogenesis imperfecta model. Matrix Biol. 2004; 23:101-112.

204. Persikov A., Ramshaw J.A., Brodsky B. Prediction of collagen stability from amino acid sequence. J. Biol. Chem. 2005; 280:19343-19349.

205. Hadiana M., Corcoranb B.M., Bradshaw J.P. Molecular changes in fibrillar collagen in myxomatous mitral valve disease. Cardiovasc. Pathol. 2010; 19(5):el41-148.

206. Flandin F., Buffevant C., Herbage D. A differential scanning calometry analysis of the age-related changes in the thermal stability of rat skin collagen. Biochim. Biophys. Acta. 1984; 791:205-211.

207. Melling M., Reihsner R., Pfeiler W., Schnallinger M., Karimian-Teherani D., Behnam M., Mostler S., Menzel E.J. Comparison of palmar aponeuroses from individuals with diabetus mellitus and Dupuytren's contracture. Anat. Rec. 1999; 255:401-406.

208. Miles C.A., Wardale R.J., Birch H.L., Bailey A.J. Differential scanning calorimetric studies of superficial digital flexor tendon degeneration in the horse. Equine Vet. J. 1994; 26(4) :291-295.

209. Michel-Hasquin F., Gayot A., Volle-Gacin I. The influence of ionizing radiations upon different forms of collagen. Drug Dev. Ind. Pharm. 1994; 20(3):293-314.

210. Sun W.Q., Leung P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomater. 2008; 4(4):817-826.

211. Miles C.A., Sioknowska A., Hullin S.L., Sims T.J. Identification of an intermediate state in the helix-coil degradation of collagen by ultraviolet light. J. Biol. Chem. 2000; 275(42):33014-33020.

212. Bognar G., Szabo I., Balint L., Hepp B., Kereskai L., Lorinczy D. Thermal effects of shoulder electrothermal arthroscopic capsulorrhaphy monitored by differential scanning calorimetry. Thermochim. Acta 2007; 464(1 ):78-82.

213. Sionkowska A. Thermal denaturation of UV-irradiated wet rat tail tendon collagen. Int. J. Biol. Macromol. 2005; 35:145-149.

214. Payne K.J., Veis A. Fourier transform ir spectroscopy of collagen and gelatin solutions: Deconvolution of the amide I band for conformational studies. Biopolymers 1988; 27(11): 1749-1760.

215. Bachmann L., Gomes A.S., Zezell D.M. Collagen absorption bands in heated and rehydrated dentine. Spectrochim. Acta. A: Mol. Biomol. Spectrosc. 2005; 62(4-5): 1045-1049.

216. Eliades G., Palaghias G., Vougiouklakis G. Effect of acidic conditioners on dentin morphology, molecular composition and collagen conformation in situ. Dent. Mater. 1997; 13(l):24-33.

217. West P.A., Torzilli P.A., Chen C., Lin P., Camacho N.P. Fourier transform infrared imaging spectroscopy analysis of collagenase-induced cartilage degradation. J. Biomed. Opt. 2005; 10(1):014015.

218. West P.A., Bostrom M.P.G., Torzilli P.A., Camacho N. P. Fourier transform infrared spectral analysis of degenerative cartilage: an infrared fiber-optic probe and imaging study. Appl. Spectrosc. 2004; 58(4):376-381.

219. Southern D., Lutz G., Bracilovic A., West P., Spevak M., Pleshko-Camacho N., Doty S. Histological and molecular structure characterization of annular collagen after intradiskal electrothermal annuloplasty. HSS J. 2006; 2(l):49-54.

220. Hanlon E.B., Manoharan R., Koo T.-W., Shafer K.E., Motz J.T., Fitzmaurice M., Kramer J.R., Itzkan I., Dasari R.R., Feld M.S. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Phys. Med. Biol. 2000; 45.-R1-R59.

221. Liu K.Z., Jackson M., Sowa M.G., Ju H., Dixon I.M.C., Mantsch H.H. Modification of the extracellular matrix following myocardial infarction monitored by FTIR spectroscopy. BBA 1996; 1315:73-77.

222. Jastrzebska M., Wrzalik R., Kocot A., Zalewska-Rejdak J., Cwalina B. Raman spectroscopic study of glutaraldehyde-stabilized collagen and pericardium tissue. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2003; 14(2):185-197.

223. Sebag J. Imaging vitreous. Eye 2002; 16:429-439.

224. Бломберген H. Нелинейная оптика. M.: Мир. 1966. 424 с.

225. Дмитриев В.Г., Тарасов JI.B. Прикладная нелинейная оптика. М.: ФИЗМАТЛИТ. 2004.-512 с.

226. Friedl P., Wolf K., von Andrian U.H., Harms G. Biological second and third harmonic generation microscopy. Curr. Protoc. Cell Biol. 2007; Chapter 4:Unit 4.15.

227. Roth S., Freund I. Optical second-harmonic scattering in rat-tail tendon. Biopolymers 1981; 20(6):1271-1290.

228. Raub C.B., Unruh J., Suresh V., Krasieva Т., Lindmo Т., Gratton E., Tromberg B.J., George S.C. Image correlation spectroscopy of multiphoton images correlates with collagen mechanical properties. Biophys. J. 2008; 94:2361-2373.

229. Williams R.M., Zipfel W.R., Webb W.W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys. J. 2005; 88:1377-1386.

230. Yasui T., Tohno Y., Araki T. Determination of collagen fiber orientation in human issue by use of polarization measurement of molecular second-harmonic-generation light. Appl. Opt. 2004; 43(14):2861-2867.

231. Kim B.M., Eichler J., Reiser K.M., Rubenchik A.M., Da Silva L.B.Collagen structure and nonlinear susceptibility: effects of heat, glycation, and enzymatic cleavage on second harmonic signal intensity. Lasers Surg. Med. 2000; 27(4):329-335.

232. Cox G., Kable E., Jones A., Fraser I., Manconi F., Gorrell M.D. 3-dimensional imaging of collagen using second harmonic generation. J. Struct. Biol. 2003; 141(l):53-62.

233. Mansfield J.C., Winlove C.P., Moger J., Matcher S.J. Collagen fiber arrangement in normal and diseased cartilage studied by polarization sensitive nonlinear microscopy. J. Biomed. Opt. 2008; 13(4):044020.

234. Lacomb R., Nadiarnykh O., Campagnola P.J. Quantitative SHG imaging of the diseased state osteogenesis imperfecta: experiment and simulation. Biophys. J. 2008; 94(11):4504-4514.

235. Sun Y., Chen W.L., Lin S.J., Jee Sh.H., Chen Y.F., Lin L.Ch., So P.T.C., Dong Ch.Yu. Investigating mechanisms of collagen thermal denaturation by high resolution second-harmonic generation imaging. Biophys. J. 2006; 91:2620-2625.

236. Tan H.Y., Teng S.W., Lo W., Lin W.C., Lin S.J., Jee S.H., Dong C.Y. Characterizing the thermally induced structural changes to intact porcine eye, part 1: second harmonic generation imaging of cornea stroma. J. Biomed. Opt. 2005; 10(5):054019.

237. Gong W., Xie Sh., Huan Y. Evaluating thermal damage induced by pulsed light with multiphoton microscopy. Proc. SPIE 2009; 7161:1-5.

238. Matteini P., Ratto F., Rossi F., Cicchi R., Stringari C., Kapsokalyvas D., Pavone F.S., Pini R. Investigation on fibrous collagen modifications during corneal laser welding by second harmonic generation microscopy Proc. SPIE 2009; 7163:22-28.

239. Sankaran V., Walsh J.T. Birefringence measurement of rapid structural changes during collagen denaturation. Photochem. Photobiol. 1998; 68(6):846-851.

240. Naylor E.J. Polarized light studies of corneal structure. Brit. J. Ophthal. 1953; 37:77-84.

241. Bairati A., Comazzi M., Gloria M. A comparative study of perichondrial tissue in mammalian cartilages. Tissue&Cell 1996; 28(4):455-468.

242. McMurray Т., Pearce J.A. Thermal damage quantification utilizing tissue birefringence color image analysis. Biomed. Sci. Instrum. 1993; 29:235-242

243. Niemz M.H. Laser-tissue interactions: fundamentals and applications. 3rd, enlarged edition. Berlin Heidelberg: Springer Verlag. 2007. 308 p.

244. Баграташвшш B.H., Соболь Э.Н., Шехтер А.Б., ред. Лазерная инженерия хрящей. М.: ФИЗМАТЛИТ. 2006. 423 с.

245. Гладкова Н.Д, Шахова Н.М., Сергеев A.M., ред. Руководство по оптической когерентной томографии. М.: ФИЗМАТЛИТ. 2007. 264 с.

246. Гуров И.П. Формирование и анализ стохастических интерференционных полей. В кн.: Гуров И.П., Козлов С.А., ред. Проблемы когерентной и нелинейной оптики. СПб: СПбГИТМО. 2000. 278 с.

247. Huang D., Swanson Е.А., Lin С.Р., Schuman J.S., Stinson W.G., Chang W., Нее M.R., Flotte Т., Gregory K., Puliafito C.A. Optical coherence tomography //Science 1991; 254(5035): 1178-1181.

248. Pierce M.C., Strasswimmer J., ITyle Park В., Cense В., De Boer J.F. Birefringence measurements in human skin using polarization-sensitive optical coherence tomography. J Biomed Opt. 2004; 9(2):287-291.

249. Matcher S.J., Winlove C.P., Gangnus S.V. The collagen structure of bovine intervertebral disc studied using polarization sensitive optical coherence tomography. Phys. Med. Biol. 2004; 49:1295- 1306.

250. Xie Т., Guo S., Zhang J., Chen Z., Peavy G.M. Use of polarization-sensitive optical coherence tomography to determine the directional polarization sensitivity of articular cartilage and meniscus. J. Biomed. Optics 2006; 11(6):064001 064008.

251. Pierce M.C., Sheridan R.L., Hyle Park В., Cense В., de Boer J.F. Collagen denaturation can be quantified in burned human skin using polarization-sensitive optical coherence tomography. Burns 2004; 30(6):511-517.

252. Srinivas S.M., de Boer J.F., Park H., Keikhanzadeh K., Huang H.E., Zhang J., Jung W.Q., Chen Z., Nelson J.S. Determination of burn depth by polarization-sensitive optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 2004; 9(1):207-212.

253. Эскубе M., Пинери M. Сравнение изменений массы и энергии при сорбции воды коллагеном и кератином. В сб. Роуленд С., ред. Вода в полимерах. М.: Мир. 1984. 239 с.

254. Timmermann Е.О., Chirife J., Iglesias H.A. Water sorption isotherms of foods and foodstuffs: BET or GAB parameters? J. Food Eng. 2001; 48:19-31.

255. Пирс Э. Гистохимия (теоретическая и прикладная), М.: Изд-во Иностранной Литературы. 1962. 962 с.

256. Ар Gwynn S., Wade M.J., КдцЬ G., Owen R.H., Richards R.G. Freeze-substitution of rabbit tibial articular cartilage reveals that radial zone collagen fibres are tubules. J. Microscopy 2000; 197(Pt 2):159-172.

257. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. Сборник статей. Камминс Г., Пайк Э., ред. М.: Мир. 1978. 584 с.

258. Лебедев Д.А., Левчук Ю.Н., Ломакин А.В., Носкин В.А. Лазерная корреляционная спектроскопия в биологии. Киев: Наук, думка. 1987. — 255 с.

259. Zimnyakov D.A., Briers J.D., and Tuchin V.V. Speckle technologies for monitoring and imaging of tissues and tissue-like phantoms. In: Handbook of optical medical diagnostics. Tuchin V.V., ed. Bellingham, Wash.: SPIE Press, 2002.

260. Bland Y.S., Ashhurs D.E. Fetal and postnatal development of the patella, patellar tendon and suprapatella in the rabbit, changes in the distribution of the fibrillar collagens:, J. Anat. 1997; 190: 327-342.

261. Moussa M., Swider P., ВаЫШ R., Fernandez X., Rfimignon H. Effects of physical activities on biochemical and biomechanical properties of tendons in two commercial types of chickens. Connect. Tissue Res. 2008; 49(2):76-84.

262. Amiel D., Frank C., Harwood F., Fronek J., Akeson W. Tendons and ligaments: a morphological and biochemical comparison. J Orthop Res. 1984; l(3):257-265.

263. Graf B.K., Fujisaki K., Vanderby R. Jr., Vailas A.C. The effect of in situ freezing on rabbit patellar tendon. A histologic, biochemical, and biomechanical analysis. Am. J. Sports Med. 1992; 20(4):401-405.

264. Fujii K., Yamagishi Т., Nagafuchi Т., Tsuji M., Kuboki Y. Biochemical properties of collagen from ligaments and periarticular tendons of the human knee. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 1994; 2(4):229-233.

265. Rumian A.P., Wallace A.L., Birch H.L. Tendons and ligaments are anatomically distinct but overlap in molecular and morphological features—a comparative study in an ovine model. J Orthop Res. 2007; 25(4):458-464.

266. Nakagaki W.R., Biancalana A., Benevides G.P., Gomes L. Biomechanical and biochemical properties of chicken calcaneal tendon under effect of age and nonforced active exercise. Connect. Tissue Res. 2007; 48(5):219-228.

267. Benevides G.P., Pimentel E.R. Toyama M.H., Novello J.C., Marangoni S., Gomes L. Biochemical and biomechanical analysis of tendons of caged and penned chickens. Connect. Tissue Res. 2004; 45(4):206-215.

268. Suzuki D., Takahashi M., Abe M., Nagano A. Biochemical study of collagen and its crosslinks in the anterior cruciate ligament and the tissues used as a graft for reconstruction of the anterior cruciate ligament. Connect. Tissue Res. 2008; 49(l):42-47.

269. Amiel D., Kleiner J.B., Roux R.D., Harwood F.L., Akeson W.H. The phenomenon of "ligamentization": anterior cruciate ligament reconstruction with autogenous patellar tendon. J Orthop. Res. 1986; 4(2): 162-172.

270. Kastelic J., Galeski A., Baer E. The multicomposite structure of tendon. Connect. Tissue Res. 1978; 6(1): 11-23.

271. Kannus P. Structure of the tendon connective tissue. Scand. J. Med. Sci. Sports 2000; 10(6):312-320.

272. Franchi M., Raspanti M., Dell'Orbo C., Quaranta M., De Pasquale V., Ottani V., Ruggeri A. Different crimp patterns in collagen fibrils relate to the subfibrillar arrangement. Connect. Tissue Res. 2008; 49:85-91.

273. Gathercole LJ and Keller A crimp morphology in the fibre-forming collagens. Matrix 1991 V.l 1,214-234.

274. Franchi M., Fini M., Quaranta M., De Pasquale V., Raspanti M., Giavaresi G., Ottani V., Ruggeri A. Crimp morphology in relaxed and stretched rat Achilles tendon. J. Anat. 2007; 210:1-7.

275. Graf B.K., Fujisaki K., Vanderby R. Jr., Vailas A.C. The effect of in situ freezing on rabbit patellar tendon. A histologic, biochemical, and biomechanical analysis. Am. J. Sports Med. 1992; 20(4):401-405.

276. Stouffer D.C., Butler D.L., Hosny D. The relationship between crimp pattern and mechanical response of human patellar tendon-bone units. J. Biomech. Eng. 1985; 107(2): 158165.

277. Finch A., Gardner P. J., Ledward D.A., Menashi S. The thermal denaturation of collagen fibres swollen in aqueous solutions of urea, hexamethylenetetramine, p-benzoquinone and tetra-alkylammonium salts. Biochim. Biophys. Acta 1974; 365(2):400-404.

278. Usha R., Ramasami T. Effect of crosslinking agents (basic chromium sulfate and formaldehyde) on the thermal and thermomechanical stability of rat tail tendon collagen fiber. Thermochim. Acta 1999; 356:59-66.

279. Bigi A., Castellani P.P., Cojazzi G., Roveri N. Age-related changes in the thermal transition of turkey flexor tendon collagen. J. Therm. Anal. Calorimetiy 1992; 38:505-514.

280. Ruberti J.W., Hallab N.J. Strain-controlled enzymatic cleavage of collagen in loaded matrix. Biochem. Biophys. Res. Comm. 2005; 336:483^189.

281. Rada J.A., Shelton S., Norton T.T. The sclera and myopia. Exp. Eye Res. 2006; 82(2):185-200.

282. Trier K., Olsen E.B., Kobayashi T., Ribel-Madsen S.M. Biochemical and ultrastructural changes in rabbit sclera after treatment with 7-methylxanthine, theobromine, acetazolamide, or L-ornithine. Br. J. Ophthalmol. 1999; 83:1370-1375.

283. Weiyi C., Wang X., Wang C., Tao L., Li X., Zhang Q. An experimental study on collagen content and biomechanical properties of sclera after posterior sclera reinforcement. Clin. Biomech. (Bristol, Avon). 2008; 23(Suppl 1):S17-S20.

284. Keeley F.W., Morin J.D., Vesely S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp. Eye Res. 1984; 39(5):533-542.

285. Malik N.S., Moss S .J., Ahmed N., Furth A.J,. Wall R.S., Meek K.M. Ageing of the human corneal stroma: structural and biochemical changes. Biochim. Biophys. Acta 1992; 1138(3):222-228.

286. Rada J.A., Achen V.R., Penugonda S., Schmidt R.W., Mount В .A. Proteoglycan composition in the human sclera during growth and aging. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000; 41:1639-1648.

287. Rem A.I., Oosterhuis J.A., Journee-de Korver H.G., van den Berg T.J.T.P., Keunen J.E.E. Temperature dependence of thermal damage to the sclera: exploring the heat tolerance of the sclera for transscleral thermotherapy. Exp. Eye Res. 2001; 72:153-162.

288. Rem A.I., Oosterhuis J.A., Journee-de Korver H.G., de Wolff-Rouendaal D., Keunen J.E. Transscleral thermotherapy: short- and long-term effects of transscleral conductive heating in rabbit eyes. Arch Ophthalmol. 2003; 121(4):510-516.

289. Иомдина E.H. Биомеханика склеральной оболочки глаза при миопии: диагностика нарушений и их экспериментальная коррекция. Дисс. докт . биол. наук. Москва. 2000. 360 с.

290. Тарутта Е.П., Андреева Л.Д., Иомдина Е.Н., Маркосян Г.А., Иващенко Ж.Н., Воллензак Г., Коригодский А.Р., Шкуренко С.И. Новые технологии склероукрепляющего лечения прогрессирующей миопии. Росс. Педиатр. Офтальмол. 2008; (1):28-30.

291. Paul R.G., Avery С., Slatter D.A., Sims Т.J., Bailey A.J. Isolation and characterization of advanced glycation end products derived from the in vitro reaction of ribose and collagen. Biochem. J. 1998; 330:1241-1248.

292. Bailey A.J. Intermediate labile intermolecular crosslinks in collagen fibres. Biochem. Biophys. Acta 1968; 160(3):447-453.

293. Bailey A.J., Lister D. Thermally labile cross-links in native collagen. Nature 1968; 220(164):280-281.

294. Spoerl E., Wollensak G., Seiler T. Increased resistance of crosslinked cornea against enzymatic digestion. Cur. Eye Res. 2004; 29(l):35-40.

295. Wollensak G. Crosslinking treatment of progressive keratoconus: new hope. Cur. Opin. Ophthalmol. 2006; 17(4):356-360.

296. Sung H.W., Hsu C.S., Wang S.P., Hsu H.L. Degradation potential of biological tissues fixed with various fixatives: an in vitro study. J.Biomed. Mater. Res. 1997; 34:147-155.

297. Zeeman P.J., Dijkstra P.B., vanWachem M.J.A., van Luyn M., Hendriks P.C., Cahalan P.T., Feijen J. Successive epoxy and carbodiimide cross-linking of dermal sheep collagen. Biomaterials 1999; 20:921-931.

298. Sung H.W., Chang Y., Chiu C-T., Chen C-N., Liang H-C. Crosslinking characteristics and mechanical properties of a bovine pericardium fixed with a naturally occuring crosslinking agent. J. Biomed. Mater. Res. 1999; 47:116-126.

299. Wollensak G., Spoerl E. Collagen cross-linking of human and porcine sclera. J. Cataract. Refract. Surg. 2004; 30:689-695.

300. Sung H.W., Chang W.H., Ma C.Y., Lee M.H. Crosslinking of biological tissues using genipin and/or carbodiimide. J. Biomed. Mater. Res. A. 2003; 64:427-438.

301. Tu R., Shen S.H., Lin D., Hata C., Thyagarajan K., Noishiki Y., Quijano R.C. Fixation of bioprosthetic tissues with monofunctional and multifunctional poly epoxy compounds. J. Biomed. Mater. Res. 1994;28:677-684.

302. Wollensak G., Iomdina E., Dittert D.D. Cross-linking of scleral collagen in the rabbit using riboflavin and UVA. Acta Ophtalmol. Scand. 2005; 83:477-482.

303. Nickerson C.S. Engineering and the mechanical properties of ocular tissues. Thesis for the degree of PhD, California Institute Technology. 2006. 163 p.

304. Vandelli M.A., Rivasi F., Guerra P., Forni F., Arletti R. Gelatin microspheres cross-linked with glyceraldehyde as a potential drug delivery system: preparation, characterisation, in vitro and in vivo studies. Int. J. Pharm. 2001; 215:175-184.

305. Wollensak G., Iomdina E. Crosslinking of scleral collagen in the rabbit using glyceraldehyde. J.Cataract. Refract. Surg. 2008; 34(4):651-656.

306. Wollensak G., Iomdina E. Long-term biomechanical properties after collagen crosslinking of sclera using glyceraldehyde. Acta Ophtalmol. Scand. 2008; 86(8):887-893.

307. Lee K.W., Simpson G., Ortwerth B. A systematic approach to evaluate the modification of lens proteins by glycation-induced cross-linking. Biochim. Biophys. Acta 1999; 1453:141-151.

308. Rudenskaya G., Isaev V., Shmoylov A., Karabasova M. Preparation of proteolytic enzymes from kamchatka crab. Paralithodes camchatica hepatopancreas and their application. Appl. Biochem. Biotechnol. 2000; 88:175-180.

309. Tessier F.J., Monnier V.M., Sayre L.M. Kornfield J.A. Triosidines: novel Maillard reaction products and cross-links from the reaction of triose sugars with lysine and arginine residues. Biochem. J. 2003; 369:705-711.

310. Zeeman R. Cross-linking of collagen-based materials. Thesis University of Twente, Enschede, The Netherlands. 1998. 200 p.

311. Sperling L. H. Introduction to physical polymer science (2nd edition). New York: Wiley-Interscience. 1993. 363 p.

312. Demer J.L., Miller J.M., Poukens V., Vinters H.V., Glasgow B.J. Evidence for fibromuscular pulleys of the recti extraocular muscles. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1995; 36:1125-1136.

313. McClung J.R., Allman B.L., Dimitrova D.M., Goldberg S.J. Extraocular connective tissues: a role in human eye movements. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006; 47:202-205.

314. Miller S.B., Lichtig C., Modan M.5 Meyer E. Tenon's capsule: ultrastructure of collagen fibrils in normals and infantile esotropia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1992; 33(3):651-656.

315. Gross R.L. Collagen type I and III synthesis by tenon's capsule fibroblasts in culture: individual patient characteristics and response to mitomycin C, 5-fluorouracil, and ascorbic acid. Tranc. Am. Opht. Soc. 1999; 97:513-518.

316. Debelle L., Tamburro A.M. Elastin: molecular description and function. A review. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1999; 31:261-270.

317. Curtin B.J., Iwamoto T., Renaldo D.P. Normal and staphylomatous sclera of high myopia. Arch. Ophthalmol. 1979; 97:912-915.

318. McBrien N.A., Cornell L.M., Gentle A. Structural and ultrastructural changes to the sclera in a mammalian model of high myopia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001; 42:2179-2187.

319. Pasquali Ronchetti I., Alessandrini A., Baccarani Contri M, Fornieri C., Mori G., Quaglino D.Jr., ValdraU. Study of elastic fiber organization by scanning force microscopy. Matrix Biol., 1998; 17(l):75-83.

320. Iomdina E.N., Daragan V.A., Ilyina E.E. Certain biomechanical properties and cross linking of the scleral shell of the eye in progressive myopia. Proc. XIV Congress Biomech. Paris. 1993:616.

321. Than P., Lorinczy D. Differential scanning calorimetric examination of the osteoarthritic hyaline cartilage in rabbit. Thermochim. Acta 2003; 404:149-153.

322. Than P., Kereskai L. Thermal analysis of the osteoarthritic human hyaline cartilage J. Therm. Anal. Calorimetry 2005; 82:213-216.

323. Ghosh P. The Biology of the intervertabral disc. Florida: Boca Raton. 2000. V. 1.

324. HumzahM.D., Soames R.W. Human intervertebral disc: structure and function. Anat.Rec. 1988; 220:337-356.

325. Blumenkrantz N., Sylvest J., Asboe-Hansen G.Local low-collagen content may allow herniation of intervertebral disc: biochemical studies. Biochem. Med. 1977; 18(3):283-290.

326. Scott J.E., Bosworth T.R., Cribb A.M., Taylor J.R. The chemical morphology of age-related changes in human intervertebral disc glycosaminoglycans from cervical, thoracic and lumbar nucleus pulposus and annulus fibrosus. J. Anat. 1994; 184 (l):73-82.

327. Antoniou J., Pike G.B., Steffen T., Baramki H., Poole A.R., Aebi M., Alini M. Quantitative magnetic resonance imaging in the assessment of degenerative disc disease. Magn.Res.Meth. 1998;40:900-907.

328. Olczyk K Age-related changes in glycosaminoglycans of human intervertebral discs. Folia Histochem Cytobiol. 1993; 31(4):215-220.

329. Olczyk K. Age-related changes in collagen of human intervertebral disk. Gerontology 1992; 38(4): 196-204.

330. Scott J.E., Haigh M. Proteoglycan-collagen interactions in intervertebral disc. A chondroitin sulphate proteoglycan associates with collagen fibrils in rabbit annulus fibrosus at the d-e bands. Biosci. Rep. 1986; 6(10):879-888.

331. Ghosh P., Taylor T.K.F., Horsburgh B.A. The composition and protein metabolism in the immature rabbit intervertebral disc. Cell Tissue Res. 1975; 163(2):223-238.

332. Demers C.N., Antoniou J., Mwale F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine 2004; 29(24): 2793-2799.

333. Iatridis J.C., MaClean J.J., Ryan D.A. Mechanical damage to the intervertebral disc annulus fibrosus subjected to tensile loading. J. Biomech. 2005; 38(3):557-565.

334. Mizuno H., Roy A.K., Vacanti C.A., Kojima K., Ueda M., Bonassar L.J. Tissue-engineered composites of anulus fibrosus and nucleus pulposus for intervertebral disc replacement. Spine 2004; 29(12):1290-1298.

335. Iatridis J.C., Mente P.L., Stokes I.A.F., Aronsson D.D., Alini M. Compression-induced changes in intervertebral disc properties in a rat tail model. Spine 1999; 24(10):996-1002.

336. Berthet-Colominas C., Miller A., Herbage D., Ronziere M.C., Tocchetti D. Structural studies of collagen fibres from intervertebral disc. Biochim. Biophys. Acta. 1982; 706(1):50-64.

337. Beard H.K., Ryvar R., Brown R., Muir H. Immunochemical localization of collagen types and proteoglycan in pig intervertebral discs. Immunology 1980; 41:491-501.

338. Pokharna H.K., Phillips F.M. Collagen crosslinks in human lumbar intervertebral disc aging. Spine 1998; 23(15):1645-1648.

339. Beckstein J.G., Sen S., Schaer T.P., Vresilovic E.J., Elliott D.M. Comparison of animal discs used in disc research to human lumbar disc: axial compression mechanics and glycosaminoglycan content. Spine 2008; 33(6): 166-173.

340. Buckwalter J. A. Aging and degeneration of the human intervertebral disc. Spine 1995; 20(11):1307-1314.

341. Stevens R.S., Ewins R.F.E., Revell P. A., Muir H. Proteoglycans of the intervertebral disc homology of structure with laryngeal proteoglycans. Biochem. J. 1979; 179:561-572.

342. Cole T.C., Burkhardt D., Ghosh P., Ryan M., Taylor T. Effects of spinal fusion on the proteoglycans of the canine intervertebral disc. J. Orthop. Res. 1985; 3(3):277-290.

343. Sztrolovics R., Alini M., Roughley P., Mort J.S. Aggrecan degradation in human intervertebral disc and articular cartilage. Biochem. J. 1997; 326:235-241.

344. Marchini M., Strocchi R., Castellani P.P., Riva R. Ultrastructural observations on collagen and proteoglycans in the annulus fibrosus of the intervertebral disc. Basic App. Histochem. 1979; 23(2):137-148.

345. Stoeckelhuber M., Brueckner S., Spohr G., Welsch U. Proteoglycans and collagen in the intervertebral disc of the rhesus monkey (Macaca mulatta). Ann. Anat. 2005; 187(l):35-42.

346. Cassidy J.J., Hiltner A., Baer E. Hierarchical structure of the intervertebral disc. Connect. Tissue Res. 1989; 23(l):75-88.

347. Inoue H. Three-dimensional architecture of lumbar intervertebral discs. Spine 1981; 6(2):139-146.

348. Hashizume H. Three-dimensional architecture and development of lumber intervertebral discs. Acta Med Okayama 1980; 34(5):301-311.

349. Inoue H., Takeda T. Three-dimensional observation of collagen framework of lumbar intervertebral discs. Acta Orthop Scand. 1975; 46(6):949-956.

350. Postacchini F., Belocci M., Massobrio M. Morphologic changes in annulus fibrosus during agging. Spine 1984; 9(6):596-603.

351. Gruber H.E. and Hanley E.N. Observations on morphologic changes in the aging and degenerating human disc: Secondary collagen alterations Musculoskeletal Disorders 2002; 3(9):1-6.

352. Schollmeier G., Lahr-Eigen R., Lewandrowski K.U. Observations on fiber-forming follagens in the anulus fibrosus. Spine 2000; 25(21):2736-2741.

353. Kemp N.J., Park J., Zaatari H.N., Rylander H.G., Milner T.E. Fibre orientation contrast for depth-resolved identification of structural interfaces in birefringent tissue. Phys. Med. Biol. 2006;51:3759-3767.

354. Hickey D.S, Hukins D.W. Relation between the structure of the annulus fibrosus and the function and failure of the intervertebral disc. Spine 1980; 5(2): 106-116.

355. Gu W.Y., Mao X.G., Rawlins B.A., Iatridis J.C., Foster R.J., Sun D.N., Weidenbaum M., Mow V.C. Streaming potential of human lumbar anulus fibrosus is anisotropic and affected by disc degeneration. J. Biomech. 1999; 32(11):1177-1182.

356. Biyani A., Andersson G.B.J. Low back pain: patophysiology and management. J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2004; 12(2): 106-115.

357. Arnoczky S.P., Aksan A. Thermal modification of connective tissues: basic science considerations and clinical implication. J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2000; 8(5):305-313.

358. Wang J.C., Kabo J.M., Tsou P.M., Halevi L., Shamie A.N. The effect of uniform heating on the biomechanical properties of the intervertebral disc in a porcine model. Spine J. 2005; 5(l):64-70.

359. Sobol E., Zakharkina O., Baskov A., Shekhter A., Borschenko I., Guller A., Baskov V., Omelchenko A., Sviridov A. Laser engineering of spine discs. Laser Physics 2009; 19(4):825-835.

360. Dickson IR, Happey F, Pearson CH Naylor A, Turner RL. Decrease in hydrothermal stability of collagen on ageing in the human intervertebral disk. Nature 1967; 215(5096):50-52.

361. Doman I., Toth G., Illes T., Lorinczy D. Differential scanning calorimetric examination of the human intervertebral disc: A preliminary study. Thermochim. Acta 2001; 376:117-122.

362. Dom6n I., Illfe T. Thermal analysis of the human intervertebral disc. J. Biochem. Biophys. Methods 2004;61:207-214.

363. Bass E.C., Wistrom E.V., Diederich C.J., Nau W.H., Pellegrino R., Ruberti J., Lotz J.C. Heat-induced changes in porcine annulus fibrosus biomechanics. J. Biomech. 2004; 37(2):233-340.

364. Ortolani F., Giordano M., Marchini M. A model for type II collagen fibrils: distinctive D-band patterns in native and reconstituted fibrils compared with sequence data for helix and telopeptide domains. Biopolymers 2000; 54(6):448-463.

365. Bai P., Phua K., Hardt .T, Cernadas M., Brodsky B. Glycation alters collagen fibril organization. Connect. Tissue Res. 1992; 28:1-12.

366. Lotz J.C., Hadi T., Bratton C., Reiser K.M., Hsieh A.H. Anulus fibrosus tension inhibits degenerative structural changes in lamellar collagen. Eur. Spine J. 2008; 17:1149-1159.

367. Roughley P.J., Melching L.I., Heathfield T.F., Pearce R.H., Mort J.S. The structure and degradation of aggrecan in human intervertebral disc. Eur. Spine J. 2006; 15:326-332.

368. Cornah M.S., Meachim G., Parry E.W. Banded structures in the matrix of human and rabbit nucleus pulposus. J. Anat. 1970; 107(2):351-362.

369. Happey F., Johnson A.G., Naylor A., Turner R.L. Preliminary observation concerning the fine structure of the intervertebral disc. J. Bone Joint Surg. Br. 1964; 46:563-567.

370. Iatridis J.C., Setton L.A., Weidenbaum M., Mow V.C. Alterations in the mechanical behavior of the human lumbar nucleus pulposus with degeneration and aging. J. Orthop. Res. 1997; 15(2):318-322.

371. Urban J.P., McMullin J.F. Swelling pressure of the inervertebral disc: influence of proteoglycan and collagen contents. Biorheology 1985; 22(2):145-157.

372. Oegema T. R. The role of disc cell heterogeneity in determining disc biochemistry: a speculation Biochem. Soc. Trans. 2002; 30(6):839-844.

373. Roberts S., Menage J., Urban J.P. Biochemical and structural properties of the cartilage end-plate and its relation to the intervertebral disc. Spine 1989; 14(2): 166-174.

374. Aspden R.M., Hickey D.S., Hukins D.W. Determination of collagen fibril orientation in the cartilage of vertebral end plate. Connect. Tissue Res. 1981; 9(2):83-87.

375. Eurell J. A, Kazarian L.E. The vertebral cartilaginous endplate of the preadult rhesus monkey (Macaca mulatta). A correlative scanning electron- and light-microscopic study. Spine 1986; ll(5):483-486.

376. Basser P.J., Schneiderman R., Bank R.A., Wachtel E., Maroudas A. Mechanical properties of the collagen network in human articular cartilage as measured by osmotic stress technique. Arch. Biochem. Biophys. 1998; 351(2):207-219.

377. Than P., Vermes C., Schiffer B., Lôrinczy D. Differential scanning calorimetric examination of the human hyaline cartilage. A preliminary study. Thermochim. Acta 2000; 346:147-151.

378. Tyth K., Soh6r G., Pallagi E., Szaby-RMvMsz P. Further characterization of degenerated human cartilage with differential scanning calorimetry. Thermochim. Acta 2007; 464(1 ):75-77.

379. Eisenberg S.R., Grodzinsky A.J. Swelling of articular cartilage and other connective tissues: electromechanochemical forces. J. Orthop. Res. 1985; 3(2): 148-159.

380. Kempson G.E., Muir H., Pollard C., Tuke M.A. The tensile properties of the cartilage of human femoral condyles elated to the content of callogen and glycosaminoglycans, Biochim. Biophys. Acta 1976; 428:741-760.

381. Broom N.D., Poole C.A. Articular cartilage collagen and proteoglycans: their functional interdepende. Arthritis Rheum. 1983; 26:1111-1119.

382. Prathiba V. Suryanarayanan M. Biochemical and dynamic studies of collagen from human skin and keloid tissue. Ind. J. Biochem. Biophys. 1999; 36:158-164.

383. Pieper J.S. Oosterhof A., Dijkstra P.J., Veerkamp J.H., van Kuppevelt T.H. Preparation and characterization of porous crosslinked collagenous matrices containing bioavailable chondroitin sulphate. Biomaterials 1999; 20:847-858.

384. Hardingham T.E., Muir H., Kwan M.K., Lai W.M., Mow V.C. Viscoelastic properties of proteoglycan solutions with varying proportions present as aggregates. J. Orthop. Res. 1987; 5(l):36-46.

385. Kronick P.L., Cooke P. Thermal stabilisation of collagenfibres by calcification. Connect Tissue Res. 1996; 33:275-282.

386. Nielsen-Marsh C.M., Hedges R.E.M., Mann T., Collins M.J. A preliminary investigation of the application of differential scanning calorimetry to the study of collagen degradation in archaeological bone. Thermochim. Acta 2000; 365:129-139.

387. Tr^bacz H., Wojtowicz K. Thermal stabilization of collagen molecules in bone tissue. Int. J. Biol. Macromol. 2005; 37(5):257-262.

388. Amiel D., Harwood F.L, Abel M.F, Akeson W.H. Collagen types in neocartilage tissue resulting from rib perichondrial graft in an articular defect a rapid semi-quantitative methodology. Coll. Relat. Res. 1985; 5(4):337-347.

389. Bruns J., Meyer-Pannwitt U., Silbermann M. The rib perichondrium. An anatomical study in sheep of a tissue used as transplant in the treatment of hyaline-cartilage defects. Acta Anat. (Basel). 1992; 144(3):258-266.

390. Bairati A., Comazzi M., Gioria M. An ultrastructural study of the perichondrium in cartilages of the chick embryo. Anat. Embiyol. 1996; 194:155-167.

391. Rotter N., Tobias G., Lebl M. Age-related changes in the composition and mechanical properties of human nasal cartilage. Arch. Biochem. Biophys. 2002; 403:132-140.

392. Homicz M.R. McGowan K.B. Lottman L.M., Beh G., Sah R.L., Watson D. A Compositional Analysis of Human Nasal Septal Cartilage. Arch. Facial Plast. Surg. 2003; 5:53-58.

393. Popko M., Bleys R.L., De Groot J.W., Huizing E.H. Histological structure of the nasal cartilages and their perichondrial envelope. I. The septal and lobular cartilage. Rhinology 2007; 45(2):148-152.

394. Helidonis E., Sobol E., Kavvalos G., Bizakis J., Christodoulou P., Velegrakis G., Segas J., Bagratashvili V. Laser shaping of composite cartilage grafts. Am. J. Otolaryngol. 1993; 14(6):410-412.

395. Naumann A., Dennis J.E., Awadallah A., Carrino D.A., Mansour J.M., Kastenbauer E., Caplan A.I. Immunochemical and mechanical characterization of cartilage subtypes in rabbit. J. Histochem. Cytochem. 2002; 50(8):1049-1058.

396. Peters T.J., Smillie I.S. Studies on chemical composition of menisci from the human kneejoint. Proc. Roy. Soc. Med. 1971; 64:261-262.

397. Lee-Own V., Anderson J.C. Interaction between proteoglycan subunit and type II collagen from bovine nasal cartilage, and the preferential binding of proteoglycan subunit to type I collagen. Biochem. J. 1976; 153:259-264.

398. Cohen S.R., Cheung D.T., Nimni M.E., Mahnovski V., Lian G., Perelman N., Carranza A.P. Collagen in the developing larynx. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 1993; 102:655-659.

399. Claassen H., Werner J. Gender-specific distribution of glycosaminoglycans during cartilage mineralization of human thyroid cartilage J. Anat. 2004; 205:371-380.

400. Hughes L.C., Archer C.W., ap Gwynn I. The ultrastructure of mous articular cartilage: collagen orientation and implication for tissue functionality. A polarized light and scanning electron microscope study and review. Eur. Cells Mat. 2005; 9:68-84.

401. Kirsch T., Claassen H. Matrix vesicles mediate mineralization of human thyroid cartilage. Calcif. Tissue Int. 2000; 66:292-297.

402. Vetter U., Pirsig W., Helbing G., Heit W., Heinze E. Patterns of growth in human septal cartilage: a review of new approaches. Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. 1984; 7(l):63-74.

403. Chen M.H., Broom N. On the ultrastructure of softened cartilage: a possible model for structural transformation. J. Anat. 1998; 192:329-341.

404. Szanto Z., Benko L., Gaszl B., Jancsy G., Horv6th O.P., Roth E. Differential scanning calorimetric examination of the tracheal cartilage after primary reconstruction with differential suturing techniques. J. Therm. Anal. Cal. 2005; 82:217-220.

405. Kozaci L.D.; Buttle D.J., Hollander A.P. Degradation of type II collagen, but not proteoglycan, correlates with matrix metalloproteinase activity in cartilage explant cultures. Arthritis Rheum. 1997; 40(1):164-174.

406. Hagg R., Bruckner P., Hedbom E. Cartilage fibrils of mammals are biochemically heterogeneous: differential distribution of decorin and collagen IX. J. Cell Biol. 1998; 142(l):285-294.

407. Quacci D., Dell'Orbo C., Diaz G. Collagen fibril ultrastructure alters after glycanolitic digestion. Ann. Anat. 1992; 174(6):569-574.

408. Kuhn K., von der Mark K. The influence of proteoglycans on the macromolecular structure of collagen. Suppl. Thromb. Haemost. 1978; 63:123-126.

409. Christner J.E., Baker J.R., Caterson B. Studies on the Properties of the Bovine Nasal Cartilage Inextractable Proteoglycans from Bovine Nasal Cartilage. J. Biol. Chem. 1983; 258(23): 14335-14341.

410. Nam K., Kimura T., Kishida A. Preparation and characterization of cross-linked collagen-phospholipid polymer hybrid gels. Biomaterials 2007; 28:1-8.

411. Messner K., Gao J. The menisci of the knee joint. Anatomical and functional characteristics and a rationale for clinical treatment. J. Anat. 1998; 193:161-178.

412. Rath E., Richmond J.C. The menisci: basic science and advances in treatment. Br. J. Sports Med. 2000; 34:252-257.

413. Baker B.M., Nathanyz A.S., Huffman R.G., and Mauck R.L. Tissue engineering with meniscus cells derived from surgical debris. Osteoarth. Cart. 2008; 2009; 17(3):336-345.

414. Herwig J., Egner E., and Buddeke E. Chemical changes of human knee joint menisci in various stages of degeneration. Ann. Rheum. Diseases 1984; 43:635-640.

415. Nakano T., Dodd C.M., Scott P.G. Glycosaminoglycans and Proteoglycans from Different Zones of the Porcine Knee Meniscus. J. Orthop. Res. 1997; 15:213-220.

416. Oegema T.R., Deloria L.B., Sandy J.D., Hart D.A. Effect of Oral Glucosamine on Cartilage and Meniscus in Normal and Chymopapain-Injected Knees of Young Rabbits. Arthr. Rheum. 2002; 46(9):2495-2503.

417. Kambic H.E., McDevitt C.A. Spatial organization of types I and II collagen in the canine meniscus. J. Orthop. Res. 2005; 23:142-149.

418. Chevrier A., Nelea M., Hurtig M.B., Hoemann C.D., Buschmann M.D. Meniscus Structure in Human, Sheep, and Rabbit for Animal Models of Meniscus Repair. J. Orthop. Res. 2009; 27:1197-1203.

419. Scott P.G., Nakano T., Dodd C.M. Isolation and characterization of small proteoglycans from different zones of the porcine knee meniscus. Biochim. Biophys. Acta 1997; 1336(2):254-262.

420. Bullough P.G., Munuera L., Murphy J., Weinstein A.M. The strength of the menisci of the knee as it relates to their fine structure. J. Bone Joint Surg. 1970; 52(3):564-570.

421. Skaggs D.L., Warden W.H., Mow V. C. Radial Tie Fibers Influence the Tensile Properties of the Bovine Medial Meniscus. J. Orthop. Res. 1994; 12:176-185.

422. Petersen W. Tillmann B. Collagenous fibril texture of the human knee joint menisci. Anat. Embryol. 1998; 197:317-324.

423. Ghadially F.N., Lalonde J.-M.A and Wedge J.H. Ultrastructure of normal and torn menisci of the human knee joint. J. Anat. 1983; 136(4):773-791.

424. Rattner J.B., Matyas J.M, Barclay L., Sciore P., Reconsidering the structure of the neniscus: identification of new structural component interrelationships. 53rd Ann. Meeting ORS 2007:0795

425. B61int G., Than P., Dom6n I., WiegandN., HorvGth G., Lurinczy D. Calorimetric examination of the human meniscus. J. Therm. Anal. Calorimetry 2009; 95(3):759-761.

426. Fratzl P., Misof К., Zizak I., Rapp G., Amenitsch H., Bernstorff S. Fibrillar structure and mechanical properties of collagen. Review. J.Struct. Biol. 1997; 122(1-2): 119-122.

427. Калитеевский Н.И. Волновая оптика, M.: Наука. 1971. 376 с.

428. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. Саратов: Изд-во Саратовского Университета. 1998.

429. Welch A .J., van Gemert М .J.C, eds. Optical-thermal response of laser-irradiated tissue. New York, London: Plenum Press. 1995.

430. Wieliczka D.M., Weng S., Querry M.R. Wedge shaped cell for highly absorbent liquids: infrared optical constants of water. Appl. Opt. 1989; 28:1714-1719.

431. Dark L., Perelman L.T., Itzkan I., Schaffer J.L., Feld M.S. Physical properties of hydrated tissue determined by surface Interferometry of laser-induced thermoelastic deformation. Phys. Med. Biol. 2000; 45:529-539.

432. LeCarpentier G.L., Motamedi M., McMath L.P., Rastegar S., Welch A.J. Continuous wave laser ablation of tissue: analysis of thermal and mechanical events. IEEE Trans. Biomed. Eng. 1993; 40(2): 188-200.

433. Прикладная лазерная медицина. Берлиен Х.-П., Мюллер Г.Й., ред. М.: Интерэксперт. 1997.

434. McNally К.М., Sorg B.S., Welsh A.J. Photothermal effects of laser tissue soldering. Phys. Med. Biol. 1999; 44: 983-1002.

435. Tang S., O'Callaghan D., Rony S. Quantitative changes in collagen levels following 830 nm diode laser welding. Lasers Surg. Med. 1998; 22:207-211.

436. Brinkmann R., Radt В., Flamm C., Kampmeier J., Koop N., Birngruber R. Influence of temperature and time on thermally induced forces in corneal collagen and the effect on laser thermokeratoplasty. J. Cataract. Refract. Surg. 2000; 26(5):744-754.

437. Khan M.H., Sink R.K., Manstein D., Eimerl D., Anderson R.R. Intradermally focused infrared laser pulses: thermal effects at defined tissue depths. Lasers Surg. Med. 2005; 36(4):270-280.

438. Vangsness C.T.J., Mitchell W., Nimni M., Erlich M., Saadat V., Schmotzer H. Collagen shortening: An experimental approach with heat. Clin. Orthop. 1997; 337(1):267-271.

439. Matteini P., Sbrana F., Tiribilli В., Pini R. Atomic force microscopy and transmission electron microscopy analyses of low-temperature laser welding of the cornea. Lasers Med. Sci. 2009; 24:667-671.

440. Medvecky M.J., Ong B.C., Rokito A.S., Sherman O.H. Thermal capsular shrinkage: Basic science and clinical applications. Arthroscopy 2001; 17(6):624-635.

441. Wallace A.L., Hollinshead R. M., Frank С. B. The scientific basis of thermal capsular shrinkage. J. Shoulder Elbow Surg. 2000; 9:354-360.

442. Brinkmann R., Kampmeier J., Grotehusmann U., Vogel A., Koop N., Asiyo-Vogel M., Bimgruber R. Corneal collagen denaturation in laserthermokeratoplasty. Proc. SPIE 1996; 2681:56-63.

443. Hayashi K., Thabit G. Ill, Bogdanske J.J., Mascio L.N., Markel M.D. The effect of nonablative laser energy on the ultrastructure of jointcapsular collagen. Arthroscopy 1996; 12(4):474 — 481.

444. Hayashi K., Hecht P., Thabit G., Peters D.M., Vanderby R., Cooley A.J., Fanton G.S., Orwin J.F., Markel M.M. The biological response to laser thermal modification in an vivo sheep model. Clin. Orthop. Relat. Res. 2000; 373:265-276.

445. Selecky M.T., Vangsness C.T. Jr, Liao W.L., Saadat V., Hedman T.P. The effects of laser-induced collagen shortening on the biomechanical properties of the inferior glenohumeral ligament complex. Am. J. Sports Med. 1999; 27(2): 168-172.

446. Schaefer S.L., Ciarelli M.J., Arnoczky S.P., Ross H.E. Tissue shrinkage with the holmium: yttrium aluminum garnet laser. A postoperative assessment of tissue length, stiffness, and structure. Am J Sports Med. 1997; 25(6):841-848.

447. Naseef III G.S., Foster Т.Е., Trauner К., Solhpour Sh„ Anderson R.R., Zarins B.The thermal properties of bovin joint capsule. The basic science of laser- and radiofrequency-induced capsular shrinkage. Am. J. Sports Med. 1997; 25(5):671-673.

448. Valvano J.W., Pearce J. Temperature measurements. In: Welch A.J., van Gemert M.J.C.,eds. Optical-thermal response of laser-irradiated tissue. New York: Plenum Press. 1995.

449. Криксунов JI.3. Справочник по основам инфракрасной техники. М., Советское радио, 1978.

450. Госсорг Ж. Инфракрасная термография, Москва, 1988

451. Шиллинг. Статистическая физика в примерах. М., Мир, 1976, 431 с.

452. Григорьва И.С., Мейлихова Е.З., ред. Физические величины. Справочник. М.: Энергоатомиздат, 1991. 1232 с.

453. Ohno К., Yasuda К., Yamamoto N., Kaneda К., Hayashi К. Biomechanical and histological changes in the patellar tendon after in situ freezing. An experimental study in rabbits. Clin. Biomech. 1996; 11(4):207-213.

454. Weiss J. A., Maakestad B.J. Permeability of human medial collateral ligament in compression transverse to the collagen fiber direction. J. Biomech. 2006; 39(2):276-283.

455. Chen CT, Malkus DS, Vanderby R., Jr. A fiber matrix model for interstitial fluid flow and permeability in ligaments. Biorheology 1998; 35(2): 103-118.

456. Kleinstueck F.S., Diederich C.J., Nau W.H., Puttlitz C.M., Smith J.A., Bradford D.S., Lotz J.C. Acute biomechanical and histological effects of intradiscal electrothermal therapy on human lumbar discs. Spine 2001; 26(20):2198-2207.

457. Karamzadeh A.M., Chang J.C., Diaz S., Milner Т.Е., Wong B.J.F. Long-term in vivo stability of rabbit nasal septal cartilage following laser cartilage reshaping: a pilot investigation. Lasers Surg. Med. 2005; 36:147-154.

458. Trelles M.A., Mordon S.R. Correction of ear malformations by laser-assisted cartilage reshaping (LACR). Lasers Surg. Med. 2006; 38(7):659-662.

459. Sobol E., Omelchenko A., Mertig M., Pompe W. Scanning force microscopy of the fine structure of cartilage irradiated with CO2 laser. Lasers Med. Sci. 2000; 15:15-23.

460. M. Heger, S. Mordon, G. Leroy, L. Fleurisse, С. Creusy Raman microspectrometry of laser-reshaped rabbit auricular cartilage: preliminary study on laser-induced cartilage mineralization Journal of Biomedical Optics 11(2), 024003, March/April 2006

461. Youn J.I., Milner Т.Е. Evaluation of photothermal effects in cartilage using FTIR spectroscopy. Lasers Med. Sci. 2008; 23(3):229-235.

462. ManoharanR., Wang Y., Feld M.S. Histochemical analysis of biological tissues using Raman spectroscopy. Spectrochimica Acta. Part A 1996; 52: 215-249.

463. Gohen S.C., Lis L.J., Kauffman J.W. Raman spectroscopy of intact feline corneal collagen. Biochem. Biophys. Acta 1978; 536:197-204.

464. Knudsen L., Johansson C.K., Philipsen P.A., Gniadecka M., Wulf H.C. Natural variations and reproducibility of in vivo near-infrared Fourier transform Raman spectroscopy of normal human skin. J. Raman Spectrosc. 2002; 33:574-579.

465. Fercher A.F., Briers J.D. Flow visualization by means of single-exposure speckle photography. Optics Commun. 1981; 37(5):326-330.

466. Briers J. D., Webster S. Laser speckle contrast analysis (LASCA): a nonscanning, full-field technique for monitoring capillary blood flow. J. Biomed. Opt. 1996; 1(2): 174-179.

467. Maret G., Wolf P.E. Multiple light scattering from disordered media. The effect of. Brownian motion of scatterers. Zs. Phys. В 1987; 65:409-417.

468. MacKintosh F.C., John S. Diffusing-wave spectroscopy and multiple scattering of light in correlated random media. Phys Rev В 1989; 40:2383-2406.

469. Пиментел Дж., Мак-Клеллан О. Водородная связь. M.: Мир. 1964. 462 с.

470. Хэм А., Кормак Д. Гистология. Т. 2. М.: Мир.1982. 254 с.

471. Верещагин А.Г. Биохимия триглицеридов. М.: Наука. 1972.

472. Тютюнников Б.Н., ред. Химия жиров.М.: Колос. 1992. 448 с.

473. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. М.: Мир. 1993.

474. Garti N., Sato К., eds. Cristalization and polimorphism of fats and fatty acids. New York; Basel: Dekker. 1988. VIII, 450 c.

475. Zeberg-Mikkelesen C.K., Stenby E.H. Predicting the melting points and the enthalpies of fusion triglycerides by a group contribution method. Fluid Phase Equilibria 1999; 162:7-17.

476. Parks J.S., Atkinson D., Small D.M., Rude L.L. Physical characterization of lymph chylomicra and very low density lipoproteins from nonhuman primates saturated dietary fat. J. Biol. Chem. 1981; 256(24): 12992-142999.

477. Apfelberg D.B. Results of multicenter study of laser assisted liposuction. Clin. Plast. Surg. 1996; 23(4):713.

478. Johnson D.S., Cook W.R., Jr. Advanced techniques in liposuction. Semin. Cutan. Med. Surg. 1999; 18(2): 139-148.

479. Badin A.Z., Moraes L.M., Gondek L., Chiaratti M.G., Canta L. Laser lipolysis: flaccidity under control. Aesth. Plast. Surg. 2002; 26:335-339.

480. Свердлов JI. M., Ковнер М. А., Крайнов Е. П. Колебательные спектры многоатомных молекул, М.: ФИЗМАТЛИТ. 1970. 562 с.

481. Chen М., Irudayarai J., McMahon D.J. Examination of full fat and reduced fat Cheddar cheese during ripening by Fourier transform infrared spectroscopy. J. Dairy Sci. 1998; 81(ll):2791-2797.

482. Древинг В.П., Калашников Я.А. Правило фаз. М.: Изд-во Моск. Ун-та. 1964.- 455 с.

483. Huang С.Н., Li S. Calorimetric and molecular mechanics studies of the thermotropic phase behavior of membrane phospholipids. Biochim. Biophys. Acta 1999; 1422:273-307.

484. Belopolskaya T.V., Tsereteli G.I., GruninaN.A., Vaveliouk O.L. DSC study of the postdenaturated structures in biopolymer-water systems. J. Therm. Anal. Calorim. 2000; 62:75-88.

485. Козлов П.В., Папков С.П. Физико-химические основы пластификации полимеров. М.: Химия. 1982.-224.

486. Сочава И.В., Смирнова О.И. Теплоемкости увлажненных и обезвоженных глобулярных белков. Денатурационный инкремент теплоемкости. Молекулярная биология 1993; 27(3):348-357.