Тонкослойная хроматография диацилглицеринов и ее применение для анализа видового состава их смеси тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Методы хроматографического фракционирования липидов.

1.2 Анализ смесей нативных липидов.

1.3 Анализ смесей липидов в виде продуктов их гидролиза.

1.3.1 Разделение диацилглицеринов по величине липофильности.

1.3.2 Разделение диацилглицеринов по ненасыщенности.

1.4 Анализ смесей липидов в виде производных диацилглицеринов.

1.4.1 Фракционирование ацетилдиацилглицеринов.

1.4.2 Фракционирование других производных диацилглицеринов .

Полярные глицеролипиды* нормально функционирующей биологической мембраны, как правило, включают в качестве их главных структурных элементов несколько классов диацильных фосфо- и гликолипидов, несущих различные полярные головные группы. В свою очередь, любой из этих классов обычно представляет собой совокупность нескольких видов липидов, содержащих одну и ту же гидрофильную головную группу, но имеющих различные диацилглицериновые (5«-1,2-ДАТ) радикалы. Каждый вид липидов, относящийся к тому или иному классу, характеризуется общим числом атомов углерода (тт.\ + тзп.?) и двойных связей (е5П„1 + е^) в остатках жирных кислот этих радикалов. Физико-химические и биологические свойства таких липидов во многом определяются видовым составом (тонкой структурой) их ДАГ-остатков, т.е. качественным составом и количественным содержанием индивидуальных видов данных липидов в мол.% [5]

НгС-ОСОЯ1 тт.ь етЛ тзп-2, е*п-2 Я2ОСО-СН н2с-он

В настоящее время липиды биологических объектов чаще всего изучаются с точки зрения содержания их отдельных классов и жирнокислотного состава; видовой состав их ДАГ-остатков исследуется значительно реже, поскольку методы анализа тонкой структуры ДАТ развиты еще недостаточно [94]. Между тем, будучи важнейшим элементом структуры липидов, ДАТ принимают участие во всех процессах их биосинтеза и метаболизма, а, следовательно, - и в функционировании клеточных мембран. Кроме того, благодаря особенностям своей структуры - наличию полярной гидроксильной группы и гидрофобных

Ниже, до конца главы I, полярные глицеролипиды обозначаются термином "липиды". 8 алифатических цепей, свободные ДАТ способны стабилизировать водомасляные эмульсии [154]. Поэтому ДАТ используют в качестве главных компонентов биологически совместимых эмульгаторов в производстве пищевых и косметических продуктов. Эти эмульгаторы обычно получают в промышленном масштабе путем переработки и модификации жиров различных типов, и их технологические свойства зависят не только от жирнокислотного, но и от видового состава ДАТ [154]. При технологическом контроле производства эмульгаторов необходимо располагать данными анализа тонкой структуры ДАТ, проведение которого требует разработки надежных методов определения видового состава ДАТ [154]. Поэтому исследование этого состава в настоящее время весьма актуально.

Таким образом, исследование тонкой структуры липидов является важной задачей современной мембранологии и химической технологии. Основным методом такого исследования обычно служит хроматография. Однако, вследствие сложности видового состава природных липидов, каждая из получаемых хроматографических фракций, как правило, представляет собой смесь отдельных видов липидов. Поэтому в настоящее время для аналитического или препаративного разделения того или иного класса липидов на индивидуальные виды необходимо использовать последовательно несколько хроматографических методов. К их числу принадлежат жидкостная (ЖХ) и газожидкостная хроматография (ГЖХ).

До сих пор главным методом определения видового состава таких липидов обычно служила ГЖХ. Однако для её осуществления необходимо сначала получить летучие липофильные О-производные ДАТ, что значительно затрудняет последующую регенерацию исходных ДАТ. Кроме того, получение таких производных, особенно ненасыщенных, нередко связано с большим или меньшим нарушением нативности проб исходных ДАТ; обычно он сопровождается изменением состава таких проб, что вызывается их частичной потерей и разрушением в ходе синтеза. Наконец, само ГЖХ-фракционирование О-производных ДАТ приводит к абсорбции части липидов в колонке [47]. 9

Для ГЖХ этих производных в большинстве случаев пригодны только неполярные стационарные фазы, обеспечивающие фракционирование лишь по числу атомов углерода т. Хотя в последние годы ГЖХ производных ДАТ проводили и на полиэфирных стационарных фазах [94], ГЖХ-разделение данных производных по числу олефиновых связей е ещё не получило широкого распространения, что ограничивает применимость ГЖХ для анализа преобладающих в природных липидах ненасыщенных ДАТ. Кроме того, выполнение их ГЖХ-фракционирования часто затруднено вследствие термолабильности полярной стационарной фазы. Все эти факторы сильно снижают количество информации о видовом составе ДАТ, получаемой при ГЖХ-анализе, даже в сочетании с масс-спектрометрией; в данной работе ГЖХ использовали лишь для определения жирнокислотного состава ацилглицеринов.

Мы приходим к выводу, что для исследования состава смесей насыщенных и ненасыщенных видов ДАТ целесообразно применять другую разновидность хроматографии - ЖХ. Таким образом, задача настоящей диссертационной работы состояла в определении видового состава сложной смеси ДАТ методами их ЖХ-разделения, и эта задача является актуальной.

выводы

1. Разработан метод составления из природных масел препаратов триацилглицеринов с любым заданным жирнокислотным составом. Из продуктов глицеролиза одного из таких препаратов получена с высоким (47 мол. %) выходом модельная смесь свободных диацилглицеринов (ДАТ) с эквимолярным (20 ± 3 мол. %) содержанием остатков стеариновой (С), пальмитиновой (П), олеиновой (О), линолевой (Л) и линоленовой (Ле) кислот.

2. При сопоставлении ДАТ этой смеси со стандартными видами ДАТ известного жирнокислотного состава по их подвижности в условиях обращенно-фазовой ТСХ (ОФ ТСХ) диметилборатных эфиров ДАТ, адсорбционной ТСХ л-комплексов ДАТ с ионами А§+ (Ag+TCX) и ОФ ТСХ диметилборатных эфиров таких комплексов (А§+ОФ ТСХ) в смеси были однозначно идентифицированы 3, 8 и 11 индивидуальных видов ДАТ, соответственно, при последовательном применении всех трёх ТСХ-методов -13 видов ДАТ, а при сочетании Ag+TCX и Ag+OФ ТСХ в виде двухмерной хроматографии — ещё два вида.

3. Судя по этим данным, модельная смесь ДАТ (п.1), состоит из следующих 15 видов: СС, СП, СО, ПП, ПО, 00, СЛ, ПЛ, ОЛ, ЛЛ, СЛе, ПЛе, ОЛе, ЛЛе и ЛеЛе, т.е. из тех и только тех видов, которые могут образоваться при статистическом распределении ацильных остатков между отдельными оксигруппами молекулы глицерина.

4. По полноте разделения ДАТ двумерная ТСХ (п.2) не уступает методам ОФ высокоэффективной и газо-жидкостной хроматографии.

5. При ОФ ТСХ минимальное различие по величине липофильности между видами ДАТ, необходимое для их отделения друг от друга, равно двум, а зависимость подвижности диметилборатных эфиров ДАТ от их липофильности является обратно пропорциональной и носит линейный характер.

6. С ростом ненасыщенности ДАТ подвижность всех этих ДАТ при Ag+TCX экспоненциально убывает, а при А§+ОФ ТСХ — линейно увеличивается.

107

7. Любой полиненасыщенный индивидуальный вид ДАГ модельной смеси с остатками жирных кислот резко отличной друг от друга конформации алифатической цепи по сравнению с иным видом ДАТ той же ненасыщенности, отдельные ацильные остатки которого по своей конформации в целом сходны между собой, характеризуется большей полярностью его А§+-комплекса и потому - меньшей подвижностью при Ag+TCX и большей подвижностью при А£+ОФ ТСХ.

8. Эти методы обнаруживают сходство друг с другом по свойствам возникающих координационных А^-комплексов ненасыщенных ДАГ, но различаются между собой по механизму фракционирования этих комплексов.

108

1.5. Заключение

Данные литературного обзора показывают, что за последние годы в ЖХ свободных ДАТ и их липофильных производных были достигнуты

30 определенные успехи. В целом ряде случаях, когда содержание основного компонента во фракциях превышало 96%, отклонение вычисленных параметров эквивалентной липофильности или ненасыщенности получаемых фракций от номинальных было невелико (¿х < 1%, < 3%), а степень разделения была высокой (Я > 1,5, см. разделы 1.2-1.4). В то же время во многих опытах этого не наблюдалось вследствие недостаточной эффективности фракционирования ДАТ. Для отдельных фракций даже липофильных производных ДАТ абсолютные величины ¿х и™ часто превышали соответствующие параметры исходных ДАТ, а рост гидрофобности тех или иных производных ДАТ не приводил к снижению этих величин. Главные недостатки работ по установлению видового состава ДАТ заключались в том, что анализируемые производные характеризовались низкой стабильностью в подвижной фазе, выход фракций был невелик и данные их жирнокислотного состава отсутствовали, что не позволяло достоверно идентифицировать последние, а сами опыты отличались недостаточной воспроизводимостью. Таким образом, для совершенствования методов ЖХ-определения видового состава ДАТ необходимы дальнейшие исследования.

При решении данной проблемы необходимо исходить из того, что разделение фракций ДАТ, характеризующихся различными е или Ь, должно быть, прежде всего, полным (см. выше). Таким образом, следовало обеспечить максимально достижимую степень фракционирования ДАТ, а затем оценить с этой точки зрения пригодность данного метода ЖХ для надёжного определения видового состава ДАТ.

Как видно из обзора, в настоящее время для разделения ДАТ или их липофильных производных часто используют метод ОФ ВЭЖХ, а Ь-фракционирование последних на ВЭЖХ-колонке с микрочастицами силикагеля, содержащими привитые углеводородные цепи, сейчас практически полностью вытеснило другие способы их ¿-разделения. Тем не менее, соотношение величин к' фракций липидов с Ат = 2 не превышало 1,15 [131,148]. Метод А§+ВЭЖХ на колонке ещё не получил широкого распространения для е-разделения ДАТ, поскольку при этом следует

31 поддерживать исходную концентрацию ионов серебра в стационарной фазе. Это сильно удорожает анализ, поскольку для каждого, в особенности — препаративного фракционирования требуется значительный объём такой фазы. Учитывая эти недостатки, а также высокую стоимость и аппаратурную сложность ВЭЖХ, мы решили не использовать данный метод в нашей работе.

ОФ ТСХ на гидрофобном носителе, покрытом слоем парафиновых углеводородов,. превосходит ОФ ВЭЖХ по степени ¿-разделения липидов [126]. Однако стабильность этого слоя невелика; кроме того, ОФ ТСХ трудно автоматизировать. До начала нашей работы этот метод не считался перспективным для определения видового состава свободных ДАТ: ОФ-разделение ДАТ упоминалось лишь в единственном сообщении, носившем предварительный характер [139]. Тем не менее, по нашему мнению, потенциал данного метода еще далеко не исчерпан, и потому мы решили усовершенствовать ОФ ТСХ и применить её для определения видового состава ДАТ.

При оценке других ТСХ-методов по их пригодности для проведения такого определения принимали во внимание, что в случае А§+ТСХ удовлетворительная степень разделения липидов достигалась, когда концентрация в адсорбенте не превышала 2% [108]. Метод Ая+ТСХ часто давал удовлетворительные результаты при е-фракционировании сложных смесей липидов, и потому мы сочли целесообразным оценить в настоящей работе его возможности для установления видового состава ДАТ.

Наконец, имеется еще один метод фракционирования олефиновых нейтральных липидов - ОФ ТСХ их л-комплексов с ионами серебра (А§+ОФ ТСХ). Этот метод применяется уже в течение длительного времени, поскольку он отличается мягкими условиями фракционирования, высокой эффективностью разделения и не требует превращения природных липидов в те или иные производные [98]. По полноте их фракционирования он превышает как ОФ ТСХ, так и А^ТСХ [4], однако ранее [126] для определения видового состава ДАТ этот метод не использовали, и потому он не рассматривался в литературном обзоре. Поэтому представляло

32 несомненный интерес оценить его применимость для фракционирования ДАТ.

Таким образом, для нашей работы по ЖХ-разделению ДАТ были выбраны методы ОФ ТСХ, А§+ТСХ и Ag","OФ ТСХ. Ограниченные рамки данного исследования не позволили включить в него определение количественного состава ДАТ, которое сейчас является отдельной темой лаборатории, и потому цель диссертационной работы состояла в установлении только качественного видового состава сложной смеси ДАТ методами ТСХ.

Во многих случаях для ТСХ-идентификации отдельных видов нейтральных липидов их ТСХ-зоны предварительно элюировали с пластинки, а затем жирнокислотный состав элюата определяли методом ГЖХ [136]. Однако в настоящей работе был использован иной подход к установлению видового состава ДАТ, а именно — применение в процессе ТСХ стандартов ДАТ известного состава. Преимущества такого подхода заключаются в том, что он обеспечивает быстрое проведение массовых анализов качественного состава ДАТ в условиях любой химической (заводской) лаборатории, не требуя при этом сложных и дорогостоящих приборов для ГЖХ и ВЭЖХ, дефицитных и токсичных реактивов и повседневного выполнения трудоёмкого синтеза метиловых эфиров жирных кислот. В данном случае для установления состава ДАТ необходимы лишь набор их стандартов и простое оборудование для ТСХ.

Цель настоящей работы состояла в создании методов ТСХ свободных ДАТ и определении качественного видового состава модельной смеси ДАТ, полученной глицеролизом смеси растительных масел, а также в установлении функциональной зависимости ТСХ-подвижности ДАТ от их состава и свойств.

Задачи настоящего исследования включали:

- составление смеси ТАГ растительных масел с заданным составом, включавшей остатки П, С, О, Л и Ле кислот в эквимолярных концентрациях;

- получение из неё модельной смеси ДАТ с аналогичным

33 жирнокислотным составом;

- синтез стандартов ДАТ простого видового состава;

- ТСХ-разделение и ЖХ-идентификацию всех индивидуальных видов ДАТ в их модельной смеси с использованием стандартов ДАТ;

- определение (на основе данных идентификации) видового состава ДАТ и закономерностей распределения ацильных остатков в ДАТ этой смеси;

- сопоставление ТСХ с ГЖХ и ВЭЖХ по полноте фракционирования

ДАГ;

-установление функциональной зависимости подвижности индивидуальных видов ДАТ в различных ТСХ-системах от жирнокислотного состава и конформации видов ДАТ.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработанный подход для создания композиций ТАГ любого общего жирнокислотного состава и получения из них модельных смесей ДАГ.

2. Возможность установления видового состава ДАТ без проведения ГЖХ-анализа общего жирнокислотного состава отдельных зон комбинацией Аз+ТСХ и Ag+OФ ТСХ, по полноте фракционирования 15 видов модельной смеси превосходящей ОФ ВЭЖХ и не уступающей ГЖХ.

3. Соответствие видового состава переэтерифицированной модельной смеси ДАТ статистическому распределению ацильных остатков между ее отдельными молекулами.

4. Существование обратной экспоненциальной зависимости между подвижностью и ненасыщенностью ДАТ при Ag+TCX и линейной - при А£+ОФ ТСХ, а также наличие связи полярности и характера подвижности ненасыщенных видов ДАТ с конформацией их молекул.

Экспериментальные исследования, положенные в основу диссертационной работы, выполнены в Лаборатории липидного обмена Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева Российской Академии наук.

34

Автор выражает свою глубокую благодарность заместителю директора Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева Российской Академии наук кандидату биологических наук В.Д. Цыдендамбаеву за помощь при выполнении данной работы.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

II. 1. Синтез метиловых эфиров жирных кислот

Ацилсодержащие липиды подвергали омылению в 4 %-ном этанольном растворе этилата натрия с обратным холодильником в течение 1 ч при т.кип. После омыления этанол отгоняли и замещали водой. Неомыляемые вещества трижды экстрагировали гексаном. К водно-щелочному раствору добавляли 20 %-ную серную кислоту (до рН 2-3) и образовавшиеся свободные жирные кислоты также экстрагировали гексаном. Растворитель отгоняли; сухой остаток растворяли в абсолютном метаноле, смешивали с ацетилхлоридом (9:1, об/об) и выдерживали в течение 1 ч при температуре кипения смеси. Летучие растворители отгоняли, к остатку добавляли воду и метиловые эфиры высших жирных кислот экстрагировали гексаном. Жирнокислотный состав этих эфиров определяли методом ГЖХ [174].

II.2. Получение триметилбората

Смесь 475 г (600 мл, 14,8 М) абсолютного метанола и 111 г (1,8 М) борной кислоты (х.ч.) нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 3 ч. Затем смесь охлаждали и выдерживали с избытком безводного сульфата натрия в течение 45 ч для удаления воды, образовавшейся при этерификации. Надосадочную жидкость декантировали и перегоняли с ёлочным дефлегматором, собирая азеотропную смесь метанола и триметилбората с температурой кипения от 54,6 до 55,0°С и «о20 1,3478 [7].

35

И.З. Приготовление препаратов диацилглицеринов

И.3.1. Получение смеси триапилглиперинов и ее глиперолиз

Препараты ТАГ из масла бобов какао (сорт Accra), предварительно подвергнутых двукратной кристаллизации из 10%-ного (в/об) раствора в гексане, и из масел семян мака и льна [3, 4] очищали на колонке с окисью алюминия [80]. Судя по данным ТСХ (см. раздел II.3.2), выделенные из колонки ТАГ не содержали посторонних компонентов. Препараты трипальмигоил- (ППП) и тристеароил- (ССС) глицеринов (С grade, California Foundation for Biochemical Research, США) использовали без дополнительной обработки; содержание основного компонента в этих однокислотных ТАГ принималось равным 100%.

Препарат ТАГ из масла какао (2,63 г) смешивали с ТАГ из масел льна (3,73 г) и мака (2,17 г), прибавляли ССС (0,84 г) и ППП (0,63 г) и определяли жирнокислотный состав полученной смеси (см. стол.1 на рис. 2.1). К 10,00 г (11,5 мМ) этой смеси добавляли 1,30 г (14,1 мМ) безводного глицерина и 11 мг (0,3 мМ) гидроксида натрия в качестве катализатора глицеролиза [141, 158], выдерживали при непрерывном пропускании аргона в слабом вакууме (~1 кПа) при 200°С в течение 4 ч, растворяли в 100 мл эфира, промывали 20 %-ным водным раствором хлорида натрия до нейтральной реакции и высушивали безводным сульфатом натрия. После упаривания в вакууме получали 10,78 г смеси ацилглицеринов (выход 95,4%) и определяли её жирнокислотный состав.

Для установления качественного состава ацилглицеринов в полученной смеси в стартовые точки пластинки "Силуфол" (Kavalier, Чехия) наносили по 100 мкг этой смеси, а также стандартной смеси нейтральных липидов [167]. После ТСХ-разделения в течение 15 мин в системе гексан-эфир-уксусная кислота (50:50:1, об/об/об) липиды окрашивали путем обработки пластинки 5%-ным раствором фосфорно-молибденовой кислоты (ФМК) в смеси пропан-2-ола и воды (1:1, об/об) и нагревания пластинки в течение 10 мин при 120°С [167].

36

II.3.2. Получение смеси гас- 1.2-и гас- 1.3-диашшглицеринов (модельной смеси 1) из продуктов глицеролиза

Выделение препарата ДАТ проводили по видоизмененному методу Квинлина и Вэйзера [137]. В колонку 42 х 2 см, содержавшую 60 г силикате ля для адсорбционной хроматографии (М. \Voelm, Германия), вносили 2,74 г смеси ацилглицеринов в бензольном растворе и разделяли её на отдельные классы, используя последовательно бензол (растворитель 1), смесь бенола и эфира (9:1, растворитель 2) и эфир (растворитель 3). Для сбора элюата использовали автоматический коллектор фракций (Руе ишсаш, Англия). С помощью растворителей 1, 2 и 3 получали фракции ТАГ, ДАТ (модельной смеси 1, см. стол.2 на рис.2.1) и МАГ, масса которых составила 1,14 г, 1,11 г и 0,33 г, соответственно (выход 94,1%), и устанавливали их жирнокислотный состав [14].

Для оценки степени чистоты полученных фракций выполняли ТСХ-разделение 100-мкг аликвот каждой фракции (см. выше); в одну из стартовых точек пластинки наносили в качестве стандарта 0,5 мкг ТАГ. Соотношения между величинами интенсивности окраски отдельных зон после ТСХ-разделения (см. раздел П.3.1) оценивали визуально. Препарат модельной смеси 1 хранили в запаянных ампулах в бензольном растворе на холоду [11].

П.3.3. Получение смеси гас-\.2-изомеров диаиилглицеринов (модельной смеси 2) из модельной смеси 1

Для получения модельной смеси 2 40 мг модельной смеси 1 (см. раздел П.3.2) наносили полосой на слой (200x200x0,5 мм), содержавший 9,5 г силикагеля ЛСЛ 5/40 мкм с 13% гипса ("Хемапол", Чехия) и 0,5 г борной кислоты, и разделяли в камере для восходящей хроматографии в подвижной фазе хлороформ + ацетон (98:2, об/об, 50 мл) в течение 1,5 ч. После разделения пластинку опрыскивали 0,001%-ным раствором родамина бО и зоны гас-1,2- и гас-1,3-ДАГ (Я/ = 0,3 и 0,5 соответственно) обнаруживали в УФ-свете при 254 нм. Каждый региоизомер ДАТ элюировали с адсорбента в экстракторе [11] смесью хлороформа, метанола и триметилбората (2:1:0,1,

Рис.2.1. Схема получения модельных смесей ДАТ 1 и 2, стандартных смесей ДАТ к, м и л и стандартных смесей ДАТ 1-7

38 об/об/об) в течение 1 ч и растворяли в бензоле. Полученную модельную смесь 2 (15 мг, см. стол. 4 на рис.2.1) хранили на холоду (см. раздел Н.3.2).

П.3.4. Получение стандартных смесей гас-1.2- + гас- 1.3-диашшглицеринов и гас- 1.2-диацилглицеринов простого видового состава

Стандартные смеси гас-1,2- + гас-1,3-ДАТ (к, мил, см. стол.1 на рис.2.1) для ОФ ТСХ (см. раздел П.5.1) выделяли как описано выше (см. раздел П.3.1), но использовали не смесь масел, а отдельные масла какао, мака и льна, соответственно.

С целью создания стандартных смесей гас-1,2-ДАГ (стандартов 1-7, см. стол.4 на рис.2.1) смеси метиловых эфиров жирных кислот, полученные кислотным метанолизом масел какао, мака и льна (ЯСООМе, см. стол.2 на рис.2.1 и раздел Ш.З), растворяли в 22%-ном метанольном растворе мочевины и образовавшиеся карбамидные комплексы этих эфиров осаждали фракционной кристаллизацией при различной температуре [11]. Метиллиноленат выделяли из масла льна как описано ранее [2]. Из полученных препаратов составляли семь смесей метиловых эфиров для синтеза ДАТ в стандартах 1-7 (КСООМе, см. стол.З на рис.2.1), в которых число главных видов жирных кислот п было равно двум или тре м: 1) П + О, 2) С + О, 3) С + П + Л, 4) С + П + Ле, 5) О + Л, 6) О + Л + Ле и 7) Л + Ле.

Для синтеза гас-1,2-ДАГ в стандартах 1-7 (см. стол.4 на рис.2.1) использовали видоизмененный метод Маркли [105]. К каждой из смесей эфиров 1 - 7 (2 мМ) прибавляли глицерин (1 мМ), п-толуолсульфокислоту (2 мМ) и 10 мл толуола и выдерживали при 118°С с обратным холодильником в течение 1 ч. Из продуктов этой реакции выделяли сумму гас-1,3- и гас-1,2-региоизомеров ДАГ(см. раздел III.3.2), из которой, в свою очередь, получали гас-1,2-ДАТ, служившие стандартами 1 - 7, а также препарат гас-1,3-ЛЛ (см. раздел И.З.З).

39

11.4. Изготовление пластинок с постоянным слоем для тонкослойной хроматографии

Для получения стеклянных пластинок с тонким слоем инертного носителя 20 г кизельгура (Хроматон N, "Хемапол", Чехия, размер частиц 0,100 - 0,125 мм) силанизировали диметилдихлорсиланом [11], смешивали с 60 г 7-мкм порошка стекла [167], полученную смесь суспендировали в 90 мл воды и наносили на пластинки 20 х 10 см с помощью автоматического аппликатора слоя SSG-1 ('Текнишес Глас", Ильменау, Германия); величина просвета аппликатора составляла 0,5 мм. После высыхания слоя на воздухе при 20°С пластинки нагревали при 675°С в течение 20 мин [167]. Готовые пластинки очищали от органических примесей в смеси серной и азотной кислот (9:1, об/об) при 90°С в течение 3 ч, а затем через закрепленный слой пропускали метанол. Эти пластинки, которые можно было использовать для разделения неограниченное число раз, в данной работе обозначали термином "пластинки с постоянным слоем носителя" [16].

Стеклянные пластинки с постоянным тонким слоем силикагеля изготовляли по известному методу [167], но для суспендирования смеси порошка стекла и силикагеля применяли не толуол, а воду. Эти пластинки, которые также можно было использовать для разделения неограниченное число раз, в данной работе обозначали термином "пластинки с постоянным слоем адсорбента" [167].

11.5. Тонкослойная хроматография смесей диацилглицеринов II.5.1. Обращённо-фазовая хроматография

Для нанесения стационарной фазы пластинку с постоянным слоем носителя погружали в 10%-ный (об/об) бензольный раствор тетрадекана и выдерживали на воздухе до полного улетучивания бензола. Стандарты ДАТ к, м и л из масел какао, мака и льна (см. стол. 1 на рис.2.1), а также модельную смесь 1 наносили на стартовую зону пластинки полосой 65 х 2 мм с помощью автоматического аппликатора пробы GSG-1 ("Текнишес

40

Глас"), или в виде отдельных точек.

В качестве подвижной фазы использовали сначала смесь метанола и воды (95:5, об/об), а в дальнейшем для получения такой фазы к 1 объёму азеотропной смеси триметилбората с метанолом (см. раздел II.2) прибавляли 9 объёмов абсолютного метанола и образовавшуюся смесь насыщали к-тетрадеканом.

Препараты ДАТ (200 мкг на стартовой полосе или 20 - 50 мкг в отдельных точках) разделяли в течение 2,5 ч в камере для восходящей ТСХ (тип ОЕ-304, "Лабор", Будапешт, Венгрия) при 23 ± 0,5°С (термостат Bruwa, "Лаборгерэте", Берлин, Германия). Тетрадекан удаляли с пластинок в вакуумном сушильном шкафу LP-402 ("Лабор", Эстергом, Венгрия) в -течение 45 мин при 140°С [16]. /;

После обнаружения зон ненасыщенных ДАТ с помощью ФМК (см. раздел II.3.1) хроматограмму фотографировали и получали с негатива позитивное изображение (13 х 18 см) на рентгеновской пленке РМ-1 ("Свема", Шостка, Украина). Снимок сканировали в проходящем свете на универсальном автоматическом денситометре, сконструированном на кафедре автоматизации Московского государственного университета пищевых производств. Площади пиков денситограммы, соответствующих отдельным хроматографическим зонам, определяли гравиметрическим методом. При расчете значения Rf центром каждой такой зоны считали максимум её пика на денситограмме.

II.5.2. Адсорбционная хроматография в присутствии ионов серебра

Для Ag+TCX пластинку с постоянным слоем адсорбента (10 х 20 см) пропитывали 1%-ным метанольным раствором нитрата серебра [108]. В стартовые точки этой пластинки наносили по 20-50 мкг модельной смеси 1, модельной смеси 2 и стандартов 1 - 7, а также препаратов гас-1,3-ЛЛ или гас-1,3-ДАГ из модельной смеси 1, и разделяли их в течение 3 ч (при анализе насыщенных, а также moho-, ди- и триеновых видов ДАТ) или 23 ч (для тетра-, пента- и гексаеновых видов ДАТ), используя в качестве подвижной фазы смесь хлороформа и пропан-2-ола (99:1, об/об),

1 J насыщенную нитратом серебра [108]. Для разделения использовали непрерывную ТСХ, при которой верхний 1-2-см участок пластинки находился вне хроматографической камеры, и подвижная фаза могла свободно испаряться с этого участка [1]. Ионы серебра удаляли с адсорбента водой и сухую пластинку выдерживали 30 мин в атмосфере паров брома с тем, чтобы при последующем окрашивании ДАТ, как описано в разделе II.3.1, можно было достичь проявления зон не только ненасыщенных, но и насыщенных ДАТ.

II.5.3. Обращённо-Фазовая хроматография в присутствии ионов серебра: двумерная хроматография

Для одномерного Ag+ОФ ТСХ-фракционирования модельной смеси 2 (раздел И.З.З) всю поверхность пластинки "Силуфол" (15 х 15 см, Kavalier, Чехия) пропитывали сначала нитратом серебра, а затем w-тетрадеканом (см. разделы II.5.1 - 2). В стартовые точки этой пластинки наносили по 20-50 мкг модельной смеси 2 и стандартов 1-4 (см. стол.4 на рис.2.1) и разделяли их способом непрерывной ТСХ в течение 3 ч, используя в качестве подвижной фазы 5%-ный метанольный раствор борной кислоты, насыщенный нитратом серебра и тетрадеканом.

Для выполнения двумерной ТСХ модельной смеси 2 участки А и Б пластинки (рис.2.2) пропитывали раствором нитратом серебра в направлении 1 и в точку В наносили эту смесь. После проведения Ag+TCX данной смеси в направлении пропитывания 1 участок Б, не использованный при Ag+TCX, пропитывали тетрадеканом, а затем образовавшиеся зоны разделяли методом Ag+ОФ ТСХ в направлении 2, перпендикулярном первому (см. рис.2.2). Зоны ДАТ обнаруживали как описано в разделе II.6.

43

П.6. Обнаружение зон диаиилглицеринов и полуколичественная оценка видового состава стандартных смесей диацилглицеринов и модельной смеси 2

После удаления с пластинки растворимых солей серебра и/или тетрадекана отдельные ТСХ-зоны ии- и БИ-ДАГ, где и = О, Л или Ле, обнаруживали с помощью ФМК (см. раздел П.3.1), а ББ-ДАГ, не реагирующие с ФМК, окрашивали 10%-ным раствором сульфата меди в 8%-ном растворе фосфорной кислоты (СиБС^ + Н3РО4); этот реактив обнаруживал также БИ- и ии-ДАГ [36]. Затем пластинку выдерживали 5-10 мин при 170°С. Относительную интенсивность окрашивания зон ДАТ оценивали визуально и обозначали (в порядке ее повышения) символами ""+", "++" и "+++".

11.7. Расчет параметров хроматографического разделения

Для измерения хроматографической подвижности ДАТ при ОФ ТСХ использовали значения удерживания их зон относительно фронта растворителя (Щ.

В наших опытах по Аз+ТСХ и Ag+OФ ТСХ для разделения ДАТ применялась непрерывная ТСХ, которая, по сравнению с обычной ТСХ, улучшает разделение зон ДАТ между собой. Очевидно, что при использовании этого варианта ТСХ расстояние от стартовой точки до границы фронта подвижной фазы по окончании разделения, а, следовательно, - и индекс удерживания отдельных ТСХ-зон относительно этого фронта (Яу) не могут быть определены. Поэтому для измерения хроматографической подвижности вместо Яу применяли значения удерживания зон относительно величин удерживания какого-либо однокислотного стандарта ДАТ (^х)

При непрерывной А§+ТСХ модельной смеси 2 в качестве такого стандарта было целесообразно использовать изомер гас-1,3-ЛЛ, полученный из продуктов каталитической переэтерификации смеси метиловых эфиров жирных кислот масла мака с глицерином, поскольку по величине подвижности он не совпадал ни с одной из зон гас-1,2-ДАГ.

44

Наблюдавшиеся значения подвижности j-ой зоны ДАТ выражали как отношение к подвижности стандарта (i?i,3-JDi)j> для которого, очевидно, значение = 1- При Ag+ОФ ТСХ соответствующим стандартом служил гас-1,2-ЛеЛе, поскольку по величине подвижности он превышал все остальные компоненты модельной смеси 2, для которых, следовательно, ^1,2-ЛеЛе < 1- Подвижность j-ой зоны ДАТ при этом характеризовали величиной (^1,2-ЛеЛе)] Окончательный результат расчета подвижности ДАТ при непрерывной ТСХ с помощью обоих этих стандартов выражали значением х ± s, где jc - средняя арифметическая пяти измерений ее величины, a s - абсолютное стандартное отклонение этих измерений от х.

Эквивалентную липофильность индивидуальных видов ДАТ при ОФХ выражали величиной Lj (см. раздел 1.1), а при Ag+ОФ ТСХ - величиной L2 = Lj — и, где и - число U-ацильных остатков в молекуле ДАТ [6,17].

Разделяющую способность отдельных разновидностей ТСХ в отношении наших модельных смесей ДАТ выражали величиной полноты фракционирования (ПФ), равной отношению числа индивидуальных видов ДАТ смеси, выделенных и идентифицированных с помощью данной разновидности ТСХ, к общему числу видов ДАТ в той или иной смеси (равному 15). Эффективность данного метода оценивали также значениями AL], LL2 или Ае, т.е. минимальной разностью между соседними зонами ДАТ по величине соответствующего параметра молекулы, еще обеспечивавшую их разделение между собой.

II.8. Расчет статистического видового состава смеси диацилглицеринов

Обычно в смеси ТАГ, полученной переэтерификацией при высокой температуре в течение продолжительного времени, имеет место статистическое распределение ацильных остатков между молекулами глицерина [5]. Возможное общее число видов ТАГ в такой смеси (N, без учета изомеров положения), концентрации этих видов (Ai, А2, . мол.% от их суммы) и количественный состав этой смеси (мол.%), вычисленный согласно теории статистического распределения, обозначают терминами "статистическое число", "статистические концентрации" и "статистический

45 состав", соответственно. Значения N и Ai, А2, . рассчитывают, исходя из числа (п) и концентрации (а, Ь, . мол.%) остатков индивидуальных жирных кислот в смеси ТАГ. Как известно, в такой смеси N = п + п(п-1) + п(п-1)(п-2), а статистические концентрации одно-, двух- и трёхкислотных видов ТАГ равны а3/104, За2Ь/Ю4 и 6abc/104, соответственно [5].

Можно было считать, что распределение остатков жирных кислот в смесях ДАТ, полученных переэтерификацией, также является статистическим [5]. Поэтому с целью расчета статистического состава ДАТ в этих смесях мы видоизменили соответствующие вероятностные уравнения для вычисления N, а также Ai, А2 (см. выше). Очевидно, что N складывается из общего числа одно- и двухкислотных видов ДАТ, т. е. N = п + п(п-1)/2 = п(п+1)/2. Аналогичным образом, для каждого одно-кислотного вида ДАТ Ai = а2/100, а для любого двухкислотного вида А2 = 2д6/100; коэффициент 2 был введен в noaiáíee уравнение для учета обоих позиционных изомеров ДАТ [128]. Для описания вычисленного видового состава ДАТ в их смеси, полученной глицеролизом, использовали термины, приведенные выше.

Статистические концентрации ТАГ, ДАТ и МАГ в продуктах глицеролиза рассчитывали по формулам: у3/Ю4, Зу2(100-у)/104 и Зу(100-у)2/104, соответственно [104], где у = 100[ТАГ] /{[ТАГ] + [глицерин]} -содержание этерифицированных оксигрупп глицерина в мол.% от суммарного содержания всех оксигрупп (как этерифицированных, так и свободных) в исходной смеси для глицеролиза, а [ТАГ] и [глицерин] -концентрация ТАГ и глицерина (в мМ) в этой смеси (см. раздел II.3.1). Суммарную концентрацию ацилглицеринов принимали равной 100 мол.% и вычисляли концентрацию каждого из них (мол.%).

46

1. Андреев J1.B., Кощеенко К.А. Определение продуктов микробиологической трансформации кортикостероидов методом проточной тонкослойной хроматографии//Журн. аналит. химии.-1976.-T.31.-N 2.-С.343-348.

2. Бергельсон Л.Д.,Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г. и др. Препаративная биохимия липидов. М.: Наука, 1981.-С. 100.

3. Верещагин А.Г. Состав триглицеридов масла мака//Биохимия.-1962.-Т.27, вып.5.-С.866-874.

4. Верещагин А.Г., Скворцова C.B. Распределительная хроматография ненасыщенных липидов в виде п-комплексов с ионами серебра//Докл. АН СССР.-1964.-Т.157, N 3.-С.699-702.

5. Верещагин А.Г. Биохимия триглицеридов. М.: Наука, 1972.-308 с.

6. Верещагин А. Г. Закономерности строения и биосинтеза триглицеридов в масличных семенах//Изв. АН СССР. Сер. биол.-1981, N 1.-С.54-65.

7. Джерард В. Химия органических соединений бора. М.: Химия, 1966.-С.25.

8. Дятловицкая Э.В., Волкова В.И., Бергельсон Л.Д. Структурный анализ лецитинов методом ТСХ//Биохимия.-1966.-Т.31, вып.б.-С. 1189-1195.

9. Дятловицкая Э. В., Торховская Т. И., Бергельсон Л. Д. Структурный анализ лецитинов опухолевых тканей//Биохимия.-1971.-Т.36, вып.1.-С. 181-186.

10. Дятловицкая Э. В., Янчевская Г. В., Бергельсон Л. Д. Молекулярный состав лецитинов опухолей//Биохимия.-1974.-Т.39, вып.2.-С.432-439.

11. Жуков A.B., Давыдова И.М., Верещагин А.Г. Препаративное выделение и свойства к-цис-9-гептадеценовой кислоты из жира дрожжей Candida 5р.//Прикл. биохимия и микробиология.-1970.-Т.6, вып.6.-С.627-632.

12. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. М.: Мир, 1975.-324 с.

13. Кирхнер Ю.М. Тонкослойная хроматография.-T. 1.-М.: Мир, 1981.-616 с.

14. Пчелкин В.П., Верещагин А.Г. Получение диацилглицеринов с заданным жирнокислотным составом из смеси растительных109масел//Прикл. биохимия и микробиология.-1979.-Т.15, вып.5.-С.764-768.

15. Пчелкин В.П., Верещагин А.Г. Особенности реакции глицеролиза растительных триацилглицеринов//Масло-жировая промышленность. -1980.-N 5. -С.18.

16. Пчелкин В.П., Верещагин А.Г. О качественном составе смеси диацилглицеринов, полученной из растительных масел//Прикл. биохимия и микробиология.-1980.-Т. 16, Вып.3.-С.423-431.

17. Пчелкин В.П., Верещагин А.Г. Хроматографическое исследование смеси диацилглицеринов, полученной глицеролизом растительных масел //Прикл. биохимия и микробиология.-1988.-Т.24, вып.6.-С.809-815.

18. Пчелкин В.П., Верещагин А.Г. Определение видового состава полярных глицеролипидов жидкостно-хроматографическими методами//Журн. аналит. химии.-1989.-Т.44, вып. 11.-С. 1951-1975.

19. Пчелкин В.П., Верещагин А.Г. Жидкостно-хроматографическое определение видового состава мембранных липидов и их производных//Химия природных соединений.-1989.-N 4.-С.453-477.

20. Пчелкин В.П., Верещагин А.Г. О зависимости хроматографической подвижности координационных комплексов диацилглицеринов от их относительной полярности//Докл. АН СССР.-1991.-Т.318, вып.2.-С.473-476.

21. Пчелкин В.П., Верещагин А.Г. Исследование реакции переэтерификации жирных масел растений с глицерином//Прикл. биохимия и микробиология. -1992.-Т.28, вып.4.-С.545-560.

22. Пчелкин В.П., Верещагин А.Г. Анализ смеси гас-1,2-диацилглицеринов методом тонкослойной хроматографии с ионами серебра//Журн. аналит. химии.-1993.-Т.48, вып.2.-С.359-365.

23. Энгельгардг X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях .М.: Мир, 1980.-245 с.

24. Abe К., Kogure К. Accurate evaluation of 1,2-diacylglycerols in gerbil fore-brain using HPLC and in situ freezing technique//J. Neurochem.-1986.-V.47.-N 2.-P.577-582.

25. Akesson B. Initial esterification and conversion of intraportially injected 111014C. linoleic acid in rat liver//Biochim. Biophys. Acta.-1970.-V.218.-N 1.-P.57-70.

26. Arvidson G.A.E. Fractionation of naturally occurring lecithins according to degree of unsaturation by thin-layer chromatography// J. Lipid Res.-1965.-V.6.-N 4.-P.574-577.

27. Arvidson G.A.E. Reversed-phase partition thin-layer chromatography of rat liver lecithins to yield eight simple phosphatidyl cholines //J. Lipid Res.-1967.-V.8.-N 2.-P. 155-158.

28. Arvidson G.A.E. Structural and metabolic heterogeneity of rat liver glycero-phosphatides//Eur. J. Biochem.-1968.-V.4.-N 4.-P.478-486.

29. Arvidson G.A.E. Separation of naturally occurring lecithins according to fatty acid chain length and degree of unsaturation on a lipophilic derivative of Sephadex//J. Chromatogr.-1975.-V.103.-N 1.-P.201-204.

30. Baneiji B., Subbaiah P.V., Cregg R.E., Bagdade J.D. Molecular species of phosphatidylcholine in a betalipoproteinemia: effect of lecithin: cholesterol acyltransferase and lysolecithin acyltransferase//J. Lipid Res.-1989.-V.30.-N 12.-P.1907-1916.

31. Barrett C.B., Dallas M.S.J., Padley F.B. The quantitative analysis of TG mixtures by TLC on silica impregnated with silver nitrate// J. Amer. Oil Chem. Soc.-1963.- V.40.-N 6.-P.580-584.

32. Batley M., Packer N.H., Redmond J.W. High-performance liquid chromatography of diglyceride ^-nitrobenzoates. An approach of molecular analysis of phospholipids//!.Chromatogr.-1980.-V. 198.-N 4.-P.520-525.

33. Batley M., Packer N.H., Redmond J.W. Molecular analysis of phospholipids of Escherichia coli K12I/Biochim. Biophys.Acta.-1982.-V.710.-P.400-405.

34. Bell M.V. Molecular species analysis of phosphoglycerides from the ripe roes of cod (Gadus mor/wa)//Lipids.-1989.-V.24.-N 7.-P.585-588.

35. Bishop D.G. Analysis of molecular species of chloroplast lipids by HPLC//J. Liquid Chromatogr.-1987.-V.10.-N 7.-P.1497-1505.

36. Bittman J., Wood D.L. An improved copper reagent for quantitative densi-tometric TLC of lipids//J. Liquid Chromatogr.-1982.-V.5.-P.1155-1162.

37. Blank M.L., Robinson M., Fitzgerald V., Snyder F. Novel quantitative1.lmethod for determination of molecular species of phospholipids and diglycer-ides//J. Chromatogr.- 1984.-V.298.-N 3.-P.473-482.

38. Brandner J.D., Birkheimer R.L. Relative esterifiability of primary and secondary hydroxyl groups of glycerol//J. Amer. Oil Chem. Soc.-1960.-V.37.-P.390-396.

39. Brandner J.D., Birkheimer R.L. The equilibrium distribution of acyl groups between primary and secondary hydroxyl position in partial esters//J. Amer. Oil Chem. Soc.-1964.-V.41.-P.367-370.

40. Brett R.A. Analysis of partial glyceride mixtures//Nature.-1963.-V.197.-P.484-485.

41. Brockerhoff H. Stereospecific analysis of triglycerides//Lipids.-1971.-V.6.-P.942-956.

42. Buchnea D. Detritylation by silicic acid boric acid column chromatogra-phy//Lipids.-1974.-V.9.-P.55-57.

43. Cantafora A., Di Biase A., Alvaro D., Angelico M., Marin M., Attili A.F. HPLC analysis of molecular species of PC. Development of quantitative assay and its application to human bile//Clin. Chim. Acta.-1983.-V.134.-P.281-295.

44. Careaga-Houck M., Sprecher H. Effect of a fish oil on the composition of rat neutrophil lipids and the molecular species of choline and ethanolamine glyc-erophospholipids//J. Lipid Res. -1989.-V.30.-N 1.-P.77-88.

45. Child P., Myher J.J., Kuypers F.A., op den Kamp J.A.F., Kuksis A., van Deenen L.L.M. Acyl selectivity in the transfer of molecular species of phosphatidylcholines from human erythrocytes//Biochim. Biophys. Acta.-1985.-V.812.-N 2.-P.321-332.

46. Choudhury R.B.R. The preparation and purification of monoglycerides. I.Glycerolysis of oils//J. Amer. Oil Chem. Soc.-1960. -V.37.-P.483-486.

47. Christie W.W. Lipid analysis. Oxford: Pergamon Press. -1973. -P.238, 246.

48. Christie W.W., Hunter M.L. Separation of molecular species of PC by HPLC on a PLRP-S//J.Chromatogr.-1985.-V.325.-P.473-476.

49. Christie W.W. Silver ion and chiral chromatography in the analysis of triacyl-glycerols//Prog. Lipid Res.-1994.-V.33.-N 1/2.-P.9-18.112

50. Crawford C.G., Plattner R.D., Sessa D.J., Rackis J.J. Separation of oxidized and unoxidized molecular species of phosphatidylcholine by high-performance liquid chromatography//Lipids.-1980. -V.15.-N 2.-P.91-94.

51. Curstedt T., Sjovall J. Analysis of molecular species of 2H-labeled phosphatidyl cholines by GLC and GC-MS//Biochim. Biophys. Acta.-1974.-V.360.-N 1.-P.24-37.

52. Das A.K., Ghosh R., Datta J. Separation of monoacetyldiglycerides by argen-tation thin-layer chromatography//J.Chromatogr.-1982. -V.234.-P.472-477.

53. Dobson G., Christie W.W., Nikolova-Damyanova B. Silver ion chromatography of lipids and fatty acids//J. Chromatogr. B.-1995. -V.671.-P. 197-222.

54. Ellingboe J., Nystrom E., Sjovall J. Liquid-gel chromatography on lipophilic-hydrophobic Sephadex derivatives//!. Lipid Res.-1970.-V.ll.-N 3.-P.266-273.

55. Fried B., Sherma J. Thin layer chromatography: Technique and applications. N.Y., Basel: Marcel Dekker.-1986.-P.13.

56. Elovson J. Immediate fate of albumin-bound 1-14C. stearic acid following its intraportial injection into carbohydrate refed rats //Biochim. Biophys. Acta.-1965.-V.106.-N 3.-P.480-494.

57. Gunstone F.D., Padley F.B. Glyceride studies. Part III. The component glycerides of five seed oils containing linolenic acid// J. Amer. Oil Chem. Soc.-1965.-V.42.-N 11.-P.957-961.

58. Ha K.S., Thompson G.A., Jr. Diacylglycerol metabolism in the green alga Dunaliella salina under osmotic stress. Possible role of diacylglycerols in phos-pholipase C-mediated signal transduction// Plant Physiol.-1991.-V.97.-N 3.-P.921-927.

59. Hartman L. Esterification rates of some saturated and unsaturated fatty acids with glycerol//J. Amer. Oil Chem. Soc.-1966.-V.43.-P. 536-538.

60. Hasegawa K., Suzuki T. Determination of molecular species of ovolecithins using GC-MS//Iipids.-1973.-V.8.-N 11.-P.631-634.

61. Hasegawa K., Suzuki T. Examination of acetolysis products of phosphatidylcholine by GC-MS//Lipids.-1975.-V.10.-N 11.-P.667-672.

62. Haverkate F., van Deenen L.L.M. Isolation and chemical characterization of phosphatidyl glycerol from spinach leaves// Biochim. Biophys. Acta.-1965.-V.106.-N 1.-P.78-92.

63. Heinze F.J., Linscheid M., Heinz E. Release of diacylglycerol moieties from various glycosyl diacylglycerols//Anal. Biochem. -1984.-V.139.-N 1.-P.126-133.114

64. Hirayama O., Inoue Y. Chromatography of lipids and its biochemical applications. Part V. Paper chromatographic analysis of fatty acid mono-, di-, and triglyceride mixtures//J. Agr. Chem. Soc. Jap. -1961.-V.35.-N 4.-P.372-376.

65. Hirsch J. Factice chromatography: an automatically monitored, liquid-gel system for the separation of nonpolar lipids//J.Lipid Res.-1963.-V.4.-N l.-P.l-10.

66. Holub B.J., Kuksis A. Molecular species of phosphatidylethanolamine from egg yolk//Lipids.- 1969.-V.4.-P.466-472.

67. Hopkins S.M., Sheehan G., Lyman R.L. Fractionation of unaltered phosphatidyl l,2-14C2.-ethanolamines according to the degree of unsaturation of their predominant fatty acids//Biochim. Biophys. Acta.-1968.-V.164.-N 2.-P.272-277.

68. Horning M.G., Murakami S., Horning E.C. Analysis of phospholipids, cer-amides and cerebrosides by gas chromatography-mass spectrometry//Amer. J. Clin. Nutr.-1971.-V.24.-P. 1086-1096.

69. Ishinaga M., Carrol K.K. Composition of phospholipid molecular species from mammary tumors//Biochem. Cell Biol.-1988.-V.66.-N 11.-P.1163-1168.

70. Itabashi Y., Takagi T. Gas chromatographic separation of di- and monoacyl-glycerols based on the degree of unsaturation and positional placement of acyl groups//Lipids.-1980.-V.15.-N 4.-P.205-215.

71. Itoh K., Suzuki A., Kuroki Y., Akino T. HPLC separation of diacylglycerols to quantitate disaturated species of lung phosphatidylcholine//Lipids.-1985.-V.20.-N 9.-P.611-616.

72. Jensen R.G., Marks T.A., Sampugna J., Quinn J.G., Carpenter D.L. Purification of triglycerides with an alumina column//Lipids.-1966.-V.l.-P.451-452.

73. Justin A.M., Demandre C., Tremolieres A., Mazliak P. No discrimination by choline- and ethanolamine phosphotransferases from potato tuber microsomes in molecular species of endogenous diacylglycerols//Biochim. Biophys. Acta.-1985.-V.836.-P. 1-7.

74. Kaliszan R. Quantitative Structure-Chromatographic Retention Relationships. -N.Y.: Wiley-Interscience.-1987.

75. Kaufmann H.P., Makus Z. Die Duennschicht-Chromatographic auf dem Fett115gebiet I: Trennung von Modell-Mischungen//Fette Seifen Anstr.-1960.-B.62.-N ll.-S. 1014-1020.

76. Kaufmann H.P., Wessels H., Bondopadhyaya C. Die Duennschicht-Chromatographie auf dem Fettgebiet XI: Die Analyse der Lecithine und der hydrolytischen Spaltproducte der Phosphatide//Fette Seifen Anstr.-1963.-B.65.-N 7.-S.543-547.

77. Kito M., Ishinaga M., Nishihara M., Kato M., Sawada S., Hata T. Metabolism of the phosphatidylglycerol molecular species of Escherichia co////Eur.J.Biochem.-1975.-V.54.-P.55-63.

78. Kito M., Takamura H., Narita H., Urade R. A sensitive method for quantitative analysis of phospholipid molecular species by HPLC//J. Biochem.-1985.-V.98.-N 2.-P.327-331.

79. Kondoh Y., Takano S. Analysis of acylglycerols by high-performance liquid chromatography with post-column derivatization. IV. Simultaneous analysis of mono-, di- and triacylglycerols//J. Chromatogr.-1987.-V.393.-N 3.-P.427-432.

80. Kreeze G., Bederke K., Schauffelhut F. Analyse von Mono- und Diglyc-eridgemischen mit Hilfe der Gaschromatographie und Kernresonanz//Z. ana-lyt. Chemie.-1965.-B.209.-S.329-337.

81. Kruger J., Rabe H., Reichmann G., Ruestow B. Separation and determination of diacylglycerols as their naphthylurethans by high-performance liquid chromatography//!. Chromatogr.-1984. -V.307.-P.387-392.

82. Kuksis A., Marai L. Determination of the complete structure of natural leci-thins//Iipids.- 1967.-V.2.-N 3.-P.217-224.

83. Kuksis A., Breckenridge W.C., Marai L., Stachnyk O. Molecular species of lecithins of rat heart, kidney and plasma//J. Lipid Res.-1969.-V.10.-N 1.-P.25-32.

84. Kuksis A. Newer developments in the determination of structure of glycerides and phosphoglycerides/In: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lip-ids/Holman R.T., ed.-V.12.-Oxford: Pergamon Press.-1972.

85. Kuksis A., Marai L., Myher J.J. Strategy of glycerolipid separation and quantitation by complementary analytical techniques//J. Chromatogr.-1983.-V.273.-P.43-66.116

86. Kuksis A. Acylglycerols/In: CRC Handbook of Chromatography: Lip-ids./Mangold H., ed.-V.l.-Boca Raton: CRC Press.-1984.-P.381-480.

87. Kuksis A., Myher J.J., Sandra P. Gas liquid chromatographic profiling of plasma lipids using high-temperature-polarizable capillary columns//J. Chro-matogr.- 1990.-V.500.-P.427-442.

88. Laakso P., Christie W.W. Chromatographic resolution of chiral diacylglycerol derivatives: potential in the stereospecific analysis of triacyl-s«-glycerols//Lipids.-1990.-V.25.-N 6.-P.349-353.

89. Litchfield C. Analysis of triglycerides.-New York: Academic Press.-1972.-P.57.

90. Luddy F.E., Magidman P., Barford R.A., Herb S.F., Riemenschnider R.W. Pancreatic lipase hydrolysis of triglycerides by a semimicro technique//J. Amer. Oil Chem. Soc.-1964.-V.41.-P.693-696.

91. Lynch D.V., Gundersen R.E., Thompson G.A., Jr. Separation of galactolipid molecular species by high-performance liquid chromatography//Plant Physiol. -1983.-V.72.-N 3.-P.903-905.

92. Mahadevappa V.G., Holub B.J. Degradation of different molecular species of phosphatidylinositol in thrombin-stimulated human platelets//J. Biol. Chem.-1983.-V.258.-N 9.-P.5337-5339.

93. Mancha M. Estudio de los doglycerides naturales de la pulpa de la acei-tuna//Grasas y Aceites.-1975.-V.26.-N 6.-P.347-352.

94. Mangold H.K. Zur Analyse von Lipiden mit Hilfe der Radioreagenz-methode//Fette Seifen Anstr.-1959.-B.61.-N 10.-S.877-881.

95. Markley K.S., ed. Fatty Acids.-V.l.-New York: Interscience Publishers.-1961.-P.898.

96. Markley K.S., ed. Fatty Acids.-V.5.-New York: Interscience Publishers.-1968.-P.3503.

97. Masuzawa Y., Sugiura T., Ishima Y., Waku K. Turnover rates of the molecu117lar species of ethanolamine plasmalogen of rat brain//J. Neurochem.-1984.-V.42.-N 4.-P.961-968.

98. Mattson F.H., Volpenhein R.A. Synthesis and properties of glycerides//J. Lipid Res.-1962.-V.3.-P.281-296.

99. Morris L.J. Separation of lipids by silver ion chromatography//!. Lipid Res.-1966.-V.7.-N 6.-P.717-732.

100. Myher J.J., Kuksis A. Resolution of diacylglycerol moieties of natural glycero-phospholipids by gas-liquid chromatography on polar capillary columns//Can. J. Biochem.-1982.-V.60.-P.638-650.

101. Myher J.J., Kuksis A., Marai L., Sandra P. Identification of the more complex triacylglycerols in bovine milk fat by gas chromatography-mass spectrometry using polar capillary columns//J. Chromatogr.-1988.-V.452.-P.93-118.

102. Myher J.J., Kuksis A. Relative gas-liquid chromatographic retention factors of trimethylsilyl ethers of diradylglycerols on polar capillary columns//J. Chro-matogr.-1989.-V.471.-P. 187-204.

103. Myher J.J., Kuksis A., Pind S. Molecular species of glycerophospholipids and sphingomyelins of human erythrocytes: improved method of analysis//Lipids.-1989.-V.24.-N 5.-P.396-407.

104. Myher J.J., Kuksis A., Yang L.-Y. Stereospecific analysis of menhaden oil triacylglycerols and resolution of complex polyunsaturated diacylglycerols by gas-liquid chromatography// Biochem. Cell Biol.-1990.-V.68.-N 1.-P.336-344.

105. Nakagawa Y., Horrocks L.A. Separation of alkenylacyl, alkylacyl, and diacyl analogues and their molecular species by high-performance liquid chromatography//!. Lipid Res.- 1983.-V.24.-P. 1268-1275.

106. Nakagawa Y., Waku K. Selective synthesis of the hexaenoic molecular species of ether-linked glycerophosphoethanolamine of the Ehrlich ascites tumor cells//Eur. J. Biochem.-1985.-V.152.-P.569-572.

107. Nakagawa Y., Waku K. Improved procedure for the separation of the molecular species of dimethylphosphatidate by high-performance liquid chromatography//;!. Chromatogr.-1986.-V.381.-N 2.-P.225-231.

108. Nikolova-Damyanova B., Herslof B.G., Christie W.W. Silver ion highperformance liquid chromatography of derivatives of isomeric fatty acids//J.118

109. Chromatogr.-1992.-V.609.-N 2.-P.133-140.

110. Nikolova-Damyanova B., Christie W.W., Herslof B.G. High-performance liquid chromatography of fatty acid derivatives in the combined silver ion and re-versed-phase mode//J. Chromatogr. A.-1993.-V.653.-N l.-P. 15-23.

111. Nikolova-Damyanova B., Herslof B.G., Christie W.W. Silver ion highperformance liquid chromatography of esters of isomeric octadecenoic fatty acids with short-chain monounsaturated alcohols//J. Chromatogr. A.-1995.-V.693.-P.235-239.

112. Nikolova-Damyanova B., Christie W.W., Herslof B.G. Retention properties of triacylglycerols on silver ion high-performance liquid chromatography//!. Chromatogr .A.-1995.-V.694.-P.375-380.

113. Norman H., Thompson G.A.,Jr. Quantitative analysis of D. salina DAG-trimethylhomoserine and its individual molecular species by HPLC//Plant Sci.-1985.-V.42.-N 2.-P.83-87.

114. Norman H., StJohn J.B. Separation and quantitation of molecular species of plant phosphatidylcholine by high-performance liquid chromatography with flame ionization detector//J. Lipid Res.-1986.-V.27.-P.1104-1107.

115. Novitskaya G.V., Vereshchagin A.G. The chromatographic separation of higher fatty acid monoglycerides according to chain length and unsatura-tion//J. Chromatogr.- 1969.-V.40.-P.422-430.

116. Patton G.M., Fasulo J.M., Robins S.J. Separation of phospholipids and individual molecular species of phospholipids by high-performance liquid chro119matography//J. Lipid Res.-1982.-V.23.-P.190-196.

117. Pchelldn V.P., Vereshchagin A.G. Reversed-phase thin-layer chromatography of diacylglycerols as their labile dimethylborate esters//J. Chromatogr.-1981.-V.209.-P.49-60.

118. Pchelkin V.P., Vereshchagin A.G. Identification of individual diacylglycerols by adsorption thin-layer chromatography of their coordination complexes//.!. Chromatogr.-1991.-V.538.-N 2.-P.373-383.

119. Pchelkin V.P., Vereshchagin A.G. Reversed-phase thin-layer chromatography of diacylglycerols in the presence of silver ions//J. Chromatogr.-1992.-V.603.-P.213-222.

120. Pchelkin V.P., Vereshchagin A.G. Separation of polar lipid classes into their molecular species components by planar and column liquid chromatogra-phy//Adv. Chromatogr.-1992.-V.32.-P.87-129.

121. Pessin M.S., Raben D.M. Molecular species analysis of 1,2-diglycerides stimulated by a-thrombin in cultured fibroplasts//J. Biol. Chem.-1989.-264.-N 15.-P.29-38.

122. Pollack J.D., Clark D.S., Somerson N.L. Four-directional-development LC of lipids, using trimethylborate//J. Lipid Res.-1971.-V. 12.-P.563-569.

123. Porter N.A., Wolf R.A., Nixon J.R. Separation and purification of lecithins by high pressure liquid chromatography//Lipids.-1979. -V.14.-N 1.-P.20-24.

124. Privett O.S., Nutter L.J. Determination of the structure of lecithins via the formation of acetylated l,2-diglycerides//Lipids.-1967.-V.2.-N 2.-P.149-154.

125. Quinlin P., Weiser H.J.,Jr. Separation and determination of mono-, di- and triglyceride concentrates//!. Amer. Oil Chem. Soc.-1958. -V.35.-P.325-327.

126. Ramesha C.S., Pickett W.C., Murthy D.V.K. Sensitive method for the analysis of phospholipid subclasses and molecular species as 1-anthroyl derivatives of their diglycerides//J. Chromatogr.-1989.-V.491.-N 1.-P.37-48.

127. Renkonen O. The analysis of individual molecular species of polar lipids//Adv.1201.pid Res.-1967.-V.5.-P.329.

128. Renkonen O. Thin-layer chromatographic analysis of subclasses and molecular species of polar lipids//Progr. TLC Related Meth.-1971.-V.2.-P.143-181.

129. Rezanka T., Podojil M. Preparative separation of algal polar lipids and of individual molecular species by HPLC and their identification by GC/MS//J. Chromatogr.-1989.-V.463.-P.397-408.

130. Rheineck A.E., Bergseth R., Sreenivasan B. Glycerolysis of linseed oil: A composition study//J. Amer. Oil Chem Soc.-1969.-Y.46.-P. 447-451.

131. Robins S.J., Patton G.M. Separation of phospholipid molecular species by high-performance liquid chromatography: potentials for use in metabolic studies//!. Lipid Res.-1986.-V.27.-P. 131-139.

132. Ruestow B., Kunze D., Rabe H., Reichmann G. The molecular species of phosphatidic acid, diacylglycerol and phosphatidylcholine, synthesized from sn-glycerol 3-phosphate in rat lung microsomes //Biochim. Biophys. Acta.-1985.-V.835.-N 3.-P.465-476.

133. Rybicka S.M. Use of TLC for following a glycerolysis reaction//Chem. Ind.-1962.-N 6.-P.1947.

134. Salem N., Jr., Abood L.G., Hoss W. Separation of brain phosphatidylserines according to degree of unsaturation by thin-layer chromatography//Anal. Bio-chem.- 1976.-V.76.-N 2.-P.407-415.

135. Schoenmakers P.J. Optimization of chromatographic selectivity. A guide to method development. Elsevier: Amsterdam.-1986.-345 P.

136. Siebertz M., Heinz E., Joyard J., Douce R, Labelling in vivo and in vitro of molecular species of lipids from chloroplast envelopes and thylakoids//Eur. J. Biochem.-1980.-V.108.-P.177-185.

137. Siouffi A.M., Gillemonat A., Guiochon G. Chromatographic sur couche mince de microparticules de gel de silice//Chromatographia. -1977.-Y.10.-N 10.-P.651-657.

138. Smith M., Jungalawala F.B. Reversed-phase high performance chromatography of phosphatidylcholine: a simple method for determining relative hydrophobic interaction of various molecular species//J. Lipid Res.-1981.-V.22.-N 5.-P.697-704.

139. Sonntag N.O.V. Glycerolysis of fats and methyl esters status, review and critique//!. Amer. Oil Chem. Soc.-1982.-V.59.-P.759A-802A.

140. Sotirhos N., Thorngren C., Hersloff B. Reversed-phase high-performance liquid chromatographic separation and mass detection of individual phosholipid classes//J. Chromatogr.-1985.-V.331.-N 2.-P.313-320.

141. Steim J.M. Monogalactosyl diglyceride: a new neurolipid//Biochim. Biophys. Acta.-1967.-V.144.-N 1.-P.118-126.

142. Stewart H.N.M., Perry S.G. A new approach to liquid partition chromatography (Ci8-Kieselguhr)//J.Chromatogr.- 1968.-V.37.-P.97-98.

143. Subbaiah P.V., Monshizadegan H. Substrate specificity of human plasma lecithin-cholesterol acyltransferase towards molecular species of phosphatidylcholine in native plasma//Biochim. Biophys. Acta.-1988.-V.963.-P.445-455.

144. Takagi T., Suzuki T. Enantiomer separation of diacylglycerol mixtures by high-performance liquid chromatography on a chiral column//J. Chromatogr.-1990.-V.519.-N 1.-P.237-243.

145. Takamura H., Narita H., Urade R., Kito M. Quantitative analysis of polye-noic phospholipid molecular species by high-perforamance liquid chromatog-raphy//Lipids.- 1986.-V.21 .-N 5.-P.356-360.

146. Takamura H., Tanaka K., Matsuura T., Kito M. Ether phospholipid molecular species in human platelets//J. Biochem.-1989.-V.105.-P.168-172.122

147. Takamura H., Kasai H., Arta H., Kito M. Phospholipid molecular species in human umbilical artery and vein endothelial cells// J. Lipid Res.-1990.-V.31.-N 4.-P.709-718.

148. Thomas A.E.,III, Sharoun J.E., Ralston H. Quantitative estimation of isomeric monoglycerides by TLC//J. Amer. Oil Chem. Soc.-1965.-V.42.-N 9.-P.789-792.

149. Thompson W., Macdonald G. Cytidine diphosphate diglyceride of bovine brain positional distribution of fatty acids and analysis of major molecular spe-cies//Eur. J. Biochem.-1976.-V.65.-P. 107-111.

150. Tinoco J., Hopkins S.M., Mcintosh D.J., Sheehan G., Lyman R.L. Fractionation and analysis of rat liver 14CH3-lecithins labeled in vrvo//Lipids.-1967.-V.2.-N 6.-P.479-483.

151. Tinoco J., Babcock R., Mcintosh D.J., Lyman R.L. The distribution of methyl label into molecular species of liver lecithins from female rats injected with Me-14C. methionine//Biochim. Biophys. Acta.-1968.-V.164.-N 1.-P.129-131.

152. Tsydendambaev Y.D., Zhukov A.V., Vereshchagin A.G. Preparation of plates with a permanent adsorbent layer and their application in the analytical thin-layer chromatography of hpids//J.Chromatogr.-1977.-V.132.-P. 195-204.

153. Tweeten T.N., Wetzel D.L., Chung O.K. Physicochemical characterization of galactosyldiglycerides and their quantitation in wheat flour lipids by highperformance liquid chromatography//!. Amer. Oil Chem. Soc.-1981.-V.58.-N 6.-P.664-672.

154. Vereyken J.M., Montfoort A., van Golde L.M.G. Some studies on the biosynthesis of the molecular species of phosphatidylcholine from rat lung PC and PE from rat liver//Biochim. Biophys. Acta.-1972.-V.260.-N 1.-P.70-81.

155. Viswanathan C.V. Coupled gas chromatography-mass spectrometry in the separation and characterization of polar lipids//J. Chromatogr. -1974.-V.98.-P.105-128.

156. Wurster C.F., Jr., Copenhaver J.H. Thin-layer chromatograhic separation of dimethylphosphatidate derived from lecithin//Lipids.-1966.-V.l.-N 6.-P.422-426.123

157. Yamada K., Abe S., Katayama K., Sato T. Sensitive high-performance liquid chromatographic method for the determination of phosphatide acid//J. Chromatogr.-1988.-V.422.-P.367-372.

158. Yang L.Y., Kuksis A., Myher J.J. Intestinal absorption of menhaden and rapeseed oils and their fatty acid methyl and ethyl esters in the rat//Biochem. Cell Biol.-1990.-V.68.-P.480-491.

159. Zhukov A.V., Pchelkin V.P. Gas chromatographic analysis of lipids with the injection of aliquots of less than 0.05 |il from small samples//J. Chromatogr.-1977.-V. 132.-P.543-547.