Твердофазное модифицирование хитозана мономерными и полимерными гидроксикарбоновыми кислотами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

Демина Татьяна Сергеевна

ТВЕРДОФАЗНОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ ХИТОЗАНА МОНОМЕРНЫМИ И ПОЛИМЕРНЫМИ ГИДРОКСИКАРБОНОВЫМИ

КИСЛОТАМИ

02.00.06 — высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005051478

Москва-2013

005051478

Работа выполнена в лаборатории твердофазных химических реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук Акопова Татьяна Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, проф. доктор химических наук

Кузнецов Александр Алексеевич Роговина Светлана Захаровна

Ведущая организация: Институт химии твердого тела и

механохимии Сибирского отделения Российской академии наук

Защита состоится« 28 » марта 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.012.01 при Инсттуте химической физики им. КН. Семенова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН.

Автореферат разослан февраля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.012.01

кандидат химических наук Ладыгина Т.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Твердофазный синтез органических соединений позволяет получать и модифицировать широкий спектр веществ в условиях их пластического течения под действием давления и сдвиговых напряжений. Пластическая деформация компонентов реакционной смеси способствует эффективному перемешиванию на молекулярном уровне, а возникающие в процессе деформирования активные центры обеспечивают протекание химических реакций. Возможность исключить в процессе синтеза применение растворителей и катализаторов определяет высокие экономические и экологические показатели метода, а отсутствие токсичных реагентов в полученных материалах важно для синтеза и модифицирования полимеров медицинского назначения. Исследования твердофазного синтеза производных полисахаридов, в т.ч. хитина и продукта его дезацетилирования - хитозана, показали перспективность данного подхода. Благодаря биосовместимости и другим ценным свойствам, эти природные полимеры широко применяются в медицине в качестве систем доставки лекарств и материалов для регенеративной медицины. Химическое модифицирование хитозана, включающее прививку на него различных синтетических полимеров, приводит к улучшению его растворимости, повышению механических характеристик изделий и способствует проявлению новых биологических свойств. Однако модифицирование природных полимеров по классическим технологиям является трудоемким и высокозатратным процессом, осложненным их малой растворимостью в большинстве традиционных растворителей и высокой температурой плавления полисахаридов, превышающей температуру разложения. Литературный поиск показал, что одним из перспективных направлений модифицирования хитозана является прививка на него цепей алифатических сложных полиэфиров различной длины путем взаимодействия с мономерными и полимерными гидроксикарбоновыми кислотами. Таким образом, исследование возможностей твердофазного синтеза в получении

производных и привитых сополимеров хитозана с мономерными и полимерными гидроксикарбоновыми кислотами является актуальной задачей, а ее успешное решение позволит получать нетоксичные материалы с широким спектром новых практически значимых свойств.

Целью настоящей работы является разработка и оптимизация синтеза новых производных хитозана и его привитых сополимеров методом твердофазной реакционной экструзии при совместном деформировании с мономерными и полимерными гидроксикарбоновыми кислотами, комплексное исследование их структуры и свойств, а также оценка возможности применения различных форм матриксов для регенеративной медицины на основе модифицированного хитозана. Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать механизмы взаимодействия хитозана с гидроксикарбоновыми кислотами в условиях твердофазного синтеза на примере модельных объектов - 2,2-бис-(гидроксиметил)пропионовой кислоты и ЦЭ-лактида;

2. Изучить влияние условий твердофазного синтеза на структуру и свойства ацилированных производных хитозана;

3. Осуществить прививку на хитозан высокомолекулярных сложных полиэфиров поли(Ь,Ь-лактида) и поли(лактид-со-гликолида), исследовать структуру, физико-химические и физико-механические свойства продуктов;

4. Показать возможность создания различных форм матриксов для тканевой инженерии (пленки, волокна, макропористые системы, сферические микрочастицы) из синтезированных производных и привитых сополимеров хитозана.

Научная новизна. Получены новые полимерные соли и Ы-ацилированные производные хитозана при его взаимодействии с 2,2-бис-(гидроксиметил)пропионовой кислотой (БГМПК). Исследовано влияние соотношения компонентов и температуры синтеза на выход и структуру целевых продуктов. Впервые исследован механизм взаимодействия хитозана с димером молочной кислоты ЦО-лактидом в условиях твердофазного

сдвигового деформирования и изучена структура и свойства полученных продуктов. Показано, что в процессе реакционного смешения твердых компонентов в выбранных условиях проведения процесса происходит прививка олигомерных цепей лактида на хитозан в результате реакций аминолиза и алкоголиза сложноэфирных связей дилактона. Полученные бифильные производные растворяются в водных средах и равномерно набухают в органических. Методом твердофазного синтеза впервые получены сополимеры хитозана с высокомолекулярными сложными полиэфирами поли(Ь,Ь-лактидом и поли(лактид-со-гликолидом), обладающие амфифильными свойствами и способные к образованию стабильных микро- и нанодисперсий в органических растворителях.

Практическая значимость работы. Синтезированные производные

хитозана и его привитые сополимеры с полиэфирами обладают улучшенной

растворимостью в водных и органических средах и могут быть использованы

для получения различных форм матриксов для регенеративной медицины с

применением технологий, переработка по которым невозможна для исходного

хитозана. На основе водорастворимых производных хитозана с БГМПК и L,D-

лактидом сформованы термически сшитые макропористые гидрогели.

Методами сухого формования и горячего прессования получены пленочные

материалы из водорастворимых производных хитозана и его сополимеров с

полиэфирами, обладающие повышенными механическими характеристиками

по сравнению с гомополимерами; исследованы их структура и свойства.

Методом электроформования получены биосовместимые микро- и нановолокна

из сополимеров хитозана и полилактида, в т.ч. модифицированных желатином.

Благодаря амфифильной природе синтезированных сополимеров методом

эмульсионного диспергирования впервые удалось получить сферические

микрочастицы без использования эмульгатора в водной фазе. Проведены

исследования морфологии поверхности и структуры объема, механические

испытания. Исследования in vitro ферментативного гидролиза и

биосовместимости с клеточной линией фибробластов мыши L929 показали

3

перспективность разработанных материалов биомедицинского назначения для создания матриксов с контролируемой скоростью биодеградации.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены автором на X и XI Международных конференциях "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Нижний Новгород, Россия, 2010 и Мурманск, Россия, 2012); XVIII и XX International Conferences on Bioencapsulation (Portugal 2010, Canada 2012); Пятой Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры-2010» (Москва, Россия, 2010); IV International Conference on Multi-Component Reactions and Related Chemistry (Ekaterinburg, Russia, 2009); European Live Science Summit "BioMedica-2012" (Liege, Belgium, 2012); 1st, 2nd and 3rd Russian-Hellenic Symposium "Biomaterials and bionanomaterials: Recent Advances and Safety - Toxicology issues" (Heraklion, Crete-Greece, 2010, 2011, 2012); XIII and XIV Annual Conferences "YUCOMAT" (Herceg-Novi, Montenegro, 2011, 2012); VI и VII International conference on Mechanochemistry and mechanical alloying "INCOME 2011" (Herceg-Novi, Montenegro, 2011 и Jamshedpur, India, 2009); III International Conference Fundamental Bases of Mechanochemical Technologies, (Novosibirsk, Russia, 2009); "Polymerfest" (Palermo, Italy, 2009).

Связь работы с научными программами. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №07-03-00812 и 10-03-01022), ОХНМ РАН (программа 3 ОХ) и Университета г. Льеж (Бельгия).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 36 печатных работ, в том числе 5 статей из списка журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из/¿^наименований. Работа изложена на /^страницах машинописного текста, содержит J^pucyHKOB и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение производных хитозана и 2,2-бис(гидроксиметил)пропионовой кислоты

В качестве модельного объекта для изучения взаимодействия хитозана с гидроксикарбоновыми кислотами, в том числе полимерами, содержащими концевые гидроксильные и карбоксильные группы, например, алифатическими сложными полиэфирами,

выбрана нетоксичная

кристаллическая 2,2—бис—

(гидроксиметил)пропионовая кислота. Высокая температура плавления БГМПК (159°С) позволяет исследовать влияние широкого диапазона температур твердофазного синтеза на структуру и свойства продуктов реакции (Таблица 1). Проведенный литературный анализ показал, что попытки подобного модифицирования ранее не проводились.

Таблица I. Степень ацичирования (СА) хитозана в образцах, полученных при варьировании соотношения компонентов реакционных смесей хитозан/БГМПК и температуры синтеза

Образец Соотношение хитозан/БГМПК, г/г Температура со-экструдирования Количество молей БГМПК на 1 осново- моль хитозана в исходных смесях Относительное количество прореагировавшей кислоты, % СА с/ы

Хитозан - - - - - 5.29'"

ХБ-1 55/45 20 1 29 - 5.29

ХБ-2 55/45 100 1 49 0.18 5.75

ХБ-3 29/71 100 3 41 0.43 7.85

ХБ-4 55/45 130 1 36 0.16 5.63

ХБ-5 55/45 150 1 47 0.24 6.20

ХБ-6 80/20 140 0.34 69 0.18 5.83

Примечание: (1) расчетное значение отношения С/'Ы с учетом содержания в исходном хитозане остаточных ацетамидных звеньев (10%)

Совместное деформирование твердых компонентов при комнатной температуре приводит к количественному образованию солевых связей между

5

/М4

I Хитозан)

сн,он

I

V + НООС-С-СНЭ '

к I

СН2ОН

БГМПК

НОНлС—с—сн2он

СНЭ

Рис. 1. Схема образования Ы-ацилированных производных хитозана при взаимодействии с БГМПК

карбоксильными группами кислоты и аминогруппами хитозана (рис. 2а). В спектре продукта полностью исчезает полоса валентных колебаний карбоксильных групп исходной кислоты (1690 см"1) и появляется полоса при 1633 см"' за счет наложения полосы Амида I (присутствующей в спектре исходного хитозана при 1664 см"1) с огибающей полос деформационных колебаний аминогрупп хитозана и валентных колебаний карбоксилат-ионов (при 1564 см"1). При повышенных температурах синтеза получены соответствующие ацилированные производные со степенью замещения аминогрупп 0.16-0.43.

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 *'<см') V(см )

Рис.2. ИК-спектры: а - БГМПК (1), хитозана (2); образцаХБ-1, полученного при комнатной температуре (3); б-растворимой фракции образца ХБ-3, осажденного прирН 10 (1); хитозана

(2)

Как видно из сравнения ИК- спектров продуктов и исходного хитозана и представленных в таблице 1 данных, максимальная СА характерна для образца ХБ-3, полученного при мольном избытке кислоты и относительно невысокой температуре (100°С). Степень полезного использования реагента в этом случае не превышает 15%. Большое содержание кислоты в реакционной смеси пластифицирует систему и резко снижает эффективность совместного деформирования. Рост интенсивности механохимического воздействия на реакционную систему за счет уменьшения содержания БГМПК до 20 мас.% (образец ХБ-6) способствует увеличению эффективности реакции ацилирования до 69%.

Образцы ХБ-1 и ХБ-4, полученные при эквимольном соотношении компонентов, практически полностью растворяются в воде. При повторной обработке образца ХБ-1 при повышенной температуре (образец ХБ-2) и при

6

трехкратном мольном избытке БГМПК в реакционной смеси (образец ХБ-3), наблюдается небольшая потеря растворимости, которая связана как с основной реакцией ацилирования, так и с побочными реакциями самого хитозана, протекающими при каталитическом действии кислоты в ходе обработки под действием давления и сдвига и приводящим к ветвлению и частичному сшиванию полимера.

Состояние реакционной системы после деформирования в разных условиях изучали методом ДСК анализа исходных смесей. Согласно полученным данным, в результате обработки смеси при комнатной температуре (ХБ-1) термодинамическая устойчивость и однородность кристаллической фазы, а также степень кристалличности (энтальпия плавления) БГМПК значительно снижаются, что подтверждает образование ионных связей между карбоксигруппами кислоты и аминогруппами хитозана при большей дефектности твердых состояний обоих компонентов реакционной системы. То же характерно и для образцов смесей ХБ-2 и ХБ-3, подвергавшихся обработке при 100°С. При повышенных температурах синтеза (образцы ХБ-4, ХБ-5 и ХБ-6) эффективность твердофазного синтеза заметно снижается. При этом часть БГМПК вероятно вступает в реакции ацилирования и солеобразования с аминогруппами хитозана, в то время как 30-50% кислоты остаются в практически неизменном состоянии. Именно эта часть БГМПК проявляется при первом нагревании (рис. За, кривые 4, 5 и б) в виде эндотерм с пиками вблизи 155°С, которые по своим характеристикам близки эндотерме плавления БГМПК (рис. За, кривая 7).

При втором нагревании образцов ХБ-1 - ХБ-3 на соответствующих ДСК-

термограммах практически отсутствуют переходы, которые можно было бы

приписать плавлению свободной БГМПК (рис. 36, кривые 1-3). Возможно,

часть БГМПК вступает в реакции ацилирования, в том числе и гидроксильных

групп (так как предельная температура при первом проходе высока), с

образованием некристаллизующихся олигомеров и дополнительно

ацилированного хитозана. В то же время на термограммах второго нагревания

7

образцов ХБ-4 - ХБ-б четко видны переходы, соответствующие расстеклованию доменов БГМГЖ в хитозане вблизи 50°С, экзотермы холодной кристаллизации в интервале 65-95°С (образцы ХБ-4 и ХБ-5), и эндотермы плавления БГМПК в интервале 130-155°С (образцы ХБ-4, ХБ-5 и ХБ-6).

т. "с Т.*с

Рис. 3. ДСК-термограммы. записанные при первом (а) и втором (б) нагревании образцов композиций ХБ-1 - ХБ-6 (номера кривых соответствуют номерам композиций) и образца исходной БГМПК (7) в герметичном тигле при скорости нагревания 10 град/мин.

Исследование сорбционных свойств полученных ацилпроизводных хитозана показало, что введение в его структуру дополнительных гидроксильных групп приводит к почти линейному увеличению сорбционной способности образцов по отношению к воде в зависимости от степени ацилирования. Таким образом, впервые синтезированы полимерные соли и производные хитозана и БГМПК, обладающие повышенными сорбционными свойствами и улучшенной растворимостью в воде. Определены условия синтеза, приводящие к получению М-ацилированных производных со степенью замещения аминогрупп 0.16-0.43 при эффективности использования ацилирующего агента до 70%.

2. Взаимодействие хитозана и Ь,0-лактида

Синтез производных хитозана с короткими боковыми цепями лактида проводили по реакции раскрытия цикла лактида в присутствии хитозана. Исследован механизм образования в условиях твердофазного синтеза производных хитозана при взаимодействии с димером молочной кислоты -лактидом - и изучена структура и свойства полученных продуктов.

Согласно данным, приведенным в таблице 2, количество прореагировавшего лактида варьируется в пределах 57-96 мас.% и зависит как от температуры проведения синтеза, так и от соотношения компонентов. На ИК-спектрах очищенных от непрореагировавшего лактида образцов присутствуют полосы сложноэфирных связей, и наблюдается увеличение интенсивности полос поглощения амидных связей с ростом температуры обработки, что проявляется наиболее четко на спектрах образцов после длительного диализа (Амид I при 1650 см"1 и Амид II при 1540 см"1). Расчет степени ацилирования образцов по данным элементного анализа подтверждает образование ацилпроизводных хитозана со степенью замещения 0.19 - 0.41.

Таблица 2. Условия проведения процесса и характеристики продуктов реакции

Образец Массовое соотношение лактид: хитозан Температура экструдирования, °С Относительное количество прореагировавшего лактида, % Степень ацилирования аминогрупп хитозана Средняя СП привитых цепей

ХЛ-1 31 : 69 90 95.8 0.19 3.0

ХЛ-2 31 : 69 120 57.1 0.19 5.0

ХЛ-3 47 : 53 80 76.0 0.19 7.8

ХЛ-4 47 : 53 90 85.3 0.41 4.1

ХЛ-5 47 : 53 100 85.7 0.41 4.2

ХЛ-6 73 : 27 120 59.3 0.37 9.7

Подбор оптимальных условий проведения процесса позволяет получать привитые цепи олиголактида со средней степенью полимеризации 3-10, что следует из совокупности данных ИК-спектроскопии и ЭА и подтверждается данными хроматографического анализа. Введение в химическую структуру хитозана коротких привитых цепей лактида обеспечивает бифильность системы

и возможность хитозана набухать в органических растворителях при сохранении его растворимости в водных средах.

Волновое число, (см-1)

Рис. 5. ИК-спектры образцов хитозан/лактид, полученных при эквимольном соотношении компонентов при 80, 90 и 100°С: а- после экстракции непрореагировавшего лактида хлороформом; 6 - после диализа против дистиллированной воды.

Таким образом, впервые в условиях механохимического воздействия на твердые реакционные смеси в двухшнековом экструдере осуществлена прививка олигомерных цепей лактида на хитозан путем полимеризации Ь,0-лактида с раскрытием цикла в его присутствии. Установлено, что прививка в основном протекает по пути 1^-ацилирования хитозана за счет реакций аминолиза и алкоголиза сложноэфирных связей дилактона. Степень прививки в оптимальных условиях достигает 160%. Введение в химическую структуру хитозана коротких привитых цепей олиголактида обеспечивает бифильность системы и способность продуктов к набуханию в органических растворителях, которая закономерно увеличивается с ростом степени прививки. Растворимость ацилированных производных хитозана, полученных как с использованием БГМПК, так и лактида, в нейтральных водных средах указывает на статистический характер ацилирования в условиях твердофазного синтеза. Синтезированные производные обладают большим потенциалом в биотехнологических, фармацевтических и других областях применения хитозана, т.к. обнаружено, что хитозан, модифицированный лактидом и

БГМПК, обладает повышенными физико-механическими характеристиками и улучшенной биосовместимостью.

3. Получение привитых сополимеров хитозана и сложных полиэфиров

Прививку на хитозан фрагментов высокомолекулярных сложных полиэфиров осуществляли в условиях твердофазного синтеза путем реакционного смешения хитозана с поли(Ь,Ь-лактидом и поли(лактид-со-гликолидом) при различных соотношениях компонентов и температурах экстру дирования. Исследование поведения

продуктов реакции в

органических средах показало, что полученные материалы обладают амифифильными

свойствами и образуют стабильные ультрадисперсные растворы, что нехарактерно для немодифицированного хитозана

или его физических смесей С Р^. 6. Массовое распределение макромолекулярньи

ассоциатов до и после ультразвуковой обработки полиэфирами. Согласно данным смесей хитозана с (а) поли(Ь,Ь-лактидом) (40/60 г/г,

Тжанр = ¿30 и (б) поли(лактид-со-гликолидом)

динамического светорассеяния, (б0/40г/г,тттр = б0°С)

реакционное смешение хитозана

и полиэфиров приводит к системам, способным к самоорганизации в органических растворителях с образованием ассоциатов от 200 нм до 2.5 цм. Ультразвуковая обработка (УЗ) полученных дисперсий приводит к снижению среднего размера агрегатов, однако, ее эффект обратим, и системы возвращаются к своему исходному состоянию. Данное поведение не характерно для физических коллоидов и, скорее всего, является специфическим для привитых сополимеров, сочетающих цепи с различной гидрофильностью. Более детальное исследование растворов продуктов в СОС13 методом ПМР указывает на формирование мицеллярных структур, что проявляется в уширении сигналов полиэфирной составляющей смесей при отсутствии

171,9 243 344 486 687 972 1375 1944 2750 Размер, нм

шШии.-

204,^43 289 344 409 486 578 687818 97211581375

сигналов хитозана и свидетельствует о наличии набора мицеллоподобных структур «ядро-оболочка», состоящих из гидрофильных «ядер» нано-/микродисперсий, стабилизированных «оболочкой» привитых цепей полиэфиров.

Фракционный анализ продуктов реакционного смешения как в органической (хлороформ), так и в водной (4%НСООН) средах показал образование в твердом состоянии соответствующих привитых сополимеров с высоким (до 17 мас.%) содержанием хитозана в нерастворимых в кислых водных средах фракций продуктов. Данные элементного анализа этих фракций указывают также на относительно высокую длину привитых цепей полиэфиров, что препятствует растворению хитозана в его традиционном растворителе (Таблица 3).

Таблица 3. Элементный состав нерастворимых в 4-%НСООН фракций смесей хитозана и сложных полиэфиров _______

Образец Атомные концентрации, мас.% Содержание хитозана, мас.%

С N Н

Хитозан/поли(Ь,Ь-лактид), 40/60 г/г, Тэкста = 130°С 49.1 1.44 5.67 16.6

Хитозан/поли(Ь,Ь-лактид), 60/40 г/г, Т,ксто = 130°С 49.8 0.75 5.56 8.6

Хитозан/поли(Ь,Ь-лактид), 60/40 г/г, 49.8 0.88 5.68 10.1

Хитозан/поли(лактид-со-гликолид), 60/40 г/г, ТЭКСТо = 60°С 46.4 0.97 4.77 11.2

Увеличение содержания «деформационно-жесткого» компонента (хитозана), как и повышение температуры экструдирования, приводит к интенсификации реакции аминолиза сложноэфирной связи аминогруппами хитозана, являющейся наиболее вероятной при данном процессе, уменьшению длины привитых полиэфирных фрагментов и образованию водорастворимых фракций (до 12 мас.% растворимых в нейтральных водных средах продуктов).

Продукты реакционного смешения хитозана с аморфно-кристаллическим поли(ЦЬ-лактидом) изучали методом ДСК. На термограммах первого прогрева наблюдается смещение пика плавления полиэфира в сторону более низких температур и изменение его формы. В случае немодифицированного поли(Ь,Ь-

12

лактида) эндотерма плавления может быть условно разделена на два пика. После со-экструдирования с хитозаном наблюдали формирование дополнительных фаз с пониженными температурами плавления и разным вкладом, зависящим от условий обработки смесей. Для образцов также характерно наличие экзотермического пика «холодной кристаллизации» на ДСК-термограммах при втором прогреве в температурном диапазоне 80-120°С. Отсутствие данного пика на ДСК кривой исходного поли(Ь,Ь-лактида) и проявление только в смесях с хитозаном связано как с нуклеирующим действием последнего, так и со снижением СП цепей полиэфира в ходе процессов механодеструкции и аминолиза.

Рис. 7. Кривые ДСК при первом (а) и втором (6) прогревах ^модифицированного поли(Ь, ¿-лактида) (1), сополимера хитозан/поли(1.,Ь-лактид), 40/60 г/г, Тхстр = 50Т7 (2) ихитозан/поли(Ь,Ь-лактид),

40/60 г/г, Тшстр = 110 °С (3).

Таким образом, реакционное смешение хитозана с высокомолекулярными сложными полиэфирами поли(Ь,Ь-лактидом и поли(лактид-со-гликолидом) приводит к образованию в твердом состоянии соответствующих привитых сополимеров с высоким содержанием хитозана. Прививка на хитозан полиэфирных фрагментов обеспечивает возможность его диспергирования в органических растворителях с образованием макромолекулярных ассоциатов со средним размером от 200 нм до 2.5 цм. Изменение растворимости хитозана позволяет расширить возможности создания материалов на его основе, сочетающих свойства синтетического и природного компонентов.

4. Получение и применение материалов на основе модифицированного в твердом состоянии хитозана в тканевой инженерии

4.1. Макропористые гидрогели На основе водорастворимых N-ацилированных производных хитозана и мономерных гидроксикарбоновых кислот получены макропористые гидрогели с заданной морфологией, скоростью биодеградации и структурой. Образцы были сформованы в результате замораживания концентрированных растворов полимеров, сушки под вакуумом в замороженном состоянии и последующей термической обработки. Исследование срезов сухих и набухших образцов методами сканирующей электронной и конфокальной микроскопии показало, что полученные гидрогели обладают трехмерной макропористой структурой со средним размером пор 50 - 150 дм, что обеспечивает свободный доступ питательных веществ и позволяет клеткам свободно мигрировать по всему объему матрикса и равномерно его заселять (рис. 8). Данный эффект также усилен путем формирования вторичной пористости в стенках основных пор за счет оптимизации условий получения образцов гидрогелей и химической структуры производных хитозана. Гидрогели из ацилированных производных хитозана, полученных в условиях твердофазного синтеза, характеризуются высокой степенью и скоростью набухания в воде по сравнению с образцами из немодифицированного хитозана.

Рис. 8. Микрофотографии и гистограммы распределения пор по размерам в образцах гидрогелей из (а) немодифицированного хитозана, (б) хитозана, ацилированного БГМПК, (в) хитозана ацилированного Ь.й-лактидом.

Проведенные с любезной помощью лаборатории полимеров для биологии ИБХ РАН in vitro исследования скорости биодеградации макропористых гидрогелей в присутсвии лизоцима показали возможность контроля скорости ферментативного гидролиза образцов в зависимости от природы ацилирующего агента. Введение в химическую структуру хитозана стерически затрудненной БГМПК позволяет снизить степень биодеградации по сравнению с немодифицированным хитозаном, в то время как ацилпроизводные хитозана и Ь,Э-лактида характеризуются увеличенной скоростью гидролиза (рис. 9). Вне зависимости от природы ацилирующего агента жизнеспособность клеток мышиных фибробластов L929 в гидрогелях из ацилпроизводных хитозана была выше, чем в монослое и в образцах гидрогелей из немодифицированного хитозана на 20-80% (рис. 10).

5Ñ

4

200

100

0 3 10 17

Время, сутки

Рис. 9. Кинетика скорости деградации образцов

гидрогелей в присутствии лизоцима

|

О I

Рис. 10. Жизнеспособность клеток и)29 при росте в гидрогелях различных типов в течение 1 недели. За 100% принята жизнеспособность клеток, растущих в монослое на полистироле. Результаты МТГ-теста.

Таким образом, получение гидрогелей из хитозана, модифицированного мономерными гидроксикислотами в условиях твердофазного синтеза, является эффективным подходом при создании материалов для тканевой инженерии, имеющих заданную скорость биодеградации и улучшенную способность поддерживать рост клеток.

4.2. Пленочные материалы

Модифицирование хитозана в условиях твердофазного синтеза дает возможность формовать пленочные материалы на его основе как по расплавной технологии, так и из растворов в водных и органических средах. Пленки из

15

водорастворимых "Ы-ацилированных производных хитозана с мономерными гидроксикарбоновыми кислотами обладают более плотной и гомогенной структурой по сравнению с пленками из уксуснокислого раствора немодифицированного хитозана, что определяет их повышенные физико-механические характеристики. Если для уксуснокислых пленок оценить механические свойства затруднительно из-за их хрупкости, то прочность при разрыве пленочных образцов из продуктов реакционного смешения хитозана и мономерных гидроксикислот составляет 14 ± 0.5 МПа (хитозан-БГМПК) и 106 ± 4 МПа (хитозан-Ь,В-лактид).

Прививка сложных полиэфиров на хитозан позволяет получать пленочные материалы по методикам, нехарактерным для немодифицированного хитозана: горячее прессование и сухое формование из раствора в органическом растворителе. Горячее прессование смесей хитозана с поли(ЬХ-лактидом) позволяет получать пленки с прочностными свойствами, сравнимыми с пленками из немодифицированного поли(Ь,Ь-лактида): 48 и 51 МПа, соответственно, для полилактида и сополимерных пленок с содержанием хитозана 40 мас.%. Травление в плазме кислорода позволило исследовать внутреннюю морфологию пленочных образцов из сополимеров и показало наличие двухфазной структуры, характеризующейся равномерным включением областей хитозана в полиэфирную матрицу. В случае закалки пленочного образца размер включений варьируется в диапазоне 200-400 нм, что согласуется с данными динамического светорассеяния (рис. 11а).

Рис. 11. Микрофотографии пленочных образцов ХП-40/60-130 после травления в плазме, полученных прессованием при 18042 и последующей закалкой (А) или отжигом (Б)

Медленное охлаждение пленочного материала сопровождается кристаллизацией и приводит к формированию гетерогенной структуры, состоящей из кристаллических областей полиэфира (¡=2 цм) и включений хитозана на их периферии (рис. 116). Следует отметить, что в обоих случаях размер иммобилизованных в полиэфирной матрице ассоциатов сополимеров хитозана намного меньше размера частиц полисахарида, получаемых при размоле в экструдере (более 100 цм).

Амфифильная природа сополимеров, обеспечивающая получение стабильных дисперсий в органических растворителях, позволила также

о4

ан>

В | Ё £ ЗЗ

Я и

£ в

я а

сформовать пленки методом сухого формования из огранических растворов. Исследование структуры и свойств пленочных образцов, полученных таким методом из сополимера хитозана и поли(Ь,Ь-лактида), дополнительно

модифицированного желатином, выявило формирование гомогенной поверхности как с точки зрения морфологии, так и распределения заряда, а также повышенную биосовместимость образцов (рис. 12). Дополнительная обработка в плазме позволила провести более детальные исследования внутренней структуры образцов и доказала свою эффективность в качестве инструмента для модифицирования поверхностных свойств полученных пленочных материалов.

4.3. Волокнистые материалы

Методом электроформования получены нетканые микро- и нановолокнистые материалы из сополимера хитозана и поли(Ь,Ь-лактида), содержащего иммобилизованный желатин. Подбор метода электроформования (фильерное или бесфильерное) и условий проведения процесса позволил получить волокнистые материалы с различным диаметром волокон (рис. 13).

Рис. 12. Относительаня выживаемость клеток Ь929 при росте на пленочных образцах различного типа

в течение 1 недели. За 100% принята жизнеспособность клеток, растуи{их в монослое на полистироле. Результаты МТТ-теста

Рис. 13. Микрофотографии и гистограммы распределения по диаметру волокон, полученных

методом фильерного электроформования из коллоидных дисперсий образца хитозан/желатгш/поли(ЬХ-лактид) с массовым содержанием полимера 15% (Б) и 10% (В)

Предварительные in vitro

исследования возможности применения полученных нетканых волокнистых материалов в области тканевой инженерии, проведенные с использованием клеточной линии мышиных фибробластов L929, показали (рис. 14), что, как и в случае с пленочными образцами, жизнеспособность клеток при росте на волокнах из сополимеров превышает жизнеспособность клеток на материалах из

немодифицированного поли(ЦЬ-лактида) почти в два раза.

4.4. Сферические микрочастицы

Использование ацилпроизводных хитозана и его сополимеров со сложными полиэфирами позволило также получить инжектируемые клеточные микроносители с повышенной биосовместимостью. По классической технологии подобные микроносители получают методом «масло в воде» с последующим испарением органического растворителя. Масляную фазу, которая представляет собой раствор полимера в органическом растворителе, диспергируют в водной фазе, содержащей эмульгатор для предотвращения агрегирования микрочастиц. В результате механического перемешивания

Рис. 14. Жизнеспособность клеток Ь929

при росте на нетканых волокнистых материалах различных типов в течение 1 недели. За 100% принята жизнеспособность клеток, растущих в монослое на полистироле. Результаты МТТ-теста

образуется эмульсия, которая в процессе испарения органического растворителя превращается в суспензию твердых микрочастиц в жидкости. Однако наличие остаточного синтетического эмульгатора на поверхности микрочастиц после их получения ставит под вопрос их безопасность для организма, а низкая клеточная адгезия на немодифицированных полиэфирах препятствует их эффективному использованию в качестве клеточных микроносителей. Для решения данной проблемы в работе предложено использовать два подхода: (о) замена синтетического эмульгатора на биосовместимые и биодеградируемые водорастворимые ацилпроизводные хитозана и Ь,Э-лактида; (б) модифицирование фазы органического растворителя амфифильными сополимерами хитозана и сложных полиэфиров (рис. 15).

> £15

Ур

(Я) 1 тт

! .

МНК|>0'|-.|< Т1ЩМ

л

ы а

н

Й40

3 м

250-500 цт

N С \ <

"¡V

МШфОЧ11< Т1ШЫ

1125-355 цт

■ <125цт

■ >355 цт ■ капсулы

Рис. 15. Схема получения микрочастиц при модифицировании фазы водного (а) или органического (б) растворителей; влияние состава фаз на выход и распределение по размерам микрочастиц

Использование ацилированных в условиях твердофазного синтеза производных хитозана в водной фазе позволяет получать частицы с гомогенной поверхностью и требуемым распределением по размерам (150-350 цт).

Увеличение содержания лактида в продуктах приводит к более эффективной стабилизации микрочастиц, что выражается в уменьшении среднего размера микрочастиц и повышении общего выхода до значений, характерных для классического процесса с использованием ПВС в качестве эмульгатора (рис. 15а).

Исследование поверхности и срезов микрочастиц, полученных при модифицировании фазы органического растворителя, показало однородную морфологию поверхности и высокопористую внутренную структуру образцов, что может быть связано с амфифильной природой сополимеров. Подобное сочетание морфологии объема и поверхности микрочастиц определяет перспективность их применения в качестве инжектируемых клеточных микроносителей. Гладкая поверхность дает возможность для эффективного прикрепления клеток на начальной стадии культивирования, а макропористые внутренние слои обеспечивают увеличенную поверхность и свободный доступ питательных веществ, клеток и новообразующихся тканей при дальнейшей деградации матрикса и его замещении тканью.

Исследование возможности использования полученных микрочастиц в качестве микроносителей для культивирования животных клеток было показано in vitro на примере модельной клеточной линии мышиных

фибробластов L929. Данные МТТ-теста показали, что рост клеток на микрочастицах выше для микрочастиц, полученных с использованием как ацилпроизводных хитозана в водной фазе, так и амфифильных сополимеров в фазе органического растворителя, чем на микрочастицах, приготовленных по классической методике с использованием поливинилового спирта в качестве эмульгатора (рис. 16).

Время культивировлтш

Рис. 16. Жизнеспособность клеток L929 при росте на микрочастицах различного типа в течение 1 недели. Результаты МТТ-теста.

выводы

1. Реакция ацилирования хитозана гидроксикарбоновыми кислотами в твердом состоянии чувствительна к соотношению реагентов и температуре реакции, что свидетельствует о химическом контроле скорости этой реакции в условиях твердофазного синтеза. Совместное деформирование твердых компонентов при комнатной температуре приводит к количественному образованию солевых связей между карбоксильными группами кислоты и аминогруппами хитозана, а повышение температуры синтеза сопровождается получением соответствующих ацилированных производных. Реакция ацилирования хитозана протекает предпочтительно по каналу >1-ацилирования, что согласуется со сравнительной реакционной способностью гидроксильных и аминогрупп в отсутствие катализа. Растворимость ацилированных производных хитозана в нейтральных водных средах указывает на статистический характер ацилирования.

2. Впервые синтезированы полимерные соли и производные хитозана и 2,2-бис-(гидроксиметил)пропионовой кислоты. Определены условия синтеза, приводящие к получению ацилированных производных со степенью замещения аминогрупп 0.16-0.43 при эффективности использования ацилирующего агента до 70%. Сорбционная способность новых производных хитозана по отношению к воде возрастает в три раза по сравнению с исходным полимером.

3. Впервые в условиях механохимического воздействия на твердые реакционные смеси в двухшнековом экструдере осуществлена прививка олигомерных цепей лактида на хитозан. Установлено, что прививка в основном протекает по пути М-ацилирования хитозана за счет реакций аминолиза и алкоголиза сложноэфирных связей дилактона. Средняя степень полимеризации лактида составляет 3-10, степень прививки достигает 160%.

4. Реакционное смешение хитозана с высокомолекулярными сложными

полиэфирами поли(Ь,Ь-лактидом и поли(лактид-со-гликолидом) приводит к

образованию в твердом состоянии соответствующих привитых сополимеров с

21

высоким содержанием хитозана. Прививка на хитозан полиэфирных фрагментов обеспечивает возможность его диспергирования в органических растворителях на коллоидном уровне.

5. Показана возможность получения матриксов для регенеративной медицины (пленки, макропористые гидрогели, микро- и нановолокна, сферические микрочастицы) из модифицированного хитозана с использованием различных методов, в т.ч. с применением технологий, переработка по которым невозможна для исходного хитозана.

6. Установлено влияние структуры модифицированного хитозана, способа формования материала и условий его последующей обработки на свойства полученных матриксов. Обнаружен контроль скорости биодеградации матриксов в зависимости от молекулярного строения. Материалы, полученные из хитозана, модифицированного гидроксикарбоновыми кислотами в условиях твердофазного синтеза, характеризуются повышенной биосовместимостью по сравнению с материалами из гомополимеров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Демина, Т.С. Исследование взаимодействия хитозана и 2.2-бис(гидрокеиметил)пропионовой кислоты в условиях твердофазного синтеза / Т.С. Демина, Т А. Акопова, Л.В. Владимиров, А.Н. Щеголихин, А С. А.Н. Кечекьян, Н.С. Перов, А.О. Чернышенко, А.Н. Зеленецкий//Высокомолек. соед. Сер. Б. -2011. - Т. 53(6). - С. 995-1008.

2. Демина, Т.С. Влияние обработки в разряде постоянного тока на свойства поверхности композитных пленок хитозан/поли(Ь,Ь-лактид)/желатина / Т.С.Демина, М.Ю. Яблоков, А.Б. Гильман, Т.А. Акопова, А.Н. Зеленецкий // Химия высоких энергий. 2012. - Т. 46(1). - С. 6469.

3. Demina, Т. DC discharge plasma modification of chitosan/gelatin/PLLA films: surface properties, chemical structure and cell affiniy / T. Demina, D. Zaytseva-Zotova, M. Yablokov, A. Gilman, T. Akopova, E. Markvicheva, A. Zelenetskii // Surf. Coat. Tech. - 2012. - V. 207. - P. 508-516.

4. Akopova, T.A. A novel approach to design chitosan-polyester materials for biomedical applications / T.A. Akopova, T.S. Demina, A.N. Shchegolikhin, T.S. Kurkin, Ch. Grandfils, N.S. Perov, A.S. Kechekyan, A.N. Zelenetskii//Int. J. Polym. Sci. -2012. -doi.10.1155/2012/827967.

5. Акопова, Т.А. Амфифильные системы на основе полисахаридов, полученные методом твердофазного синтеза / Т.А. Акопова, Т.С. Демина, А.Н. Зеленецкий // Хим. волокна. - 2012. - № 4. - С. 18-22.

Тезисы докладов (основные):

6. Drozdova, M. Optimization of biodegradable microparticles loaded with thrombin receptor agonist peptide (TRAP-6) for tissue engineering / M. Drozdova, A. Privalova, T. Démina, T. Akopova, Ch. Grandfils, E. Markvicheva: XX International Conference on Bioencapsulation. -Canada, 2012.-P. 108-109.

7. Démina, T. Biodegradable microcarriers based on chitosan and polyesters for tissue engineering / T. Démina, T. Akopova, Ch. Sevrin, M. Drozdova, E. Markvicheva, A. Zelenetskii, Ch. Grandfils // XIV conference YUCOMAT. - Montenegro, 2012. - P. 35.

8. Демина, Т.С. Макропористые криогели на основе N-ацилированных производных хитозана, полученных методом твердофазного синтеза / Т.С. Демина, Д.С. Зайцева-Зотова, Т.А. Акопова, Е.А. Марквичева, А.Н. Зеленецкий: XI Международная конференция «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - Мурманск, 2012 - С. 3437.

9. Демина, Т.С. Биосовместимые микроносители для тканевой инженерии на основе хитозана и полиэфиров / Т.С. Демина, Т.А. Акопова, Е.А. Марквичева, К. Грандфилс, А.Н. Зеленецкий: XI Международная конференция «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - Мурманск, 2012. — С. 308-311.

10. Démina, T. Surface modification of polymeric biomaterials by low-temperature plasma to control cell affinity / T. Démina, D. Zaytseva-Zotova, M. Yablokov, A. Gilman, T. Akopova, E. Markvicheva, A. Zelenetskii: III Russian - Hellenic Symposium on Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Problems and Safety Issues. - Greece, 2012 - P. 31-32.

11. Démina, T. Optimisation of new biodegradable microcarriers tailored for tissue engineering / T. Démina, T. Akopova, A. Tsoy, Ch. Sevrin, E. Markvicheva, A. Zelenetskii, Ch. Grandfils: European Live Science Summit BioMedica. - Belgium, 2012. - P. 178.

12. Démina, T. Effect of plasma modification on surface properties and chemical structure of chitosan/gelatin/chitosan films / T. Démina, D. Zaytseva-Zotova, M. Yablokov, A. Gilman, T. Akopova, E. Markvicheva, A. Zelenetskii: XIII conference YUCOMAT. - Montenegro, 2011. - P. 75.

13. Démina, T. Chitosan/polyester materials obtained in solid state / T. Démina, T. Kurkin, T. Akopova, A. Zelenetskii: VII International conference on Mechanochemistry and mechanical alloying INCOME. - Montenegro, 2011. - P. 90.

14. Démina, T. Polysaccharides modified in solid-state for encapsulation of bioactive molecules / T. Démina, T. Akopova, A. Chernyshenko, E. Markvicheva, A. Zelenetskii: XVIII International Conference on Bioencapsulation. - Portugal, 2010. - P. 36-37.

15. Акопова, Т.А. Твердофазный синтез нанокомпозитов на основе хитозана и изучение их свойств / Т.А. Акопова, Т.С. Демина, А.Н. Щеголихин, АО. Чернышенко, JI.B. Владимиров, Е.А. Марквичева, А.С. Кечекьян, Н.С. Перов, А.Н. Зеленецкий: X Международная конференция «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - Нижний Новгород, 2010. - С. 82-85.

16. Демина, Т.С. Новые полимерные соли и амиды 2,2-бис(гидроксиметил)пропионовой кислоты и хитозана / Т.С. Демина, Т.А. Акопова, JI.B. Владимиров, А.Н. Щеголихин, А.С.

Кечекьян, А.Н. Зеленецкий: X Международная конференция «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - Нижний Новгород, 2010. -С. 18-21.

17. Демина, Т.С. Морфология и свойства систем хитозан/полиэфир, полученных методом твердофазного синтеза / Т.С. Демина, Т.А. Акопова, А.Н. Щеголихин, А.О. Чернышенко, А.С. Кечекьян, С.Н. Перов, А.Н. Зеленецкий: Пятая Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры-2010». - Москва, 2010. - С. 233.

18. Demina, Т. Nanostructured amphiphilic materials based on chitosan: solid-state synthesis and characterization / T. Demina, T. Akopova, A. Shchegolikhin, A. Chernyshenko, Y. Livney, E. Markvicheva, A. Zelenetskii, A. Ozerin: 1 Russian - Hellenic Symposium on Polymeric Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues. - Greece, 2010.-P. 48-49.

19. Akopova, T. Solid-state synthesis of chitosan-based copolymers of different hydrophilicity / T. Akopova, T. Demina, A. Chernyshenko, A. Zelenetskii, N. Perov, A. Ozerin: Polymerfest. -Italy, 2009.-P. 83-84.

20. Демина, Т.С. Новые материалы для медицинского применения, полученные твердофазным синтезом / Т.С. Демина, Т.А. Акопова, А.О. Чернышенко, А.Н. Зеленецкий: I Международная научная школа "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах". -Московская область, 2009. - С. 212-215.

21. Demina, Т. Interaction of 2,2-bis(hydroxymethyl)propionic acid with chitosan under conditions of plastic flow / T. Demina, A. Chernyshenko, L. Vladimirov, T. Akopova, A. Zelenetskii: International Conference Fundamental Bases of Mechanochemical Technologies (FBMT). - Novosibirsk, 2009. - P. 199.

22. Demina, T. Solid-State Synthesis of Chitosan-Polyester Systems for Biomedical Applications / T. Demina, A. Tsoy, T. Akopova, E. Markvicheva, A. Chernyshenko, A. Zelenetskii: IV International Conference on Multi-Component Reactions and Related Chemistry. -Ekaterinburg, 2009. - S5.

23. Akopova, T. Solid State Graft-Copolymerization onto Polysaccharides / T. Akopova, T. Demina, L. Vladimirov, V. Zhorin, S. Zelenetskii, A. Zelenetskii, A. Ozerin: VI International Conference on Mechanochemistry and Mechanical Alloying INCOME. - India, 2008. - P. 21.

Список используемых сокращений:

БГМПК - 2,2-бис(гидроксиметил)пропионовая кислота СА - степень ацилирования СП — степень полимеризации ЭА - элементный анализ

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия УЗ - ультазвуковая обработка

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолий бромида

Подписано в печать:

22.02.2013

Заказ № 8182 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

1. Bridgmen, P. Effects of high shear stress combined with high hydrostatic pressure / P. Bridgmen // Phys. Rev. 1935. V.48. P.825-836.

2. Бутягин, П.Ю. Проблемы и перспективы развития механохимии / П.Ю. Бутягин // Успехи химии. 1994. - Т. 63. - С. 1031 -1043.

3. Toda, F. Organic solid state reactions / F. Toda. Netherlands : Springer, 2005. -122 p.

4. Ениколопов, H.C. Твердофазные химические реакции и новые технологии / Н.С. Ениколопов. // Успехи химии. 1991. - Т.60. - С.586-594.

5. Жорин, В.А. Процессы в полимерах и низкомолекулярных веществах, сопровождающие пластическое течение под высоким давлением / В.А. Жорин. // Высокомол. соед. сер. А. 1994. - Т. 36. - С. 559-579.

6. Zharov, А.А. High-pressure chemistry and physics of polymers / In: Reactions of solid monomers and polymers under shear deformation and high pressure. London : CRC Press Inc., 1994. - P.267-297.

7. Avvakumov, E.G. Soft Mechanochemical synthesis: A basis for new chemical technologies / E.G. Avvakumov, M. Senna, N.V. Kosova. Boston : Kluwer Academic Publishers, 2001. - 200 p.

8. Баранов, А.О. Влияние характера химической реакции на структуру и свойства смесей при реакционном смешении полимеров / А.О. Баранов, А.В. Котова, А.Н. Зеленеций, Э.В. Прут // Успехи химии. 1997. - Т. 66. - С.972-984.

9. Ляхов, Н.З. Мехаиохимический синтез органических соединений и композитов с их участием / Н.З. Ляхов, Т.Ф. Григорьева, А.П. Баринова, И.А. Ворсина. // Успехи химии. 2010. - Т. 79. - С. 218-233.

10. Grigorieva, Mechanosynthesis of nanocomposites / T.F. Grigorieva, A.P. Barinova, N.Z. Lyakhov // J. Nanoparticle Research. 2003. - V. 5. - P. 439.

11. Болдырев, В.В. К вопросу об оценке эффективности действия различных машин в качестве механических активаторов /В.В. Болдырев, С.В. Павлов, В.А. Полубояров, А.В. Душкин. // Неорганические материалы. 1995. - Т.31. -С. 1128-1138.

12. Чернышенко, А.О. Твердотельный синтез хитозана и получение материалов на его основе: дис. .канд. хим. Наук: 02.00.06 / Чернышенко Александр Олегович. М., 2007. - 113 с.

13. Dushkin, A.V. Potential of mechanochemical technology in organic synthesis and synthesis of new materials / A.V. Dushkin. // Chemistry for sustainable development. 2004 - V. 12. - P. 251-273.

14. Сурков, В.Г. Превращения ацетилена при механохимической обработке в присутствии кварца / В.Г. Сурков, А.К. Головко, О.И. Ломовский. // Химия в интересах устойчивого развития. 2010. - Т. 18. - С. 165-170.

15. Дубинская, A.M. Превращения органических веществ под действием механических напряжений / A.M. Дубинская // Успехи химии. 1999. - Т. 68. -С. 708-724.

16. Жаров, А. А. Реакции полимеризации твердых мономеров при их деформации под высоким давлением / А.А. Жаров. // Успехи химии. 1984. - Т. 53. - С. 236-250.

17. Зеленецкий, А.Н. Роль нуклеофильности и кислотности реагентов в твердофазных реакциях полиприсоединения к эпоксидам / А.Н. Зеленецкий, В.А. Жорин, Л.А. Жорина. // Высокомолек. соед. А. 1996. - Т. 38. - С. 762771.

18. Жорина, Л.А. Структурные особенности комплексов аминов и циануровой кислоты, полученных при пластическом течении под давлением / Л.А. Жорина, Л.В. Владимиров, М.И. Кнунянц, В.А. Жорин, А.Н. Зеленецкий. // Доклады АН СССР. 1991. - Т. 320. - С. 374-377.

19. Ениколопов, Н.С. Сверхвысокая молекулярная подвижность в твердых телах / Н.С. Ениколопов. // Докл. АН СССР. 1985. - Т. 283. - С. 897-899.

20. Роговина, С.З. Химическая модификация природных полисахаридов целлюлозы, хитина и хитозана в твердой фазе под действием сдвиговых деформаций: автореф. дис. .докт. хим. наук : 02.00.06 / Роговина СветланаЗахаровна. Москва, 2003. - 232 с.

21. Bychkov, A.L. Perspectives of using yeast biomass mechanochemical hydrolysis for recycling of alcohol industry wastes / A.L. Bychkov, O.I. Lomovsky. // J. Intern. Sci. Publications: Ecology & Safety. 2011. - V. 5. - P. 4-11.

22. Lomovsky, O.I. Mechanochemically assisted extraction. Enhancing Extraction Processes in the Food Industry. Contemporary food engineering series. / O.I. Lomovsky, I.O. Lomovsky. NY : Taylor & Francis Group, 2011. - P. 61-398.

23. Аввакумов, Е.Г. Механические методы активации в переработке природного и техногенного сырья / Е.Г. Аввакумов, А.А. Гусев. Новосибирск : Академическое изд-во "Гео", 2009. - 155 с.

24. Зеленецкий А.Н. Иммобилизация трипсина на полисахаридах при интенсивном механическом воздействии / А.Н. Зеленецкий, Т.А. Акопова, Н.Р. Кильдеева, Г.А. Вихорева, Е.С. Оболонкова, A.A. Жаров. // Изв. АН. Сер. хим. 2003. - №9. - С. 1963-1967.

25. Роговина, С.З. Модификация полисахаридов в условиях сдвиговых деформаций / С.З. Роговина, Т.А. Акопова. // Высокомолек. соед. А. 1994. -Т. 36.-С. 593-600.

26. Метелева, Е.С. Механохимическое получение производных хитозана / Е.С. Метелева, A.B. Душкин, В.В. Болдырев // Химия в интересах устойчивого развития.-2007.-Т. 15.-С. 127-133.

27. Bracconnot, H. Sur la Nature des Champignons / H. Bracconnot // Ann. Ahi. Phys. 1811.-V. 79.-P. 265-304.

28. Варламов, В.П. Хитин и хитозан: природа, получение и применение / В.П. Варламов, C.B. Немцев, В.Е. Тихонов. M.: РХО, 2010. - 292 с.

29. Mima, S. Highly Deacetylated Chitosan and Its Properties / S. Mima, M. Miya, R. Iwamoto, S. Yoshikawa // J. Appl. Polym. Sei. 1983. - V. 28. - P. 1909-1917.

30. Акопова, Т.А. Образование хитозана из хитина в условиях сдвиговых деформаций / Т.А. Акопова, С.З. Роговина, Г.А. Вихорева, С.Н. Зеленецкий, JI.C. Гальбрайх, Н.С. Ениколопов // Высокомолек. соед. Сер. Б. 1991. - Т.32. - №10. - С.735-737.

31. Вихорева, Г.А. Изучение фракционного состава хитозана, полученноготвердофазным и суспензионным методами / Г.А. Вихорева, С.З. Роговина, Т.А. Акопова, С.Н. Зеленецкий, J1.C. Гальбрайх // Высокомолек. соед. Сер. Б. -1996.-Т. 38.-С. 1781-1785.

32. Kim, S.-K. Chitin, chitosan, oligosaccharides and their derivatives: biological activities and applications. NY : CRC Press, 2011. 666 p.

33. Yu, L. Biodegradable polymer blends and composites from renewable resources. New Jersey : John Wiley & Sons, Inc., 2009. 488 p.

34. Скрябин, К.Г. Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / К.Г. Скрябин, Г.А. Вихорева, В.П. Варламов. М.: Наука, 2002. - 368 с.

35. Salmon, S. Crystal morphology, biosynthesis and physical assembly of cellulose, chitin and chitosan / S. Salmon, S.M. Hudson // J. Macromol. Sci. Reviews in Macromolecular Chemistry and Physics. - 1997. - V. 37. - P. 199-276.

36. Li, J. Effect of degree of deacetylation of chitin on the properties of chitin crystallites / J. Li, J.F. Revol, R.H. Marchessault // J. Appl. Polym. Sci. 1997. - V. 65.-P. 373-380.

37. Могилевская, E.JT. О кристаллической структуре хитина и хитозана / E.J1. Могилевская, Т.А. Акопова, А.Н. Зеленецкий, А.Н. Озерин // Высокомолек. соед. Сер. А. 2006. - Т. 48. - С. 216-226.

38. Акопова, Т.А. Влияние размола на структуру и свойства хитозана / Т.А. Акопова, С.З. Роговина, И.Н. Горбачёва, Г.А. Вихорева, С.Н. Зеленецкий // Высокомолек. соед. Сер. А. 1996. - Т. 38. - С. 263-268.

39. Dong, Y. Studies on glass transition temperature of chitosan with four techniques / Y. Dong, Y. Ruan, H. Wang, Y. Zhao, D. Bi // J. Appl. Polym. Sci. 2004. - V. 93. -P. 1553-1558.

40. Cervera, M.F. Solid-state characterization of chitosans derived from lobster chitin / M.F. Cervera, J. Heinamaki, M. Rasanen, S.L. Maunu, M. Karjalainen, O.M.N. Acosta, et al. // Carbohydrate Polymers. 2004. - V. 58. - P. 401-408.

41. Suyatma, N.E. Effects of hydrophilic plasticizers on mechanical, thermal, and surface properties of chitosan films / N.E. Suyatma, L. Tighzert, A. Copinet // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005. - V. 53. - P. 3950-3957.

42. Dash, M. Chitosan A versatile semi-synthetic polymer in biomedical applications / M. Dash, F. Chillini, R.M. Ottenbrite, E. Chiellini // Progress in Polymer Science. -2011.-V. 36.-P. 981-1014.

43. Kean, T. Biodegradation, biodistribution and toxicity of chitosan / T. Kean, M. Thanou // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2010. - V. 62. - P. 3-11.

44. Pillai, C.K.S. Chitin and chitosan polymers: chemistry, solubility and fiber formation / C.K.S. Pillai, W. Paul, C.P. Sharma // Progress in Polymer Science.2009.-V. 34.-P. 641-678.

45. Mourya, V.K. Chitosan-modifications and applications: Opportunities galore / V.K. Mourya, N.N. Inamdar // Reactive & Functional Polymers. 2008. - V. 68. - P. 1013-1051.

46. Haider, S. Preparation of the electrospun chitosan nanofibers and their applications to the adsorption of Cu(II) and Pb(II) ions from an aqueous solution / S. Haider, S.Y. Park // Journal of Membrane Science. 2009. - V. 328. - P. 90-96.

47. Kamerling, J.P. Comprehensive glycoscience: from chemistry to system biology (Analysis of glycans polysaccharide functional properties) / J.P. Kamerling. -Amsterdam : Elsevier, 2007. 814 p.

48. Shigemasa, Y. Application of chitin and chitosan for biomaterials / Y. Shigemasa, S. Minami // Biotech. & Genetic Eng. Rev. 1996. - V. 13. - P. 383-420.

49. Muzzarelli, R.A.A. Chitosan Chemistry: Relevance to the Biomedical Sciences / R.A.A. Muzzarelli, C. Muzzarelli // Adv. Polym. Sci. 2005. - V. 186. - P. 151— 209.

50. Awad, G.A.S. Marine derived polysaccharides as drug delivery systems / G.A.S. Awad, N.D. Mortada, A.O. Kamel, A.H. Elshafeey // In: Polysaccharides: Development, properties and applications. NY : Nova Science Publishers, Inc.,2010. P. 151-175.

51. Акопова, T.A. Твердофазный синтез амфифильных систем хитозан-полиэтилен малеинизацией обоих компонентов / Т. А. Акопова, J1.B. Владимиров, В.А. Жорин, А.Н. Зеленецкий // Высокомолек. соед. Сер. Б. -2009.-Т. 51.-С. 693-704.

52. Аксенова, H.A. Механохимическое взаимодействие хитозана и карбоксилсодержащих порфиринов / Н.А. Аксенова, С.З. Роговина, А.А. Жаров, А.Б. Соловьева: сб. матер. «Полимеры-2003». Черноголовка, 2003.С. 3-7.

53. Rogovina, S.Z. Biodegradable blends based on chitin and chitosan: production, structure and properties / S.Z. Rogovina, Ch.V. Alexanyan, E.V. Prut. // J. Appl. Polym. Sei. 2011. - V. 121.-P. 1850-1859.

54. Роговина, С.З. Исследование целлюлозно-хитозановых смесей, полученных в условиях сдвиговых деформаций / С.З. Роговина, Т.А. Акопова, Г.А. Вихорева, И.Н. Горбачева, A.A. Жаров, А.Н. Зеленецкий // Высокомолек. соед. Сер. А. 2000. - Т.42. - С.10-15.

55. Lasprilla, A.J.R. Poly-lactic acid synthesis for application in biomedical devices A review / A.J.R. Lasprilla, G.A.R. Martinez, B.H. Lunelli, A.L. Jardini, R.M. Filho // Biotechnology Advances. - 2012. - V. 30. - P. 321-328.

56. Garlotta, D. A Literature review of poly(lactic acid) / D. Garlotta // Journal of Polymers and the Environment. 2001. - V. 9. - P.63-82.

57. Simamora, P. Poly-L-lactic acid: an overview / P. Simamora, W. Chern // J. Drugs Dermatol. 2006. - V. 5. - P. 436-440.

58. Auras, R. Poly(lactice acid) synthesis, structures, properties, processing, and applications / R. Auras, L.-T. Lim, S.E.M. Selke, H. Tsuji. New Jersey : John Wiley & Sons, Inc., 2010. - 528 p.

59. Mehta, R. Synthesis of poly(lactic acid): a review / R. Mehta, V. Kumar, H. Bhunia, S.N. Upadhyay // J. Macromol. Sei. Part C: Polymer Reviews. 2005. - V. 45. - P. 325-349.

60. Saeidlou, S. Poly(lactic acid) crystallization / S.Saeidlou, M.A. Huneault, H. Li, C.B. Park // Progress in Polymer Science. 2012. - V. 37. - P. 1657-1677.

61. Nejati, E. Synthesis and characterization of nanohydroxyapatite rods/poly(L-lactide acid) composite scaffolds for bone tissue engineering / E. Nejati, H. Mirzadeh, M. Zandi // Composites: Part A. 2008. - V. 39. - P. 1589-1596.

62. Cui, Y.L. Biomimetic surface modification of poly(-lactic acid) with chitosan and its effects on articular chondrocytes in vitro / Y.L. Cui, A.D. Qi, W.G. Liu, X.H. Wang, H. Wang, D.M. Ma, K.D. Yao // Biomaterials. 2003. - V. 24. - P. 38593868.

63. Luckachan, G.E. Chitosan/oligo L-lactide graft copolymers: Effect of hydrophobic side chains on the physico-chemical properties and biodegradability / G.E. Luckachan, C.K.S. Pillai // Carbohydrate Polymers. 2006. - V. 64. - P. 254-266.

64. Wu, Y. Synthesis and characterization of a novel amphiphilic chitosan-polylactide graft copolymers / Y. Wu, Y Zheng, W. Yang, C. Wang. J. Hu, S. Fu // Carbohydrate Polymers. 2005. - V. 59. - P. 165-171.

65. Liu, Y. Synthesis and characterization of a brush-like copolymer of polylactide grafted onto chitosan / Y. Liu, F. Tian, K.A. Hu // Carbohydrate Research. 2004. -V. 339.-P. 845-851.

66. Feng, H. Synthesis and characterization of phthaloyl-chitosan-g-poly(L-lactide) using an organic catalyst / H. Feng, C.-M. Dong // Carbohydrate Polymers. 2007. -V. 70.-P. 258-264.

67. Qu, X. Synthesis and characterization of pH-sensitive hydrogels based on chitosan and D,L-lactic acid / X. Qu, A. Wirsen, A.-C. Albertsson // J. Appl. Polym. Sei. -1999.-V. 74.-P. 3193-3202.

68. Qu, X. Novel pH-sensitive chitosan hydrogels: swelling behavior and states of water / X. Qu, A. Wirsen, A.-C. Albertsson // Polymer. 2000. - V. 41. - P. 4589-4598.

69. Correlo, V.M. Properties of melt processed chitosan and aliphatic polyester blends / V.M. Correlo, L.F. Boesel, M. Bhattachaiya, J.F. Mano, N.M. Neves, R.L. Reis // Mat. Sei. & Eng. A. 2005. - V. 403. - P. 57-68.

70. Wan, Y. Biodegradable polylactide/chitosan blend membranes / Y. Wan, H. Wu, A. Yu, D. Wen // Biomacromolecules. 2006. - V. 7. - P. 1362-1372.

71. Ganji, F. Chitosan-g-PLGA copolymer as a thermosensitive membrane / F. Ganji, M.J. Abdekhodaie // Carbohydrate Polymers. 2010. - V. 80. - P. 740-746.

72. ASTM F2150-07 Standard guide for characterization and testing of biomaterial scaffolds used in tissue-engineered medical products. 2007.

73. Gualandi, C. Porous polymeric bioresorbable scaffolds for tissue engineering / C. Gualandi. Springer Theses. - 2011; doi: 10.1007/978-3-642-19272-2.

74. Elsabee, M.Z. Chitosan based nanofibers, review / M.Z. Elsabee, H.F. Naguib, R.E. Morsi // Mater. Sci. & Eng. C. 2012. - V. 32. - P. 1711-1726.

75. Gu, S.-Y. Electrospinning of gelatin and gelatin/poly(L-lactide) blend and its characteristics for wound dressing / S.-Y. Gu, Z.-M. Wang, J. Ren, C.-Y. Zhang // Mater. Sci. & Eng. C. 2009. - V. 29. - P. 1822-1828.

76. Lao, L. Chitosan modified poly(l-lactide) microspheres as cell microcarriers for cartilage tissue engineering / L. Lao, H. Tan, Y. Wang, C. Gao // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2008. - V. 66. - P. 218-225.

77. Park, K. Acrylic acid-grafted hydrophilic electrospun nanofibrous poly(L-lactic acid) scaffold / K. Park, H.J. Jung, J.-J. Kim, K.-D. Ahn, D.K. Han, Y. M. Ju // Macromolecular Research. 2006. - V. 14. - P. 552-558.

78. Chen, J.-P. Surface modification of electrospun PLLA nanofibers by plasma treatment and cationized gelatin immobilization for cartilage tissue engineering / J.-P. Chen, C.-H. Su // Acta Biomaterialia. 2011. - V. 7. - P. 234-243.

79. Zhu, H. Surface engineering of poly(D,L-lactic acid) by entrapment of chitosan-based derivatives for the promotion of chondrogenesis / H. Zhu, J. Ji, R. Lin, C. Gao, L. Feng, J. Shen // J. Biomed. Mater. Res. 2002. - V. 62. - P. 532-539.

80. Khorasani, M.T. Comparison of fibroblast and nerve cells response on plasma treated poly (L-lactide) surface / M.T. Khorasani, H. Mirzadeh, S. Irani // J. Appl.Polym. Sci. 2009. - V. 112. - P. 3429-3435.

81. Duartea, A.R.C. Novel 3D scaffolds of chitosan-PLLA blends for tissue engineering applications: Preparation and characterization / A.R.C. Duartea, J.F. Manoa, R.L. Reis // J. of Supercritical Fluids. 2010. - V. 54. - P. 282-289.

82. Niu, X. Porous nano-HA/collagen/PLLA scaffold containing chitosan microspheres for controlled delivery of synthetic peptide derived from BMP-2 / X. Niu, Q. Feng, M. Wang, X. Guo, Q. Zheng // J. Control. Release. 2009. - V. 134. -P. 111-117.

83. Tan, H. Gelatin/chitosan/hyaluronan scaffold integrated with PLGA microspheres for cartilage tissue engineering / H. Tan, J. Wu, L. Lao, C. Gao. // Acta Biomaterialia. 2009. - V. 5 - P. 328-337.

84. Li, Y. Electrospun poly(lactic acid)/chitosan core-shell structure nanofibers from homogeneous solution / Y. Li, F. Chen, J. Nie, D. Yang // Carbohydrate Polymers. -2012.-V. 90.-P. 1445-1451.

85. A complete guide to DMPA brand of dimethylolpropionic acid. Allentown : GEO-Specialty Chemicals, 1999. - 51 p.

86. Malafaya, P.B. Natural-based polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications / P.B. Malafaya, G.A. Silva, R.L. Reis // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2007. - V. 59 - P. 207-233.

87. Купцов, A.X. Фурье-спектры комбинационного рассеяния и инфракрасного поглощения / А.Х. Купцов, Г.Н. Жижин М.:Физматлит, 2001. - 656 с.

88. Brugnerotto, J. An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization / J. Brugnerotto, J. Lizardi, F.M. Goycoolea, W. Arguelles-Monal, J. Desbrieres, M. Rinaudo // Polymer. 2001. V. 42. - P. 3569-3580.

89. Pasch, H. Chromatography / H. Pasch // Polymer Science: A Comprehensive Reference. 2012. - P. 33-64.

90. Рабек, Я. Экспериментальные методы в химии полимеров / Я. Рабек М. : Мир, 1983.-480 с.

91. Аверко-Антонович, И.Ю. Методы исследования структуры и свойств полимеров / И.Ю. Аверко-Антонович, Р.Т. Бикмуллин Казань, 2002. - 604 с.

92. Тейтельбаум, Б.Я. Термомеханический анализ полимеров / Б.Я. Тейтельбаум. М. : Наука, 1979. - 236 с.

93. Гильман, А.Б. / А.Б. Гильман, А.И. Драчев, A.A. Кузнецов, Г.В. Лопухова, В.К. Потапов Воздействие разряда постоянного тока на свойства и структуру полиимидных пленок // Химия высоких энергий. 1997. - Т. 31. - № 2. - С. 141145.

94. Wu, S. Polymer Interfaces and Adhesion / S. Wu. NY : Marcel Dekker, 1982. -152 p.

95. NIST X-ray Photoelectron Spectroscopy Database, URL: http://srdata.nist.gov.

96. Бриггс, Д., Сих, М.П. Анализ поверхности методами оже- и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии / Д. Бриггс, М.П. Сих М. : Мир, 1987 - 141 с.

97. Яблоков, М.Ю. Электретные свойства нанокомпозиционных материалов на основе полипропилена / М.Ю. Яблоков, A.C. Кечекьян, А.Б. Гильман, А.Н. Озерин. // Нанотехника. 2011. - № 2. - С. 86-88.

98. Зоткин, М.А. Разработка безреагентного способа модификации хитозановых пленок / М.А. Зоткин, Г.А. Вихорева, Е.П. Агеев, H.H. Матушкина, В.И. Герасимов, and Е.С. Оболонкова // Химическая технология. 2004. - V. 9. - Р. 15-19.

99. VanVlierberghe, S. Biopolymer-based hydrogels as scaffolds for tissue engineering applications: a review / S. VanVlierberghe, P. Dubruel, E. Schacht // Biomacromolecules, 2011.-V. 12.-P. 1387-1408.

100. Jenkins, M. Biomedical polymers / M. Jenkins. NY : CRC Press, 2007. - 224 p.

101. Kim, B.-S. Design of artificial extracellular matrices for tissue engineering / B-S Kim, I-K Park, T Hoshiba, H-L Jiang, Y-J Choi, T Akaike, C-S Cho // Progress in Polymer Science. 2011. - V. 36. - P. 238-268.

102. Shi, X. Hydrolysis and biomineralization of porous PLA microspheres and their influence on cell growth / X. Shi, J. Jiang, L. Sun, Z. Gan // Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. -2011.- V. 85.-P. 73-80.