УФ-лазерная агрегация водорастворимых белков тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

□□3465158

На правах рукописи <0

ЧЕЛНОКОВ Евгений Владимирович

УФ ЛАЗЕРНАЯ АГРЕГАЦИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ

01.04.21 - лазерная физика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

[ ? г:

I -л I ---

Нижний Новгород 2009

003465158

Работа выполнена в Институте прикладной физики Российской академии наук (г. Нижний Новгород)

Научные руководители:

кандидат физико-математических наук Н. М. Битюрин

кандидат физико-математических наук Л. В. Соустов

Официальнее оппоненты:

Ведущая организация:

доктор физико-математических наук А. А. Бабин

доктор физико-математических наук В. И. Кочубей

Физический факультет Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Защита состоится " 20 " 2009 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 002.069.02 в Институте прикладной физики РАН (603950, г. Нижний Новгород, ул. Ульянова, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института прикладной физики Российской академии наук.

Автореферат разослан /-< СХ^г^ А

2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор физико-математических наук,

профессор 10. В. Чугунов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы:

За почти полувековой срок, прошедший с момента создания первого оптического квантового генератора, лазерное излучение получило применение в самых различных областях промышленности, техники, медицины. В настоящее время в связи с развитием лазерных технологий большое внимание уделяется исследованию взаимодействия лазерного излучения с веществом [1-4]. При воздействии излучения УФ-лазеров важную роль могут играть фотохимические реакции, которые не связаны с общим нагревом вещества.

Изучение воздействия лазерного излучения на биологические среды важно для применения в медицинских целях [5-6]. Особенностью воздействия на эти среды является то, что мягкие биологические ткани в значительной степени состоят из воды, что приводит к специфической реакции вещества на лазерный нагрев [7-8], а также то, что белки, составляющие основу тканей, являются молекулами со сложной пространственной структурой. Лазерное воздействие может приводить к значительному изменению этой структуры - к денатурации, которая существенно изменяет свойства этих молекул.

Процесс образования и агрегации кластеров лежит в области интересов биологии, иммунологии, полимерной и коллоидной химии, металлургии. Прикладные исследования агрегации актуальны также и в социальных науках, например, для исследования миграционных и демографических процессов.

При фазовых переходах процесс агрегации зачастую лежит в основе процесса формирования новой фазы. В настоящее время одной из стандартных методик получения металлических наночастиц в растворе является преципитация, осаждение частиц, возникающая при пересыщении раствора [9]. Этот процесс может быть рассмотрен как фазовый переход первого рода. Если в твердых растворах агрегация образующихся частиц, зародышей новой фазы, затруднена [10], то в жидкости управление агрегацией и ростом частиц, выпадающих в осадок, является одной из основных задач этой методики [11].

Молекула белка является полимером биологического происхождения (биополимером), в котором аминокислоты играют роль мономеров. В этой связи следует отмстить некоторое сходство процесса агрегации с такими химическими процессами в полимерной химии, как полимеризация и поликонденсация. Агрегация белковых молекул приводит к образованию олигомеров "неправильной" формы вследствие "ошибочных" межмолекулярных взаимодействий.

В данной работе значительное внимание уделяется исследованию процессов агрегации водорастворимых белков при воздействии лазерного излучения.

Агрегация белков является причиной многих заболеваний [12]. Одно из них - катаракта, являющаяся по данным Всемирной Организации Здравоохранения основной причиной потери зрения во всем мире [13]. Катаракта является клиническим результатом увеличения рассеяния света хрусталиком

глаза. Это светорассеяние может возникать из-за потери клеточного порядка в хрусталике в результате нарушения процесса его развития или бесконтрольного деления клеток, а также из-за потери прозрачности отдельных клеток хрусталика. Последнее, в частности, может произойти из-за фотоповреждения основных белков хрусталика - кристаллинов, вызывающего их агрегацию. Причиной появления наследственной катаракты могут стать мутированные кристаллины из-за изменения стабильности связи (ассоциации) или растворимости. Вызванная воздействием на хрусталик ультрафиолетовым излучением катаракта активно изучается in vivo [14-16] и in vitro [17-20].

Как показали ранее проведенные исследования, при воздействии УФ-излучения в организме выделяются специальные белки, препятствующие развитию процессов денатурации (шапероны). Однако, например, в хрусталике глаза изначально присутствует белок а-кристаллин, который замедляет агрегацию Р" и у-кристаллинов при воздействии высокой температуры [21] или УФ-излучения [22].

В работах [17-20] исследовались фотоповреждения хрусталика глаза при воздействии излучения УФ лампы. Установлено образование агрегатов полипептидов [18], изменение зарядов кристаллинов хрусталика [19], повреждения структуры глаза [20] и наличие процессов комплексообразования в растворах кристаллинов. В этих работах использовалось широкополосное излучение с коротковолновой границей ~ 260 нм, где существенны процессы фотолиза. Роль процессов фотолиза в кристаллинах существенно уменьшается при воздействии на них более длинноволнового монохроматического лазерного излучения с длинами волн 295 и 308 нм. Однако до работы над диссертацией в литературе были опубликованы лишь единичные статьи по лазерной агрегации белков [22].

Задачей данной работы является исследование биофизических процессов УФ-индуцированной агрегации при использовании интенсивкостей, достаточных для возникновения нелинейных эффектов при агрегации, но не приводящих к нагреву и нелинейному поглощению УФ-излучения в растворах белков. Другая задача - использование результатов исследования агрегации при поиске веществ, способных защитить белки от денатурирующих воздействий.

Целью диссертационной работы является:

Экспериментальное исследование воздействия лазерного излучения ультрафиолетового диапазона, не сводящегося к нагреву вещества излучением, на биологические среды и, в частности, на водные растворы белков.

Построение модели фотоагрегации водорастворимых белков, объясняющей выявленные закономерности.

Создание на основе экспериментальной методики и теоретической модели нового физического метода исследования процессов агрегации водорастворимых белков при воздействии на них импульсного лазерного УФ излучения.

Исследование возможности применения нового метода для сравнения способности белков к фотоагрегации и отбора добавок, ее замедляющих, в частности, для поиска новых антикатарактальных препаратов.

Научная новнзна работы заключается в следующем:

В работе экспериментально исследована зависимость УФ-лазерной фотоагрегации белков в растворе от экспозиции облучения Б и выявлен эффект зависимости степени агрегации (наведенного рассеяния) не только от экспозиции, но и от интенсивности облучения.

Предложен новый физический механизм агрегации через бимолекулярное взаимодействие фотоактивированных молекул белка. Этот механизм позволяет не только качественно, но и количественно описать полученные экспериментальные результаты.

В работе предложен новый экспресс-метод исследования агрегации белковых растворов, который применен для сравнения чувствительности растворов различных белков к воздействию УФ излучения. Данный метод может быть использован для экспресс-тестирования добавок, замедляющих агрегацию основных белков хрусталика глаза человека - кристаллинов. Такие добавки могут быть использованы при создании препарата для профилактики развития и, возможно, для лечения начальной стадии катаракты.

На основе исследования с помощью экспресс-метода влияния на скорость УФ-индуцированной агрегации кристаллинов различных пептидов, используемых при создании антикатарактальных препаратов, предложена новая комбинация короткоцепочечных пептидов, применение которой дало существенное (в несколько раз) замедление развития УФ-индуцированной катаракты у экспериментальных животных (крыс).

Научно-практическая значимость работы:

Предложен новый механизм фотоагрегации водорастворимых белков.

Созданный в работе тестовый экспресс-метод может быть использован при отборе веществ, защищающих кристаллины хрусталика глаза от повреждающего воздействия УФ излучения, на основе которых могут быть созданы принципиально новые антикатарактальные препараты.

Работа проводилась в рамках исследований, поддержанных Российским фондом фундаментальных исследований (гранты № 00-02-16411-а, 01-02-06492-мас, 02-04-49342-а, 03-04-06233-мас, 04-04-08150-офи_а, 05-04-48749-а, 08-02-01157-а, 08-04-97108-р_поволжье_а) и программой Президиума РАН «Фундаментальные Науки - Медицине» с 2002 по 2008 годы.

В рамках проекта РФФИ № 04-04-08150-офи_а в ГУ Научно-исследовательском институте глазных болезней РАМН проведены испытания предложенной нами комбинации короткоцепочечных пептидов. Получено существенное замедление развития УФ-индуцированной катаракты у экспериментальных животных. Получено решение Роспатента о выдаче патента на

изобретение «Фармацевтическая композиция для профилактики развития и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты)».

На защиту выносятся следующие положения:

Экспозиция УФ облучения необходимая для агрегации водо-

растворимых белков, вызванной мягким УФ излучением ХеС1 лазера, зависит от значений плотности энергии лазерных импульсов »V и частоты их следования При фиксировании одного из этих параметров (и> или Р) уменьшение второго приводит к увеличению экспозиции необходимой для агрегации, при увеличении же этого параметра необходимая для агрегации экспозиция стремится к константе.

Начальная стадия УФ-лазерной фотоагрегации происходит при взаимодействии двух активированных светом молекул с конечным временем жизни фотоактивированного состояния. Такая модель качественно и количественно описывает экспериментальные результаты.

Созданный экспресс-метод позволяет сравнить чувствительности растворов различных белков к воздействию УФ излучения и для исследования влияния различных веществ на скорость фотоагрегации белков хрусталика глаза.

Мутантные р-кристаллины АЗП- обладают повышенной предрасположенностью к фотоагрегации по сравнению с нормальными Р-кристаллинами АЗ. Исследованные структурные изменения этих белков могут способствовать более раннему развитию катаракты у людей с соответствующими приобретенными или генетически унаследованными изменениями.

Созданная комбинация короткоцепочечных пептидов замедляет фотоагрегацию основных белков хрусталика глаза - кристаллинов. Композиция была апробирована в ГУ Научно-исследовательском институте глазных болезней РАМН. Получено существенное замедление развития УФ-индуцированной катаракты у экспериментальных животных.

Достоверность:

Достоверность и обоснованность положений и выводов, полученных в диссертации, обеспечена применением современной стандартизованной измерительной аппаратуры, метрологической поверкой измерительного оборудования, использованием стандартных экспериментальных оптических и биохимических методов, обработкой данных с помощью современного программного обеспечения, воспроизводимостью экспериментальных результатов и согласованием некоторых выводов с результатами других авторов. Система менеджмента и качества соответствует требованиям ГОСТ РВ 15.0022003 и ГОСТ Р ИСО 9001-2001.

Публикации и апробация результатов:

Основные результаты диссертации докладывались как на российских, так и на международных конференциях:

- отчетные конференции по Программе Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине": 25-26 ноября 2002; 10-11 декабря 2003; 2-3 декабря 2004; 14-16 декабря 2005; 27-29 ноября 2006; 3-4 декабря 2007, Москва;

- 11-я Нижегородская сессия молодых ученых (естественнонаучные дисциплины), 16-21 апреля 2006, д. Татинец, Нижегородская область;

- II и III Троицкая Конференция по Медицинской Физике (ТКМФ-2), 1619 мая 2006, (ТКМФ-3) 3-6 июня 2008, г. Троицк Московская область;

- X International Conference Nonresonant Laser-Matter Interaction (NLMI-10), 21-23 august 2000, Saint-Petersburg, Russia;

- European Biomedical Optics Week - EBIOS 2000, 4-8 July 2000, Amsterdam, Netherlands;

- International Quantum Electronics Conference 2002 / Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2002 (IQEC/LAT 2002), 22-27 June 2002, Moscow, Russia;

- XI International Conference Laser Matter Interaction (LMI-XI), 30 June -2 July 2003, St.-Petersburg-Pushkin, Russia;

- Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO 2003), 4 May 2003, Fort Lauderdale, Florida, IJSA;

- Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO 2005), 1-5 May 2005, Fort Lauderdale, Florida, USA;

- International Conference on Coherent and Nonlinear Optics / International Conference on Lasers, Applications, and Technologies (ICONO/LAT-2005), 11-15 May 2005, Saint-Petersburg, Russia;

- International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics, Saratov Fall Meeting405,27-30 September 2005, Saratov, Russia;

- International Conference on Coherent and Nonlinear Optics / International Conference on Lasers, Applications, and Technologies (ICONO/LAT-2007) Fundamentals of laser chemistry and photobiology, May 28 - June 1, Minsk, Belarus, 2007;

-Laser Applications in Life Sciences (LALS-2007), June 11-14, Moscow, Russia, 2007;

- International Conference "Fundamentals of Laser Assisted Micro- and Nano-technologies" (FLAMN-07), June 25-28, 2007, St. Petersburg - Pushkin, Russia.

По материалам диссертации опубликовано семь статей в рецензируемых научных журналах, включая препринт ИПФ РАН [1*], четыре статьи из перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени кандидата наук [2*-5*], и две статьи из списка зарубежных научных журналов и изданий, в которых могут быть опубликованы основные научные результаты диссертации [6*, 7*], определяемых Высшей аттестационной комиссией. Кроме того, опубликованы семь статей в сборниках научных трудов международных [8*-11*] и российских [12*- 14*] конференций и одиннадцать тезисов докладов на международных и российских научных конференциях [15*].

Результаты, представленные в диссертации, вошли в отчет о научной и научно-организационной деятельности ИПФ РАН за 2004, 2005 и 2008 годы по разделу "Основные результаты в области естественных, технических, гуманитарных и общественных наук" [16*- 18*]. Получено решение Роспатента о выдаче патента на изобретение «Фармацевтическая композиция для профилактики развития и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты)» [19*].

Личный вклад автора:

Личный вклад автора в работах, выполненных в соавторстве с сотрудниками лаборатории 332 отдела 330 Отделения нелинейной динамки и оптики Института прикладной физики РАН, заключается в участии постановки задачи, в проведении экспериментальных исследований и построении теоретической модели, в обработке, обсуждении, подготовке к публикации и представлению па конференциях полученных результатов, а также в оформлении проектов и отчетов по грантам РФФИ и по Программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».

Структура и объем диссертации:

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка трудов по диссертации и списка литературы. Общий объем диссертации составляет 120 страниц, включая 38 рисунков, 6 таблиц, 3 схемы. Список цитированной литературы содержит 181 наименование.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении рассматривается современное состояние проблемы и обзор литературы по тематике исследования, обоснована актуальность темы диссертации, формулируется цель исследования, дается общая характеристика работы, включающая научную новизну, практическую значимость и основные положения, выносимые на защиту.

Первая глава посвящена экспериментальному исследованию индуцированной импульсным излучением УФ-лазера агрегации яичного белка, хрусталика глаза свиньи и модельного белка карбоангидразы. Впервые такие исследования проведены в широком диапазоне изменения плотности энергии лазерных импульсов и частот их повторения. Важной задачей, решаемой в первой главе, является исследование воздействия на белки излучения ультрафиолетового диапазона различных длин волн. В первой части главы описаны эксперименты, проделанные с яичным белком и хрусталиком глаза свиньи, и направленные на определение диапазонов УФ излучения, в которых доминируют либо процессы агрегации (рис. 1, б), либо процессы фотолиза и фотоокисления (рис. 1, а), а также на определение температурного режима в процессе облучения. Определены соответствующие источники лазерного излучения, оптические методы регистрации и геометрия экспериментальных схем.

Кроме того, выявлены характеристики этих естественных сред, в частности, большая внутренняя неоднородность образцов и отсутствие требуемой повторяемости свойств от образца к образцу, что потребовало проведения серии экспериментов для получения статистически достоверных данных. В результате был сделан вывод о целесообразности проведения экспериментов с отдельными компонентами биологических сред - растворами входящих в их состав белков.

-!------,---,---1-------г—< U^I ---1----1----1-—-I-.

0 20 40 60 80 100 17.0 0 20 40 60 80

Экспозиция УФ, Дж/см2 Экспозиция УФ, Дж/см

а б

Рис. I. Изменение пропускания 633 нм из-за наведенного рассеяния в свином хрусталике в процессе воздействия излучением 270 нм (а) и 308 нм (б) от экспозиции облучения при двух значениях плотности энергии лазерных импульсов при частоте следования импульсов F = 10 Гц.

Обнаружено, что при воздействии на белковые среды излучения ХеС1-лазера (308 нм) в отличие от воздействия лазера с К = 270 нм наблюдается зависимость наведенного рассеяния не только от экспозиции облучения, но и от плотности энергии в импульсе.

Во второй части главы приведены результаты, полученные при воздействии излучения ХеСьлазера (308 нм) на карбоангидразу. Выбор этого белка в качестве модельного был обусловлен следующими обстоятельствами. Во-первых, по таким биофизическим свойствам как характерный размер и молекулярная масса он близок к у-кристаллину и некоторым формам р-кристаллина, являющимися основными белками хрусталика глаза. Во-вторых, зависимость степени его агрегации от экспозиции УФ облучения близка к соответствующей зависимости для PL-кристаллина.

Эксперименты с карбоангидразой позволили отработать последовательность действий при приготовлении и очистке растворов белков, а также температурные режимы их облучения и хранения.

Во второй главе, основываясь на выработанной в предыдущей части работы методике исследования, осуществляется изучение кинетики УФ (308 нм)-индуцированной агрегации основных белков хрусталика глаза а-, р-и у-кристаллинов как по отдельности, так и в смеси (рис. 2). Наиболее подробно была исследована УФ-индуцированная агрегация PL-кристаллина. По

9

экспозиционным зависимостям для ¡ЗЬ-кристаллина, как и для карбоангидра-зы, выявлена зависимость степени их агрегации не только от экспозиции, но и от режимов УФ облучения - от плотности энергии лазерных импульсов и частоты их повторения.

О 100 200 300 400 Б00 0 100 200 300 ^00

Экспозиция УФ, Дж/см Экспозиция УФ, Дж/ем

а б

Рис. 2. Экспозиционные зависимости для раствора РЬ-кристаллина с концентрацией С = 0,5 мг/мл при разных частотах повторения (Г) лазерных импульсов и плотности энергии (и') 40 мДж/см2 (о) и экспозиционные кривые для растворов а, а+Р и полного набора кристаллитов (б).

Полная смесь трех кристаллитов рассматривается как некоторая модель хрусталика глаза, наиболее близкая к нему по физико-химическим свойствам, нежели раствор каждого кристаллина в отдельности.

Основываясь на экспериментальных результатах для рЬ-кристаллина и карбоангидразы, были сделаны основные предположения, использованные при построении физической теории фотоагрегации, подробно изложенной в третьей главе.

Третья глава посвящена созданию физической модели начальной стадии агрегации белков при воздействии на них мягким УФ излучением, которая описывает образование агрегатов, а также оценкам температурных эффектов в образце при импульсном лазерном воздействии. В модели (рис. 3) рассматривается как случай непрерывного излучения, моделирующий солнечный УФ, так и более соответствующий эксперименту импульсный режим. Как следует из экспериментальных результатов первой и второй главы, такие характеристики излучения, как частота следования и плотность энергии лазерных импульсов, являются ключевыми факторами, определяющими кинетику агрегации. Установлено, что экспозиция УФ облучения, необходимая для агрегации белков (критическая экспозиция), нелинейно зависит от частоты и плотности энергии лазерных импульсов (ХеС1-лазер) таким образом, что эта экспозиция сильно падает с увеличением интенсивности, выходя на константу при их увеличении. Для объяснения этого эффекта принято, что первый этап фотоагрегации состоит в объединении двух активированных светом мо-

лекул белка. При этом фотоактивированное состояние обладает конечным временем жизни.

dR „ / , п2 /г

— = r¡aC--k2R¿--,

dt tico т

dM dt

k2R

2

аС 1 К

— ~-г]аС— + — dt Ьа> г

Рис. 3. Физическая модель начальной стадии агрегации белков при воздействии на них мягким УФ-излучением. Слева: процессы, происходящие согласно созданной модели (1 - активирование светом молекулы, 2 - возвращение в исходное состояние за время г, 3 - агрегация двух фотоактивированных молекул (ФАМ)). Справа: соответствующая система уравнений, где R - концентрация фотоактивированных молекул, а-эффективное сечение поглощения УФ квантов исходными молекулами белков (мономерами), Г}- квантовый выход фотоактивации мономеров при поглощении фотона, /интенсивность УФ излучения, к (О - энергия кванта излучения, к2 - константа скорости образования димеров при взаимодействии двух фотоактивированных мономеров, Г-характерное время жизни фотоактивированного состояния молекулы, М-концентрация проагрегировавших мономеров, С- концентрация молекул мономера.

Конкуренция процессов парного взаимодействия активированных молекул и релаксации активированного состояния при малой концентрации фотоактивированных состояний приводит к резкой зависимости экспозиции УФ-облучения, необходимой для агрегации белков, от интенсивности излучения I = Н'Х/\ Напротив, при большой концентрации фотоактивированных состояний конкуренции нет - все молекулы, активированные светом, агрегируют в парных процессах и зависимость критической экспозиции УФ облучения от интенсивности исчезает. При этом предполагается, что при рассматриваемых нами интенсивностях концентрация фотоактивированных молекул всегда много меньше, чем концентрация исходных мономеров.

Наложение теоретических кривых на экспериментальные данные позволили с помощью построенной модели не только качественно объяснить механизмы фотоагрегации, но н количественно, по порядку величины, оценить важные параметры задачи, основным из которых является время темповой дезактивации фотоактнвированного состояния, от величины которого существенно зависит скорость фотоатрегацпи белков.

Для самосогласования нового физического механизма начальной стадии УФ-индуцировапной агрегации были проведены дополнительные эксперименты, в результате которых было обнаружено и исследовано явление продолжения агрегации уже без действия света (эффект постагрегации).

В четвертой главе обосновывается создание экспериментального экспресс-метода изучения агрегации белковых молекул при воздействии излуче-

ння ХеС! лазера на водные растворы белков, а также возможность трактовки результатов, полученных с его помощью, на случай слабых интенсивностей, в частности, солнечного ультрафиолета. Этот метод использован для сравнения чувствительности к УФ излучению нормального и модифицированного р-кристаллина. Исследование влияния генетических изменений в строении молекулы кристаллина на восприимчивость к ультрафиолетовому излучению осуществлялось на искусственно полученных Р-кристаллинах. Основной результат этого исследования заключается в том, что изменение в строении белковой молекулы, в частности, купирование у нее аминокислотных остатков приводит к увеличению чувствительности к УФ (рис. 4, а). Такие приобретенные или унаследованные генетические изменения могут являться причиной ускоренного развития катаракты.

. 300-, _

180

Экспозиция УФ, Дж/см

О + Р О+Р+Г

а V р + ¥ + М-здетилхариозин

у у + О-паитетин а + Р + Т +0-ггазгг.+М-ацет.

0 100 200 300 , 400 Экспозиция УФ, Длс/см"

Рис. 4. Изменение рассеяния 633 нм (а) при УФ-облучении образцов фАЗ и фА31г с концентрациями 0,5 мг/мл в зависимости от УФ экспозиции. Экспозиционные кривые для полного набора кристалликов с добавлением О-пантстина и М-ацетилкарнозина -(б). Концентрация всех белков и добавок в растворе 0,5 мг/мл.

Особое внимание в четвертой главе уделяется исследованию действия веществ, замедляющих фотоагрегацию белков хрусталика глаза. При этом в качестве добавок рассматривались не только уже используемые в медицине антикатарактальные препараты и их составляющие. На основе сравнения влияния на агрегацию белков известных пептидов, использующихся в анти-катарактальных препаратах, предложена новая комбинация короткоцепочеч-ных пептидов, обладающих лучшими защитными свойствами (рис. 4, б). Фактически действие этих пептидов эквивалентно действию а-криеталлипа на агрегацию других белков, а-кристаллин обладает свойствами шаперона, то есть вещества, защищающего белковые молекулы в организме человека от разрушения при воздействии различных денатурирующих факторов.

В конце главы приведено количественное подтверждение того, что добавление в раствор исследуемого белка некоторых короткоцепочечных пептидов оказывает влияние на время темновой дезактивации и другие параметры системы. Делается заключение о том, что такие эксперименты совместно с привлечением для трактовки их результатов построенной модели позволяют производить экспресс-отбор добавок, которые могут рассматриваться как потенциальные антикатарактальные препараты. Приведены первые результаты экспериментов на лабораторных животных.

В заключении сформулированы основные результаты диссертационной работы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Экспериментально обнаружено, что экспозиция УФ облучения (О - \v-F-t), необходимая для агрегации водорастворимых белков, вызванной мягким УФ излучением ХеС1 лазера, зависит от значений плотности энергии лазерных импульсов н' и частоты их следования Р. При фиксировании одного из этих параметров (и- или Г) уменьшение второго приводит к увеличению экспозиции необходимой для агрегации, при увеличении же этого параметра необходимая для агрегации экспозиция стремится к константе.

2. Построена модель, согласно которой агрегация при УФ-лазерном облучении инициируется объединением двух фотоактивированных белковых молекул. При этом предполагается, что фотоактивированное состояние имеет конечное время жизни. Модель позволяет качественно и количественно описать экспериментальные результаты.

3. Создана экспресс-методика изучения УФ-лазерной агрегации белковых молекул при воздействии импульсного излучения ХеС.1 лазера на водные растворы белков. С помощью этой методики установлена повышенная чувствительность к воздействию УФ излучения модифицированного Р-кристаллина по сравнению с нормальным, а также исследовано влияние различных веществ на скорость УФ-индуцированной агрегации белков хрусталика глаза.

4. На основе исследования действия короткодепочечных пептидов установлена селективность их воздействия на агрегацию различных кристаллитов хрусталика глаза. Создана комбинация пептидов, которая в большей степени замедляет агрегацию кристаллитов, чем вещества, на основе которых созданы известные антикатарактальные препараты.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Анисимов С.И., Имас Я.А., Романов Г.С., Ходыко Ю.В., Действие излуче-

ния большой мощности на металлы // М. Наука, 1970.

2. Веденов А.А., Гладуш Г.Г., Физические процессы при лазерной обработке

материалов // М.: Энергоатомиздат, 207 е., 1985.

3. Bauerle D., Laser Processing and Chemistry // Springer, 3rd ed., Berlin, 2000.

4. Bityurin N., Studies on laser ablation of polymers // Annu. Rep. Prog. Chem.,

Sect. C, 101, pp. 216-247,2005.

5. Jacques S.L., Laser-tissue interaction: Photochemical, photothermal and photo-

mechanical // Surgical Clinics of North America, 72(3), pp. 531-558,1992.

6. Niemz M.H., Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications II Bio-

logical and Medical Physics, Biomedical Engineering, Springer-Verlag, 2003.

7. Каменский B.A., Исследование режимов лазерной модификации мягких

биотканей при помощи ИК лазерных устройств // Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук. Саратовский Государственный Университет, 2001.

8. Welsh A.J., The Thermal Response of Laser Irradiated Tissue // IEEE Journal of

Quantum Electronics, 20, pp. 1471-1481, 1984.

9. Daniel M.-C., Austruc D., Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular

Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology // Chem. Rev., 104(1), pp. 293-346,2004.

10. Смирнова Л.А., Александров А.П., Якимович H.O., Сапогова Н.В., Кирсанов А.В., Соустов Л.В., Битюрин Н.М., УФ индуцированное формирование наночастиц золота в полимерной матрице полиметилметакрилата II Доклады академии наук, 400(6), с. 779-781, 2005.

11. Mafune F., Kohno J., Takeda Y., and Kondow Т., Full Physical Preparation of Size-Selected Gold Nanoparticles in Solution: Laser Ablation and Laser-Induced Size Control // Journal of Physical Chemistry B, 106(31), p. 75757577,2002.

12. Taubes G., Protein Chemistry: Misfolding the Way to Disease II Science, 271, pp. 1493-1495,1996.

13. World Health Organization Fact Sheet No. 282; WHO November 2004; available at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs282/en/index.html

14. Ayala M.N., Michael R., and Soderberg P.G., Influence of Exposure Time for UV Radiation-Induced Cataract // Investigative Ophthalmology tfe Visual Science, 41( 11), pp. 3539-3543,2000.

15. Lofgren S., Michael R-, and Soderberg P.G., Impact of Age and Sex in Ultraviolet Radiation Cataract in the Rat II Investigative Ophthalmology & Visual Science, 44(4), pp. 1629-1633, 2003.

16. Merriam J.C., Lofgren S., Michael R., Soderberg P., Dillon J., Zheng L., and Ayala M., An Action Spectrum for UV-B Radiation and the Rat Lens // Investigative Ophthalmology & Visual Science, 41(9), pp. 2642-2647,2000.

17. Корхмазян M.M., Федорович И.Б., Островский M.A., Механизмы фотоповреждения структур глаза. Действие УФ-света на растворимые белки хрусталика. И Биофизика, 38(6), с. 966-971,1983.

18. Ельчанинов В.В., Федорович И.Б., Механизмы фотоповреждения структур глаза. Образование агрегатов лолипептидов при УФ-облучении белков хрусталика // Биофизика, 34, с. 758-762, 1989.

19. Ельчанинов В.В., Федорович И.Б., Механизм фотоповреждения структур глаза. Изменение зарядов кристалликов хрусталика при ультрафиолетовом облучении // Биофизика, 35, с. 200-204, 1990.

20. Островский М.А., Федорович И.Б., Ельчанинов В.В, Кривавдин А.В., Опасность повреждающего действия света на структуры глаза. Хрусталик - как естественный светофильтр и объект фотоповреждения I! Сенсорные системы, 8(3-4), с. 135-146,1994.

21. Khanova Н.А., Markossian К.А., Kurganov В.I., Samoilov, A.M., Kleimenov S.Yu., Levitsky D.I., Yudin I.K., Timofeeva A.C., Muranov K.O., Ostrovsky M.A., Mechanism of Chaperone-like Activity. Suppression of Thermal Aggregation of PL-Crystallin by a-Crystallin // Biochemistry, 44(47), pp. 1548015487,2005.

22. Borkman R.F., Knight G. and Obi В., The Molecular Chaperone a-Crystallin Inhibits UV - Induced Protein Aggregation // Exp. Eye Res., 62, p. 141-148,1996.

СПИСОК РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ

1*. Битюрин Н.М., Соустов JI.B., Челноков Е.В., Немов В.В., Яхно Т.А., Сергеев Ю.В., Островский М.А., Исследование фотоагрегации белков при воздействии излучения ХеС1 лазера // Препринт НПФ РАН, № 599, Нижний Новгород, 19 е., 2002.

2*. Соустов JI.B., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Немов В.В., Сергеев Ю.В., академик Островский М.А., Фотоагрегация водорастворимого белка (кар-боангидразы) под действием ультрафиолетового излучения ХеС1-лазера // Доклады Академии Наук, 388(5), с. 683-688,2003.

3*. JI. В. Соустов, Е. В. Челноков, Н. В. Сапогова, Н. М. Битюрин, В. В. Немов, Ю. В. Сергеев, М. А. Островский, Исследование биофизических механизмов агрегации кристаллинов, индуцированной импульсным лазерным УФ излучением 308 нм И Биофизика, 53(4), с. 582-597,2008.

4*. Соустов JI.B., Челноков Е.В., Сапогова Н.В., Битюрин Н.М., Немов В.В., Карпова О.Е., Шеремет H.JL, Полунин Г.С., Аветисов С.Э., Островский М.А., Исследование влияния шапероноподобной (защитной) активности короткоцепочечных пептидов на скорость УФ-нвдуцированной зксимер-ным лазером агрегации бета-кристаллина И Вестник офтальмологии, 124(2), сс. 6-8, 2008.

5*. Аветисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет Н.Л., Макаров И.А., Федоров А.А., Карпова О.Е., Муранов К.О., Тимофеева А.К., Соустов Л.В., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Сапогова Н.В., Немов В. В., Болдырев А.А., Островский М.А., Изучение воздействия смеси ди- и тетра-пептидов на «пролонгированной» модели ультрафиолет-индуцироанной катаракты у крыс // Вестник офтальмологии, 124(2), сс. 12-16,2008.

6*. Sergeev Yu.V., Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Backlund P.S., Wingfield Jr.P.T., Ostrovsky M.A., and Hejtmancik J.F., Increased Sensitivity of Amino-Arm Truncated f3A3-Crystallin to UV-Light-Induced Photoaggregation // Investigative Ophthalmology and Visual Science, 46(9), pp. 3263-3273, 2005.

7*. Evgeny Chelnokov, Lev Soustov, Natalia Sapogova, Mikhail Ostrovsky, and Nikita Bityurin, Nonreciprocal XeCl laser-induced aggregation of P-crystallins in water solution // Optics Express, 16(23), pp. 18798-18803, 2008.

8*. Bityurin N.M., Muraviov S.V., Kamensky V.A., Malyshev A.Y., Chelnokov E.V., Soustov L.V., Gelikonov G.V., Kinetics of low scattering biotissue photodenaturation induced by the UV harmonics of a Nd:YAP laser and by a YAG:Nd laser at a wavelength 1440 nm // Proc. SPIE, 4161, pp. 1-11, 2000.

9*. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Nemov V.V., Yahno T.A., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Investigation of photo-aggregation of proteins irradiated by XeCl laser light // Proc. SPIE, 5149, pp. 85-95,2003.

10*. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Kiselev A.L., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Photoagreggation of crystallins (main proteins of eye lens) under the action of XeCl laser radiation И Proc. SPIE, 5506, p. 28-33,2004.

11*. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Kiselev A.L., Bityurin N.M., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Study of molecular mechanisms of UV-induced aggregation of crystallins and possibility of maintaining eye lens transparency // Proc. SPIE, 6257, p. 280-287,2006.

12*. Соустов Л. В., Челноков Е. В., Бкгюрин Н. М., Киселев А. Л., Немов В. В., Сергеев Ю. В., Островский М. А., Исследование агрегации кристаллинов хрусталика глаза при воздействии неионизирующего УФ излучения

и шапероно-подобных свойств короткоцепочечных пептидов // Труды XI нижегородской сессии молодых ученых, стр. 210,2006.

13*. Соустов JI.B., Челноков Е.В., Киселев А. Л., Немов В.В., Сергеев Ю. В., Островский М.А., Битюрин Н.М., Исследование молекулярных механизмов УФ-индуцированной агрегации кристаллинов хрусталика глаза и возможностей поддержания его прозрачности // Альманах клинической медицины, XII, труды II троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине», стр. 34,2006.

14*. Челноков Е.В., Соустов Л.В., Сапогова Н.В., Сергеев Ю. В., Островский М.А., Битюрин Н.М., Модель УФ-индуцированной агрегации бета-кристаллина при различных уровнях облучения // Альманах клинической медицины, XVII(l), стр. 109,2008.

15*а. Kamensky V., Muraviov S., Malyshev A., Chelnokov E., Bityurin N., Photomodification of low-scattering biotissues by a YAG:Nd laser at a wavelength of 1440 nm and by the fifth harmonic of a Nd:YAP laser (216 nm) below ablation threshold // Abstracts of X International Conference NLMJ-J0, St.-Petersburg, 21-23 august, p. 29,2000.

15*6. Bityurin N.. Muraviov S., Malyshev A., Chelnokov E., Kamensky V., Kinetics of low scattering biotissue photodenaturation induced by the fifth harmonic of a Nd:YAP laser (216 nm) and by a YAG:Nd laser at a wavelength 1440 nm // Technical Programme of European Biomedical Optics Week, EBIOS, Amsterdam, 4-8 July, p. 74,2000.

15*u. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Ostrovsky M.A., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Investigation of photoaggregation of proteins irradiatied by XeCl laser light // Technical program of International Quantum Electronics Conference 2002 / Conference on Lasers, Applications, and Technologies, Moscow, 22-27 June, p. 155,2002.

15*r. Chelnokov E.V., Soustov L.V., Bityurin N.M., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Photoagreggation of Crystallins (Main Proteins of Eye Lens) Under the Action of XeCl Laser Radiation U Abstracts of XI International Conference Laser Matter Interaction (LMI-XI), St.-Petersburg-Pushkin, june 30 -july 2, p. 21,2003,

15*д. Sergeev Y.V., Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Wingfield P.T., Ostrovsky M.A., Hejtmancik J.F., Increased Sensitivity of Amino-arm Truncated ЬАЗ Crystallin to UV-light Induced Photo-aggregation U Abstracts of Association for Research in Vision and Ophthalmology, Fort Lauderdale, Florida, USA, 4 May, 2003.

15*e. Sergeev Yu.V., Backlund P.S., Soustov L.V., Chelnokov E.V., Ostrovsky M.A., Hejtmancik J.F., Increased UV-Light Sensitivity of Amino-Arm Truncated

рАЗ-CrystalIin: Specific Structural Modifications // Abstracts of Association for Research in Vision and Ophthalmology, Fort Lauderdale, Florida, USA, 2005.

15*ж. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Kiselev A.L., Bityurin N.M., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Study of molecular mechanisms of UV-induced aggregation of crystallins and possibility of maintaining eye lens transparency И Conference program oflCONO/LAT-2005, p. 108, 2005.

15*з. Соустов JI.B., Челноков E.B., Битюрин H.M. и др., Тезисы отчетных конференций по Программе Президиума РАН "Фундаментальные науки -медицине", Москва, 25-26 ноября, с. 51,2002; 10-11 декабря, с. 36, 2003; 23 декабря, стр.192, 2004; 14-16 декабря, с. 114, 2005, 27-29 ноября, с.47, 2006; 3-4 декабря, с.54,2007.

15*и. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Study of molecular mechanisms of UV aggregation of eye proteins // Abstracts of Saratov Fall Meeting, p. 7,2005.

15*к. Chelnokov E.V., Soustov L.V., Sapogova N.V., Bityurin N.M., Ostrovsky M.A., Postaggregation in XeCl laser irradiated water solutions of PL-crystallin at low exposures // Technical Digest of International Conference on Coherent and Nonlinear Optics / International Conference on Lasers, Applications, and Technologies (ICONO/LAT-2007), May 28 - June 1, Minsk, Belarus, 2007.

15*л. Chelnokov E.V., Soustov L.V., Sapogova N.V., Bityurin N.M., Ostrovsky M.A., Postaggregation in XeCf laser irradiated water solutions of (3L-crystaHin // Technical Digest of Laser Applications in Life Sciences (LALS-2007), June 11-14, Moscow, Russia, 2007.

16*. Соустов Л.В., Челноков E.B., Бипорин H.M., Киселев А.Л., Немов В.В., Сергеев Ю.В., Островский М.А., Исследование механизмов поддержания прозрачности хрусталика глаза при воздействии УФ излучения // Отчет о научной и научно-организационной деятельности ИПФ РАН за 2004 год, с. 36,2005.

17*. Соустов Л.В., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Островский М.А., Sergeev Yu.V., Backlund P.S., Wingfield P.T., Hejtmancik J.F., Лабораторное моделирование развития катаракгы под действием УФ излучения // Отчет о научной и научно-организационной деятельности ИПФ РАН за 2005 год, с. 50,2006.

18*. Соустов Л.В., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Немов В.В., Аветисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет Н.Л., Карпова О.Е., Муранов К.О., Островский М.А., Замедление развития катаракты // Отчет о научной и научно-организационной деятельности ИПФ РАН за 2008 год, с. 50,200S.

19*. Соустов Л.В., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Немов В.В., Аветисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет Н.Л., Карпова О.Е., Муранов К.О., Островский М.А., Фармацевтическая композиция для профилактики развития и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты), Заявка на патент, Россия, № 2007144339 от 3.12.2007. Полож. решение 17 сентября 2008 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ВВЕДЕНИЕ

Цель диссертационной работы Научная новизна работы Научно-практическая значимость ГЛАВА 1. Экспериментальное исследование агрегации водорастворимых белков при воздействии УФ-лазерного излучения различных длин волн

1.1 Выбор исследуемой среды и длины волны излучения

1.1.1 Материалы и методы

1.1.2 Схемы экспериментов

1.1.3 Результаты и их обсуждение

1.1.4 Выводы

1.2 Изучение УФ-вддуцированной агрегации модельного белка карбоаигидразы

1.2.1 Материалы и методы

1.2.2 Результаты и их обсуждение

1.2.3 Выводы

ГЛАВА 2. Исследование УФ-индуцированной агрегации кристаллинов хрусталика глаза при воздействии излучения ХеС1 лазера

2.1 Материалы и методы

2.2 Результаты и их обсуждение

2.2.1 Исследование УФ-индуцированной агрегации рь-крнсталлина

2.2.2 Исследование УФ-индуцированной агрегации смссн кристаллинов

2.3 Выводы

ГЛАВА 3. Построение модели фотоагрегаиии водорастворимых белков и сравнение с экспериментом

3.1 Оценки

3.2 Физическая модель фотоагрегации

3.2.1 Режим непрерывного УФ-облучения

3.2.2 Воздействие на раствор белка импульсного УФ-имучення

3.2.3 Выводы

3.3 Исследование постагрегации. Самосогласовалие модели

3.4 Заключение

ГЛАВА 4. Экспресс-метод исследования УФ-лазерной агрегации водорастворимых белков и некоторые ею применения

4.1 Исследование влияния короткоцепочечньгх пептидов на скорость УФ-индуцированной агрегации смеси кристаллитов

4.1.1 Материалы и методы

4.1.2 Результаты и их обсуждение

4.2 Обобщение модели на случай слабых интснснвностсй

4.3 Подбор новых антикатарахтаиьных добавок

4.4 Повышенная чувствительность РАЗ-кристаллина с измененным строением молекулы (укороченной аминокислотной цепочкой) к фотоагрегашш, вызванной УФ-излучением

4.4.1 Материалы и методы

4.4.2 Результаты

4.4.2.1 Кинетика фотоагрегации, вызванной УФ-облучснисм

4.4.2.2 Исследование физико-химиическимн методами

4.4.2.3 Влияние концентрации раствора

4.4.3 Выводы

4.5 Заключение ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ ЛИТЕРАТУРА

Евгений Владимирович Челноков

УФ ЛАЗЕРНАЯ АГРЕГАЦИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ

Автореферат

Подписано к печати 13.03.2009 г. Формат 60 х 90 . Бумага офсетная № 1. Усл. печ. я. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ № 35(2009)

Отпечатано в типографии Института прикладной физики РАН, 603950, Н. Новгород, ул. Ульянова, 46

ВВЕДЕНИЕ.

Цель диссертационной работы:.

Научная новизна работы:.

Научно-практическая значимость.

ГЛАВА 1. Экспериментальное исследование агрегации водорастворимых белков при воздействии УФ-лазерного излучения различных длин волн.

1.1 Выбор исследуемой среды и длины волны излучения.

1.1.1 Материалы и методы.

1.1.2 Схемы экспериментов.

1.1.3 Результаты и их обсуждение.

1.1.4 Выводы.

1.2 Изучение УФ-индуцированной агрегации модельного белка карбоангидразы.

1.2.1 Материалы и методы.

1.2.2 Результаты и их обсуждение.

1.2.3 Выводы.

ГЛАВА 2. Исследование УФ-индуцированной агрегации кристаллинов хрусталика глаза при воздействии излучения ХеС1 лазера.

2.1 Материалы и методы.

2.2 Результаты и их обсуждение.

2.2.1 Исследование УФ-индуцированной агрегации рЬ-кристаллина.

2.2.2 Исследование УФ-индуцированной агрегации смеси кристаллинов

2.3 Выводы.

ГЛАВА 3. Построение модели фотоагрегации водорастворимых белков и сравнение с экспериментом.

3.1 Оценки.

3.2 Физическая модель фотоагрегации.

3.2.1 Режим непрерывного УФ-облучения.

3.2.2 Воздействие на раствор белка импульсного УФ-излучения.

3.2.3 Выводы.

3.3 Исследование постагрегации. Самосогласование модели.

За почти полувековой срок, прошедший с момента создания первого оптического квантового генератора, лазерное излучение получило применение в самых различных областях промышленности, техники, медицины. В настоящее время в связи с развитием лазерных технологий большое внимание уделяется исследованию взаимодействия лазерного излучения с веществом (см. например монографии [1-3]). Одним из важных направлений этих исследований является изучение взаимодействия лазерного излучения с полимерными средами [4-5]. Поглощение материалом лазерного излучения вызывает нагрев, полимерного вещества, что, в свою очередь, может приводить к разрыву полимерных цепей, их сшиванию, выделению газообразных продуктов, и связанным с этим механическим эффектам. При воздействии излучения УФ лазеров" важную роль могут играть также фотохимические реакции, которые не связаны с общим нагревом вещества.

Изучение воздействия лазерного' излучения на биологические среды важно для применения в медицинских целях [6-9]. Особенностью воздействия на эти среды является то, что мягкие биологические ткани в значительной степени состоят из воды, что приводит к специфической реакции вещества на лазерный нагрев [10-13], а также то, что белки, составляющие основу тканей, являются молекулами со сложной пространственной структурой. Лазерное воздействие может приводить к значительному изменению этой структуры - к денатурации, которая существенно изменяет свойства этих молекул [14, 15].

Тепловая денатурация белков часто сопровождается агрегацией молекул [16 - 17]. Разворачивание водорастворимых белковых молекул {unfolding) приводит к "обнажению" гидрофобных остатков, и движущей силой агрегации являются гидрофобные взаимодействия между развернутыми молекулами [18-20]. Важно подчеркнуть различие между процессами ассоциации и агрегации. Ассоциацией (или самосборкой; selfз assembly) называют взаимодействие белковых молекул, приводящее к образованию стехиометрически строго детерминированных олигомерных структур. Агрегацией называют взаимодействие развернутых белковых молекул, которое приводит к образованию олигомеров "неправильной" формы вследствие "ошибочных" межмолекулярных взаимодействий [21]. В данной работе значительное внимание уделяется исследованию процессов агрегации водорастворимых белков при воздействии лазерного излучения.

Впервые теоретические работы по агрегации молекулярных систем были опубликованы М. Смолуховским в 1916 году [22]. В них записывались уравнения для необратимой агрегации и вводилась вероятность необратимого слипания кластеров, которая может зависеть, например, от пространственного строения кластера [23]. В связи с большим практическим, интересом широкое распространение получили теоретические и экспериментальные работы, по диффузионно-ограниченной агрегации [24 -26], и; по реакционно-ограниченной агрегации, образующимся в результате агрегации фракталам, их размерностям и свойствам [24, 26 -28]. В настоящее время опубликованы многочисленные математические модели, обобщающие уравнения М. Смолуховского на» случай обратимой агрегации и агрегации с фрагментацией [24,29-31]. Уравнения, написанные в общем виде М. Смолуховским, применяются для оценки правильности • полученных решений, например, в работе по математическому моделированию молекулярной, динамики коллоидной суспензии с учетом как коллоидных частиц так и «частиц» раствора [32]. Процесс образования и агрегации кластеров лежит в области интересов биологии, иммунологии, полимерной и коллоидной химии, металлургии. Прикладные исследования агрегации актуальны также и в социальных науках. Так, например, в работах [33, 34] модель необратимой агрегации применена к исследованию миграционных и демографических процессов.

Наряду с многочисленными исследованиями; посвященными агрегации большого количества частиц, лишь малая доля внимания уделяется изучению бимолекулярных механизмов взаимодействия [35,36]. В работе [37], показано, что* в растворах белка возможно образование равновесных кластеров, содержащих до двух десятков молекул, причем равновесие определяется не специфическим взаимодействием белковых молекул, а выравниванием сил электростатического отталкивания и ближнепольного притяжения. В этой работе продемонстрирована зависимость размера агрегатов от концентрации белка в растворе. При этом концентрация белка в эксперименте была всего в несколько раз ниже, чем концентрация этого же белка в яичном белке [38].

Представляется уместным упомянуть другие процессы, в которых, как и при' агрегации, сложные молекулярные образования получаются из более простых.

Молекула белка является полимером биологического происхождения (биополимером), в которой аминокислоты играют роль мономеров. В этой связи следует отметить некоторое сходство процесса агрегации с такими химическими процессами в полимерной химии, как полимеризация и поликонденсация, кинетика которых изучалась в нашей группе [39-42].

При полимеризации мономер может реагировать только с микрорадикалом и растущей полимерной цепью, макрорадикалом [43, 44]. Интересно отметить, что белковые агрегаты, состоящие из небольшого числа исходных белковых молекул, называются олигомерами аналогично синтетическим полимерам с малой длиной цепи. При поликонденсации могут вступать в химическую реакцию любые две частицы, находящиеся в системе [45]. Поликонденсация может приводить к образованию трехмерных сеток, гелей. При полимеризации полифункциональных мономеров также возможно образование трехмерных структур. Такие гигантские трехмерные фракталоподобные образования возможны и на поздних стадиях агрегации белковых молекул.

При фазовых переходах процесс агрегации зачастую лежит в основе процесса формирования новой фазы [28]. В настоящее время одной из стандартных методик получения металлических наночастиц в растворе является преципитация, осаждение частиц, возникающая при пересыщении раствора [46]. Этот процесс может быть рассмотрен как фазовый переход первого рода. Если в твердых растворах агрегация образующихся частиц, зародышей* новой фазы, затруднена [47, 48], то в жидкости управление агрегацией и ростом частиц, выпадающих в осадок, является одной из основных задач этой методики [49-52]. Сходство термодинамики самоорганизации белков с фазовыми переходами первого рода экспериментально установлено в работах П. JL Привалова [53], а сходство кинетических аспектов этих явлений - в компьютерных экспериментах Е. И. Шахновича и А. М. Гутина [54]. При определенных условиях (степень пересыщения^ раствора, уровень температуры, величина рН) белок как в физиологическом растворе in vitro, так и in vivo, например, в хрусталике глаза, способен кристаллизоваться [55, 56]: Такие фазовые переходы белка изучаются белковой кристаллографией [57, 58].

Агрегация белков является, причиной многих заболеваний [59-63]. Одно из них - катаракта, являющаяся по данным Всемирной Организации Здравоохранения основной' причиной потери зрения- во всем» мире [64, 65]. Катаракта является клиническим результатом увеличения рассеяния света хрусталиком глаза. Это светорассеяние может возникать из-за потери клеточного порядка в хрусталике в. результате нарушения процесса его развития или бесконтрольного деления клеток, а также из-за потери прозрачности отдельных клеток хрусталика. Последнее, в частности, может произойти из-за фотоповреждения основных белков хрусталика -кристалл инов, вызывающего их агрегацию. Причиной появления наследственной катаракты могут стать мутированные кристаллины из-за изменения стабильности связи (ассоциации) или растворимости. Вызванная воздействием на хрусталик ультрафиолетовым излучением катаракта активно изучается in vivo [66-68] и in vitro [69-72].

Из литературы известно, что в организме развитию процессов денатурации препятствуют специальные белки - шапероны [73-75], механизм действия которых частично раскрыт в [76,77]. Многие молекулярные шапероны известны как белки теплового шока {heat-shock proteins, Hsp), которые синтезируются в клетках всех организмов в ответ на повышение температуры выше допустимой. Белки теплового шока необходимы для защиты клеток от теплового повреждения и для нормализации функций клеток после прекращения теплового воздействия [78-84]. В то время'как одни шапероны способствуют сворачиванию полипептидной цепи в нативную (исходную) структуру, другие - способны замедлять процесс агрегации белковых субстратов, но не могут обеспечить полный- переход белка в нативное состояние [78, 80, 85 - 92]. Большой интерес к изучению свойств белков теплового шока и процессов агрегации привело к тому, что в последнее время появилось большое количество экспериментальных и теоретических работ по тепловой агрегации белков [21-38, 73 - 101].

Как показали ранее проведенные исследования, воздействие на организм УФ излучения является стрессом, в результате которого в организме также выделяются шапероны [102, 103]. Однако, например, в хрусталике глаза изначально присутствует белок а-кристаллин, который замедляет агрегацию (3- и у- кристаллинов, при воздействии высокой температуры [104, 105] или УФ излучения [106]. Шаперонная активность а-кристаллина была открыта сравнительно недавно [107-113] и похожа на хорошо известную шаперонную активность белков теплового шока. Несмотря на защитные свойства а-кристаллина с возрастом в хрусталике накапливаются, необратимые изменения, приводящие к его помутнению, то есть к развитию катаракты.

В работах [69-72] исследовались фотоповреждения хрусталика глаза при воздействии излучения УФ лампы. Установлено образование агрегатов полипептидов [70], изменение зарядов кристаллинов хрусталика [71], повреждения структуры глаза под действием света [72] и наличие процессов комплексообразования в растворах кристаллинов [101]. В этих работах использовалось широкополосное излучение с коротковолновой границей ~ 260 нм, где существенны процессы фотолиза. Роль процессов фотолиза в кристаллинах существенно уменьшается при воздействии на них более длинноволнового монохроматического лазерного излучения с длинами волн 295 и 308 нм. Однако до работы над диссертацией в литературе были опубликованы лишь единичные статьи по УФ лазерной агрегации белков [106, 114-116].

Подчеркивая принципиальное отличие лампового и лазерного ультрафиолетового излучения, отметим, что результаты, полученные при воздействии монохроматическим излучением проще трактовать, нежели следствия облучения широкополосным спектром мощных УФ ламп. При вырезании же узкого диапазона из спектра излучения УФ лампы существенно уменьшается интенсивность и, соответственно, увеличивается время проведения экспериментов. Некоторые процессы агрегации белков при лазерном воздействии связаны именно с большими плотностями энергии лазерных импульсов.

Задачей данной работы является исследование биофизических процессов УФ-индуцированной агрегации при использовании интенсивностей, достаточных для возникновения нелинейных эффектов при агрегации, но не приводящих к нагреву и нелинейному поглощению УФ излучения в растворах белков. В данной работе мы не будем различать термины доза и экспозиция УФ облучения. Другая задача - использование результатов исследования агрегации при поиске веществ, способных защитить белки от денатурирующих воздействий.

Эффективным методом исследования агрегации частиц в водном растворе является измерение мощности рассеянного излучения пробного лазерного пучка [117-120]. Этот метод, получивший широкое применение в экспериментальных работах [121, 122], будет использован и в настоящей работе.

Цель диссертационной работы:

- экспериментальное исследование воздействия лазерного излучения ультрафиолетового диапазона, не сводящегося к нагреву вещества излучением, на биологические среды и, в частности, на водные растворы белков;

- построение модели фотоагрегации водорастворимых белков, объясняющей выявленные закономерности;

- создание на основе экспериментальной методики и теоретической модели нового физического метода исследования процессов агрегации водорастворимых белков при воздействии на них импульсного лазерного УФ излучения;

- исследование возможности применения нового метода для сравнения способности белков к фотоагрегации и отбора добавок, ее замедляющих, в частности, для поиска новых антикатарактальных препаратов.

Научная новизна работы:

В работе экспериментально исследована зависимость УФ* лазерной фотоагрегации белков в растворе от экспозиции облучения I) и выявлен эффект зависимости степени агрегации (наведенного рассеяния) не только от экспозиции, но и от интенсивности облучения.

Предложен новый физический, механизм агрегации через бимолекулярное взаимодействие фотоактивированньтх молекул белка. Этот механизм позволяет не только качественно, но и количественно описать полученные экспериментальные результаты.

В работе предложен новый экспресс-метод исследования агрегации белковых растворов, который- применен для сравнения чувствительности растворов-различных белков к воздействию УФ излучения. Данный метод может быть использован для экспресс-тестирования добавок, замедляющих агрегацию основных белков хрусталика глаза человека - кристаллинов. Такие добавки могут быть использованы при создании препарата для профилактики развития и, возможно, для лечения начальной стадии катаракты.

На основе исследования' с помощью экспресс-метода влияния на скорость УФ-индуцированной агрегации кристаллинов различных пептидов, используемых при создании антикатарактальных препаратов, предложена новая комбинация короткоцепочечных пептидов, применение которой дало существенное (в несколько раз) замедление развития УФ-индуцированной катаракты у экспериментальных животных (крыс).

На защиту выносятся следующие положения:

Экспозиция УФ излучения (П = \v-F-t), необходимая для агрегации водорастворимых белков, вызванной мягким УФ излучением ХеС1 лазера, зависит от значений плотности энергии лазерных импульсов и частоты их следования Г. При фиксировании одного из этих параметров (и- или Г) уменьшение второго приводит к увеличению экспозиции необходимой для агрегации, при увеличении же этого параметра необходимая для агрегации экспозиция стремится к константе.

Начальная стадия УФ-лазерной фотоагрегации происходит при взаимодействии двух активированных светом молекул с конечным временем жизни фотоактивированного состояния. Такая модель качественно и количественно описывает экспериментальные результаты.

Созданный экспресс-метод позволяет сравнить чувствительности растворов различных белков к воздействию УФ излучения и для исследования влияния различных веществ на скорость фотоагрегации белков хрусталика глаза.

Мутантные Р-кристаллины АЗй обладают повышенной предрасположенностью к фотоагрегации по сравнению с нормальными (3-кристаллинами АЗ. Исследованные структурные изменения этих белков могут способствовать более раннему развитию катаракты у людей с соответствующими приобретенными или генетически унаследованными изменениями.

Созданная комбинация короткоцепочечных пептидов замедляет фотоагрегацию основных белков хрусталика глаза — кристаллинов.

Композиция^ была апробирована в ГУ Научно-исследовательском институте глазных болезней РАМН; Получено существенное замедление развития УФ-: индуцированной катаракты у экспериментальных животных.

Научно-практическая значимость

Предложен новый механизм фотоагрегации водорастворимых белков.

Созданный в работе тестовый;экспресс-метод может быть использован при отборе веществ, защищающих кристаллины хрусталика глаза-, от повреждающего воздействия УФ излучения, на основе которых могут быть созданы принципиально, новые антикатарактальные препараты.

Работа проводилась в рамках, исследований, поддержанных Российским' фондом^ фундаментальных исследований; (гранты № 00-02-16411-а. №» 01-02-06492-мас, № 02-04-49342-а, № 03-04-06233-мас; №04-04-08150-офша, № 05-04-48749-а, № 08-02-01157-а, №08-04-97108-рповолжьеа) и программой Президиума РАН «Фундаментальные Науки; -Медицине» с 2002 по 2008 годы.

В рамках проекта РФФИ № 04-04-08150-офи«а в ГУ Научно-исследовательский институт глазных болезней РАМН проведены: испытания предложенной, нами комбинации короткоцепочечных пептидов. Получено существенное замедление развития УФ-индуцированной катаракты у экспериментальных животных. Получено решение Роспатента о выдаче патента, на изобретение. «Фармацевтическая композиция для профилактики; развития и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты)».

Достоверность и обоснованность положению и выводов, полученных в диссертации, обеспечена применением современной? стандартизованной измерительной аппаратуры^ метрологической поверкой измерительного оборудования, использованием стандартных экспериментальных оптических и биохимических методов, обработкой данных с помощью современного программного обеспечения, воспроизводимостью экспериментальных результатов и согласованием некоторых выводов, с результатами других авторов. Система менеджмента и качества соответствует требованиям ГОСТРВ 15.002-2003 иГОСТРИСО 9001-2001.

Публикации и апробация результатов. Основные результаты диссертации докладывались как на российских конференциях:

- отчетные конференции по Программе Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине": 25-26 ноября 2002; 10-11 декабря 2003; 2-3 декабря 2004; 14-16 декабря 2005; 27-29 ноября 2006; 3-4 декабря 2007, Москва;

-11-я Нижегородская сессия молодых ученых (естественнонаучные дисциплины), 16-21 апреля 2006, д. Татинец, Нижегородская область;

- II и III Троицкая Конференция по Медицинской Физике (ТКМФ-2), 16-19 мая 2006,^ (ТКМФ-3) 3-6 июня 2008, г. Троицк Московская область; так и на международных:

-X International Conference Nonresonant Laser-Matter Interaction (NLMI-10), 21-23 august 2000, Saint-Petersburg, Russia;

- European Biomedical Optics Week - EBIOS 2000, 4-8 July 2000, Amsterdam, Netherlands;

- International Quantum Electronics Conference 2002 / Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2002 (IQEC/LAT 2002), 22 27 June 2002, Moscow, Russia;

- XI International Conference Laser Matter Interaction (LMI-XI), 30 June -2 July 2003, St.-Petersburg-Pushkin, Russia;

- Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO 2003), 4 May 2003, Fort Lauderdale, Florida, USA;

-Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO 2005), 1-5 May 2005, Fort Lauderdale, Florida, USA;

- International Conference on Coherent and Nonlinear Optics / International Conference on Lasers, Applications, and Technologies (ICONO/LAT-2005), IIIS May 2005, Saint-Petersburg, Russia;

- International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics, Saratov. Fall Meeting"05, 27-30 September 2005, Saratov, Russia;

- International Conference on Coherent and Nonlinear Optics / International Conference on Lasers, Applications, and Technologies (ICONO/LAT-2007) Fundamentals of laser chemistry and. photobiology, May 28 - June 1, Minsk, Belarus, 2007;

-Laser Applications in' Life Sciences (LALS-2007), June 11-14, Moscow, Russia, 2007;

-International Conference "Fundamentals of Laser Assisted Micro- and Nanotechnologies" (FLAMN-07), June 25-28, 2007, St. Petersburg - Pushkin, Russia.

По материалам диссертации опубликовано семь статей в рецензируемых научных журналах, включая препринт ИПФ РАН [1*], четыре статьи из перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в- которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени кандидата наук [2*-5*], и две статьи из списка зарубежных научных журналов и изданий, в которых могут быть опубликованы основные научные результаты диссертации [6*, 7*], определяемых Высшей аттестационной комиссией. Кроме того, опубликованы семь статей в-сборниках научных трудов международных [8*11*] и российских [12* -14*] конференций и одиннадцать тезисов докладов на международных и российских научных конференциях [15*].

Результаты, представленные в диссертации, вошли в отчет о научной и научно-организационной деятельности ИПФ РАН за 2004, 2005 и 2008 годы по разделу "Основные результаты в области естественных, технических, гуманитарных и общественных наук" [16* -18*]. Получено решение Роспатента о выдаче патента на изобретение «Фармацевтическая композиция для профилактики развития и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты)» [19*].

Личный вклад, автора- в работах, выполненных в соавторстве с сотрудниками лаборатории 332*отдела 330 отделения Нелинейной Динамки и Оптики Института прикладной физики РАН, заключается в участии постановки задачи, в проведении экспериментальных исследований и построении - теоретической модели, в- обработке, обсуждении, подготовке к публикации и представлению на конференциях полученных результатов^, а также в оформлении проектов и отчетов по грантам РФФИ и по Программе фундаментальных* исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».

Содержание работы. Во введении рассматривается, современное состояние проблемы и обзор литературы по тематике исследования, обоснована актуальность темы диссертации, формулируется цель исследования, дается^ общая- характеристика работы, включающая научную новизну, практическую значимость и основные положения; выносимые на защиту.

Первая глава посвящена экспериментальному исследованию индуцированной импульсным излучением УФ лазера агрегации яичного белка, хрусталика глаза свиньи и модельного белка карбоангидразы. Впервые такие исследования проведены в широком диапазоне1 изменения плотности энергии лазерных импульсов и частот их повторения. Важной задачей, решаемой- в первой главе, является исследование воздействия на белки излучения ультрафиолетового диапазона различных длин волн. В первой части главы описаны эксперименты, проделанные с яичным белком и хрусталиком глаза свиньи, и направленные на определение диапазонов УФ излучения, в которых доминируют либо процессы агрегации, либо процессы фотолиза И'фотоокисления, а также на определение температурного режима в процессе облучения. Определены соответствующие источники лазерного излучения, оптические методы регистрации и геометрия экспериментальных схем. Кроме того, выявлены характеристики этих естественных сред, в частности, большая внутренняя неоднородность образцов и отсутствие требуемой повторяемости свойств от образца к образцу, что потребовало проведения серии экспериментов для получения статистически достоверных данных. В результате был сделан вывод о целесообразности проведения экспериментов с отдельными компонентами биологических сред -растворами входящих в их состав белков.

Обнаружено, что при воздействии на белковые среды излучения Хе61 лазера (308 нм) в отличие от воздействия лазера с А, = 270 нм наблюдается зависимость наведенного рассеяния не только от дозы облучения, но и от плотности энергии в импульсе.

Во второй части главы приведены результаты, полученные при воздействии излучения ХеС1 лазера (308 нм) на карбоангидразу. Выбор этого белка в качестве модельного был обусловлен следующими обстоятельствами. Во-первых, по таким биофизическим свойствам как характерный размер н молекулярная масса он близок к у-кристаллину и некоторым формам (3-кристаллина, являющимися основными белками хрусталика глаза. Во-вторых, зависимость степени его агрегации от дозы УФ облучения близка к соответствующей зависимости для рЬ-гсристаллина.

Для исследованных белков выявлена нелинейная зависимость степени их агрегации от режимов УФ облучения - от плотности энергии лазерных импульсов и частоты их повторения.

Эксперименты с карбоангидразой позволили последовательность действий при приготовлении и очистке растворов белков, а также температурные режимы их облучения и хранения.

Во второй главе, основываясь на выработанной в предыдущей части работы методике исследования, осуществляется изучение кинетики УФ (308 нм) индуцированной агрегации основных белков хрусталика глаза а-, Р-и у-кристаллинов как по отдельности так и в смеси. Наиболее подробно была исследована УФ-индуцированная агрегация (ЗЬ-кристаллина. По экспозиционным зависимостям для (ЗЬ-кристаллина, как и для карбоангидразы, выявлена зависимость степени их агрегации не только от дозы, но и от режимов УФ облучения - от плотности энергии лазерных импульсов и частоты их повторения. Полная смесь трех кристаллинов рассматривается как некоторая модель хрусталика глаза, наиболее близкая к нему по физико-химическим свойствам, нежели раствор каждого кристаллина в отдельности.

Основываясь на экспериментальных результатах для рЬ-кристаллина и карбоангидразы, были сделаны основные предположения, использованные при построении физической теории фотоагрегации, подробно изложенной в третьей главе.

Третья глава посвящена созданию физической модели начальной стадии агрегации белков при воздействии на них мягким УФ излучением, которая описывает образование агрегатов, а также оценкам температурных эффектов в образце при импульсном лазерном воздействии. В модели рассматривается как случай непрерывного излучения, моделирующий солнечный УФ, так и более соответствующий эксперименту импульсный режим. Как следует из экспериментальных результатов первой и второй главы, такие характеристики излучения, как частота следования и плотность энергии лазерных импульсов, являются ключевыми факторами, определяющими кинетику агрегации. Установлено, что доза УФ облучения, необходимая для агрегации белков (критическая*доза), нелинейно зависит от частоты и плотности энергии лазерных импульсов (ХеС1-лазер) таким образом, что эта доза сильно падает с увеличением интенсивности, выходя на константу при их увеличении. Для объяснения этого эффекта принято, что первый этап фотоагрегации состоит в объединении двух активированных светом молекул белка. При этом фотоактивированное состояние обладает конечным временем жизни. Конкуренция процессов парного взаимодействия активированных молекул и релаксации активированного состояния при малой концентрации фотоактивированных состояний приводит к резкой зависимости дозы УФ облучения, необходимой для агрегации белков, от интенсивности излучения / = \vxF- Напротив, при большой концентрации фотоактивированных состояний конкуренции нет - все молекулы, активированные светом, агрегируют в парных процессах и зависимость критической дозы УФ-облучения от интенсивности исчезает.

Наложение теоретических кривых на экспериментальные данные позволили с помощью построенной модели не только качественно объяснить механизмы фотоагрегации, но и количественно; по порядку величины, оценить важные параметры задачи, основным из которых является время темновой дезактивации фотоактивированного состояния, от величины которого существенно зависит скорость фотоагрегации белков.

Для самосогласования нового физического механизма начальной стадии УФ индуцированной агрегации были проведены дополнительные эксперименты, в результате которых было обнаружено и исследовано явление продолжения агрегации уже без действия света (эффект постагрегации).

В, четвертой главе обосновывается создание экспериментального экспресс-метода изучения агрегации белковых молекул при воздействии излучения ХеС1 лазера на водные растворы, белков, а также возможность трактовки результатов, полученных с его помощью, на случай слабых интенсивностей, в частности, солнечного ультрафиолета. Этот метод использован для сравнения чувствительности к УФ излучению нормального и модифицированного (3-кристаллина. Исследование влияния генетических изменений в строении молекулы кристаллина на восприимчивость к ультрафиолетовому излучению осуществлялось на искусственно полученных (З-кристаллинах. Основной результат этого исследования заключается в том, что изменение в строении белковой-молекулы, в частности, купирование у нее аминокислотных остатков, приводит к увеличению чувствительности к УФ. Такие приобретенные или унаследованные генетические изменения могут являться причиной ускоренного развития катаракты.

Особое внимание в четверной главе уделяется исследованию действия веществ, замедляющих фотоагрегацию белков хрусталика глаза. При этом в качестве добавок рассматривались не только уже используемые в медицине антикатарактальные препараты и их составляющие. На основе сравнения влияния на агрегацию белков известных пептидов, использующихся в антикатарактальных препаратах, предложена новая комбинация короткоцепочечных пептидов, обладающих лучшими защитными свойствами. Фактически действие этих пептидов эквивалентно действию ос-кристаллина на агрегацию других белков. Использование нашего метода еще раз продемонстрировало тот факт, что а-кристаллин обладает свойствами шаперона, то есть вещества, защищающего белковые молекулы в организме человека от разрушения при воздействии различных денатурирующих факторов.

В конце главы приведено количественное подтверждение того, что добавление в раствор исследуемого белка некоторых короткоцепочечных пептидов оказывает влияние на время темновой дезактивации и другие параметры системы. Делается заключение о том, что такие эксперименты совместно с привлечением для трактовки их результатов построенной модели позволяют производить экспресс-отбор добавок, которые могут рассматриваться как потенциальные антикатарактальные препараты. Приведены первые результаты экспериментов на лабораторных животных.

В заключении сформулированы основные результаты диссертационной работы.

Основные результаты диссертационной работы:

1. Экспериментально обнаружено, что экспозицияУФ облучения (£> = \v-F-t), необходимая для агрегации водорастворимых белков, вызванной мягким УФ излучением ХеС1 лазера, зависит от значений плотности энергии • лазерных импульсов м' и частоты их следования Г. При фиксировании одного из этих параметров (и- или; Е)> уменьшение второго/ приводит к увеличению экспозиции необходимой для агрегации, при увеличении же этого параметра необходимая для агрегации экспозиция стремится к константе.

2': Построена5 модель,, согласно? которой' агрегация при; УФ-лазерном облучении инициируетеяюбъединением двух фогоактивированныхЛзелковых , молекул-. При этом предполагается, что фотоактивированное состояние имеет конечное время жизни. Модель позволяет качественно? и количественно описать »экспериментальные результаты:

3. . Создана* экспресс-методика* изучения УФ-лазерной агрегации белковых молекул при* воздействии , импульсного излучения ХеСГ лазера на водные растворы; белков. € помощью этой методики установлена- повышенная чувствительность к воздействию < УФ* излучения модифицированного р-кристаллина по/ сравнению с нормальным, а также- исследовано влияние различных веществ на скорость УФ-индуцированной агрегации белков хрусталика глаза.

4. На основе: исследования действия короткоценочечных пептидов' установлена селективность их: воздействия на агрегацию различных кристаллинов хрусталика глаза. Создана комбинация пептидов, которая в большей степени замедляет агрегацию кристаллинов, чем вещества, на основе которых созданы известные антикатарактальные препараты.

СПИСОК РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ

1*. Битюрин Н.М., Соустов Л.В., Челноков Е.В., Немов В.В., Яхно Т.А., Сергеев Ю.В., Островский М.А., Исследование фотоагрегации белков при воздействии излучения ХеС1 лазера II Препринт ИПФ РАН, № 599, Нижний Новгород, 19 е., 2002.

2*. Соустов JT.B., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Немов В.В., Сергеев Ю.В., академик Островский М.А., Фотоагрегация водорастворимого белка (карбоангидразы) под действием ультрафиолетового излучения ХеС1-лазера // Доклады Академии Наук, 388(5), с. 683-688; 2003.

3*. Соустов JI.B., Челноков Е.В., Сапогова Н.В., Битюрин Н.М., Немов В.В., Карпова О.Е., Шеремет H.JL, Полунин Г.С., Аветисов С.Э., Островский М.А., Исследование влияния шапероноподобной (защитной) активности короткоцепочечных пептидов на скорость УФ-индуцированной эксимерным лазером агрегации бета-кристаллина // Вестник офтальмологии, 124(2), сс. 6-8, 2008.

4*. Аветисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет Н.Л., Макаров И.А., Федоров А.А., Карпова О.Е., Муранов К.О., Тимофеева А.К., Соустов JI.B., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Сапогова Н.В., Немов В. В., Болдырев А.А., Островский М.А., Изучение воздействия смеси ди- и тетра-пептидов на «пролонгированной» моделиулмрафиолет-индуцироанной^ катаракты .у -крыс -Л —Вестник офтальмологии, 124(2), сс. 12-16, 2008.

5*. JI.B. Соустов, Е.В.Челноков, Н. В. Сапогова, Н. М. Битюрин, В. В. Немов, Ю. В. Сергеев, М. А. Островский. "Исследование биофизических механизмов агрегации кристаллинов, индуцированной импульсным лазерным УФ излучением 308 нм." // Биофизика, т. 53(4), сс. 582-597, 2008.

6*. Sergeev Yu.V., Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Backlund P.S., Wingfield Jr.P.T., Ostrovsky M.A., and Hejtmancik J.F., Increased Sensitivity of Amino-Arm Tiuncated РАЗ-Crystal!in to UV-Light-Induced Photoaggregation // Investigative Ophthalmology and Visual Science, 46(9), pp. 3263-3273, 2005.

7*. Evgeny Chelnokov, Lev Soustov, Natalia Sapogova, Mikhail Ostrovsky, and Nikita Bityurin, Nomeciprocal XeCl laser-induced aggregation of beta-crystallins in water solution // Optics Express, 16(23), pp. 18798 18803, 2008.

8*. Bityurin N.M., Muraviov S.V., Kamensky V.A., Malyshev A.Y., Chelnokov E.V., Soustov L.V., Gelikonov G.V., Kinetics of low scattering biotissue photodenaturation induced by the UV harmonics of a Nd:YAP laser and by a YAG:Nd laser at a wavelength 1440 nm // Proc. SPIE, 4161, pp. 1-11, 2000.

9*. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Nemov V.V., Yahno T.A., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Investigation of photo-aggregation of proteins irradiated by XeCl laser light I/ Proc. SPIE, 5149, pp. 85-95, 2003.

10*. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Kiselev A.L., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Photoagreggation of crystallins (main proteins of eye lens) under the action of XeCl laser radiation // Proc. SPIE, 5506, p. 28-33, 2004.

11*. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Kiselev A.L., Bityurin N.M., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Study of molecular mechanisms of UV-induced aggregation of crystallins and possibility of maintaining eye lens transparency 11 Proc. SPIE, 6251, p. 280-287, 2006.

12*.Соустов JI. В., Челноков Е. В., Битюрин Н. М., Киселев A. Л., Немов В. В., Сергеев Ю. В., Островский М. А., Исследование агрегации кристаплинов хрусталика глаза при воздействии неионизирующего УФ излучения и шапероно-подобных свойств короткоцепочечных пептидов // Труды XI нижегородской сессии молодых ученых, стр. 210-210, 2006.

13*.Соустов JI.B., Челноков Е.В., Киселев А. Л., Немов В.В., Сергеев Ю. В., Островский М.А., Битюрин Н.М., Исследование молекулярных механизмов УФ-индуцированной агрегации кристаллинов хрусталика глаза и возможностей поддержания его прозрачности // Альманах клинической медицины, XII, труды II троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине», стр. 34, 2006.

14*.Челноков Е.В., Соустов Л.В., Сапогова Н.В., Сергеев Ю. В., Островский М.А., Битюрин Н.М., Модель УФ-индуцированной агрегации бета-кристаллина при различных уровнях облучения II Альманах клинической медицины, XVII(l), стр. 109-112, 2008.

15*. a. Kamensky V., Muraviov S., Malyshev A., Chelnokov E., Bityurin N., Photomodification of low-scattering biotissues by a YAG:Nd laser at a wavelength of 1440 nm and by the fifth harmonic of a Nd:YAP laser (216 nm) below ablation threshold II Abstracts of X International Conference NLMI-10, St.-Petersburg, 21-23 august, p. 29, 2000.

BityurinN., Muraviov S., Malyshev-A.* Chelnokov E.-, Kamensky-V., Kinetics of low scattering biotissue photodenaturation induced by the fifth harmonic of a Nd:YAP laser (216 nm) and by a YAG:Nd laser at a wavelength 1440 nm // Technical Programme of European Biomedical Optics Week, EBIOS, Amsterdam, 48 July, p. 74, 2000.

15*. в. Soustov L.Y., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Ostrovsky M.A., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Investigation of photoaggregation of proteins irradiatied by XeCl laser light // Technical program of International Quantum Electronics Conference 2002 / Conference on Lasers, Applications, and Technologies, Moscow, 22 27 June, p. 155,2002.

15*. r. Chelnokov E.V., Soustov L.V., Bityurin N.M., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Photoagreggation of Crystallins (Main Proteins of Eye Lens) Under the Action of XeCl Laser Radiation // Abstracts of XI International Conference Laser Matter Interaction (LMI-XI), St.-Petersburg-Pushkin, june 30 - july 2, p. 21, 2003.

15*. д. Sergeev Y.V., Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Wingfield P.T., Ostrovsky M.A., Hejtmancik J.F., Increased Sensitivity of Amino-arm Truncated ЬАЗ Ciystallin to UV-light Induced Photo-aggregation II Abstracts of Association for Research in Vision and Ophthalmology, Fort Lauderdale, Florida, USA, 4 May, 2003.

15*. e. Sergeev Yu.V., Backlund P.S., Soustov L.V., Chelnokov E.V., Ostrovsky M.A., Hejtmancik J.F., Increased UV-Light Sensitivity of Amino-Arm Truncated (3A3-Crystallin: Specific Structural Modifications // Abstracts of Association for Research in Vision and Ophthalmology, Fort Lauderdale, Florida, USA, 1-5 May, 2005.

15*. ж. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Kiselev A.L., Bityurin N.M., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Study of molecular mechanisms of UV-induced aggregation of crystallins and possibility of maintaining eye lens transparency // Conference program o/ICONO/LAT-2005, p. 108, 2005.

15*. 3. Соустов JT.B., Челноков E.B., Битюрин H.M. и др., Тезисы отчетных конференций по Программе Президиума РАН "Фундаментальные науки — медицине", Москва, 25-26 ноября, с. 51, 2002; 10-11 декабря, с. 36^ 2003; 2-3 декабря, стр. 192, 2004; 14-16 декабря, с. 114, 2005, 27-29 ноября, стр. 47, 2006; 3-4 декабря, стр. 54, 2007, Москва.

15*. и. Soustov L.V., Chelnokov E.V., Bityurin N.M., Nemov V.V., Sergeev Yu.V., Ostrovsky M.A., Study of molecular mechanisms of UV aggregation of eye proteins // Abstracts of Saratov Fall Meeting, p. 7, 2005.

Н"". к. Ghelnokov E.V., Soustov L.V., Sapogova N.V., Bityurin*N.M;, Ostrovsky M.A., Postaggregation in XeCl laser irradiated water, solutions of j3L-crystallin at low exposures // Technical Digest of International Conference on Coherent and Nonlinear Optics / International Conference on Lasers, Applications, and Technologies,(ICONO/LAT-2007), May 28 - June 1, Minsk, Belarus, 2007.

15*. л. Chelnokov E.V., Soustov L.V., Sapogova N.V., Bityurin N.M., Ostrovsky M.A., Postaggregation in XeCl laser irradiated water solutions of pL-crystallin // Technical Digest of Laser Applications in Life Sciences (LALS-2007), June 11-14, Moscow, Russia, 2007.

16*. Соустов Л.В., Челноков E.B., Битюрин H.M'., Киселев А.Л., Немов B.B.,

--Сергеев Ю.В., Островский-М-. A-j - Исследование ~ механизмов ~поддержания^ прозрачности' хрусталика глаза при воздействии* УФ излучения // Отчет о научной и научно-организационной деятельности ИПФ РАН за 2004 год, с. 36,

2005.

17*. Соустов Л.В:. Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Островский М.А., Sergeev Yu.V., Backlund. P.S., Wingfield P.T., Hejtmancik J.F., Лабораторное моделирование развития катаракты под действием УФ излучения // Отчет о научной и научно-организационной деятельности ИПФ РАН за 2005 год, с. 50,

2006.

18*. Соустов Л.В., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Немов. В.В., Аветисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет Н.Л., Карпова О.Е., Муранов К.О., Островский М.А., Замедление развития катаракты // Отчет о научной и научно-организационной деятельности ИПФ РАН за 2008 год, с. 50, 2009.

19*. Соустов1 Л.В., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Немов- В.В., Аветисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет Н.Л., Карпова О.Е., Муранов К.О., Островский М.А., Фармацевтическая* композиция для профилактики развития» и лечения начальной стадии возрастной катаракты*(варианты), Заявка на патент, Россия, №2007144339 от 3.12.2007. Дата принятия положительного решения РосПатента - 17 сентября 2008 года.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Анисимов С.И., Имас Я.А., Романов Г.С., Ходыко Ю.В., Действие излучения большой мощности на металлы Н М. Наука, 1970.

2. Веденов А.А., Гладуш Г.Г., Физические процессы при лазерной обработке материалов // М. Энергоатомиздат, 207 е., 1985.

3. Bauerle D., Laser Processing and Chemistry // Springer, 3rd ed., Berlin, 2000.

4. Bityurin N., Luk'yanchuk B'.S., Hong M.H., and Chong T.C., Models for Laser Ablation of Polymers // Chemical Reviews, 103(2), pp. 519-552, 2003.

5. Bityurin N., Studies on laser ablation of polymers // Annn. Rep. Prog. Chem. Sect. C, 101; pp.216 247, 2005.

6. Jacques S.L., Laser-tissue interaction: Photochemical, photothermal and photomechanical // Surgical Clinics of North America, 72(3), pp. 531-558, 1992.

7. Avrillier S. andiSchermann J.P., Applications of Lasers to Early Detection of Cansers and Mass Spectrometric Determination of Structures of Clusters of Biological Interest // Conference on Lasers Applications, Plovdiv (Bulgaria), September 1999.

8. Berlien H.-P. and Miiller G.J., Applied Laser Medicine // Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 2003.

9. Niemz M.H., Laser-Tissue Interactions. Fundamentals and Applications // Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering, Springer-Verlag, 2003.

10. Л0. Asshauer—T., Delacretaz G., Rastegai-Sr, Phototermal denaturation of egg white~by~pulsed~ holmium laser // Proc. SPIE, 2681, pp. 120-124, 1996.

11. Каменский В.А., Исследование режимов лазерной модификации мягких биотканей при помощи ИК лазерных устройств // Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук. Саратовский Государственный Университет, 2001.

12. Bityurin N.M., Kamensky V.A., Muraviov S.V., Feldchtein F.I., Malyshev A.Yu., Sergeev A.M., Snopova L.B., Yurkin A.M., Combined effect of IR and UV laser radiation on biological tissues: cleaning// Technical Digest Series, CLEO'98, p. 230, 1998.

13. Welsh A.J., The Thermal Response of Laser Irradiated Tissue // IEEE Journal of Quantum Electronics, 20, pp. 1471-1481, 1984.

14. Firsov N.N., Priezzhev A.V., Ryaboshapka O.M., Aggregation and disaggregation kinetics oferythrocytes in whole blood under low-energy laser irradiation // Proc. SPIE, 2086, pp. 365370, 1994.

15. London R.A., Glinsky M.E., Zimmerman G.B., Bailey D.S., Eder D.C., and Jacques S.L.,1.ser-tissue interaction modeling with LATIS H Appl. Optics, 36, pp. 9068-9074, 1997.

16. Жоли M., Физическая химия денатурации // Мир, Москва, с. 153-170, 1968.

17. DeYoung L.R., Fink A.L., and Dill K.A., Aggregation of globular proteins И Accounts Chem. Res., 26, pp. 614-620, 1993.

18. Jaenicke R., Intermolecular forces in the process of heat aggregation of globular proteins and the problem of correlation between aggregation and denaturation phenomena // J. Polym. Sex. C, 16, pp. 2143-2160, 1967.

19. Mitraki A., King J., Protein folding intermediates and inclusion body formation // Bio Technology, 7, pp. 690-697, 1989.

20. Fields G.B., Alonso D.O.V., Stigter D., and Dill K.A., Theory for the aggregation of proteins and copolymers II J. Phys Chem., 96, pp. 3974-3981, 1992.

21. Manna L., Milliron D.J., Meisel A., Scher Е.С. and Alivisatos A.P., Controlled growth of tetrapod-branched inorganic nanocrystals // Natuie materials, 2, pp. 382-385, 2003.

22. Witten T.A., Sander L.M., Diffusion-Limited Aggregation, a Kinetic Critical Phenomenon // Phys Rev Lett., 47(19), p. 1400, 1981.

23. Micali N., Monsu'Scolaro L. and Romeo A., Mallamace F., Light absorption» study of aggregating porphyiin in aqueous solutions II Phys. Rev. E, 57, pp. 5766 5770, 1998

24. Chandra A., Shukla M.K., Mishra P.C., and Chandra S., Fractal growth in uv-irradiated DNA: Evidence of nonuniversal diffusion limited aggregation // Phys. Rev. E, 51, pp. R2767 R2768, 1995.

25. Feder J. and Jossang T., Rosenqvist E., Scaling Behavior and Cluster Fractal Dimension Determined by Light Scattering from-Aggregating Proteins // Phys Rev Lett., 53, pp. 1403 1406, 1984.

26. Zhang J.Z., Nucleation-aggregation of molybdena crystals at the vapoui-solid interface // J. --Phys.-Condens Matter., 3, pp 8005-8009,199Г~~ ~ — - --

27. Family F., Meakin P., Deutch J.M., Kinetics of Coagulation with Fragmentation: Scaling Behavior and Fluctuations II Phys. Rev. Lett., 57(6), p. 727, 1986.

28. Sorensen С M., Zhang H.X. and Taylor T.W., Cluster-Size Evolution in a Coagulation-Fragmentation System II Phys. Rev. Lett., 59(3), p. 363, 1987.

29. Vigil R.D. and Ziff R.M., Comment on "Cluster-Size Evolution in a Coagulation-Fragmentation System" II Phys. Rev. Lett., 61(12), p. 1431, 1988.

30. Bastea S., Aggregation Kinetics in a Model Colloidal Suspension // Phys. Rev. Lett., 96, p. 028305, 2006.

31. Zhenquan'L , Jianhong K., Kinetics of a migration-driven aggregation process with birth and death H Phys. Rev. E, 67(3), p. 031103, 2003.

32. Redner S., Aggregation kinetics of popularity И Physica A, 306, pp. 402-411, 2002

33. Kuzovkov V., Kotomin E., Dynamic particle aggregation in the bimolecular A+B 0 reaction // The Journal of Chemical Physics, 98(11), pp 9107-9114, 1993.

34. Mey W., Walker E.I.P., Hoesterey D.C., Bimolecular recombination in aggregate organic photoconductors // Journal of Applied Physics, 50(12), pp. 8090-8094, 1979.

35. Stradner A., Sedgwick H., Cardinaux F., Poon W.C.K., Egelhaaf S.U. & Schurtenberger P., Equilibrium cluster formation in concentrated protein solutions and colloids // Nature, 432, p. 492, 2004.

36. Краткая энциклопедия домашнего хозяйства. T. 2. Il M.: Большая Советская Энциклопедия, 1959.

37. Большая Советская Энциклопедия, Изд. 1-е. // М.: Советская Энциклопедия, 1926 1947.

38. Химическая энциклопедия // М.: Советская Энциклопедия, 1988 1998. ГОСТ 27583-88.http://en.vvikipedia.org/wiki/Eggwhite

39. Битюрин Н.М., О* непрерывном приближении для уравнений;- описывающих, полимеризацию И Высокомолек. соед. сер. Б, 23(11), с. 859-862, 1981.

40. Битюрин Н.М., Генкин В.Н., Зубов В.П., Лачинов М.Б., Высокомолек. соед. сер. А, 23(8), с. 1702, 1981.

41. Pikulin A'., Bityurin N., Spatial resolution in polymerization of sample features at nanoscale HPhys. Rev. В75, pp. 195430-195441, 2007

42. Bityurin N., Znaidi L., Kanaev A., Laser-induced absorption in Titanium Oxide Based Gels // Chem. Phys. Lett, 374,' pp. 95-99, 2003.

43. Оудиан Дж., Основы химии полимеров // М. Мир, 1974.

44. Уоллинг.Ч., Свободные радикалы в растворе // М. Мир, I960.

45. Коршак В.В., Виноградова С.В., Неравновесная поликонденсация // М. Наука, 1972.

46. Daniel М.-С., Austruc D., Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology // Chem. Rev., 104(1), pp. 293-346, 2004.

47. Смирнова Jl.A., Александров А.П., Якимович H.O., Сапогова Н.В., Кирсанов А.В., Соустов Л.В., Битюрин Н.М., УФ индуцированное формирование наночастиц золота в полимерной матрице полиметилметакрилата // Доклады академии наук, 400(6), с. 779781,2005.

48. Alexandrov A., Smirnova L., Yakimovich N., Sapogova N., Soustov L., Kirsanov A., Bityurin N., U V-initiated'Growth of Gold Nanoparticles in PMMA Matrix // Appl. Surf. Sci., 248, pp. 181-184,2005. '

49. Einlc~S.," BurdaTC^TNikoobakht В., and El-Sayed M.A., Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses // Journal of Physical Chemistry B, 104(26), pp. 6152 6163, 2000.

50. Mafune F., Kohno J., Takeda Y., and Kondow Т., Full Physical Preparation of Size-Selected Gold Nanoparticles in Solution: Laser Ablation and Laser-Induced Size Control II Journal of Physical Chemistry B, 106(31), pp. 7575 7577, 2002.

51. Itoh H., Tahara A., Naka K., and Chujo Y., Photochemical Assembly of Gold Nanoparticles Utilizing the Photodimerization of Thymine // Langmuir, 20(5), pp. 1972 1976, 2004.

52. Maye M.M., Lim I.S., Luo J., Rab Z., Rabinovich D., Liu Т., and Zhong C.-J., MediatorTemplate Assembly of Nanoparticles // Journal of the American Chemical Society, 127(5), pp. 1519 1529,2005.

53. Privalov P.L., Thermodynamic Problems of Protein Structure I I Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry, 18; pp. 47-69, 1989.

54. Privalov P.L., Khechinashvili N.N., A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: A calorimetric study II J. Mol. Biol., 86, pp. 665 684, 1974.

55. Shakhnovich E.I., Gutin A.M., Formation of unique structure in polypeptide chains. Theoretical investigation with the aid of a replica approach II Biophys. Chem., 34, pp. 187 199, 1989.

56. Shakhnovich E.I., Gutin A.M., Implications of thermodynamics of protein folding for evolution of primaiy sequences II Nature, 346, pp. 773 775, 1989.

57. Judge R.A., Jacobs R.S., Frazier Т., Snell E.H., and Pusey M.L., The Effect of Temperature and Solution pH on the Nucleation of Tetragonal Lysozyme Crystals // Biophysical Journal, 77, pp. 1585 1593,1999.

58. Pande A., Pande J., Asherie N., Lomakin A., Ogun O., King J., and Benedek G.B., Crystal cataracts: Human genetic cataract caused by protein crystallization // Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(11), pp. 6116 6120, 2001.

59. McRee D.E., Practical Protein Crystallography // Second Edition, Academic Press, 1994.

60. Blundell T.L., Johnson L., Protein Crystallography (Molecular Biology Series) // Academic Press, 1976.

61. Nilsson R., Brunner J., Hoffman N.E. and Wijk K.J., Interactions of ribosome nascent chain complexes of the chloroplast-encoded D1 thylakoid membrane protein with cpSRP54 // The EMBO Journal, 18(3), pp. 733 742, 1999.

62. Chiti F., Taddei N., Baroni F., Capanni C., Stefani M., Ramponi G. and Dobson C.M., Kinetic partitioning of protein folding and aggregation // Nature structural biology, 9(2), pp. 137-143, 2002.

63. Taylor J.P., Hardy J., Fischbeck K.H., Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease // Science, 296(5575), pp. 1991-1995, 2002.

64. Taubes G., Protein Chemistry: Misfolding the Way to Disease // Science, 271, pp. 14931495, 1996.

65. World Health Organization Fact Sheet No. 282; WHO November 2004; available at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs282/en/index.html

66. Clark A.F. and Yorio T., Ophthalmic drug discovery //Nature reviews, 2, pp. 448-459, 2003.

67. Ayala M.N., Michael R., and Soderberg P.G., Influence of Exposure Time for UV Radiation-Induced Cataract // Investigative Ophthalmology & Visual Science, 41(11), pp.3539-3543,-2000. ----— ----- —-

68. Lofgren S., Michael R., and.Soderberg P.G., Impact of Age and Sex in Ultraviolet Radiation Cataract in the Rat // Investigative Ophthalmology & Visual Science, 44(4), pp. 1629-1633, 2003.

69. Merriam J.C., Lofgren S., Michael R., Sodeiberg P.", Dillon^ J., Zheng L., and Ayàla M., An Action Spectrum for UV-B Radiation and» the Rat Lens // Investigative Ophthalmology & Visual Science, 41(9), pp. 2642-2647, 2000.

70. Корхмазян M.M., Федорович И.Б., Островский М.А., Механизмы фотоповреждения структур глаза. Действие УФ-света на растворимые белки хрусталика. // Биофизика, 38(6), с. 966-971, 1983.

71. Ельчанинов В.В., Федорович И.Б., Механизмы фотоповреждения структур глаза. Образование агрегатов полипептидов при УФ-облучении белков хрусталика // Биофизика, 34, с. 758-762, 1989.

72. Ельчанинов В.В., Федорович И.Б., Механизм фотоповреждения структур глаза. Изменение зарядов кристаллинов хрусталика при ультрафиолетовом облучении // Биофизика, 35, с. 200-204, 1990.

73. Островский М.А., Федорович И.Б., Ельчанинов В.В, Кривандин А,В., Опасность повреждающего действия света на структуры глаза. Хрусталик как естественный светофильтр и объект фото повреждения // Сенсорные системы, 8(3-4), с. 135-146, 1994.

74. Haslbeck M., Braun N., Stromer T., Richter В., Model N., Weinkauf S. and Buchner J., Hsp42 is the general small heat shock protein in the cytosol of Saccharomyces cerevisiae // The EMBO Journal, 23, pp. 638 649, 2004.

75. Demmig-Adams B., Adams W.W.III, Antioxidants in Photosynthesis and Human Nutrition // Science, 298(5601), pp. 2149-2153, 2002.

76. Mayhew M., da Silva A.C., Martin J., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Hartl F.U., Protein folding in the central cavity of the GroEL-GroES chaperonin complex // Nature, 379(6564), pp. 420-426, 1996.

77. Frydman J. and Hartl F.U., Principles of Chaperone-Assisted Protein Folding: Differences Between in Vitro and in Vivo Mechanisms I I Science, 272(5267), pp. 1497 1502, 1996.

78. Jakob U., and Buchner J., Assisting Spontaneity: The Role of Hsp90 and Small Hsps as Molecular Chaperones // Trends Biochem. Sci., 19, pp. 205-211, 1994.

79. Sax C.M., and Piatigorsky J., Expression of the alpha-crystallin/small heat-shock protein/molecular chaperone genes in the lens and other tissues // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol Biol., 69, pp. 155-201, 1994.

80. Buchner J„ Supervising the fold: functional principles of molecular chaperones // The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal, 10, pp. 10-19, 1996.

81. Ehrnsperger, M., Gaestel, M., Buchner, J. Chaperon function of small heat shock proteins and a-crystallin. In: Molecular chaperones in the life cycle of proteins. Editor: A.L. Fink & Y. Goto. New York: Marcel Dekker, pp. 533-576, 1997.

82. Forreiter C. and Nover L., Heat stress-induced proteins and the concept of molecular chaperones // J. Biosci., 23, pp. 287-302, 1998.

83. Hartl F.U., Molecular chaperones in cellular protein folding // Nature, 381(6583), pp. 571579, 1996.

84. Skovvyra D., Georgopoulos C., and Zylicz M., The E. coli dnaK gene product, the hsp70 homolog, can reactivate heat-inactivated RNA polymerase in an ATP hydrolysis-dependent manner// Cell, 62(5), pp. 939-944, 1990.

85. Hwang D.S., Crook E., and Kornberg A., Aggregated dnaA protein is dissociated and activated for DNA replication by phospholipase or dnaK protein // J. Biol. Chem., 265(31), pp. 19244-19248, 1990.

86. Johnson J.L., and Craig E.A., Protein folding in vivo: Unraveling complex pathways // Cell, 90, pp. 201-204, 1997.

87. Freeman B.C., and Morimoto R.I., The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding IIEMBO Journal., 15(12), pp. 2969-2979, 1996.

88. Freeman B.C., Toft D.O., and Morimoto R.I., Molecular chaperone machines: chaperone activities of the cyclophilin Cyp-40 and the steroid aporeceptor-associated protein p23 // Science, 274(5293), pp. 1718-1720, 1996.

89. MacRae T.H., Structure and function of small heat shock/alpha-crystallin proteins: established concepts and emerging ideas. // Cell. Mol. Life Sci., 57, pp. 899-913, 2000.

90. De Young L.R., Dill K.A. and Fink A.L., Aggregation and Denaturation of Apomyoglobin in Aqueous Urea Solutions // Biochemistry, 32, pp. 3877-3886, 1993.

91. Hook D.W.A., and Harding J.J., Molecular chaperones protect catalase against thermal stress I/Eur. J. Biochemistry, 247, pp. 380-385, 1997.

92. Kurganov B.I., Dobrov E.N., Rafikova E.R., Fedurkina N.V., Mitskevich L.G., Belousova L.V., and Zhou H.-M. Abstracts of 1st Tsinghua International Conference of Protein Sciences (may 21-23, 2001, Beijing, China), p. 36, 2001.

93. Kiefhaber T., RudolphR., Kohler H.-H., and Buchner J., Protein aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation // BioTechnology, 9, pp. 825-859, 1991.

94. Курганов Б.И., Кинетика агрегации белков. Количественная оценка шаперонной активности в тестах, основанных на подавлении агрегации белков // Биохимия, 67(4), с. 492-507, 2002.

95. Кривандин А.В., Муранов К.О., Островский М.А., Исследованиекомплексообразования-врастворах а- и pL-кристаллинов при 60°С7/ Молекулярнаябиология, 38(3), с. 1-15, 2004.

96. Clark J.l. and Huang Q.-L., Modulation of the chaperone-like activity of bovine a-crystallin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Cell Biology, 93, pp. 15185 15189, 1996.

97. Borkman R.F., Knight G. and Obi В., The Molecular Chaperone a-Crystallin inhibits UV -Induced Protein Aggregation // Exp. Eye Res., 62, p. 141-148, 1996.

98. Horwitz J., a- crystallin can function as a molecular chaperone // Proc. Natl. Acad Sci. USA., 89, pp. 10449-10453, 1992.

99. Wang K., Spector A., The chaperone activity of bovine a- ciystalline // J. Biol Chem , 269, pp. 13601-13608, 1994.

100. Wang K., Spector A., a- crystallin can act as a chaperone under conditions of oxidative stress И Invest. Ophtalm. Vis. Sci., 36, pp. 311-321, 1995.

101. Rao P.V., Huang Q., Horwitz J., Zigler J.S., Evidence that a-crystallin prevents nonspecific protein aggregation in intact eye lens // Biochem. Biophys. Acta., 1245, pp. 439447, 1995.

102. Srinivas V., Raman В., Rao K.S., Ramakrishna Т., and Rao Ch.M., Structural perturbation and enhancement of the chaperone-like activity of a-crystallin by arginine hydrochloride // Protein Science, 12, pp. 1262 1270, 2003.

103. Garrido C., Size matters: of the small HSP27 and its large oligomers // Cell Death and Differentiation, 9, pp. 483-485, 2002.

104. Cherian M. and Abraham E.C., Decreased molecular chaperone property of alpha-crystallins due to posttranslational modifications // Biochem. Biophys. Res. Comm., 208, pp. 675-679, 1995.

105. Hott J.L. and Borkman R.F., Concentration dependence of transmission losses in UV-laser irradiated bovine alpha-, beta H-, beta L- and gamma-crystallin solutions // Photochem. Photobiol., 57, pp. 312-317, 1993.

106. Li D.Y., Borkman R.F., Wang R.H., and Dillon J., Mechanisms of photochemically produced turbidity in lens protein solutions // Exp. Eye Res., 51, pp. 663-669, 1990.

107. Andley U.P., Sawardekar M.A., and Burris J.L., Action spectrum for photocross-Iinking of human- lens proteins // Photochem. Photobiol., 65, pp. 556-559,1 1997.

108. Тучин B.B., Исследование биотканей методами светорассеяния // УФН, 167(5), с. 517539, 1997.

109. Zhou Sh., Burger Ch., Chu В., Sawamura M., Nagahama N., Toganoh M., Hackler U.E., Isobe H., Nakamura E., Spherical Bilayer Vesicles of Fullerene-Based Surfactants in Water: A Laser Light Scattering Study II Science, 291(5510), pp. 1944-1947, 2001.

110. Weitz D.A., Lin M.Y., Laser light scattering as a probe of fractal colloid aggregates II NASA1.ser Light~Scattering~Advanced~TecHndlog}TDevelopment Workshop, Annandale, NJ.,pp.173-183, 1988.

111. Бубис E.JT., Варьгин B.B., Кончалина JT.P., Шилов А.А., Исследование слабопоглощающих сред для ВРМБ в ближнем ИК диапазоне спектра // Оптика и спектроскопия, 65(6), с. 1281-1285, 1988.

112. Sankaran V., Walsh* J.T., An Optical, Real time Measurement of Collagen Denaturation // Proc. SPIE, 2975, pp. 34-42, 1997.

113. Payne B.P., Nishioka N.S., Mikic B.B., Venugopalan V., Comparison of pulsed CO2 laser ablation at 10.6 цт and 9.5 цт // Lasers in surgery and medicine, 23(1), pp. 1-6, 1998.

114. Калоус В., Павличек 3., Биофизическая химия // пер. с чешек., М.: Мир, 1985.

115. Weinryb Т., and Steiner R.F., The luminescence of the aromatic amino acids // In Excited States of Proteins and Nucleic Acids. Plenum Press, New York, pp. 277 318, 1971.

116. Под. ред. Берлиена Х.-П., Мюллера Г.Й. Прикладная лазерная медицина // Учебное пособие, пер. с нем. — М., АО "Интерэксперт", 1997.

117. Ostrovsky М.А., Sergeev Y.V., Atkinson D.L., Soustov L.V., Hejtmancik J.F., Comparison of UV-induced photo-kinetics for lens-derived and recombinant beta-crystalline // Molecular Vision, 8, pp. 72-78, 2002.

118. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде E.B., Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография // М. Химия, 284 е., 1986.

119. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., Морфология биологических жидкостей человека // М. "Хризостом", 303 е., 2001.

120. Рапис Е.Г., Образование упорядоченной структуры при высыхании пленки белка // Письма вЖТФ, 14(17), с. 1560-1565, 1988.

121. Яхно Т.А., Яхно В.Г., Санин А.Г., Шмелев И.И., Исследование'динамики фазовых переходов жидкостей разного типа методом регистрации акусто-механического импеданса высыхающей капли // Биофизика, 47(6), pp. 1101-1105, 2002.

122. Wong К.Р., Tanford С. Denaturation of bovine carbonic anhydrase В by guanidine hydrochloride. A process involving separable sequential conformational transitions // J. Biol. Chem., 248(24), pp. 8518-8523, 1973.

123. Taylor H.R., The environment and the lens // Br. J. Ophthalmol., 64(5), pp. 303-310, 1980.

124. Zigman S., Cotlier E., The role of sunlight in human cataract formation^/ Surv Ophthalmol., 27(5), pp. 317-326, 1983.

125. Taylor H.R., West S.K., Rosenthal F.S., Muñoz В., Newland H.S., Abbey H., Emmett E.A. Effect of ultraviolet radiation on cataract formation UN. Engl. J. Med., 319(22), pp. 14291433, 1988.

126. Itoh K., Ozaki Y., Mizuno A., Iriyama K. Structural changes in the lens proteins of hereditary cataracts monitored by Raman spectroscopy // Biochemistry, 22 (8), pp. 1773 1778, 1983.

127. Russella P., Ugaa S., Zigler J.S., Kaiser-Kupfera M. and Kuwabaraa T. Studies using human lenses from a family displaying hereditary congenital cataracts // Vision Research, 21(1), pp. 169-172, 1981.

128. Krivandin A.V., Lvov Yu.M., Ostrovsky M.A., Fedorovich I.B., Feigin L.A., Structural conversions of crystalline under senile cataract, dehydration and UV-irradiation studied by X-ray diffraction // Exp.Eye Res., 49, pp. 853-859, 1989.

129. T 39. Kozakov" M.YuT, Muraviev^S.V., Soustov L.V7, Измеритель энергии импульсов электромагнитного излучения // Патент на изобретение №2031378, 26 марта 1991, Россия.

130. Bityurin N. and Malyshev A., Codes on laser ablation of polymers (nanosecond pulses) // it'U'U' iapras.ru/english/structure/lab332e.html. '

131. Bityurin N. and Malyshev A., Bulk photothermal model for laser ablation of polymers by nanosecond and subpicosecond pulses IIJ Appl. Phys., 92(1), pp. 605-613, 2002.

132. Samarskii A.A., Vabishchevich P.N., Computational heat transfer // Jhon Willey & Sons, New York, 1995.

133. Шайтан K.B., Конформационная подвижность белка с точки зрения физики // СОЖ, 5, с. 8-13, 1999.

134. Kubelka J., Hofrichter J. and Eaton W.A., The protein folding "speed limit" // Curr. Opin. Struct. Biol., 14, pp. 76-88, 2004.

135. Levinthal C., Are there pathways for protein folding? IIJ Chun. Phys., 65, pp. 44-45, 1968.

136. Lin M.Y., Lindsay H.M., Weitz D.A., Ball R.C., Klein R., Meakin P., Universal reaction-limited colloid aggregation //Phys. Rev A, 41(4), pp. 2005 2020, 1990.

137. Zigman S., Environmental near-UV radiation and cataracts // Opto in Vis. Sci., 72, pp. 899 901, 1995.

138. Reddy V.N., Glutathione and its function in the lens: an oveiview // Exp. Eye Res., 50, pp. 771 778, 1990.

139. Spector A., The search for a solution to senile cataracts. Proctor Lecture // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 25, pp. 130 146, 1984.

140. Болдырев A.A., Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине //М.: Изд-во МГУ, 320 стр., 1998.

141. Clark J.I., Benedek G.B., Siezen R.J., Thomson J.A., Friedman S.H., Chemical prevention or reversal of cataract by phase separation inhibitors // United States Patent, № 5.091.421, feb. 25, 1992.

142. Болдырев A.A., Рагимов А.А., Формазюк B.E., Глазные капли для лечения катаракты

143. Hejtmancik J.F., Wingfield P., Chambers C, Russell P., Chen H.-C., Sergeev Y.V., Hope J.N., Association properties of beta-B2- and betaA3-crystallin: ability to form dimmers II Protein Eng., 10, pp. 1347 1352, 1997.

144. Sergeev Y.V., Wingfield P.T., Hejtmancik J.F., Monomer-dimer equilibrium of normal and modified beta A3-crystallins: experimental determination and molecular modeling II Biochemistry, 39, pp. 15799 15806, 2000.

145. Sergeev Y.V., Hejtmancik J.F., Wingfield P.T., Energetics of domaiiidomain interactions and entropy driven association of beta-crystal lin s II Biochemistry 43, pp. 415 424, 2004.

146. Bax В., Lapatto R., Nalini V., Driessen H., Lindley P.F., Mahadevan D., Blundell T.L., Slingsby C., X-ray analysis of beta B2-crystallin and evolution of oligomeric lens proteins II Nature, 347, pp. 776 780, 1990.

147. Bateman J.B., Geyer D.D., Flodman P., Johannes M., SikelaJ., Walter N., Moreira A.T., Clancy K., Spence M.A., A new betaAl-crystallin splice junction mutation in autosomal dominant cataract//Invest. Ophthalmol Vis. Sci., 41, pp. 3278 3285, 2000.

148. Litt M., Kramer P., LaMorticella D.M., Murphey W., Lovrien E.W., Weleber R.G., Autosomal dominant congenital cataract associated with a missense mutation in the human alpha crystallin gene CRYAA // Hum. Mol. Genet., 7, pp. 471 474, 1998.

149. Mackay D.S., Boskovska O.B., Knopf H.L., Lampi K.J., Shiels A., A nonsense mutation in CRYBB1 associated with autosomal dominant cataract linked to human chromosome 22q // Am. J Hum. Genet., 71, pp. 1216 1221, 2002.

150. Heon E, Priston M, Schorderet DF, et al. The gamma-crystallins and human cataracts: a puzzle made clearer. Am J Hum Genet. 1999; 65:1261 1267.

151. Santhiya S.T., Manohar M.S., Rawlley D., Vijayalakshmi P., Namperumalsamy P., Gopinath P.M., Loster J., Graw J., Novel mutations in the gamma-crystallin genes cause autosomal dominant congenital cataracts II J. Med Genet., 39, pp. 352 358, 2002.

152. Heon E., Priston M.K., Billingsley G., Lubsen N.H., Munier F., Clarifying the role of gamma-crystallin in congenital CCL cataract (abstract) II Am. J. Hum. Genet., 65, p. A19, 1999.

153. Schägger H. and von Jagow G., Tricine-Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Separation of Proteins in the Range from 1 to 100 kDa 11 Analytical Biochemistry, 166, pp. 368-379, 1987.

154. Walrant P., Santus R., N-formyl-kynurenine, a tryptophan photooxidation product, as a photodynamic sensitizer // Photochem. Photobwl., 19, pp. 411-417, 1974.