Количественные характеристики агрегационного взаимодействия эритроцитов и их применение в клинике тема автореферата и диссертации по механике, 01.02.08 ВАК РФ

'£ •1

'о ^ министерство здравоохранения и медицинской с^ промышленности российской федерации

-о ^российский государственный медицинский университет

■к^ -

л.

v На правах рукописи

СИРКО Игорь Владимирович

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АГРЕГАЦИОННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭРИТРОЦИТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КЛИНИКЕ

Специальность 01.02.08 - биомеханика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Российском Государственном Медицинском Университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук профессор H.H. Фирсов Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.П. Ефимов кандидат физико-математических наук Н.В. Нетребко

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.С.Павлова РАН

Защита состоится "/<Г" 1997 г. в _ часов

на заседании Диссертационного совета Д 123.02.01 Центрального научно-исследовательского института протезирования и протезостроения по адресу: 127486, Россия, Москва, ул. И.Сусанина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "__"_1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 123.02.01, кандидат технических наук

Н.Г. НИКИТИН

общая характеристика работы

Актуальность работы. В последние 10+15 лет было

подтверждено значение гемореологической патологии в клинической практике, как неспецифической реакции организма, отягощающей различные заболевания. Многочисленные исследования показали связь гемореологических нарушений с изменениями в системе свертывания крови, микроциркуляции и иммунной системе организма. В настоящее время осуществляется активный переход от экспериментальных лабораторных установок к автоматизированным приборным системам, выпускаемых во Франции (Sefam), Голландии (LORCA), ФРГ (Myrenne). Главной проблемой использования гемореологических методик обследования в клинике является недостаточно разработанная система показателей агрегационного состояния крови. Каждый из создателей эритроагрегометров применяет свою систему оценки гемореологических характеристик, однако ни одна из них не имеет строгого физико-математического обоснования. Предлагаемые ими подходы к оценке агрегационного состояния используют параметры, которые не представляется возможным соотнести друг с другом.

Поэтому, дальнейшее исследование процессов спонтанной агрегации эритроцитов и сдвиговой дезагрегации, а также методов их оценки, продолжает быть актуальным.

Научная новизна работы.

• Впервые разработана система микрореологических показателей крови, с помощью которой можно оценивать тяжесть гемореологических нарушений в клинике.

• Проанализирована кинетика спонтанной агрегации и ее зависимость от гематокрита и температуры в пределах от

4 °С до 4 5 °С.

• Получены различные варианты кинетики спонтанной агрегации эритроцитов при заболеваниях.

• Показано, что изменение агрегационного состояния эритроцитов при переходе от полной агрегации к течению при скорости сдвига 2.5 с"1 может служить показателем, характеризующим гиперагрегационное состояние.

• Предложен способ диагностики скрытой гиперагрегацион-ной патологии, основанный на сравнении кинетики дезагрегации цельной крови при 4 "С и 37 °С.

• Показано, что на основе предложенных показателей Т; и Тг возможна гемореологическая классификация для различных групп заболеваний.

Цель работы. Обнаружить основные закономерности спонтанной агрегации и сдвиговой дезагрегации в

цельной крови при различных патологических процессах (заболеваниях).

Задачи работы.

• Исследовать кинетику спонтанной агрегации в норме и ее зависимость от объемной концентрации эритроцитов и температуры в толстом слое.

• Исследовать кинетику спонтанной агрегации при различных заболеваниях.

• Исследовать кинетику сдвиговой дезагрегации в Куэт-товском потоке цельной крови больных с различными заболеваниями.

• Изучить воздействие плазмафереза на спонтанную агрегацию и сдвиговую дезагрегацию.

• Выявить наиболее информативные признаки микрореологической патологии, которые могли бы быть использованы для клинической практики.

Практическая ценность работы. Внедрение системы показателей, характеризующих агрегационное состояние крови, в клиническую практику позволяет оценить тяжесть гемореологических расстройств при различных заболеваниях и объективно контролировать лечение этих больных.

Публикация результатов работы. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены:

на научной конференции "Медицинская (Москва, 1993);

на конференции международного общества техники (SPIE),(Юваскюла (Финляндия), 1993);

на конференции международного общества техники (Лос-Анжелес, (США), 1993);

на конференции международного общества техники (Москва - Нижний Новгород, 1994);

на конференции международного общества техники (Лос-Анжелес, (США), 1994);

на конференции международного общества техники (Минск, 1995);

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 36 рисунков, 3 таблицы и состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы из 17 отечественных и 84 зарубежных источников.

физика-93" оптической оптической оптической оптической оптической

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение содержит обоснование актуальности темы диссертации, сформулированы цели и задачи, научная новизна работы.

АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Агрегация эритроцитов в монетные столбики была обнаружена еще в 19 веке, а первые подробные описания этого феномена начинаются в 20-х годах нашего столетия (Fahraeus). Роль агрегации эритроцитов, как формы патологии, начала осознаваться с работ M. Knisely (1947), который ввел термин "blood sladge" для обозначения патологии циркуляции, связанной с агрегационным состоянием эритроцитов.

В настоящее время процессы агрегации объясняются "мостиковым механизмом", который был предложен S. Chien. По этой теории, макромолекулы (фибриноген, IgG, IgM, продукты деградации фибрина), неспецифически сорбируясь на мембране эритроцита, вследствие своих размеров, превышающих барьер отталкивания, могут сорбироваться одновременно и на другой клетке, образуя "мостик". Малые макромолекулы, например, альбумин или декстран с молекулярной массой менее 40000 дальтон по конкурентному типу вытесняют более крупные макромолекулы из центров связывания, вызывая дезагрегацию. Поэтому альбумин является единственной макромолекулой, обеспечивающей суспензионную стабильность крови. L. Dintenfass (1975) ввел два отношения: альбумины/фибриноген и альбумины/глобулины, как главные показатели плазменных факторов агрегации. Эта теория полностью объяснила экспериментальные результаты Gregersen е. а. по исследованию агрегационной способности декстранов разной молекулярной массы. Детали мостикового механизма агрегации были уточнены в 1989 году Rapmling е.а.

Таким образом, механизм агрегации эритроцитов включает в себя следующие этапы: 1) Электростатические силы сводят эритроциты на расстояние около 100 нм и ориентируют их параллельно друг другу. Этот процесс требует присутствия электролитов. 2) В присутствии нейтральных или отрицательно заряженных макромолекул размером больше 100 нм происходит связывание эритроцитов этими молекулами. Энергия этих связей стабилизирует параллельную конфигурацию эритроцитов, в результате образуются монетные столбики. 3) Монетные столбики объединяются в сферические агрегаты, что уменьшает их поверхностную энергию. Только после этого может начаться седиментация сферических агрегатов.

Методы измерения агрегации эритроцитов

Исследование кинетики образования эритроцитарных агрегатов у человека в норме и патологии современными методами началось с работ H. Schmid-Schoenbein, который использовал микросъемку эритроцитов в однородном сдвиговом потоке в Wells-Brookfild вискозиметре типа "конус - пластина" с прозрачной рабочей частью. Методика позволяла измерять напряжение сдвига, возникающее в суспензии, ее вязкость, наблюдать морфологию агрегатов и поведение их в потоке. Морфология агрегатов при различных скоростях сдвига была изучена В.А. Левтовым в специальной проточной камере толщиной 50 мкм. Такие же исследования, но с применением современной техники, были проведены Dintenfass е. а. и Shiga е. а. Фотометрические исследования агрегационных характеристик крови начались с работ Dognon е.а., изучавшего изменения фотометрического сигнала, отраженного от крови, во время и после перемешивания. Ими была показана зависимость интенсивности сигнала от ориентации и агрегации эритроцитов.

С целью изучения трехмерной агрегации эритроцитов в достаточно толстых слоях крови были разработаны рефлек-тометрические методы и устройства (Usami S., Chien S., 1973), в которых сдвиговый поток моделировался Куэттов-ским течением. Два направления в нефелометрических методах нашли свое отражение в конкурирующих эритроаг-регометрах типа конус-пластина (Myrenne, Aachen) и Куэтта (Sefam, Wandoeurre les Nancy).

Влияние температуры на агрегационные свойства эритроцитов

Данные по воздействию температуры на свойства эритроцитов весьма противоречивы и плохо поддаются систематизации .

Так, инкубация суспензии эритроцитов при 20 или 37 °С в течение 30 часов не сопровождалась развитием гемолиза. При 50 °С эритроциты почти полностью гемоли-зировались в течение 5-=-6 часов. При 40+45 °С за 30 часов лизировалось l-s-4 %. Есть указания на влияние белковой денатурации при температурах 38 °С и выше (Gershfeld, 1988) .

Проводилась лазерная рефлектометрия эритроцитов, взвешенных в солевом растворе декстранов, в норме и при нагревании до 48.4, 48.8 и 4 9.5 °С. После обработки теплом время образования монетных столбиков увеличилось, напряжение сдвига, необходимое для дезагрегации не изменилось. Снижение деформируемости эритроцитов при

обработке теплом связывается с отсутствием компактных агрегатов и ветвистых сетей (Snabre, 1986).

При помощи реоскопа с видеокамерой, анализатором изображения и компьютером проводились исследования в диапазоне температур 5+4 3 "С. При агрегации в растворах фибриногена, IgG, D-70, полиглютаминовой кислоты скорость агрегации непрерывно растет с повышением температуры. В 70 % аутологичной плазме скорость агрегации минимальна при 15+18 °С. Форма агрегатов в растворе фибриноген (12 мкМ) + альбумин (770 мкМ), а также в 70 % плазме зависит от температуры: при 15+18 °С образуются трехмерные агрегаты, при температуре меньше 15+18 °С - одномерные (Shiga, Maeda, 1989).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Забор крови осуществлялся посредством пункции локтевой вены в стеклянную пробирку. В качестве антикоагулянта использовался EDTA в конечной концентрации 2.5 мг/мл (0.5 мл 5 % раствора EDTA на 10 мл цельной крови). Все измерения производились в течение 12 часов после взятия крови. Для экспериментов использовалась кровь взрослых(18+2 5 лет) здоровых доноров и кровь больных следующих групп патологий: наследственная гиперхолестеринемия, больные в возрасте старше 60 лет с хирургическими патологиями, ишемическая болезнь сердца, гипертрофия левого желудочка сердца, болезнь Шогрена, хронический гломерулонефрит, системная красная волчанка, псориаз, псориатический артрит, беременность.

Определение гематокрита проводилось путем центрифугирования в капиллярной микроцентрифуге МЦГ-8 (без коррекции по захваченной плазме).

Для измерения параметров агрегации кровь помещалась в цилиндрическую стеклянную кювету объемом 5 мл и приводилась в движение внутренним цилиндрическим ротором. Вращение ротора осуществлялось синхронным электродвигателем через редуктор, имеющий шесть позиций переключения скорости. Скорость вращения самого электродвигателя можно было плавно регулировать при помощи генератора низкой частоты. Это позволило обеспечить задание скорости сдвига в интервале от 1 до 720 с 1.

Кювета была помещена в водяную рубашку, соединенную с ультратермостатом УТ-15. Это позволяло поддерживать постоянную температуру исследуемого образца от 2 °С до 4 6 °С с точностью до 0.1 градуса Цельсия. Температура в кювете измерялась при помощи калиброванного термодатчика, подсоединенного к цифровому вольтметру.

Через волоконный световод на кювету подавался свет от источника (лампа накаливания) через красный светофильтр с максимумом пропускания 660 нм (использовался также другой вариант источника света - красный светоди-од) . Через другой световод отраженный свет попадал на фотодиодный датчик. Сигнал от датчика подавался на усилитель, позволяющий ступенчато изменять коэффициент усиления в 10 раз и вручную компенсировать нулевой уровень в широких пределах. Затем усиленный сигнал подавался на самописец, в качестве которого использовался потенциометр КСП-4. Блок-схема прибора приведена на Рис. 1.

Рис. 1

Схема эритроагрегометра. 1-цилиндрический ротор, 2-электродвигатель с редуктором, 3-генератор низкой частоты ГЗШ-бЗ, 4-стеклянная кювета, 5-исследуемый образец крови, 6-водяная рубашка, 7-ультратермостат УТ-15, 8-волоконные световоды, 9-лампа накаливания с красным светофильтром, 10-фотодиодный датчик, 11-усилитель, 12-самописец.

Помещенная в кювету кровь подвергалась сдвиговому воздействию при скорости сдвига в потоке у = 720 с"1. При такой скорости сдвига все эритроциты находятся в дезагрегированном состоянии, ориентированы и деформированы вдоль потока. Затем поток резко останавливали и записывали кривую агрегации. Запись велась до выхода кривой на плато, устанавливаемым визуально, что занимало не более 3 мин. в зависимости от исследуемого образца.

Для получения кривой дезагрегации образец крови подвергали сдвиговому воздействию в интервале скоростей

сдвига от 2.5 с 1 до 720 с"1, последовательно увеличивая скорость сдвига в среднем в 1.5 раза за каждый шаг С 12-^15 точек в зависимости от образца).

Полученные данные обрабатывались на компьютере при помощи алгоритма симплекса. Суммарная ошибка метода составила 1.5-^2.0 % для разных параметров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спонтанная агрегация в норме

Кривая изменения интенсивности обратного светорас-сеивания от Куэттовского потока крови после внезапной остановки, чисто формально, может рассматриваться как релаксационный процесс спонтанного перехода к равновесному состоянию.

В полулогарифмической системе координат 1п(1а)-Ии кривая интенсивности обратного светорассеивания для нормальной крови представляется в виде двух линейных процессов, котангенсы углов наклона которых дают характеристические величины Тх и Тг (Рис. 2).

~1 ' I ' I 1 I 1 I 1 I

о 20 40 SO SO ЮО

Время t, с

Рис. 2

Это означает, что кривая изменения интенсивности обратного светорассеивания может быть представлена в виде:

I, = Ial- е Т1 + 1а2 • е Т2 .

В соответствии с этой зависимостью вычислялись, также, амплитуды данных процессов Iai и 1аг- В качестве характеристических параметров агрегации исследовались как сами амплитуды Iai и 1а2 (при изучении различных воздействий, т.е. рассматривалось относительное изменение амплитуд), так и их отношение —— .

Исследование нормальной донорской крови показало, что первый процесс протекает со средним временем 12.5 ± 0.8 с, а второй - со средним временем

ïai

41.4 ± 0.75 с. Отношение амплитуд этих процессов -

равно в среднем 3.5 ± 0.4. Корреляционная зависимость между временами Ti и Тг отсутствует (коэффициент корреляции менее 0.01) (Рис. 3). Это говорит о том, что каждый из показателей характеризует отдельный процесс.

юо

о р

«>* «г.

8 12 Время Т1. с

Рис. 3

"I -is

Анализ кинетики агрегации, проведенный Т. Fabry, позволил нам обосновано считать, что первое время (Тх) связано с процессом сборки линейных агрегатов, т.е. агрегацией "торец в торец" и образованием монетных столбиков.

Медленный процесс агрегации (Тг) связан с укрупнением агрегатов, объединением монетных столбиков по принципу "торец в бок" и "бок в бок" и формированием крупных сфероидных образований. Данной методикой регистрируется образование агрегатов, предшествующее

оседанию, которое начинается, как показал Т. Fabry (1987), через 2.5+3.0 мин.

Если интенсивность светорассеивания пропорциональна числу рассеивающих центров, т.е. агрегатов в единице объема, то величина, обратная светорассеиванию при заданном гематокрите, должна соответствовать среднему размеру агрегатов. На Рис. 4 показано, что кривая в

координатах —-s-(t) спрямляется на большей части

амплитуды агрегации, составляющей в среднем 93 ± 0.7 Оставшаяся часть кривой светорассеивания, как правило, изменяется случайным образом. Спрямление означает, что произведение Ia"t = const, и эта константа может характеризовать процесс агрегации в целом. Для характеристики спонтанной агрегации при данном способе обработки нами вычислялся параметр tg(a) = —-—, как это

const

показано на Рис. 4.

О 40 80 12 0

Время t. с

Рис. 4

В дальнейшем нами, в основном, применялся метод логарифмирования кривой изменения интенсивности обратного светорассеивания, т.к. нас интересовал не только быстрый процесс агрегации (Т1) , но и медленный процесс образования крупных сфероидных агрегатов (Тг) , после чего начинается оседание, регистрируемое пробой СОЭ.

Влияние гематокрита

Гематокрит изменялся путем разбавления эритроцитар-ной суспензии аутологичной плазмой в диапазоне от 0.2 до 0.8.

Время Ti зависит от гематокрита следующим образом: ¡2

Ti = -1-5- + С3 (Рис. 5)

(Ht - С2Г

где коэффициенты: Ci = 0.57 ± 0.15 для разных образцов; С2 = 0.06 ± 0.005; С3 = 4.0 ± 1.5.

I ■ 1

0.4 О.б

Гематокрит Ht. усл.ед.

Рис. 5

а.а

Аналогичная зависимость наблюдалась для времени Т2:

С,

т2 = -1- + с3

Ht - С2 С2 = 0.06 ± 0.005; Сз

где Ci = 8.8 ± 1.

Зависимость показателя

45.0 ± 12.0. от гематокрита иссле-

tg(a)

довалась на нормальной крови. На Рис. б показаны результаты экспериментов. Кривая существенно нелинейна и может быть разбита на две части: сильно зависящую от гематокрита в области от 0.1 до 0.4 и слабо зависящую, в области выше 0.4. Применение данного метода обработки полученных кривых и параметра tg(a) для оценки кинетики агрегации целесообразно при гематокрите не ниже 0.4.

1 .О -1

I „..:

—1— о. л

Рис. 6

Аномальная кинетика Таб. 1

п Тх, с Т2, с 1а1 1а2

Хронический гломерулонефрит 31 9.4+0.6 62.211.6 3.810.23

ХГН нефротиче-ского типа 17 7.4±0.9 61.512.8 4.310.33

Системная красная волчанка 8 8.6+0.5 55.618.3 3.810.24

Наследственная гиперхоле-стеринемия 48 11.4±0.8 35.011.1

Легочная гипертензия 19 18.0±1. 2 45.811.7

Абдоминальная хирургическая патология 10 14,1±1.9 46.214.0

Псориатический артрит 45 8.1±0.6 51.6+1.4

Хроническая ишемическая болезнь сердца 22 6.9±0.2 37.9+1.0

ХрИБС + сахарный диабет 17 6.2±0.14 34.110.5

Псориаз 57 12.5±0.5 40.011.2

Беременность 15 6.8+0.32 71.9+2.8 4.27+0.18

Норма 40 12.5±0.8 41.410.8 3.5+0.4

В Таб. 1 показано, что времена агрегации при различной патологии сильно варьируют от 18.0 ± 1.2 с при легочной гипертонии до 6.2 ± 0.14 при хронической ИБС осложненной диабетом для первого времени и от 62.2 ± 1.2 с при хроническом гломерулонефрите до 34.1 ± 0.5 с при хронической ИБС осложненной диабетом.

Все исследуемые заболевания могут быть классифицированы по реологическим параметрам Тх и Тг, как на Рис. 7. Заболевания разделяются на три группы, причем со сходным патогенетическим механизмом. Группа заболеваний, связанных с аутоимунными процессами (псориатическая артропатия, ХГН, ХГН нефротического типа, СКВ, болезнь Шогрена) характеризуется высокой скоростью образования линейных агрегатов (уменьшение времени Тх) и замедлением образования крупных агрегатов (увеличение времени Тг) .

Сердечно-сосудистая патология характеризуется ускорением обоих процессов. В отдельную группу с замедлением обоих процессов попали больные с легочной гипертензией и абдоминальной хирургией. Четвертой группы в этой классификации быть не может, так как увеличение времени Т1 и уменьшение времени Т2 неизбежно приведет к процессу, близкому к одноэкспоненциаль-ному с характеристическим временем, средним между Т1 и Т2.

Т1

* легочная гипертензия

* абдоминальная хирургическая патология

т2

-норма -

* ИБС

* ИБС+диабет

* наследственная гиперхолестерин-емия

* псориатическая артропатия

* СКВ

* ХГН

* ХГН нефротич.типа

* болезнь Шогрена

* беременность

Рис. 7

Изменения кинетики агрегации после лечебного воздействия

Лечебные воздействия, а также воздействие физических факторов и лекарственных препаратов in vitro резко меняют кинетику агрегации.

Кривые спонтанной агрегации крови больных с наследственной гиперлипидемией имеют особенность, отличающую их от двухэкспоненциальной формы. В ряде случаев можно выделить начальный участок с небольшой амплитудой агрегации, но с очень высокой скоростью (характерное время порядка 0.5 с). Эту компоненту мы определили как "мгновенную" (Рис. 8), соответствующую "formation of primary red cell aggregates", и описанную H. Schmid-Schoenbein (1975) для тонкого слоя крови. Амплитуда этого процесса составляет 27 ± 2.6 % от полной амплитуды агрегации. Можно заключить, что "мгновенная" компонента связана с образованием парных агрегатов, о чем свидетельствует фоторегистрация как Т. Fabry (1987), так и Н. Schmid-Schoenbein (1975).

О 60 100 1 so

Время t, о

РИС. 8

"Мгновенная" компонента кривой спонтанной агрегации у больных наследственной гиперлипидемией. После "мгновенной" фазы происходит одноэкспоненциальный

процесс.

После массивного плазмафереза (обменное замещение до 2.3 литра плазмы) кривая изменения обратного свето-рассеивания при спонтанной агрегации претерпевает резкие изменения. Время Тх исчезает, а амплитуда "мгновенной" компоненты значительно увеличивается, составляя, иногда, до 50 % общей амплитуды изменения светорассеивания (от полной дезагрегации до полной агрегации). Вслед за "мгновенным" процессом наступает медленный одноэкспоненциальный процесс укрупнения агрегатов с характеристическим временем порядка Т2. Переход одного агрегационного процесса в другой происходит либо в виде излома (Рис. 8), либо в виде небольшого куполообразного "пика", либо происходит задержка агрегации (Рис. 9).

Время с

Рис. 9

Первичные агрегаты - это, в основном, "пары", и их образование значительно облегчено как остаточной конвекцией, так и тем обстоятельством, что пары образуются, в основном, за счет поворота эритроцитов, уже имеющих контакт.

Следующую за этим задержку агрегации объяснить очень трудно, но этот эффект может трактоваться в пользу теории дальнодействия между эритроцитами. В обедненной макромолекулами среде после образования парных агрегатов ("мгновенная" компонента) необходимо время для создания макромолекулярной структуры в "атмосфере" эритроцита, необходимой для преодоления образовавшегося слоя плазмы и стягивания пар в монетные столбики. Появление колоколообразного выброса на кривой

обратного светорассеивания можно отнести к изменению ориентации парных агрегатов после их формирования.

Гидродинамическая дезагрегация эритроцитов

Процесс дезагрегации в норме

Процесс дезагрегации в норме первично изучен H.H. Фирсовым (1983), который показал, что изменение интенсивности обратного светорассеивания для нормальной крови при изменении скорости сдвига подчиняется закону:

Га = I

a(max)

(l - е-™)

где Ia (max) - полная амплитуда агрегации (разность интенсивностей светорассеивания при полной дезагрегации и при у = 0; см. Рис. 10), а р - константа гидродинамической дезагрегации, определяемая как тангенс угла наклона графика в координатах In(1а) + (у ) .

1.0 —1

100 150

Время t, с

Рис. 10

Параметр 1а(2.5) в норме (1) и патологии (2). 1а(у = 2.5)

250

а (2 . 5) = -

100% ( 3 — I а ( У - 2.5), 4-Ia,maX|) •

La(max)

Тщательное изучение показало, что это соотношение воспроизводится независимо от направления изменения скорости сдвига: от максимальной агрегации до полной дезагрегации или наоборот. При переключении с меньшей скорости сдвига на большую интенсивность светорассеива-ния изменяется с характерным временем 0.5 с. Таким образом, для нормальной крови петли гистерезиса не наблюдается.

В норме при скорости сдвига 2.5 с"1 интенсивность обратного светорассеивания увеличивается на 20-5-25 %, так как прочность крупных агрегатов в норме мала.

На Рис. 11 показано, что зависимость Iа<2.5> от объемной концентрации эритроцитов носит существенно нелинейный характер. Смещение интенсивности обратного светорассеивания в область увеличения размеров агрегатов при уменьшении гематокрита можно связать с механизмом сдвиговой агрегации. Действительно, при пересчете значений гематокрита в среднее расстояние между эритроцитами, нелинейность графика значительно уменьшается. Это подтверждает, что агрегация при низких скоростях сдвига является функцией вероятности столкновения клеток в сдвиговом потоке и указывает на необходимость проводить исследования показателя 1а(2.5) при стандартизированном значении гематокрита.

О.О 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Гематокрит Ж, усл.ед.

Рис. 11

Зависимость показателя 1а(2.5) от гематокрита для нормальной крови.

Процесс дезагрегации в патологии

При некоторых видах патологии (ХрИБС, легочная гипертония, псориаз, наследственная гиперхолестерине-мия) наблюдается двухфазный характер зависимости: кривая изменения интенсивности светорассеивания распадается на две экспоненты, характеризующиеся двумя постоянными Р1 и Рг (Таб. 2).

Таб. 2

(2 . 5} с % ßi, Рг, с"1

Хронический гломерулонефрит -17.5±2.7 п=31 32.2±3.8 п=31

ХГН нефротиче-ского типа -3.3±4.5 п=17 48.0±7.3 п=17 —

Системная красная волчанка -10.4±5.2 п=8 35.9±4.0 п=8 —

Наследственная гиперхолестерин-емия -15.8±1.5 п=33 45.7+2.8 п=4 8 84 .4 + 6.3 п=14

Легочная гипер-тензия -23.5±2.8 п=19 26.0±3.3 п=19 70.0±5.0 п=14

Абдоминальная хирургическая патология -14,3±3.3 п=10 56.0±4.0 п=10

Псориатический артрит -1.7±3.2 п=4 5 57 . 3±5.6 п=39 —

Хроническая ишемическая болезнь сердца не оценивалось 33.0±1.0 п=22 55.2±2.3 п=22

ХрИБС + сахарный диабет не оценивалось 30.0±0.9 п=17 57.3±2.0 п=17

Псориаз -22.2±1.2 п=57 28.0±1.4 п=57 61.6±6.2 п —11

Беременность -14.5+2.7 п=15 35.7±3.2 п=15 —

Норма -25.7±0.83 п=37 26.3±1.1 п=40 —

Константа Р1 характеризует процесс разрушения крупных агрегатов, а константа Рг - мелких. Во всех случаях Рх « р2 и процесс дезагрегации мелких агрегатов затягивается до высоких скоростей сдвига. Операция плазмафереза уменьшает константы Рх и р2, а повторная операция приводит кинетику к состоянию со значением р близким к норме (Рис. 12).

О 40 80 12 0

Скорость сдвига у , с-1

Рис. 12

Изменение кинетики дезагрегации после операции плазма-фереза. 1-до плазмафереза, 2-после первого плазмафере-за, 3-после второго плазмафереза, 4-оСразец нормальной

дезагрегации.

При некоторых видах патологии наблюдается столь высокая прочность агрегатов, что интенсивность светорас-сеивания при у =2.5 с"1 практически не меняется. Это наблюдается при хроническом гломерулонефрите нефротиче-ского типа (1а(2.5) = -3.3 ± 4.5 %) и при псориатическом артрите (_Ха(2.5) = -1.7 ± 3.2 %). В последнем случае в крови части больных наблюдалось парадоксальное явление: уменьшение интенсивности обратного светорассеивания при включении (после достижения полной агрегации) скорости сдвига 2.5 с-1. Как правило, это сочетается с замедлением дезагрегации в виде переходного процесса, происходящего с характерным временем от 2.5 до 10 секунд в зависимости от скорости сдвига. При обратном процессе, то есть ступенчатом изменении скорости сдвига от полной дезагрегации до остановки потока, наблюдаются другие значения интенсивности светорассеивания, т.е. возникает

петля гистерезиса, площадь которой может быть значительной, а форма - существенно асимметричной (Рис. 13) . 1.0

-|—I—I II I 11-1-1—I—I I I I 11-

10 100 Скорость сдвига Г,с-1

-1—I I I I 11

1000

Рис. 13

Типичные кривые зависимости процесса дезагрегации от направления изменения скорости сдвига.

Площадь петли может служить показателем аномальности агрегационного поведения эритроцитов при данном заболевании. Изменение светорассеивания при скорости сдвига 2.5 с 1 является важным показателем гиперагрегации и определяет прочность особо крупных агрегатов. Для вычисления этого параметра использовалась формула:

1а<2.5) = - Ia'"i' " 2-5)-100% (Рис. 10)

■^а(шах)

Обнаруженный эффект поведения агрегирующей суспензии связан с двумя процессами: индуцированной сдвигом агрегации эритроцитов и индуцированного сдвигом оседания эритроцитов. Эффект увеличения агрегации-оседания был обнаружен в нормальной крови одним из основоположников современной гемореологии A.L. Copley в 1976 году. Было показано, что в цельной крови доноров при Ht = 0.38+0.4 0 скорость оседания эритроцитов увеличивается в 2.5 раза при скорости сдвига 0.1 с"1, а при скоростях сдвига более 5 с"1 прекращается. Обнаруженный нами эффект можно считать экстраполяцией при патологи-

0.6

ческом усилении агрегации обнаруженного Copley эффекта на более высокие скорости сдвига.

С нашей точки зрения, причинами уменьшения сигнала обратного светорассеивания при нормальном гематокрите и у =2.5 с"1 являются:

• Разрушение образовавшейся структурной сети из агрегированных в покое эритроцитов с последующим образованием более крупных агрегатов вследствие сдвигового .столкновения более мелких.

• Миграция образованных крупных агрегатов от поверхностей скольжения внутреннего и наружного цилиндров с образованием пристеночных слоев плазмы и дальнейшее укрупнение агрегатов.

• Быстрое оседание эритроцитарных агрегатов в придонный слой кюветы.

Все вышеизложенные результаты позволяют выделить четыре основных типа сдвиговой дезагрегации в патологии как различные сочетания изменения прочности крупных и мелких агрегатов, схематически изображенных на Рис. 14.

Рис. 14

Четыре основных типа сдвиговой дезагрегации в патологии как различные сочетания изменения прочности крупных и мелких агрегатов. 1-равномерное увеличение прочности всех агрегатов; 2-малая прочность крупных агрегатов и высокая прочность мелких; 3-высокая прочность крупных агрегатов (начало дезагрегации при высокой скорости сдвига) и высокая прочность мелких агрегатов; 4-тяжелый гиперагрегационный синдром, характеризующийся повышением прочности крупных агрегатов при сдвиге и высокой-прочностью мелких агрегатов; 5-норма: быстрая дезагрегация крупных и мелких агрегатов.

Влияние температуры на процессы агрегации/дезагрегации

Исследовалось влияние температуры на процессы агрегации/дезагрегации нормальной крови в интервале от 2 до 50 °С (в области температур 45+50 °С исследования затруднены тепловой денатурацией крови, в связи с чем достоверными можно считать результаты в области до 45 °С). Времена агрегации Тх и Т2 не зависят от температуры вплоть до 35+37 °С, после чего наблюдается резкое увеличение скорости агрегации (в среднем в 3 раза при 45 °С) (Рис. 15 для времени Ть аналогичная зависимость для времени Т2) .

Рис. 15

Амплитуда медленной фазы агрегации 1а2 не зависит от температуры практически во всем диапазоне измерений и, только при температурах выше 4 0 °С возрастает. Амплитуда быстрой фазы Iai не изменяется при температурах ниже 35 °С, в области 37 °С имеет выраженный минимум, а, затем резко возрастает, аналогично амплитуде

1а2-

Прочность агрегатов (Р) не зависит от температуры в пределах точности эксперимента.

Исходя из общетеоретических посылок (например, возможность фазовых переходов в липидной структуре мембраны эритроцита) ожидалось существенное изменение параметров агрегации/дезагрегации при низких температурах.

Однако, согласно полученным результатам, у здоровых доноров существенных изменений параметров не происходит. Видимо следует признать, что в отсутствие грубых изменений в мембране эритроцитов параметры агрегации определяются, в основном, свойствами плазмы и сорбцион-ными свойствами поверхности мембраны эритроцита. Резкое увеличение скорости образования линейных агрегатов (Т1) не укладывается в общие представления о скорости оседания эритроцитов и их диффузионной подвижности, которые рассматриваются как причина сближения эритроцитов друг с другом.

Для проверки роли плазменных факторов агрегации были проведены эксперименты по изучению воздействия температуры на кровь больных болезнью Шогрена (Sjogren) in vitro. Выбор объекта связан с чувствительностью этих больных к охлаждению конечностей и возникновению, в результате, сосудистых расстройств. Это связывается с наличием в крови таких больных разных концентраций так называемых криобелков, т.е. белков, агрегирующих при понижении температуры. В Таб. 3 показана динамика основных показателей спонтанной агрегации и дезагрегации при температурах 4 °С и 37 °С.

Таб. 3

I а (2 . 5) ! % Р, с"1 Ti, с Т2, с Ьк 1а2

п 17 26 20 20 20

4 °С +21.0+3.9 93.0±13.2 16.2±1.7 71.6+3.1 3.1+0.3

37 °С + 4.1±3.3 55.0±6.0 8.3±0.7 69.4+3.5 4.4±0.4

Р < 0.01 < 0.01 < 0.001 не достоверно < 0.05

Получились парадоксальные результаты: прежде всего, при понижении температуры отмечается резкое увеличение прочности крупных и мелких агрегатов (1а(2.51 и Р) с замедлением образования линейных агрегатов {Т1 ?, при общем уменьшении вклада этой компоненты агрегации в общий процесс. Такое сочетание противоположно тому, что наблюдается для патологической агрегации эритроцитов при других заболеваниях. Обычно, увеличение прочности агрегатов слабо коррелирует с ускорением процесса спонтанной агрегации. Замедление процесса спонтанной агрегации (увеличение времени Тх) связано, возможно, с увеличением вязкости плазмы при понижении температуры и снижением подвижности эритроцитов. Повышение прочности агрегатов при этом может

быть связано с увеличением адгезионного сродства белковых агрегатов к поверхности эритроцитов. Данные эксперименты показывают перспективность выявления скрытой гемореологической патологии путем сравнения агрегационных свойств эритроцитов при температурах 4 °С и 37 °С.

ВЫВОДЫ

• Спонтанная агрегация нормальных эритроцитов может быть представлена в виде суммы двух экспоненциальных процессов: быстрого (~ 12.5 с) - образование монетных столбиков и медленного (~ 45.0 с) - образование трехмерных агрегатов.

• Патологическая агрегация эритроцитов характеризуется значительным ускорением образования монетных столбиков, разнонаправленным изменением медленного процесса агрегации и появлением промежуточного (Ti' ~ 22.5 с) процесса.

• Воздействие плазмафереза приводит к искажению нормального процесса спонтанной агрегации эритроцитов с появлением "мгновенной" компоненты с характеристическим временем 0.5 с, и с последующей задержкой агрегационно-го процесса, становящегося одноэтапным.

• Выявлено четыре основных типа сдвиговой дезагрегации в патологии как различные сочетания повышения прочности крупных и мелких агрегатов.

• Выделено 4 основных параметра микрореологического состояния крови (1а(2.5) / Р? Ti, Тг) , которые могут полностью описывать агрегационные характеристики цельной крови в норме и патологии.

• Полученные нами данные (задержка спонтанной агрегации эритроцитов после плазмафереза, резкое увеличение скорости агрегации при увеличении температуры выше 37 °С) ставит вопрос о серьезном рассмотрении механизмов дальнодействия, как причины спонтанной агрегации эритроцитов.

• Метод сравнительной оценки агрегационных свойств крови при температурах 4 °С и 37 °С может быть применен для выявления скрытой реологической патологии, связанной с криопротеинемией.

Список опубликованных работ по теме диссертации. 1. Двухкоординатный эритроагрегометр. Фирсов H.H., Сирко И.В.

Труды научной конференции "Медицинская физика-93", Москва, 1993, стр. 122-123.

2. Diagnostic potentials of laser nephelometry of aggregating erythrocytes suspension.

Firsov N.N., Priezzhev A.V., Ryaboshapka O.M.,

Sirko I.V.

4th International Conference on Laser Application in Life Sciences: Laser Study of Macroscopic Biosystems, SPIE, Jyvaskyla, 1993, Vol. 1922, pp. 139-144.

3. Aggregation properties of erythrocytes of whole blood under shear stress by backscattering nephelometry.

Firsov N.N., Priezzhev A.V., Ryaboshapka O.M.,

Sirko I.V.

Static and Dynamic Light Scattering in Medicine and Biology, SPIE, Los Angeles, 1993, Vol. 1884, pp. 283-290.

4. Problems of the optimum design of erythronephelome-ter.

Firsov N.N., Priezzhev A.V., Ryaboshapka O.M.,

Sirko I.V.

Optics of Cells and Biotissues, SPIE, Moscow - Niz-hny Novgorod, 1994, Vol. 2100, pp. 195-202.

5. Experience of application of nephelometry for the analysis of aggregational state of blood in a clinic of internal diseases.

Priezzhev A.V., Firsov N.N., Ryaboshapka O.M.,

Sirko I.V.

Biochemical Diagnostics Instrumentation, SPIE, Los Angeles, 1994, Vol. 2136, pp. 114-118.

6. Оптимизация конструкции эритронефелометра. Приезжев A.B., Рябошапка О.М., Сирко И.В., Фирсов H.H. Изв. РАН, серия физическая, 1995, т. 59, № б, стр. 168173.

7. Dependences of erythrocyte aggregation and disaggregation parameters on suspension hematocrit: study by backscattering nephelometry.

Firsov N.N., Priezzhev A.V., Ryaboshapka O.M.,

Sirko I.V., Vyshlova M.A.

Laser Application in Life Sciences, SPIE, Minsk, 1995, Vol. 2370, pp. 393-401.