Выделение и физико-химические свойства ауксинсвязывающего белка из проростков хлопчатника тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИА1ИИ л I им. АКАДЕМИКА САДЫКОВА А. С.

.М У М

« ' "ГЫ V 4 и

' На правах рукописи

УДК 581.192.7

АРЗАНОВА Ирина Александровна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АУКСИНСВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА ИЗ ПРОРОСТКОВ ХЛОПЧАТНИКА

(02.00.10 — биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ)

АВТОР ЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1990

Работа выполнена в лаборатории химии белка и пептидов Института биоорганической химии им. акад. Садыкова А. С. АН РУз.

Научные руководители:

Академик АН РУз Салихов Ш. И.

кандидат биологических наук Тонких А. К.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Азимова Ш. С,

кандидат биологических наук Голубенко 3.

Ведущая организация: НПО «Биолог» АН РУз.

Защита состоится « » ^Х._ 1996 г.

в часов на заседании Специализированного совета

Д.015.21.21 при Институте биоорганической химии им. акад. Садыкова А. С. АН Республики Узбекистан (700143, Ташкент, проспект акад. X. М. Абдуллаева, 83)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. Садыкова А. С. АН РУз.

л О

Автореферат разослан «• б^с/» _1996 г

Ученый секретарь специализированного Совета доктор химических наук, профессор ц_ и. БАРАМ

1. 01ЩАЯ ХЛГАКТКГИСТИКИ РЛВОТН.

Актуальность томи. Гормон растений - ауксин или инд<чил-3-уксусная кислота (ИУК) - стимулирует прорастание семян, развитие корней, рост клетск растянонирм, принимает участие в фото-, хемо-, и гравитропических ответах растениП, участвуетв регуля-торной Функции других фитогормойов и ряде других процессов (Дор-флинг, 1985). На молекулярном урогно действии ауксиип 'начинается поело связывания его со специфическими рецепторами. Предполагается существование нескольких типов аукспновых рецепторов (Ltb-benga ßt а! . , 1908; Hertel, 1987). Один из них, попадшмцнй при гомогенизации растительных тканой во фракцию водорастворимых белков, активирует работу специфических генов и через синтез соответствующих белков управляет развитием растения. Один из белков мембранных фракций стимулирует рост клеток •растяжением. Функция других аукси нсвязыпаютих белков (АСБ) яыяснвна еще недостаточно.

Несмотря на то, что ауксинсвязывакицие белки являются объектом изучения целого ряда исследовательских коллективов (1ЛЬЬвп ga et al. ), аукенновне рецепторы хлопчатника исследовались мало (Халилова Г.Б. Аптореф.дис. канд.биол.наук, 1982), и это мояот служить сдерживающим фактором в развитии генетики хлопчатника и скрининге новых регуляторов роста для хлопководства.

Цель работа. Целью настоящей работы являлось выделение, очистка и изучение свойств АСБ, через которые ауксин регулирует активность генов хлопчатника,а также поиск физиологически активных веществ,опосредующих свое действие на растение через эти ре-цепторнма белки.

Основпио задачи исследования. D соответствии с поставленной целью определони следующие основные задачи работы- исследовать характеристики аукеинсвяяыпакпцих участков ия про-

ростков хлопчатника;

- разработать мотодичесхне подходы ДЛН выделения АСБ;

- прорости виделоние,очистку и изучение свойств АСБ, otbstctpoii-иого зе< .регуляцию активности генов;

- провмсти скрининг иеиеств нлиярщнх нъ связывание ауксина с изучаемы») белком.

Научили новизна. Изучены ларактористики ауксипсЕнзмиаюцнх

учпс-скоп из проростков хлопчатника. Для имдальнин ЛПК сннт.<гч1-

рован n'i'itiiid.ijrt сорслнт ИУК-ацбтанидогекснлс&фпроэа и рпзработпн

¡.I'.riiuiiKChuii н-'чч очистки, гключающиЛ ¿житную и високо'«Ффйкгиь-

нут жидкостную .хроматографию. Из йодного экстракта проростков

ллогматника пыдйлри белок с м.н. 2U0 кДа, состоящий из субъв-

Аимии по 43 кДа, который специфически с высоким сродством связи-л

•> Н-ИУК н в присутствии ауксина стимулирует синтез ГНК in t/itio i. хроматине из проростков хлопчатника, то огп. иропнлн^т свонетва, характерные для ауисинового рецептора, отяетотпшшого па регуляцию активности генов. Обнаружено, что большая группа синтетических соединений - краун-эфиры,а такжи горной жиногных -тироксин - являются конкурентами МУК в действии на растворимый пуксиноншч рецептор в акспоринентах in vitro.Установлено,что из -вестиий Фитотокеин иэ гриба Fusicoccu»i Amygdale ингибируот связывание ^Н-ИУК с раст.чоримым ауксиловым рецептором и, подобно ИУК, стимулирует синтез РНК » хроматине,зависящий от присутствия ауксинового роцептора,что существенно уточняет представления о действии этого нысокоэффектипного регулятора роста растения.

Практическая значимость. Выделенный физиологически активиг.й растворимый ЛСБ позволяет провести исследование механизма активации ауксином специфических генов и соответствующих им болков. Отработанные методы изучения ауксинранапторного связывания.выделения ■чуксииапяг.нвечщих бс-лкои и оценки аукеннзчинсим' :•:■> сиигечп

ГНК позволяют проводить направленный скрининг новых пестицнл^,« ауксинподобного действия. Обнаруженное в настоящей работ" дойет вне тироксина и Фузмкокиина на ауксинокый рецептор,возможно.позволит пересмотреть некоторые фундаментальные положения о системч гормональном регуляции у растений и углубит существующие и часто -ящее время представления об уровнях филогенетической спяэи между животным и растительным миром.

Публикации. По материалам диссертации получено 1 авторское свидетельство, опубликовано 7 статей и 12 тзэиеннх сообщений,

Апробации работы. Материалы дчссортацни били долсаени на 4 съезде Физиологов Узбекистана (Ташкент, 19Й8), 14 Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва , 198в), 10 Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР - ГЛР (Москва, 1989), 1 Всесоюзной совеыании по биологическим свойствам макро-цикличесгих соединений (Ташкент, 1990), 2 Всесоюзном совещании по проблемам генетики ралгштия растений (Ташкент. 1990), 2 Делегатском съезд?- Всесоюзного оЗшества физиологов растений (Минск, 1980), 1 съезде физиологом растений Узбекистана (Ташкент, 1Я91). 5 конференции • биохимиков Сродней- Азии и Казахстана (Ташкент, 1991), конференции "Современные проблемы общей физиологии и биофизики" (Тазжент, 1993), 2 конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1933), конференции "Структура и Функция биологических мембран" (Ташкент, 1995).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах и включает о себя следующие разделы: введение, ебэор литературы, материл ли и методы, результаты и обсужден»«, чаключ^нк«; выводы и список литературы из 134 наименований. Глава "Гчзульготы И обсуждение" содержит 18 рисунков и 9 таблиц.

2. МАТЕРИАЛЫ Н НКТОДИ ИСОЛКДОВЛШ'Я ОСьокг исс>чгдог<1ния. Источником а т к си н с та эк паягпи х пр-лм-лг"

тов служили трехдневные этиолированные проростки хлопчатника (tioRsypinm hirautum) сорта 175-ф.

Нояучонио ауксннсиыаивлпцих препаратов. Препараты,сказывающие Н-ИУК. получади гомогенизацией проростков в 10 объемах 6у-фор.юго раствора, содержащего 50 пМ Трис-IICl. рН 7,8, 50 г.М КС1, ? ,Ъ m И (1 д С i z , Ь пН ЭДТЛ, 2. uH Д'ГТ, 25U шМ сахарозы. Фракции, обогащенный ядрами, фрагментами клеточных мембран, микросомами, получали последовательниц центрифугированием гоиогената. фракцию во/юрастпорпмих белков высаливали us сугшрнатанта добавлением сухого сульфата амноннл до концентрации fifi% от насыценнн. Для обессолнвэнип и удалении ипзкимолекулярних веществ осадок нора-' растворяли в небольшим объема буфера 50 UiH Трис-HCl pli 7,8 и пропускали чериз колонку с Сефадг-ксои 0-25. Для работы использовали белки, выходшциз в свободном объеме колонки.

Аффинная хроматогра-тни. Для синтеза аффинного сорбента ПУК реакцией алкилировании присоединяли к АН-Сефарозе 4Б по известному методу (Cuatrocasas', 1972). Полученным сорбентом -ИУК-ацетами-догексилсефарозой заполняли колонку (10 х 2,0 см) и уравновешивали ее буфером 50 тН Трис-HCl рН 7,8. Обессоленную фракции водорастворимых Белков пропускали через аффинную колонку,и адсорбированные на ней белки элюиропали I M MaCl. Аналогично проводили очистку и белков иэ солвбилиэированных мембран,только в.качестве буфера использовали ]0 шМ цитрат натрия рН 5,5 с 0,1% Тритоном Х-100.

Жидкостная хроматографии высокого разревенкя.Для дальнейшей очистки элюиропанних с аффинной колонки белков и оценки »и молекулярных масс использовали ВЭЖХ.с помощью аппаратуры фирмы ЛКБ. Для оценки суб-ьединичного состава использовали гель^электрофорвз с SD5 в градиенте НААГ (5-25Х).

Эксперииенты по связыванию. Специфическое связывание аН-ИУК с уд.акт.21 Ки/пмоль "Aoershan" (Англия) как с препаратом м—*раи.

тая н водорастпоримих болкоп изучили,испольауп метод Фильтрования на нитроцеллилоэпых фильтрах "Мижинор" и "Спинор" с размером поп 0,4-0,0 икн. Специфическое связывании моченого лигандп оцонпшии относительно но ноччо чей тысячекратного избытка намоченного ганда.Влияние ЛС!> на РНК подимпрагшую активность хроматина оцеги-впги по вилвчонип ^И-УТФ с уд.акт.20 Ки/ниоаь "Изотоп" п ГНК хроматина из проростков хлопчатника.

з. гюулътлти и их <шсгкдение Поксг яуксинсшлзивоощих сайтов о проростки* хлопчатника.

В соответствии с гипотезами о механизме действии ауксин? га плеточном уровне предполагается существование нескольких т«!г»-:э ACR. Поэтому,нами в первую очередь били проволоки исследовании го Локализации ауксннспяэыяявщих сайтов во фракциях, лолуюппия пг-< последовательном центрифугировании гомогемата из проростков хлопчатника. В таблице 1 представлены результаты этих экспоринянтсч».

Таблица 1.Специфическое связывание Зц-ИУК (пноль/мг балка) с фракциями из семядольных листьев (А) и гипокотидей (К) трехдневных проростков хлопчатника.

Фракции "А Б

Осадок 1000g Осадок 20000я Осадок lOPOUOg Супернатант

0,60 ± 0,04 0,10 ± 0,02 не выявлялось на выявлялось

3,50 ± 0,05 0,80 i 0,05 0.Б0 t 0,03 0,80 ± 0,05

Примечание. Концентрация Зц-ИУК = 30 нН.

Как видно из таблицы, наиболее богаты ИУК-счяэывпюошн»

T9HII прспара г;д из пнкжс,тилей, в кот ориX ОНИ ХОСОИО ПЫЯВ П .!Г"'~<! »•• D мр'-'паra r.i:: •> Ъклггспш. ,ч гракций, >,ла и сю фракции

- û -

белков, поэтому дли изучения ауксннсиизииавщих сайтов были использованы гииокотилн проростков хлопчатника. В связи с: том, что и исследовании ДСЬ иамболыпеа количество работ гюсшщопо белкам из фраю,ни оЬосацоиник мембранами и водорастворимым белкам,кы и дальнейший работе изучали ауксмнсвязивающив сайты из осадка поел« центрифугирования при 20000(4 и сайты из фракции водорастворимых бедкоп.

Специфической скязивание ¿Н-ИУК при'концентрации 30 нЫ как с препаратами мембран,так и с водорастворимыми белками достигало насыщении ни волне чцн за 1й минут при 20°0. Оптимум уН дли снизывании с препаратом манбрам был около 5,Ъ, а с препаратам растворимых божков окало 7,5. Кривыо специфического сразившими 3 tl - H У К с препаратом мембран указыо^ют на наличие не моноо чьи днук типов связывающих сайтов с SU лежащими о области 0,1 и 1,0 мкН. Кривая снизывания Зн-ИУК с препаратом водорастворимых белков свидетельствует об однотипности свизывавдмх сайтов с К<1 -6 "il и Вмакс = 0,2 пноль/нг Силка. Для характеристики свойств ауксипсвнэываищих сайтов было изучено действие на связывание И--ИУК различных соединений, имеющих отношение к ответам растений нп ауксины (таблица 2).

Таблига 2. Ингибированио (Ï) специфического связывании ?И-ИУК с фракциями мембран и водорастворимых болкоп соедингош-ями имеющими отношение к ответам растений на ауксины

Препарат 'НУК ИУК ТИКК 2,4-Д ИНК

Мембраны 80,3 75,0

Ьодораст.белки ЬС,4 9Ь,1

Примечание. Кс.п,. • /рацин Зц-ИУК^ЗО нМ.а изучаемы;', новости -10 Hxll

57.3 30,7 Й.1

82.4 32,2 15,4

кз тввивцч иилио. что порядок ингибиропчичп тугими -

ими сплэмгшнии Зц-ИУК дли комбратшх фракций НУК> ИУК>ТИРК> 21, 4 - Д> И ПК» а для водорастворимых белков ИУК>ТИПК>11УК>2,. Порядок ингибироплния свлзипзннч Зц.цук с препаратами менбрпи позволяет предположить, что мембраны из нргросткоп хлопчатника обогптчнчи сизмпппщимн спйтпми, близкими по сгойстппм к тик называемому "сайту-1", хорошо описпнному для мембран ип колооитилей кукурузы, бобовых, элакоп. Яодорпстворимып хе белки близки по свойствам ра (.'тпоримим бе." ка» этих so растений и культури хлоток тсбпхл (I.ili-l)(;nga et aJ.,19B6). Un фракции мембран Сил получен препарат сплю-бклиэиролапмых п Тритонч Х-3 00 белкой, который сохранял гы~окоо срсдстпо связывания с ^И-ИУК и последовательность ингибирования итого связывании вилсухээашычи соединениями, характерную для чп-типиых номбрам.

Таблица С. Иклвчвнко ^11-УТФ п РНК хроматина из проростков хлопчатника з присутствии ИУК и фракций содержащих ДСП.

Препараты Лклк>чение ЗП-УТФ Симп/мин)

Контроль 5ЯЗЗ + 393 100Z

ИУК 7475 i 433 1.2ВХ

Колюбилизироп.мембраны 4865 + 407 07Д

Сохсбнхизироп.мембрами + ИУК 4983 t 503 тъ

Растворимые белки 5827 + 440 00*

Растворимые болки + ИУК 9064 ± 473 160%

Примечание. Концентрации белков = 1мг/мл, ИУК = 10 мкН

Так как работы япЯ1Ш;>еь выделение и очистка ауксинспя-

знваглцих болкоп, отпстстпршш* за регуляцию активности гсто», подученные фракции растворимых и солюбилизированных мембранных боя-

- о -

Кии Пили ылслидоьешн на способность стимулировать синтез MIX в OHCTtiiUi iii vit.ro. Из таблицы 3 видно, что суцостиошю увеличивает »««¡ъчсишо Зи УТФ в I'll К. хроматина совместно i. ПУК только препарат, содержащий р«-.створнныа ауксинсниэшмющио (ш-аки, что шюлно согласуете« со сиоатшимисп продотивлевиин» а роли иоло1>аСТВиримых ayксинсинаинавдцих Ьолкоь (Lihbeiijja tit ul., liUlii).

Валчлинна и очистка (юстыришыго ну ► оыиси-ищвлочаго бона.

На ссно.о изучения структур т*д|ш»шы омльдачлцпх ауксишю-добнин действием сложилось ирадстаьлыш«, чго я*« лвяэивашш с ауксиновим рецептором аналоги ауксина а.лныш им .-ть сьсбодную карбоксильную группу I Thimann , 1 377) . Пс.л . ну , л ли оч.:сткм АОБ нами выл синтезирован иффннний сорбент ИУК ацатаиидогиксилсефароза,в котором ПУК присоединили через иминогруши к "спьй upy" Ali-Сефароэи 41). Обессиленный экстракт ьодп^асть'оригых белков пропускали чероэ аффинную Ko^oiuy и сьнэньыиъси на ней !">«лки злчировали U1 рас упором ««.С I. иол к и алюирогшнные с аффинной колонки выходили одним пиком, йис л«1 иЬесчч.-аиигишп в них научали оиецифичо. кое сг-изыпднис^Н-ИУК. Плотность ауксннсгсяэшмющих сййтои измеренная при кепцчптрацик За-ИУк йи нИ у белков элюировашшл с аффинной колонки спет аолилв около 20 шюль/мг болкз, а у Ьвяхоп наносимых на к о «он г. у - 0,0 имилъ/пг белка,то есть обогаци-ниа ИУЛ-синзииаьгцинн участками в результате аффшший хроматографии составило не менео 2Ь раз.Необходимо окштнгь, что величина концентрации НУК-спязЫЕаитнх участков в очищенном белке скорее всего запихана,так как трудно опродылить количество задержанного на фильтрах белка в процессе тестироь'ания связывании при нанесении на фильтр зяюата с аффинной колонки е количестве -менее 11) нкг.Очицешше аФФи.шой хроматографией белки,тан я а как и наносимый экстракт растворимых белков, стимулироа.чли Рнк-пелимерапную активность в хроматине в присутствии ИУК.

Дли дальнейшей очистки и оценки молекулярных масс элюиропан••

nu* с аффинной попонки белков бича мрим<;н«на пмсокол.М>'»ктмнши| яидкостная хгпилт'ч'рафич нл аналитической колонки (51 an ТРЛ

1Щ-ЭООО (О * 301) мм} <|шрмы ЛКБ.

Как видно «э рисунка 1, с аффинной колонки Рил элотироплм чп-лый ряд компонентом с кажущимися малскулярннин массами от 200 к"а до 8 кДа. Из этого ппп.тга были собраны 5 оснопных iiiikor н княдмй из ннл' бы» исслодорпн мп снизывание -^Н- ИУК и способность стимудн-ропогь включение ^н утф в PI« хроматина. Из пяти Фракций гпдьгп белок с гахущсйси молекулярной массой 200 кДа обладал способность» стимулировать РНК нолиморязпуг актипность (Тпблица 4). Мтот бою* еппнпфнчпекн сшг.шнмл Зц-МУК в концентрации :50 нН г плотно стьго сн.чзннаюгрис сайгой не менее 1Р0 пмояь/мг белка. Кслн исходить из того, что с каплей молекулой дсп с м.м. 200 кДа связаться одна молекула ИУК, го теоретическая концентрации смч воютн* сайтов доягна Сыть :НШ0 пноль/мг Солка. В наших яг.сипvл • нонтах воличигм Волгю 200 нмоль/мг белка ни tu» получали. Tir: оягодояемде» количоеггп С|шпм1к'1»1|11х сайтов патрулнечю » «в«*, :

TC(I, 'ITC ("!'■ Я':[-:>:н|!-'' 1Г>УЧ«1ДИ П ЗЛСчП'О С ОЧОН', mir Г. ОЙ (»'I >. t

1 нх1'/нд), и подтоку ни определяемой концентрацией божка. Коли-чесгво б)1лк.-1 и н.н. 200 кДа, оцененное по площади пика нл рисунки 1. оостапляот о поло 13* от суммы белков роздажоииых на Ю£Х.

----------------------------------Таблица 4 . Включения Зи-угФ

Франции Нклг.ченио Зц~ут* в ГИК хроматина из Пророст-имп/мин X ков хлопчатника в присутст-------- -----------или ПУК и Фрикций пояучвн-

Контроль :>SB7¿-23 100 них с помощью li'JÍX..

КУК (ЮмкН) 121 Примечание. Концентрации

200кДаН)УК 71(101351 iag белка во Фракциях из-за низ-

ЬОкДаШУК 122 кой концентрации но опреде-

ЗОкДа*ИУК 4520+207 12ß лялась (монпо 1 ыкг/нл).

1ГлсДа»НУК 44071 P.34 125

ИкДа+ИУК 43001203 120

Дли оценки сувъпдиничиого состава очинённого белка. с м. м. 200 КДа с ним проводили электрофорез в Г1АЛГ с ДЦС-натрия-Как видно из рисунка 2 очи^опный,обладающий способностью стимулировать синтез РНК,ЛОБ с «пжуаюйсн и.и.200 КДа состоит из субъедтшц по 43 кДд

Можно ли называть выделенный нами болок ауксиновыь роцопторон? По-видимому,да,так как он обладает двумя основными свойствами рецепторов: специфически и с высоким сропством сивзываот молекулу мо-диатора и в присутствии медиатора активирует эффекторную функцию. Валок с такой ке примерно молекулярной массой и'способностью активировать зависимый оУ.ИУК синтез РНК был выделен Неннесом с соав. (Mennes at al.,1087) из культуры клеток табака.По-видимому,так называемый АСБ-Я с м.м.190 кДа состоящий из субъединиц по 40 к Да выделенный из фракции водорастворимых белкой проросткои мава (Salt« i, 1(105) также пналогичои этому белку,хотя авторы и ие исследовали его IM способность активировать синтез 1'ИК.Дли растений табака получены

lt.1T

То

-Э-Кт

Рис. 2. ДОИСИТУГРТ'ИЛ ||';'.»уч I.

Тс»ТО 11 Г'Л'.!КТр01'0р» -1.x 1' '• С л>' с

ДДС-н.т?рин С-оякп о Испо*1,-1')иали с»"лут/ли 'р-

КОРНЫ" Г'ПЯКИ: 1-ЛЛ1-бУ11!1И би-•:»й <07 к Да), 2-пл1.бумЧ1! пич-нпЯ С!Г) кД'О, З-корбоксиан гидрзза (ЯП г.Да), 4 -счгнбитор трипсина (20,1 г.Да), 5-нио'-гдобин (.17,0 г Да >, 0 ¡;ито-хром С (1?,кДа).

данные о том, что ауксин выпивает изменения а транслинии споцн'5"»'-!Лс-кик вилоЧ мРИК (Уг.л гпп1 «Л а 1. ,1887). Проделанная помп рлг-ота позволяет разливать исследования в направлении выяснения:гннтоз каких нРИХ и соотвотствухздих им бол коп активирует рпстпорммиЯ аукси-ноомй рецептор, а такжч' ««зучоиия механизма отоД пктиплпии. Глпрябо-тзнныо п работе мотоды получения ауксинспязиваклтпх белкой поэполчют раэвипать и другое практически важное направление - пергаппыП скрининг полых регуляторов роста реетеинй.

Поиск соединений, действующих на водорастворимое лев.

Для обнаружения соединений,действувашх на растпоримыо ЛТО,г-ылн исследованы около 50 доступных нам Ьеществ.длп которых имелись указания о стимуляруадом пли гербйцидном действии на растоиич.8 результате работы впервые выявлено действие на растворимые ДСП 2 соединений из группы металлсорганических комплексонатов ХТС-1 и ДЛХЦ, рчдп предста&итадеа из бодызой группы синтетических накроцикяичоских кон-плекссмов - крэун-зфиров,тиреоидного гормона животных - тироксин;! и известного фитотохеин?,предлагаемого на роль фитогормспа - ^у^ик-к-цкна. Наиболее интересные результаты рассматриваются ииго и отдельных разделах.'

Действие тироксина на растворимый ауксин с ткндниицие балки.

МИ чвин'Г'-л'осовлшсь двумя публикациями. Н одной из них сообщалось, что экстракты из водоросли Spiral inn piwUmBib язлйютса эОектньннми стимуляторами ьсхосестм с^мим хлопчатника (Каримова X . ,Тураиулов Я. X . , 1 981 >, с, ь другой, что и экстракта*, cmtriy чипы со-дерхитсл тиреоидиый гормон днвотных-тирокож 'Баб imii Т.Д. и др., löftrt). Наши эксперннеыи ло изучен?.» действия тироксин.* па всхожесть семян хлопчатника показали,что тироксин » концентрациях 10 нМ - 100 нМ увеличивал асе показатели прорастай.юетн (:>неггия про-¿'¿»сгания, исхожесгь.сила госта 1сь-ия»(, имевших попижшшу» похожесть, ti последующий работа тироксин был исследован в экспериментах с растворнммми АСЕ.Эти эксперименты покапали (Рио,3 и ТаСл.5),что, j-o корни.-?, тироксин конкурентна ингибируст связывание 3Ii ЛУК с растя-ipiiHUMH АСБ с Кинг-3 нН.И во вторых,тироксин аналогично ИУК активировал 'зависимый от присутствия растворимых ЛСК синтез ГНК in vitro в препарате хроматина из проростков хлопчатник.], содержащим эндогенные гик-полннерамь.То есть,тироксин по отношению к ftСБ проявляет свойства прямого конкурента ауксина.

IIa основании изучения взаимосвязи структуры и активности различных ауксиноь возникло предположение,что для проявления аукси-новой активности у различных соединений необходимо, чтобы у них присутствовала карбоксильная группа и чтобы отрицательный эарид нонннкамиий при диссоциации этой группы был бы удален от Колее слабого положительного заряда на расстояние 0,55 им (Уоррнпг Ф., 4-иллнпс И.,1004).Если на основании нмеюцнхен в литературе давних о структуре молекулы тироксина <Гуссиковский К.,Бабаев Т.,1885) построит»., его молекулярную модель,то из не« будет видно, что при •¡р^х возможных пололониах нланиново^ части на расстоянии Г,.г)5 нм от гидро»-сильного кислорода карбоксильной грушш ногут ннходитьег .-•гомы, у которнх »¡плот возникать полохмтол1.ммй лярял: ?■ п П атомы

НО

I

MYK

Тироксин

семян хлопчатника и предположить,что в Фиаиологичесгих тэстях гиро-

Ео.ньиен группа синтетических макроциклических комл.'.оксолов -крпун-эфиро» - обладает'инроким спохтром биологической активности (Богатокий A.B.,1003).Имеется сообщение,что некоторое предстевнтв-

лируют всхожесть сонлн рядо растений с последующим увеличением их зеленой массы (Кравченко и др.,А.с.,1582). В связи с там, что все ¡этапы жизни растений,начиная с прорастания сомян,запускаются и ре-

ри.стличамчиеся размерами кольца,были исследованы в экспериментах с растворимыми нуксинсвяэывающими белками.

'Как видно из таблицы 8,все изученные краун-эфиры с размерами "полости" макроцикла от 4 до 10 атомов кислорода,включая и псевдо циклический аналог дибензо~1В-краун-В ингибируют свяяыэаиис И-ИУК с Фракцией растворимых ЛСБ. Концентрации полумаксималыюгс ингиби . гооония (КингЗОХ) кроун-эфиров находятся примерно в тон порядке кснцянтраний.что и для ПУК.Графики в двойных обратных координатах кривых связывания различных кснцентрвций Зн-КУК -с фракцией ЛСБ в присутствии двух концентраций краун-эфиро (Е'ис.4) указывают на конкурентный характер ингибированип. Эксперименты в которых изучали синтез П1К 1п показали,что краук-гфиры также каг и ИУХ сти-

мулируют утот смпсэ. Таким образом, в экспериментах с растсорикнма ЛСБ крауч-эфиры ведут есе:г аналогично прямым конкурента« ЮТ." '

ксни будет нроязлпть ауксппподобно'З действие.

Л^йстпио кроун-зфнрив на раствэрнные АСБ.

гулируются системами растительных гормонов.х-ыаеуказанныо крауи-эфи-

- Ii -

Краун-афнр

Kimrí'UC

'l'núüvr.ia Q.

KüHHtiHTpfiUtiii ./o;./tut: шимыюго inu-iM.tipcujä-

ИУК

Дихлорматилбанзо-1Ъ-краун--5 Дитратамилдибонэо-ЗО-криун-0 КЗ-краун-ß (с ацотоиитрияом)

3 нМ мня стпииачия -ПУН

3 нМ <3 нМ> с Фраг.ци<:й лег;

4 мМ очищенных а'И.ы.т.й 10 им хроматограф-iturt рлзлич-

Осевдоциклнчиский аналог 18-краун-З 20 нМ ними краун-^иряии

Дибонэо-lil- краун-б 15-краун -5

Дивалерилдибеиэо-Ю-враун-8 Дкнтороутилдибензо-lö-краум-б Диацетилднбонзо-1а-крлун~6 Дибензо-24-крауп-8 йакэо-J2-Kpayn~4

22 нН 20 ,/¡1 3h нМ •15 lili 4Й ИМ 50 ИМ Ь7. нМ

Гис. 4 . Ppfi'l ик л Д[ -.Иных обоат-ных координатах сьяэмрннпя различных концентраций Н-НУК с фракцией AGB и отсутствии (1) кряун-эфира и в присутствии 18-краун-8 в концентрацн-

' г, 0,1 3„°,5¡ÍL tai их 10 НИ (2) и 1С0 нИ (Э).

1/кснцентрация Н-ИУК, I/M

У всех известных ауксинов присутствует карбоксильная группа способная при диссоциации- образовывать сильный отрицательный заряд. Для ACH из мембран кслеоптилей кукурузы устаноплонз тзрпич-иая структура (Xnohara ot al..1860) из которой пидно.что а составе этого балка импотсп насколько оснопных групп, например остатк-f лизина, с которыми могли бы связываться ауксины с помець» сво<дг. клгсогсил^ней группы,

a f v

гУ 1

à

rfn.

I ]

Л«*ло(>мнти* - К-16-к-S Дитрчтнмил -ДВ-ЗО к- 111 111 к-G

Inc.S.. Структура iKMiororux исслидг.iuiiiiimi крпун-зфнроп.

Краун -эфчрм к их отмч'тоцншшо тм ноги - подан дм благодаря сын)Я характерной сгрукт/рв (Гнс.5) могут,помимо конажопсчи v катионами ряэхн'шмх металлов.образовывать комплексы типа "гость-хо-:>пни" с совдимениями,имеющими аминогруппы,поляриэо/ткнно имг.«»о--группы и да*о аронатнччскиг» омини (фегтло Ф. и др., ЮСО) .Поатону, шшжпл попиосно.мти крпуи-эфиры,образуя комплексы с иоложнтолын» эпрнхсншими группами » пуксинспязыватцмх сайтах на АОП,активируют эти бол пи, как и в случао спяпыпания Аитогормона.

Нави попытки выпоить какую-либо корреляции можду структурой не-«одон?(иных крауи-эфиров и стоппнып их сродства к A4 В ocofjx. р<» эудьтлтои no принесли.Но-видимому,для этой ш:*и необходимы споци-мышо исследования рядов фуикцнонализироианных произподных краун-эФирчв.Иы обнаружили,только некоторую корреляцию мекду растворимо-сты) враун-:1Фироп в подо и способностью связываться с ауксинсиязи -вающчни спйтлни.

Таким образом, результаты наших исследований могут объяснить стимулирующий действие краун-зфнров на «схожесть семян и предполагает пуксинполобпос действие их в Физиологических тестах.

4.у зпкоккин и фракция растворимых ауксиисвягшвамщих белков.

фузикокцин (ФК) основной Фитотоксический метаболит из гриба Fusicoooiim Amygdale является патогенным для многих рестений (Bal-1 i<> et. в.|., 1УВ1 >. В физиологических экспериментах, в тканях, от-спмяюцяих на ауксины, ' ФК во многих отнотежшх имитирует дойеттю я.-'кечн-п !- концентрации .от 10 нИ до 1 мхМ. Имеются также до/.рэй-rv.'^crn!. ЧТО К • i ИХ (ШСШИХ Г'дстеккй г.р:!С.УТСГ«Т~? ''¡¡¡Л" Г'-:'.ГГГ:1

ФК-подобний хневнц (Л(1оое 1 ь1., ЮйО). В синаи о зтик > т.рьш зе иссявдоиагелей механизма действия »К возник нопрос: пи доист-вунг ли -1К и фуксин чараэ одни и ти яа рецвптори? Пксп.-грмм.щIи начешш апологом '{К пока за ли, что *К свяэнвается с ь-ш.-окнм с.-|..-дг. г ион (К>1-1 Ь нН) г. кеиорыншнн и иикрлсамалышнн фракциями из кй-леонтилай ».укуру.ш <ОоЬгтапп е1 а\., 1077) и листьев шпината <Ьа-1Ни в1., 10Ш1), и и обоих случаях ауксини иа дейстпоиэли н» связывание 4К. Убедительных данных об отсутствии действии пн Различные тнгш ауксиисеизипаюннх сайтов ни и» об.шруяини, ш»т»му в нас то>,11|гл1 работе ем «о предпринято исследований действии в экс;)<?рниен гвх с раств.-.ринипи АСБ из гипокотилей хлопчатника.

600 0-тлЧ Рис.в. Счтчииаппе Зн-ИУК г»

. концентрации 10 нН с фракци-

'Г

400 п присутствии рачлич

м них концентраций немеченой

<в ц

8 2 ь-А ПУК О) " *к (2).

о л

# I

г» г: 13 я о к

- (д концентрации ,Ы Эксперимент полазили,что ФК иигибирует специфическое связи-ынио ^Н-ИУК с фракцией растворимых АСБ ( Рис. 0). Ингибированиа йыло неп-^лним.то ость, не превышало ййХ.Эксперименты по определению типа ингибированин дали криииа,которые трудно интерпретировать.Эксперименты, в которых изучали влияние на синтез РНК, зависимый от присутствия ЛСв,показали,что ФК стимулирует вуксинзаписимый синтез РНК уИ:<-о. Результаты вышеописанных экспериментов могут укьэы-вать на то,что АС13, ответственный за регуляцию активности гвиоа,полет иметь н ФК-свчзинающий сайт. В настоящее время известно много ендов белковых рецепторних комплексов (например, нсЧрорвцопторнив),

в которых одной яффакториой функцией ногут управлять несколько различных лигакдап,имеющих собственные связывающие сайты.В этих кимп-лексях связывание каждого из лигандов может оллостчрнчески зависеть от связывания остальных лигандов.Изученный нами лее имеет кахуиуюся н.м. ехоло 200 кДа и состоит из субт>вдиниц с н.м. 43 кг.в, поэтому шюлив можно допустить присутствие на одной из суб-ьединиц и ФК-свя-зыввющего сайта.

Несмотря на то,что действие ФК на растения изучается ужо около 15 лот,п публикациях,посвящс-.нных этой теме,мы но встречали уки-зяиий на способность ФК активировать синтез РНК или но то, что ФК-свиэмпапщме сайты ногут присутствовать во Фракциях растворимых балков. Это говорит о том, что наши результаты следует рассматривать как. предварительные, нуждающиеся в подтверждении, например,в экспериментах по связыванию радиоактивно меченого ФК.

ВЫВОДЫ

1. В препаратах мембран и экстрактах водорастворимых еолкоп из гн-покотилей проростков хлопчатника обнаружены сайты", специфическ!' ti с высоким сродством связывающие меченый ауксин.

2. Из экстрактов водорастворимых белков гипскотилой хлопчатника с помощью аффинной хроматографии и последующей ВЭХХ выделан белок с кбкуйщейся н.м.200 кДа,состоящий из субъединиц с м.м.43 кДа.

3. Белок с м.м.200 кДа связывает Зн-ИУК с Kd=6 нм и в присутствии ИУК стимулирует синтез РНК in vitro в хроматине,содержащем эндогенные FHK-полимераэы.

4. Установлено,что тироксин и ряд представителей крауи-эфиров,являются прямыми конкурентами ауксина в экспериментах с АСБ,ответственным за синтез И1К.

5. Установлено также действие на АСБ Фуэикокцина и 2 соединений ме-таллооргвнических комплексонатов с сокращенным названием ХТС-1 и ДАХЦ.

- 1Й -

СПИСОК ОПУБЛИКОВАШШ* 1'ЛПОТ 110 TKMIÍ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Таканаав A.A.,Иешкурооа О.Н. Лилянаь Х.К.,Сялихии т.н. Отруктур-нофукциональнив характер, рйцопторов фитогормонп».и сб. "Проб.» .

и opeen.раав.химии природных и Физиол. актипних неитстп" Таык&нт, ФАн,18аа,с.17;н-104.

2. Ахмаджянов И.Г..Тонких А.К.,ГуссакопскиИ К.В. Дойстипа красного свата на специфическое сиязываниа моченого вугеина с препаратами комарам И") Проросткои хлопчатника.Тез.4 съезда физиол. Узбекистана. Ташкент,ФАН,1088,с.155-IS8.

3. Гонких Л. К. ,11ал*имоь У.К.Салихон Ш.И. и др.Поиск нопых стимул» -торов роста растопил на основа изучения гормон-роцкпгориого вчаи-модайстоин.Тез.докл.14 Мендв*.съезда по ойчаИ и прикл.химии.Мисч-ва,Наука, 1969,т 4,N4 ,с. г!)7.

4. Тонких А.К.,Сагдиав Н.1.,Салихов 21.И.Характеристика ауксинсвячиьа-ющих участков из проростков хлопчатника.Тез.докл. 10 оСъод.chmiüv«. биохим.обицэстп СССР-ГДР,Иоскиа. 1969, с.51.

6. Тонких А.К.,Напимопл Э.М,.Салнхов Ш.И. и др.О нвхаи.юнв стимулирующего действия крауи-эфиров на растения.Докл.АН УэССР,1ÖS0,HÖ,с,52,

0. Тонких Л.К.,Ли А.Н.,Салихоп Ш.И,Ауксинсвяэиваюций белок из аодцогэ экстракта пророеткоп хлопчатника активирует синтез РНК в препарата хроматина в присутствии ПУК и ФК. Тез.докл.2 Всес.еопец."Генетика развития'' т.1,ч.2,с. IUI.

7. Тонких А.К. , Салихов Ш.И. Обнаружение луксимсвязыоаюиих участков а проростках хлопчатника.Физиол.растений,18Ö0.T.37,Вып.4,с.727-732.

В. Тонких А.К.,Ли А.Н.,Салихов Ш.И. и др. Действие ФК на аукеинозиЧ рецептор.Тез.докл.2 съезда Всес.общества Физиол.ряст.Москва,1CÜU.

9. Тонких А.К. Действие ФК на ауксиновыа рецопторы.В сб. "Актуал! !>;-: о вопросы физиол. биохимии и биотехнол." ТашГУ,1991,с.ЯЗ-87.

10. Тонких Д..К. •, Ли A.B. .Селихов Ш.Н.Ауксинспязываюцие белки хлоггг»"! ! -нп.Тпз. чок" ■ 1 <п.и(1д« -»'яз-.юл.раст.у-.'Овкнстанл.Ташкент, J9;j: ,с. '• : ■•'..

1 i. Тонких А.К.,Ли А.П..Сплнхои Й. Н. Ay ксинсиизываюЕШе б«?«ки хлопчат. Тез.докл.5 конф.биох.Среди.Азии и Казахстана.Ташкент,ЮТ1,с. &37.

12.Тонких А.К.., Карась A.B., Салихов а.И. Способ получения ауксннре-цэлторпого Солка нз растений. A.C. 1735770 СССР Заявл. 25.10.89. tM74«ÖVe/13 Опубл. в ИЛ. 1872 К IS.

13.Тонких A.R. .Иаспмова З.И. и др.Краун-эфиры -ауксинподобние стимуляторы роста растений.Бнологич.науки,Н13Э,П 2 <3iö), с. 12В-133.

И.Илсниови З.М..Нодгннгдипови И.А.Криун-пФиры -гормошюдобные стимуляторы росл» растений.Тез.докд.конфор.Соврем.пробл.обией Фиэнол.н Ьиофиз. Ин-т физиод. и биофизики АН ГУэ, Ташкент, 1993, с.7Ь. 1Ь.Тонких А.К. ,liu(ia<;D Т.А., Гпгелы-анс а.И.Механизм аухеишюдосиого действия тмроксииа.Тез.деи*.2 юнф.биохим.Узбекистана.Ин-т бнохкн. ЛИ РУ, Твикент, НШЗ, с.175. 1Ü.Тонки* А. К., Вабтш Т.Д. н др.Неканиз» г у «счышдздИюго действия тироксина. Физиология растений 1805, т.42, И 2, с.И!5-200. 17 Л'рвчухаиепои U.A.,НасиМопп З.М.,Тонких А.К. и др.Нехшшзн стимулн-руищо.го действия граун-эфиров на растения.'Тея.докд.'конф. посшщ.7£-летив ТпвГУ,ТаикенТ, 10D5,часть 2,с.00. Ю.Пасиноям Я.К.,Тонких Л.К. н др. Изученнэ механизма дейстнви краун-эфирои на растения.Тез.докл.конф."Структура и Функция бнол.мембран" Ин-т Физкод. и биофизики,АН РУ,Тапконт,190S,с.Bö. 10.Тонких Л.К. .Оплихов И,И.Имдедснио из проростков хлопчатника пуксмн-связинмюцого «едка,регулируемого синтез l'HK. ХНС, 10!).'),НЗ,с.457-4Ь2.

Fy:in мижолларида аукеиибогяопчи окснлни аяратиб олив па упикг физик-кимёий хоссдлари.

Мазкуf пш р£зэ нихолдзридан ауксин борловчи оксилларни ажратиб олиш га унинг характерисгикалариги Ургпнивгя, куза нихоллари орк^.лн Фитогормон эум'.ин Гейдар пктнплигинн бошвэрик туривини ургзниигл,хонда ту оясплхар ор^- тп усншини бопхярупчигшрчии «здаига «атила ■••сч.

Ауаомнборловчн оконлларни алрятиб,олиа учуи аффин сорбент ИУК-ацотимидогоконлсяфароэа скнтозландн.хамда аФФин на яхориаФФоктып суюклнх хрокатографияни /и ичига ол/очи комплекс матод накис! чнкилди.Уч купли» а нияоаларннннг пню котилиЯлнр.ч эрувчм оисилларнн нкетраитидан 200 *Да и.о. :>ги оксил авраткб олннди.У 43 кДп суббирликдян гдвкиа топган на специфик лолдл юкори аффинликди ¿Ii-И/К-ни биглайди на ауксин иятирокида tjfaft нихол» кроннтннида РНК пинтиэшм стнмуллайдк, ят>нн пнмар а;:тмилИ1'иги лдвобгпр ауксин рацопторчга мапсуб зсоссаларни к/риитади.Лнняланншиа./ргннилгач сшгготик макро-циклик компликсоилнр -краун-одмрлар 12 накклининг xiikmisoi; хамда хайпоплар горионм -тироксин PUK синтозини бо&клрилиан-га аакобгир пуксин рвципторягп тач.сир к^члиадп пуксин биашн туррн конкуринтдир.Еу роцйпторга мага ух вудган Фисотоксин Фуэикокцин ва бир каичц моталяоорганик комнлнксонлар таъсирк урганилди.

iHolatlori and phyniijo-oheaical prupertiem of ttia auxin-blndin$ protulna fron cotton needling.

In thin work characteristics of auxin-bindine sites of both water-soluble extract and crude mombranea fractions have been studied with the help of radioaotive labeled indo-lyl aoatlo acid (%-IAA). To purify *uxin-bindinj? complexes tho affinity chromatography ыяз uaed. Indolyl acotic acid binded to aninohexy lsepliat-ose was uaed as a ligand. By affinity chromatography fractions enriched with lAA-bindinS si-teo него obtained from aqueous extract and solubilized mbzi-bri!;i4!5.rrotain3 isolated fron aqueous extract unlike the proteins isolated from membranes showed on increase of RHA-poly-oercoa activity in ehrcsi?tine prepereMons from cotton rrneH-

1 incB in the presence of IAA.Hjoh ute evaluate!! according to

incorporation of H-UTP .Evaluation of molecular r.aRs of •, au-xin-bindinjJ Riteo uaa ourried out by Bel-filtration. It Has ahovn.fraction purifiad froo aqueous extract yield a nunber of proteins with apparont *>asa from ZUO to 8 !«Da,but 200 ItPa protein oiily had RMA-polymerase activity .this protsin on EDS del elcctroplioreslB showed 43 kDa b^nd.It was diacovered the action oil lAA-bindJni with thia protoin of two metsloorganio cociplexonate.pliytotoxino - fuaiooccin,pnimol thyroid hormone-thyroxino, and nacrocyolic QonploxoriRte - crown-ethers.