Выделение и строение абиенана - пектина пихты сибирской (Abies sibirica L.) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

на правах рукописи

МАКАРОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ И СТРОЕНИЕ АБИЕНАНА - ПЕКТИНА ПИХТЫ СИБИРСКОЙ (Abies sibirica L.)

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

V НОЯ 2014

005555802

Новосибирск - 2014

005555802

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химии Коми научного центра УрО РАН

Научный руководитель: к.х.н., доцент Патова Ольга Андреевна

Официальные оппоненты: Базарнова Наталья Григорьевна д.х.н., профессор,

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Алтайский государственный университет, декан химического факультета

Абрамова Татьяна Вениаминовна, д.х.н. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, с.н.с.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Защита состоится « 24 » декабря_ 2014 г. в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан « /0у> ИМхА^^иЯ 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Пектины представляют собой сложные гетерополисахариды, относящиеся к классу гликаногалактуронанов - кислых растительных полисахаридов. Они входят в состав межклеточного пространства и первичных клеточных стенок молодых растительных клеток, где выполняют многочисленные жизненно важные функции, участвуя в росте, развитии и защите клеточной стенки, в клеточной адгезии, организации пористости стенки. Несмотря на значительные успехи в области структурных исследований пектиновых полисахаридов, в настоящее время тонкая химическая структура и полифункциональные свойства пектинов остаются на стадии обсуждения. Хотя отдельные структурные элементы пектина достаточно хорошо описаны в литературе и их строение выявлено, знания о взаимосвязях различных структурных элементов друг с другом и с другими полисахаридами ограничены и находятся в стадии прений. Идентификация связей в различных структурных элементах пектиновой макромолекулы приведет к более глубокому всестороннему выяснению структуры пектина и, соответственно, к лучшему пониманию растительной клеточной стенки.

Главными объектами изучения полисахаридного состава хвойных растений являлись составляющие древесины ствола - флоэма и камбий (молодые слои древесины, содержащие живые клетки), заболонь и ядро (содержащие в основном отмершие клетки). Показано, что флоэма и камбий характеризуются высоким содержанием пектиновых веществ (4.4-18 %), в то время как заболонь и ядро - низким (0.5-3.8 %). В то же время биологические процессы также активно протекают и в запасающих органах хвойных растений, в частности в древесной зелени, где происходит основное накопление метаболитов, в том числе пектинов, расходуемых в течение многолетних циклов на построение вегетативной массы растения. Известно, что молодые побеги содержат гораздо больше уроновых кислот, чем старая древесина ствола. Пектиновые полисахариды обнаружены в древесной зелени Picea obovata, Larix sibirica, Abies sibirica, Pinus sibirica.

Однако, к настоящему времени исследования пектиновых полисахаридов древесины и запасающих органов хвойных растений ограничиваются изучением моносахаридного состава.

Пихта сибирская Abies sibirica Ledeb. - крупное вечнозеленое хвойное дерево, является одной из главных лесообразующих пород таежной зоны европейской части России, Западной и Восточной Сибири. Возможность круглогодичного использования и достаточная обеспеченность сырьевой базой делает древесную зелень пихты перспективным сырьевым ресурсом для получения биологически активных полисахаридов. Эффективное использование древесной зелени пихты затрудняется недостатком сведений о динамике накопления, составе и строении водорастворимых полисахаридов.

Цель работы: Установление структуры абиенана - пектина древесной зелени A. sibirica. Задачи исследования: 1. Выделение, общая химическая характеристика, анализ динамики накопления и характера изменения моносахаридного состава пектиновых полисахаридов и связующих гликанов древесной зелени A. sibirica в течение года; 2. Установление общих закономерностей и особенностей строения углеводных цепей пектиновых полисахаридов древесной зелени с помощью методов химии углеводов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изучена годичная динамика накопления и характер изменения моносахаридного состава полисахаридов древесной зелени пихты сибирской. Оптимальным временем сбора для выделения пектиновых полисахаридов является осенний период, связующих гликанов — зимне-весенний период.

2. Макромолекула абиенана состоит из линейной области, представленной участками

частично метилэтерифицированного а-1,4-0-галактопиранозилуронана, и разветвленной области, представленной участками частично 2-О- и/или З-О-ацетилированного рамногалактуронана I (RG-I).

3. Боковые углеводные цепи RG-I образованы, главным образом, фрагментами высокоразветвленного 1,5-а-Ь-арабинана и AG-II, а также фрагментами AG-I (минорный компонент). Точками разветвления углеводных цепей AG-II являются остатки 1,3,6-р-0-галактопиранозы( AG-I - 1,4,6-р-0-галактопиранозы. Точками разветвления углеводных цепей 1,5-сс-Ь-арабинана являются остатки 1,2,5-, 1,3,5- и 1,2,3,5-а-Ь-арабинофуранозы. Остатки T-a-L-арабинофуранозы и T-ß-D-галактопиранозы находятся на невосстанавливающих концах боковых цепей. Особенностью данного полисахарида является наличие остатков T-ß-L-арабинофуранозы, находящихся на невосстанавливающих концах боковых цепей 1,5-а-Ь-арабинана.

Научная новизна. Впервые изучена годичная динамика накопления и характер изменения моносахаридного состава пектинов и связующих гликанов древесной зелени A. sibirica. Впервые установлены структурные элементы пектина древесной зелени А. sibirica и показано, что линейная область главной углеводной цепи представлена участками частично метилэтерифицированного 1,4-а-0-галактопиранозилуронана, а разветвленная область - участками частично 2-О- и/или З-О-ацетилированного RG-I. Боковые углеводные цепи RG-I образованы фрагментами высокоразветвленного 1,5-a-L-арабинана, AG типа I и AG типа II.

Практическая и теоретическая значимость. Показано, что многотоннажный отход деревообрабатывающей промышленности - древесная зелень А. sibirica, является потенциальным источником отечественного пектина, который может быть использован в составе функциональных продуктов. На примере А. sibirica разработан и запатентован эффективный способ получения пектиновых полисахаридов и связующих гликанов из древесной зелени хвойных растений. Данные о сезонных изменениях состава и содержания полисахаридов древесной зелени А. sibirica могут быть использованы при оценке качества и определении сроков заготовки древесной зелени, а также положены в основу разработки новых технологий комплексного использования данного сырья.

Результаты структурного исследования абиенана расширяют возможности для направленного изучения зависимости физиологической и биологической активностей от особенностей структуры макромолекулы. Исследование структуры полисахаридов древесной зелени пихты сибирской позволит расширить знания о структурных особенностях растительных полисахаридов. Данные о химическом строении абиенана могут быть использованы для выявления особенностей строения пектиновых полисахаридов других хвойных растений. Данные по биологической и физиологической активностям указывают на перспективность использования древесной зелени пихты как источника биологически активных веществ, обладающих ростстимулирующим и иммуномодулирующим действием.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научной конференции «Химия растительных веществ и органический синтез» (Сыктывкар, 2009), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2010), конференции «Химия и переработка биомассы леса» (Санкт-Петербург, 2010), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010» (Москва, 2010), VII Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2011), конференции "Фундаментальная гликобиология" (Казань, 2012), VIII Всероссийской

научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Калининград, 2013), II Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Саратов, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ: пять статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, один патент и 10 тезисов.

Личный вклад автора. Выполнен анализ литературы по теме исследования, проведено планирование экспериментов, получена основная часть результатов, проведена интерпретация и систематизация полученных результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах, содержит 27 таблиц и 27 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 159 источников, в том числе 119 на английском языке.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химии Коми НЦ УрО РАН (№ ГР 01201255402); при финансовой поддержке Программы ОХНМ РАН № 7, проект 12-Т-3-1018; Программы фундаментальных исследований, выполняемых УрО РАН совместно с организациями СО РАН, проект № 12-С-3-1007; Программы Президиума РАН № 9, проект №12-П-3-1024.

Принятые сокращения. Mw- средневесовая молекулярная масса, Mw/Mn -степень полидисперсности, СМ - степень метиэтерифицирования, AG — арабиногалактан, HG - гомогалакгуронан, RG - рамногалакгуронан, RG-I - рамногалактуронан I, ФГ -ферментативный гидролиз, Ara/"— арабинофураноза, GalpA - галактопиранозилуроновая кислота, Rha/7 — рамнопираноза, Xylp - ксилопираноза, Man/? — маннопираноза, Glcp — глюкопираноза, Gal/? - галактопираноза, Т - терминальный остаток.

Основное содержание работы

1. Выделение и общая характеристика полисахаридов пихты сибирской. При

разработке схемы выделения, позволяющей получать пектиновые полисахариды и связующие гликаны в нативном виде с максимальным выходом, были апробированы различные условия экстракции: варьирование температуры, рН реакционной среды, природа экстрагента и продолжительность экстракции; проведён сравнительный анализ результатов экстракции воздушно-сухого и свежесобранного растительного сырья. В результате для получения полисахаридов была разработана схема, согласно которой свежесобранную древесную зелень A. sibirica, заготовленную в первой декаде каждого месяца (г. Сыктывкар, Республика Коми), измельчали, последовательно экстрагировали этилацетатом и хлороформом для удаления экстрактивных веществ; далее методом последовательной экстракции растительного сырья получали пектиновые полисахариды: ASW (Н20, 70°С); ASa (водный раствор НС1, рН4.0, 70°С); AS0 (0.7 %-ный раствор (ЖЦ^СгО^НгО, 70°С); и связующие гликаны: глюкуроноксилан ASK (7.0 %-ный раствор КОН, 25°С), галактоглюкоманнан ASN (14.0 %-ный раствор NaOH, 25°С).

Показано, что в древесной зелени пихты присутствуют, главным образом, пектиновые полисахариды ASW и ASa и связующие гликаны класса глюкуроноксиланов ASk, содержание которых зависит от интенсивности ростовых и экспортных процессов, происходящих в растении в зависимости от его вегетационного периода (рис. 1).

В частности, во фракциях пектиновых полисахаридов к осеннему периоду содержание остатков GalpA достигает максимального значения (69 %), при этом снижается количество белка (до 3.5%) и крахмала (табл. 1). Таким образом, оптимальным временем сбора древесной зелени A. sibirica для выделения пектинов является осенний период.

III IV V VI VII IX X XI XII ..

Месяц

Рис. 1. Годичная динамика содержания пектиновых полисахаридов и связующих гликанов в древесной зелени А. 31Ыг1са

Таблица 1. Годичная динамика моносахаридного состава и содержания _белка в абиенанах А8уу и А5а-_

Содержание, %

месяц Оа1А а&\ Ага Ю1а Ху1 ас Мап Белок

АБ

I 50.0 12.3 15.0 2.6 0.3 1.7 2.3 16.0

II 37.0 12.2 15.5 2.0 0.5 2.0 2.7 14.0

III 43.0 13.3 16.0 2.2 0.5 2.5 3.4 14.0

IV 53.0 10.4 16.0 2.6 0.4 3.6 3.5 10.5

V 36.6 8.7 16.0 1.9 0.4 8.8 4.3 13.5

VI 52.8 9.8 16.0 3.1 0.4 7.5 5.1 5.0

VII 60.0 7.3 15.0 1.7 0.4 7.0 3.6 5.0

IX 61.1 8.5 15.0 3.3 0.5 3.1 2.1 5.0

X 56.0 7.0 15.0 2.0 0.4 5.8 3.6 9.1

XI 37.5 11.1 15.1 2.9 0.4 3.3 3.3 26.0

XII 49.0 10.0 15.5 2.7 0.4 2.1 2.9 14.0

Ав а

I 53.8 16.7 9.7 3.9 0.5 4.4 4.8 5.5

III 56.0 8.7 4.7 2.5 0.5 3.8 4.5 12.7

IV 52.3 8.9 2.9 2.9 0.8 12.2 7.5 11.7

V 37.0 7.0 2.5 3.5 0.6 39.7 3.5 3.8

VI 25.5 6.5 4.3 2.7 0.5 53.0 5.3 2.4

VII 33.0 5.7 3.3 2.1 0.5 48.0 4.3 2.8

IX 62.4 8.1 4.8 3.8 1.2 10.0 5.8 3.7

X 69.0 7.0 5.7 1.8 0.2 9.3 3.2 3.5

XI 50.0 10.5 8.7 3.1 0.7 3.9 6.0 7.7

XII 57.3 9.1 8.5 3.6 0.7 3.8 3.9 6.5

Оптимальным временем сбора древесной зелени A. sibirica для выделения связующих гликанов является зимне-весенний период, поскольку в это время снижается содержание крахмала.

2. Исследование структуры абиенанов ASw и ASa.

Строение углеводной цепи пектиновых полисахаридов A. sibirica устанавливали классическими и современными методами химии углеводов. Спектры ЯМР исходных полисахаридов характеризуются высокой степенью сложности, поэтому для установления структуры использовали фрагменты исследуемых пектинов, полученные с помощью частичного кислотного и ферментативного гидролизов, распада по Смиту.

Для фракционирования и очистки полисахаридных фракций применяли ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-проникающую хроматографию на сефадексе G-25, сефакриле S-500 и S-300. Для химической характеристики полисахаридных фракций использовали спектрофотометрические методы определения содержания гликуроновых кислот, метоксильных групп, белка, определение удельного вращения. Моносахаридный состав устанавливали методом ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов, молекулярно-массовое распределение - методом ВЭЖХ. Для установления мест и последовательности присоединения моносахаридных остатков, типа гликозидных связей, размера окисных циклов моносахаридных остатков, конфигурации гликозидных связей, распределения остатков между основной и боковыми цепями, длины боковых цепей использовали спектроскопию ЯМР. Спектры 13С- и 'Н-ЯМР расшифровывали с помощью двумерной спектроскопии TOCSY, COSY, HSQC, ROESY, НМВС.

В качестве исходного материала для получения и исследования структуры пектина использовали древесную зелень A. sibirica, собранную в октябре. Установлено, что в состав углеводной цепи абиенанов ASW и ASa входят, главным образом, остатки Gal А (СМ 58 и 35 % соответственно), Ara, Gal и Rha (табл. 2).

Ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе (СГ-форма) показано, что абиенаны ASW и ASa состоят, главным образом, из пектиновых полисахаридов с высоким содержанием остатков a-D-GalA, элюируемых 0.2 М NaCl (ASW-D2 и ASa-D2) и 0.3 М NaCl (ASii~D; и ASa-D3), имеющих близкую средневесовую молекулярную массу и отличающихся соотношением остатков GalA, образующих кор пектина, к сумме остатков нейтральных моносахаридов, образующих боковые углеводные цепи (табл. 2).

В результате частичного кислотного гидролиза абиенанов AS»j и ASa 0.05 М ТФУ (4 ч, 70°С) получены полисахаридные фрагменты ASn-H, ASa-H (табл. 2).

Из водно-спиртовых супернатантов выделены полисахаридные фрагменты ASf¡~Hi и AS.4-H,. Моносахаридный анализ полимеров ASrH, (GalA:Ara:Gal:Rha 7.5:14.5:1.2:1) и ASa-H¡ (GalA:Ara:Gal:Rha 5.6:2.9:3.6:1) выявил высокое содержание остатков Ara и Gal, а также Rha и GalA - характерных компонентов боковых и главной углеводных цепей RG-I (табл. 2). Фракции моно- и олигосахаридов, выделенные из спиртовых супернатантов гидролизатов, состоят, главным образом, из остатков Ara (до 50%).

В результате последующего гидролиза фрагментов AS^H (1.0 М ТФУ, 4 ч, 70°С) и ASa-H (0.4 М ТФУ, 4 ч, 70°С) получены полисахаридные фрагменты AStv-H2 и ASa-H2, при гидролизе которых 2М ТФУ (1.5 ч, 100°С) выделены галактуронаны AS„~II3 и ASa-H3 (табл. 2). Данные ЯМР спектроскопии подтверждают наличие в углеводной цепи галактуронанов ASw-H¡ и ASa-H3 участков, состоящих из остатков 1,4-a-D-GalA (рис. 2). Таким образом, кор абиенанов A Su - и AS., состоит из 1,4-а-0-галактопиранозилуронана.

Таблица 2. Характеристика абиенанов ASW, ASА и их фрагментов

Выход, %' 20 M о Mw, кДа Mw/ Mn Содержание, вес. %

Фракции GalA Gal Ara Rha Xyl Glc Man Fuc Белок

ASW 2.72 H.O. H.O. H.O. 59.0 7.0 15.0 2.3 0.4 1.9 2.4 1.0 5.3

ASw-S 0.12 -68 12 2.0 5.1 2.6 64.0 1.5 0.5 2.5 3.9 - 1.8

ASw-Do 5.4 -2 H.O. H.O. 5.1 14.5 47.1 2.3 1.2 9.1 15.9 1.8 4.7

ASW-D, 5.0 H.O. H.O. H.O. 17.0 33.0 31.8 3.6 1.1 4.1 3.8 2.1 5.5

ASw-D2 37.5 +172 76 5.7 54.4 8.5 9.2 4.0 0.3 0.8 1.6 1.3 5.3

ASW-D3 31.6 +244 85 3.1 80.0 2.0 3.0 3.9 0.8 1.2 0.4 - 4.5

ASW-H 79.0 H.O. H.O. H.O. 67.0 8.5 8.4 2.4 0.4 1.7 2.2 1.2 5.0

ASW-H| 1.8 +16.0 12 1.7 27.0 4.4 52.3 3.6 1.4 2.3 2.1 2.3 H.O.

ASw-H2 52.2 H.O. H.O. H.O. 75.3 9.4 1.4 2.3 0.5 2.0 2.8 1.1 2.3

ASW-НЗ 16.5 +334 H.O. H.O. 96.0 - - 0.8 - - - - 1.8

ASw-D2-F 11.6 H.O. 180 10.7 86.0 1.0 1.5 1.0 0.6 2.7 - 4.1

ASa 3.52 H.O. H.O. H.O. 67.6 7.0 10.0 2.4 0.4 2.2 2.4 1.0 3.0

ASA-S 0.12 -65 12 1.8 9.7 3.6 48.0 1.6 0.7 3.7 6.8 - 1.8

ASa-DO 5.9 +4 20 3.1 5.9 11.4 45.8 2.3 0.9 8.5 12.0 1.2 3.4

ASA-D, 6.4 H.O. 21 2.9 21.0 22.2 14.5 3.1 0.8 5.8 2.4 2.3 5.1

ASa-D2 41.4 +196 111 5.6 60.0 9.0 7.4 4.4 0.4 1.7 1.7 1.4 3.5

ASa-D3 31.8 +296 140 8.6 87.0 1.6 1.9 3.5 0.2 0.4 0.2 0.6 3.3

ASA-D4 3.6 H.O. H.O. H.O. 74.0 3.0 2.5 5.3 0.2 3.7 0.8 - 6.1

ASA-H 80.0 H.O. H.O. H.O. 68.3 7.0 3.5 2.4 0.2 2.2 2.6 1.1 3.0

ASA-H, 3.7 +51 13 1.7 29.0 18.6 15.2 5.2 1.4 5.9 3.9 2.7 4.3

ASa-H2 63.0 H.O. H.O. H.O. 74.5 8.3 0.6 2.0 0.2 2.5 2.3 0.7 2.7

ASA-H3 24.0 +336 54 2.7 95.0 - - - - 0.5 0.2 - 3.1

ASa-D2-F 10.1 H.O. 179 10.3 85.0 1.2 1.3 1.1 0.5 2.9 - - 2.1

- от исходного абиенана ASw или ASa; 2 - от массы воздушно-сухого обезжиренного сырья.

В спектре 'Н/|3С HSQC (рис. 3) фрагмента ASa-Hj наблюдаются сигналы С/Н-атомов СН30-групп при 54.0/3.80 м.д. и метальной группы ацетата СН3СО- при 21.8/2.18 м.д., которые указывают на наличие в абиенане ASa участков, состоящих из остатков, метилэтерифицированной a-D-GalpA (СМ 29%) и ацетилированной a-D-GalpA (СА 7%).

В резонансной области аномерных атомов спектра 'H/I3C-HSQC фрагмента ASA-Ht (рис. 3, табл. 3) наблюдаются интенсивные сигналы остатков a-L-Rhap (С1/Н1 100.3/5.21, 100.3/5.20 м.д.). В сильном поле присутствуют сигналы С6/Н6 при 18.0/1.25, 18.0/1.32 м.д., обусловленные СН3-группами остатков a-L-Rha. Кроме того, в спектре 'Н/,3С HSQC наблюдаются корреляционные пики С2/Н2 (77.8/4.12 м.д.) и С4/Н4 (80.2/3.68 м.д.), указывающие на присутствие остатков 1,2- и 1,2,4-ди-О-замещенной a-L-Rhap. Данные гомоядерных двумерных спектров COSY, TOCSY и ROESY подтверждают присутствие вышеуказанных остатков a-L-Rhap.

Рис. 2. Спектр 'н/,3с HSQC галактуронана ASa-H3

Рис. 3. Спектр 'Н/|3С HSQC фрагмента ASa-H,

Соотношение интегральных интенсивностей Н6 остатков 1,2-a-L-Rhap и Н6 остатков 1,2,4-a-L-Rhap спектра 'Н-ЯМР фрагмента ASa-H, составляет 73:27, что указывает на наличие участков линейного и разветвленного RG.

В спектре ROESY фрагмента ASA-Ht наблюдаются корреляционные пики: Н1/Н2 при 4.96/3.72, 5.09/3.73 м.д., Н1/Н4 при 5.09/4.45, 4.96/4.45 м.д. которые указывают на наличие фрагментов углеводной цепи: ...—>4)-a-GalpA-(l—>..., ...—>4)-a-GalpA(OMe)-(l —>..., a-Gal/?A-(l—>.... Кроме того, в данном спектре наблюдаются транс-гликозильные корреляционные пики: Н1 остатков a-L-Rhap с Н4 1,4-a-D-GalpA при 5.21/4.45 м.д., Н1 остатков a-L-Rhap с НЗ 1,4-a-D-GalpA при 5.21/4.11 м.д., Н1 остатков 1,4-a-D-GalpA с Н2 1,2-a-L-Rhap при 5.01/4.11 м.д., свидетельствующие о наличии в углеводной цепи

фрагментов: ...^2)-а-Ш1а/>(1—>4)-а-Са1рА-(1 —и ...—>4)-а-0а1рА-(1->2)-а-Ш1а;Н;1->-....

Таблица 3. Химические сдвиги сигналов 'Н- и |3С-ЯМР фрагмента А8Л-Н,

Остатки С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С-6

Н-1 Н-2 н-з Н-4 Н-5,5' Н-6,6'

-^4)-а-Оа1рА-6-ОМе-( 1 101.3 69.4 69.5 79.7 72.0 171.7

4.96 3.72 4.00 4.45 5.05

—>4)-а-Оа1рА-( 1 —» 101.3 69.4 69.4 79.9 71.5 174.0

5.09 3.73 4.00 4.45 4.97

—>4)-а-Оа1рА-( 1 —>-2 100.7 69.7 70.9 79.9 71.5

5.01 3.93 4.11 4.45 4.97 174.0

—>2)-а-К11ар-( 1 —» 100.3 77.8 72.2 73.0 70.7 18.0

5.21 4.12 3.87 3.44 3.64 1.25

—>2,4)-а-Ш1а/?-( 1 —» 100.3 77.8 72.6 80.2 69.1 18.0

5.20 4.12 4.08 5.6« 3.73 1.32

Р-Оа1р-(1—► 104.9 72.6 73.4 69.8 76.2 62.1

4.42 3.56 3.64 3.92 3.68 3.78:3.72

—>4)-|3-Оа1р-(1—>4 105.2 72.6 74.5 78.8 76.0 62.1

4.63 3.68 3.80 4.15 5.70 3.81:3.78

—>4,6)-Р-Оа1;>-(1—» 105.5 72.6 74.5 78.8 74.7 _

4.61 3.52 3.79 4.15 3.91 4.04:3.92

Л» /-1 1 /1 105.0 72.6 83.0 н.о. 76.0 61.9

—>3)-р-Оа1/?-(1—♦ 4.68 3.82 3.87 4.20 3.70 3.78

—+2,3,5)-а-Агау^( 1 —> 108.0 86.4 85.2 81.5 67.9

5.23 4.29 4.08 4.24 3.94;3.84

—>5)-а-Ага/-(1— 108.9 82.5 77.8 83.6 67.9

5.08 4.12 4.01 4.19 3.86;3.81

->3,5)-а-Аг%/"-(1 —> 108.6 80.5 82.7 82.2 67.9

5.10 4.27 4.09 4.28 3.93:3.83

а-Ага/-( 1 —>2 108.2 82.4 77.8 85.2 62.4

5.14 4.13 3.96 4.03 3.85:3.75

а-Ага/-(1—> 108.2 82.4 77.8 85.2 62.4

5.17 4.13 3.97 4.07 3.85:3.75

а-Ага/-(1—+ 110.5 82,5 77.8 85.2 62.4

5.25 4.21 3.98 4.10 3.80:3.71

В спектре ЯОЕвУ фрагмента также присутствуют корреляционные пики Н1

с НЗ, Н4, Н5 остатков 1,4-Р-В-Оа1/? при 4.63/3.80;4.15;3.70 м.д., указывающие на наличие фрагмента: ....—>4)-р-Оа1р-(1—1-4)-Р-Оа1/?-(1 —>...; а также корреляционный пикН1 остатков 1,4-(3-В-Оа1р с Н4 1,2,4-а-Ь-КЬар при 4.63/3.68 м.д., возможно, указывающий на замещение остатков 1,2,4-а-Ь-ЯЬа/? по 4-му положению остатками 1,4-р4)-Ста|р.

Установлено, что в состав углеводной цепи полисахарида А8ц~Н/ входят участки 1,4-а4Э-Оа1А. метилэтерифицированной (СМ 21 %) и/или ацетилированной (СА 32 %) 1,4-а-0-0а1А. на это указывают сигналы в спектре 'Н/ЬС ГОС>С С/Н-атомов СНзО-групп при 55.6/3.81 м.д. и метальных групп ацетата СН3СО- при 23.0/2.14;2.18 м.д. (рис. 4).

8

Рис. 4. Спектр 'н/13с HSQC фрагмента ASlrH,

Сигналы остатков a-D-GalA, наблюдаемые в спектре 'Н/13С HSQC фрагмента ASiy-Hi, имеют низкую интенсивность. Это можно объяснить более низкой степенью свободы остатков GalA. Напротив, интенсивные сигналы остатков Ara свидетельствуют о высокой подвижности данных углеводных цепей.

В спектре ROESY фрагмента ASw-Н/ установлено присутствие интра- и транс-гликозильных корреляционных пиков: Н1 с НЗ, Н5,5' остатков а-L-Ara/ при 5.08/4.00, 5.08/3.87;3.81 м.д., указывающих на наличие фрагмента: ...—>5)-а-Ага/"-(1—>...; Н1 с НЗ, Н5,5' остатков 1,2,3,5-три-О-замещенной a-L-Araf при 5.23/4.08, 5.23/3.95;3.85 м.д., указывающих на присутствие точки разветвления боковой углеводной цепи: ...—>2,3,5)-а-Ага/(1—►...; Н1 остатков T-a-L-Ara/" с Н2 остатков 1,2,3,5-a-L-Ara/ при 5.15/4.30 м.д., указывающих на замещение остатков 1,2,3,5-три-О-замещенной а-L-Ara/по 2-му положению остатками T-a-L-Ara/; Н1 остатков Т-a-L-Ara/ с НЗ 1,3,5-a-L-Ara/ или 1,2,3,5-a-L-Ara/ при 5.17/4.08 м.д., указывающих на замещение остатков 1,3,5- или 1,2,3,5-a-L-Ara/по 3-му положению остатками T-a-L-Ara/; Н1 остатков 1,2,3,5-a-L-Ara/с Н5,5' остатков 1,5-a-L-Ara/при 5.23/3.81;3.87 м.д., указывающих на замещение остатков 1,5-связанной a-L-Ara/"по 5-му положению остатками 1,2,3,5-три-О-замещенной a-L-Ara/?

Спектр НМВС подтверждает присутствие вышеназванных остатков а-L-Ara/ Кроме того, в спектре НМВС присутствуют корреляционные пики: С1/Н5;5' при 110.2/3.87;3.81 м.д., С5/Н1 при 69.5/5.08 м.д., подтверждающие наличие в углеводной цепи фрагмента: ... —>5)-а-Ara/( 1 —>5)-а-Ara/:( 1 —>...; С1(Т-а-Ага//Н2(1,2,3,5-а-Ага/ 109.6/4.30 м.д., С1 (Т-а-Ara/)/H4( 1,2,3,5-а-Ara/) 109.7/4.23 м.д., Н1(Т-а-Ага/)/С4(1,2,3,5-а-Ага/) 5.15/82.8 м.д., Cl(T-a-Ara/)/H3(l,2,3,5-a-Ara/) 109.6/4.08, указывающий на замещение остатков 1,2,3,5-a-L-Ara/по 2-му положению остатками T-a-L-Ara/

Сигналы в спектре 'Н/13С HSQC при С1/Н1 109.6/5.18, С2/Н2 89.7/4.16 м.д. были отнесены к остаткам l,2,5-a-L-Ara/¡ остальные сигналы идентифицировать не удалось, вероятно, из-за небольшого содержания данных остатков. В спектре НМВС присутствует корреляционный пик С2/Н1 при 89.7/5.18 м.д. подтверждающий присутствие остатков 1,2,5-ди-О-замещенной a-L-Ara/

Хотя большинство остатков L-Ara/ имели а-аномерную конфигурацию, были обнаружены остатки T-¡3-L-Araf, находящиеся на невосстанавливающих концах боковых цепей. Об этом свидетельствуют четко определенные сигналы Т-(3-Ага/в спектре HSQC при С1/Н1 104.3/5.09 м.д., С2/Н2 79.0/4.13 м.д., СЗ/НЗ 77.0/4.04 м.д., С4/Н4 85.1/3.91 м.д., С5/Н5;5' 65.7/3.79;3.72. В спектре НМВС присутствует корреляционный пик СЗ/Н1 при 77.0/5.09 подтверждающий присутствие остатков Т-р-Ага/(1-». Следует отметить, что остатки Т-p-Ara/ были обнаружены только в пектиновых полисахаридах выделенных из оливковой пульпы и сосны ладанной Pinus taeda.

Из соотношения интегральных интенсивностей Н1 остатков Ara спектра Н-ЯМР фрагмента ASlt-Hi следует, что среди остатков Ara, представленных различными типами связей, превалирующими являются остатки 1,5-a-L-Ara/ (-40%) (табл. 4), при этом средняя длина олигомерных цепей из остатков 1,5-a-L-Ara/составляет ~ 17 мономеров, а средняя длина кора арабинана, состоящего из остатков 1,5-, 1,2,5-, 1,3,5-, 1,2,3,5-a-L-Ara/ составляет ~ 25 мономеров. Относительно большое количество остатков T-a-L-Ara, а также значительное количество 1,3,5-ди-О- и 1,2,3,5-три-О-замещенной а-L-Ara/ указывает на весьма разветвленную структуру полисахарида ASW-H¡.

Таблица 4. Соотношение интегральных интенсивностей спектра 'Н-ЯМР

_Н1 остатков Ara во фрагменте ASrH;_

Соотно-

Моносахаридные остатки

—>5)-a-Ara/1( 1 —> / ->3)-а-Ага/-(1 — + ->3,5)-а-Ага/-(1-> + —2,5)-а-Ага/-(1-+ + —>-2,3,5)-а-Ага/-(1 —> + а-Ага/-(1->

—>5)-а-Ага/(1—► / -^3,5)-а-Ага/-(1— + -^2,5)-а-Ага/-(1^ + -*2,3,5)-а-Ага/-(1-a-Ara/-(l-^ / -^5)-a-Ara/:( 1 —> + -^3)-a-Ara/-(l-^ +-+3,5)-a-Ara/-(W + -+2,5)-а-Ага/-(1-* + -^2,3,5)-а-Ага/-(1 — —>5)-а-Ara/( 1 —> / P-Ara/-(1 —

При анализе результатов, полученных методом частичного кислотного гидролиза, обнаружено различие в скорости гидролиза гликозидных связей остатков Araf боковых углеводных цепей абиенанов ASW и ASa Содержание остатков Ara во фрагментах AS]V-H и ASy¡-H, значительно выше, чем в ASa-H и ASa-H, соответственно. Это, указывает на то, что в пектиновом полисахариде ASW гликозидные связи остатков Araf гидролизуются труднее, чем в ASa. Возможно, это связано со стереохимическими особенностями строения макромолекул ASW и ASa, которые могут быть обусловлены различной длиной и/или степенью разветвленности боковых углеводных цепей данных полисахаридов, состоящих из остатков Araf.

Соотношение интегральных интенсивностей Н1 остатков Т- и 1,5-a-L-Ara/ спектра 'Н-ЯМР фрагментов ASrH¡ (табл. 4) и ASa-H, составляет 0.8:1 и 5.1:1 соответственно. Очевидно, что фрагмент ASw-Hj отличается от фрагмента ASa-H¡ более высоким содержанием 1,5-связанной a-L-Araf и более низким содержанием T-a-L-Ara/? Высокое соотношение остатков Ara/Rha ~ 15 и значительное количество терминальной. 1,3,5-ди-О- и 1,2,3,5-три-О-замещенной а-L-Ara/ во фрагменте AS„-Hh вероятно, указывает на присутствие в абиенане ASH- более длинных высокоразветвленных боковых углеводных цепей и более коротких участков кора RG-I, в сравнении с абиенаном AS,,. Напротив, невысокое соотношение остатков Ara/Rha (~2.9), входящих в состав углеводных цепей

1/1.43 1/0.53 1/2.0 16/1

фрагмента ASa-Hj, вероятно, указывают на присутствие в абиенане ASa более коротких боковых углеводных цепей и более длинных участков главной цепи RG-I.

Таким образом, различную скорость гидролиза гликозидных связей остатков Ага/ боковых углеводных цепей абиенанов ASw и ASh можно объяснить наличием вышеуказанных особенностей строения макромолекул.

С помощью частичного кислотного гидролиза установлено что, линейная область абиенанов ASW и ASa представлена участками частично метилэтерифицированного 1,4-a-D-HG. Разветвленная область абиенанов состоит из участков частично 2-0- и/или 3-0-ацетилированного RG-I, кор которого представляет собой 1,2-a-L-paMHO-1,4-ct-D-галактуронан. Боковые углеводные цепи разветвленной области присоединены 1,4-гликозидной связью к остаткам a-L-Rhap кора и образованы, главным образом, остатками терминальной, 1,5-0-, 1,3,5-ди-О- и 1,2,3,5-три-О-замещенной a-L-Ara/ указывающими на наличие высокоразветвленного 1,5-а-Ь-арабинана, а также остатками 1,4- и 1,4,6-связанной p-D-Galр, свидетельствующими о присутствии 1,4-р-О-галактана или AG-I. Точками разветвления углеводных цепей 1,5-а-Ь-арабинана являются, главным образом, остатки 1,3,5- и 1,2,3,5-a-L-Ara/ Остатки Т-a-l.-Ara/и Т-P-L-Ara/находятся на невосстанавливающих концах боковых цепей.

Получение полисахаридов AS^-S и ASa-S. Из спиртовых супернатантов, полученных при осаждении абиенанов ASW и ASa 4-х кратным объемом 96 %-ного этанола выделены пектиновые полисахариды ASty-S и ASa-S характеризующиеся небольшой Mw, отрицательным значением удельного вращения и высоким содержанием остатков Ara (табл. 2). Вероятно, данные полимеры присутствуют в клеточной стенке как самостоятельные нейтральные полисахариды, образующиеся при различных биохимических процессах, включая биосинтез, модификацию и/или деградацию пектиновой макромолекулы. Установление их структуры методом ЯМР дополняет информацию о строении разветвленной области абиенанов ASW и ASa.

Сигналы низкой интенсивности в спектре 'Н/13С HSQC (рис. 5) принадлежат остову полисахарида - остаткам a-GalpA и 1,2-a-Rhap, что позволяет предположить пектиновую природу полисахарида. Интенсивные сигналы метальных групп ацетата при 21.4/2.18;2.15 м.д. в данном спектре, вероятно, указывают на то, что остатки 1,4-a-D-GalA содержат ацетильные группы по 2-му и/или 3-му положению.

Рис. 5. Спектр 'Н/13С HSQC полисахарида AS,rS

В спектрах 'Н/,3С HSQC (рис. 5), ROESY, COSY и TOCSY полисахарида ASa-S наблюдаются корреляционные пики, указывающие на наличие фрагментов: ...—>5)-а-Ага/(1—>5)-а-Ага/-(1—>..., ,..-»3,5)-а-Ага/-(1 ...->2,3,5)-а-Ага/-(1->....

Аналогичный вывод можно сделать для полисахарида ASn~S.

При анализе моносахаридного состава и из соотношения интегральных интенсивностей HI остатков a-Araif установлено, что пектиновый полисахарид ASlf-S, имеет более высокие соотношения остатков Ara/Rha (43/1) и Ara/GalA (12/1) и более высокое содержание остатков Т-, 1,5-, 1,3,5- и 1,2,3,5-a-L-Ara/ по сравнению с полисахаридом ASa-S, что, вероятно, указывает на присутствие в полисахариде ASW-S более длинных высокоразветвленных боковых углеводных цепей и более коротких участков кора RG-I.

Таким образом, полисахариды AS^S и AS¡V-H,, как и полисахариды ASa-S и ASA-Hh содержат участки углеводной цепи, имеющие аналогичное строение и представленные, главным образом, фрагментами 1,5-а-Ь-арабинана.

В результате ферментативного гидролиза а-1,4-П-поп игалактуроназой полисахаридных фракций ASh-D2, ASa-D2 с последующим фракционированием ферментолизатов методом гельхроматографии, получены фрагменты AS»^D2-F и ASa-D2-F (табл. 2), структура которых исследована методом спектроскопии ЯМР.

Ферментативный гидролиз фракций ASn~D2, ASa-D2 сопровождается заметным расщеплением их углеводных цепей и образованием свободной GalA, что подтверждает присутствие в абиенанах ASW и ASa значительных участков неэтерифицированного линейного галактуронана.

Совместный детальный анализ одномерных и двумерных спектров фрагмента ASa-D2-F свидетельствует о наличии в углеводной цепи участков метилэтерифицированной (СМ 65 %) и/или ацетилированной 1,4-a-D-Gal/jA (СА 4 %). В сильном поле присутствуют сигналы С6/Н6 при 19.3/1.25 и 19.4/1.32 м.д., обусловленные метальными группами остатков a-L-Rha/?. В спектре ROESY фрагмента ASa-D2-F (рис. 6) наблюдаются аналогичные с фрагментом ASa-Hi интенсивные сигналы, подтверждающие наличие участков углеводной цепи: a-GaljPA-(l—>..., ...—►4)-a-GalpA(OMe)-(l—>..., ...—>2)-a-Rhap-(l—>4)-a-GalpA-(l—...->4)-a-GalpA-(l->2)-a-Rhap-(l->-...,

Рис. 6. Спектр ROESY фрагмента ASA-D2-F 12

J

В данном спектре также присутствуют корреляционные пики Н1 с НЗ остатков 1,3-ß-D-Galp при 4.71/3.87 м.д., что указывает на наличие фрагмента углеводной цепи: ...—>3)-ß-D-Gal/?-(l—>... - характерного компонента AG-II. Детальный анализ спектров ЯМР фрагмента AS¡V-D2-F свидетельствует о том, что он имеет аналогичные по строению элементы структуры в сравнении с фрагментом ASa-D2-F.

При ферментативной обработке 1,4-а-й-полигалактуроназой абиенанов ASW и ASa с последующим фракционированием методом гельхроматографии получены различные полисахаридные фрагменты (рис. 7, табл. 5). Из водно-спиртовых супернатантов ферментолизатов выделены фрагменты ASrFrl, ASA-Frl с небольшой Mw 5.9, 5.7 кДа и Mw/Mn 1.4, 1.7 соответственно.

Полученные на третьей ступени ферментативного гидролиза фрагменты, устойчивые к действию фермента, характеризуются значительно более высоким содержанием остатков Rha, Gal и Ara, и более низким содержанием остатков GalA, по сравнению с исходным полисахаридом.

Пектиназа Пектиназа

AS™ 4 ч. 37Ч

ASw-F-, 3 ч, 37°С^ ASw-F2

Сефакрил S-500

Супернатант

ASm-Fi-1 V

ЯМР

Пектиназа 2 ч. 37°<^ ASm-F3

Сефакрил S-500

i i

ASW-F3-A ASW-F3-B

ASvv-Fi-2

выход, 17%

I

ЯМР

ASw-F-,-3

Выход, 5.1%

ASW-F3-1

выход, 2.0%

Сефакрил S-300

г

ASw-F3-2 -

выход, 7.4%

►ЯМР

i

ASw-F3-3

выход, 1.2%

í

ASw-F3-4

выход 0.5%

Á*

ASw-F3-5

выход, 4. С

ЯМР

Рис. 7. Схема ферментативного гидролиза абиенана ASW

Таблица 5. Характеристика фрагментов абиенанов А.Зц' и АБа. полученных в результате

_ферментативного гидролиза_

Содержание, вес.%

Фракции %' % GalA Gal Ara Rha Xyl GIc Man Fuc Белок

ASw-F) 46.4 48.5 43.7 14.6 14.0 4.2 0.5 3.1 4.8 1.8 4.7

ASw-F, -1 5.5 - 60.0 1.5 25.8 0.6 2.5 3.8 1.1 1.8 2.9

ASw-Fr2 17.2 55.0 38.0 19.6 14.0 7.1 0.4 1.9 4.6 0.7 4.8

ASw-F2 30.1 64.8 29.0 20.9 18.7 6.4 0.4 3.0 4.8 2.7 4.2

ASw-F3-2 7.4 17.0 27.0 18.8 25.8 2.4 0.5 0.8 2.3 1.0 3.8

ASw-F3-5 4.0 43.0 52.6 9.4 9.2 9.6 0.9 2.0 2.6 2.7 2.4

ASa-F, 44.6 42.2 43.0 14.1 14.0 4.8 0.6 3.4 4.4 1.8 2.7

ASa-F,-1 3.5 - 57.0 3.6 17.3 0.7 0.9 10.1 3.8 1.5 3.8

ASa-F2 25.5 62.7 29.0 22.8 19.2 7.8 0.9 4.5 4.7 2.9 1.9

ASa-F3 20.2 65.3 27.5 21.8 19.5 9.7 0.7 3.5 4.8 2.9 1.9

■ от исходных абиенанов ASW и ASa

Таким образом, данные фрагменты содержат значительные участки разветвленной области абиенана ASu- Фрагменты ASn~Fr2, ASA-Fh ASrF3-2, ASn~F3-5, ASn~F/-l, ASj-Fj-1 изучены с помощью спектроскопии ЯМР.

Анализ одномерных и двумерных спектров подтверждает наличие в углеводной цепи фрагмента AS^F,-2 участков 1,4-a-D-GalA, метилэтерифицированной 1,4-a-D-GalA (СМ 55%), 2-О- или 3-О-ацетилированной 1,4-a-D-GalA (CA 21%). В спектре 'Н/13С HSQC фрагмента ASfy-F¡-2 (рис. 8) наблюдаются корреляционные пики С2/Н2-атомов при 78.2/4.11 м.д. и С4/Н4-атомов при 82.8/3.69 м.д., указывающие на присутствие остатков 1,2- и 1,2,4-ди-О-замещенной a-L-Rhap.

В резонансной области аномерных атомов спектра 'НУ|3С HSQC фракции ASrFr2 (рис. 8) наблюдаются интенсивные сигналы, характерные для остатков Т-, 1,3- и 1,3,6-ß-D-Galp, а также Т-, 1,5-, 1,3- и 1,2,3,5-a-L-Ara/^ свидетельствующие о присутствии AG-II и разветвленного l,5-a-L-apa6HHaHa, являющимися боковыми цепями RG-I.

В спектре ROESY фрагмента AS¡rFr2 наблюдаются аналогичные с фрагментом ASa-DtF корреляционные пики: Н1 с НЗ, Н5 при 4.68/3.86, 4.68/3.70 м.д., указывающие на наличие фрагмента: ....—>3)-ß-Galp-(l—>-3)-ß-Gal/j-(l—а также Н1 с Н5, Н6 при 4.52/3.92, 4.52/4.04 м.д., указывающие на наличие точки разветвления боковой углеводной цепи из остатков 1,3,6-ди-О-замещенной ß-D-Galp.

Кроме того, в спектрах ЯМР фрагмента ASw-Fr2 наблюдаются сигналы низкой интенсивности остатков 1,4-связанной ß-D-Galp, что говорит об их невысоком содержании, в отличие от фрагмента ASa-Hi, полученного методом частичного кислотного гидролиза, где данные остатки были превалирующими. Вероятно, боковые углеводные цепи, состоящие из остатков 1,4-связанной ß-D-Galр, более короткие по сравнению с углеводными цепями, состоящими из остатков 1,3-связанной ß-D-Gal/?.

2.2 U 13

5.4 5.3 5.2 5.1 5.0 4.9 4Í 4J 4 Я 45 АЛ 4-3 4.2 4.1 4.8 3.» 3.» 3.7 ЗЛ 3.5 3.4 3J ррт

Рис. 8. Спектр 'Н/'3С HSQC фрагмента AS„~F,-2

Спектроскопией ЯМР установлено, что фрагменты, полученные на первой и третьей ступени ФГ АЗ^-Р/ и А5я^Р3-2) имеют аналогичные по строению элементы

структуры. Таким образом, вышеуказанные фрагменты содержат значительные участки разветвленной области абиенанов AS¡y и ASa

Детальный анализ спектров ЯМР фрагмента ASít-Fj-5 свидетельствует о наличии в углеводной цепи участков 1,4-a-D-GalpA, метилэтерифицированной 1,4-a-D-GalpA (СМ 43%), а также 2-0- и/или 3-0-ацетилированной 1,4-a-D-GalрА (CA 17%).

В спектре ROESY фрагмента ASH,-Fr5 наблюдаются аналогичные с фрагментами ASa-Hi и ASu~D2-F транс-гликозидные корреляционные пики, указывающие на наличие фрагментов: ....-»2)-a-Rhap-( 1 ->4)-a-GalpA-( 1 ...,^4)-a-GalpA-( 1 ->2)-a-Rhap-( 1 —►.... Соотношение интегральных интенсивностей Н6 остатков 1,2-a-L-Rha/? и Н6 остатков 1,2,4-a-L-Rhap спектра 'Н-ЯМР составляет 58:42.

Анализ спектров |3С- и 1 Н-ЯМР с помощью двумерной спектроскопии позволил обнаружить в составе фрагмента ASly-F3-5 остатки Т-a-Ara/ и 1,5-связанной a-Araf, 1,3-, 1,3,6-ди-О-замещенной ß-D-Galр.

Невысокое соотношение Ara/Rha (~1) и Gal/Rha (~1) фрагмента ASn~Fr5, вероятно, указывает на наличие коротких боковых углеводных цепей и на их низкую разветвленность, а также на наличие длинных участков кора RG-I. Напротив, высокое соотношение Ara/Rha (~10) и Gal/Rha (~8) во фрагменте AS¡y-F3-2 указывает на наличие длинных боковых углеводных цепей и присутствие коротких участков кора RG-I.

Полученные данные свидетельствуют о наличии во фрагменте AS^Fj-5 участков частично метилэтерифицированного 1,4-а-0-галактуронана, а также участков разветвленной области RG-I с высокой степенью ветвления остатков рамнозы, с боковыми цепями, состоящими, главным образом, из остатков Т- и 1,5-a-L-Ara/ Т-, 1,3- и 1,3,6-ди-О-замещенной ß-D-Galp.

Присутствие в спектре 'H/I3C-HSQC фрагмента ASA-Frl сигналов метальных групп ацетата при 2.15, 2.17 и 23.2 м.д., вероятно, свидетельствует о наличии в углеводной цепи остатков a-D-GalpA, содержащей ацетильные группы по 2-му и/или 3-му положению. В спектре ROESY фрагмента ASA-F,-1 установлено присутствие интра- и транс-гликозильных корреляционных пиков: Н1 с НЗ, Н5,5' остатков Araf при 5.09/4.02, 5.09/3.89;3.81 м.д., указывающих на наличие фрагмента: ...—>-5)-а-Ага/^(1—»5)-a-Ara/(l—>... Спектр НМВС подтверждает присутствие остатков 1,5-a-L-Ara/наличием корреляционных пиков: Н1/С4 (5.09/85.26 м.д.), Н1/СЗ (5.09/79.59 м.д.), Н1/С5 (5.09/69.66 м.д.).

Таким образом, фрагмент ASA-FrI содержит участки разветвленной области абиенана ASa, где кор макромолекулы представлен, главным образом, остатками ацетилированной 1,4-a-D-Gal А, а боковые цепи, состоят, главным образом, из остатков 1,5-a-L-Ara/! Спектроскопией ЯМР установлено, что фрагмент ASn,~Fr¡ имеет аналогичные по строению элементы структуры, по сравнению с фрагментом ASA-Frl-

Таким образом, результаты анализа фрагментов, полученных при ферментативном гидролизе, не только подтвердили, но и дополнили результаты, полученные при частичном кислотном гидролизе. Структурное исследование абиенанов ASw и ASÁ с помощью ферментативного гидролиза свидетельствует о наличии в их углеводной цепи участков частично метилэтерифицированного 1,4-a-D-HG. Разветвленная область представлена участками частично 2-0- и/или 3-0-ацетилированного RG-I, а боковые углеводные цепи состоят из остатков 1,3-, 1,6-связанной ß-D-Galp, 1,3-, 1,5-a-L-Ara/ а также 1,3,6-ди-0-замещенной ß-D-Galp и 1,3,5-ди-0-, 1,2,3,5-три-0-замещенной a-L-Araf в качестве точек разветвления боковой углеводной цепи.

Для проведения распада по Смиту использовали абиенаны ASiv, ASA и фрагменты ASn^Fi, ASa-F¡ — продукты ферментативного гидролиза. В результате получили фрагменты

А5ГР5, А8Л-Р8,, АБа-Р5 и АЗ^РЗ, А8а-РР5 соответственно (табл. 6).

Моносахаридный анализ и ЯМР спектроскопия исходных (табл. 2, 5) и полученных фрагментов (табл. 6) свидетельствуют о том, что в результате периодатного окисления значительная часть остатков а-1)-Оа!А подвергается разрушению, что указывает на наличие участков из остатков неацетилированной 1,4-а-Т)-Оа1рА, а также участков из остатков ацетилированной 1,4-а-0-Са1/?А, неподвергающихся окислению.

Таблица 6. Выход и характеристика фрагментов, полученных методом распада по Смиту

Содержание, вес. %

Фракции % GalA Gal Ära Rha Xyl Glc Man Fuc Белок

ASw-PS 12.2 34.4 21.3 19.5 2.8 0.5 1.3 2.0 1.5 2.7

ASa-PS, 3.2 34.0 20.6 22.3 2.6 0.6 1.1 1.9 1.4 1.6

ASa-PS 5.7 35.0 27.0 20.6 3.7 0.5 2.1 2.3 1.6 1.3

ASw-FPS 15.9 30.0 21.8 25.7 3.2 0.5 2.3 3.1 0.7 2.3

ASa-FPS 14.8 30.7 27.7 24.6 3.0 0.5 2.3 3.0 0.6 1.5

' - от исходных абиенанов ASty и ASa

Детальный анализ одномерных и двумерных спектров фрагментов, полученных методом распада по Смиту, подтвердил результаты, полученные при частичном кислотном и ферментативном гидролизе.

В спектрах HSQC и ROESY (рис. 9, 10) фрагмента AS^-FPS наблюдаются аналогичные с фрагментами AS^Fs-5, ASf,^D2-F, AS^Fi-2 и ASw~F3-2 интенсивные сигналы, указывающие на наличие участков углеводной цепи, состоящих из остатков: ...—>2)-a-Rhap-(l —>4)-a-GalpA-( 1 —>..., ...-^4)-a-GalpA-(l->-2)-a-Rhap-(l^..., 1,3-ß-D-Galp, 1,5-a-L-Ara/; точек разветвления боковой углеводной цепи из остатков 1,3,6-ди-О-замехценной ß-D-Galp и 1,3,5-ди-О-замещенной а-L-Ara/ которые свидетельствуют о наличии AG-II и 1,5-а-Ь-арабинана, являющимися боковыми цепями RG-I. Спектроскопией ЯМР установлено, что фрагменты ASA-FPS, AS,rPS и ASa-PS имеют аналогичные по строению с фрагментом ASh-FPS элементы структуры.

Рис. 9. Спектр 'H/I3C-HSQC фрагмента AS,rFPS 16

Рис. 10. Спектр ROES Y фрагмента AS^FPS

В результате проведенного исследования можно заключить, что в древесной зелени пихты присутствуют: высокомегилэтерифицированный пектиновый полисахарид AS,у, вероятно, слабо связанный с компонентами клеточной стенки, и низкометилэтерифицированный пектиновый полисахарид ASa, вероятно, связанный с компонентами клеточной стенки с помощью ионных связей и входящий в состав протопектинового комплекса. Вместе они представляют собой макромолекулярные компоненты одного пектина - абиенана.

Впервые установлены структурные элементы пектина древесной зелени A. sibirica и показано, что линейная область главной углеводной цепи представлена участками частично метилэтерифицированного 1,4-а-0-галактопиранозилуронана. Разветвленная область представлена, главным образом, участками частично 2-О- и/или 3-О- ацетилированного RG-I. Боковые углеводные цепи RG-I образованы, главным образом, остатками терминальной, 1,5-0-, 1,3,5-ди-О- и 1,2,3,5-три-О-замещенной a-L-Ara/,' свидетельствующими о присутствии высокоразветвленного 1,5-а-Ь-арабинана; остатками терминальной, 1,4-0-, 1,4,6-ди-О-замещенной ß-D-Gal/), подтверждающими наличие AG-I; остатками терминальной, 1,3-0-, 1,3,6-ди-О-замещенной ß-D-Galp, указывающими на присутствие AG-II.

Установлено, что полисахариды AS,у и ASa незначительно отличаются между собой по строению углеводных цепей. ЯМР спектроскопией полисахаридных фрагментов, полученных при частичном кислотном гидролизе, показано, что исходные абиенаны содержат участки углеводной цепи, которые имеют свои структурные особенности. Абиенан ASw характеризуется присутствием более коротких участков кора RG-I, более высоким содержанием 1,5-связанной а-L-Ara/ что наряду со значительным количеством 1,3,5-ди-О- и 1,2,3,5-три-О-замещенной а-L-Ara/ указывает на то, что он имеет более длинные высокоразветвленные боковые углеводные цепи, в сравнении с абиенаном ASa, напротив, характеризующимся наличием более длинных участков кора RG-I, более высоким содержанием остатков терминальной Ara,f и более низким содержанием остатков 1,5-связанной a-L-Ara/; и таким образом имеющим более короткие боковые углеводные цепи.

При анализе моносахаридного состава и из соотношения интегральных

интенсивностей Н1 остатков а-Ага/"установлено, что пектиновый полисахарид ЛЯн-З имеет более длинные высокоразветвленные боковые углеводные цепи и более короткие участки кора ГШ-Г, по сравнению с полисахаридом /4-5.

Эти особенности указывают на вариабельность структуры абиенана. Оценка такой вариабельности может служить основой для понимания биохимических процессов происходящих, как в ходе формирования клеточной стенки (в том числе полисахаридов в её составе), так и в ходе её последующих преобразований.

Суммируя полученные данные, можно схематически представить строение абиенана:

Линейная область: галактуронан:

...—«4)-а-0-0а1/?А-( 1 — [4)-а-0-0а1рА-( 1 ]„->■4)-а-0-0а1/?А-( 1 — • • • 4)-а-О-0а1рА-(1-^4)-а-1>-Са1/7А(ОМеН1->'-"

Разветвленная область: рамногалактуронан Г.

главная цепь: .. .-»2)-а-Ь-ЯЬар-(1 —4)-а-0-Са1рА-(1 —... ... ->4)-а-0-0а1/>А-( 1 —2)-сх-Ш1ар-( 1—.... ...—►2)-а-Ь-Ш1а1о-( 1 ->4)-а-0-Оа1рА(ОАс)-( 1—... точки разветвления:

^4)

.... -^3)-Р-0-0а1р-(1

...—>5)-а-Ь-Ага/:(1

боковые цепи: арабиногалактан типа I и II:

■ ■ [4НИМ}ф-( 1 ]„—4)-Р-0-0а1р-( 1—...

.. ,->[3)-Р-0-0а1р-( 1 ]„—*3)-р-0-0а1/>-( 1 —3)-рЛ>Оа1р-( ...

...—6)-Р-0-0а1р-(1^...

точки разветвления:

...— 3,6)-Р-0-0а1р-(1—••• ...->4,6)-Р-0-0а1р-(1—....

арабинан:...—>5)-а-Ь-Ага/-(1—> [5)-а-Ь-Ага/-(1]п—►5)-а-Ь-Ага^(1—> ... ...—»3)-а-Ь-Ага/-( 1—... а-Ь-Ага/-( 1 — 3)-а-Ь-Ага/"-( 1 —....

Р-Ь-АгаГ-О--точки разветвления: ... ->-3,5)-а-Ь-Ага/-(!-►...,... — 2,5)-а-Ь-Ага/-(1->...,2,3,5)-а-Ь-Ага/-(1—...

Выводы:

1. Из древесной зелени пихты сибирской А. sibirica впервые выделены пектин (абиенан) и связующие гликаны. Изучена динамика накопления и характер изменения моносахаридного состава полисахаридов древесной зелени пихты в течение года. Установлено, что оптимальным временем сбора для выделения пектиновых полисахаридов является осенний период, связующих гликанов - зимне-весенний период.

2. Установлено, что макромолекула абиенана состоит из линейной области, представленной участками частично метилэтерифицированного

1.4-а-0-галакгопиранозилуронана, и разветвленной области, представленной участками частично 2-0- и/или З-О- ацетилированного рамногалакгуронана I.

3. Установлено наличие в RG-I ковалентной связи между кором, представленным 2-О- и/или З-О-ацетилированным 1,2-а-Ь-рамно-1,4-а-П-галактуронаном, и боковыми углеводными цепями, представленными остатками 1,4-р-0-галактопиранозы, которые присоединены по 4-му положению к остаткам a-L-рамнопиранозы кора.

4. Боковые углеводные цепи RG-I образованы фрагментами высокоразветвленного

1.5-а-Ь-арабинана и арабиногалакгана типа II, а также фрагментами AG типа I (минорный компонент). Точками разветвления углеводных цепей AG-II являются остатки 1,3,6-р-0-галактопиранозы, AG-I - 1,4,6-Р-0-галактопиранозы. Точками разветвления углеводных цепей 1,5-а-Ь-арабинана являются остатки 1,2,5-, 1,3,5- и 1,2,3,5-а-Ь-арабинофуранозы. Остатки T-a-L-арабинофуранозы и T-ß-D-галактопиранозы находятся на невосстанавливающих концах боковых цепей. Особенностью данного полисахарида является наличие остатков T-ß-L-арабинофуранозы, находящихся на невосстанавливающих концах боковых цепей 1,5-а-Ь-арабинана.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах

1. Макарова Е. Н., Шахматов Б. Г., Патова О. А. Способ получения полисахаридов из древесной зелени хвойных растений // Заявка на изобретение № 2010121802. Приоритет от 28.05.2010 г.

2. Макарова Е. Н., Патова О. А., Михайлова Е. А., Демин В. А. Сезонная динамика и биологическая активность древесной зелени пихты сибирской (Abies sibirica Ledeb) // Химия растительного сырья. -2011. -№ 2. -С. 35—42.

3. Makarova Е. N., Shakhmatov Е. G. Structural and chemical characterization of abienan, a pectin from the greenery of Siberian fir (Abies sibirica L.) // Russ. J. Bioorg. Chem. -2012. -V.38.-P. 707-712.

4. Макарова E. H., Шахматов E. Г. Структурно-химическая характеристика абиенана -пектина древесной зелени пихты сибирской Abies sibirica L. // Химия растительного сырья. -2011. -№ 3. -С. 59-64.

5. Makarova Е. N., Patova О. A., Shakhmatov Е. G., Kuznetsov S. P., Ovodov Y. S. Structural studies of the pectic polysaccharide from Siberian fir (Abies sibirica Ledeb.) // Carbohydr. Polym. -2013. -V. 92.-P. 1817-1826.

6. Shakhmatov, E. G., Toukach, P. V., Michailowa, E. A., Makarova, E. N. Structural studies of arabinan-rich pectic polysaccharides from Abies sibirica L. Biological activity of pectins of A. sibirica II Carbohydr. Polym. -2014. -V. 113. -P. 515-524.

Благодарности

Автор выражает огромную благодарность академику |Юрию Семеновичу Оводову,| сотрудникам лаборатории гликологии Института физиологии: научному руководителю, к.х.н., доценту Ольге Андреевне Патовой, вед. н.с., к.х.н., Раисе Григорьевне Оводовой, вед. н.с., д.х.н., доценту Виктории Владимировне Головченко, м.н.с., к.х.н. Федору Васильевичу Витязеву за ценные советы, консультации и помощь в выполнении работы. Особую признательность автор выражает сотрудникам Института химии Коми НЦ УрО РАН: к.х.н., доценту Елене Васильевне Удоратиной, м.н.с. Евгению Геннадьевичу Шахматову за ценные советы и помощь в выполнении работы, Сергею Петровичу Кузнецову, Игорю Николаевичу Алексееву за регистрацию ЯМР спектров, а также всем сотрудникам лаборатории химии растительных полимеров, лаборатории физико-химических методов исследования Института химии Коми НЦ УрО РАН за ценные советы и помощь в выполнении работы.

Подписано в печать 23.10.2014 г. Формат 60x84 1/16 Бумага писчая. Печать офсетная. Авт. л. 1,0 Тираж 110 экз. заказ № 34. Редакционно-издательский отдел Коми научного центра УрО РАН 167982, ГСП, г. Сыктывкар, ул. Первомайская, 78 Тел.: (8212)24-47-79