Выделение и структурная идентификация амаранта, сквалена и полисахаридов из новых сортов растений рода Amaranthus L. химическая модификация пектиновых полисахаридов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

Миндубаев Антон Зуфарович

г.

ВЫДЕЛЕНИЕ И СТРУКТУРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМАРАНТИНА, СКВАЛЕНА И ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ НОВЫХ СОРТОВ РАСТЕНИЙ РОДА АМАЯАМТНЮI. ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ПЕКТИНОВЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

02.00.03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань-2005

Работа выполнена в лаборатории фосфорилированных аналогов природных соединений Института органической и физической химии им. А.Е.Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Миронов Владимир Фёдорович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Катаев Владимир Евгеньевич

кандидат химических наук, доцент Казымова Марина Александровна

Ведущая организация:

Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН

Защита состоится 16 ноября 2005 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 022.005.01 при Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук по адресу: 420088, г. Казань, ул. Арбузова, 8, зал заседаний Ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института органической и физической химии им. А.Е.Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук.

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 420088, г. Казань, ул. Арбузова, 8, ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН.

Автореферат разослан 14 октября 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета кандидат химических наук

Муратова Р.Г.

2т<эА 3 Msm

XI О ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Наряду с традиционными источниками химического сырья (нефть, газ, уголь) все большее значение приобретает возобновляемое растительное сырье. Химия возобновляемого растительного сырья - одно из интенсивно развиваемых актуальных направлений современной органической химии. Одной из перспективных культур для получения практически важных соединений является нетрадиционная культура амарант. Помимо белка амарант содержит ценные высокомолекулярные соединения - пектиновые полисахариды и ряд важных низкомолекулярных веществ, в том числе флавоноид с Р-витаминной активностью — рутин, и пигмент амарантин. Семена амаранта содержат ценный компонент - сквален. Большая урожайность амаранта, наличие нескольких классов практически полезных веществ делают данную культуру перспективным воспроизводимым растительным сырьем. В связи с этим одними из важных задач являются углубленное изучение химического состава и создание технологии комплексной переработки фитомассы новых сортов амаранта, районированных в условиях России. Химия полисахаридов является одним из приоритетных направлений органической химии и химии природных соединений. Особое место среди растительных полисахаридов занимают пектиновые полисахариды, которые входят в состав структурных элементов клеточной ткани высших растений и выполняют функции связывающих и упрочняющих компонентов клеточной стенки, а также регулируют водный обмен. Пектиновые полисахариды представляют собой уникальный биологически активный продукт с детоксицирующими, радиопротекторными и другими лечебно-профилактическими свойствами, что чрезвычайно акгуально в условиях интенсивного развития химической, нефтеперерабатывающей промышленности, автотранспорта. В настоящее время производство пектинов в России отсутствует. Кислые пектиновые полисахариды, в отличие от хорошо известных целлюлозы и крахмала, мало изучены в плане получения функциональных производных, и исследование их химической модификации является современной актуальной задачей. Химическая модификация позволяет влиять на физико-химические характеристики пектиновых полисахаридов, а также на сорбционную емкость и селективность комплексообра-зования, так как при этом появляются дополнительные центры координации. Одним из наиболее важных направлений химической модификации пектиновых веществ является получение производных пектиновых полисахаридов на основе реакций комплексообразования и солеобразования с ионами одновалентных и двухвалентных металлов микро- и макроэлементов, функционально замещенными ами-носоединениями, а также фосфорилирование и ацилирование. Особенно актуально получение водорастворимых карбоксипроизводных пектинов, что имеет принципиальное значение для поиска биологически активных соединений.

Цель работы. 1) Разработка способов выделения высокомолекулярных (кислые и нейтральные полигалактуронаны) и низкомолекулярных компонентов (бета-цианиновые пигменты, рутин, сквален) новых сортов растения амарант {Amarartthus tricolor, «Валентина»; Amarartthus cruentus, «Кизлярец») в единой технологической цепочке, их структурная и физико-химическая идентификация. 2) Разработка способов химической модификации кислых полигалактуронанов и Низкомолекулярных

уроновых кислот (комплексообразование ных и двухвалентных металлов-микроэ

и uwwGijajqMHHe с ионами одновалент-

i ий¥й£8леме{,тов' с функцио-

узда

нально-замсщенными аминами; ацилирование и фосфорилирование; получение молекулярных комплексов с дикарбоновыми кислотами).

Научная новизна работы заключается в том, что впервые разработана схема комплексной переработки амаранта сорта «Валентина», включающая в едином цикле выделение рутина и полифенольных соединений, амарантина, пектиновых полисахаридов и сквалена (из семян амаранта сортов «Кизлярец» и «Валентина»). Проведена оптимизация параметров экстракции полисахаридов в условиях ультразвуковой обработки. Впервые разработаны способы получения водорастворимых смешанных солей (металлокомплексов) полигалактуронанов с двухвалентными s- и rf-металлами - микро- и макроэлементами, а также функционально замещенными аминами, строение которых подтверждено методами ИКС, спектроскопии ЯМР 13С, 'Н и ЭПР. Методами спинового эха установлено, что в водорастворимых комплексах меди и кобальта металл связан только с одной цепочкой полисахарида; координационные связи с несколькоми цепочками приводят к образованию гелей и осадков. Впервые получены молекулярные комплексы полигалактуронанов с насыщенными и ненасыщенными дикарбоновыми кислотами и проведено твердофазное фосфорилирование пектинов.

Практическая значимость работы заключается в подтверждении перспективности амаранта как промышленного источника пектиновых полисахаридов, амарантина и сквалена, в разработке новых экологически безопасных способов их выделения, а также в разработке подходов для химической модификации пектиновых полисахаридов, что является основой для получения новых биологически активных веществ. Проведена оптимизация процессов гидролиза-экстракции полисахаридов с использованием ультразвука и вибро-акустического воздействия. Показано, что полученные смешанные соли пектина с биогенными металлами являются малотоксичными и проявляют выраженное противоанемическое действие, по эффективности превышающее действие известных препаратов «Тотема», «Ферронал», «Ферроплекс». Молекулярные комплексы полигалактуронанов с янтарной и фума-ровой кислотой, в отличие от самих кислот обладают меньшим раздражающим действием на слизистую оболочку желудка. Установлена большая комплексующая способность фосфорилированного пектина по отношению к ионам кальция, что представляет интерес для поиска новых антигемостатиков.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Казань, 2002), V Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Пущино, 2003), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), II Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003), III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов, 2004), III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004), XI Международной конференции студентов и аспирантов "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений" (Казань, 2005), XIV Международной конференции по химии фосфора (Казань, 2005). По результатам исследований опубликовано 17 работ, в том числе положительное решение на изобретение РФ.

• Объем и структура диссертации. Диссертация включает 3 главы (литературный обзор, экспериментальная часть и анализ полученных результатов), выводы и

список литературы. Литературный обзор посвящен метаболизму, биологической активности и химическим превращениям двух групп природных соединений - кислых полисахаридов пектинов и беталаиновых пигментов, а также биологии и химическому составу растений рода Amaranthus L. Диссертация изложена на 199 страницах, содержит 26 таблиц, 64 рисунка и список литературы из 235 наименований.

Работа выполнена в соответствии с научным направлением Института по г/б теме «Разработка научных основ создания новых физиологически активных препаратов для медицины и сельского хозяйства из растительного сырья» (№ гос. per. 01.20.0005795). Работа поддержана совместным грантом Российского фонда фундаментальных исследований и Академии наук Татарстана (№ 03-03-96244).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В Институте органической и физической химии им. А.Е.Арбузова КазНЦ РАН начаты и развиваются работы по использованию амаранта в качестве источника практически полезных соединений. Возможность получения при переработке амаранта низкомолекулярных физиологически активных соединений и высокомолекулярных веществ делает перспективным создание комплексной схемы переработки растительного сырья.

1. Влияние метода экстракции иа количественный и качественный состав выделяемых углеводных фракций Amaranthus cruentus L.

Одной из первых задач работы явилось изучение влияния условий экстракции на качественный и количественный состав извлекаемых углеводных фракций с целью ее оптимизации, а также исследование воздействия слабых кислот и комилек-сона на физико-химические и структурные особенности извлекаемых олиго- и полисахаридов растения Amaranthus cruentus L. при механоакустическом воздействии. Извлечение пектиновых веществ, проводимое в роторно-пульсационном аппарате, протекает в более мягких условиях даже при использовании в качестве гидроли-зующего агента таких слабых кислот как янтарная, адипиновая и фумаровая. Исследованы физико-химические и структурные особенности олиго- и полисахаридов, извлекаемых с помощью комплексона (гексаметилендиаминотетрауксусной кислоты, ГМАУК). Полученные результаты сопоставлялись с результатами "классического" гидролиза-экстракции (щавелевая кислота, 50-95°С, 3.5-4 ч).

Первый этап исследований - извлечение полисахаридных фракций из амаранта с помощью комплексона, а также янтарной, адипиновой, фумаровой кислот, и установление влияния механоакустического воздействия на качественный состав извлекаемых продуктов при рН 6.0. Процесс гидролиза-экстракции проводился в роторно-пульсационном аппарате «8-эмульгатор»в течение 2-3 мин (30-45°С). После обработки сырья определяли рН экстракта; при использовании воды («холостой» опыт) рН 6.0, янтарной кислоты - рН 4.25, адипиновой кислоты - рН 4.64, фумаровой кислоты - рН 3.75 и для комплексона рН - 4.54. Далее экстракт концентрировали в 10-12 раз в вакууме. При использовании комплексона концентрирование полученного экстракта осуществляли с помощью ультрафильтрации, которая позволила избавиться от органических и неорганических низкомолекулярных при-

месей. Последняя операция включала осаждение олиго- и полисахаридов равным объемом ацетона. Во всех случаях коагулянт имеет вид объемного молочного сгустка, всплывающего на поверхность. При обработке сырья в роторно-пульсацион-ном аппарате без добавления кислот при осаждении ацетоном образуется низкомолекулярный осадок, оседающий на дно емкости. Далее отделенный центрифугированием осадок подвергался сушке (термошкаф, 45-50°С). Полученные пектиновые продукты представляют собой аморфные порошки, очистка которых производилась методом переосаждения с предварительной обработкой раствора ионообменной смолой (КУ-2) с целью деминерализации продукта. Во всех случаях, когда извлечение происходило с использованием либо кислот, либо комплексона, получены порошки светло-серого цвета. При обработке сырья без кислот получен осадок черного цвета. Все продукты малорастворимые в воде. Выход пектиновых полисахаридов составляет ~ 1 % на сухой вес сырья.

Для установления строения образцов проведен кислотный гидролиз с последующим качественным и количественным определением моносахаридного состава. Продукты гидролиза идентифицировались ТСХ. Во всех образцах присутствует преимущественно глюкоза. Содержание галактуроновой кислоты в гидролизате, определенное с помощью ВЭЖХ состаляет 0.49 % (экстрагент янтарная кислота), 1.4 % (адипиновая кислота), 0.52 % (фумаровая кислота), 0.42 % (комплексен ГМАУК). Количественное содержание глюкозы в образцах, полученных с использованием янтарной кислоты и комплексона, было устанавлено биосенсорным методом и составляет 64.0 млмоль/л для образца, экстагированного янтарной кислотой, и 53.5 млмоль/л для образца, извлеченного адипиновой кислотой. Полученные данные указывают на то, что все анализируемые образцы представляют собой нейтральные олигосахариды - глюканы.

Второй этап исследований - извлечение полисахаридной фракции амаранта при использовании щавелевой кислоты без механоакустической обработки. Данный вид гидролиза-экстракции используется, как правило, для извлечения пектиновых веществ и применен нами в качестве сравнения с вышеописанным механо-акустическим методом. Обработка сырья проводилась растворами щавелевой кислоты различной концентрации: 0.25, 0.5 и 1.0 %. При мягком способе сырье амаранта обрабатывали 0.25 % раствором щавелевой кислоты (3.5 ч, рН 3.87, 45-50°С), а при жестком способе - 1 % раствором щавелевой кислоты (4 ч, рН 2.23, 90-95°С). Экстракция пектина также проводилась в умеренно-жестких условиях 0.5 % раствором щавелевой кислоты (5 ч, 50-55°С). Максимально жесткие условия гидролиза-экстракции позволяют получить продукт с максимальным выходом, но при этом происходит частичная деструкция образца. При данном способе наряду с гидролизом протопектина из клеточной стенки растений и его дальнейшим диффундировании в раствор происходит извлечение и нейтральных полисахаридов (крахмал).

Как и в предыдущих способах экстракции с использованием слабых кислот, раствор концентрировали и осаждали ацетоном. Идентификацию продуктов кислотного гидролиза проводили тонкослойной и бумажной хроматографией. Показано, что в образце, полученном при мягких условиях гидролиза, присутствуют глюкоза (как основной сахар), галактоза, арабиноза, рамноза и галактуроновая кислота. Количественное содержание галактуроновой кислоты устанавливали методом ВЭЖХ (17 %). Таким образом, можно заключить, что и при данных способах гидролиза-экстракции извлекаются олиго- и полисахариды нейтральной природы,

содержащие в своем составе в качестве основного сахара глюкозу. Небольшая уро-нидная составляющая, определенная методом титриметрии, составляет ~ 19 % и согласуется с данными ВЭЖХ.

На третьем этане исследований проводилось извлечение полисахаридной фракции амаранта после предварительной обработки сырья с целью удаления содержащихся в нем примесей - сапонинов и пигментов фенольной природы. Для экстракции последних применялась дистиллированная вода либо формалин. Полисахариды из предварительно обработанного сырья извлекались при использовании щавелевой кислоты различной концентрации и комплексона без механоакустиче-ской обработки. Данный вид гидролиза-экстракции применен нами в качестве сравнения с вышеописанными методами. Предварительная обработка сырья проводилась двумя способами - мягким и жестким. При мягком способе сырье амаранта предварительно экстрагировали дистиллированной водой (4-8 ч, 40°С), а при жестком способе - 0.5 % формалином (5 ч, 20°С или 3 ч, 75°С). Методом ТСХ обнаружены галактуроновая кислота, глюкоза, арабиноза, рамноза и ксилоза. Количественное содержание галактуроновой кислоты установлено карбазольным методом (уронидная составляющая 55.8 %). В продукте присутствуют также аминокислоты (проявитель - нингидрин).

Таким образом, предварительная очистка сырья водой (формалином) и спиртом позволяет получить пектиновый продукт, имеющий более светлую окраску, характерную для незагрязненных полисахаридов, что согласуется с литературными данными. Следует отметить, что выход целевых продуктов при этом незначительно уменьшается, т.к. при предварительной обработке происходит извлечение водорастворимых фракций пектиновых полисахаридов. Моносахаридный состав сходен с составом полисахаридов, полученных предыдущими методами.

2. Выделение и структурная идентификация высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений из Amaranthus tricolor сорта «Валентина»

Нами впервые проведены работы по оценке содержания практически важных низкомолекулярных и высокомолекулярных веществ в амаранте сорта «Валентина», выведенного во Всероссийском Институте селекции и семеноводства овощных культур (ВНИИССОК). В рамках комплексной переработки сырья выделены рутин, потенциальный пищевой краситель амарантин, пектиновые полисахариды, для которых исследованы физико-химические свойства и структурные особенности. В результате предложена технологическая схема (схема I) извлечения компонентов из сырья амаранта, позволяющая в рамках единого процесса получать наиболее важные соединения. Схема 1 включает три последовательные экстракции (96 % этиловым спиртом, дистиллированной водой и разбавленным водным раствором слабой органической кислоты).

2.1. Выделение и физико-химические характеристики амарантина

Методом тонкослойной хроматографии проведен качественный анализ эта-нольного экстракта амаранта (элюент бензол): обнаружены неполярные пигменты -хлорофиллы и каротиноиды. Общее содержание сухих веществ в этанольном экстракте по отношению к исходному сырью составляет 8.4 %.

Сырьё|

Каротинонды Хлорофиллы

Этанольная 40°С

экстракция

жом]

Рутин выход 1%

Экстракция

Водная 40оС

бутанолом 20-25ОС

Водораство-рнмый пектин (выход 2.5 %)

экстракция

ЖОМ

Кислотный

Водный экстракт (сухие вещества 10-12 %)

гидролиз 50ос

Пектин + белок (выход 3 %)

Схема 1.

Амарантин + аминокислоты (выход 7 %)

колоночная

хроматография

Аминокислоты

• Триптофан

• Фенилаланин ■ Треонин ■Лейцин

Амарантин

Последующая экстракция растительного сырья (измельченных высушенных листьев и соцветий амаранта) по предлагаемому в данной работе способу основана на суммарном извлечении низкомолекулярных экстрактивных веществ водой (гидромодуль 1 : 15, 50°С, 1.5 ч) с последующим их фракционированием. Такая экстракция дает ~ 90 % содержащихся в сырье бетацианинов. На рис. 1 показана зависимость содержания сухих веществ в экстракте от продолжительности процесса (оптимум 1.5 ч).

Рис. 1. Зависимость концентрации бетацианинов в экстракте от продолжительности экстракции. ОН

-СХХ Ц .соон

30 90 150 210 Время, мин

Амарантин

Экстракт отфильтровывают (плотность 1.005, рН 6.3-6.4), концентрируют и обработкой бутанолом извлекают рутин (1 %), который кристаллизуют из растворителя. Общее содержание сухих веществ в водном экстракте к весу исходного сырья составляег в среднем 10 %. Установлено, что в состав водного экстракта входят и высокомолекулярные соединения, в том числе и водорастворимые пектины, после отделения которых бетацианины высушивают в вакууме (1 мм рт. ст.) Далее водный раствор высушенных бетацианинов подвергают колоночной хроматографии с целью отделения амарантина от аминокислот.

200

250

350 300 500 800

Л_I-1_I_I_I_I

a

0J 0,6 0,4 0,2 0

113 47 78,5 130 147 169 194 V, мл

Рис. 2. Спектр поглощения пигментных фракций при 538 нм.

Рис. 3. Электронный спектр поглощения пигментных фракций после колонки.

Контроль за содержанием амарантина осуществляют по изменению цветности каждой фракции в видимой области (538 нм), используя в качестве стандарта элю-ент (см. рис. 2). Проведенные расчеты показывают, что пурпурная фракция, отделенная от сопутствующих веществ, составляет 60 %. Выделенные пигменты идентифицированы также методом ТСХ. В качестве систем для ТСХ амарантина экспериментально подобраны композиции: уксусная кислота - метанол - бензол - вода (2:2:1.5: 0.3), изопропанол - вода (4 : 1), а также ацетонитрил - уксусная кислота -вода.

В целях дальнейшей идентификации выделенного пигмента получены электронные спектры поглощения выделенных фракций, представленные на рис. 3. Из спектров усматривается два интенсивных максимума поглощения - в ультрафиолетовой (Я. 280 нм) и в видимой областях спектра (А. 538 нм), совпадающие с таковыми амарантина, полученного иными способами. Для идентификации выделяемого пигмента был также использован метод MALDI TOF масс-спектроскопии, который позволяет установить форму, в которой амарантин присутствует в экстракте (соли Na, К, Са) (рис. 4). Пурпурная фракция, полученная после колонки, дополнительно очищалась через анионит (АВ-17, ГОСТ 20301-74) и исследовалась методами ЯМР (|3С, 'Н, COSY 'Н-Н, HSQS, НМВС) и ИКС. В спектре ЯМР |3С полученного амарантина присутствуют сигналы следующих групп (5с м.д.): СН-О (66.0-76.0), СН2-О (60.0-65.0), CH-N (50.0-57.0), CH2-N (34.0-42.0), СН-СООН (34.0-42.0), СООН (169.8, 178.8), СН2-С=С (25.0-33.0), СН2С (20.0-26.0), СН,С (13.0-20.0). В целом, сложная спектральная картина соответствует основным фрагментам амарантина, присутствующего в нескольких формах.

Поскольку амарантин является потенциальным пищевым красителем, требовалось изучение его термостабильности. Для этого методом спектофотометрии исследовано влияние температуры в интервале от 20 до 100°С на устойчивость пигментов (рис. 5).

Из рис. 5 видно, что выделенный амарантин термостабилен до 80°С и пригоден в качестве пищевого красителя. Нами также исследовалась устойчивость амарантина в диапазоне рН 2-12. Снижение рН до 1.6 титрованием 0.1 н НС1 не ekiiti-вает изменений окраски раствора (спектрофотомеприя). При титровании 0 1 V ■ NaOH цвет раствора амарантина сначала темнеет, а при достижении рН 12.0 утрачивает пурпурную окраску, становясь желто-коричневатым. Добавление кислоты

возвращает исходный пурпурный цвет. Этот результат аналогичен литературным данным, указывающим на нестабильность бетацианинов в растворах с высокими значениями рН. Обесцвеченный щелочной раствор не поглощает при X 538 нм (при этом интенсивность поглощения в УФ области не утрачивается и появляется дополнительный пик при X 360 нм).

600

' 1300 11900

Рис. 4. Спектр MALDITOF очищенного амарантина.

0 g ОДо колонки 0,6

После колонки

60° 80° 100° Температура, °С

Рнс. 5. Зависимость оптической плотности 0.0625 % раствора амарантина от температуры.

Исследована растворимость выделенного амарантина и установлено, что он хорошо растворяется в воде, трифторуксусной кислоте; плохо - в уксусной кислоте, диметилсульфоксиде и метаноле; практически нерастворим в этаноле с концентрацией выше 70 %, диметилформамиде и менее полярных растворителях.

2.2. Выделение пектиновых полисахаридов

После отделения бетацианинов и полифенольных соединений заключительным этапом комплексной переработки амаранта Amaranthus tricolor сорта «Валентина» является кислотная экстракция пектинов. В промышленности для извлечения пектинов применяются растворы сильных минеральных кислот, ведущие к деградации полисахаридных цепей и, как следствие, снижению качества конечного продукта. Нами и качестве экстрагентов применялись растворы слабых органических кислот, способствующие сохранению нативной молекулярной массы пектинов, в сочетании с комплексоном, освобождающим пектин от ионов кальция, а также ультразвуковая обработка. На стадии гидролиза-экстракции пектиновых веществ исследованы щавелевая и лимонная кислоты с обработкой на УЗДН-1. Оптимизированы технологические параметры (температура, рН, гидромодуль и продолжительность обработки) процесса гидролиза-экстракции пектинов, которые очищали методом персосаждения с предварительной обработкой раствора ионообменной смолой (КУ-2). Обработка на УЗДН-1 позволяет существенно сократить продолжительность экстракции и увеличить выход пектинов, который контролировали каль-ций-пектатным методом.

Условия экстракции и природа экстрагента влияют на свойства выделяемого пектина. Так, применение в качестве экстрагента 1 % щавелевой кислоты ведет к резкому снижению степени этерификации пектина; тот же самый эффект вызывает ультразвуковое воздействие во время экстракции. Условия экстракции влияют также на соотношение пектин/белок в конечном продукте - от полного отсутствия

белка до содержания 5 % (в пересчете на азот). Особенностью нового сорта амаранта «Валентина» является высокий процент водорастворимого пектина: примерно половина извлекаемого пектина из «Валентины» приходится на водный экстракт.

Проведено исследование физико-химических характеристик и структурных особенностей полученных пектиновых веществ. Элементный анализ очищенных образцов пектинов показывает отсутствие примесей белка (С 41.87 %, Н 6.56 %) при экстракции 0.5 % щавелевой кислотой с добавлением комплексом (0.5 % ГМАУК) и высокое содержание белка (Ы 4.43 %) при экстракции 0.5 % лимонной кислотой. В образцах, полученных в условиях ультразвуковой обработки как при экстракции 0.5 % щавелевой кислотой, так и 0.5 % лимонной кислотой содержание азота составляет 2 %. С целью исследования моносахаридного состава пектина из нового сорта его подвергали кислотному гидролизу и анализировали ТСХ и ВЭЖХ. Гидролизат содержит галактуроновую кислоту, галактозу, глюкозу, рамнозу и ара-бинозу.

СН2ОН СН2ОН НО *—О

/Л чМе \'"ОН

((он /" ОН /он >"ОН \ /

М ноЧ-Г Кн он

ОН

СООН

ОН

он

«OH

он

oD-GalAр (71 %) Z)-Galр (7.7 %) />-Glcр (8.3 %) L-Rhap(4.1%) ¿-Агар (6.6%)

Рамноза присутствует в следовых количествах, что указывает, по-видимому, на низкую степень разветвленности пектиновых макромолекул (рамноза присутствует в узлах ветвления полисахаридов).

Методом масс-спектроскопии MALDI TOF установлено молекулярно-массо-вое распределение продуктов кислотного гидролиза образцов, полученных экстракцией щавелевой кислотой как в присутствии к'омплексона ГМАУК, так и без него. В гидролизатах наблюдается наличие неэтерифицированных и этерефициро-ванных димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров. Следует отметить, что в спектрах присутствует интенсивный пик компонента с массой 899 (пентамер галак-туроновой кислоты), на который приходится весомая доля гидролизата. Необычна способность данного олигосахарида противостоять гидролизу в жестких условиях, указывающая на его возможную регуляторную функцию в живой клетке растения. Таким образом, пектин из нового сорта «Валентина» отличается от пектинов ранее исследованных сортообразцов более низкой молекулярной массой и большей водо-растворимостью, низкой уронидной составляющей и более высокой степенью эте-рификации. Его основные физико-химические свойства следующие: степень этери-фикации 80-85 %, М.м 50 тыс. у. е., уронидная составляющая 60-65 %. Структурная идентификация пектинов проведена методами ЯМР и ИКС. В ИК спектрах присутствуют полосы (см1) 1650-1750 [v(C-OH) и v(COOH)], 1020-1100 (валентные колебания пиранозных циклов), 1325 и 1400 (плоскостные колебания групп СН).

Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что новый сорт амаранта «Валентина» является перспективным источником физиологически активных соединений, в том числе ценного лекарственного вещества витаминного действия - рутина, каротиноидов, пигмента беталаиновой природы - потенциального пищевого красителя амарантина и пектиновых полисахаридов.

3. Химическая модификация пектиновых полисахаридов на основе реакций комплексообразования и солеобразования

3.1. Получение водорастворимых комплексов пектиновых биополимеров с двухвалентными и одновалентными «-металлами

Водорастворимые соли и комплексы пектинов весьма привлекательные объекты для исследования биологической активности, которая должна быть более четко выраженной по сравнению с нерастворимыми в воде производными пектинов. Нами впервые получены водорастворимые пектаты кальция и магния - жизнено важных макроэлементов. Решение проблемы растворимости удалось найти при использовании в качестве матрицы для получения водорастворимого комплекса не самого пектина, а натриевой соли полностью деэтерифицированного пектина -пектоной кислоты со степенью солеобразования 100 % (пектата натрия). Эта соль получена обработкой пектина щелочью при контролируемых значениях рН при 1 итриметрическом переходе рН из слабокислой в слабощелочную область. Наряду с контролем рН при разработке способа получения этой соли параллельно использовался контроль за состоянием карбоксильных групп методом ИКС в области валентных колебаний группы СОСГ (1660-1800 см-1).

COOR

1) HCI (рН 2), -ROH

2) М1+ОН (рН 12) п 3) M2+CI2

Ml+ = Na, К, Li; М2+ = Са, Mg

п М+ или п/2 М2+

При этом комплексы Са2+ и получены по реакции лигандного обмена ионов № на соответствующий 5-металл в пропорциях, определенных на основе экспериментального исследования закономерностей комплексообразования в системе пектат натрия - соль Б-металла. Для рассматриваемых систем экспериментально найдена область концентраций (0.019-0.002 г-экв/л), в которой наблюдается селективное образование только водорастворимых соединений без побочного образования нерастворимых структур. Для этого были исследованы такие же графические зависимости массы образующихся водорастворимых и нерастворимых комплексов (т, г) от концентрации солей металлов (рис. 6, 7).

растворимый нерастворимый

растворимый ; нерастворимый

1-'-Г

0.006 0.010 0.014 0.020 0.024 Рис. 6. Зависимость массы выделенных

комплексов (т, г) системы пектат натрия - СаС1у от концентрации соли металла.

0.06 0.10 0.14 Рис. 7. Зависимость массы выделенных

комплексов (т, г) системы пектат натрия — MgS04 от концентрации соли металла.

Исходя из этих данных, нами разработан способ количественного получения водорастворимых комплексов пектинов с ионами Са2+ и Mg2+, пригодный для укрупненного лабораторного и технологического применения. Аналогичным образом были получены пектаты натрия, калия, лития, а также пектинат лития (соли лития применяются в качестве лекарственных препаратов; пектат и пектинат лития - потенциальные лекарственные формы, которые могут обладать более мягким воздействием). Строение полученных солей доказано методами ИКС [v(COCT) 1618-1632 см"'] и ЯМР. На рис. 8 приведены спектры ЯМР ,3С-{'Н} (150.9 МГц, D20) водорастворимых пектатов Li, Na, Са и Mg. Интерпретация сигналов сделана с учетом данных корреляций 2D COSY, 2D HSQS, 2D НМВС.

170 150 130 110 90 70 8см.л.

Рис. 8. Спектры ЯМР "С-{'Н'} водорастворимых пектатов Li, Л1а, Са и Mg.

В области слабых полей проявляется сигнал шестого атома углерода гексозы, соответствующего солевой форме карбоксильной группы галактуроновой кислоты (175.6-175.8 м.д.). В области сильных полей проявляются пять сигналов атома углерода, входящих в пиранозный цикл.

3.2. Получение металлокомплексов пектинов и катионов биогенных Л-металлов - микроэлементов

Одним из наиболее характерных свойств пектинов является их способность к комплексообразованию с ионами р- и «/-металлов. Нами для комплексообразования был выбран не пектин, а натриевая соль деэтерифицированной пектовой кислоты -пектат натрия со степенью солеобразования 100 %. Такой подход позволил получить натриевую соль пектовой кислоты с точно известным содержанием ионов на-

трия в полимере и провести количественные аналитические расчеты для получения металлокомплексов пектовой кислоты с фиксированной степенью превращения полимерной молекулы при замене иона натрия на катион ¿-металла. Вторым фактором, который учитыиался при разработке способа получения целевых смешанных солей (металлокомплексов) ¿-металлов, была растворимость. Известные соли пектинов в воде не растворимы, что связано с координацией металлов различными цепями, приводящей к сшивке макромолекул пектина. Мы предположили, что добиться образования растворимых в воде металлокомплексов пектовой кислоты можно за счет создания достаточно разреженной трехмерной структуры комплексов с относительно невысокой степенью замещения ионов натрия на ¿-металл (в пределах 1 -40 % двухвалентного металла относительно исходного содержания натрия) при сохранении большей части ионов натрия в солевой форме в составе полимерного комплекса для обеспечения его водорастворимых свойств.

Экспериментальные исследования по получению водорастворимых смешанных солей общей формулы (I) показали, что их образование наряду с нерастворимыми комплексами наблюдается при использовании 1-25 %-ной концентрации ¿-металла относительно концентрации ионов натрия. Использование более высоких концентраций ¿-металлов приводит к образованию только нерастворимых форм комплексов и формированию гелей в маточных растворах. Таким образом, была определена пороговая концентрация ¿-металлов относительно катиона натрия, равная - 25 %, которая является границей между образованием растворимых и нерастворимых комплексов пектатов.

Для определения условий избирательного образования водорастворимых комплексов проведено исследование закономерностей комплек-сообразования в указанных системах в зависимости от концентрации солей ¿-металлов. Результаты исследований представлены графическими зависимостями на рис. 9-14 (верхние кривые -растворимый комплекс, нижние - нерастворимый).

м'= N8

М?-СоП,СцН,РеП, (1) £пН, Мп", N¡11 п = 3-9, ш = 10-25

ш г

1.2 0.8

0.4-1

0.025 0.075 0.125 Рис. 9. Зависимость массы выделенных комплексов (т, г) из системы пектат натрия - СоС12-6Н20 от концентрации соли металла.

1.6 1.2 0.8 0.4

0.025

0.075

0.125 С г- экв/л

Рис. 10. Зависимость массы выделенных

комплексов (т, г) из системы пектат натрия - РеБО^УНгО от концентрации соли металла.

m г 1.6 1.2 0.8 0.4

С г. экв/л

0.025 0.075 0.125 Рис. 11. Зависимость массы выделенных

комплексов (т, г) из системы пектат натрия - СиЕ04-5Н20 от концентрации соли металла.

Растворимый Нерастворимый

0.025 0.075 0.125 Рис. 12. Зависимость массы выделенных

комплексов (т, г) из системы пектат натрия - Мп$04-5Н}0 от концентрации соли металла.

■ ♦ Растворимый —■— Нерастворимый

0,0019 0,0116 0,0137

<»л

Рис. 13. Зависимость массы выделенных

комплексов (т, г) в системе пектат натрия - ШС1г-6НгО от концентрации

0,008 0,01 0,013 ОД) 14 0,015 С,мка/л

соли металла.

Рис. 14. Зависимость массы выделенных

комплексов (т, г) в системе пектат натрия - ZnCl}-7H¡0 от концентрации соли металла.

Целевые комплексы (I) представляют собой порошки с характерной окраской для каждого комплекса (сиреневой для Со2+, зеленоватой для Си2+, желто-коричневой для Fe2+, бесцветной для Мг.2+, кремовой для Zn2+ и зеленой для Ni2+) и обладают оптическим вращением в интервале [a]D20 24-150°, то есть являются оптически активными. В ИК спектрах комплексы имеют характерные полосы поглощения карбоксианиона в области 1600-1700 см"1.

Структура (Na+, Си2+)-содержащих комплексов была установлена методом ЭПР и ЯМР спинового эха. Спектры ЭПР записывали для твердых (высушенных) образцов комплексов со степенями замещения ионов натрия ионами Си24, равными 2.5, 5.0, 25.0, 50.0 % (рис. 15, 16). Из рисунков можно видеть, что для всех четырех образцов (Na+, Си2+)-металлокомплексов наблюдается одинаковый характер сигналов ЭПР, указывающий на одинаковую симметрию окружения ионов Си2+. Это позволяет сделать вывод, что во всех четырех случаях мы имеем дело с однотипными комплексами Си2+ с идентичным лигандным окружением. На это указывает также совпадение g-факторов этих комплексов, равных соответственно: g¡ — 2.35, g¡ = 2.05, <g> = 2.15, А|| = 127 э.

На рис. 17 приведена зависимость интегральной интенсивности сигналов ЭПР (I, %) пектата меди в зависимости от рН раствора, показывающая, что комплекс устойчив в достаточно широком интервале рН, важном для его биологического применения.

45 мм

45 мм

Рис. 15. Спектры ЭПР (Ыа\ Ы")-металлокомппексов пектиновых полисахаридов. 1-50% Си2*, 2-25% Си2*, 3-5% Си2* (1 ■№?), 4- кривая сравнения, 5-2.5% Си2*.

Рис. 16. Спектры ЭПР (Иа\ Си2*)-металлокомплексов пектиновых полисахаридов. 1 — твердый комплекс, 2 - комплекс в растворе, 3 - аква-комплекс Си2*.

Рис. 17. Интегральная интенсивность сигналов ЭПР (I, %) пектата меди в зависимости от рНраствора (черные квадраты - % пектатного комплекса меди, черные кружки-% аква-комплекса меди).

3.3. Получение молекулярных комплексов полисахаридов с дикарбоновыми

кислотами

При разработке способов выделения пектинов слабыми кислотами нами обнаружено, что некоторые из них (янтарная, фумаровая) способны образовывать соединения-включения с пектином (комплексы), которые высаждаются этанолом из водных растворов в виде длинных нитей. Нами исследована стехиометрия ком-плексообразования янтарной кислоты с пектином в зависимости от температуры. Полученные данные представлены на рис. 18, 19.

m г

Рис. 18. Зависимость процесса комплексообризования янтарной кислоты (т, г) от температуры.

m г

-

у

> Г

/

/

f -fr-

I KOMI лексо образе вание

0.35 0.7 1.2 13 1.4 Вес израсходованной янтарной кислоты

Рис. 19. Зависимость выхода комплекса (т, г) от количества израсходованной янтарной кислоты (т, г).

Как можно видеть из рис. 19, с увеличением температуры выход комплекса увеличивается, достигая максимума при 50-60вС и далее не меняется.

Щавелевая кислота проявляет в реакциях с пектинами в 2 раза менее выраженные комплексующие свойства, чем янтарная кислота. Малоновая кислота проявляет в примерно 2 раза меньшие комплексообразующие свойства, чем щавелевая кислота. Гомологи янтарной кислоты - глутаровая и адипиновая кислоты - значительно уступают ей по комплексующим свойствам в реакциях с пектиновыми биополимерами. Ненасыщенная фумаровая кислота также образует соединения-включения с пектином. Комплексообразование пектина с янтарной и фумаровой кислотами подтверждено методом ЯМР 13С.

3.4. Получение солей пектиновых полисахаридов с замещенными аминами

Анализ результатов, полученных при исследовании синтеза комплексов гюли-галаюуроновой кислоты с катионами двухвалентных биогенных металлов, показывает перспективность поиска биологически активных веществ в ряду этих карбок-сиполимеров на основе реакций комплексообразования и солеобразования.

Нами предпринята попытка получения аммониевых солей биополимеров пектинового ряда с функционально замещенными аминами, в качестве которых были использованы гидроксихлорзамещенные производные (II). Реакции аминов (II) с пектинами проводились в воде с последующим высаждением продукта органическим растворителем (спиртом или ацетоном). Известно, что пектин образует соль с диэтиламином при 20°С, которая осаждается спиртом аналогично исходному пектину. Однако аммонийные соли пектина с аминами (II) в этих условиях не образуются. В основу способа получения целевых продуктов был положен экспериментальный подбор концентраций исходных реагентов с таким расчетом, чтобы растворимость целевых солей в 2 раза превышала растворимость исходной уроновой кислоты, что, в свою очередь, потребовало повышения температуры растворов до максимально возможного для этой группы полимеров значения 55-60°С с образованием вязких коллоидных растворов. По мере прохождения солеобразования коллоидные растворы превращаются в истинные высококонцешрированные растворы, из которых методом осаждения и происходит выделение солей (III). Аммониевые соли в ряду полностью деэтерифицированных пектинов - пектовых (полигалакту-роновых) кислот в литературе неизвестны. Первой ступенью исследований в этом ряду явился синтез самих исходных полнгалактуронанов со степенями содержания свободных карбоксильных групп 30-70 % с одновременным содержанием COONa групп 70-30 % соответственно. За основу синтеза, как и при получении комплексов полигалактуроновой кислоты с ионами двухвалентных металлов, была выбрана натриевая соль полностью деэтерифицированного полигалаюуронана со степенью солеобразования 100 %.

ОН

» скАж*,

Ii R2

JH Н r2

COOK

III

R2 = Et, CH2CH2OH, (CH2CH2)2CH2, (CH2CH2)20

Строение пектовых полигалактуронанов, как и в случае пектиновых полига-лактуронанов, подгверждено спектральными методами (ИКС, ЯМР 'Н и 13С). На рис. 20 приведены спектры ЯМР *Н (600 МГц, ОгО) некоторых солей.

№ СН2

Пектин—СОО СТСН,СНСН,1Ч' то 21 2Х'

ОН

£—°н

Н^ОН

БМвО

ССН,

скуч

,осн}

ЩСН^ БМвО

+/—ч С1СН2СНСН21Ч,

он н

Пектин—СОО-ССН,

5 6 4.8 4.0 3.2 2.4 8 м.д.

Рис. 20. Спектры ЯМР 'Н (600 МГц, Б20) производных (III).

3.5. Фосфорилирование пектина

Фосфорилированные производные кислых пектовых полисахаридов до настоящего времени не были известны. В данной работе мы показали, что пектин подвергается реакции фосфорилирования Р2О5, которая была осуществлена в твердофазном варианте (интенсивное растирание пектина и Р2О5). После мягкого гидролиза фосфорилированный пектин (IV) осаждали ацетоном или этанолом.

ИК спектр галактуронана (IV) содержит полосы, соответствующие Р-ОН и Р=0 группам (2200-2600 и 1235-1260 см"1). В спектре ЯМР 3,Р-{'Н} (Н20) ему соответствует группа сигналов с 5Р 1.0 + -0.3 м.д. (рис. 21). На рис. 21 приведены также спектры ЯМР 13С-{'Н} 13С полученного полимера. Сигналы ядер углерода С1, С2 и С3 дополнительно расщеплены на дублеты из-за спин-спинового взаимодействия с фосфором (/рос. Лосс 5.0-7.0 Гц). Описанная спектральная картина согласуется с неравномерным фосфорилированием групп ОН. Фосфорилированный пектин содержит 3-4 % фосфора и связывает кальций на 30 % эффективнее обычного, что представляет интерес для поиска новых антигемостатиков.

170 150 130 НО 90 70 8см.д.

Рис. 21. Спектры ЯМР 3,Р-{'Н} (36.48 МГц, 020)ЯМР ,3С-{'Н}, ,3С (150.9 МГц, D20) фосфорилированного пектина (IV).

4. Оценка содержания нейтральных, кислотных компонентров и сквалена в маслах семян амаранта сортов «Кизлярец» и «Валентина»

В работе был проанализирован состав масел из семян новых сортов Атагап-thus cruentus L. («Кизлярец») по сравнению с амарантом A. tricolor L. («Валентина»). Амарантовые масла получали экстракцией из семян СНгС12. Для определения содержания кислотных и нейтральных компонентов масла подвергали омылению щелочью в водно-спиртовой среде до образования солей жирных кислот и экстрагировали последовательно гексаном и бутанолом (после подкисления реакционной смеси до образования свободной кислоты). Статистические показатели определяли по 8-10 опытам по извлечению и разделению масел. Разброс данных в проведенных опытах составлял - 1.02 %. Изучение количественных показателей проводили аналитическим весовым способом, состав выделенных масел устанавливался методами газо-жидкостной хроматографии и хроматомасс-спектрометрии. Данные масс-спектров приведены на рис. 22, из которого видно, что новые сорта амаранта богаты скваленом. Установлено, что его содержание в нейтральной части масла из семян «Кизлярца» составляет 39.4-43.0 %, наиболее высокое содержание сквалена -48.5 % обнаружено в сорте «Валентина». Установлено также, что в амарантовом масле преобладают ненасыщенные жирные кислоты (линолевая и олеиновая). В отличие от «Кизлярца» и «Валентины», в составе масла несортового амаранта присутствует линоленовая кислота, содержится меньше линолевой. Масло «Кизлярца» бедно пальмитиновой кислотой, но богато стеариновой. Видно также, что состав амарантового масла в очень большой степени зависит от сортовой принадлежности источника и может служить важным сортовым признаком. Таким образом, масло семян амаранта сортов «Валентина» и «Кизлярец» можно рассматривать как потенциальный промышленный источник сквалена.

Усредненный состав масла АтагапОшз сгиепйм, % (литературные данные)

60

40

20

1Г □ 0

П, а,в,.т

а а в г

т р г я

® 2 * 3 ч я в

14 1 ° £

К

Состав масла сорта "Кизлярец", %

50 40 30 20 10 0

Состав масла амаранта сорта "Валентина", %

I

-От

Я 3

&

(2

X

о.

е

о I"

к ©

? ?

Р 3

X

к Ч

а в я

ООО

ч я м

о К X

£ ^

« I

а

в

X

ч

о ■§•

о ©

Рис. 22. Усредненный состав масла из семян сортов амаранта согласно данным хро-

матомасс-спектрометрии.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана схема комплексной переработки амаранта сорта «Валентина», включающая в едином цикле выделение рутина, амарантина и пектиновых полисахаридов и сквалена. Проведена оптимизация параметров экстракции (температура, время, тип экстагента, ультразвук, механо-акустическая обработав).

2. Методом колоночной хроматографии получены обогащенные (80-85 %) амаран-тином фракции и показана термостабильность (до 90°С) и устойчивость пигмента в интервале рН 1.5-12.5.

3. Установлен моносахаридный состав пектиновых полисахаридов новых сортов амаранта, который включает глюкозу, галактозу, арабинозу, галактуроновую кислоту и рамнозу; содержание галактуроновой кислоты составляет 60-65 %. в отличие от пектинов амаранта багряного.

4. Впервые получены водорастворимые пектаты щелочных металлов (К, 1л) и водорастворимые смешанные соли пектиновых полисахаридов с двухвалентными

и ¿-металлами - микро- и макроэлементами (Со, Си, Ре, 7л, №, Са, Mg), строение которых подтверждено методами ИК, |3С ЯМР спекгроскопии. Методом ЭПР показано октаэдрическое строение натриймедьполигалактуроната. Изучены закономерности комплексообразования в зависимости от концентрации соли 5- и ¿-металла, установлена их пороговая концентрация, позволяющая получать растворимые ме-таллокомплексы пектиновых полисахаридов. Показано, что полученные металло-комплексы являются малотоксичными и проявляют выраженное противоанемиче-ское действие.

5. Впервые получены молекулярные комплексы пектиновых полисахаридов с насыщенными и ненасыщенными дикарбоновыми кислотами, перспективные в качестве биологически активных добавок. Установлено, что комплексообразование ди-карбоновых кислот - янтарной и фумаровой кислот с пектиновыми полисахаридами приводит к четкому снижению их токсического воздействия на организм и снижает раздражающее влияние кислот на слизистую желудочно-кишечного тракта.

6. Впервые получены и охарактеризованы соли пектинов и других полигалактуро-нанов с функционально замещенными аминосоединениями (2-гидрокси-З-хлорпро-пиламины), структура которых доказана методом спектроскопии ЯМР 13С, 'Н и ИКС.

7. Впервые твердофазным синтезом получен фосфорилированный пектин и показано, что его комплексообразующая способность по отношению к кальцию на 30 % выше по сравнению с исходным пектином.

8. Исследован состав масел семян новых сортов амаранта и показано, что основными компонентами являются непредельные кислоты - олеиновая, линолевая и лино-леновая и тритерпен сквален. Показано, что состав масла зависит от сортовой принадлежности семян и может рассматриваться в качестве сортового признака. Впервые разработана принципиальная схема выделения сквалена из семян амаранта сортов «Кизлярец» и «Валентина», содержание которого в неомыляемой части масла составляет 40-95 %.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах

Миронов В.Ф, Kapaceea А.Н., Цепаева О.В., Выштакалюк А.Б., Минзанова С.Т., Морозов В.И,, Карлин В.В., Юнусов Э.Р., Миндубаев А.З. Некоторые новые аспекты комплексообразования пектиновых полисахаридов с катионами d-металлов. // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщ. 2003. № 3. С. 45-50.

Kapaceea А Н., Миронов В.Ф., Цепаева О.В., Выштакалюк А Б., Минзанова С.Г., Карлин В В., Миндубаев А.З. Полиметаллокомплексы пектиновых полисахаридов и их биологическая активность. // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщ. - 2004. - Т. 5, № 1. - С. 33-35.

Миндубаев А.З., Миронов В.Ф., Минзанова С.Т., Цепаева OB, Kapaceea А.Н., Выштакалюк А.Б., Карлин В.В., Гинс В.К., Кононков П Ф., Еникеев K.M. Выделение, физико-химические и структурные исследования пектиновых полисахаридов из амаранта сорта «Валентина». // Нетрадиционные сельскохозяйственные, лекарственные и декоративные растения. 2005. №2. - 2005. - С. 39-44. Минзанова С.Т., Kapaceea А Я, Миронов В.Ф., Э.А. Гурылев, К.О. Синяшин, Выштакалюк А Б, Карлин В.В., Петрова Г.Р., Миронова JIГ., Миндубаев А.З. Количественное определение содержания кобальта и меди в комплексах пектиновых биополимеров. II III Всероссийская конференция «Химия и технология растительных веществ». - Саратов, 2004. - С. 45-46.

Миндубаев A3, Минзанова С.Т., Миронов В.Ф., Kapaceea А.Н., Выштакалюк А Б., Карлин В В., Миронова Л Г, Гинс В К., Кононков П. Ф, Лагоденко М. В. Научные основы комплексной переработки растения Amaranthus tricolor сорта «Валентина». // III Всероссийская конференция «Химия и технология растительных веществ». - Саратов, 7-10 сентября 2004. - С. 239-241.

Цепаева О В, Соснина Н.А , Миронов В. Ф, Минзанова С. Т., Kapaceea А.Н., Еникеев К. М. Миндубаев А 3., Коновалов А. И. Структурно-химические исследования пектиновых веществ растения Amaranthus cruentus и их производных. // Материалы II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ". Казань, 24-27 июня 2002 г. Изд-во. КНЦ РАН. - С. 107. Миндубаев А.З., Миронов ВФ, Минзанова С.Т., Kapaceea А.Н., Выштакалюк А Б, Карлин В В, Миронова Л Г., Гинс В К., Кононков П Ф, Лагоденко М.В. Бе-тацианины растения Amaranthus tricolor сорта «Валентина». // III Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов». - Саратов, 9-11 сентября 2004. - С. 48-49.

Цепаева О В, Миндубаев А 3, Миронов В Ф, Еникеев К М. Выделение и структурно-химические характеристики олигосахаридов и полисахаридов растения Amaranthus cruentus. II Материалы II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ". Казань, 24-27 июня 2002 г. Изд-во. КНЦ РАН. -С. 109.

Миндубаев А 3, Гинс В.К, Карлин В,В., Ефремов Ю.Я., Шарафутдинова Д.Р., Миронов В.Ф, Цепаева О.В, Кононков П.Ф. Оценка состава масел новых сортов амаранта. // Материалы V Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования". Том III. Пущино, 9-14 июня 2003 г. Изд-во. Российского университета дружбы народов. - С. 120.

10. Цепаева О.В., Соснина H.A., Миронов В. Ф., Минзанова С Т., Карасева А H, Ени-кеев K.M., Миндубаев А.З., Коновалов А.И. Влияние природы гидролизующего агента на физико-химические характеристики и структурные особенности пектиновых веществ Amaranthus cruenlus. II Материалы "XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии". Том 4. Казань, 21-26 сентября 2003 г Изд-во ИОФХ им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН. - С. 315. I 11. Минзанова С.Т., Миндубаев А.З., Миронов В.Ф, Цепаева OB, Карасева АН, Еникеев K.M., Коновалов А.И. Физико-химические и структурные исследования пектиновых полисахаридов, выделенных из амаранта сорта «Валентина». И Ма-Ù териалы II Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и

перспективы развития". Том I. Москва, 10-14 ноября 2003 г. Изд-во ЗАО «ПИК Максима». - С. 310.

12. Мухина В.П., Миндубаев А.З., Миронов В Ф„ Коновалов А И., Гинс В KJ ВЭТСХ определение пигмента амарантин в листьях Amaranthus tricolor L. II Тезисы докл. Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы». Москва, 2004. - С. 257.

13. Mukhina V.P., Mindubaev A.Z, Mironov V.F., Gins V.K., Malinowska /., Rozylo J.KJ HPTLC determination of betacyanin pigments in leaves of Amaranthus tricolor L. II Abstracts Pap. of International Conference on Natural Products, Kazimir Dolny, Poland, 14-16 .Arne 2004. - P. 112.

14. Миндубаев A.3., Миронов В.Ф., Минзанова С. Т., Карасева А Н„ Карлин В.В Вы-штакалюк A.B., Коновалов А.И. Выделение, идентификация и структурная модификация высокомолекулярных и низкомолекулярных компонентов растения амарант. // XI Международная конференция студентов и аспирантов "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений". - Казань, 24-25 мая 2005. - С. 266.

15. Миндубаев А.З., Карасева А.Н., Миронов В.Ф., Минзанова С. Т., Баландина А А Соли пектина и пектатов с замещенными аминами. // VIII молодежная научная школа-конференция по органической химии. - Казань, 22-26 июня 2005. - С. 397.

16. Mindubaev A.Z., Karaseva A.N., Mironov У.F., Minzanova S.T, Karlin V.V, Baiandina A.A., Latypov Sh K„ Konovalov A.I Phosphorylating of pectines. II XIV International conference on chemistry of phosphorus compounds. Kazan, Russia, June 27-Уи1у 1, 2005, Posters. P94.

17. Миронов В.Ф., Карасева A.H., Минзанова C.T., Карлин B.B, Симонова H H, Po--r манова H К, Костина JI.A., Миндубаев A3. Комплексы пектинового биополимера с дикарбоновыми кислотами и способ их получения. // Положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение по заявке № 2004111029/04 от 16 авгу-

i ста 2005 г.

J-Aj/

4

Ч

Лицензия на полиграфическую деятельность №0128 от 08.06 98г выдана Министерством информации и печати Республики Татарстан Подписано в печать 28.09.2005 г. Форм бум. 60x84 1/16 Печ. л.1,5 Тираж 120. Заказ 247.

Минитипография института проблем информатики АН РТ 420012, Казань, ул.Чехова, 36.

«18633

РНБ Русский фонд

2006-4 17690

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 2

ГЛАВА I. Низко- и высокомолекулярные вещества растения амарант.

Выделение, идентификация, биологическая активность (Литературный обзор) 7

1.1. Амарант - перспективный источник практически полезных соединений и важнейшая культура XXI века 7

1.2. Беталаиновые пигменты и перспективы их практического использования 20

1.3. Физико-химические свойства и биологическая активность амарантина 24

1.4. Пектины: получение, структурная идентификация, химическая модификация, свойства и применение 27

ГЛАВА II. Обсуждение результатов 55

2.1. Влияние метода экстракции на количественный и качественный состав выделяемых углеводных фракций Amaranthus cruentus L. 55

2.1.1. Структурное изучение углеводных фракций с помощью

ИК спектроскопии 59

2.1.2. Структурное изучение олиго- и полисахаридов с помощью спектроскопии ЯМР 13С 67

2.2. Выделение и структурная идентификация высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений Amaranthus tricolor сорта "Валентина" 70

2.2.1. Выделение амарантина 71

2.2.2. Исследование физико-химических характеристик амарантина 74

2.2.3. Исследование амарантина методами спектроскопии ЯМР

13С и ИКС 80

2.2.4. Выделение пектиновых полисахаридов 84

2.2.5. Исследование физико-химических свойств и структурных особенностей выделенных пектиновых полисахаридов 86

2.3. Химическая модификация пектиновых полисахаридов на основе реакций комплексообразования и солеобразования 92

2.3.1. Получение металлокомплексов пектинов на основе пектинов и катионов биогенных ^-металлов микроэлементов 92

2.3.2. Краткая справка. Биологическая активность металлокомплексов пектинов с катионами биогенных J-металлов-микроэлементов 103

2.3.3. Получение водорастворимых комплексов пектиновых биополимеров с двухвалентными и одновалентными s-металлами 107

2.3.4. Получение молекулярных комплексов полисахаридов с насыщенными дикарбоновыми кислотами 113

2.3.5. Краткая справка по биологическим свойствам комплексов пектинов с дикарбоновыми кислотами 128

2.3.6. Получение солей полисахаридов пектинового ряда с замещенными аминосоединениями 129

2.3.7. Фосфорилирование пектина 141

2.4. Оценка содержания нейтральных, кислотных компонентов и сквалена в маслах семян амаранта сортов "Кизлярец" и "Валентина" 145

ГЛАВА III. Экспериментальная часть 148

Актуальность исследований. Наряду с традиционными источниками химического сырья, такими как нефть, газ, уголь, все большее значение приобретает возобновляемое растительное сырье. Одной из перспективных культур для мало- и среднетоннажного химического производства является нетрадиционная культура амарант. Особенностью амаранта является большой прирост биомассы, что позволяет получать тонны зеленого растительного сырья на относительно небольших площадях. Пищевая ценность белка амаранта по данным аминограмм очень высока в сравнении с "идеальным белком ФАО", и по сумме незаменимых аминокислот составляет 75 %. Амарант - культура, способная обеспечитьну дополнительным количеством качественных кормов и полноценных продуктов питания, освободив ее тем самым от необходимости их закупки за рубежом. Помимо белка амарант содержит ценные высокомолекулярные соединения - пектиновые полисахариды и ряд важных низкомолекулярных веществ, в том числе флавоноид с Р-витаминной активностью — рутин, и пигмент амарантин. Семена амаранта содержат ценный компонент - сквален. Большая урожайность амаранта, наличие нескольких классов практически полезных веществ делают данную культуру перспективным воспроизводимым растительным сырьем. Для того, чтобы амарант стал конкурентоспособным источником сырья, необходимо дальнейшее углубленное изучение его химического состава и создание рентабельной технологии комплексной переработки фитомассы.

Перспективным направлением исследований является выделение полисахаридов из амаранта. Биополимеры полисахаридной структуры - важнейший класс природных соединений, находящих практическое использование в различных областях науки и техники. Особое место среди растительных полисахаридов занимают пектиновые полисахариды, которые входят в состав структурных элементов клеточной ткани высших растений и выполняют функции связывающих и упрочняющих компонентов клеточной стенки, а также регулируют водный обмен. Пектиновые полисахариды представляют собой уникальный биологически активный продукт с детоксицирующими, радиопротекторными и другими лечебно-профилактическими свойствами, что чрезвычайно актуально в условиях интенсивного развития химической, нефтеперерабатывающей промышленности, автотранспорта н других отраслей. Социальная значимость данной проблемы связана с ухудшением экологии окружающей среды, что в свою очередь ведет к ухудшению здоровья.

В связи с известными полезными свойствами, пектиновые вещества находят широкое применение в пищевой промышленности. Основным потребителем пектина является кондитерская промышленность. Свойство пектина образовывать студни используют при производстве кондитерских изделий пастило-мармеладной группы (зефир, пастила, желейный мармелад) и конфет с желейными и фруктово-желейными корпусами. Широкий спектр направлений использования пектинов и невозможность адекватной замены пектинов другими веществами делают необходимым производство пектинов в отечественной промышленности.

Кислые пектиновые полисахариды, в отличие от хорошо известных целлюлозы и крахмала, мало изучены к настоящему времени в плане получения функциональных производных, и исследование их химической модификации является современной актуальной задачей.

Химическая модификация позволяет влиять на физико-химические характеристики пектиновых полисахаридов, а также на сорбционную емкость и селективность комплексообразования, так как при этом появляются дополнительные центры координации. Одним из наиболее важных направлений химической модификации пектиновых веществ является получение производных пектиновых полисахаридов на основе реакций комплексообразования и солеобразования с ионами одновалентных и двухвалентных металлов микроэлементов и функционально замещенными аминосоединениями, а также фосфорилирование и ацилпрование пектиновых полисахаридов. Особенно актуально получение водорастворимых карбоксн-производных пектинов, что принципиально важно для поиска биологически активных соединений. Большой интерес представляют растворимые в воде аммониевые соли полигалактуронанов.

Поскольку пектиновые вещества содержат в качестве элементарного звена а-гидроксикислоту - галактуроновую кислоту, целесообразно было исследовать закономерности реакции солеобразования и свойства образующихся при этом продуктов на модельных соединениях - галактуроновых циклических кислотах.

Цель настоящего исследования - выделение высокомолекулярных и ннзко-молекулярных компонентов растения амарант в единой технологической цепочке, исследование их физико-химических характеристик, идентификация методами ИКС и спектроскопии ЯМР. Для достижения цели определены следующие задачи:

1. Разработка технологической схемы комплексной переработки фитомассы амаранта, позволяющей в рамках единого технологического процесса выделять наиболее ценные практически значимые компоненты из данной культуры (бета-цианиновые пигменты, пектиновые полисахариды, рутин, сквален) с применением максимально дешевых и экологически безопасных методов.

2. Исследование химического состава различных органов (соцветия, листья, семена) нескольких сортов амаранта (Валентина, Кизлярец, несортовой Атагап-thiis cruentus) в сравнительном аспекте. Установление физико-химических характеристик выделяемых из амаранта соединений с привлечением современных методов: масс-спектрометрии, и 13С-ЯМР и ИК- спектрометрии, ЭПР, высокоэффективной жидкостной колоночной и тонкослойной хроматографии н другими аналитическими методами.

3. Разработка способов химической модификации пектиновых полисахаридов: 1) комплексообразование и солеобразование с ионами одновалентных и двухвалентных металлов-микроэлементов и макроэлементов; 2) солеобразование с функционально-замещенными аминосоединениями; 3) ацилирование, фосфорилирование пектиновых полисахаридов; 4) получение молекулярных комплексов полисахаридов с насыщенными и ненасыщенными дикарбоновыми кислотами; 5) исследование реакции солеобразования на модельных соединениях - низкомолекулярных уроновых кислотах.

Новизна. Впервые разработана схема комплексной переработки амаранта сорта «Валентина», включающая в едином цикле выделение рутина и полифеноль-ных соединений, амарантина и пектиновых полисахаридов. Проведена оптимизация параметров экстракции. Впервые разработана принципиальная схема выделения сквалена из семян амаранта сортов «Кизлярец» и «Валентина». Впервые получены водорастворимые металлокомплексы с двухвалентными s- и ^-металлами-микро- и макроэлементами, строение которых подтверждено методами ИК, 13С ЯМР спектроскопии и ЭПР. Показано, что полученные металлокомплексы являются малотоксичными и проявляют выраженное противоанемическое действие. Впервые получены молекулярные комплексы полисахаридов с насыщенными и ненасыщенными дикарбоновыми кислотами. Впервые получены и охарактеризованы соли пектиновых и других полигалактуронанов с функционально замещенными аминосоединениями.

Практическая значимость работы заключается, прежде всего, в подтверждении перспективности амаранта как промышленного источника пектиновых полисахаридов и других практически значимых веществ, в разработке новых экологически чистых способов их выделения, а также в разработке подходов для химической модификации пектиновых полисахаридов, что является основой для получения новых биологически активных веществ.

Основные положения, выносимые на защиту: способы выделения пектиновых полисахаридов и других практически полезных соединений (амарантина, сквалена) из амаранта и их структурно-химическая идентификация; способы модификации пектиновых полисахаридов и их спектральное подтверждение; результаты комплексообразования и солеобразования с ионами одновалентных и двухвалентных металлов-микроэлементов и макроэлементов; получение молекулярных комплексов полисахаридов с насыщенными и ненасыщенными дикарбоновыми кислотами; солеобразование с функционально-замещенными аминосоединениями.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Казань, 2002), V Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Пущино, 2003), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), II Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003), III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов, 2004), III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004), XI Международной конференции студентов и аспирантов "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений" (Казань, 2005), XIV Международной конференции по химии фосфора (Казань, 2005). По результатам исследований опубликовано 16 работ в том числе положительное решение на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и 64 рисунков. Список цитируемой литературы включает 235 наименований. Работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов собственных исследований, экспериментальной части, выводов, списка используемой литературы и приложения.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана схема комплексной переработки амаранта сорта «Валентина», включающая в едином цикле выделение рутина, амарантина и пектиновых полисахаридов. Проведена оптимизация параметров экстракции (температура, время, тип экстагента).

2. Методом колоночной хроматографии получены обогащенные (80-85 %) амаран-тином фракции и показана термостабильность и устойчивость пигмента в интервале рН 1.5-12.5.

3. Установлен моносахаридный состав пектиновых полисахаридов новых сортов амаранта, который включает глюкозу, галактозу, арабинозу, галактуроновую кислоту и рамнозу; содержание галактуроновой кислоты составляет 60-65 %. в отличие от пектинов амаранта багряного.

4. Впервые получены водорастворимые пектаты щелочных металлов (К, Na, Li) и водорастворимые металлокомплексы пектиновых полисахаридов с двухвалентными s- и ^-металлами - микро- и макроэлементами (Со, Си, Fe, Zn, Ni, Са, Mg), строение которых подтверждено методами ИК, 13С ЯМР спектроскопии. Методом ЭПР показано октаэдрическое строение натриймедьполигалактуроната. Изучены закономерности комплексообразования в зависимости от концентрации соли s- и d-металла, установлена их пороговая концентрация, позволяющая получать растворимые металлокомплексы пектиновых полисахаридов. Показано, что полученные металлокомплексы являются малотоксичными и проявляют выраженное противо-анемическое действие.

5. Впервые получены молекулярные комплексы пектиновых полисахаридов с насыщенными и ненасыщенными дикарбоновыми кислотами, перспективные в качестве БАД. Установлено, что комплексообразование дикарбоновых кислот - янтарной и фумаровой кислот с пектиновыми полисахаридами приводит к четкому снижению их токсического воздействия на организм и снижает раздражающее влияние кислот на слизистую желудочно-кишечного тракта.

6. Впервые получены и охарактеризованы соли пектинов и других полигалактуронанов с функционально замещенными аминосоединениями (2-гидрокси-З-хлор-проииламины), структура которых доказана методом спектроскопии ЯМР 13С {'Н} и ИКС.

7. Впервые твердофазным синтезом получен фосфорилированный пектин и показано, что его комплексообразующая способность по отношению к кальцию на 30 % выше по сравнению с исходным пектином.

8. Исследован состав масел семян и показано, что основными компонентами являются непредельные кислоты - олеиновая, линолевая и линоленовая и тритерпен сквален. Показано, что состав масла зависит от сортовой принадлежности семян и может рассматриваться в качестве сортового признака. Впервые разработана принципиальная схема выделения сквалена из семян амаранта сортов «Кизлярец» и «Валентина», содержание которого в неомыляемой части масла составляет 40-95 %.

1. Коненков, П. Ф. Амарант перспективная культура 21 века / П.Ф. Коненков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. - М. : Изд. Российского ун-та дружбы народов. Издание второе, 1999.-296 с.

2. Хазиев, Р. Ш. Изучение биологически активных веществ растений рода Amaranthus L.: дис. канд. биол. наук. / Р. Ш. Хазиев. Казань, 1992. - 126 с.

3. Черепанов, С. К. Сосудистые растения СССР. / С.К.Черепанов. Л.: Наука, 1981.- 504 с.

4. Чернов, И. А. Амарант физиолого-биохимические основы интродукции. / И.А.Чернов. - Казань.: изд. Казанского ун-та, 1992. - 90 с.

5. Paredes-Lopez О. Amaranth: biology, chemistry and technology. / О. Paredes-Lopez.- CRC Press Inc, 1994. -223 p.

6. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Сем. Magnoliaceae Limoniaceae. - Л., "Наука". - 1984. - 460 с.

7. Кадошников, С. И. Первая всесоюзная конференция "Возделывание и использование амараита в СССР в связи с решением проблем кормопроизводства" (4-7 сентября 1989 г., Казань) / С.И. Кадошников // Растительные ресурсы. 1990, Т. 26, вып. 2. - С. 285-287.

8. Офицеров, Е. Н. Амарант перспективное сырье для фармацевтической промышленности. / Е.Н. Офицеров // Химия и комп. модел. Бутлеровские сообщ. -2001.-№5.

9. Чернов, И. А. Амарант фабрика белка. / И.А.Чернов,, Б.Я. Земляной. - Казань : изд. Казанского ун-та, 1991. - 91 с.

10. Saunders R. Amaranthus: a potencial food and feed resourse. / R. Saunders, R. Becker. Adv. in cereal sci. and technol, 1984. - Vol. 6. - N 6. - P. 357-396.

11. Subba Rao P.V., Goering K.J. New starches V. Properties of the small granules from Amaranthus retroflexus. / P.V. Subba Rao, K.J. Goering. Cereal chem., 1970. - Vol. 47. -P. 655-661.

12. Sugimoto Y. Some properties of normal and waxy-type starches of Amaranthus hypochondriacus L. / Y. Sugimoto, K. Yamada, S. Sakamoto, H. Fuwa. Staerke, 1981. -Vol. 33.-N4.-P. 112-116.

13. Lakshminarayana G. Lipid class and fatty acid compositions of young Amaranthus gangeticus L. Leaves. / G. Lakshminarayana, A.J. Pantulu, K.S. Rao. J. Agric. Food Chem, 1984. - Vol. 32. - N 6. - P. 1361-1363.

14. Leon-Camacho M. "A detailed and comprehensive study of amaranth {Amaranthus cruentus L.) oil fatty profile." / M. Leon-Camacho, D.L. Garcia-Gonzalez, R. Aparicio. -Eur. Food Res. Technol, 2001. P. 349-355.

15. Ахмед-Заде, А. Ш. Препаративное получение сквалена из амарантов. / А.Ш. Ахмед-Заде, Н.А. Мамедов. Первая республиканская биохимическая конференция. Баку, "Элм", 1990.-33 с.

16. Xu S. Sterols of Amaranthaceae. / S. Xu, G.W. Patterson, K. Schmid. Phytochem, 1986.-Vol. 25.-N8.-P. 1883-1886.

17. Беликова, С. В. Опыт выращивания амаранта на Ставрополье. / С.В. Беликова, П.П. Гаевская, А.И. Подколзин. Возделывание и использование амаранта в СССР. Материалы I Всесоюзной научной конференции. Казань: изд. Казанского ун-та, 1991.-С. 37-46.

18. Pol van der F. Trans-cis isomerisation of carotenes its effect on the vitamin A potency of some common Indonesian foods. / F. Pol van der, S.U. Purnomo, H.A. Ros-malen van. Nutrition reports internat, 1988. - Vol. 37. - N 4. - P. 695-703.

19. Офицеров E. H. Углеводы амаранта и их практическое использование / Е.Н. Офицеров, В.И. Костин. Ульяновск, 2001. -178 с.

20. Becker R. A compositional study of amaranth grain. / R. Becker, E.L.Wheeler, K. Lorenz. J. Food Sci, 1981. Vol. 46. - N 4. - P. 1175-1180.

21. Stanek V. Uber das Vorkommen von betain in den Chenopodiaceae. / V. Stanek, K. Z. Domin Zuckerind. in Bohmen, 1909/10. - Vol. 34. - S. 297-308.

22. Schliemann W. Betalains of Celosia argentea. / W. Schliemann, Y. Cai, T. De-genkolb, J. Schmidt, H. Corke Phytochem, 2001. - Vol. 58. - P. 159-165.

23. Strack D. Hydrocinnamic acid esters of isocitric acid: accumulation and enzymatic synthesis in Amaranthus cruentus. / Strack D., Leicht P., Bokern M. Phytochem, 1987. -Vol. 26.-N 11.-P. 2119-2122.

24. Hegnauer R. Chemotaxonomie der Pflanzen. / Hegnauer R. Basel: Stuttgart. - 1964. -Bd. 3.-743 s.

25. Connick W.J. Identification and bioactivity of of volatile allelochemicals from amaranth residues. / W.J. Connick, J.M. Bradow, M.G. Legendre. J. Agric. Food Chem, 1989. - Vol. 37. - N 3. - P. 792-796.

26. Connick W.J. Identification of volatile allelochemicals from Amaranthus palmeri S. Wats. / WJ. Connick, J.M. Bradow, M.G. Legendre et all. J. Chem. Ecol., 1987. - Vol. 13.- N 3. - P. 463-472.

27. Kujala T.S. Betalain and phenolic compositions of four beetroot (Beta vulgaris) cultivars / T.S. Kujala, M.S. Vienola, K.D. Klika, J.M. Loponen, K. Pihlaja. Eur. Food Res. Technol, 2002. - 214. - P. 505-510.

28. Hempel J. Betaxanthin pattern of hairy roots from Beta vulgaris var. lutea and its alteration by feeding of amino acids. / J. Hempel, H. Bohm. Phytochem, 1997. - Vol. 44. -N5.-P. 847-852.

29. Stuppner H. Application of capillary zone electrophoresis to the analysis of betalains from Beta vulgaris. / H. Stuppner, R. Egger. J. Chromatogr. A, 1996. - Vol. 735. - NI-2. p. 409-413.

30. Wybraniec S. Betacyanins from vine cactus Hylocereus polyrhizus / S. Wybraniec, I. Platzner, S. Geresh, H. E. Gottlieb, M. Haimberg, M. Mogilnitzki, Y. Mizrahi. Phytochem, 2001. - Vol. 58. - P. 1209-1212.

31. Fernandez-Lopez J.A. Application of high-performance liquid chromatography to the charactcrization of the betalain pigments in prickly pear fruits / J.A. Fernandez-Lopez, L. Almcla. J. Chromatogr. A, 2001. - Vol. 913. - N 1-2. - P. 415-420.

32. Schliemann W. Betacyanins from plants and cell cultures of Phytolacca americana. / W. Schliemann, R.W. Joy, A. Komamine, J. W. Metzger, M. Nimtz, V. Wray, D. Strack. Phytochem, 1996. - Vol. 42. - N 4. - P. 1039-1046.

33. Mizrahi Y. Climbing and columnar cacti: new arid land fruit crops. / Y. Mizrahi, A. Nerd. In: Janick, J. Perspectives on New Crops and New Uses. American Society for Horticultural. Sci. Press, Alexandria, 1999. - P. 358-366.

34. Комиссаренко, С. H. Пектины их свойства и применение. / С.Н. Комиссарен-ко, В.Н. Спиридонов. - Растит. Ресурсы, 1998. - Т. 34, вып. 1. - С. 111-119.

35. Worth H.G.J. The chemistry and biochemistry of pectic substances. / H.G.J. Worth.

36. Royal Holloway College, University of London, Englefield Green, Surrey, Great Britain, 1967.-P.465-473.

37. Perez S. The three-dimensional structures of the pectic polysaccharides./ S. Perez, K. Mazeau, C. Herve du Penhoat. Plant Physiol. Biochem, 2000. - P. 37-55.

38. Оводов, Ю. С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Ю.С. Оводов. Биоорганич. Хим., 1998. - Т. 24. - № 7. - С. 483501.

39. Bonnin Е. Characterisation of pectin subunits released by an optimized combination of enzymes. / E. Bonnin, E. Dolo, A. Le Goff, J.F. Thibault. Carbohydr. Res, 2002. -Vol. 337.-N 18.-P. 1687-1696.

40. Zhong H.J. Capillary electrophoresis studies of pectins. / H.J. Zhong, M.A.K. Williams, D.M. Goodall, M.E. Hansen. Carbohydr. Res., 1998. - Vol. 308. - N 1-2. - P. 1-8.

41. Bedouet B. Rapid quantification of O-acetyl and O-methyl residues in pectin extracts. / B. Bedouet, B. Courtois, J. Courtois. Carbohydr. Res., 2003. - Vol. 338. - N 4. - P. 379-383.

42. Ralet M.C. Chromatographic study of highly methoxylated lime pectins deesterified by different pectin methyl-esterases. / M.C. Ralet, E. Bonnin, J.F. Thibault. J. Chroma-togr. B, 2001. - Vol. 753. - N 1. - P. 157-166.

43. Pellerin P. Structural characterization of red wine rhamnogalacturonan II. / P. Pel-lerin, T. Doco, S. Vidal, P. Williams, J.M. Brillouet, A. O'Neil. Carbohydr. Res., 1996.-Vol. 290.-N2.-P. 183-197.

44. Arslan N. Extraction of pectin from sugar-beet pulp and intrinsic viscosity molecular weight relationship of pectin solutions. / N. Arslan. J. Food Sci. Tech., 1995. - Vol. 32. -N5.-P. 381-385.

45. Ridley B.L. Pectins: structure, biosynthesis, and oligogalacturonide-related signaling. / B.L. Ridley, M.A. O'Neill, D. Mohnen. Phytochem., 2001. - Vol. 57. - P. 929-967.

46. Iglesias M.T. Extraction and characterization of sunflower pectin. / M.T. Iglesias, J.E. Lozano. J. food engineer, 2004. - Vol. 62. - N 3. - P. 215-223.

47. Vignon M.R. Structural features of the pectic polysaccharides isolated from retted hemp bast fibres. / M.R.Vignon, C. Garcia-Jaldon. Carbohydr. Res., 1996. - Vol. 296.1. N 1-4. P. 249-260.

48. Rcnard C.M.G.C. Structure of the repeating units in the rhamnogalacturonic backbone of apple, beet and citrus pectins. / C.M.G.C. Renard, M.J. Crepeau, J.F. Thibault. -Carbohydr. Res., 1995. Vol. 275. - N 1. - P. 155-165.

49. Mukhiddinov Z.K. Isolation and structural characterization of a pectin homo and ramnogalacturonan. / Z.K. Mukhiddinov, D.Kh. Khalikov, F.T. Abdusamiev, Ch.Ch. Av-loev. Talanta, 2000. - Vol. 53. - N 1. - P. 171-176.

50. Duan J. Structural features of a pectic arabinogalactan with immunological activity from the leaves of Diospyros kaki. / J. Duan, X. Wang, Q. Dong, J. Fang, X. Li. Carbohydr. Res., 2003. - Vol. 338. - N 12. - P. 1291-1297.

51. Schols H.A. Hairy (ramified) regions of pectins. 4. Occurrence of pectic hairy regions in various plant-cell wall materials and their degradability by rhamnogalacturonase / H.A. Schols, A.G. Voragen. J. Carbohydr. Res., 1994. - Vol. 256. - P. 83-95.

52. Schols H.A. A xylogalacturonan subunit present in the modified hairy regions of apple pectin. / H.A. Schols, E.J. Bakx, D. Schipper, A.G. Voragen. J.Carbohydr. Res.,1995. Vol. 279. - N 27. - P. 265-279.

53. Schols H.A. Different populations of pectic hairy regions occur in apple cell walls. / H.A. Schols, E. Vierhuis, E.J. Bakx, A.G. Voragen. J. Carbohydr. Res., 1995. - Vol. 275.-N2.-P. 343-360.

54. Azadi P. The backbone of the pectic polysaccharide rhamnogalacturonan-I is cleaved by an endohydrolase and an endolyase / P. Azadi, M.A. O'Neill, C. Bergmann, A.G. Dar-vill, P. Albersheim. Glycobiology, 1995. - Vol. 5. - P. 783-789.

55. Aldington S. Rhamnogalacturonan-II-a biologically-active fragment / S. Aldington, S.C. Fry. J. Exper. Bot., 1994. - Vol. 45. - P. 287-293.

56. Kobayashi M. Two chains of rhamnogalacturonan-II are cross-linked by borate-diol ester bonds in higher plant cell walls. / M. Kobayashi, T. Matoh, J. Azuma. Plant Physiol., 1996. - Vol. 110. - N 3. - P. 1017-1020.

57. Loomis W.D. Chemistry and biology of boron. / W.D. Loomis, R.W. Durst. Bio-Factors, 1992. - Vol. 3. - P. 229-239.

58. Kindel P.K. Solubilization of pectic polysaccharides from the cell walls of Lemna minor and Apium graveolens. / P.K. Kindel, L. Cheng, and B.R. Ade. Phytochem.,1996. Vol. 41. - N 3. - P. 719-723.

59. Golovchenko V.V. Structural studies of the pectic polysaccharide from duckweed1.mna minor L. И V.V. Golovchenko, R.G. Ovodova, A.S. Shashkov, Y.S. Ovodov. -Phytochem. 2002. - Vol. 60. - N 1. - P. 89-97.

60. Aspinall G.O. Gums and Mucilages / G.O. Aspinall. Adv. Carbohydr. Chem. Bio-chem., 1969. - Vol. 24. - P. 333-379.

61. Tomoda M. A reticuloendothelial system activating glycan from the rhizomes of Curcuma longa. / M. Tomoda, R. Gonda, N. Shimizu, M. Kanari, M. Kimura. Phytochem., 1990. - Vol. 29. - N 4. - P. 1083-1086.

62. Sakamoto T. Analysis of structure of sugar-beet pectin by enzymatic methods. / T. Sakamoto, T. Sakai. Phytochem., 1995. Vol. 39. - N 4. - P. 821-823.

63. Донченко, Jl. В. Технология пектина и пектинопродуктов. / Л.В. Донченко. М.1. ДеЛи, 2000. 256 с.

64. Barra G. A DSC study of thermal transitions of apple sistems at several water contents / G. Barra, P. Di Matteo, V. Vittoria, L. Sesti Osseo and A. Cesaro. J. of Thermal Analysis and Calorimetry, 2000. - Vol. 61. - N 2. - P. 351-362.

65. BeMiller J.N. Chemistry and Function of Pectins / J.N. BeMiller, M.L. Fishman, J.J. Jen. Eds Washington, D.C.: Am Chem. Soc., 1986. - P. 2-12.

66. Цепаева, О. В. Выделение, структурная идентификация и химическая модификация пектиновых веществ растения амарант и некоторых модельных соединений: автореф. дис. . канд. хим. наук. / О.В. Цепаева. Казань, 2000. - 20 с.

67. Kohn R. Ion binding on polyuronates alginate and pectin / R. Kohn. - Pure Appl. " Chem., 1975. - Vol. 42. - P. 371-397.

68. Rees D.A. In M.T.P. International Review of Sci. Biochemistry Series / D.A. Rees . -Biochemistry of Carbohydrates. P.l. Butterworths, London and University Park Press, Baltimore, MD, 1975. Vol. 5. - P. 165.

69. Rees D.A. Polysaccharide shapes and their interactions some recent advances / D.A. Rees. - Pure Appl. Chem., 1981. - Vol. 53. - N 1. - P. 1-14.

70. Rees D.A., Welsh E.J. Secondary and tertiary structure of polysaccharides in solutions and gels / D.A. Rees. Angew. Chem. Intern. Ed. Engl., 1977. - Vol. 16. - N 4. - P. 214-223.

71. Morris E.R. In Aggregation Processes in Solution. / E.R. Morris, I.I. Norton, E.W. щ Jones, J. Gormaly. Elsevier Sci Publishing Co., Amsterdam, 1983. - 549 p.

72. Ccsaro Л. Interaction of divalent-cations with polyuronates / A. Cesaro, F. Delben, S. Paoletti. J. Chem. Soc. Faraday Trans. I, 1988. - Vol. 84. - N 8. - P. 2573-2584.

73. Smidsroed O. Dependence upon the gel-sol state of the ion-exchange properties of alginates / O. Smidsroed, A. Haug. Acta Chem. Scand., 1972. - Vol. 86. - N 5. - P. 2063-2074.

74. Gyurcsik B. Carbohydrates as ligands: coordination equilibria and structure of the metal complexes. / B. Gyurcsik, L. Nagy. Coord. Chem. Rev., 2000. - Vol. 203. - N 1. -P. 81-149.

75. Braddock R.I. Pectin content of Meyer lemon / R.I. Braddoek, P.G. Grandall, I.W. Kesterson. J. Food Sci., 1976. - Vol. 41. - N 6. - 1486 p.

76. Фишман, Г. M. Физико-химические характеристики пектиновых веществ цитрусовых плодов. / Г.М. Фишман // Субтропические культуры. 1977, № 1-2. - С. 105-107.

77. Fuertes Р.С. Pectin content of by products from the Spanish citrus-fruit industry // P.C. Fuertes, I.J. Royo. Ion, 1954. - N 14. - P. 455-457.

78. Донченко, JT. В. Разработка и интенсификация технологических процессов получения пектина из свекловичного и других видов сырья: дис. докт. техн. наук. / Л.В. Донченко. Киев, 1990. - 360 с.

79. Ободович, А. Н. Получение пектинового концентрата из отходов производства цитрусовых настоев. /А.Н. Ободович, Н.М. Самопал // Электротехнология пектиновых веществ. Тезисы, докл. 3 научн.-технич. семинара К. 1992. - С. 41-42.

80. Ширко, Т. С. Пектиновые вещества яблок Белоруссии. / Т.С. Ширко, Л.М. Яро-хович // Консервн. и овошесуш. пром. 1983. - № 5. - С. 34-35.

81. Трибунская, А. Я. Содержание пектина в яблоках северных сортов. / А.Я. Трибунская // Пищ. технол. 1964. - № 5. - С. 24-27.

82. Зайко, Г. М. Содержание пектина в плодах, овощах, и продуктах их переработки (обзор) / Г.М. Зайко, И.А. Гайворонская, В.А. Хадкевич // Рук. деп. в редкол. журн. Пищ. технол. № 1793. - 1989. - С. 17.

83. Моисеева, В. Г. Физико-химические свойства пектинов яблок Кубани. / В.Г. Моисеева, В.Ю. Бархатов // Пищ. технол. 1972. - № 3. - С. 34-36.

84. Симхович, Е.Г. Разработка технологии пектинового концентрата и его производных: дис. . канд. техн. наук / Е.Г. Симхович. К. - 1992. - 295 с.

85. Гапоненков, Т. К. О распределении пектиновых веществ в корне сахарной свеклы / Т.К. Гапоненков // Сахарн. свекла. 1956. - № 10. - С. 36-37.

86. Фремель, А. Б. Использование отходов свекловичного производства. / А.Б. Фремель // М.: ЦНИИТЭИПищепром. 1963. - С. 115.

87. Хужоков Ж.Д. Производство и применение пектина (опыт Нальчикской кондитерской фабрики). / Ж.Д. Хужоков, В.В. Парфененко. Нальчик, 1961. - 111 с.

88. Литвак, И. М. Изучение технологических условий получения пищевого пектина из жома. / И.М. Литвак, М.И. Баранов // Тр. Киевского технол. инст. пищ. пром. -1959.-Вып. 21.-С. 16-19.

89. Парфененко, В. В. Усовершенствование технологии производства пектина из свекловичного жома: автореф. дис. . канд. техн. наук. / В.В. Парфененко. М., 1969. - 32 с.

90. Гапоненков, Т. К. О пектиновых веществах подсолнечника. / Т.К. Гапоненков, З.И. Проценко //Ж. прикл. хим. 1956. - Т.29. - № 9. - С. 1444-1447.

91. Абдуразакова С.Х. Пектинсодержащее сырье Узбекистана для производства пищевого пектина. / С.Х. Абдуразакова, А.С. Темирходжаев. Тр. Ташкент, политехи. ин-та, 1973. - Вып. 107. - С. 92-94.

92. Арифходжаев, X. А. Особенности подготовки сырья для производства пектина из отходов хлопководства. / Х.А. Арифходжаев. Тез. докл. Ш-го н.-т. сем. "Электротехнология пектиновых веществ". Киев, 1992. - 63 с.

93. Балтага, С. В. Технологическая схема производства пектина из кормового арбуза. / С.В. Балтага, М.С. Гримпель, В.В. Арасимович. Тр. Молд. НИИ орош. землед. и овощеводства, 1961. - Т.З. - С. 240-247.

94. Кондратенко, В. В. Биохимическое обоснование технологии пектиновых веществ из тыквы: дис. . канд. техн. наук / В.В. Кондратенко. Краснодар, 1999. -250 с.

95. Рустамбекова, Г. У. Сравнительная характеристика пектинов различного сырья. / Г.У. Рустамбекова, Д.Т. Мирзарахметова, С.Х. Абдуразакова // Виноград, и винод. 1992. - № 1-2. - С. 72-74.

96. Ярцева, Н. А. Характеристика пищевых пектинов из коры хвойных пород Сибири. / Н.А. Ярцева, Г.В. Пермякова, Р.А. Степень. Продовол. корм, ресурсы лесов Сибири. Красноярск, 1983. - 144 с.

97. Фишман, Г. М. Производство пектина из плодовой мякоти тунга / Г.М. Фишман, Т.В. Джабуа-Тр. Груз. НИИ пищ. пром., 1971. Т. 5. - С. 85-87.

98. Pruthi I.S. A study of factors affecting the recovery and quality of pectin from guava. / I.S. Pruthi, K.K. Mookerji, G. Lai. Indian Food Packer, 1960. - Vol. 14. - N 7. -P. 7-19.

99. Srirangarajan A.N. Characterisation of mango peel pectin. / A.N. Srirangarajan, A.J. Shrikhande. J. Food Sci., 1977. - Vol. 42. - N 1. - P. 289-290.

100. Datta R.K. Pectin extraction from fruits and vegetables. // R.K. Datta. Ins. Horticulture, 1987.-Vol. 11.-N2. P. 15-17.

101. Лебедев, E. И. Комплексное использование сырья в пищевой промышленности. / Е.И. Лебедев. М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982. - 238 с.

102. Белова, С. М. Пектин из льна и его отходов / С.М. Белова, Г.Т. Игнатьева, Л.В. Донченко. Научные и практические пути решения проблемы производства пектина: Тез. докл. I Всерос. н.-т. сем. Краснодар, 1994. - 46 с.

103. Кукта, Е. П. Пектиновые вещества эфиромасличных культур. Выделение и характеристика пектина Rosa canina. / Выделение и характеристика пектина Salvia sclarea. / Е.П. Кукта, В.Я. Чирва, Г.Н. Шадрин // Хим. природн. соед. 1979. - № 2. - С. 220-222.

104. Донченко, Л. В. Безопасность пищевого сырья и продуктов питания. / Л.В. Донченко, В.В. Надыкта. М.: Пищепромиздат, 1999. - 356 с.

105. Мохиачев И.Г. Технологические аспекты углубленной переработки табачныхотходов. / Мохначев И.Г., Давиденко Л.И. // Пищевая технология. 1998. - Т.1. - С. 40-43.

106. Thibault J.F. Studies of the length of homogalacturonic regions in pectins by acid-hydrolysis / J.F. Thibault, C.M.G.C. Renard, M.A.V. Axelos, P. Roger, M.J. Crepeau. -Carbohydr. Res., 1993. Vol. 238. - P. 271-286.

107. Kravtchenko T.P. Enzymatic and chemical degradation of some industrial pectins. / T.P. Kravtchenko, M. Penci, A.G.J. Voragen, W. Pilnik. Carbohyd. Polym., 1993. -Vol. 20.-P. 195-205.

108. Голубев, В. H. Пектин: химия, технология, применение / В.Н. Голубев, Н.П. Шелухина. М.: Издательство АТН РФ, 1995. - 387 с.

109. Fishman M.L. Characterization of pectin, flash-extracted from orange albedo by microwave heating, under pressure. / M.L. Fishman, H.K. Chau, P. Hoagland, K. Ayyad. Carbohydr. Res., 2000. - Vol. 323. - N 1-4. - P. 126-138.

110. Islam M.S. Effects of low hydrostatic pressure and moderate heat on texture, pectic substances and color of carrot. / M.S. Islam, N. Igura, M. Shimoda. 1. Hayakawa. Eur.• Food Res. TcchnoL 2003. Vol. 217. - N 1. - P. 34-38.

111. Pathak D.K. Self coagulation phenomenon of pectin in sunflower / D.K. Pathak, W.B. Date. J. Food Sci. and Techn., 1975. - Vol. 12. - N 2. - P. 94-95.

112. Zhou H.W. Pectin esterase, polygalacturonase and gel formation in peach pectin fractions. / H.W. Zhou, R. Ben-Arie, S. Lurie. Phytochem., 2000. - Vol. 55. - N 3. - P. 191-195.

113. Constenla D. Effect of Pomace Drying on Apple Pectin / D. Constenla, A.G. Ponce, J.E. Lozano. Lebensm. -Wiss. u. -Technol., 2002. Vol. 35. - P. 216-221.

114. Роговин, 3. А. Химия целлюлозы. / З.А. Роговин. М. : Изд. Химия, 1972. -519с.

115. Thakur B.R. Chemistry and uses of pectin / B.R. Thakur, R.K. Singh, A.K. Handa .- Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 1997. Vol. 37. - P. 47-73.

116. Ben-Arie R. Pectic changes occurring in Elberta peaches suffering from woolly breakdown. /R. Ben-Arie, S. Lavee. Phytochem., 1971. - Vol. 10. - N 3. - P. 531-538.

117. Pressey R. Separation and characterization of endopolygalacturonase and exopoly-galacturonase from peaches. / R. Pressey, J.K. Avants. Plant Physiology, 1973. - Vol. 52. - P. 252- 256.

118. Buescher R.W. Role of pectinesterase and polygalacturonase in the formation of woolliness in peaches. / R.W. Buescher, R.J. Furmanski. J. of Food Sci., 1978. - Vol. 43. - P. 264-266.

119. Ben-Arie R. Pectolytic enzyme activity involved in woolly breakdown of stored peaches. / R. Ben-Arie, L. Sonego. Phytochem., 1980. - Vol. 19. - P. 2553-2555.

120. Shen Z. Purification and characterization of polygalacturonase from the rice weevil, Sitophilus oryzae (Coleoptera: Curculionidae) / Z. Shen, J.C. Reese, G.R. Reeck. Insect Biochem. Molec. Biol., 1996. - Vol. 26. - N 5. - P. 427-433.

121. Ros J.M. Extraction, characterization, and enzymatic degradation of lemon peel * pectins. / J.M. Ros, H.A. Schols, A.G.J. Voragen. Carbohydrate Research, 1996. - Vol.282.-N 2.-P. 271-284.

122. Kitagavva Y. Isolation of p-galactosidase fractions from Japanese pear: activity against native cell wall polysaccharides. / Y. Kitagawa, Y. Kanayama, S. Yamaki. -Physiologia Plantarum, 1995. Vol. 93. - N 3. - P. 545-550.

123. Lerouge P. Structural characterization of endo-glycanase-generated oligoglycosyl side-chains of rhamnogalacturonan I / P. Lerouge, M.A. O'Neill, A.G. Darvill, P. Alber-sheim. Carbohydr. Res., 1993. - Vol. 243. - P. 359-371.

124. Edashige Y. Rhamnogalacturonan II from cell walls of Cryptomeria japonica. / Y. Edashige, T. Ishii. Phytochem., 1998. - Vol. 49. - N 3. - P. 681-690.

125. Hennink H. Production, characterization and application of rhamnogalacturonase. / H. Hennink, H. Stam, M.G. Oort. Pectins and pectinases: proceedings of an International symposium. Wageningen, Netherlands, 1996. P. 485-494.

126. Wang X.S. Structure and potential immunological activity of a pectin from Centella asiatica (L.). Urban. / X.S. Wang, Q. Dong, J.P. Zuo, J.N. Fang. Carbohydr. Res., 2003.- Vol. 338. N 22. - P. 2393-2402.

127. Ашубаева, 3. Д. Химические реакции пектиновых веществ. / З.Д. Ашубаева. -Фрунзе, 1984. 186 с.

128. Kohn R. Distribution of free carboxyl groups in the molecule of pectin after esterifi-cation of pectin and pectinic acid by methanol / R. Kohn, I. Furda. Collect. Czech. Chem. Commun., 1969. - Vol. 34. - P. 641-648.

129. Renard C.M.G.C. Acetylation and methylation of homogalacturonans 1: optimisation of the reaction and characterisation of the products / C.M.G.C. Renard, M.C. Jarvis.- Carbohyd. Polym., 1999. Vol. 39. - P. 201-207.

130. Kohn R. Dissociation of acetyl derivatives of pectic acid and intramolecular binding of calcium ions to those substances / R. Kohn, A. Malovikova. Collect. Czech. Chem.

131. Commun., 1977. Vol. 43. - P. 1709-1719.

132. Филиппов, M. П. Инфракрасные спектры пектиновых веществ. / М.П. Филиппов. Изд. Штиинца, 1978. - 75 с.

133. Kratchanov С. Reaction of appel pectin with ammonia / C. Kratchanov, P. Denev, M. Kratchanova. Inter. J. Food Sci. Techn., 1989. - Vol. 24. - P. 261-267.

134. Андреева, M. А. Ферменты обмена фолиевой кислоты. / M.A. Андреева. М. : Наука, 1974. - 96 с.

135. Андреева, М. А. Витамины группы фолиевой кислоты. / М.А. Андреева М. : Изд. АН СССР, 1963.- 63 с.

136. Лущевская, Г. М. Определение фолиевой кислоты в плодах и овощах. / Г.М. Лущевская. В кн. Труды III Всесоюзн. семинара по биологически активным лечебным веществам плодов и ягод. Свердловск. - 1968. - 476 с.

137. Мс Cann M.C. Plant cell wall architecture: the role of pectins. / M.C. Mc Cann, K. Roberts. Pectins and pectinases: proceedings of an International symposium. - Wageningen, Netherlands. - 1996. - P. 91-107.

138. Mc Cann M.C. Architecture of the primary cell wall. / M.C. McCann, K. Roberts. -In: Lloyd, C.W. (Ed.), The Cytoskeletal Basis of Plant Growth and Form. Academic Press, London, 1991.-P. 109-129.

139. Carpita N.C. Structural models of primarycell walls in .owering plants: consis-tencyof molecular structure with the physical properties of the walls during growth. / N.C. Carpita, D.M. Gibeaut. Plant J. 3, H, 1993. - P. 1-30.

140. Cathala B. Synthesis, characterisation and water sorption properties of pectin-dehydrogenation polymer (lignin model compound) complex. / B. Cathala, B. Chabbert, C. Joly, P. Dole, B. Monties. Phytochem., 2001. - Vol. 56. - N 2. - P. 195-202.

141. Сапожникова, Е. П. Пектиновые вещества плодов. / Е.П. Сапожникова. М. : ф Наука, 1965.- 182 с.

142. Hayashi T. Formation of UDPxylose and xyloglucan in soybean. / T. Hayashi, T. Koyama, K. Matsuda. Plant Physiol., 1988. - Vol. 87. - N 2. - P. 341-345.

143. Orellana A. Enzymatic synthesis and puri.cation of 3H.uridine diphosphate galacturonic acid for use in studying Golgi-localized transporters. / A. Orellana, D. Mohnen. -Anal. Biochem., 1999. Vol. 272. - P. 224-231.ф

144. Orellana A. Topography and function of Golgi uridine-50-diphosphatase from pea stems. / A. Orellana, G. Neckelmann, L. Norambuena. Plant Physiol., 1997. - Vol. 114. -P. 99-107.

145. Doong R.L. Solubilization and characterization of a galacturonosyltransferase that synthesizes the pectic polysaccharide homogalacturonan. / R.L. Doong, D. Mohnen. -Plant J., 1998. Vol.13. - P. 363-374.

146. Liljebjelke K. Enzymatic synthesis and puri.cation of uridine diphosphate 14C. galacturonic acid: a substrate for pectin biosynthesis. / K. Liljebjelke, R. Adolphson, K. Baker, R.L. Doong, D. Mohnen. Anal. Biochem., 1995. - Vol. 225. - P. 296-304.

147. Basu S.S. A facile enzymatic synthesis of uridine diphospho-14C.galacturonic acid. / S.S. Basu, G.D. Dotson, C.R.H. Raetz Anal. Biochem., 2000. Vol. 280. - P. 173177.

148. Barash I. Purification of Geotrichum candidum endopolygalacturonase from culturc and from host tissue by affinity chromatography on cross-linked polypectate. /1. Barash, E. Zilberman, L. Marcus. Physiol. Plant Pathol., 1984 . - Vol. 25. - P. 161-169.

149. Moshrefi M. Purification and characterization of two tomato polygalacturonase isoenzymes. / M. Moshrefi, B.S. Luh. J. Food Biochem., 1984. - Vol. 8. - P. 39-54.

150. Shanley N.A. Isolation and characterization of an endopolygalacturonase from Phy-anerochacte chrysosporium. / N.A. Shanley, L.A.M. van den Broek, A.G.J. Voragen, M.P. Coughlan. J. Biotechnol., 1993. - Vol. 28. - P. 179-197.

151. Smith C.J.S. Antisense RNA inhibition of polygalacturonase gene expression in transgenic tomatoes. / C.J.S. Smith, C.F. Watson, J. Ray, C.R. Bird, P.C. Morris, W. Schuch, D. Grierson.-Nature, 1988. Vol. 334. - P. 724-726.

152. Clarke A.E. Molecular aspects of recognization and response in the pollen stigma interactions. / A.E. Clarke, P.A. Glesson. Rec. Adv. Phytochem., 1981. - Vol. 15. - P. 161-211.

153. Collmer A. The role of pectic enzymes in plant pathogenesis. / A. Collmer, N.T. Keen. Ann. Rev. Phytopathol., 1986. - Vol. 24. - P. 383-409.

154. Adams J.B. Pectinase in saliva of Mysis persicae (Sulz) (Homoptera: Aphididae). / J.B. Adams, J.W. Mc Allan. Can. J. Zool., 1956. - Vol. 34. - P. 541-543.

155. Adams J.B. Pectinases in certain insects. / J.B. Adams, J.W. Mc Allan. Can. J. Zool., 1958. - Vol. 36. - P. 305-308.

156. Ma R. Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivare secretions of living greenbugs, Schizaphus graminum (Homoptera: Aphididae). / R. Ma, J.C. Reese, W.C. Black, C.P. Bramel. J. Insect Physiol., 1990. - Vol. 36. - P. 507-512.

157. Laurema S. On the occurrence of pectin polygalacturonase in the salivare glands of Heteroptera and Homoptera Auchenorrhyncha. / S. Laurema, P. Nuorteva Ann. Ent. Fenn., 1961.-Vol.27.-P. 89-93.

158. Laurema S. Studies on enzymes in the salivare glands of Lygus rugulipennis (Hemiptera, Miridae). / S. Laurema, A. Varis, H. Mettinen. Insect Biochem. Molec. Biol., 1985.-Vol. 15. -P 211-224.

159. King E.E. Pectinase from boll weevil larvae, Anthonomus grandis. / E.E. King. J. Insect Physiol., 1972. - Vol. 18. - N 7. - P. 1295-1301.

160. Shukle R.H. Identification of pectinase in larvae of the Hessian fly. / R.H. Shukle, H.V. Scheller, J.E. Foster. Indiana Acad. Sci., 1985. - Vol. 94. - P. 305.

161. Campbell B.C. On the role of microbial symbiotes in herbivorous insects. / B.C. Campbell. Insect- Plant Interactions, (edited by Bemays E.A.) Press. Boca Ration, Florida., 1989.-Vol.1.-P. 1-44.

162. Campbell B.C. Phylogeny of symbiotic bacteria of four weevil species (Coleoptera: Curculionidae) based on analysis of 16 S ribosomal DNA. / B.C. Campbell, T.S. Bragg and C.E. Turner. Insect Biochem. Molec. Biol., 1992. - Vol. 22. - P. 415-421.

163. Zabotina O.A. Rhizogenesis in buckwheat thin-cell-layer explants: effect of plant oligosaccharides / Zabotina O.A., Gurjanov O.P., Ibragimova N.N., Ayupova D.A., Lo-zovaya V.V. Plant Sci., 1998. - Vol. - 135. - N 2. - P. 195-201.

164. Паушева, 3. П. Практикум по цитологии растений. / З.П. Паушева М. : Колос, 1974.-288 с.

165. Максютина, Н. П. Рослиш антиоксиданти i пектини в л1-кунанш i профилак-Timi променевих уражень i детоксикацн организму / Н.П. Максютина, Л.Б. Пилип-чук// Фармац. Журн. 1996. № 2. - С. 35-41.

166. Kohnova Z. Pouzitie pectinu vo farmacii a medicinu / Z. Kohnova. Ceskoslov, farmazia, 1977.-Vol. 7. - P. 316-322.

167. Кацсва, Г. H. Исследование взаимодействия пектиновых веществ с солями меди, ртути, цинка и кадмия / Г.Н. Кацева, Е.П. Кухта, Э.П. Панова, В.Я. Чирва //. -Химия природ, соединений. 1988. - Т. 2. - № 2. - С. 171-179.

168. Акимов, И. Г. Пектиновые вещества и их характеристика. / И.Г. Акимов //. -Сб. науч. тр. Ивановского гос. мед. инст. Иваново. 1957. - Т. 13. - С. 65-72.

169. Каминская, Ф. И. Исследование антибактериальных свойств яблочного пектина. / Ф.И. Каминская, С.И. Юрченко // Консерв. и овощесуш. пр-ть. 1975. - Т. 4. -№4.-С. 35-37.

170. Потиевский, Э. Г. Опыт экспериментального и клинического исследования пектина. / Э.Г. Потиевский, А.Н. Садыкова, И.М. Мухитдинов // Науч.-практ. конф.: Тез. докл. Ташкент. 1990. - С. 119-120.

171. Потиевский, Э. Г. Бактерицидное действие пектинов на возбудителей острых кишечных инфекций. / Э.Г. Потиевский, З.Д. Ашубаева и др. // Мед. ж. Узбекистана.-1991.-Т. 7.-С. 20-22.

172. Потиевский, Э. Г. Концепция экологического подхода к терапии кишечных инфекций. / Потиевский Э.Г., Бондаренко В.М. //ЖМЭИ. 1997. - № 2. - С. 98-101.

173. Стрельников, В. В. Использование пектина и лигнина в рационах цыплят-бройлеров, как факторов, нивелирующих негативное действие нитратов на организм человека. // В.В. Стрельников. Краснодар. КГАУ, 1996. - 56 с.

174. Рахнев Н. Пектин съвременни аспекта на приложение // Н. Рахнев, Ив. Исаев. - Фармация (София). - 1981. - Т.31. - № 6. - С. 63-68.

175. Pienta K.J. Inhibition of spontaneous metastasis in a rat prostate cancer model by oral administration of modified citrus pectin. // K.J. Pienta. I. Natl. Cancer Inst., 1995, Vol. 87.-N5.-P. 348-353.

176. Piatt D. Modulation of the lung colonization of В 16:fl melanoma cell by (modified) citrus pectin. // D. Piatt. -1. Natl. Cancer Inst., 1992. Vol. 84. - N 6. - P. 438-442.

177. Raloff J. Pectin helps fight cancer's spread. // Sci. news. 1992. - Vol. 141. - N 12. -P. 180.

178. Yamada H. Contribution of pectins on health care. / H. Yamada. Pectins and pect-inascs: proceedings of an International symposium. - Wageningen, Netherlands, 1996. -P. 577-582.

179. Szu S.C. Synthesis and some immunological properties of an O-acetyl pectin poly(l->4)-alpha-D-Gal/?A.-protein conjugate as a vaccine for typhoid-fever. / S.C. Szu,

180. S. Bystricky, M. Hinojosa-Ahumada, W. Egan, I.B. Robbins. Infect. Immun., 1994.1. Vol. 62. P. 5545-5549.

181. Smee D.F. Effects of plant derived polysaccharides on murine cytomegalovirus and encephalomyocarditis virus infections in mice. / D.F. Smee, A.J. Verbiscar. Antiviral Chem. Chemother., 1995. - Vol. 6. - P. 385-390.

182. Nakano M. Polysaccharide from Aspalathus linearis with strong anti-HIV activity. / M. Nakano, Y. Itoh, T. Mizuno, H. Nakashima. Biosci. Biotech. Biochem., 1997. - Vol. 61.-P. 267-271.

183. Kiyohara H. Effect of oral administration of a pectic polysaccharide fraction from a kampo (Japanese herbal) medicine "Juten-Taiho-to" on antibody-response of mice. / H. Kiyohara, T. Matsumoto, N. Takemoto, H. Kawamura, Y. Komatsu, H. Yamada. Planta

184. Med., 1995. -Vol. 61. P. 429-434.

185. Nosalova G. Antitussive activity of a rhamnogalacturonan isolated from the roots of Althaea officinalis L, Var robusta. / G. Nosalova, A. Strapkova, A. Kardosova, P. Capek . -Carbohydr. Chem., 1993. Vol.12. - P. 589-596.

186. Пат РФ № 2134991- 1999. Способ получения белка из растительного сырья. / А.И. Коновалов, Е.Н. Офицеров, Н.А. Соснина, В.Н. Шекуров, В.Ф. Миронов, В.В.

187. Карлин, А.А. Лапин, С.Т. Минзанова, А.Н. Карасева, А.Н. Бережной, А.Я. Мутрисков; заявитель и патентообладатель Каз. ИОФХ им. А.Е. Арбузова -№ 97119239/13 ;заявл. 18.11.97 ; опубл. 27.08.99.-Б.И. №24.-С. 146.

188. Kacurakova М. FT-IR study of plant cell wall model compounds: pectic polysaccharides and hemicelluloses / M. Kacurakova, P. Capek, V. Sasinkova, N. Wellner, A.Ebringerova. Carbohydr. Polym., 2000. - Vol. 43. - P. 195-203.

189. Coimbra M.A. FTIR spectroscopy as a tool for the analysis of olive pulp cell-wallpolysaccharide extracts / M.A. Coimbra, A. Barros, D.N. Rutledge, I. Delgadillo. Carbohydr. Res., 1999.-Vol. 317.-N 1-4.-P. 145-154.

190. McCann M.C. Fourier-transform infrared microspectroscopy is a new way to look at plant cell walls / M.C. McCann, R. Hammouri, R. Wilson, P. Belton, K. Roberts. -Plant Physiol., 1992. Vol. 100. - P. 1940-1947.

191. Bock K. Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Monosaccharides. / К. Bock, C. Pedersen. Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry, 1983.-Vol.41.-P.27-66.

192. Алексеев, Ю. E. Комплексы природных углеводов с катионами металлов. / Ю.Е. Алексеев, А.Д. Гарновский, Ю.А. Жданов // Усп. Химии. 1998. - Т.67. -Вып.8. - С. 723-744.

193. Крисс, Е. Е. / Е.Е. Крисс, И.И. Волченскова, Л.И. Бударин // Координационная химия. 1990. - Т.6. - Вып.1. - С.11-23.

194. Хьюз, М. Неорганическая химия биологических процессов. / М. Хыоз; пер. с англ. М., 1983.-414 с.

195. Верту, Дж. Теория и практическое применение метода ЭПР. / Дж. Верту, Дж. Балтон ; пер. с англ. М.: Мир. - 1975. - 548 с.

196. Богданов, Г. А. Кормление сельскохозяйственных животных. / Г.А. Богданов. М.: ВО Агропромиздат, 1990. - 527 с.

197. Войнар, А. О. Биологическая роль микроэлементов в организме животных и человека. // А.О. Войнар. М.: Советская наука, 1953. - 490 с.

198. Хэгглин, Р. Дифференциальная диагностика внутренних болезней. / Р. Хэгг-лин ; пер. с англ. М.: Фирма «Миклош», Инженер, 1993. - С. 62-63.

199. Лакин, Г. Ф. Биометрия. / Г.Ф. Лакин. М. : Высшая школа, 1990. - С. 113124.

200. Казицына, Л. А. Применение УФ-, ИК- и ЯМР спектроскопии в органической химии./Л.А. Казицына, Н.Б. Куплетская. -М.: Высшая школа, 1971. 263 с.

201. Авцып, А. Г. Микроэлементозы человека (этиология, классификация, органо-патология). / А.Г. Авцып, А.А. Жаворонков, М.А. Риш, JI.C. Строчкова. М. : Медицина, 1991.-494 с.

202. Лазарева, Л. В. Применение пектинов в производстве хлебопекарных продуктов. / Л.В. Лазарева // Пищевая промышленность. 1995. - № 5. - С. 10-11.

203. Бакин, В. М. Роль янтарной кислоты как энергетического источника в составе пищевых продуктов/В.М. Бакин // Пиво и напитки. 1998. - № 1. - С. 34-35.

204. Кондрашова, М. Н. Терапевтическое действие янтарной кислоты. / М.Н. Кон-драшова. М.: НИИ Биофизики РАН, 1974. - 230 с.

205. Худых, Т. В. Использование янтарной кислоты в рецептуре диетических маргаринов / Т.В. Худых, Л.П. Тертышная, Е.А. Гутина // Пищевая технология. 1998. - № 1. - С. 36-38.

206. Сергеев, А. И. Некоторые аспекты применения карбоновых кислот / А.И. Сергеев // Пищ. пром-сть. 1989. - № 2. - С. 26-29.