Выделение, идентификация и изучение физико-химических и биологических свойств препаратов, обладающих антипаразитарной активностью тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



1ЧХ:СИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ MИДИ!1H ПСКИХ ПАУК НАУЧНО-ИССЛНДОВАТЕШЬСКИИ ИНСТИТУТ ПО ИЗЫСКАНИЮ НОВЫХ АНТИБИОТИКОВ

с

Ня правах рукописи.

ШОПОТОВА ЛЮДМИЛА ПЬТЮПНА

ВЫДЕЛЕНИЕД1ДЁ1 ГГИФИКЛЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ФИ3ИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ с: ВО ЙСТ ! Л1 РЕ 11А РАТО В,О В Л АДА !ОЩ ИХ АКТИПЛГЛЗИТЛРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ.

02.00.10-бисх>ргянимсская химия,

ХИМИЯ Природных И фиЗЖЯОГИЧССКН HK1UIUIUX HCIIIfCIIl

Л н i «ре <î с [xi г днсс«piïiuiH m соискание >"1еноЙ cicnemi КЛПДНДЯТН ХИМ!Г:ССКИХ наук

Работа выполнен« в Государственном ниушоисслсдоадгсл1>с*сом инсткту1с антибиотики» и фермоггс® медицинского назначения.

Нхуший руко&одаггмй.:

доктор химических наук Ю Д. III в»вю

ОфшхЕШКЛше онаонеши:

доктор химические наук.профессор Г.С.Кггрух*.

кандидат химических наук Ю.В.Жддлотя

Ведущая оршгюшта:

Хнмихо-фармацсвтачесхиЯ институт (Сшкт-Пстсрбург).

Защита состоятся " 1993г. в_часа» на

заседании специализированного совета Д.001.05.01 при Нвучмо-нсслеяоватсльсхом институте по изысканию новых антибиопосо® по адресу: 119867 Москва.ул.Б.11ирсгс®ская.д.11.

С дисоергацксй можно сонакомитьси & библиотеке Научно-исслсдовапгеяьского института по кзыскшюо новых атмбиотихсФ РАМН.

Автореферат разослан " ^" 1993г.

Ученый оекретарь соьсга,

кандадаг биодошчсскнх наук

/ТА.Усовисыш/

Актуальность проблемы. Интенсификация сельского хозяйства в нашей стране связана с решением целого ряда проблем,одной из которых является разработка и применение новых антибиотиков и препаратов, обладающих антапаразитарншк свойствами. В настоящее время во всем мире широко и успешно используигся микробиологические средства защиты растений. В нашей стране ежегодно эти препараты применяются на площади 7-0 млн.га. Однако, объемы применения биопрепаратов в обеих масштабах зашиты растений очень невелики и составляют Ь-6? (Кандыбин.1909). Объясняется это, в первую очередь,недооценкой возможностей микробиологических методов зашиты растений и их экологической значимости. С другой стороны, качество применяемых и других форм микробных препаратов пока ецэ низкое и срок годности их мал.

В связи с этим актуальной является проблема поиска новых микроорганизмов. продуцирующих биологически активные вещества с широким спектром англларазитарного действия. Важность пробтемы обуславливается и тем, что против некоторых вредителей ; астений эффективных биопрепаратов нет;в условиях кэ закрытого грунта применение химических препаратов запрещено. Использование химических средств защиты растений связано с целым рядом нежелательных явлений .'вредное воздействие на само защищаемое растение я окруяэгцую сроду,появление резистентных форм растений-вредителей (Мзкажанова.1992). Биоинсектициды используется ие только как эффективные сродства борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур, но и с успехом применяется в различных областях народного хозяйства,например.в ветеринарии л в животноводстве [Росланиева,19871.

Таким образом, несомненно важным с научной и практической точек зрения представляется поиск ногых Ококнсекткцидсв,разработка способов их выделения п очистки, а тзкге ¡иентификацля л устан:-в-'■--кие их структур«.

В процесса направленного скр'.н'.'.кгз стрептсйкцетов-лрэдуцентов

новых препаратов с антипаразитарноЯ активностью в ГНИ'Шг оыли ни-делены культуры актиномицетов,идентифицированные как Б^герСотусез 11рпап1 (5.11рьап1) и 5 (герЮшусез аигапШасиз (Б.аигагНиасиз). Из штамма Б.ИриаШ Оыл выделен препарат лиоцид.обладающий высокой активность») в отношении саркоптоидного клеща , из шгамып 5. аигаШиасиз - препарат алейшд .активный в отношении оранжерейной Овлокрылки , которые и явились оОьектами наших исследований.

Цель исследования: Характеристика компонентного состава комплексных препаратов лиотип и олейцида.изучение свойств и идентификация активных вешэств лиоцида и алейцида,установление их структуры. В связи с этим Оыли поставлены следующие задачи:

- разделение .комялексашх лоаларатав лиоцида я алейцида компоненты.

- яыдндпние и очистка активных компонентов , хрплктргшспик* . чу Физико-химических и биологических свойств.

- у1с.танавлешп ,Л1кжчаског:о .сухшния .вилелеяных .лктиешх соединений.

Научная новизна и практическая ценность раОоты. Автором

диссертации впервые проведено выделение активных компонентов лиоцила и алойцида,обладающих высокой акарицидной и инсектицидной активностью. Проведена идентификация основного компонента комплекса лиоцида с нонактином, а из комплексного' препарата алейцид выделено новое соединение,названное алвйцидом В. Установлены структуры основных активных компонентов комплексного препарата алейцида . Впервые получены данные об акарицидной активности нонактина. Лиоцид является единственным отечественным препаратом, эффективным против'

саркоптоидных клещей Р80Г0р1еБ с11п1си11, вызиваицих ушную

часотку (псороптоз) у животных. Препарат испытывалол п

Фермерских хозяйствах Тюменской области. Алейцид является единственным отечественным препаратом,эффективным против оранжерейной пплокрмлки ХгШеагойев уарогаг1ип. Препарат алойцид проходил

испытания в закрытом грунте на растениях томатов и порцах, а также в полевых условиях на посевах хлопчатника в Средней Лзии и показал высокую эффективность в отношении оранжерейной белокрылки.

Разработан метод контроля биологической активности комплексного препарата алейцида н метод количественного определения тетраиактина и других тетролидных антибиотиков.Методы получили апробацию и приняты для анализа производственных партий препаратов алейцида и лиоцида,

Апробация раСоты.Результаты работы доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Биологически активные соединения.Синтез и использование",г.Пенза,1992г.

Публикации.Материалы диссертации опубликованы в 2 статьях и 1 тезисах.

Структура и обьем диссертации: Диссертация сострит из введения,обзора литературы,обсуждения результатов исследования,описания основных методов', исследования .выводов. , списка лите-

I

ратуры.Диссертация изложена на 140 страницах;из них 81 машинописного текста, 38 рисунков, 21 таблица. Завершается работа выводами и списком цитируемой литературы,включающим 156 наименований,из них 124 иностранных. В приложении приводятся методы количественного определения лиоцида и алейцида и акты их апробации.

2.Результаты исследования.

Комплексные препараты лиоцид и алейцид выделяли из мицелия Б.11ртап1 и Б.аигагииасив, соответственно, экстракцией последних метанолом. После удаления растворителя и обработки осадков получали маслянистую массу янтарного цвета в случае лиоцида и порошок розового цвета в случае алойцида.

2.I.Физико-химические и биологичоские свойства комплекса лиоцида. Биоавтографическое проявление хроматограммы лиоцида с

тест-культурами показало.что лноцид содержит два антибиотических вещества , одно из которых подавляет рост Вас11из БиЫ111з,другое-

- -

СашШа ШШ8. Результаты разделения лиоцида на компоненты методом колоночной хроматографии представлены в таблице I.

Таблица 1.

Хроиатографмескоб разделение диоиила на кремневой кислоте.

N Элюент Кол-во. Кол-во

фр. элюентэ.мл. выделен.в-ва • мг.

1 гексан 60 20

2 гексан-эфир.99:1 100 5

3 гексан-эфир,95:5 100 ■ 20

4 гексан-эфир,92:8 100 40

5 гексан-эфир,05:15 100 30

6 эфир 100 450

7 метанол 60 275

Основными фракциями являются соединения,элюируемые эфиром и метанолом (фракции 6 и 7 ). Они же обладают инсектицидной и акари-цидной активностью.Анализ выделенных фракций показал,что фракция 1 представляет собой углеводорода:фэрнвзан (2.6,1О-триметиллодекан), пристан (2,6,10*I4 - тетраметиллентадекан).фитан (2,6.10,14-тетра-метилгексадекан) , докозан (2-метилгенэй козан) и скволан(2.6.10.15. )9,23-гексаиетилтетракоэан),В;состав фракций 2 и 3 входят кислоты нормального, строения (тетрадекановая.гексадекановая.октадекановая) и кислоты с разветвленной! ^впью типа изо- и антеизо- во фракции 7 качественными реакциями, обнаружены фосфолипиды. Кирше кислоты, входящие в состав фосфолипидов,включали кислоты с разветвленной цепью .содержащие от 12 до 18 атомов углерода. Основными кислотами были пента- и гэптадекаяовые кислоты типа изо- и антеизо-, гептадекановая (пальмитиновая ) и изопальмитиновая .

Сопоставление лилидного состава лиоцида с липидным

- л -

состввом,выделенным из мембран актиномицетов,показало их значительную близость.Поскольку основными соединениями комплексного препарата лиоцид являются фракции 6 и 7,в дальнейшем основное внимание было сосредоточено на препарате,выделенном из этих фракций и приведена его идентификация.

2.2 Выделение и идентификация нонактина.Препарат.выделенный из Фракций 6 и 7 после перекристаллизации из ацетона,представляет собой бесцветные иглы с Тил 145-и7°С, нерастворим в воде, но растворим в большинстве органических растворителей((хлоро форм,спирты,ацетон.укс усная кислота, диметилсульфоксид). Антибиотик не содержит в своем составе азота,оптически неактивен, в УФ-спектре выделенного вещества

I

имеется слабый максимум поглощения в области 203-211 нм (Е =8) и

см

плечо в области 260 нм.В ИК-спектре выделенного вещества наблюдаются интенсивные полосы поглощения в области 1730 см и ЮЬО- 11201 см^слояс-но*,с(фирные. связи). Препарат обладает высокой активностью в отношении саркоптоидного клеща Рзогор1еа сил1си11.

Ретроспективное сравнение физико-химических и биологических свойств полученного препарата со свойствами соединений.выделенных из актиномицетов и обладающих инсектоакарицидмыми свойствами, позволило отнести выделенный препарат к группе тегролидов.Наибольшая близость по фмзико-химическим характеристикам наблюдалась с нонактином (Табл.2).Об их идентичности говорят следующие данные:

хроматографическая подвижность препарата и нонактина в ряде систем растворителей была одинаковой. Молекулярная масса антибиотика, определенная методами касс-спектрометрии электронного ударз и методом ЭРИАД.составляла 736 а.е.м.,что соответствует данным элементного состава .и молекулярной массе нонактина. Фрагментация молекулы в масс-спектре выделенного препарата идентична фрагментации нонактина (Рис.1). Идентичны нонактину и ИК-.ЯМР-спектры выделенного соединения. Исследуемый антибиотик, как и нонактин,активен против грамполо.»..'лельных бактерий и неактивен против дрожжей и грибов.Все

-.я -

эти данные позволили нам утверждать,что выделенный нами препарат есть тетролидный антибиотик нонактин .

Структурная формула нонактина .

Таблица 2.

Сравнительная характеристика физико-химических и биологических свойств выделенного антибиотика с нонактином.

Антибиотик Продуцент Брутто-формула Мол. масса Т пл от3он Ув^пе^т X ПЯ1,

I 2 3 4 5 6 7

Исследуемый Б.Пр- С40Н64 °12 736 145- 0+2 208-211

антибиотик там 147 260

Нонактин Б. 1811- С4о"б4 °12 736 147- 0+2 211-213

з1таеп< 140 260

818

вислог и активн

Г»

Г*

Компонентный_состав тетролидного комплекса.Из литературы

известно, что продуценты тетролидных антибиотиков синтезируют смесь тетролидов.В связи с этим было проведено разделение лиоцида на .компоненты методом противоточного распределения при 50-ти переносах в системе гексан-этанол-вода (20:17:3).Анализ 'выделенных фракций методом масс-спектрометрии и ТСХ в системах:хлороформ-этилпцотат

(1:2) ;гексан-эфир (1:2) показал, что исследуемый антибиотический комплекс представляет собой смесь тетролидных антибиотиков.В масс-спектрах фракций 4(трубки 2 4-30) и 5(31-35) имеются молекулярные ионы с m/z 736 +14п(п => 1,2,3,4,5) ,что говорит о присутствии в этих Фракциях моно- ,ли-.три- и тетрвнактина .Основным компонентом смеси является антибиотик нонактин(фракция ЗЛ6-23(.Определение акаршшдной активности выделенных препаратов показало,что высокую степень гибели клешей вызывали фракции , содержащие в своем составе наибольшее количество тетранактинов.что согласуется с литературными данными.

Идентификация компонента,aKTiiBHoro iia J^antlUla и411 а . Как' было отмечено ранее лиоцид содержит наряду с биологически активным против Bacillus subtIlls компонентой,вешество,активное в отношении Candida util Is. Из литературных источников известно,что штамм-продуцент нонактина Streptomyces tsuslmaensls продуцирует наряду с тегролидапи в качестве минорных компонентов депсипептидный антибиотик валиноминин и глутаримидный антибиотик циклогекснмид. Из производственной партии лиоцида методом препаративной ТСХ в системе гексан-этилацетат (4:1) было выделено вещество с К Г=0,74. После перекристаллизации из OOS (по объему) метанола были получены бесцветные кристаллы с Тпл= 130-140°С.Б У5>-спектре выделенного соединения имеется широкий молоинтенсивный максимум в области 200-285 нм. В масс-спектре антибиотика присутствует молекулярный ион с n/z. 339 а.е.м. Среди фрагментационных пиков ионов следует отметить пики,с n/z. 323,200,263,183,139,123,111 а.е.м..характерные для глутаримидных антибиотиков.По совокупности физико-химических свойств было показано, что выделенный нами компонент является близким к глутаримидному антибиотику Е-73 (ацетоксицлклогексимид).

СН„ 0 ,0

- .1.0 -

Рис.1. Масс-спектр антибиотика из Б.Нртап!.

Рис.2. (1Н) ЯМР-спектр антнбиоткка из Б.Пршап!.

Физико-химические свойства и идентификация диэфирэ о-фталевой! кислоты, проявления хроматограим лиоцида в УФ-светв было замечено, что во всех партиях присутствует соединение . обладающее интенсивной фиолетовой флюоресценцией,содержание которого в препарате составляет не менее 5*. При противоточном распределении в системе гексан-мвтанол-вода ( 20 : 17 : 3 ) соединение находилось в первых трубках . После удаления растворителей из трубок 5-15 получили масло светло-желтого цвета. Выделенное вещество не обладает активностью против бактерий и дрояяеЯ , имеет слабую акарицидную активность.

В протонном спектре выделенного соединения имеются сигналы в

13

области 7,5-8,0 й'.д., в С ( ЯМР"» - спектре- в области 125-130 м.д.(замещенное бензольное кольцо).Молекулярная масса выделенного эфира,определенная методом масс-спектрометрии электронного удара и методом ЭРИАД.составляет 279а.е.м. В масс-спектре базовым пиком является пик иона с п/г.149,характерный для производных фталевых кислот. На основании данных элементного состава мояно представить брутто-формуду С. ,Н,,Х0 .В масс-спектре имеются фрагментационные пики

1 3 с » 4

нонов:264(М-15),222(М-57),205(М-Н-73),характерные для эфиров кислот.

С ( ЯМР}спектрв мы находим сигналы ароматического коль-ца:125,8;128,6;130,7м.д.карбонильного эфира (174,04 м.д.).сигналы ОСН (68,6:65,3:64,1).метальной группы (13,8).сигнал группы СН-М (42,1м.д.). Такое отнесение сигналов хорошо согласуется с протонным спектром. Из продуктов щелочного гидролиза нами были выделены кристаллы с Тпл«145°С., кмещяе максимум поглощения при 278 нм. Хроматографягческая подвижность выделенного соединения и фрагментация молекулы в масс-спектре говорят об идентичности его с о-фталевой кислотой. На основании приведенных данных для выделенного соединения предлагаем частичную структуру:

ДгСАМ

Таким оОраэом, заканчивая характеристику лиоцида, ш можем констатировать,что в его состав входят¡жирные кислоты, фосфолини-ды,углеводороды,тетролидныв антибиотики (нонактин,моно-,ди-,три- и тетранакткны) .диэфиро-фтвлввой кислоты. Основным активным началом препарата является тетранактин.

2.5. Характеристика физико-химических и _биологических свойств алейщда.Комплексный препарат,выделенный из S.auranluucus,представляет собой порошок розового цвета, в УФ-спектре которого имеются максимумы поглощения при 235,242,265нм и слабое поглощение при ЫО-ЬЬОнм (пигмент),усиливающиеся в щелочных условиях. Разделение препарата на компоненты методом ТСХ в ряде систем растворителей показало,что пигментированные образцы алейцида представляют собой сложную смесь различных по хроматографической подвижности веществ.

Методом колоночной хроматографии на водной кремневой кислоте были выделены два активных в отношении тли компонента алейи;. «а, имеющие различную хроматографическую подвижность в системе растворителей н- бутанол-э,танол-255 1 4:3:1) с Ri=0.6Ь -и 1(1 = 0,20 соответственно (Табл.3).

2.5.1. Идентификация мемомицина. Активное вещество с II/ » 0,65 было идентифицировано путем прямого сравнения с антибиотиком

'I

мемомицином, выделенным ранее из штамма Actinomyces тестоИаа sinus (ЛИА-0775)(Табл.4,6).

Следует отметить высокую инсектицидную активность мемомицина,не отмеченную ранее(ТаОл.3). Мемомицин присутствовал только в пигментированных партиях, и ,наоборот.отсутствовал в непигментированных образцах.Поэтому наше внимание было сосредоточено на ентиСиотико с 1П-0,2 0 ,

_физико-химических и___биологических .__свойсти

алейцида В. Второе активное вещество с Rf=0.20 (выход по массе составлял 5,5?), нестабильно при хранении и быстро теряет

- Л.ч -

Таблица 3-

Анализ фракций колоночной хроматографии алейцида на водной кремневой кислоте.

Гибель тли, !*(»*>

О 45

100 35

54

95 25 0 О О

* Силуфол 07-254. н- бутанол-»танол-25$ МП3(14:3:1) »* Активность.фракция .о^падялялась.по.ма^сишка

инсектицидную активность в кислых растборах.Вещество показывает

положительные реакции с РеС13. в эфирном растворе.с реактивом

Драгендорфа,с йодом и перманганатом калия,"дает положительную реакцию

на присутствие гидроксилов и отрицательную с нингидрином.При

гидрировании над платиной поглощается 3,6 молей водорода.Выделенный

препарат представляет собой белые кристаллы с Тпл=84-85

^.нерастворимые в воде, но растворимые в большинстве

органических растворителей (спирты,уксусная кислота,диметилсульфоксид),

В УФ-спектре препарата наблхщаются максимумы поглощения при 235,242нм

Цвет Кол-во 1

Элюент в-ва. выделен. в-ва(мг)

Хлороформ-метанол,7:1 краен 173,0 0.G5.

Хлороформ-метанол,5:1 розов 103,0 0.85. 0.65 .

Хлороформ-метанол,5:1 р-бел 10,0 0,65.

Хлороформ-метанол ,4:1 белое 150,0 0.65. 0,32 .

Хлороформ-метанол,4:1 белое 300,0 0.32. 0,20.

Хлороформ-метанол, 3:1 белое 100,0 0,20,

Хлороформ-метанол, 3:1 белое 3112.0 О.Г.

Хлороформ-метанол,2:1 белое 797,0 0,05.

Хлороформ-метанол, 1:1 белое 1797.0 0.05.

Метанол белое 122г.0 0,05.

Таблица 4.

Характеристика физико-химических и биологических свойств антибиотик» ( К.>0.65) из Э.аитИиасиз и мемомицина.

Название вещества ....... тнл, °0 УФ спектр сн,ан ИК-спектр (см-1 ) (КБг) Лктин-ность.

Лмтибиотик мг- 242(340), 17Ю.1650. г*;

с К1-0,65 144 2о5(зм 1510 грибы, дрожжи

Мемомицин 1 40- 242(340). 1720,1050,

141 265 (¡>М 1520 1

Таблица '5.

Хроматографическая подвижность антибиотика с ( 1^=0,05) из Б.аигапгиасиз и мемомицина.

N Система растворителей на силу^оле 25«

п/п ...---------- г-...........-......

Антибиотик Йемомицин

1 н-Бутанол-этанол-25*аммиак (14:3:1) 0.(5 0.03

2 90* Метанол-хлороформ(1:4) 0,50 0.49

3 Этилацвтат-пиридин-вода(2:1:2,в/ф) 0,00 0.05

4 Вода-атанол-вцетон (7:2:1) 0,60 О.ЬО

и 265нм. Препарат, в отличие от мемомицина.оптически неактивен, не подавляет рост бактерий.дрожжей и грибов в концентрации 100мкг/мл.

Как и в случае нонактина . нами был проведен сравнительный ретроспективный анализ свойств выделенного соединения со свойствами препаратов,обладающих инсектицидными свойси«л»> 'Тзйл.6).Такое сопоставлении позволило нам отнести препарат алейцид Ь ¡КГ=0.2) к

группе пиерицилинов.

Таблица б-

Сравнительная характеристика физико-химических и биологических свойств алейцида В и пиерицилинов групп Л и В.

Группа пиорицидин Брутто-формула Мол. масса Т ил, °С_ УФ-спектр, СНлОН ' ). шах ( в

Алейцид В С25Н37М04 415 04 235 (?.?3704 242 (327К'>)

Группа А

А) СгьН37И04 41Ь масл 232(39500) 239(40000) 267(5300)

А2 С26и39ш4 429 — ** — 225(20000)

АЗ Сг7Н4(И04 443 239(40000)

А4 с20л43»ю4 457 225(20000)

Группа В

В1 сгби39ио4 429 239(40000)

В2 С2ТН4,ИОд 443 _ м 225(20000)

ВЗ С20,!43Ы04 457 239(40000)

В4 С291,45Н04 471 _ и _ 225(20000) .... .. _ ......... *

В отличие от пиерицилинов групл А и В,представляющих сооой вязкие иаола желтого цвета, выделенный нами препарат продст.иштт собой порошок с Тпл=Й4-05|ОС. Из группы пиерицилинов Оолнии. анчарными порошками являытся глокопиврицидкны А и В и З-рпмнопиприцилин Л.

Однако, в отлично от последних.виделонный нами препарат но содержит в споем составе Сахаров, что показано при изучении пролуктоп кислотного гидролиза внлолинного препарата.

- 1.6 -

В протонном спектре алейцида В мы имеем сигналы в области 1.3 1.0

м.д..обусловленые протонами метальных групп, при двойных связях

(С ,С ,С ). В этой области находится сигнал протонов конечного 14 А5 1В

углерода (С ) боковой цепи.Два протонных дуОлета при 3.30 м.д. 13

обусловлены протонами метиленовой группировки =СН СИ

-J.vt.fC |Л--Цро.тпиный дуПлй.т ,п,пи .м.-лг. .мпжрт Пы.т> лтьягпн к дуюто-

нам В метиленовых группах »СН-С^-С« (С^, Сд). Еще один сигнал при .,.04

м.д.обусловлен протонами метоксильной группы (С^), В этой же области

имеется сигнал,который можно отнести к протонам группы

=С-ГлН/ОСН„1-/С >.. ДуЛпет с адс-тогой 3-&3 пг^г.лгжлпн и.гюлшлми

'•>10

метоксильных групп в пиридиновом кольце (С ,С ). Наконец, в области

?0 21

5.2-6.3 м.д. мы наблюдаем сигналы протонов двойных связей (С,,,С^С^ и

с)2).

Такое отнесение сигналов протонов в'н (ЯМР)-спектре хорошо согласуется с данными, приведенными(Суцуии 19б6)для пиеринидинов Л и В. в отличие от пиерицидина А', в спектре алейцида отсутствует мультиплот при 3.00 м.д.отвечахнций за вторичный гидроксил Ооковой цепи и присутствует синглет в области 3,04 м.д,ответственный за моток-сильную группу боковой цепи (С . В отличив от пиерицидинов Л и В в протонном спектре алейцида В отсутствует дублет в области 0,16 м.д,соответствующий иетильной группе при С^.как и в случае пиерицидина А. Из этих данных можно предположить,что выделенный нами алейцид

В наиболее близок к пиерицидину В,отличаясь от последнего отсутствием

11

метильной группы при Сд.Это находит подтверждение в ( С) ЯМР-спектро

10

алейцида В.В отличие от { С)-ЯМР-спектров пиерицидинов Л и В ,в спектре алейцида В отсутствует сигнал в области 17,5 м.д..

Окончательное подтверждение структуры алейцида В было сделано на основании изучения иасс-споктров алейцида В и ацетата октагид- . роалейцида В. Молекулярная масса алейцида В,определенная методом масс-спектрометрии электронного удара и методом ЭРИДД, составляет 415 а.е.и.,что соответствует молекулярной массе пиерицидина Л. В

масс-спектре препарата ин находим фрагментационные ионы.обуслоп-ленные распадом по имеющимся разветвлениям в молекуле (D/z 55,99,153,233) н пик иона с в/г 183,обусловленный замещенным пиридином. Базовым пиком является пик с а/г 55 (Рис.3).

Лля установления структуры выделенного соединения нами был получен моно»иетат. октагидроалейцида В.Масс-спектрометрн-

ческий анализ полученного производного алейцида В показал наличие ' пика .но-пак^улифчого ионы1 с п/г 465 я.я.м.,что поз-

волило нам утверждать,что в молекуле алейцида В имеется одна' гид-роксильная группа,а не две.как в случае пиерицидина А.

В масс-спектре вцетата октагидроалейцида В имеется серия пиков ионов,обусловленных фрагментацией по имеющимся разветвлениям п алифатической цепи и Фрагментацией замещенного пиридина (Гис.4). Базовым пиком в данном случае является пик с а/г 225 . Наличие пика с Ч/г 101. в спектре ацетата и пика с ffl/z 99 в спектре алейцида D говорят о том,что у С ,q находится метоксигрупиа,что согласуется с данными ИК-спектра выделенного соединения.

Сравнение масс-спектра ацетата октагидроалейцида В с ацетатом октагидропиерицилина В (Рис.4).показывает,что их спектры похожи,но в масс-спектре первого отсутствует пик иона с в/г 129а.е.м.,чго можно трактовать,как отсутствие метильной группы у Сд.

На основании полученных нами данных был сделан вывод о том,что плейиид В является новым представителем группы пиерицидинов и иноет структуру 9-деметилпиерицидина В.

0U

21 CU,Ö

14 15 16

cu5 СИ, cu,

- ля -

Идентификация активных компонентов комплекса _олойцида ,|,идвльн-ных методам ВЭКХ.Определение компонентного состава опытных партий комплексного препарата алейцида методом обращено-фазовой ВЭЖХ показало, что влейцид в иэократическом режиме при элюировании смесью ацетонитрил-ацетатный Оуфер, рН«4,62(45:55).делится на два компонента . В условиях градиентного элюирования смесь« ацетонитрил-ацетатный Оуфер (рН 4.62) с постепенным увеличением доли ацо-тонитрила в смеси (от 201 до 70*по оОьему) опытные паргии алейцида,напротив. представляют соОой сложную смесь.содержащую не менее 9 компонентов, два из которых являются основными (Рис.Ь). При этом следует отметить.что количество и соотношение компонентов в опытных партиях алейцида,обладающих различной инсектицидной активностью, но является величиной постоянной при одинаковых условиях хроматографирования.Соотношение между компонентами не зависит от инсектицидной активности препаратов.величина которой определяется суммарным содержанием основных компонентов в смеси.

В масс-спектре компонента I имеется молекулярный ион с т/г. 415

а.е.м. Его фрагментация полностью совпадает с фрагментацией алейцида

1 13

В. Идентичными были их Н и С (ЯМР)-спектры.Это дает нам право предположить, что компонент 1 является алейцидом В. Напротив,в масс-спектре компонента 2 наблюдали молекулярный ион с т/г 431 а.е.м.В протонном спектре компонента имеются сигналы:

0,85((1) ;1,21 (й);1,68(51:2,03 (в);г ,40Сю) ;2,48 (в);2,60(в) ¡3.26 (с1); 3,75(8):3,88(в);4.09(й);5,31ИГ)¡5.42(з).В спектре имеется три вида олефиновых протонов (5.42(8);4,09((1);5.31(1г)). Дублет и триплет могут быть отнесены к С^ и С^ . Среди фрагментационных пиков в масс-спектре компонента 2 наблюдается слабый пик иона с га/г 55 а.е.м.. и напротив, имеются интенсивные пики ионов с «/г 71,115, 169 а.е.м. Интенсивным пиком является пик иона с в/г 183 а.е.м. наблюдали молекулярный ион с щ/г 431 а.е.м.Все эти данные говорят о том,что в молекуле 'компонента 2, как и в случае пиерицидинов групп С и С. в положении 11,12 имеется

•Г.ч!')

г%> хч> >» *оо

Рис.3.Масс-спектр алейцида В.

ю too г-5 гм ¿х

i.,, I ,1 h1 ■ А—. __I_А- 1 t'í h .h 1. -,,

» КЮ j JX «oo

Рис.4'. Масс-спектр ацетата октагндроалейцида В.

м

г

« ■ <• л Вге**,мия.

----4—

п /

Рис.5. Высокоэффективная жидкостная хроматография комплексного препарата алейцид (Сепарон 5С ). По осн аОсцисс-время удерживания ,мин.

эпоксидная группа.

Выделенный компонент является оригинальным соединением и мы

обозначили его как алейцид С. Таким образом, мокно предположить,что

комплексный препарат алейцид представляет собоЛ сложную смесь

пиерицидинов серии В и серии С,

ВЫВОДЫ.

I.Иэ продуктов метаболизма стрептомицетов БЛ1ртап1 и Б.аи-гапШасиз методом экстракции метанолом с последующим кон-

центрированием выделенных экстрактов.выделены комплексные препараты лиоцид и алейцид .обладающие антипаразитарными свойствами.

2. Показпяо,что пгепара? л*оцня пре лотвмчвг побоя м«ог»ком пи едтяуя смйОк.вкяючйюяу» в себя:

-углеводороды Сфаркеаан.п-ристая.фитпп.докоаяя к скиоллкЧ, -жиряие кнслоты нврмальяого стовеяич <тетгадехаповяи.ггке*пеня новяя.октадеквпав»я") к киалоты о оа»н*гвлеяпой цепью типа «»е- и аятеиав,

-фосфолипидн.икиючвидис в себя КИСЛОТЫ С! СЯЯИЙТВЛГЯНОЙ Ц^НЬН ^ппяьмитияога п.« зональмитмппва «5,

-тетголилпые аятибиотики ("нояахтин.иояо-. аи-,тги-.тег пя'^ктии1*, -гл^тярякидиыЯ яятибкртик ацетокоициклогекпимид, -пи-5*?«г> си^^та лъевоп кислоты.

3. ГЪ^ияа метолом вмсокоРЭДектнвяоЯ жидкостной хроматографии п )юви»гх гг>а зкеяткого гитаговяямя яа обращенной фазе, что алепцма заставляет побоП ияогокомпонаяткуп еыесь.в состав которой вхолтт шилиеяты серии аяеЛцкдов П .-1 С, ойлядасиие хяоектицмяяой яктквяоогм».

Прове пека икряти'Тиквцкя оаяовяого коипояеитя кемгигкеа дионина аятибкотикон иокактило«.описаияым ранее » литературе.

5. Лля выделения осяовяых коипопеятоа хомпяехсеа »лепципа зработяям условия кояоиочяоЯ Хроматографии яв водяоЯ кремяевой «слоте и гтргиаративиоЯ внпохот**фектив«ой **дкоотяоП хроматографии.

6. Показало,что препарат алеЯцид В является цемегилтшегииилином И; ороЯ актквяын компояеят- аяейцид С тахжк отяеееи к пиерицияичам

уппы С.

Т. Впервые усгаяовяекс.что аитибяотик яояяктия обчадарт акари.1.0 й активностью отновеики спркоптскаяого к «едя

сшкчж глког, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТКМК ДИССЕРТАЦИИ:

l.IlliHKkTtKM Л.11.,1Н*шн ЮЛ. Ицсншфмкниня жяшкппм-vbcm<4uikîn nynviyjHi Strepu«nyocs Uj*«w\i. // Кн^кси'каси акшмилс cocAKiiciiHH, Ciuirea м «идкшкк*«шме: Тс i JHVK. Всчсомишя кои«];«: jkuiiimm. -Heim.,- !992. -с. 145.

Z.illfettainata JI.II , IIUmmh ЮД. lfwuutt njwjxiOHutt mmockiwhrii, ^М)ЮК>ШЬ1Й Ш »XlMHOUHUCr* SUXpUMlyoCS. »Ull»n(U*CUS. ВыДСЛСНИС, (}ШГШК^-«ШК*ЧЖ>1С, бмоЛОГМЧССАМС v»4>flcl Wt И КДСНШ4*<КвЦ)1Я.//

XyjiM прикладной чмхгнм -т. 66. -nun.5. -cjp.UU-1117.

¿.IHoUOtUM Л.Н ЛНМММ ЮД, 1ЬшЫЙ НрИрОДШЛ« HHOCKIHUWJ., Н1Ч1Д>ЦН(>у."ииа SUCpUXUYlO 11 ¡411 а Г Ц // Жури щчиклиднчй «шин-WÎ -it.*. -eip. i378 -ШЗ.