Высокочувствительное определение арилалкиламинов методом поверхностно активированной лазерной десорбции-ионизации в сочетании с газовой хроматографией

Бородков, Алексей Сергеевич

Высокочувствительное определение арилалкиламинов методом поверхностно активированной лазерной десорбции-ионизации в сочетании с газовой хроматографией тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Бородков, Алексей Сергеевич АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Высокочувствительное определение арилалкиламинов методом поверхностно активированной лазерной десорбции-ионизации в сочетании с газовой хроматографией»

Автореферат диссертации на тему "Высокочувствительное определение арилалкиламинов методом поверхностно активированной лазерной десорбции-ионизации в сочетании с газовой хроматографией"

На правах рукописи

005013352

Бородков Алексей Сергеевич

Высокочувствительное определение арилалкиламинов методом поверхностно активированной лазерной десорбции-ионизации в сочетании с газовой хроматографией

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2012

005013352

Работа выполнена в лаборатории инструментальных методов и органических реагентов Института геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат химических наук

Гречников А.А.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор доктор химических наук

Хамизов Р.Х.

Филиппов М.Н.

Ведущая организация:

Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 16.02.2012 в 14:00 на заседании диссертационного совета Д.002.109.0 в Институте геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, В-334, ул. Косыгина, 19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН.

Автореферат разослан 16 января 2012 г.

Учёный секретарь совета

доктор химических наук

Кубракова И.В.

Общая характеристика работы Актуальность темы. Одна из наиболее актуальных задач аналитической химии - идентификация и высокочувствительное количественное определение биологически активных соединений в различных средах. В первую очередь это касается лекарственных препаратов, из которых к числу наиболее важных относятся арилалкиламины и их производные. На основе этих соединений разработаны и разрабатываются многочисленные лекарственные препараты, используемые в терапевтической практике в качестве нейростимуляторов, медиаторов, антидепрессантов и сосудорасширяющих средств. Ряд арилалкиламинов относятся к сильнодействующим психотропным соединениям, включены в конвенцию по психотропным веществам и являются объектами судебно-медицинских исследований. Производными арилалкиламинов являются также некоторые синтетические наркотики, распространение которых становится в последние годы серьезной социальной проблемой. Все эти соединения обычно находятся в анализируемых образцах в следовых количествах. В этой связи, очевидно, что разработка высокочувствительного и селективного метода определения арилалкиламинов является актуальной задачей.

Одним из наиболее перспективных подходов для решения этой задачи является метод лазерной десорбции-ионизации, активируемой поверхностью (surface assisted laser desorption ionization - SALDI). Этст метод отличает высокой чувствительностью при определении ряда органических и биоорганических соединений и активно развивается в последнее десятилетие. Традиционно приборная реализация метода SALDI основана на использовании серийных MALDI времяпролетных масс-спектрометров, при которой анализируемую пробу наносят на акгивную поверхность эмиттера ионов, высушивают и помещают в вакуумную камеру масс-спектрометра для анализа. Такой подход ограничивает спектр определяемых соединений только малолетучими веществами и характеризуется низкой воспроизводимостью. Другим подходом, перспективным для анализа летучих соединений, может быть сочетание метода SALDI с газовой хроматографией (ГХ). Ариалкиламины достаточно легко могут быть переведены в газовую фазу путем нагрева, что создает предпосылки для разработки высокочувствительного метода их определения на основе сочетания ГХ с SALDI-масс-спекгрометрией (МС).

Цель работы. Целью настоящей работы являлось дальнейшее развитие метода SALDI путем его сочетания с газовой хроматографией и разработка на этой основе метода высокочувствительного определения соединений группы арилалкиламинов. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать интерфейс сопряжения ГХ с MC и определить оптимальные условия хроматографического разделения арилалкиламинов для их последующего детектирования методом SALDI;

- исследовать зависимость эффективности SALDI от химического состава эмиттера ионов, интенсивности лазерного излучения, величины потока протонодонорных молекул на поверхность эмиттера и на основе полученных результатов найти оптимальное сочетание этих факторов для анализа арилалкиламинов;

- получить и изучить SALDI масс-спектры арилалкиламинов на примере 20 соединений и исследовать основные направления фрагментации;

- определить основные аналитические параметры - эффективность ионизации, предел обнаружения, чувствительность, воспроизводимость и динамический диапазон в условиях ГХ/SALDI-MC определения арилалкиламинов в многокомпонентных растворах;

- провести квантово-химические расчеты величин сродства к протону (РА) и основности в газовой фазе (GB) для исследуемых соединений и установить связь между рассчитанными величинами и значениями чувствительности;

- разработать методику ГХ/SALDI-MC определения арилалкиламинов в крови. Научная новизна работы.

Впервые продемонстрирована возможность сочетания ГХ с SALDI-времяпролетной MC для определения органических соединений в пробах сложного состава.

Разработан метод высокочувствительного и селективного определения арилалкиламинов, основанный на лазерной десорбции-ионизации с поверхности аморфного кремния в сочетании с ГХ.

Установлены закономерности фрагментации протонированных молекул арилалкиламинов, полученных при лазерной десорбции-ионизации с поверхности аморфного и пористого кремния.

На основе квантово-химических расчетов определены термодинамические параметры - энергии сродства к протону РА и основности в газовой фазе GB для 20 арилалкиламинов.

Найдено, что эффективность ионизации и чувствительность анализа в условиях ГХ/SALDI-MC экспоненциально зависит от основности в газовой фазе определяемых соединений.

Разработана методика определения арилалкиламинов в крови с пределом обнаружения на уровне 6-300 пг/мл.

Практическая значимость работы. Разработан метод определения арилалки-ламинов, основанный на сочетании ГХ с SALDI-MC, с пределом обнаружения до 100 раз ниже, чем при использовании стандартных масс-спектрометрических методов анализа. Предложена методика определения арилалкиламинов в крови.

Представленные в работе схемы фрагментации позволяют по полученным масс-спектрам однозначно идентифицировать арилалкиламины в смесях сложного состава. Найденная зависимость чувствительности от GB дает возможность прогнозировать эффективность SALDI на основе рассчитанных или известных значений основности в газовой фазе определяемых соединений.

Разработанный метод может применяться в медицинской практике для терапевтического лекарственного мониторинга, для решения задач фармакокинетики, для проведения судебно-медицинской экспертизы, в аналитической практике для определения следовых количеств арилалкиламинов в природных и промышленных пробах. На защиту выносятся:

- Метод высокочувствительного определения арилалкиламинов, основанный на лазерной десорбции-ионизации с поверхности аморфного кремния в сочетании с газовой хроматографией и времяпролетной масс-спекгрометрией;

- Результаты исследования факторов, определяющих эффективность образования ионов арилалкиламинов в условиях ГХ/SALDI-MC анализа: геометрии интерфейса сопряжения ГХ с МС, режима хроматографического разделения определяемых соединений, состава и структура эмиттера ионов, интенсивности лазерного излучения, плотности потока протонодонорных молекул на поверхность эмиттера ионов.

- SALDI масс-спектры арилалкиламинов, схемы фрагментации образующихся в процессе SALDI ионов и результаты исследования зависимости степени фрагментации от интенсивности лазерного излучения.

- Результаты квантово-химических расчетов величин сродства к протону РА и основности в газовой фазе GB для 26 соединений.

- Результаты исследования зависимости эффективности ионизации и чувствительности разработанного метода от величины GB определяемых соединений.

- Методика ГХ/SALDI-MC определения арилалкиламинов в крови с пределом обнаружения для различных арилалкиламинов 6 - 300 пг/мл.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на всероссийской конференции «Аналитика России» (2004), И-ом международном семинаре-школе: «Масс-спекгрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (2004), международной конференции «Analytical chemistry and chemical analysis» (2005, Украина),

XXII международной Чугаевской конференция по координационной химии (2005, Молдавия), всероссийской конференции "Масс-спекгрометрия и ее прикладные проблемы" (2005, 2009, 2011), международном аналитическом конгрессе ICAS-2006 (2006), 40-ой конференции «Diskussionstagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie» (2007, Германия), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (2007), 57-ой масс-спектрометрической конференции ASMS (2009, США), 7-ой конференции BPU (2009, Греция), 16-ой международной школе в Болгарии (2009, Болгария), съезде аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" (2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 18 тезисов докладов.

Струюура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка литературы из 181 наименований. Диссертация изложена на 142 страницах печатного текста, содержит 37 рисунков и 12 таблиц.

Основное содержание работы

Обзор опубликованных работ по методам лазерной десорбции-ионизации, проведенный в главе 1, позволил сделать вывод, что метод SALDI является новым и динамически развивающимся методом масс-спектрометрического анализа, характеризующимся высокой чувствительностью и селективностью. За последние годы было предложено несколько реализаций метода, из которых наибольшее распространение получили варианты, основанные на применении кремниевых материалов в качестве эмиттеров ионов. Показано, что известные способы приборной реализации метода SALDI характеризуется низкой воспроизводимостью и не позволяют определять летучие соединения, в частности, арилалкиламины. Отмечено, что возможным подходом для определения летучих соединений, может быть сочетание метода SALDI с газовой хроматографией (ГХ).

В главе 1 на основе обобщения литературных данных также проанализированы известные методы определения арилалкиламинов. Показано, что наиболее чувствительный и селективный анализ этих соединений основан на инструментальных методах, из которых чаще всего применяется сочетание ГХ с MC. В большинстве известных методик ГХ/МС используют метод электронной ионизации. Однако применительно к анализу арилалкиламинов, этот метод обладает рядом существенных недостатков, в частности, недостаточно высокой чувствительностью, сильной фрагментацией ионов и в ряде случаев длительной пробоподготовкой. Поэтому, несмотря на

большое количество публикаций, достоверная идентификация следовых количеств арилалкиламинов в различных образцах все еще остается серьезной проблемой. Отмечено, что потенциально высокие характеристики SALDI создают предпосылки для успешного решения этой проблемы. Оборудование, материалы, методика эксперимента

На рис.1 представлена схема экспериментальной установки, детальное описание которой приведено в главе 2. Установка включает в себя времяпролетный масс-спектрометр, Nd:YAG лазер с генерацией гармоник, газовый хроматограф для ввода пробы и регистрирующую аппаратуру.

Рис.1. Схема экспериментальной установки. 1 — №:УАй лазер с диодной накачкой, 2 — Дисперсионная призма, 3 — оптический датчик синхронизации, 4 — аттенюатор, 5 — устройство сканирования лазерным лучом, 6 — фокусирующая линза, 7 —эмиттер ионов, 8 — времяпролетный масс-спектромегр, 9 — источник паров воды, 10 — газовый хроматограф.

Времяпролетный масс-спектрометр 8 собран по линейной схеме с дайной свободного пролета 70 см и ускоряющим промежутком 14 мм. В качестве детектора ионов использовалась сборка двух микроканальных пластин, сигнал с которых поступал на плату АЦП с временным разрешением 1 не, установленную в персональном компьютере. Обработка сигнала состояла в аппаратном накоплении 300 масс-спектров, следующих с частотой 300 Гц, непосредственно на АЦП и

последующей обработке масс-спектров.

В качестве источника лазерного излучения применялся Nd-YAG лазер с диодной накачкой 1, работающий с частотой повторения 300 Гц при длительности импульса 0.35 не. Для лазерной десорбции-ионизации использовалась 3 гармоника (355 нм) основного излучения с энергией в импульсе до 50 мкДж. Плотность энергии лазерного излучения изменялась в диапазоне 3-50 мДж/см2 с помощью аттенюатора 4. Излучение фокусировалось на поверхность подложки линзой б в пятно с площадью 7-Ю-5 см2 по уровню 1/е.

В отличие от классических ионных источников с электронной ионизацией, в методе SALDI ионизируемые молекулы адсорбируются и накапливаются на поверхности эмиттера ионов 7, поэтому ионный сигнал пропорционален облучаемой площади. Для ее увеличения и, следовательно, для снижения предела обнаружения, использовано двузеркальное электромеханическое устройство сканирования лазерным лучом 5, которое разворачивало луч в кадр размером 2-1 мм2. Длительность одного цикла сканирования составляла 1 сек.

Для разделения анализируемой смеси и ввода пробы в ионный источник масс-спектрометра использовался газовый хроматограф 10 (ThermoQuest, GC8000 Series, Italy), оборудованный 15 метровой капиллярной колонкой (Restek, Rtx-5MS).

В качестве эмиттеров ионов были исследованы следующие материалы: кремний, графит, германий, оксиды титана и цинка. Способы формирования эмиттеров ионов приведены в главе 2. Rj

Исследованные в работе арилалкиламины общей 'f 'Y формулы RiC6H4(CH2)„CHR2NR3R4 приведены далее в *А^=нГсн3,с5н<, сн,о

таблице 1. Для исследования использовались растворы яГ^-™сн3Нс2н5

арилалкиламинов в метаноле. ОД. ch(cii,),, снгрь

Исследование факторов, определяющих эффективность ионизации арилалкиламинов

Ариалкиламины, исследованные в работе, достаточно легко могут быть переведены в газовую фазу путем нагрева. Это позволяет использовать для их нанесения на поверхность эмиттера ионов адсорбцию из газовой фазы. В главе 3 отмечено, что газофазный ввод пробы имеет ряд преимуществ, которые и послужили основой для разработки воспроизводимого количественного метода анализа арилалкиламинов. Среди них следует выделить следующие:

- подложки-эмиттеры ионов находятся в вакуумной камере при давлении остаточных газов ниже 10"6 мм.рт.ст., что позволяет избежать дестабилизирующего воз-

действия химических факторов на состав поверхности;

- возможно периодическое воздействие лазерного излучения для активации поверхности эмиттера ионов;

- в отличие от жидко-фазного нанесения пробы, где вещество наносится вместе с избытком растворителя, при адсорбции из газовой фазы определяемое соединение взаимодействует непосредственно с поверхностью подложки;

- возможно контролируемое введение в ионный источник масс-спектрометра реагентов для изменения физических и химических свойств поверхности.

В главе 3 приведены результаты исследований основных факторов, определяющих эффективность SALDI, для нахождения оптимальных условий детектирования арилалкил аминов.

На первой стадии был разработан и реализован интерфейс сопряжения ГХ с MC, позволяющий получить ионный сигнал без искажений масс-спектров. Для обеспечения транспортных функций капиллярную колонку соединяли с кварцевым капилляром, который заводили в масс-спектрометр через прогреваемую промежуточную камеру. Разработанная конструкция позволяла регулировать температуру капилляра в диапазоне от комнатной до 250 °С. Выход капилляра был удален от поверхности на расстояние в 20 мм и расположен под углом 45° к оси источника. Такое геометрическое расположение обеспечивало прямой поток газа на поверхность подложки и не приводило к искажению ускоряющего поля в ионном источнике. Схема разработанного узла сопряжения ГХ и MC, использованного в дальнейшей работе, представлена на рисунке 4.

Выбор эмиттера ионов

В качестве эмиттеров ионов были исследованы подложки на основе графита, шероховатого, пористого и аморфного кремния (a-Si), аморфного германия, нанокри-сталлического оксида цинка и оксида титана. Все эти материалы известны по литературным данным в качестве эмиттеров ионов при жидко-фазном нанесении пробы.

В результате проведенных экспериментов установлено, что подложки из пиро-графита, аморфного и монокристаллического германия, оксида титана, а также монокристаллического кремния не давали ионного сигнала в диапазоне концентраций ана-литов 0.1-10 мкг/мл. Графит и шероховатый кремний позволяли получить ионный сигнал только при высоких концентрациях аналитов (более 5 мкг/'мл), что свидетельствует о низкой эффективности лазерной десорбции-ионизации арилалкиламинов с их поверхности. Существенно более высокой чувствительностью характеризуются под-

ложки с поверхностным слоем га ZnO. Однако максимальную чувствительность, превышающую по крайней мере на порядок величины чувствительность подложек с ZnO, показали образцы на основе пористого и аморфного кремния. Поэтому именно они были выбраны в качестве эмиттеров ионов арилалкиламинов и использовались в дальнейшей работе.

Эксперименты также показали, что не только структура, но и химический состав поверхности кремния является важным фактором, определяющим эффективность ионизации, что необходимо учитывать при разработке метода определения арилалкиламинов. Особенно показательны эксперименты с лазерно-индуцированной химической модификацией свежеприготовленного пористого кремния в присутствии паров воды. Рис. 2 на примере М,1\'-дютші-бетил амина иллюстрирует экспериментально полученную зависимость величины сигнала протонированных молекул этого соединения (m/z 164) от количества циклов сканирования лазерным излучением поверхности свежеприготовленного образца пористого кремния. В экспериментах использовался постоянный поток аналита на поверхность эмиттера ионов. Из приведенных на рис. 2 данных видно, что ионный сигнал при такой обработке поверхности возрастает в течение первых 250 циклов, а потом выходит на насыщение.

2000-,

18001600 14001200. 1000 800 600 400 200 0

100 1ю 200 250 Циклы сканирования

Рис. 2. Зависимость величины выхода протонированных молекул КМ-диэтилбензил-амина от количества циклов сканирования в процессе лазерно-индуцированной модификации поверхности пористого кремния. Интенсивность лазерного излучения 20 мДж/см2.

Анализ химического состава кремниевых поверхностей до и после обработки, проведенный методами Оже-спектроскопии с высоким пространственным разрешением и SALDI масс-спектрометрии показал, что в процессе лазерно-индуцированной химической модификации поверхности происходит замещение силановых SiH на си-ланольные SiOH группы, что и приводит к увеличению аналитического сигнала.

Как показали эксперименты, образцы свежеприготовленного аморфного кремния, в отличие от пористого кремния, дают аналитический сигнал уже в первом цикле сканирования. При дальнейшей лазерной обработке наблюдался только небольшой рост (в 2 раза) аналитического сигнала, связанный с очисткой поверхности.

С целью выбора оптимального эмиттера ионов для определения арилалкилами-нов было проведено сравнение пористого и аморфного кремния. Устновлено, что оба этих эмиттера ионов характеризуются близкими значениями эффективности SALDI. Однако в масс-спекграх, полученных с аморфного кремния, фоновый сигнал существенно ниже и поэтому ниже предел обнаружения. Кроме того, полная десорбция адсорбированного аналита с аморфного кремния происходит за 2-3 цикла сканирования, в то время как пористый кремний требует не менее 5-7. Поэтому аморфный кремний предпочтительнее, особенно при использовании в условиях недостаточно полного ГХ разделения компонентов анализируемых растворов. С другой стороны, пористый кремний является более стабильным эмиттером ионов. При его использовании заметное уменьшение сигнала отмечалось только после 500 вводов пробы. Учитывая, что среднее время анализа обычно составляло 20 минут, одна подложка пористого кремния позволяла работать не менее трех недель даже в условиях полной загрузки прибора. Для аморфного кремния деградация эмиттера ионов наблюдалась при значительно меньших количествах инжекций пробы. В частности, величина сигнала уменьшалась в 2 раза примерно после 200 вводов пробы. Поэтому на праетнке целесообразно заменять подложки из аморфного кремния примерно после 100 вводов пробы. Далее в работе использовался аморфный кремний.

Исследование влияния интенсивности лазерного излучения и давления паров воды в масс-спектрометре на эффективность SALDI

На рис. 3 представлены типичные зависимости величины аналитического сигнала с аморфного кремния от плотности энергии лазерного излучения, полученные при исследовании N.N-диметил-бензиламина и М,1Ч-диметил-1 -фенилэтиламина. Аналогичные зависимости были получены и для всех остальных арилалкиламинов. Порог выхода ионов в условиях эксперимента составлял 3-4 мДж/см2. Из приведенных данных видно, что начальные участки зависимостей, примерно до 20 мДж/см2, характеризуются экспоненциальным ростом величины выхода ионов при увеличении плотности энергии лазерного излучения.

¡j 1000000-

I to

5 100000. го

>s 10000-

1 i о

s 1000-1

100-1-1-1-1-1-|-1-1-1-1-1-1-1-1-.-|-

5 10 15 20 25 30 35 40

Плотность энергии, мДж/см2

В интервале интенсивностей лазерного излучения 25-35 мДж/ем2 сигнал слабо зависит от плотности энергии. Следует отметить, что насыщение ионного тока при 25 мДж/см2 наблюдалось для существенно различных количеств инжектированного вещества. Это позволяет сделать вывод о том, что насыщение сигнала не связано с насыщением детектора или перегрузками электронного тракта, а обусловлено полной десорбцией определяемых соединений с поверхности аморфного кремния. Дальнейшее увеличение плотности энергии излучения до величин, превышающих 35 мДж/см2, приводит к падению аналитического сигнала. В масс-спектрах появляются пики ионов кремния и его кластеров, а также пик с m/z 45, соответствующий (SiOH)+. Появление кремнийсодержащих пиков свидетельствует о том, что в данном режиме происходит плавление аморфного слоя. Этот факт может быть использован для оценки максимальной температуры поверхности при различных интенсивностях лазерного воздействия. Температуре плавления аморфного кремния (1480 К) соответствует интенсивность 35 мДж/см2. В предположении линейной зависимости максимальной температуры поверхности от плотности лазерной энергии, можно сделать вывод, что экспоненциальный участок зависимостей на рис. 3 соответствует диапазону температур 500 - 900 К, а выход на насыщение достигается при температурах зыше 1000 К. Экспоненциальная зависимость величины выхода ионов от температуры позволяет предположить, что десорбция в SALDI имеет активированный характер, а энергия активации определяется энергией связи иона с поверхностью кремниевой подложки.

Очевидно, детектирование арилалкиламинов методом SALDI следует проводить при плотности энергии излучения, лежащей на участке насыщения зависимости величины выхода ионов от плотности энергии. Из полученных данных следует, что опти-

Рис.З. Зависимость ионного сигнала от плотности энергии лазерного излучения: 1 -К,М-диметил-1 -фенилэтиламин; 2 - ]чт,М-диметил-бензиламин.

малыш для анализа плотность лазерной энергии при использовании аморфного кремния лежит в диапазоне 20 - 35 мДж/см2, поэтому все дальнейшие измерения проводились при 25 мДж/см2. При таких интенсивностях лазерного воздействия обеспечивается полная термодесорбция ионов и максимально высокая чувствительность анализа, а многократное облучение поверхности не меняет ее ионизационных свойств.

Важным фактором, определяющих эффективность ионизации арилалкиламинов методом SALDI-MC, является величина плотности потока воды на поверхность эмиттера ионов. Необходимость подачи воды в масс-спектрометр обусловлена тем, что для эффективной ионизации (протонирования молекул аналита) необходим источник протонов. Представленные в главе 3 результаты экспериментов с тяжелой водой показали, что именно вода является, в конечном счете, источником протонов. Найдено, что оптимальным является поток, соответствующий величине давления паров воды примерно 10"6 мм.рт.ст. При меньших значениях давления снижается эффективность ионизации. При значениях, больших 10"6 мм.рт.ст. растет шум и ухудшается разрешение, в то время как сам сигнал уже слабо зависит от давления.

Исследование хроматограмм арилалкиламинов

В отличие от классических ионных источников, в методе SALDI ионизируемые молекулы адсорбируются и накапливаются на поверхности эмиттера ионов. Это предъявляет особые требования к сочетанию SALDI с ГХ. В главе 4, приведены результаты исследований оптимальных условий ГХ разделения смеси арилалкиламинов, их последующему детектированию методом SALDI и анализу полученных масс-спектров с целью выяснения основных закономерностей фрагментации.

На рис. 4 приведена типичная хроматограмма по полному ионному току, полученная при вводе в прибор раствора, содержащего 11 арилалкиламинов. Масс-хроматограмма получена при найденных на основе предварительных экспериментов оптимальных условиях разделения. Из приведенных данных видно, что разработанный интерфейс сопряжения масс-спектрометра и газового хроматографа, а также найденный режим работы хроматографа обеспечивают полное разделение компонентов анализируемых растворов в SALDI хроматограмме.

25000-1

20000-

15000-

'5 10000л X X

5000-

"Г

200

"г

400 600

-г

800 1000

время, с

Врвмяпрол«п»й

Рис. 4, Хромато1рамма по полному ионному току следующих соединений, расположенных по порядку выхода: 1 - бензиламин, 2 - № этил-бензиламин, 3 - 1-фенилэтиламин, 4 -метил-1-фенилэтиламин, 5 -К,>^диметил-1 -фенилэтил-амин, б - 1-(4-метшхфенил)-этиламин, 7 - 3-фенил-пропиламин, 8 - М-метил-1-(4-меггилфенил)этиламин, 9-1-(4-метоксифенил) этиламин, 10 - К,М-дипро1Шд-1 -фенил-1200 1400 1600 18С этиламин, 11 - К-бензил,\т-метил-1 -фенилэтиламин

-р

На рис. 5 в качестве примера приведены масс-спектры четырех из 20 исследованных арилалкиламинов, которые были получены в условиях хроматографического разделения на рис. 4. Каждый масс-спектр получен интегрированием соответствующего хроматографического пика и нормирован на 100% по пику с максимальной амплитудой. Проведенный в главе 4 анализ всех полученных масс-спектров позволил сделать вывод, что присутствующий в масс-спектре арилалкиламинов пик с максимальным значением m/z соответствует протонированной молекуле или иону (М-Н)+ и характеризует молекулярную массу соединения. Протонированные молекулы наблюдаются в масс-спектрах всех третичных, а также - большинства вторичных аминов. При этом относительная интенсивность пиков (М+Н)+ бензиламинов выше, чем у 1-фенилалкиламинов, что свидетельствует о большой устойчивости бензиламинов. В целом, относительная интенсивность пиков прогонированных молекул третичных аминов выше, чем вторичных аминов. В масс-спектрах всех первичных аминов отсутствовал пик (М+Н)+, но всегда наблюдался пик (М-Н)+, интенсивность которого обычно значительно ниже интенсивности других фрагментных пиков.

Установлено, что положение пиков с минимальным значением m/z характеризует структуру аминогруппы. В частности в масс-спектрах первичных аминов наблюдается пик низкой интенсивности с m/z 18 (см., например, рис. 5а). У вторичных аминов с одним метальным заместителем при азоте наблюдается пики с m/z 30 и m/z 32 (рис.

4г и рис. 6а), причем пик с m/z 30 характерен для бензиламинов, а пик с m/z 32 - для 1-фенилэтиламинов. Похожая картина наблюдается для третичных аминов, например, в масс-спектре N.N-дипропил-1 -фенилэтиламина на рис. 5в содержится пик с m/z 102. Следует отметить, что относительная интенсивность пиков с минимальным m/z у вторичных и третичных аминов значительно выше, чем у первичных.

| 80

m/z 105

m/z 18

nh,

(М-Н)+

100-1

X Е а и ео-

>s 2 z 80-

о S

л X X

i S0-

о 00

m/z

m/z 105

m/z 102

Jftw

(M+Hf

_mJU

m/z

Рис. 5. Масс-спектры а -1-фенилэтиламин, б - N,N-диметил-1 -фенилэтиламин, в - N,N-дипропил-1 -фенилэтиламин, г - N-метил-1 -(4-метилфенил)этиламин.

Наряду с пиками, характеризующими молекулярную массу соединения и аминогруппу, масс-спектры содержат от 1 до 3 фрагментных пиков, которые характеризуют углеводородный скелет молекулы арилалкиламина. Например, пик с m/z 91 (рис. 7, врезка) наблюдался только у бензиламинов, а пик с m/z 119 (рис. 5г) - только у 1-фенилэтиламинов с метальным заместителем в ароматическом кольце.

Основные направления фрагментации протонировапных молекул арилалкила-мииов

Анализ полученных масс-спектров позволил выявить четыре основных канала фрагментации, которые представлены ниже на схемах 1-4.

ГІТснз

СН3

,сн+

+ (СНз^'Н

Схема і

Схема 1 иллюстрирует фрагментацию с элиминированием амина НМ1г на примере КЫ-диметил-1 -фенилэтиламина. Это - основной канал фрагментации, наблюдавшийся для всех исследованных соединений. Фрагментация по схеме 1 обусловлена а-разрывом С-Ы связи с образованием карбокатиона и нейтральной молекулы амина. Следует отметить, что образующиеся при такой фрагментации ионы характеризуют состав арилалкильной группы в исследованных соединениях.

Тот же самый разрыв СЧ\Г связи, но сопровождающийся элиминированием молекулы арилалкена, описывается схемой 2. При этом происходит перенос атома водорода от углеводородной группы к атому азота. Из исследованных соединений такой канал фрагментации наблюдался для арилалкиламинов, имеющих разветвленный углеводородный скелет между ароматическим кольцом и аминогруппой. Образующиеся при фрагментации ион характеризуют состав аминогруппы в исследованных соединениях.

По схеме 3 происходит фрагментация с элиминированием молекулы водорода и образованием иона (М-Н)+. Вероятность фрагментации одного и того же соединения по схеме 3 всегда ниже, чем по схеме 1.

Схема 2

Схема 3

СН.

3 Схема 4

Схема 4 на примере КИ-диметилбензиламина иллюстрирует фрагментацию с элиминированием молекулы ароматического углеводорода. Среди исследованных соединений такой процесс наблюдался только для бензиламинов с вторичной или

третичной аминогруппой. Как и в схемах 1 и 2, фрагментация происходит с разрывом C-N связи, однако в данном процессе происходит перенос атома водорода к углеводородной группе. На масс-спеїсіре, приведенном на врезке рис. 7, фрагментации по схеме 4 соответствует пик с m/z 44. Образующийся при фрагментации ион характеризует не только состав аминогруппы, но также позволяет предположить, что один из заместителей при азоте является бензилом или его производным.

Наряду с разрывом C-N связи, в спектрах некоторых арилалкиламинов присутствуют пики, обусловленные разрывом С-С связи.

Для подтверждения предложенных схем фрагментации были проведены эксперименты с вводом в вакуумную камеру масс-спеюрометра паров тяжелой воды, давление которой составляло примерно 10"6 мм.рт.ст.

н-ы^снз н

105

(М-НГ

МЫ

13іШІ

m/z

Рис. 6. SALDI масс-спектры N-метил-1 -фенилэтиламина, полученные при подаче в вакуумную камеру паров обычной (а) и тяжелой (б) воды.

В качестве примера, на рис. 6 приведены два масс-спектра N-метил-1-фенилэтиламин, полученные при подаче в вакуумную камеру паров обычной и тяжелой воды. Видно, что пик с m/z 105 не меняет своего положения, это, с одной стороны, говорит о том, что атомы водорода, связанные с углеродом, не вступают в реакцию изотопного обмена, а с другой стороны, подтверждает образование пика с m/z 105 по схеме фрагментации 1.

Пик с m/z 32 на рис. 6а, соответствующий ионам CH3NH3+, при добавлении тяжелой воды расщепляется на три пика с m/z 32, 33 и 34. Именно такая картина должна наблюдаться для пика, образованного по схеме фрагментации 2. На первый взгляд, исходя из структуры иона CH3NH3+, можно было ожидать появление в масс-спектре

пиков с m/z 33, 34 и 35, поскольку с атомом азота связаны три атома водорода, и все они могут замещаться на дейтерий. Однако, в масс-спектре на рис. 66 отсутствует пик с m/z 35. Этот факт можно объяснить тем, что один из этих атомов водорода не участвовал в изотопном обмене и, значит, находился при атоме углерода. Как следует из схемы 2, это атом водорода метальной группы, образовавший связь с атомом азота в результате внутримолекулярного переноса водорода. Можно сделать вывод, что образование перестроечного иона с m/z 32 происходит после десорбции протонированной молекулы соединения с кремниевой подложки. Тот факт, что атом водорода переносится с метальной группы, подтверждает отсутствие ионов, образованных по схеме 2, в масс-спектрах всех арилалкиламинов с линейной углеводородной цепочкой (например, КМ-диметилбензил амина на рис. 7).

Пики с m/z 134 и 136 на рис. 6а, соответствующие ионам (М-Н)+ и (М+Н)+ после введения в вакуумную камеру паров тяжелой воды расщепляются и дают пять пиков с m/z от 134 до 138. Поскольку в структуре протонированной молекулы содержатся два атома водорода, и каждый из них может замещаться на дейтерий, то пик (М+Н)+ расщепляется на три пика с m/z 136, 137 и 138. Присутствие пиков с m/z 134 и 135 можно объяснить их образованием по схеме 3. Тот факт, что пик с m/z 135 имеет максимальную амплитуду, обусловлен его образованием при фрагментации как ионов с m/z 138, так и ионов с m/z 137.

Исследование зависимости фрагментации от плотности лазерного излучения

Изложенные в главе 4 результаты показывают, что степень фрагментации ионов органических соединений в SALDI можно непрерывно изменять путем изменения интенсивности воздействующего лазерного излучения.

Рис. 7 на примере соединения 21 иллюстрирует зависимость относительной доли протонированных молекул (m/z 136) и основных фрагментных ионов (m/z 44 и 91) в общем ионном сигнале этого соединения от плотности энергии лазерного излучения. Видно, что при относительно низких значениях интенсивности излучения в масс-спектрах доминирует пик протонированных молекул. При увеличении плотности энергии излучения растет степень фрагментации, достигая, также как и ионный ток, насыщения. Дальнейшее увеличение плотности энергии излучения уже слабо влияет на степень фрагментации. Тот факт, что степень фрагментации также почти не зависит от плотности лазерной энергии в диапазоне 25 - 35 мДж/см2, свидетельствует в пользу полной десорбции ионов. Следует отметить, что фрагментные ионы ведут себя по-разному от плотности лазерного излучения. Как видно из данных рис. 7, доля осколочных ионов с m/z 91, полученных простым разрывом C-N связи (схема 1), быстро

растет с ростом интенсивности лазерного излучения, а доля перестроечных ионов с m/z 44 (схема 4) растет гораздо медленнее.

Рис. 7 - зависимость степени фрагментации N,N-

диметллбензиламина от интенсивности лазерного излучения. На вставке представлен масс-спектр N,N-диметилбеазил амина при интенсивности лазерного излучения 20 мДж/см2.

Полученные результаты иллюстрируют важную для аналитической практики возможность в методе SALDI контролировать в ходе анализа степень фрагментации термолабильных определяемых соединений. Следует отметить, что наличие небольшого числа диагностически значимых пиков существенно упрощает определение арилалкиламинов в сложных смесях органических соединений. Этим предложенный в работе метод ионизации выгодно отличается от наиболее распространенной в ГХ/МС электронной ионизации.

Аналитические параметры SALDI при определении арилалкиламинов

Основным процессом образования положительно заряженных ионов в SALDI является протонировшше, что предполагает зависимость вероятности ионизации от величины энергии сродства к протону (РА) или основности в газовой фазе (GB) определяемых соединений. В главе 5 приведены результаты исследований, включающих квантово-химические расчеты этих термодинамических параметров для всех исследованных арилалкиламинов, а также ряда других органических соединений и изучение зависимости чувствительности от рассчитанных величин РА и GB.

Методика расчетов РА и GB, выполненная с использованием программного пакета Firefly, приведена в главе 5. Полученные значения представлены в таблице 1.

На рис. 8 представлена зависимость чувствительности определения арилалкиламинов от рассчитанной величины их основности в газовой фазе. Из

0,0

1-'-1-■-1-1-1-■-1-■-1-1-1-.-г

5 10 15 20 25 30 35 40

Плотность энергии, мДж/см2

приведенных данных видно, что в исследованном диапазоне величин йВ чувствительность экспоненциально убывает с уменьшением основности в газовой фазе определяемого соединения.

10000■

с; о Е

§ 1000■

о m >. У

100 ^

1 г

1—I—'—I—

800 820 840

Рис. 8 Зависимость чувствительности от рассчитанных значений основности в газовой фазе определяемых соединений.

—I—'—1—■—I—■—I—I—I—I—I—1—1—'—I—'

860 880 900 920 940 9S0 980 1000

GB, кДж/моль

В работе обсуждается возможное объяснение наблюдаемой зависимости. Предполагая, что величина выхода ионов в условиях эксперимента определяется стадией ионизации (протонирования), показано, что она пропорциональна выражению exp(GB(A)/RT), где GB(A) - основность в газовой фазе аналита.

Представленные в табл. 1 результаты позволили также оценить эффективность лазерной десорбции-ионизации с поверхности аморфного кремния - отношение числа ионов химического соединения, десорбированных с облучаемой лазером поверхности, к числу молекул соединения, падающих на эту поверхность в единицу времени. Очевидно, эффективность SALDI равна произведению чувствительности на величину, обратную геометрическому фактору - доле молекул аналита, падающих на облучаемую поверхность, в общем их количестве, введенном в масс-спектрометр. Показано, что геометрический фактор в условиях эксперимента примерно равен I0"3. Найдено, что эффективность SALDI для исследованных соединений варьируется от 1.1-Ю-4 до 1,2 10"2. Учитывая, что современные масс-спекгрометры высокого разрешения позволяют надежно идентифицировать химические соединения на основе всего 100 ионов и даже ниже, полученные результаты показывают, что метод SALDI теоретически может обеспечить детектирование арилалкиламинов на уровне единиц аттомоль.

В табл. 1 представлены пределы обнаружения всех исследованных арилалкила-минов, рассчитанные по наиболее интенсивному пику. Выбор единственного пика для оценки предела обнаружения обусловлен полным хроматографическим разделением.

Таблица 1 Рассчитанные значения РА и БВ и аналитические параметры исследован-

ных соединений.

Название РА, кДж/моль GB, кДж/моль Чувствительность, ион/фмоль Предел обнаружения, нг/мл

пиразин 881.9 847.1 4 6.9

морфолин 928.1 895.1 22 1.23

триэтиламин 978.2 948.2 1862 0.01

анилин 878.4 845.1 12 2.25

2-амино-5-пиколин 970.6 936 449 0.07

пиридин 937.1 904.2 314 0.08

бензиламин 926.7 893.5 66 0.5

Х-метилбензиламин 956.9 923.7 226 0.2

К-этил-бензиламин 964.1 930.9 340 0.14

Х.Х-диметилбензиламин 974.0 940.7 2052 0.03

1-фенилэтиламин 936.2 903.4 92 0.39

метил-1 -фенилзтиламин 967.3 934.0 357 0.12

N диметил-1 -фенилзтиламин 979.7 946.5 3126 0.02

1 -фенилпропиламин 942.2 909.0 261 0.25

1 -(4-метилфенил)этиламин 943.9 910.8 248 0.12

Х-изопропил-1 -фешшэтиламин 973.5 941.1 813 0.07

3-фенил-пропиламин 947.1 915.7 423 0.17

Х-метил-4-метилбекзкламшг 964.3 931.4 247 0.15

Хт-метил-1 -(4-метилфенил)-этиламин 974.7 941.7 978 0.04

Щ^-диэтилбензиламин 989.3 956.3 2433 0.02

1 -бензилпропиламин 951.4 918.6 416 0.14

1-(4-этилфенил) этиламин 945.2 911.7 255 0.14

1 -(4-метоксифенил) этиламин 950.5 917.0 585 0.06

Х.М-дипропил-1 -фенилзтиламин 1008.2 976.8 7458 0.01

Х-бснзил-1 -фенилзтиламин 978.4 945.1 2040 0.04

Х-бензил,М-метил-1 -фенилзтиламин 998.9' 964.9 8654 0.01

Как видно из приведенных данных, пределы обнаружения варьируются в достаточно широких пределах, что связано с различием величин газо-фазной основности. Однако даже для соединений с относительно низкими значениями ОВ предел обнаружения не превышает 500 пг/мл, а для высокоосновных арилалкиламинов составляет величину 10 пг/мл. Как показано в главе 1, традиционные методы ГХ/МС опреде-

ления арилалкиламинов обеспечивают предел обнаружения на уровне не ниже 1 нг/мл.

В главе 5 показано, что разработанный метод ГХ/вАЫЛ-МС отличается исключительно высокой селективностью.

Найдено, что относительное стандартное отклонение величины аналитического сигнала (площадь соответствующего хроматографического пика) для всех исследованных арилалкиламинов составило примерно 5-7%. Сравнительно высокая воспроизводимость анализа обусловлена тем, что в варианте ГХ/8АЬ01-МС эмиттер ионов постоянно находится в вакууме под воздействием десорбирующего лазерного излучения, что обеспечивает неизменность физико-химического состава его поверхности, а газовый хроматограф позволяет воспроизводимо вводить пробу.

На рис. 9 на примере трех арилалкиламинов приведены типичные для ГХ/8А1Л)1-МС градуировочные кривые. Из представленных данных следует, что концентрационные характеристики остаются линейными в диапазоне по крайней мере четырех порядков величины, после чего выходит на насыщение. В работе показано, что это насыщение обусловлено особенностями системы регистрации ионов и даже на участке насыщения градуировочных кривых степень заполнения поверхности молекулами аналита не превышает нескольких сотых монослоя.

1е8-

с£ 0)

I &

га юооооо

100000

Л X X

5 10000

1000

■ А Т ЧМ-дипропилП-фенилэталамин ММ-диметилбензиламин 1-бензиламин ■ А А

■ А

У т

/ / у / X

У* У /■

У у' У*

У* <■ /

А У

--Г"! У 1 ■ 1111»-1 Ы 1 1 М1|-1 1 ПМ11| 1 1 НИЦ-1 1 1 Ш1Ц-1 1 1 1ИИ\

Рис. 9 Градуировочные кривые при определении содержания N,>1-

дипропил-1 -этиламина, К,1\т-диметилбензиламина и 1-бензиламин.

1 10 100 1000 10000 100000 юооооо Концентрация, пмоль/мл

Приведенные результаты получены при анализе модельных растворов арилалкиламинов. Однако на практике обычно необходимо проводить анализ проб сложного состава. Особенно важной задачей является высокочувствительное определение арилалкиламинов в биологических жидкостях. В заключительной части главы 5 пред-

ставлены результаты, полученные при определении арилалкиламинов в крови.

Разработанная методика основана на жидкостной экстракции для извлечения соединений в органическую фазу с последующим их определением методом ГХ/SALDI-МС. По результатам исследований различных экстрагирующих смесей найдено, что оптимальным является использование солевого буфера на основе хлорида аммония и экстрагирующих смесей состава хлороформ:ацетонитрил (6:4 - 4:6). Выход экстракции составил 95 %.

Для экспресс-анализа полученный раствор (органическая фракция) непосредственно вводится в ГХ, однако при этом концентрация аналитов в пробе в 5 раз меньше, чем в крови вследствие разбавления в процессе пробоподготовки. При таком способе предел обнаружения арилалкиламинов в крови составляет 0.05-2.5 нг/мл. Относительное стандартное отклонение не превышало 9%. Разработанная методика предусматривает также возможность концентрирования аналита до 10 раз путем испарения растворителя в токе сухого воздуха. Соответственно, предел обнаружения арилалкиламинов снижается до 10 раз. При этом относительное стандартное отклонение составляет 12-14 %.

Сравнение полученных результатов с метрологическими параметрами стандартных методов ионизации (электронная и химическая ионизации) показало, что достигнутые пределы обнаружения арилалкиламинов по крайней мере на два порядка величины ниже. Выводы:

1. Разработан метод высокочувствительного масс-спектрометрического определения арилалкиламинов, основанный на поверхностно-активированной лазерной десорбции-ионизации (SALDI) в сочетании с газовой хроматографией и времяпролет-ной масс-спектрометрией. Разработан и реализован интерфейс сопряжения хроматографа с MC, выбраны оптимальные условия разделения сложных смесей и получены SALDI масс-спектры 20 арилалкиламинов.

2. Исследованы факторы, определяющие эффективность образования ионов ари-алкиламинов - состав и структура эмиттера ионов, интенсивность лазерного излучения, плотность потока протонодонорных молекул на поверхность эмиттера ионов. Показано, что по совокупности таких параметров, как чувствительность, уровень фонового сигнала и воспроизводимость получения, лучшими свойствами характеризуются эмиттеры ионов на основе аморфного кремния. На основе полученных результатов выбраны оптимальные условия анализа арилалкиламинов методом ГХ/SALDI-МС.

3. Изучены закономерности фрагментации протонированных молекул арилалки-ламинов в условиях лазерной десорбции-ионизации с поверхности аморфного кремния. Предложены схемы фрагментации. Показано, что фрагментация однозначно определяется структурой молекул арилалкиламинов, что позволяет достоверно идентифицировать определяемые соединения при анализе проб сложного состава. Установлено, что степень фрагментации можно менять в широких пределах путем изменения интенсивности лазерного излучения.

4. Проведены квантово-химические расчеты величин сродства к протону РА и основности в газовой фазе GB для 26 соединений. На основе полученных значений установлена связь между чувствительностью и величиной GB определяемых соединений. Показано, что эффективность SALD1 экспоненциально зависит от GB в исследованном диапазоне величин GB 845-977 кДж/моль. Полученные результаты имеют прогностическую ценность и позволяют прогнозировать эффективность SALDI и следовательно чувствительность анализа по известным или рассчитанным значениям РА и GB.

5. Определены основные аналитические параметры разработанного метода ГХ/SALDI-MC при анализе модельных растворов арилалкиламинов - чувствительность, эффективность ионизации, предел обнаружения, динамический диапазон. Чувствительность варьировалась от 6.6-Ю1 до 8.6-103 ион/фмоль дая исследованного ряда соединений. Диапазон линейности градуировочных кривых для всех арилалкиламинов превышает 4 порядка величины.

6. Разработана методика определения арилалкиламинов в крови, основанная на жидкостной экстракции определяемых соединений в раствор хлоро-форм:ацетонитрил. Степень извлечения арилалкиламинов составила 0.9-0.95. Предел обнаружения варьировался для различных соединений от 6 до 300 пг/мл, что от 3 до 200 раз ниже, чем при использовании стандартных масс-спектрометрических методов анализа.

Список публикаций по теме диссертации Статьи:

1. Шишкина И.Н., Кузнецова А.А., Бородков А.С., Демьянович В.М., Потехин К.А., Чеснова А.В., Зефиров Н.С. Стереохимия циклизации 6-[(S)-l-фенилэтил]аминоспиртов в хиральные 1,3-дигидроизобензофураны // ДАН. 2005. Т.405. №2, С.213-218.

2. Alimpiev S.S, Grechnikov А.А., Sunner J., Borodkov A.S., Karavanskii V.A., Simanovsky Ya.O, Nikiforov S.M. Gas chromatography/surface-assisted laser desorption ionization mass spectrometry of amphetamine-like compounds // Anal. Chem. 2009. Vol. 81, P.1255-1261.

3. Гречников A.A., Бородков A.C., Алимпиев С.С., Никифоров С.М., Симановский Я.О., Караванский В.А. Определение соединений группы фенилалкиламинов методом поверхностно активированной лазерной десорбции-ионизации с аморфного кремния // Масс-спектрометрия. 2010. Т.7. №1, С.53-59.

4. Grechnikov A.A., Georgieva V.B., Alimpiev S.S., Borodkov A.S., Nikiforov S.M., Simanovsky Ya.O., Dimova-Malinovska D., Angelov O.I. The investigation of nanocrystalline ZnO layers for Laser Desorption-Ionization // J. of Phys.:Conf.Ser. 2010. V.223. P.012038(5).

5. Жабин C.H., Пенто A.B., Гречников A.A., Бородков A.C., Сартаков Б.Г., Симановский Я.О., Никифоров С.М., Алимпиев С.С. // О роли лазерного излучения в процессах лазерной десорбции/ионизации с кремниевых поверхностей // Квантовая электроника. 2011. Т.41, № 9. с.835-842.

Тезисы докладов:

1. Гречников A.A., Бородков A.C., Алимпиев С.С., Никифоров С.М., Симановский Я.О. Определение лекарственных препаратов группы фенамина методом лазерно-индуцированной десорбции-ионизации на поверхности // Всероссийская конференция «Аналитика России», 27 сентября-1 октября 2004 г., Москва. Тезисы. С.200-201.

2. Бородков A.C., Гречников A.A., Никифоров С.М., Алимпиев С.С., Караванский В.А. ГХ/МС определение азотсодержащих соединений методом лазерно-индуцированной десорбции-ионизации на поверхности // И-ая международная семинар-школа: «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород, 4-7 октября 2004 г. Тезисы доклада. С.55.

3. Borodkov A.S., Zhabin S.N., Grechnikov A.A., Alimpiev S.S., Nikiforov S.M. Detection of aromatic amines by surface-assisted laser desoption-ionization/ International conference «Analytical chemistry and chemical analysis». September 12-18, 2005, Kiev, Ukraine. Books of abstracts, p. 103.

4. Жабин C.H., Бородков A.C., Никифоров С.М., Алимпиев С.С., Гречников A.A., Симановский Я.О. Спектральная зависимость выхода ионов органических соединений при лазерной десорбции и ионизации с поверхности шероховатого кремния (SALDI) // Всероссийская конференция с международным участием "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы", Москва, 12-16 сентября 2005 г. Тезисы докладов, с.91.

5. Бородков A.C., Кузнецова A.A., Шишкина И.Н., Демьянович В.М., Потехин К.А. Синтез и конфигурация (+)-3-метил-1-трифторметил-1-фенил-1,3-дигидроизобензофурана // XXII Международная Чугаевская конференция по координационной химии, 20-24 июня 2005 года, г.Кишинев. Тезисы докладов, с.304.

6. Grechnikov A.A., Alimpiev S.S., Nikiforov S.N., Borodkov A.S., Zhabin S.N., Sunner J.A. // On the mechanism of surface assisted laser desorption ionization (SALDI) of amines from silicon surfaces. International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006, June 25-30, 2006, Moscow, Russia. Book of Abstracts, vol.2, p.508-509.

7. Nikiforov S.M., FedotovaN.A., Borodkov A.S., Simanovski I.O., Alimpiev S.S. Comparison of surface assisted laser desorption ionization (SALDI) efficiency from silicon surfaces // 40 Diskussionstagung der Deutschen Gesellschaft fiir Massenspekt'ometrie. Bremen, März 11-14, 2007. Referat. S.46.

8. Grechnikov A.A., Borodkov A.S., Zhabin S.N., Alimpiev S.S., Nikiforov S.M. GC/MS detection of basic nitrogen compounds by surface assisted laser desorption

ionization (SALDI) // 40 Diskussionstagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie. Bremen, März 11-14, 2007. Referat. S.48.

9. Бородков A.C., Гречников A.A., Шишкина И.Н., Демьянович B.M. Исследование механизма фрагментации арилалкиламинов при использовании метода лазерно-индуцированной десорбции и ионизации на поверхности // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Москва, 23-28 сентября 2007. Тезисы докладов. С. 90.

10. Бородков A.C., Гречников A.A., Алимпиев С.С., Никифоров С.М., Караванский В.А. Определение азотсодержащих гетероциклических соединений методом лазерно-индуцированной десорбции и ионизации на поверхности // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Москва, 23-28 сентября 2007. Тезисы докладов. С. 91.

11. Бородков A.C., Гречников A.A., Никифоров С.М., Алимпиев С.С., Симановский Я.О. Исследование зависимости эффективности лазерной десорбции-ионизации на кремниевой поверхности от сродства к протону химических соединений // 4 Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». Москва, 18-22 мая 2009 г. С. 150.

12. Никифоров С.М., Симановский Я.О., Бородков A.C., Гречников A.A., Макаров A.A., Алимпиев С.С. Масс-спектрометр с поверхностно активированной лазерной десорбцией-ионизацией для детектирования органических соединений // 4 Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». Москва, 18-22 мая 2009 г. С.181.

13. Grechnikov А., Alimpiev S., Sunner J., Borodkov A., Nikiforov S., Simanovsky Ya. Gas Chromatography SALDI: Importance of Proton Affinity and Laser Fluence to Sensitivity and Ion Fragmentation // Proc. 57-th ASMS Conference on Mass Spectrometry. May 31 - June 4,2009. Philadelphia, USA.

14. Grechnikov A.A., Borodkov A.S., Georgieva V.B., Spassov L.S. Negative Mode, Laser Desorption/Ionization from Amorphous Titanium Dioxide Thin Layers // Proc. 7-th BPU General Conference, 9-13 September 2009. Alexandroupolis, Greece. P.153-154.

15. Кубасов A.A., Бородков A.C., Гречников A.A., Алимпиев С.С. Сравнение аналитических характеристик методов ионизации электрораспылением и поверхностно активированной лазерной десорбции/ионизации на примере анализа лекарственных препаратов. Съезд аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" 26-30 апреля, 2010. Москва. Тезисы докладов. С.164.

16. Кубасов A.A., Бородков A.C., Гречников A.A. Исследование процессов фрагментации биогенных аминов при лазерной десорбции-ионизации с поверхности. 4 всероссийская конференция-школа: «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» 10-14 октября, 2010. Звенигород. Тезисы докладов. С. 106.

17. Кубасов A.A., Бородков A.C., Гречников A.A. Определение ß-адреноблокаторов в плазме крови методом лазерной десорбции-ионизации, активируемой поверхностью. IV Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 05-09 сентября 2011 г. Москва. Тезисы докладов. С. 78.

18. Бородков A.C., Кубасов A.A., Гречников A.A. Высокочувствительное определение трициклических антидепрессантов в плазме крови методом ГХ/МС с SALDI ионизацией. Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии. 02-08 октября 2011 г. Краснодар. Тезисы докладов. С. 226.

Отпечатано на ризографе в ОНТИ ГЕОХИ РАН Дата печати 11.01.2012 Тираж 100 экз.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Бородков, Алексей Сергеевич, Москва

61 12-2/333

Институт геохимии и аналитической химии им. В.И.Вернадского РАН

Бородков Алексей Сергеевич

Высокочувствительное определение арилалкиламинов методом поверхностно активированной лазерной десорбции-ионизации в сочетании с газовой

хроматографией

02.00.02 - аналитическая химия

диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: кандидат химических наук А.А.Гречников

Москва 2012

Оглавление

Введение 5

Глава 1. Литературный обзор 9

1.1 Применение методов лазерной десорбции-ионизации для 9 определения органических соединений

1.1.1 Основные направления развития методов лазерной десорбции- 9 ионизации

1.1.2 Мягкая лазерная десорбция ионизация - Soft LDI 11

1.1.3 MALDI 12

1.1.4 SELDI 16

1.1.5 SALDI 17

1.1.5.1 SALDI на основе суспензий наночастиц 18

1.1.5.2 SALDI с углеродных поверхностей 21 1.5.3 SALDI на основе кремниевых поверхностей 22

1.2 Методы определения арилалкиламинов 28

1.2.1 Иммунохимические методы анализа 28

1.2.2 ИК- и УФ-спектроскопия 30

1.2.3 Газохроматографические методы анализа 31

1.2.4 Сочетание ГХ с MC 35

1.3 Заключение 39 Глава 2. Оборудование, материалы, методика эксперимента 41

2.1 Оборудование 41

2.2 Эмиттеры ионов 45

2.3 Реагенты 47 Глава 3. Исследование факторов, определяющих эффективность 50 ионизации арилалкиламинов

3.1 Интерфейс сопряжения газового хроматографа с времяпролетным 51 масс-спектрометром

3.2 Выбор эмиттера ионов для поверхностно активированной 52 лазерной десорбции-ионизации арилалкиламинов

3.2.1 Лазерно-индуцированная модификация поверхности 53 пористого кремния

3.2.2. Исследование химического состава поверхности пористого 57 кремния при лазерно-индуцированной модификации

3.2.3. Эмиттер ионов на основе аморфного кремния 60

3.3 Исследование зависимости выхода ионов от плотности энергии 63 лазерного излучения

3.4 Роль воды в процессе лазерной десорбции-ионизации 66 арилалкиламинов

3.5 Выводы 69 Глава 4. Анализ масс-спектров арилалкиламинов, полученных в 70 условиях ГХ/SALDI-MC

4.1 Масс-хроматограммы арилалкиламинов в режиме ГХ/SALDI-MC 70

4.2 SALDI масс-спектры арилалкиламинов 75

4.3 Основные направления фрагментации протонированных молекул 77 арилалкиламинов

4.3.1 Схемы фрагментации 7 7

4.3.2. Исследования закономерностей фрагментации в условиях 80

подачи паров тяжелой воды

4.3.3 Идентификация промежуточных продуктов в синтезе 85

оптически активных соединений из (S)-(-)-1 -фенилэтиламина

4.4 Исследование зависимости фрагментации от плотности лазерного 86 излучения

4.5 Выводы 91 Глава 5. Аналитические параметры метода ГХ/SALDI-MC определения 93 арилалкиламинов

5.1. Квантово-химические расчеты величин сродства к протону и 94 основностей в газовой фазе арилалкиламинов

5.2 Зависимость чувствительности от основности соединений в 97 газовой фазе

5.3 Метрологические характеристики метода 99

5.3.1 Оценка эффективности SALDI 99

5.3.2 Предел обнаружения арилалкиламинов 101

5.3.3 Селективность определения арилалкиламинов 103

5.3.4 Воспроизводимость и динамический диапазон метода SALDI 103 5.3 ГХ/SALDI-MC определение арилалкиламинов в крови 106 5.5 Выводы 111

Выводы 112

Список литературы 114

Приложение 1 132

Приложение 2 134

Список статей в реферируемых журналах по теме диссертации 141

Вклад соавторов печатных работ 142

Введение

Актуальность темы. Одна из наиболее актуальных задач аналитической химии - идентификация и высокочувствительное количественное определение биологически активных соединений в различных средах. В первую очередь это касается лекарственных препаратов, из которых к числу наиболее важных относятся арилалкиламины и их производные. На основе этих соединений разработаны и разрабатываются многочисленные лекарственные препараты, используемые в терапевтической практике в качестве нейростимуляторов, медиаторов, антидепрессантов и сосудорасширяющих средств. Ряд арилалкиламинов относятся к сильнодействующим психотропным соединениям, включены в конвенцию по психотропным веществам и являются объектами судебно-медицинских исследований. Производными арилалкиламинов являются также некоторые синтетические наркотики, распространение которых становится в последние годы серьезной социальной проблемой. Все эти соединения обычно находятся в анализируемых образцах в следовых количествах. В этой связи, очевидно, что разработка высокочувствительного и селективного метода определения арилалкиламинов является актуальной задачей.

Одним из наиболее перспективных подходов для решения этой задачи является метод лазерной десорбции-ионизации, активируемой поверхностью (surface assisted laser desorption ionization - SALDI). Этот метод отличается высокой чувствительностью при определении ряда органических и биоорганических соединений и активно развивается в последнее десятилетие. Традиционно приборная реализация метода SALDI основана на использовании серийных MALDI времяпролетных масс-спектрометров, при которой анализируемую пробу наносят на активную поверхность эмиттера ионов, высушивают и помещают в вакуумную камеру масс-спектрометра для анализа. Такой подход ограничивает спектр определяемых соединений только малолетучими веществами и характеризуется низкой воспроизводимостью. Другим подходом, перспективным для анализа летучих соединений, может быть сочетание метода SALDI с газовой хроматографией (ГХ). Арилалкиламины достаточно легко могут быть переведены в газовую фазу путем нагрева, что создает предпосылки для разработки высокочувствительного метода их определения на основе сочетания ГХ с SALDI-

масс-спектрометрией (MC).

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести квантово-хими хкие расчеты величин сродства к протону (РА) и основности в газовой фазе (GB) для исследуемых соединений и установить связь между рассчитанными величинами и значениями чувствительности;

- разработать методику ГХ/SALDI-MC определения арилалкиламинов в крови. Научная новизна работы.

Установлены закономерности фрагментации протонированных молекул

арилалкиламинов, полученных при лазерной десорбции-ионизации с поверхности аморфного и пористого кремния.

Разработана методика определения арилалкиламинов в крови с пределом обнаружения на уровне 6-300 пг/мл.

Практическая значимость работы. Разработан метод определения арилалкиламинов, основанный на сочетании ГХ с SALDI-MC, с пределом обнаружения до 100 раз ниже, чем при использовании стандартных масс-спектрометрических методов анализа. Предложена методика определения арилалкиламинов в крови.

- Результаты исследования факторов, определяющих эффективность образования ионов арилалкиламинов в условиях ГХ/SALDI-MC анализа: геометрии интерфейса сопряжения ГХ с MC, режима хроматографического разделения

определяемых соединений, состава и структура эмиттера ионов, интенсивности лазерного излучения, плотности потока протонодонорных молекул на поверхность эмиттера ионов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на всероссийской конференции «Аналитика России» (2004), Ii-ом международном семинаре-школе: «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (2004), международной конференции «Analytical chemistry and chemical analysis» (2005, Украина), XXII международной Чугаевской конференция по координационной химии (2005, Молдавия), всероссийской конференции "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы" (2005, 2009, 2011), международном аналитическом конгрессе ICAS-2006 (2006), 40-ой конференции «Diskussionstagung der Deutschen Gesellschaft fur Massenspektrometrie» (2007, Германия), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (2007), 57-ой масс-спектрометрической конференции ASMS (2009, США), 7-ой конференции BPU (2009, Греция), 16-ой международной школе в Болгарии (2009, Болгария), съезде аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" (2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 18 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка литературы из 181 наименований. Диссертация изложена на 142 страницах печатного текста, содержит 37 рисунков и 12 таблиц.

Глава 1 Литературный обзор 1.1 Применение методов лазерной десорбции-ионизации для определения органических соединений

В настоящее время методы масс-спектрометрии широко используются для анализа органических и биоорганических соединений, позволяя получать точную информацию о структуре и обеспечивая относительно низкие пределы обнаружения. Обычно для ионизации органических соединений используют классические методы: электронную и химическую ионизацию. Однако, при решении ряда важных для практики задач данные методы имеют ряд существенных ограничений. В первую очередь это связано с относительно низкой величиной эффективности ионизации в газовой фазе (10~5 - 10"6), которая является решающей при определении предела обнаружения. Другим существенным недостатком наиболее распространенного метода - электронной ионизации, является значительная фрагментация сложных молекул. При определении молекул в образцах сложного состава или в случаях, когда необходим быстрый анализ в реальном времени, ионизуются одновременно сразу несколько соединений. В результате, при значительной фрагментации образуются очень сложные масс-спектры, и идентификация индивидуальных соединений на их основе крайне сложна, а во многих случаях и невозможна. Альтернативным подходом к масс-спектрометрическому анализу органических и биоорганических соединений, который особенно активно развивается в последние годы, является использование лазера для десорбции-ионизации молекул аналита.

1.1.1 Основные направления развития методов лазерной десорбции-ионизации

Лазерная техника нашла применение в масс-спектрометрии почти сразу после своего изобретения [1]. Быстрое развитие лазерной техники привело к появлению новых подходов и методов анализа, к числу которых относятся методы лазерной десорбции-ионизации (Laser Desorption Ionization - LDI). Уже на самых ранних этапах развития этих методов работы велись по двум направлениям. Первое направление основано на том, что лазерному облучению подвергалось

непосредственно исследуемое вещество, находящееся в газовой фазе. Обычно для этого применялась многофотонная ионизация. Метод многофотонной ионизации при использовании перестраиваемых по частоте лазеров обладает высокой селективностью по ионизуемому соединению, когда частота излучения настраивается в резонанс с электронным переходом молекул определяемого соединения, возбуждает его и далее ионизует вторым или третьим фотоном [2]. При этом в условиях резонансного возбуждения может достигаться вероятность ионизации, близкая к единице, уже при сравнительно низких значениях плотности энергии лазерного излучения. Однако, несмотря на столь высокую эффективность ионизации, метод многофотонной селективной лазерной ионизации остается и по сей день на уровне лабораторного оборудования и не нашел своего приборного воплощения. Очевидной причиной этого является исключительная сложность и громоздкость лазерных систем, которые в состоянии обеспечить плавно перестраиваемое излучение в области 200-300 нм. К значимым недостаткам также следует отнести небольшое количество классов веществ, поддающихся анализу (в основном низкомолекулярные органические соединения), а также сильную фрагментацию.

Другое направление развития методов LDI основано на том, что лазерное излучение может эффективно быть использовано для десорбции и испарения, т.е. переведения в газовую фазу нелетучих или мало летучих органических соединений. Развитие этого направления достаточно быстро привело к появлению приборов типа LAMMA, используемых для элементного и в том числе примесного анализа состава твердых тел [3]. В этих приборах обычно применяется достаточно мощный (до 100 мДж в импульсе) импульсный NdrYAG лазер, излучение которого фокусируется на исследуемый объект и испаряет его. Возникающая лазерная плазма ионизует продукты испарения, ионный состав которых регистрируется времяпролетным масс спектрометром. Неоднократно предпринимались попытки применения этой техники для определения сложных органических и биоорганических соединений. Несмотря на внешнюю простоту метода пробоподготовки (анализируемую пробу из раствора наносят на металлическую подложку), применение этой техники оказалось малопродуктивным. Основными недостатками оказались крайне сильная фрагментация и низкая чувствительность.

Несмотря на эти недостатки, метод используется и в настоящее время, но главным образом для решения локальных задач. В частности, этот метод применялся для анализа нефтяных порфиринов [4], замещенных полициклических карбоновых кислот [5], полициклических ароматических углеводородов [6].

Методы LDI получили дальнейшее развитие в середине 80-х годов, когда были предложены два принципиально новых варианта LDI. Оба варианта были основаны на использовании специальной матрицы, хорошо поглощающей лазерное излучение, в качестве средства для десорбции-ионизации тяжелых органических и биоорганических соединений.

1.1.2 Мягкая лазерная десорбция ионизация - Soft LDI

Первый вариант LDI с использованием матрицы, который автор назвал «мягкая лазерная десорбция-ионизация (Soft LDI) на основе ультра тонких металлических порошков» был предложен в качестве патента Японии в 1985 г. и как научная публикация в 1987 г. [7]. По своей сути матрица представляла собой суспензию наночастиц кобальта диаметром 300 Â в глицерине. В своих исследования автор использовал импульсный азотный лазер с длиной волны 337 нм в сочетании с времяпролетным масс-спек