Агрегация тромбоцитов человека: поиск путей ее регуляции и коррекции

Демина, Ольга Викторовна

Агрегация тромбоцитов человека: поиск путей ее регуляции и коррекции тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Демина, Ольга Викторовна АВТОР

доктора химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2014 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Агрегация тромбоцитов человека: поиск путей ее регуляции и коррекции»

Автореферат диссертации на тему "Агрегация тромбоцитов человека: поиск путей ее регуляции и коррекции"

На правах рукописи

ДЕМИНА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

АГРЕГАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА: ПОИСК ПУТЕЙ ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ И КОРРЕКЦИИ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

2 7 МЛР 2014

Москва - 2014

005546514

Работа выполнена в лаборатории кинетики и механизмов ферментативных и каталитических реакций ФГБУН Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук и на кафедре Биотехнологии и бионанотехнологии ФГБОУ ВПО Московского государственного университета тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова

Научный консультант: Швец Виталий Иванович, академик РАН, доктор химических наук, профессор, зав. кафедрой Биотехнологии и бионанотехнологии ФГБОУ ВПО Московского государственного университета тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

Атауллаханов Фазоил Иноятович, доктор биологических наук, профессор, директор ФГБУН Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук

Чупин Владимир Викторович, доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук Яровенко Владимир Николаевич, доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории гетероциклических соединений ФГБУН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук

Ведущая организация:

ФГБУН Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита диссертации состоится «21» апреля 2014 г. в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «17» марта 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ1 Актуальность темы исследования.

Рецепторно-ферментные системы клеток, включающие

высокоспецифичные белковые рецепторы (рецепторы, сопряженные с й-белками (СРСЯ) и др.), расположенные на внешней клеточной мембране, и группу сопряженных с ними ферментных систем и ионных каналов, осуществляют анализ и переработку полученной извне информации, направленное регулирование и управление определенным типом клеточного ответа. Молекулярное распознавание лиганда (активатора или ингибитора) мишенью - ОРСЯ является первой стадией практически всех процессов, протекающих в биологических системах. Геометрическая и химическая комплементарности малых молекул-лигандов с макромолекулярными биологическими структурами-мишенями - белками (рецепторами, ферментами) определяют пути передачи сигнала в клетках или пути метаболизма, вызывая, таким образом, физиологический ответ. Направленное регулирование передачи сигнала в клетке и прогнозирование типа получаемого физиологического ответа зависит от точного знания закономерностей функционирования мембранных рецепторов и сочетания различных параметров для получения желаемого физиологического ответа.

Расшифровка механизма функционирования жизненно важных рецепторно-ферментных систем и разработка эффективных методов их регуляции является фундаментальной научной и практической задачей. Комплексное изучение таких систем на клеточном уровне и в организме необходимо для выявления закономерностей, позволяющих целенаправленно управлять клеточным ответом, и для создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов для лечения и предотвращения различных патологий человеческого организма. Одной из таких систем является система гемостаза человека. Неполное знание регуляторных механизмов функционирования и отсутствие эффективных антиагрегационных фармакологических препаратов с минимальными побочными эффектами обходится ежегодно в десятки миллионов человеческих жизней: смертность от заболеваний сердечно-сосудистой системы занимает первое место в мире. Разработка методов и путей целенаправленной коррекции системы гемостаза человека позволит предотвращать и успешно излечивать такие тяжелые патологии сердечно-сосудистой системы человека, как тромбозы, инфаркты и инсульты. Накопление экспериментальных и теоретических знаний в области биохимии крови позволило выявить наиболее важный и доступный объект для исследований потенциальных антиагрегационных веществ -тромбоциты (Тц). Тц являются критическим звеном процесса нормального или патологического тромбообразования, так как агрегация Тц человека с образованием первичного «белого тромба» в месте повреждения сосуда является ключевой стадией в процессе функционирования системы

Автор выражает особую благодарность член-корр. РАН Варфоломееву С.Д. за постоянную помощь и консультации в ходе настоящего исследования

гемостаза. При ряде патологий возможно спонтанное тромбообразование, приводящее к инфарктам, инсультам или к мгновенной смерти.

Поиск эффективных путей и средств целенаправленной коррекции системы гемостаза человека является одной из важнейших и актуальнейших проблем биоорганической химии, физико-химической биологии и медицины. Агрегация Тц представляет собой яркий пример физиологического ответа и является удобной моделью для исследования антиагрегационной активности синтетических и природных соединений. Наиболее вероятными объектами-мишенями действия антиагрегационных средств являются мембранные рецепторы, связанные с в-белками (ОРСЯ), которые являются начальным звеном цепи передачи сигнала в клетке и/или ферменты, участвующие в передаче сигнала по цепи: тирозинкиназы, фосфолипазы, ферменты каскада арахидоновой кислоты (АА). Среди ОРСЯб Тц особое внимание уделяется рецептору тромбоксана А2 (ТхА2), поскольку ТхА2 считается одним из мощных активаторов агрегации, опосредованно увеличивающим агрегацию, вызванную более сильными активаторами - тромбином и АБР. Эффект АЭР, тромбина и ТхА2 при определенных патологиях (диабет, гиперлипидемия, заболевание коронарной артерии) может привести к эндотелиальной дисфункции, характеризующейся понижением синтеза сосудорасширяющих и антиагрегационных факторов: простациклина и расслабляющего фактора, синтезируемого эндотелием (БОЯР). Разработанные ранее антиагрегационные средства в основном являются нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП), воздействующими на циклооксигеназу - первый фермент каскада АА. Известно, что ингибиторы СОХ-1 (изоформы СОХ) обладают рядом побочных действий, приводя к дисфункции системы гемостаза при длительном применении, поэтому на данном этапе исследований наиболее перспективными прототипами антиагрегационных средств являются антагонисты рецепторов Тц, включая рецептор тромбоксана А2 (ТР рецептор), или ингибиторы двойного действия, например, одновременно воздействующие на тромбоксансинтетазу (ТхБ) и ТР рецептор, на ТР рецептор и 5-липоксигеназу или на ТР рецептор и рецептор лейкотриена 04.

Процесс взаимодействия Тц с потенциальными антиагрегационными средствами и их прототипами различной химической природы требует особого изучения для выявления механизма действия исследуемого класса веществ на сигнальные пути клетки при формировании биологического ответа и установления фармакофорных фрагментов молекул, позволяющих создать новые, более эффективные лекарственные препараты. Разработка отечественных инновационных, конкурентоспособных лекарственных препаратов представляет несомненный интерес и важна для клинической медицины и развития отечественной фармацевтической промышленности.

При определении механизма действия биологически активных соединений часто используется стандартный прием - введение в молекулу лиганда различных меток или зондов с последующим анализом процесса связывания с генерированием определенного физического сигнала, пропорционального

количеству связанного меченого лиганда. Особое значение для структурно-функциональных исследований биологических мишеней и других субстратов в последние годы приобрели новые типы меток, превосходящие по своим характеристикам уже ранее известные. В связи с этим в данной работе были созданы и разработаны методы синтеза нового типа фотохромных меток на основе спиропиранов, обладающих бинарным набором 2-х различных типов аналитических сигналов (поглощение в области 560-600 нм и индукция флуоресценции у фотоиндуцированной мероцианиновой формы). Эти исследования весьма актуальны, так как позволят определить конкретные мишени для дизайна новых лекарственных препаратов, необходимых для лечения и профилактики ряда тяжелых заболеваний.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является:

- целенаправленный дизайн молекул и разработка методов синтеза новых ингибиторов агрегации в ряду 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов и их 4,5-дигидропроизводных,

- исследование кинетических закономерностей агрегации Тц человека под действием разрабатываемых потенциальных ингибиторов агрегации при использовании ряда нативных индукторов агрегации, и

- изучение механизма действия этого класса ингибиторов.

Реализация этой цели включала в себя решение комплекса следующих задач:

1. Целенаправленный дизайн молекул прототипов новых антиагрегационных средств на основании результатов анализа собранных литературных данных.

2. Разработка методов синтеза и создание комбинаторных библиотек новых ингибиторов агрегации Тц на основе 3,5-замещенных изоксазолов, их 4,5-дигидропроизводных и биоизостеров класса замещенных 1,2,4-оксадиазолов. Исследование региоселективности процесса получения замещенных изоксазолов.

3. Разработка методов синтеза ингибиторов агрегации, содержащих метки различной природы (радиоактивную, остаток ретиноида и фотохромную). Изучение спектрально-кинетических характеристик, фотохромного поведения и флуоресцентных свойств серии синтезированных ингибиторов агрегации Тц человека, содержащих фотохромные метки спиропиранового ряда.

4. Исследование кинетических особенностей процесса агрегации Тц человека in vitro с использованием ингибиторов агрегации класса 3,5-замещенных изоксазолов под действием 3 природных индукторов агрегации (арахидоновой кислоты, аденозиндифосфата, адреналина).

5. Определение фармакофорного фрагмента соединений класса 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов.

6. Исследование механизма действия антиагрегационных веществ на Тц человека in vitro с использованием меченых ингибиторов агрегации. Научная новизна. Все результаты, полученные в ходе выполнения работы, являются новыми.

1. Открыт новый класс ингибиторов агрегации тромбоцитов на основе производных 3,5-замещенных изоксазолов, проявляющих

антиагрегационную активность в диапазоне концентраций lxlO"6 M - lxlO"3 M.

2. Разработаны и успешно апробированы методы синтеза ряда комбинаторных библиотек новых потенциальных антиагрегационных средств на основе реакции [3+2]-циклоприсоединения с доказательством строения всех синтезированных веществ современными методами физико-химического анализа. Проведено исследование региоселективности и особенностей реакции [3+2]-циклоприсоединения изомерных пиридилнитрилоксидов с непредельными соединениями различной природы.

3. Кроме классического метода генерирования пиридилнитрилоксидов по Хьюзгену (Huisgen) был успешно апробирован ряд альтернативных вариантов этого процесса: реакция дегидрирования оксимов в двухфазной системе NaOCl водн./ CH2CI2 в присутствии катализатора межфазного переноса; реакция хлорирования оксимов N-хлорсукцинимидом с последующим дегидрохлорированием продукта под действием триэтиламина.

4. Разработаны методы синтеза и получены ингибиторы агрегации, содержащие метки различной природы (радиоактивную, остаток ретиноида и фотохромную). Проведено изучение спектрально-кинетических характеристик, фотохромного поведения и флуоресцентных свойств серии синтезированных ингибиторов агрегации Тц человека, содержащих фотохромные метки спиропиранового ряда.

5. Исследованы кинетические особенности процесса агрегации Тц человека in vitro с использованием новых ингибиторов агрегации класса замещенных изоксазолов и их аналогов под действием 3 природных индукторов агрегации (адреналина, аденозиндифосфата, арахидоновой кислоты) в образцах плазмы крови человека, обогащенной Тц, и в суспензиях отмытых тромбоцитов. Установлено, что соединения этого класса полностью подавляют агрегацию Тц, вызванную арахидоновой кислотой (АА), и вторую волну агрегации, инициированной адреналином (EPI) или аденозиндифосфатом (ADP), но не влияют на первую волну агрегации, инициированной EPI или ADP. Показано, что S-образные кривые агрегации, инициированной АА, имеют пороговую зависимость. Определены 1С50 и константы ингибирования для протестированных соединений и проведено сравнение антиагрегационной активности антиагрегационных средств класса 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов. Определены структура фармакофорного фрагмента и пространственные ограничения для дизайна новых веществ.

6. Установлено, что новый класс ингибиторов агрегации тромбоцитов не относится к ингибиторам ферментов каскада арахидоновой кислоты -циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы, а также - тромбина, но относится к антагонистам рецептора ТхА2.

Практическая значимость.

Впервые было показано, что 5-замещенные 3-пиридилизоксазолы проявляют высокую антиагрегационную активность in vitro, являясь при этом малотоксичными веществами. Для всех протестированных веществ показано

наличие явления суперкооперативности, определены 1С50 и константы ингибирования, определен механизм действия - антагонисты рецептора ТхА2 (Vrzhesch P., Démina О. et al., 1994; О.В. Демина и др., 1995; О.В. Демина и др., 2002; О.В. Демина и др., 2011).

Разработанная в ходе работы унифицированная стратегия позволяет проводить синтез целевых соединений по одной и той же схеме с использованием реакции [3+2]-циклоприсоединения с высокой региоселективностью и может быть использована для масштабирования при создании технологии их производства. Отработаны схемы получения 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов с использованием как классического варианта генерирования пиридиннитрилоксидов методом Хьюзгена (Huisgen), так и ряда других дополнительных вариантов. Успешно апробирован альтернативный двухстадийный вариант получения целевых соединений дегидрированием 4,5-дигидропроизводных в производные изоксазола с высокими выходами с использованием терминальных алкенов вместо малодоступных алкинов.

Разработан и апробирован новый тип фотохромных меток для маркирования разнообразных по природе биообъектов и субстратов.

Модифицирована методика получения образцов суспензий отмытых Тц из крови человека методом двойного осаждения для проведения экспериментов на агрегометре «Биола» (Россия).

В ходе исследований получен ряд авторских свидетельств СССР (4) и патентов РФ (4).

Согласно результатам испытаний in vitro, разработанные в ходе выполнения работы серии новых соединений пригодны для дальнейших исследований по созданию новых прототипов антиагрегационных средств на стадиях «кандидат в лекарственное средство» (ADME-Tox) и последующих доклинических испытаний.

Полученные результаты являются основой для формирования стратегии поиска новых потенциальных антиагрегационных средств среди других классов соединений и выявления механизма их действия на молекулярном уровне.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Унифицированная стратегия, разработанная в ходе работы, позволяет проводить синтез 3,5-замещенных изоксазолов и их 4,5-дигидропроизводных по одной и той же схеме с использованием реакции [3+2]-циклоприсоединения с высокой региоселективностью. Исследование альтернативных подходов синтеза 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов и их 4,5-дигидропроизводных.

- 5-Замещенные 3-пиридилизоксазолы и их 4,5-дигидропроизводные являются потенциальными антиагрегационными средствами in vitro, полностью подавляя агрегацию тромбоцитов человека, вызванную АА, и вторую волну агрегации, вызванной ADP или EPI, не подавляя первую волну агрегации, вызванной ADP или EPI, в диапазоне концентраций 1x10' M ^ lxlO"3 M.

Определение структуры фармакофорного фрагмента путем сравнения антиагрегационной активности 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов с различными заместителями в С5-положении изоксазольного кольца и их биоизостеров - 5-замещенных 3-пиридил-1,2,4-оксадиазолов.

- Фармакофорный фрагмент молекул потенциальных антиагрегационных средств включает пиридиновое и изоксазольное кольца целиком. Определение пространственных ограничений для заместителей в С5-положении изоксазольного или 4,5-дигидроизоксазольного кольца на основании данных по антиагрегационной активности.

- Механизм действия данного класса соединений в цепи передачи сигнала в тромбоците — антагонисты рецептора тромбоксана А2.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных и всероссийских конференциях в виде 97 докладов, в том числе: 10-ой конференции "Синтез и исследование биологически активных соединений" (Рига, 1989); 13th International Symposium on Medicinal Chemistiy (Paris, France 1994); 11th International Symposium on Carotenoids (Leiden, The Netherlands, 1996); конференции посвященной 100-летию проф. Н.А. Преображенского (Москва, 1996); International Conference "Biocatalysis-98, Fundamentals and Applications" (Pushchino, 1998); 6-ой, 10-ой, 12-ой международных научно-технических конференциях "Наукоемкие химические технологии", (Москва 1999, Волгоград, 2004, Волгоград, 2008); International conference "Biocatalysis -2000: Fundamentals and Applications" (Moscow, 2000); International conference "Biochemical Physics on the Frontiers of Centuries" (Moscow, 2000); 6-ой международной конференции "Результаты фундаментальных исследований для инвестиций. Молекулярная медицина" (Пущино, 2001); 4th International Symposium on Photochromism "Photoswitchable Molecular System and Devices" (Arcachon, France, 2004); 3rd, 4th International Symposia on Supramolecular Chemistry "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures" (Kazan, 2004, 2006); 22nd International Conference on Photochemistry (Queensland, Australia, 2005); 21st, 22™ IUPAC Symposia on Photochemistry (Kyoto, Japan, 2006, Gothenburg, Sweden, 2008); International Symposium on Molecular Photonics devoted to the memory of academician A.N. Terenin (St. Petersburg, 2006); международных конференциях "Advanced Science in Organic Chemistry" (Судак, Крым, 2006, Мисхор, Крым, 2010); 18th Mendeleev congress on general and applied chemistry (Moscow, 2007); International Conference "Molecular and nanoscale system for energy conversion" (Moscow, 2007); международной конференции "Нанофотоника" (Черноголовка, 2007); International Symposium on Photochromism (Vancouver, British Columbia, Canada, 2007); 23rd International Conference on Photochemistry (Cologne, Germany, 2007); международной конференции «Нанофотоника» (Ужгород, Украина, 2008); 3-ей Молодежной конференции ИОХ РАН (Москва, 2009); конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, АР Крым, Украина, 2009); международной конференции «Органическая нанофотоника 2009» (С-Петербург, 2009); 16th

European Symposium on Organic Chemistry (Prague, Czech Republic, 2009); международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009); 9, 10, 12 Ежегодных международных молодежных конференциях "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва, 2009, 2010, 2012); 4th International Conference on Optical Optoelectronic and Photonic Materials and Application (Hungary, Budapest, 2010); 6th International Symposium on Organic Photochromism (Japan, Yokohama, 2010); 6th, 7th Moscow International Congresses "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development" (Москва, 2011, 2013); 23-ей зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011); International Congress on Organic Chemistry, dedicated to the 150th anniversary of the Butlerov's theory of chemical structure of organic compounds (Kazan, 2011); 17th European Symposium on Organic Chemistry (ESOC-17) (Crete, Greece, 2011); 23rd International Congress on Heterocyclic Chemistry (Glasgow, UK, 2011); всероссийской конференции "Фотоника органических и гибридных наноструктур" (Черноголовка, 2011); Russian-French Joint Symposium on Organic Photochromes" Phenics in Russia" (Chernogolovka, 2011); международном симпозиуме «Нанофотоника-2011» (Кацивели, Крым, Украина, 2011); 3-ем Международном Симпозиуме имени академика А.Н. Теренина "Молекулярная Фотоника" (Репино, Санкт-Петербург, 2012); международной конференции «Биология — наука XXI века» (Москва 2012); Конгрессе гематологов России (Москва 2012); 7th Phenics - Internatonal Network Symposium (Nantes, Loire Atlantique, France, 2012); 15th International Conference on Heterocycles in Bioorganic Chemistry (Bio-Heterocycles-2013) (Riga, Latvia, 2013); 2-ой всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики» (Черноголовка, 2013); 1-ой Российской конференции по медицинской химии (Москва, 2013).

Публикации. Основные результаты исследований, полученные в ходе выполнения диссертации, опубликованы в 5 обзорах, 16 оригинальных статьях в рецензируемых научных журналах (8 публикаций в иностранных и 13 в журналах из списка ВАК), в 7 статьях в сборниках материалов конференций и в более 90 тезисов международных и российских научных конференций и симпозиумов. Получено 4 авторских свидетельства СССР и 4 патента РФ на изобретения.

Грантовая поддержка работы. Работа проводилась при частичной финансовой поддержке Международного научного фонда (грант MRYOOO), фондов ИНТАС (грант ИНТАС-01-0267 (И)), РФФИ (гранты № 98-04-49122 (Р), № 01-03-32078 (Р), № 04-03-32746 (И), № 09-03-00565 (И), № 09-0401003 (Р)), госконтракта № 02.512.11.2250 (И) ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», госконтракта № 16.740.11.0177 (И) ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2007-2013 годы.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах работы: от выбора направления и объектов исследования, постановки задачи, планирования, разработки и обоснования путей их решения, реализации, проверки предложенных в работе экспериментальных подходов и непосредственного участия в проведении ключевых экспериментов до обсуждения и оформления полученных результатов. Весь экспериментальный материал получен при непосредственном участии автора и под его научным руководством.

Работа была выполнена в лаборатории кинетики и механизмов ферментативных и каталитических реакций ФГБУН Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, на кафедре Биотехнологии и бионанотехнологии ФГБОУ ВПО МИТХТ им. М.В. Ломоносова, при участии кафедры химической энзимологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Исследование антиагрегационной активности синтезированных соединенй выполнено лично автором в лаборатории физической биохимии крови ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России. Отдельные этапы работы проводились в рамках международного сотрудничества по программе "The IRG "PHENICS" - PHoto-switchablE orgaNIC molecular systems & devices" (2008-2014 гг.). Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 494 страницах, содержит 68 рисунков и 41 таблицу, 41 схему. Работа построена по традиционной схеме и состоит из следующих разделов: введения, 4 глав, описания материалов и методов исследования, выводов, списка литературы (641 источник) и списка сокращений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Современные тенденции в дизайне новых антиагрегацнонных средств.

В данной главе представлен критический анализ литературных данных о структурно-функциональной модели Тц и известных сигнальных путях Тц, приводящих к частичному или полному физиологическому ответу клетки (О.В. Демина и др., 2002). Рассмотрен процесс агрегации Тц как пример физиологического ответа и удобная модель для исследования антиагрегационной активности синтетических и природных соединений. Отражена роль каскада АА с характеристиками рецепторов простаноидов и тромбоксана А2, являющихся одним из важных звеньев в цепи передачи сигнала как в Тц, так и в эндотелиальных клетках. Выявлены возможные мишени для регуляции - ферменты и рецепторы, обсуждены проблемы направленного регулирования передачи сигнала в Тц. Описаны возможные пути регуляции каскада АА синтетическими физиологически активными веществами. Показано, что направленное регулирование передачи сигнала в клетке и прогнозирование типа получаемого физиологического ответа зависят от точного знания закономерностей функционирования мембранных

рецепторов и сочетания различных параметров для получения желаемого физиологического ответа. Описан выбор скэффолда на основе литературных данных о структурах ингибиторов тромбоксансинтетазы, ингибиторов СОХ, агонистов и антагонистов рецептора ТхА2.

Глава 2. Методы синтеза 3,5-замещенных пиридилизоксазолов и их 4,5-дигидропроизводных.

В настоящее время можно выделить несколько направлений, по которым ведется поиск и разработка новых антиагрегационных средств для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, тромбозов, гипертонии, астматических явлений:

1) поиск селективных активаторов и ингибиторов ферментов каскада АА (селективных ингибиторов циклооксигеназы-2 (СОХ-2), фосфолипазы А2 (РЬА2), тромбоксансинтетазы (ТхБ), липоксигеназ и антагонистов ТР— рецептора);

2) поиск препаратов двойного действия: ингибиторов циклооксигеназы и липоксигеназы, ингибиторов тромбоксансинтетазы и антагонистов ТР-рецептора, антагонистов ТР-рецептора и ингибиторов синтеза лейкотриенов, антагонистов ТР-рецептора и рецептора лейкотриена Э4;

3) поиск веществ, тормозящих катаболизм эйкозаноидов (салазодиметоксин, салазопиридазин и т.д.) (см. рис. 1).

В настоящее время также большое внимание уделяется разработке новых ингибиторов тромбина и блокаторов кальциевых каналов, которые также предотвращают агрегацию Тц.

Рис. 1. Активные сайты воздействия и мишени для основных типов лекарственных средств, влияющих на метаболизм ТхАг / ТР-рецептора.

Эти направления поиска новых лекарственных препаратов включают ряд химических задач:

а) получение более активных аналогов известных препаратов с менее выраженными побочными эффектами;

б) разработка и синтез соединений, состоящих из активных фрагментов молекул (фармакофоров) двух и более известных препаратов;

в) разработка пролекарств, т. е. средств, которые превращаются в активную форму только после введения в организм;

г) направленный скрининг новых веществ в определенных классах химических соединений (ряды имидазола, пиридина, индола).

Так как ТР-рецептор принимает участие в ряде важнейших патологий и заболеваний человека (тромбозы, инсульт, гипертония, иммунные/воспалительные заболевания, болезни почек и канцерогенез), то при создании эффективных антитромбоцитарных средств особое внимание уделяется веществам, специфически влияющим на пути синтеза и утилизации ТхА2. При селективном блокировании Тх8 в Тц происходит подавление биосинтеза ТхА2 и накопление РОН2, что может не приводить к предотвращению агрегации Тц, поскольку РОН2 также является агонистом ТР-рецептора. Наибольший интерес представляют разработки специфических антагонистов ТР-рецепторов и препаратов двойного действия, которые одновременно являлись бы и ингибиторами ТхБ, и антагонистами ТР-рецептора. Несколько антагонистов ТР-рецептора успешно применяются в медицинской практике.

Следует подчеркнуть, что наиболее перспективными будут только новые соединения с высокой эффективностью, минимальными побочными эффектами и низкой токсичностью для организма, превосходящие известные антиагрегационные препараты.

2.1. Синтез производных 3,5-замепденных пиридилизоксазолов.

Проведенный сравнительный анализ строения массива молекул ряда известных антиагрегационных средств - НПВП, ингибиторов ТхБ и антагонистов ТР рецептора, с учетом наиболее предпочтительных гетероциклических фрагментов для каждого вида биологической активности, позволил предложить новый скэффолд, объединивший в целевой молекуле

пакета

моделирования 8.03.

Рис. 2. Топография и 30-модель фрагмента молекулы ТР-рецептора человека,

симулированная на основе файла 1ВЦЧ с помощью

молекулярного НурегСИет

человека,

два важных фармакофорных звена - пиридиновый и изоксазольный циклы, связанные между собой С-С-связью.

Основные варианты модификации указанного скэффолда с получением сфокусированных комбинаторных библиотек представлены ниже:

разнообразие заместителей при СЗ-атоме включало: изомерный пиридиновый (2-, 3-, 4-пиридил) фрагмент или фенильный фрагмент

Рис. 3. Основные направления дизайна целевого скэффолда новых антнагрегационных средств.

- изменения степени компланарности взаимного расположения двух циклических структур - пиридинового и изоксазольного фрагментов путем замены центрального изоксазольного фрагмента на его 4,5-дигидропроизводное (типы ОУБ-2, ОУЭ-З, ОУБ-6) или на 1,2,4-оксадиазольный цикл (тип ОУО-4);

- широкой вариабельности заместителей при С5-атоме изоксазольного кольца (библиотеки ОУО-1 - ОУЭ-б).

В общем случае процесс формирования скелета молекулы целевой структуры изоксазола можно представить рядом нескольких вариантов, из которых наиболее часто используются следующие:

Кз

А %_/ Б

[С-С-С] + [N-0]-► /7"Л -[С-М-О] + [С-С]

1) вариант А: взаимодействие двух синтонов, имеющих фрагменты [С-С-С] и [N-0];

2) вариант Б: сочетание двух фрагментов [С-М-О] и [С-С].

Вариант А - старейшая группа хорошо известных методов синтеза производных изоксазола, в основе которых - реакции циклоконденсации 1,3-дикарбонильных соединений с гидроксиламином или гидрохлоридом гидроксиламина, или его производными (рис. 4). Недостатком является низкая региоселективность в случае несимметричных 1,3-дикарбонильных соединений. Данный классический подход наиболее широко применялся до

открытия в середине 40-х годов реакции [3+2]-циклоприсоединения нитрилоксидов к алкинам или алкенам (вариант Б), которая на сегодняшний день практически его заменила.

Рис. 4. Вариант А. Синтез производных изоксазола по реакции 1,3-дикарбонильных соединений или их эквивалентов с гидроксиламином или его гидрохлорндом.

Для реализации основной цели исследования - получения новых ингибиторов агрегации в ряду 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов и их 4,5-дигидропроизводных, на начальном этапе потребовалось разработать наиболее эффективный метод синтеза 6 сфокусированных комбинаторных библиотек 3,5-замещенных пиридилизоксазолов и их аналогов: серия OVD-1

- соединения без заместителя (1а-с), а также содержащие С|- ^ Cg-алкильные радикалы (2Ь - 8а-с) при С5-атоме изоксазола, с последующим расширением спектра вариабельности заместителей при С5-атоме изоксазольного фрагмента (соед. 9а-с 16Ь).

Были предложены пути получения серии OVD-5 (соед. 17-19) с «обменом» заместителей в СЗ- и С5 положениях изоксазольного кольца: введение пиридинового фрагмента в С5-положение, а фенильного фрагмента

- в СЗ-положение. Были предложены и апробированы пути синтеза соединений серий OVD-2,3,6 - 4,5-дигидропроизводных 3,5-замещенных пиридилизоксазолов (соед. 21а-с - 45Ь).

Синтез 3,5-замещенных пиридилизоксазолов (серия OVD-1) и их 4,5-дигидропроизводных (серии OVD-2,3,6) проводили по универсальной схеме, изображенной на рис. 5. С этой целью был более детально изучен процесс 1,3-циклоприсоединения изомерных 2-, 3- и 4-пиридилнитрилоксидов (46а-с) с непредельными компонентами различной природы. На этом этапе работы были разработаны или модифицированы методы получения и проведена наработка в препаративных количествах ряда библиотек 3,5-замещенных пиридилизоксазолов (1а-с - 45Ь) (см. схему на рис. 5).

Основное внимание было уделено: сравнению и определению эффективности различных методов генерации нитрилоксидов (46а-с); изучению региоселективности реакции 1,3-циклоприсоединения изомерных

пиридилнитрилоксидов с алкинами и алкенами; исследованию влияния природы заместителя при СЗ- и С5-атомах изоксазольного фрагмента на физико-химические и спектральные свойства 3,5-замещенных пиридилизоксазолов и их аналогов.

R-C=N-0

46 а-с, 47

Serie OVD-1 Ri

[О]

Serie OVD-5

Serie OVD-2,6 О" R1

Serie OVD-3

Рис. 5. Схема получения целевых производных пзоксазола при помощи реакции 1,3-

прн(

днполярного циклоприсоедннення.

Serie OVD-1,5

№ соед. R R1 № соед. R R

1 а-с 2-,3-,4-Ру -Н И b З-Ру -CH2OCO(CF2)2CF3

2b З-Ру -СНз* 12 b З-Ру -С(ОН)(СН3)2

3 а-с 2-,3-,4-Ру -(СН2)2СН3 13 а-с 2-,3-,4-Ру -СООН***

4 а-с 2-,3-,4-Ру -(СН2)зСНз 14 а-с 2-,3-,4-Ру -СООС2Н5

5 а-Ь 2-,3-Ру -(СН2)4СН3 15 а-с 2-,3-,4-Ру -conh2**

6 а-с 2-,3-,4-Ру -(СН2)5СН3 16 b З-Ру -conhch2c6h5**

7 а-с 2-,3-,4-Ру -(СН2)6СНз 17 -С6Н5 2-Ру*

8 а-с 2-,3-,4-Ру -(СН2)7СН3 18 -СбНз З-Ру*

9 а-с 2-,3-,4-Ру -СбНз 19 -СбН5 4-Ру*

10 а-с 2-,3-,4-Ру -СН2ОН 20 -СбН5 -СбНз

"YV Serie OVD-2,6

№ соед. R R соед. R R

21 а-С 2-,3-,4-Ру -Н 32 b З-Ру -(CF2)7CF3

22 а-с 2-,3-,4-Ру -СНз 33 а-с 2-,3-,4-Ру -СН2С1

23 а 2-Ру -(СН2)3СН3 34 b З-Ру -ch2nh2

24 Ь З-Ру -(СН2)4СН3 35 а-с 2-,3-,4-Ру -cn

25 b З-Ру -(СН2)5СН3 36 а-с 2-,3-,4-Ру -СООСНз

№ соед. r r1 № соед. r r1

26 а-с 2-,3-,4-Py -(CH2)7CH3 37 a-c 2-,3-,4-Py -COOC2H5

27 а-с 2-,3-,4-Py -(CH2)15CH3 38 a-c 2-,3-,4-Py -conh2

28 а-с 2-,3-,4-Py -C6H5 39 a-c 2-,3-,4-Py -cooh

29 а-с 2-,3-,4-Py -CH2OH 40 a,b 2-,3-Py -(CH2)8COOH

30 b 3-Py -CH2CH2OH 41 a,b 2-,3-Py -OCOCHj

31 b 3-Py -(CF2)3CF3 42 b 3-Py -coch3

43 a-c -c6h5 2-,3-,4-Py

Serie OVD-3

№ соед. r n № соед. r n

44 а-с 2-,3-,4-Py 1 45 b 3-Py 2

Указанные соединения были получены: * - дегидрированием соответствующих 4,5-дигидропроизводных; ** аминированием или *** омылением соответствующих сложных эфиров (14а-с).

Исходными соединениями служили коммерчески доступные 2-; 3- и 4-пиридинкарбальдегиды (48а-с), из которых были получены соответствующие Е-оксимы (49а-с) с выходами 80-93%. Гидрохлориды хлорангидридов пиридингидроксимовых кислот (50а-с) были получены при хлорировании соответствующих оксимов газообразным хлором в дихлорметане при -5 - 0°С с выходами 93-98%. Для получения 3,5-замещенных изоксазолов серий OVD-5,6 с «обратной заменой» (20,43а-с), содержащих пиридиновый фрагмент в С5-положении, а фенильный - в СЗ-положении изоксазольного кольца, был использован бензонитрилоксид (47), генерированный in situ. Генерирование пиридилнитрилоксидов (46а-с) и бензонитрилоксида (47) in situ проводили, используя один из перечисленных ниже вариантов: а) классическую реакцию дегидрогалогенирования гидроксимоилхлоридов (метод Хыозгена (Huisgen)); б) реакцию дегидрирования оксимов (49а-с) в условиях межфазного катализа в двухфазной системе NaOCl водн./ СН2С12 в присутствии катализаторов межфазного переноса (Aliquat 336); в) реакцию хлорирования оксимов при помощи NCS с последующим дегидрохлорированием под действием триэтиламина, г) реакцию дегидрирования оксимов (49а-с) с использованием системы хлорамин Т/ CuS04 - аскорбат Na (катализ Cu(I)). Так как большинство нитрилоксидов отличается низкой стабильностью и склонностью к димеризации с образованием фуроксанов, то для синтеза подавляющего большинства целевых соединений (1а-с - 45Ь) был использован метод Хьюзгена in situ -реакция дегидрогалогенирования гидроксимоилхлоридов под действием триэтиламина. Последний в виде разбавленного раствора очень медленно добавляли к охлажденной до -10° - - 5°С смеси гидрохлорида

гидроксимоилхлорида и алкена или алкииа для поддержания низкой стационарной концентрации образующегося нитрилоксида. Для выделения продукта после завершения реакции использовали следующие процедуры: удаление растворителя и экстракция продукта из остатка при помощи сухого диэтилового эфира, упаривание полученного экстракта и выделение продукта с помощью колоночной хроматографии или фракционной кристаллизации.

Для исключения стадии хлорирования оксимов газообразным хлором была успешно проведена апробация одностадийных способов генерирования пиридилнитрилоксидов (46а-с): б) реакция дегидрования оксимов (49а-с) в двухфазной системе NaOCl водн./ СН2С12 в условиях межфазного катализа с катализатором межфазного переноса Aliquat 336; в) процедура хлорирования оксимов (49а-с) при помощи NCS с последующим дегидрохлорированием под действием триэтиламина. Анализ результатов показал перспективность использования всех 3-х вариантов для синтеза библиотек целевых соединений. Следует отметить, что предложенный в работах Фокина вариант дегидрирования оксимов с использованием системы хлорамин Т/ (CuS04 -аскорбат Na) оказался менее удачным, по-видимому, из-за плохой растворимости реагентов (49а-с) в среде реакции.

Выходы целевых соединений (1а-с - 45Ь) варьировались в достаточно широких пределах: от высоких (порядка 80-85%) до средних, в зависимости от ряда факторов, определяющими из которых являлись реакционная способность непредельного соединения (терминальный алкен > терминальный алкин), их стабильность в условиях реакции (терминальный алкен > терминальный алкин), склонность генерированного in situ пиридилнитрилоксида к димеризации (максимальная - у 4-региоизомера), а также легкость выделения целевых соединений (в некоторых случаях была использована препаративная ВЭЖХ). В случае циклоалкенов выход соединения (44Ь) почти в 10 раз превышал выход соединения (45Ь).

Как показали проведенные эксперименты, в отработанных условиях реакция [3+2]-циклоприсоединения протекала региоселективно, и, согласно данным ТСХ и анализа структуры продуктов с помощью масс-, 'Н- и 13С-ЯМР спектров, образования 3,4-замещенного региоизомера изоксазолов не было зафиксировано ни в одном случае.

В случае меньшей доступности терминальных алкинов, по сравнению с алкенами, был успешно апробирован альтернативный двухстадийный вариант получения целевых соединений серий OVD-1,5. Вначале были синтезированы соответствующие 4,5-дигидропроизводные серий OVD-2,6 из терминальных алкенов, из которых затем путем дегидрирования получали производные изоксазола серий OVD-1,5. После тестирования ряда известных систем реагентов для этого процесса было обнаружено, что выход целевых соединений сильно зависит от природы заместителя при С5-атоме. Наиболее высокие выхода изоксазолов были получены при нагревании и использовании системы ЫВЗ/с^а'-азобис-изобутиронитрил/ССЦ для алкильных заместителей и системы МпОг/СНгСЬ - для 5-пиридилзамещенных 4,5-дигидропроизводных.

Структура всех синтезированных соединений и полупродуктов была охарактеризована с помощью данных 'Н-ЯМР- и пС-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

2.2. Синтез 5-замещенных 3-пиридил-1,2,4-оксадиазолов.

Дизайн целевых структур новой библиотеки ингибиторов агрегации (серия ОУО-4), в которых центральный изоксазольный фрагмент был заменен на 1,2,4-оксадиазольный при сохранении комбинаторного разнообразия заместителей по С5-положению кольца, проводили для выяснения влияния замены атома углерода на атом азота в С4-положении кольца на антиагрегационную активность полученных соединений серии ОУБ-4.

гТ^Г * А

и ■¿П'мн, к;'С1 о°с N

(65а-с)

(51Ь-63Ь)

Рис. б. Схема получения целевых производных 1,2,4-оксадиазолов - библиотеки ингибиторов агрегации (ОУО-4).

Serie OVD-4

,о

h2n'r,

TBAF JL

N^O

0°C ^-N

№ соед. r' R1 № соед. r1 r'

51 b з-ру -(ch2)5ch3 58 b 3-Py -conhch2ch2ch3*

52 b 3-Py -(ch2)6ch3 59 b 3-Py -conhch2c6h5*

53 b 3-Py -(ch2)7ch3 60 b 3-Py -con(ch3)2*

54 а-с 2-,3-,4-Py -сбн5 61 b 3-Py -con(ch2ch3)2*

55 а-с 2-,3-,4-Py -COOC2H5 62 b 3-Py * Yv

56 b 3-Py -con112* 63 а 2-Py * Yo 0

57 b 3-Py -conhnh2 * 63 b 3-Py 4 O"

* соединения были получены амшгарованием сложных эфиров (55 а-с)

Для синтеза производных 5-замещенных 3-пиридил-1,2,4-оксадиазолов (51Ь - 63Ь) (серия ОУО-4) со следующими заместителями по С5-атому: алкильные и арильные производные; сложные эфиры, гидразиды и Ы-замещенные амиды, - был выбран следующий вариант: циклизация О-

ациламидоксимов и последующая модификация сложноэфирной функции по С5-положению кольца.

Исходными соединениями служили коммерчески доступные изомерные пиридинкарбонитрилы (64а-с), из которых при взаимодействии с хлоргидратом гидроксиламина в присутствии ЫаОН получали предшественники 1,2,4-оксадиазолов - региоизомеры соответствующих пиридинкарбоксамидоксимов (65а-с). Циклизация О-ациламидоксимов, полученных ацилированием соответствующих пиридинкарбоксамидоксимов (65а-с) под действием ТВАБ при нагревании реакционной массы в толуоле до кипения, была использована для образования 1,2,4-оксадиазольного кольца с получением соединений (51Ь — 55а-с) (рис. 6). Модификация сложноэфирной функции в соединениях (55а,Ь) под действием аминов или гидразинов различного строения приводила к Ы-замещенным амидам и гидразидам (56Ь - 63Ь). Структура всех синтезированных соединений и полупродуктов была охарактеризована с помощью данных 'Н-ЯМР- и 13С-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

2.3. Синтезы меченых ингибиторов агрегации Тц.

При исследованиях механизмов действия небольших биологически активных молекул-лигандов (как природного, так и синтетического происхождения) центральное место занимает изучение процесса взаимодействия низкомолекулярного лиганда со своей специфической мишенью (ферментом, рецепторами, включая ОРСЯ и ядерные рецепторы, определенными сайтами последовательностей нуклеиновых кислот). Для определения места связывания и степени его эффективности используется стандартный прием - введение в молекулу лиганда различных меток или маркеров с последующим анализом процесса связывания при генерировании определенного физического сигнала, пропорционального количеству связанного меченого лиганда.

Основные типы меток и маркеров, применяемых для проведения биомедицинских исследований, можно разделить на 2 большие группы: радиоактивные (3Н-, 14С- и 32Р-изотопы) и нерадиоактивные. В группе нерадиоактивных меток можно выделить следующие типы: стабильные (нерадиоактивные) изотопы (2Н-; 13С-; 15М-; 19Р- и др.); хромогенные, флуоресцентные, спиновые, фотохромные и др.

2.3.1. Методы введения тритиевой метки в молекулу ингибиторов агрегации Тц.

Для введения тритиевой метки в молекулу одного из наиболее активных ингибиторов агрегации Тц - 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) были использованы 2 варианта изотопного обмена изотопа протия на тритий -жидкофазный и твердофазный методы. В результате был получен неопределенно-меченый тритием препарат [3Н]-3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) с удельной радиоактивностью 0,24 Ки/моль.

2.3.2. Синтезы ингибиторов агрегации Тц, содержащих фрагмент ретиноевой кислоты.

Хромогеиные метки для определения и оценки активности разнообразных ферментных препаратов и прочих лекарственных средств различного спектра действия являются часто применяемыми аналитическими тестами в течение последних 40 лет. Основным аналитическим параметром является величина оптической плотности в спектрах поглощения в определенном спектральном диапазоне, соответствующая количеству хромогенного субстрата, которое пропорционально концентрации или активности меченого лиганда.

Рис. 7. Синтез производного нзоксазола (66) с остатком ретиноевой кислоты при помощи реакции [3+2|-цнклоприсоедш1е11ня.

Выбор ретиноидов в качестве хромогенной метки обусловлен был следующими обстоятельствами: для них характерно интенсивное поглощение света в диапазоне 350-380 нм, а также ретиноиды, как производные витамина А, сами по себе обладают ярковыраженной специфической биологической активностью (А-витаминное, противоопухолевое и дерматологическое действие). В качестве конъюгата ингибитора агрегации Тц из класса пиридилизоксазолов был выбран сложный эфир all-E-изомера ретиноевой кислоты (66) и 5-гидроксиметил-З-(З-пиридил)изоксазола (10Ь), с проведением исследования методов его получения (рис. 7). Были исследованы несколько вариантов получения меченого производного (66). Первоначально был исследован процесс прямой этерификации гидроксильной функции 5-гидроксиметил-3-(3-пиридил)изоксазола (10Ь) активированными производными ретиноевой кислоты (67). Были протестированы несколько вариантов образования сложноэфирной связи: метод смешанных ангидридов в присутствии катализатора, 4-(диметиламино)пиридина; использование генерированного in situ имидазолида ретиноевой кислоты и реакция Мицунобу с диизопропилазодикарбоксилатом. Проведенные эксперименты показали, что

гидроксильная группа изоксазола (10b) оказалась малоактивной в реакции этерификации и, несмотря на широкое варьирование реагентов для активации карбоксильной группы ретиноевой кислоты и условий реакции, во всех случаях выход целевого продукта был крайне низок (5-15%). По этой причине был исследован другой подход - реакция [3+2]-циклоприсоединения для пропаргилового эфира ретиноевой кислоты (70) и 3-пиридилнитрилоксида (46Ь) (рис. 7). Ключевой интермедиат - сложный эфир (70) был получен методом смешанных ангидридов в присутствии катализатора - 4-(диметиламино)пиридина с выходом 59%.

Реакцию [3+2]-циклоприсоединения пропаргилового эфира ретиноевой кислоты (70) с генерированным in situ 3-пиридилнитрилоксидом (46b) проводили в отработанных ранее условиях. В результате был получен конъюгат изоксазола с хромогенной меткой (66) с выходом 25%.

2.3.3. Синтезы ингибиторов агрегации Тц, содержащих фотохромные метки.

В ходе выполнения данной работы был разработан и апробирован новый тип фотохромных меток для маркирования разнообразных по структуре биообъектов и субстратов. Использование нового поколения фотохромных лигандов с терминальными реакционно-способными группами или «молекулярными адресами» привело к созданию эффективного пути исследования процесса взаимодействия меченого лиганда со своей макромишенью, который в будущем открывает перспективы к созданию фотоуправляемых гибридных наноразмерных биоансамблей. Впервые было предложено использовать фотохромные производные ряда спиропиранов и дитиенилэтенов в качестве фотохромно-меченых аналогов хромофорных групп светозависимой протонной транслоказы - бактериородопсина.

В настоящей работе для исследования процесса взаимодействия ингибиторов агрегации Тц со своими мишенями были разработаны оригинальные синтетические методы введения фрагмента фотохромной метки по СЗ- или С5-атомам изоксазольного скэффолда (71-73) (рис. 8,9). Дополнительное преимущество фотохромных меток на основе спиропиранов заключается в том, что они обладают бинарным набором 2-х разных типов аналитических сигналов (поглощение в области 560-600 нм и индукция флуоресценции у фотоиндуцированной мероцианиновой формы).

Для создания молекул фотохромных лигандов с заданными спектральными и фотохимическими параметрами необходимо введение дополнительного электроноакцепторного заместителя (EWG), например, нитро-группы, по Сб-положению пиранового фрагмента молекулы метки.

В качестве исходного соединения для синтеза фотохромно-меченых по СЗ- и С5-атомам производных изоксазола был выбран 6-нитроспиропиран (74), который избирательно форматировали при помощи запатентованного метода по С5'-положению индолинового фрагмента в условиях реакции Даффа, с выходом 86%. Следует отметить, что предложенный оригинальный подход одностадийного прямого введения якорной формильной функции в положение С5'-индолинового фрагмента молекулы фотохрома открывает

широкие перспективы для развития нового направления в химии производных ряда спиропирана, с выходом на целые серии новых, ранее неизвестных структур. Затем впервые был проведен синтез 3,5-замещенных изоксазолов с различно ориентированным фрагментом спиропиранового фотохрома в качестве фотохромной метки в СЗ- или С5-положении кольца

<71)И,=-С,Н5 (81) 1*,=-СН2ОН

(72) И, = -СН2ОН

Рпс. 8. Синтез производных изоксазолов (71,72) с фотохромной меткой по СЗ-атому при помощи реакции [3+2]-циклоприсоединения.

Рпс. 9. Синтез 4,5-днгндропронзводного нзоксазола (73) с фотохромной меткой по С5-атому при помощи реакции [3+2|-циклоприсоединеннп.

Ключевой б-нитро-5'-формилспиропиран (75) был трансформирован олефинированием по Виттигу в 5'-винил-6-нитропроизводное (82) с выходом 76% (рис. 9). На данном этапе были использованы 3 варианта генерирования нитрилоксидов: 1) из соответствующих оксимов (76/77) действием водного раствора гипохлорита натрия в условиях межфазного катализа (ЫаОС1 водн./СНгСЬ/А^иа! 336); 2) хлорирование смеси оксимов (76/77) под действием N05 с образованием гидроксимоилхлорида (78), из которого далее при дегидрогалогенировании триэтиламином образуется нитрилоксид (79); 3) при дегидрогалогенировании гидроксимоилхлорида (50Ь) триэтиламином. В подобранных нами условиях реакция 1,3-циклоприсоединения протекала региоселективно, с образованием исключительно 3,5-региоизомера, по

данным 'Н-ЯМР-спектроскопии. Далее были проведены исследования спектрально-кинетических характеристик и фотохромизма меченых соединений (71-73) в растворах толуола, ОМБО, этанола и смеси ЭМБО-вода, результаты которых представлены в табл. 1.

Спектрально-кинетические характеристики производных спнропирапов (71-73) в толуоле, этаноле, РМ50 и смеси РМ80-Н20-___Таблица 1.

№ соед. Растворитель ^шахА> ИМ 1 в лша* , НИ ДОвр'н" кв4<1Ьх10 с"1 1о.5, с

71 толуол пл 320, <300 пл 577, 617 0.50 60.00 12

ЭМБО пл 340, <300 576 0.14 3.42 203

этанол пл 324, 273 556 0.67 7.65 91

НгСШМБО 20:1 пл 340, <300 570 0.48 0.06 11200

72 толуол пл 320, <300 пл 575,617 0.45 62.90 11

ЭМБО пл 340, <300 572 0.11 3.61 192

этанол пл 345,277 555 0.78 9.51 73

НзСШМЭО 20:1 пл 340, <300 537 0.31 - *

73 толуол пл 320, <300 пл 572, 610 1.10 73.50 9

ЭМБО 344 564 0.10 0.54 1270

этанол пл 338, 265 545 0.12 2.46 282

НгСШМЗО 20:1 345 550 0.41 0.36 1910

* - не наблюдалось в течение 10 мин.

Полученные серии изоксазолов были исследованы на антиагрегационную активность на образцах Тц человека. Взаимодействие меченых ингибиторов, содержащих спиропирановую метку, изучалось при использовании суспензий отмытых Тц человека.

Глава 3. Антиагрегацнонная активность 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов. Кинетические закономерности процесса.

Исследования взаимодействия потенциальных антиагрегационных средств различной химической природы с Тц при использовании ряда природных индукторов агрегации, активирующих различные сигнальные пути клетки для получения физиологического ответа, необходимы для определения механизма их действия и для дизайна новых фармакофорных фрагментов при создании молекул прототипов новых лекарственных средств с меньшими побочными эффектами.

Влияние 5-замещенных 3-лиридилизоксазолов на процесс агрегации Тц, вызванный индукторами агрегации - АА, АБР и адреналина (ЕР1), исследовали с помощью турбидиметрического метода, основанного на непрерывном детектировании относительного изменения коэффициента светопропускания кюветы с плазмой крови человека, обогащенной тромбоцитами (РЯР), или с суспензией отмытых Тц человека после добавления индуктора агрегации на агрегометре «Биола» (Россия). При исследовании влияния тестируемых соединений на процесс агрегации Тц определялись следующие кинетические параметры — максимальная скорость агрегации (У„ка) и максимальная степень агрегации (А„,ах) (см. рис. 10А), с построением кривых зависимостей этих величин от концентрации ингибитора - [У„,ах; [I]] и [Л [I]] и определением значений /С50 для каждого тестируемого соединения. В качестве контрольного соединения нами был

выбран индометацин, конкурентный ингибитор СОХ-1. При использовании АА (500 мкМ в тестируемом образце) наблюдается только одна волна агрегации с наличием латентного периода (т|аг) - промежутка времени, прошедшего от момента введения АА до начала агрегации (от 15 с до 90 с) (рис. 10А). В ходе экспериментов было установлено, что зависимость значений Т|а( от концентрации ингибитора является линейной в диапазоне концентраций ингибитора от 1х10"6Мдо 1x10"3 М._

ÍS ц т>

Je ¡iь ' •■"'у___

! Шь................................

................................................................... 3

/ г

Рис. J0. Агрегатограммы, полученные на образцах PRP при действии индукторов агрегации: А - АА (500 мкМ); Б - ADP (5-15 мкМ); В- EPI (0.5-4 мкМ).

При агрегации Тц, вызванной ADP или EPI, наблюдаются 2 волны агрегации, при этом первая волна агрегации не зависит от каскада АА, тогда как вторая волна агрегации определяется каскадом АА. Концентрации ADP и EPI были подобраны в диапазоне 5-15 мкМ и 1-4 мкМ соответственно, для получения на агрегатограммах точки перегиба на кривой агрегации (см. рис. 10 Б и В). Для агрегации, вызванной ADP, tiat составлял не более 1 -3 с, а для агрегации, инициируемой EPI, для большинства образцов т1а1 не превышал 15-30 с.

Первоначально ряд соединений был протестирован на образцах PRP, при использовании АА в качестве индуктора агрегации. На рис. 11в качестве примера приведены зависимости [Vmax; [I]] и [А„шх; [I]] для одного из наиболее активных соединений этой серии - 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) и контрольного соединения — индометацина. Для обоих соединений характерно явление суперкооперативности - наличие пороговой зависимости, т.е. резкого уменьшения значений Атах и Vmax в узком диапазоне концентраций ингибитора.

Все исследованные соединения полностью ингибировали агрегацию Тц человека, инициированную АА, дозо-зависимым способом. При построении кривых IУшах, [I]] и [Amax; [I]] для всех соединений было отмечено, что эти кривые - S-образные, с четко выраженной пороговой зависимостью - резким уменьшением значений А„тх и Vmax в узком диапазоне концентраций ингибитора (разница концентраций составляла 0,5-2 мкМ). Кривые [Vmax; [I]] и [Апюх; [1]] почти всегда были идентичны по форме, и значения 1С50, полученные по данным этих кривых, совпадали. Все экспериментальные данные для двух и более соединений были получены на одном и том же образце плазмы, что позволило провести корректное сравнение биологической активности этих веществ.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

ФГБУН Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Автореферат разослан «17» марта 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ1 Актуальность темы исследования.

Рецепторно-ферментные системы клеток, включающие

высокоспецифичные белковые рецепторы (рецепторы, сопряженные с О-белками (ОРСЯ) и др.), расположенные на внешней клеточной мембране, и группу сопряженных с ними ферментных систем и ионных каналов, осуществляют анализ и переработку полученной извне информации, направленное регулирование и управление определенным типом клеточного ответа. Молекулярное распознавание лиганда (активатора или ингибитора) мишенью - вРСЯ является первой стадией практически всех процессов, протекающих в биологических системах. Геометрическая и химическая комплементарное™ малых молекул-лигандов с макромолекулярными биологическими структурами-мишенями - белками (рецепторами, ферментами) определяют пути передачи сигнала в клетках или пути метаболизма, вызывая, таким образом, физиологический ответ. Направленное регулирование передачи сигнала в клетке и прогнозирование типа получаемого физиологического ответа зависит от точного знания закономерностей функционирования мембранных рецепторов и сочетания различных параметров для получения желаемого физиологического ответа.

Автор выражает особую благодарность член-корр. РАН Варфоломееву С.Д. за постоянную помощь консультации в ходе настоящего исследования

Следует отметить, что для тестируемых веществ наиболее оптимальными были теоретические кривые с п, от 6,5 до 15. Эти аппроксимации позволяют относительно точно описать верхнюю и среднюю часть экспериментальной кривой, если nj > 10 и равно, по крайней мере, 15, но нижнюю часть кривой они описывают плохо, показывая плавное, а не резко обрывающееся затухание агрегации. При более высоких значениях коэффициента Хилла (15 < п, < 30) можно очень точно описать пороговую зависимость и нижнюю часть кривой, но верхняя часть теоретической кривой практически не совпадает с экспериментальными данными. Несмотря на это, на данный момент уравнение Хилла - единственный способ аппроксимации полученных экспериментальных данных. Подобные нормировки были сделаны для сравнения экспериментальных данных большого массива экспериментов для нивелирования разброса по 1С50 и показали, что для каждого соединения существует пороговая зависимость Атах и Vmax от концентрации ингибитора, при этом формы кривых похожи. Это позволяет предположить, что все эти соединения действуют по одному и тому же механизму.

При тестировании одного и того же соединения на 5-15 и более образцах PRP человека наблюдался разброс значений IC^o, который определялся индивидуальными особенностями образца PRP, поэтому в таблице 2 приведены усредненные значения 1С}(!, полученные экспериментально для серии 3,5-замещенных изоксазолов и их 4,5-дигидропроизводных, при использовании АА, ADP и EPI в качестве индукторов агрегации Тц человека.

В ходе экспериментов было установлено, что при наличии 2-, 3- или 4-пиридинового фрагмента в СЗ-положении изоксазольного и изоксазолинового кольца большей антиагрегационной активностью обладали соединения, содержащие фрагмент 3-пиридила, наименьшей антиагрегационной активностью - соединения, содержащие 2-пиридильный заместитель.

При сравнении антиагрегационной активности 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов с их 4,5-дигидропроизводными было установлено, что 4,5-дигидроаналоги менее активны (в 1,5-4 раза). На рис. 15 приведены кривые зависимости [Vmax\ [I]] и [А,„ш; [I]] для 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) (кривая 4) и серии 4,5-дигидроизоксазолов (28а-с), содержащих по С5-положению фенильный фрагмент, а по СЗ-положению -пиридиновый: 3-(2-пиридил)- (кривая 1), З-(З-пиридил)- (кривая 2) и 3-(4-пиридил)- (кривая 3). 3-(3-Пиридил)-5-фенилизоксазол (9Ь) проявлял наибольшую антиагрегационную активность, превосходя самое активное соединение серии - 3-(3-пиридил)-5-фенил-4,5-дигидроизоксазол (28Ь) в 2 раза. Для 4,5-дигидроизоксазолов, содержащих один и тот же заместитель по С5-положению и разные пиридиновые фрагменты в СЗ-положении, сохраняется та же закономерность, что и для изоксазолов: антиагрегационная активность убывает в ряду 3-пиридил > 4-пиридил > 2-пиридил.

Код соед. R '^__Ri ¡L/ Y y-«. "—o' 1С50, mkM Код соед. 'Y>- "—о' 1С50, мкМ

AA ADP EPI АА ADP EPI

Ib 75±40 - - 21Ь 105±55 - -

5b <120 25Ь 150±78 140±50 (2-я волна); (1-я волна не подавляется) 130±35 (1-я волна не подавляется)

6b 30±10; б±3(на отмытых Тц) 60±40 (2-я волна); (1-я волна пе подавляется) 60±40 (2-я волна) 22.5-30 (на отмытых Тц) 28а 245±120

9а 100±20 130±50 (2-я волна); >1000 (1-я волна) 28Ь 110±50

9b 60±30 8±4 (na отмытых Тц) 70±40 (2-я волна); >1000 (1-я волна) 70±40 28с 150±78

9с 90±30 110±30 (2-я волна); >1000 (1-я волна) 100±20 29а 200±100

10а 145±70 160±40 (2-я волна); >1000 (1-я волна) 160±50 29Ь 90±45

10b 100±30 130±20 (2-я волна); >1000 (1-я волна) 125±25 34Ь 250±50

Юс 120±60 140±30 (2-я волна); >1000 (1-я волна) 140±30 36Ь 845±200 >900 >850

12b 190±60 - - 36с 900±150 >900 >850

20 85±30 - - 38а 450±30 >500 450±30

51b 60±15 <100 (2-я волна); <100 (2-я волна); 38с 445±40 >500 450±40

54b 80±40 85±40 при > 300-частично подавляет 1-ю волну агрегации Тц 85±40 40Ь >1000 >850±150

55b >1000 > 1000 > 1000

1,11

20 40 ВО

Рис. 15. Кривые зависимостей максимальной степени агрегации и максимальной скорости агрегации от концентрации ингибитора (А и Б, соответственно) для 3-(3-ннридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) (кривая 4), 3-(2-пиридил)-5-фенил-4,5-дигидроизоксазола (28а) (кривая 1), 3-(3-пиридил)-5-феШ1л-4,5-дигидроизоксазола (28Ь) (кривая 2) и 3-(4-пирндил)-5-фенил-4,5-дигидроизоксазола (28с) (кривая 3), полученные на одном н том же образце РШ* человека при использовании АА (500 цМ) в качестве индуктора агрегации.

Если же сравнивать антиагрегационную активность для серии соединений, содержащих один и тот же пиридиновый фрагмент в СЗ-положении, но различные заместители по С5-положению, то можно отметить, что

с6н13 > с6н5 > сн2он > н > с(он)-(сн3)2 > ссжн2 > сскт

Согласно экспериментальным данным, наибольшим уровнем антиагрегационной активности обладали 3 соединения - 5-гексил-3-(3-пиридил)- (6Ь), 3-(3-пиридил)-5-фенил- (9Ь) и 5-гидроксиметил-3-(3-пиридил)изоксазолы (10Ь).

Острая токсичность 5-гидроксиметил-3-(3-пиридил)- (10Ь) и 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазолов (9Ь) составляет 2000 мг/кг и 1500 мг/кг соответственно, что позволяет говорить о перспективности данного класса соединений для дальнейшей разработки антиагрегационных средств на их основе.

3.1. Определение структуры фармакофорного фрагмента антиагрегационных средств класса 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов.

На основании полученных экспериментальных данных на начальном этапе работы была выдвинута гипотеза, что возможный фармакофорный фрагмент прототипов антиагрегационных средств класса 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов состоит из пиридинового кольца и гидроксииминовой части изоксазольного кольца.

Для уточнения структуры фармакофора были синтезированы 3-(3-пиридил)изоксазол (1Ь), 3,5-дифенилизоксазол (20) и ряд биоизостеров 5-замещенных 3-(3-пиридил)изоксазолов - 3,5-замещенных 1,2,4-оксадиазолов (51Ь,54Ь,55Ь) содержащих в СЗ- и С5-положениях оксадиазольного кольца тот же самый набор заместителей. Было проведено сравнение антиагрегационной активности 3-(3-пиридил)изоксазола (1Ь), 3,5-дифенилизоксазола (20) и 3-(3-пиридил)-5-фенил-1,2,4-оксадиазола (54Ь) с 3-

(3-пиридил)-5-фенилизоксазолом (9Ь), при использовании ряда индукторов агрегации. Согласно экспериментальным данным, 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазол (9Ь) превосходил по активности незамещенный по С5-положению изоксазольного кольца 3-(3-пиридил)изоксазол (1Ь) в 1,4-2,6 раза и был чуть лучше, чем 3,5-дифенилизоксазол (см. табл. 3 и рис. 16,17). Наличие в С5-положении изоксазола липофильного заместителя также увеличивает уровень антиагрегационной активности, но при условии, если длина алкильного фрагмента ограничена шестью атомами углерода.

£ И! | "

томил

-'»■"'дифвмип-юоксгэол

11 * ЯЗ-пирндил)-5- И

феиилиэокеаэол

А Б

Рис. 16. Кривые зависимости максимальной скорости агрегации от концентрации ингибитора для пар соединений: 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) и 3-(3-пиридил)изоксазола (1Ь) (А), 3-(3-пиридил)-5-феиилизоксазола (9Ь) и 3,5-дифенилизоксазола (20) (Б) при использовании Г'ИР человека и АА (500 цМ) как индуктора агрегации.

Рис. 17. Кривые зависимостей максимальной степени агрегации и максимальной скорости агрегации от концентрации ингибитора (А и Б, соответственно) для 3-(3-пнрндил)-5-фен11лизоксазола (9Ь), 3-(3-пнр11Д11л)-5-феш1л-4,5-Д11Г11дронзоксазола (28Ь) и 3-(3-пиридил)нзоксазола (1Ь), полученные при использовании Р1*Р человека и АА (500 цМ) как индуктора агрегации.

При сравнении антиагрегационной активности 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь), 3-(3-пиридил)изоксазола (1Ь) и 3-(3-пиридил)-5-фенил-4,5-дигидроизоксазола (28Ь), (см. рис. 17), а также 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) и 5-гексил-3-(3-пиридил)изоксазола (6Ь) с их биоизостерами - 3-(3-пиридил)-5-фенил- (54Ь) и 5-гексил-3-(3-пиридил)-1,2,4-оксадиазолами (51Ь), было установлено, что в фармакофор прототипов

антиагрегационных средств входят полностью и пиридиновое, и изоксазольное кольца целиком.

Глава 4. Исследование механизма действия 3,5-замещепных изоксазолов.

Так как все соединения полностью подавляли агрегацию Тц, вызванную АА, и вторые волны агрегации, инициированной ADP или адреналином, без подавления первых волн агрегации, было предположено, что данные вещества действуют на уровне каскада АА и могут быть ингибиторами циклооксигеназы (СОХ) (по аналогии с индометацином) или тромбоксансинтетазы (TxS), или антагонистами ТР-рецептора.

Для исследования механизма действия нами был взят 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазол (9Ь) как одно из наиболее активных соединений. Были проведены исследования влияния этого соединения на активность ферментов каскада АА — СОХ и TxS. В качестве источника этих ферментов были взяты микросомальная фракция везикулярных желез барана (циклооксигеназа) и микросомальная фракция Тц человека (комплекс СОХ-1 и TxS). Для исследования ингибирования СОХ с помощью полярографического метода при использовании электрода Кларка были выбраны следующие условия эксперимента: 150 цМ АА, стандартный калиево-фосфатный буфер (рН 7.8), 25°С. Активность СОХ определяли как скорость поглощения кислорода, выраженную в процентах, по отношению к скорости поглощения кислорода в отсутствие ингибитора (V/V0). Результаты эксперимента приведены в таблице 3. Из приведенных данных следует, что 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазол (9Ь) в диапазоне концентраций З'Ю"7 -ь 310"4 М не подавляет активность циклооксигеназы, тогда как контрольное соединение — индометацин подавляет активность циклооксигеназы при З'Ю"5 М.

Влияние 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) на активность циклооксигеназы.* __Таблица 3

№ Концентрация V/Vo

п/п ингибитора, М Индометацин 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазол (9Ь)

1. 0 1 1

2. з-ю-7 1 -

3. ПО"6 0.58 1

4. 3-ю-* 0.12 -

5. 3'10"s - 1

6. З'Ю"4 - 1

* Условия эксперимента: 150 мкМ АА, стандартный калиево-фосфатный буфер (рН 7.8), 25°С; число опытов = 3

Определение активности ТхЯ из микросом Тц человека проводили по стандартной методике: исследование превращения радиоактивномеченой тритием АА в ТхА2 по количеству его неактивного метаболита - ТхВ2 (ТхВ2). Для точек 1-3, указанных в таблице 4, проводили 3-5 измерений, и приведенные значения для ТхВ2 и АА (в % от общей радиоактивности) являются усредненными результатами нескольких измерений. Анализ приведенных в таблице 4 данных доказывает, что 3-(3-пиридил)-5-

фенилизоксазол (9Ь) в концентрации Г10'3 М не является ингибитором ТхБ, так как количество ТхВ2 при использовании и отсутствии этого вещества почти одно и тоже. Контрольное соединение - индометацин в концентрации Г10° М полностью подавляло синтез ТхА2, ингибируя СОХ-1, но не являлось ингибитором ТхБ.

Влияние нндометацнна и 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) на активность Тх8.* ___Таблица 4

№ п/п Фермент + ингибитор (концентрация) ТхВ2, % общей радиоактивности Непрореагировав шая АА, % общей радиоактивности

1. фермент без ингибитора (контроль) 8.7 ±2.2 46.4 + 3.9

2. Индометацин (1*10"3 М) 0 90.2 ± 0.9

3. 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазол (9Ь) (Г10"3 М) 8.8 ± 1.3 65.5 ±1.6

* Условия эксперимента: фермент - микросомальная фракция Тц человека, 200 мкМ АА, стандартный калиево-фосфатный буфер (рН 7.4), 25°С; число опытов = 5

В лаборатории физической биохимии крови ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России были проведены исследования по определению антитромбиновой активности 4 синтезированных соединений, включая 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазол (9Ь).

Результаты тестирования на антитромбиновую активность.

___Таблица 5.

Название соединения Концентрация Ингибирование

в пробе, мкМ скорости

гидролиза, % '

3-(3-пиридил)-5-фенил-1,2,4- 0 0

оксадиазол (54Ь) 25 мкМ 13

50 мкМ 5

125 мкМ -2

250 мкМ -

3-(3-пиридил)-5-этоксикарбонил- 0 0

1,2,4-оксадиазол (55Ь) 500 мкМ 14

1мМ 14

2,5 мМ 7

5-гексил-3-(3-пиридил)-4,5- 0 0

дигидроизоксазол (25Ь) 50 мкМ 4

100 мкМ 2

250 мкМ 2

500 мк-М -

3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазол 0 0

(9Ь) 25 мк-М 12

50 мкМ 9

125 мкМ 3

250 мкМ -

Для исследования возможного антитромбинового действия тестируемого соединения измеряли кинетику расщепления тромбином специфичного низкомолекулярного хромогенного субстрата Хромозим ТН (СТН) в присутствии данного соединения и без него.

В таблице 5 приведены данные эксперимента, в котором за 100% принимали скорость реакции без ингибитора, при этом каждый результат -усредненное значение двух параллельных измерений. Данные по ингибированию скорости гидролиза хромогенного субстрата приведены с учетом ошибки метода, которая составляет 10%. Из результата эксперимента следует, что 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазол (9Ь) не является ингибитором тромбина в концентрациях до 250 мкМ.

Для проверки возможного механизма действия 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) как антагониста рецептора ТхА2 были проведены эксперименты по связыванию меченого тритием 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) с Тц человека. Препарат меченого тритием 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) был получен методом тритиевого обмена по методике, разработанной в Институте молекулярной генетики РАН. Общая радиоактивность раствора препарата меченого соединения составила 4,6 мКи, а удельная активность - 0,24 Ки/моль.

Опыт по связыванию с нативными Тц был проведен по описанной методике с использованием PRP человека, время инкубации — 2 и 30 мин. Общее связывание определяли по количеству [3Н]-3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь), связавшегося с Тц, неспецифическое связывание определяли по количеству [3Н]-3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь), связавшегося с Тц в присутствии 100-кратного избытка немеченого соединения. Специфическое связывание определяли как разность между значениями общего и неспецифического связываний. Счет образцов проводили на сцинтилляционном счетчике Delta, время счета - 1 мин при использовании сцинтилляционной жидкости ЖС-8.

Инкубация • 2 мин

ЗИ ,

<50

toe

Рис. 18. Диаграмма радиоактивности при инку бации образцов: А - 2 мин, В - 30 мин. Точки 1, 2 (Л н В) получены после обработки образцов, содержащих 200 мкл PRP, 0,34 мкМ [3Н|-3-(3-ппридил)-5-феннл1Поксазола и контроль (растворитель для немеченого соединения); точки 3, 4 (А п В) получены после обработки образца, содержащего 200 мкл PRP, 0,34 мкМ [3Н1-3-(3-ш1рнднл)-5-феш1лтоксазола + 34 мкМ 3-(3-п11риднл)-5-фе1шл1поксазола (9Ь); общее связывание показано серым цветом, неспецнфнческое связывание — белым цветом.

Были использованы следующие концентрации [3Н]-3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) - 3,4 мМ и 34 мкМ, время инкубации — 2 и 30 мин. Разница в приготовлении образцов составила 2-5 мин. Для каждой точки готовили несколько образцов. В качестве источника Тц использовали PRP человека, инкубацию проводили при 37°С. За время инкубации образцов видимых изменений в свойствах PRP не наблюдалось (спонтанная броуновская агрегация и гравитационное осаждение Тц отсутствовали).

Данные для концентрации 0,34 мкМ [3Н]-3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) представлены на диаграмме радиоактивности на рис. 18. При сравнении столбцов видно, что неспецифическое связывание уменьшается при увеличении инкубационного периода, хотя общее связывание возрастает незначительно. Из анализа экспериментальных данных следует, что при концентрации [3Н]-3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) равной 0,34 мкМ, наблюдается специфическое связывание. Таким образом, можно предположить, что мы наблюдаем лиганд—рецепторное специфическое взаимодействие: на 1 Тц приходится ~3«103 обратимо связавшихся молекул, что соответствует количеству рецепторов ТхА2 на одном Тц (2500-3000 рецепторов ТхА2/ Тц).

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазол (9Ь) является антагонистом рецептора ТхА2, и все остальные соединения также являются возможными антагонистами рецептора ТхА2.

На основании полученных экспериментальных данных было предположено, что значение коэффициента Хилла, равное 10, 20 и более, означало, что вещество в клетке действует до стадии суперкооперативности, которая является причиной появления пороговой зависимости на кривых степени и скорости агрегации Тц: вещество действует на стадии передачи сигнала перед стадией резкого лавинообразного возрастания числа вторичных мессенджеров, участвующих в последующей передаче сигнала по сигнальному пути). Сравнение биологической активности 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола (9Ь) и селективного антагониста рецептора ТхА2 -GB32191B показало, что кривые зависимостей степени агрегации и скорости агрегации Тц от концентрации ингибитора для этих двух веществ очень похожи, и для них характерно наличие пороговой зависимости в узком диапазоне концентраций, а также большое значение коэффициента Хилла, при этом GB32191B также не подавлял I волну агрегации, вызванной ADP и адреналином (Демина О.В. и др., 2011). Возможно, что высокие значения коэффициента Хилла также характерны для антагонистов GPCRs, вовлеченных в процесс передачи сигнала в начале или середине пути его прохождения, помимо выявления стадии суперкооперативности (как в случае индометацина).

Было экспериментально показано, что 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазол (9Ь) и 5-гексил-3-(3-пиридил)изоксазол (6Ь) подавляют агрегацию Тц, вызванную фактором активации Тц (PAF) в концентрациях 150-300 мкМ, и в 5-10 раз менее активны, чем антагонист PAF - CV-3988.

Для дополнительного исследования возможности связывания синтезированных соединений с рецепторами мембраны Тц, особенно с ТР-рецептором, были синтезированы 2 соединения (71,72), содержащие фотохромную метку - спиропирановый фрагмент по СЗ-положению изоксазольного кольца, а также 1 соединение (73), содержащее «молекулярный адрес» - фрагмент 3-(3-пиридил)-4,5-дигидроизоксазола, со спиропирановым фрагментом по С-5-положению изоксазолинового цикла.

Рис. 19. Связывание соединения (73) с Тц: голубой цвет - общее связывание, бордовый цвет - неспецифическое связывание. Концентрации соединения (73) в образце 2 (5 мин связывания) и образце 7 (30 мин связывания) равны 25 мкМ и 2.5 мкМ соответственно.

Были проведены эксперименты по связыванию соединения (73) и соединения (71) с Тц человека, с детектированием комплекса при помощи измерения уровня фотоиндуцированной флуоресценции мероцианиновой формы и фотоиндуцированных спектров ее поглощения спектрофотометрически. Было показано, что соединение (73), содержащее полный фармакофорный фрагмент в качестве «молекулярного адреса», связывается с Тц намного лучше, чем соединение (71). При проведении эксперимента по связыванию соединения (73) с использованием избытка аналога - 3-(3-пиридил)-5-фенил-4,5-дигидроизоксазола (28Ь) при уменьшении концентрации в образцах меченое соединение не было обнаружено, т.е. произошло полное вытеснение его избытком аналога. Это подтверждает, что оба соединения связывались с одной и той же мишенью -ТР-рецептором.

После завершения проведенных испытаний in vitro разработанные в ходе выполнения работы образцы наиболее активных соединений можно использовать для дальнейших исследований по созданию новых прототипов антиагрегационных средств на стадиях «кандидат в лекарственное средство» (ADME-Tox) и последующих доклинических испытаний.

Таким образом, суммируя все приведенные экспериментальные результаты, можно сделать вывод, что соединения класса 5-замещенных 3-(3-пиридил)изоксазолов и их 4,5-дигидроаналоги по механизму действия являются антагонистами ТР-рецептора.

Выводы

1. С целью разработки новых антиагрегационных средств был проведен целенаправленный дизайн молекул и создан новый скэффолд для генерации сфокусированных комбинаторных библиотек 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов и их 4.5-дигидропроизводных.

2. Были разработаны и успешно апробированы методы синтеза ряда комбинаторных библиотек новых потенциальных антиагрегационных средств на основе унифицированной процедуры - реакции [3+2]-циклоприсоединения пиридилнитрилоксидов с непредельными соединениями с подтверждением строения всех синтезированных веществ.

3. Проведено исследование региоселективиости и особенностей реакции [3+2]-циклоприсоединения изомерных пиридилнитрилоксидов с непредельными соединениями различной природы, показано, что реакция протекала региоселективно, исключительно с образованием целевого 3,5-замещенного продукта. Кроме классического метода генерирования пиридилнитрилоксидов (Huisgen in situ), был успешно апробирован ряд вариантов проведения этого процесса: реакция дегидрирования оксимов в двухфазной системе NaOCl водн./СН2С12, в присутствии катализатора межфазного переноса (Aliquat 336); реакция хлорирования оксимов N-хлорсукцинимидом с последующим дегидрохлорированием продукта под действием триэтиламина. Был исследован альтернативный двухстадийный вариант получения целевых соединений ароматизацией 4,5-дигидропроизводных в производные изоксазола.

4. Получена серия биоизостеров - 3,5-замещенных 1,2,4-оксадиазолов по реакции ацилирования региоизомеров пиридинкарбоксамидоксимов хлорангидридами кислот с последующей циклизацией продукта при нагревании в толуоле в присутствии TBAF.

5. Впервые разработаны методы синтеза и получены ингибиторы агрегации, содержащие метки различной природы (радиоактивную, остаток ретиноида и фотохромиую). Проведено изучение спектрально-кинетических характеристик, фотохромного поведения и флуоресцентных свойств серии синтезированных ингибиторов агрегации тромбоцитов человека, содержащих фотохромиые метки спироииранового ряда.

6. Впервые исследованы кинетические особенности процесса агрегации тромбоцитов человека in vitro с использованием новых ингибиторов агрегации класса замещенных изоксазолов и их аналогов под действием 3 природных индукторов агрегации (адреналина, аденозиндифосфата, арахидоиовой кислоты) в образцах плазмы крови человека, обогащенной тромбоцитами, и в суспензиях отмытых тромбоцитов. Установлено, что соединения этого класса полностью подавляют агрегацию тромбоцитов, вызванную арахидоиовой кислотой, и вторую волну агрегации, инициированной адреналином или аденозиндифосфатом, но не влияют на первую волну агрегации, инициированной адреналином или аденозиндифосфатом. Показано, что S-образные кривые агрегации,

инициированной АА, имеют пороговую зависимость. Определены значения 1С}о и константы ингибирования для протестированных соединений.

6. Определена структура фармакофорного фрагмента для антиагрегационных средств класса 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов. Определены пространственные ограничения для дизайна новых веществ.

7. Установлено, что новый класс ингибиторов агрегации тромбоцитов не относится к ингибиторам ферментов каскада арахидоновой кислоты -циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы, а также - тромбина, но относится к антагонистам рецептора ТхА2. Таким образом, был открыт новый класс ингибиторов агрегации тромбоцитов человека - 5-замещенные 3-пиридилизоксазолов, обладающих низкой токсичностью и достаточно эффективных в экспериментах in vitro.

Полученные результаты могут служить основой для формирования стратегии поиска новых потенциальных антиагрегационных средств среди других классов соединений и определения механизма их действия на молекулярном уровне.

Обзоры

1. Ходонов A.A., Еремин C.B., Локшин Дж.Л., Швец В.И., Демина О.В.. Хитрина Л.В., Каулен А.Д. Аналоги ретиналя и их применение для исследования бактериородопсина. // Биоорганическая химия, 1996, Т. 22, К 10-11, С. 745-778.

2. Демина О.В.. Варфоломеев С.Д. Фарнезилтрансфераза Ras-белков. Гидрофобизация как механизм активации онкогена. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1999, Т. 2, N 1 , С. 3-22.

3. Демина О.В.. Ходонов A.A., Швец В.И., Варфоломеев С.Д. Агрегация тромбоцитов человека: молекулярно-кинетические механизмы и пути их регуляции. // Биол. мембраны 2002. Т. 19, №2, С. 115-152.

4. Ходонов A.A., Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Фомин MA., Демина О.В.. Складнев Д А., Тюрин С.А., Швец В.И. Гибридные аналоги ретиноидов: как инструменты для исследований в области нанобиофотоники.//Вестник МИТХТ 2011 Т 6 №2 С 1536.

5. Barachevsky V.A., Khodonov A.A., Belikov N E., Laptev A.V., Lukin A.Yu., Demina O.V.. Luyksaar S.I., Krayushkin M.M. Properties of the Photochrome Retináis. // Dyes and Pigments 2012. V. 92, №2. P. 831-837.

Статьи

6. Vrzhechsh P.V., Demina O.V.. Shram S.I., Varfolomeev S.D., Supercooperativity in platelet aggregation: substituted pyridyl-isoxazoles, a new class of supercooperative platelet aggregation inhibitors. // FEBS Lett. 1994. V.351, № 2. P. 168-170.

7. Демина O B.. Вржещ П.В., Ходонов A.A., Козловский В.И., Варфоломеев С.Д. Синтез новых ингибиторов агрегации тромбоцитов - замещенных пиридилизоксазолов и их 4,5-дигидроаналогов. // Биоорганическая химия. 1995. Т. 21, № 12. С. 933-940.

8. Миронова Е.В., Леонтьева C.B., Шевяков C.B., Алексеева С.Г., Швец В.И., Демина О-В.. Краснокутская И.С., Финкельштейн Е.И., Ходонов A.A. Удобный способ получения производных ретиналя, модифицированных по триметилциклогексеновому кольцу. // Биоорганическая химия. 2002. Т. 28, № 6. С. 535-542

9. Khodonov A.A., Demina O.V.. Lukin A.Yu., Laptev A.V., Shvets V.l., Gromov S.P., Vedernikov A.I., Strokach Yu.P., Venidiktova O.V., Valova T.M., Alfimov M.V., Barachevsky V.A. Photochromic and cation-binding properties of new crowned spiropyrans. // Molecular Cryst. Liquid Cryst. 2005. V. 431. P. 216-222.

10. Nikitin S., Zaitseva N., Demina P.. Solovieva V., Mazin E., Mikhalev S., Smolov M., Rubinov A., Vlasov P., Lipikhin D., Khachko D., Fokin V., Queen C., Zosimov V. A very large diversity space of synthetically accessible compounds for use with drug design programs. // J. Computer-Aided Mol. Design. 2005. V. 19. P. 47-63.

П.Лаптев A.B., Беликов H.E., Лукин А.Ю., Строкам Ю.П., Барачевский В.А., Алфимов М.В., Демина О.В.. Швец В.И., Складнее Д.А., Ходонов А.А. Синтез спиропирановых аналогов ретиналя и изучение их взаимодействия с бактериоопсином из Н. salinarum. II Биоорганическая химия. 2008. Т. 34, Ка 2. С. 276-284.

12. Лаптев А.В., Беликов Н.Е., Лукин А.Ю., Барачевский В.А., Алфимов М.В., Демина О.В.. Варфоломеев С.Д., Швец В.И., Ходонов А.А. Спиропирановые аналоги ретиналя: синтез и изучение их фотохромных свойств. // Химия высоких энергий. 2008. Т. 42, № 4 (прил.). С. 102-104.

13. Belikov N., Lukin A., Laptev A., Shvets V., Barachevsky V., |Strokach Yul Valova Т., Krayushkin M., Demina P.. Varfolomeev S., Khodonov A. Photochromic Behavior of Retinal Analogs. //J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry. 2008. V. 196, N 2-3, P. 262-267.

14. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов H.E., Земцов Р.В., Швец В.И., Демина О.В.. Варфоломеев С.Д., Барачевский В.А., Ходонов А.А. Синтез и изучение фотохромного поведения 3-[6'-нитро-1,3,3-триметилспиро(инлолино-2,2'-[2Н]-хромен-5-ил)]пропеновой кислоты и ее этилового эфира. // Химия высоких энергий. 2010. Т. 44. №3. С. 239-243.

15. Демина О.В.. Лаптев А.В., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Фомин М.А., Звездин К.В., Ходонов А.А., Варфоломеев С.Д., Швец В.И. Синтез новых 3,5-замещенных изоксазолов с потенциальной антиагрегационной активностью. // Вестник МИТХТ, 2010. Т. 5. №6. С. 47-51.

16. Laptev A., Lukin A., Belikov N., Fomin М., Zvezdin К., Demina P.. Barachevsky V„ Varfolomeev S., Shvets V., Khodonov A. Polyenic spirobenzopyrans: Synthesis and study of photochromic properties. // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry. 2011. V. 222, №1. P. 16-24.

17. Демина O.B.. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Ходонов А.А., Беликов Н.Е., Фомин М.А., Грибкова И.В., Швец В.И., Варфоломеев С.Д. Сравнение антиагрегационной активности 3-(3-пиридил)-5-фенилизоксазола и 3-(3-пиридил)-5-фенил-1,2,4-оксадиазола. // Биологические мембраны. 2011. Т. 28, № 4. С. 243-253.

18. Levin P.P., Tatikolov A.S., Laptev A.V., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Demina O.V.. Khodonov A.A., Shvets V.I., Varfolomeev S.D. The investigation of the intermediates of spiropyran retinal analogs by laser flash photolysis techniques with different excitation wavelengths// J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry. 2012. V. 231. №1. P. 41-44.

19. Звездин K.B., Беликов H.E., Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Демина О.В.. Левин П.П., Бричкин С.Б., Спирин М.Г., Разумов В.Ф., Швец В.И., Ходонов А.А. Новые гибридные фотохромные материалы с переключаемой флуоресценцией. И Российские нанотехнологии, 2012. Т. 7. № 5-6. С. 112-118.

20. Demina P.V.. Levin P.P., Belikov N.E., Laptev A.V., Lukin A.Yu., Barachevsky V.A., Shvets V.I., Varfolomeev S.D., Khodonov A.A. Synthesis and photochromic reaction kinetics of unsaturated spiropyran derivatives. // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry. 2013. V. 270. P. 60-66.

21. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов H.E., Демина Р.В.. Варфоломеев С.Д., Барачевский

B.А., Ходонов А.А., Швец В.И. Получение и изучение фотохромного поведения замещенных 5-винил-6'-нитро-1,3,3-триметил-спиро(индолино-2,2'-[2Н]-хроменов) // Вестник МИТХТ, 2013. Т. 8. № 4. С. 18-26.

Статьи, опубликованные в сборниках трудов конференций и симпозиумов.

22. Ходонов А.А., Еремин С.В., Миронова Е.В., Шевяков С.В., Локшин Дж.Л., Алексеева

C.Г., Швец В.И., Демина О.В.. Костанян И.А., Астапова М.В. Взаимосвязь между структурой ретиноидов и их дифференцирующей активностью в тест-системе промиелоцитарной лейкемии человека HL-60. П Тезисы докладов конференции, посвященной 100-летию проф. Н.А. Преображенского, М., 1996, С. 133-136.

23. Демина О.В.. Варфоломеев С.Д., Панкратова Н.М., Ходонов A.A. Региоселективный подход к получению нового класса тромбоцит-активных средств. // Тезисы докладов 6-ой международной конференции "Наукоемкие химические технологии", Москва, 1999, С. 180-182.

24. Démina O.V.. Khodonov A.A., Varfolomeev S.D. Human platelet aggregation regulation by the substituted pyridylisoxazole compounds. // Материалы VI Международной Конференции "Результаты фундаментальных исследований для инвестиций. Молекулярная медицина." Пущино, 12-14 сентября 2001 г. Р. 12-16.

25. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Шевяков C.B., Демина О.В.. Барачевский В.А., Строкач Ю.П., Ходонов A.A. Разработка методов синтеза новых фотохромных меток для биосенсорных технологий. // Материалы X Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии - 2004", Волгоград, ВГТУ, 2004 г. С. 207-210.

26. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Земцов Р.В., Ходонов A.A., Швец В.И., Барачевский В.А., Демина О.В. Синтез и фотохромные свойства полиеновых производных спиропиранов. // Материалы III Молодежной конференции ИОХ РАН, Москва, 2009, С. 92-94.

27. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Земцов Р.В., Швец В.И., Демина О.В.. Варфоломеев С.Д., Барачевский В.А., Ходонов A.A. Синтез и изучение фотохромного поведения 3-[6'-нитро-1,3,3-триметилспиро(индолино-2,2'-[2Н]-хромен-5-ил)]пропеновой кислоты и ее этилового эфира. // Труды Международной конференции «Органическая нанофотоника 2009», 21-28 июня 2009, С-Петербург, 2010. С. 228-237.

28. Карпова М.Ю., Беликов Н.Е., Лаптев A.B., Варфоломеев С.Д., Швец В.И., Демина О.В., Ходонов A.A. Синтез ингибитора агрегации тромбоцитов человека - 5-гидроксиметил-3-(3-пиридил)изоксазола, содержащего хромогенную метку. // Труды XII Ежегодной международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы, 29-31 октября 2012 г. С. 65-69.

Авторские свидетельства СССР и патенты РФ

29. A.C. СССР № 1097672. Метод выделения простагландин-синтетазы. / Якушева Л.А., Мягкова Г.И., Демина О.В.. Евстигнеева Р.П., Мевх А.Т., Варфоломеев С.Д. 15.02.1984 г.

30. A.C. СССР № 1460933. 9-Оксим-11-дезокси-15р-простагландина Ei в качестве избирательного антагониста рецепторов тромбоксана Аг / Гафуров Р.Г., Демина О.В.. Нигаматов И.М., Фрейманис Я.Ф., Макаров В.А., Серков И.В. МКИ С 07С 177/00. 22.10.1988 г.

31. A.C. СССР № 1624958. 5-Оксиметил-3-(пирид-2-ил)изоксазол, обладающий способностью ингибировать агрегацию тромбоцитов / Демина О.В.. Горин Б.И., Варфоломеев С.Д., Вржещ П.В., Татаринцев A.B. МКИ С 07D 413/04, 1.10.1990 г.

32. A.C. СССР № 1746676 // О.В. Демина, Б.И. Горин, С.Д. Варфоломеев, П.В. Вржещ, A.B. Татаринцев, Д.Е. Ершов. 5-Оксиметил-3-(пирид-3-ил)изоксазол, обладающий антиагрегационной активностью: МКИ С 07D 413/04. 8.03.1992 г.

33. Патент РФ № 2088229. Антиагрегационные средства. / Демина О.В.. Варфоломеев С.Д., Вржещ П.В., Татаринцев A.B.. Заявка 93028738/14 от 26.05.1993 г.. А61К31/44. Опубликовано 27.08.1997 г., Б.И. № 24.

34. Патент РФ № 2358977. 5-Формил-замещенные индолиновые спиробензопираны и способ их получения. / Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Швец В.И., Демина O B.. Барачевский В.А., Ходонов A.A. Заявка № 2008112485 от 02.04.2008. Опубликовано 20.06.2009, Б.И. 2009, № 17.

35. Патент РФ № 2417983. Способ получения 1l-i/iic-изомера ретиналя. / Фомин М.А., Беликов Н.Е., Лукин А.Ю., Лаптев A.B., Демина О.В., Ходонов A.A., Швец В.И. Заявка 2009140175/04 от 30.10.2009 г., Приоритет от 30.10.2009 г. Опубликовано 10.05.2011 г., бголл. № 13. МПК С07С 403/14. 13 с.

36. Патент РФ № 2458927. Фотохромные производные 5'-винил-6-нитро-спиробензопирана и способы их получения. // Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Фомин М.А., Демина О Н.. Швец В.И., Ходонов A.A. Заявка № 2011113411 на получение патента РФ от 07.04.2011. Опубликовано 20.08.2012, бюлл. № 23.

Избранные тезисы н материалы конференций и симпозиумов.

37. Демина О.В., Горин Б.И., Коваленко С.В. З-Пиридилизоксазолы: синтез и биологическая активность. // Тезисы 10-ой конференции "Синтез и исследование биологически активных соединений", Рига, 1989, С. 27.

38. Demina O.V., Khodonov A.A., Vrzhechsh P.V., Varfolomeev S.D. Synthesis and biological activity of 3-pyridylisoxazoles. // Abstracts of 13th International Symposium on Medicinal Chemistry, Paris, France, 1994, PI.

39. Khodonov A.A., Eremin S. V., Alexeeva S.G., Demina O.V., Tsytovich A.V., Shamshin D.V., Shvets V.l. Synthetic strategy for retinoids with modified polar group preparation, which possesing anti-tumor activity. // Abstracts of 11th International Symposium on Carotenoids, Leiden, The Netherlands, 1996, P. 51.

40. Demina O.V.. Vrzheshch P.V., Varfolomeev S.D., Khodonov A.A. Investigation of supercooperativity phenomena in platelet aggregation inhibition induced by isoxazole derivatives. // Abstracts of International Conference "Biocatalysis-98, Fundamentals and Applications", 1998, Pushchino, Russia, P. 31.

41. Demina O.V., Varfolomeev S.D., Pankratova N.M., Khodonov A.A. Kinetic Investigation of Platelet Aggregation Inhibitors Mode Action. // Abstracts of International conference "Biocatalysis -2000: Fundamentals and Applications." Moscow, June 10-15, 2000. P. 84-85.

42. Pankratova N.M., Demina O.V.. Varfolomeev S.D., Khodonov A.A. Investigation of the physico-chemical conformities of the human platelet aggregation inhibition induced by isoxazole derivatives. // Proceeding of the International conference "Biochemical Physics on the Frontiers of Centuries." Moscow, April 24-26 2000, P. 84-85.

43. Khodonov A.A., Lukin A.Yu., Laptev A.V., Shevyakov S.V., Shvets V.l., Barachevsky V.A., Strokach Yu.P., Venidiktova O.V., Vedernikov A.I., Gromov S.P., Alfimov M.V., Demina Q.V. Synthesis and Study of a cation-binding of a new crowned spiropyrans. // Materials of 4lh International Symposium on Photochromism "Photoswitchable Molecular System and Devices", Arcachon, France, 2004, P. 94.

44. Lukin A.Yu., Laptev A.V., Shevyakov S.V., Shvets V.l., Barachevsky V.A., Strokach Yu.P., Vedernikov A.I., Gromov S.P., Alfimov M.V., Demina O.V., Khodonov A.A. Synthesis and Study of a cation-binding of a new crowned spiropyrans. // Materials of Third International Symposium on Supramolecular Chemistry "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures", Kazan, Russia, 2004, P. 116.

45. Khodonov A.A., Krayushkin M.M., Strokach Yu.P., Barachevsky V.A., Demina O.V.. Lukin A.Yu., Belikov N.E., Laptev A.V. Retinoid derivatives as thermal irreversible photochromes. // Book of Abstracts XXII International Conference on Photochemistry, Queensland, Australia, 2429 July 2005, P. 91-92.

46. Khodonov A.A., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Laptev A.V., Shvets V.l., Barachevsky V.A., Strokach Yu.P., Krayushkin M.M., Shorunov S.V., Demina Q.V. Photochromic retinal analogs: synthesis and study of their spectral properties. // Abstracts Book of XXlst IUPAC Symposium on Photochemistry, Kyoto, Japan, April 2-7, 2006, P 230.

47. Khodonov A.A., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Laptev A.V., Shvets V.l., Barachevsky V.A., Strokach Yu.P., Krayushkin M.M., Demina Q.V. Photochromic retinal analogs: synthesis and study of their spectral properties. //Abstracts of International Symposium on Molecular Photonics devoted to the memory of academician A.N. Terenin, St. Petersburg, June 28-JuIy 2, 2006, P. 77.

48. Demina O.V.. Khodonov A.A., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Laptev A.V., Shvets V.l., Barachevsky V.A., Strokach Yu.P. Design and synthesis of photochromic labels for covalent

modification of different targets. // Abstracts of International Symposium on Molecular Photonics devoted to the memory of academician A.N. Terenin, St. Petersburg, June 28-July 2,

2006, P. 76-77.

49. Laptev A.V., Khodonov A.A., Lukin A.Yu., Shvets V.I., Barachevsky V.A., Strokach Yu.P., Venidiktova O.V., Demina O.V. Synthesis and study of a cation-binding of a new crowned spiropyrans. // Materials of IVth International Symposium on Supramolecular Chemistry "Design and Synthesis of Supramolecular Architectures", Kazan, Russia, 2006, P. 103.

50. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Швец В.И., Барачевский В.А., Строкач Ю.П., Демина О.В.. Ходонов А.А. Методы получения непредельных производных спиропиранов. // Материалы международной конференции "Advanced Science in Organic Chemistry", Судак, Крым, 2006, C-089.

51. Лукин А.Ю., Лаптев А.В., Беликов Н.Е., Барачевский В.А., Строкач Ю.П., Ходонов А.А., Демина О.В.. Краюшкин М.М., Швец В.И. Синтез фотохромных аналогов ретиналя. // Материалы международной конференции "Advanced Science in Organic Chemistry", Судак, Крым, 2006, C-098.

52. Laptev A.V., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Barachevsky V.A., Demina O.V.. Varfolomeev S.D., Shvets V.I., Khodonov A.A. Synthesis of photochromic retinal analogs. Abstracts of XVIII Mendeleev congress on general and applied chemistry. Russia, Moscow, September 23-28,

2007, N 4, P. 546.

53. Laptev A.V., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Barachevsky V.A., Demina O.V.. Shvets V.I., Khodonov A.A. Investigation of spectral properties of photochromic retinoid analogs. // Abstracts of the International Conference "Molecular and nanoscale system for energy conversion". Russia, Moscow, October 1-3, 2007, P. 85.

54. Belikov N.E., Laptev A.V., Lukin A.Yu., Barachevsky V.A., Demina O.V.. Shvets V.I., Khodonov A.A., Krayushkin M.M. Vinylogs of the bis-dihetarylethenes as new thermoirreversible photochromic materials. // Abstracts of the International Conference "Molecular and nanoscale system for energy conversion". Russia, Moscow, October 1-3, 2007, P. 89.

55. Ходонов A.A., Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Барачевский В.А., Демина О.В., Варфоломеев С.Д., Швец В.И., Краюшкин М.М. Фотохромные аналоги ретиналя: синтез и свойства. // Материалы международной конференции "Нанофотоника". Россия, Черноголовка, 18-22 сентября, 2007, С. 164.

56. Belikov N., Lukin A., Laptev A., Shvets V., Barachevsky V., Strokach Yu., Valova Т., Krayushkin M., Demina P.. Varfolomeev S., Khodonov A. Photochromic Behavior of Retinal Analogs. // Book of Abstracts International Symposium on Photochromism, Vancouver, British Columbia, Canada, October 7-10, 2007. P. 28.

57. Barachevsky V.A., Strokach Yu.P., Kobeleva O.I., Valova T.M., Krayushkin M.M., Demina O.V- Lukin A.Yu., Belikov N.E., Laptev A.V., Shvets V.I., Khodonov A.A. Photochromic Retinal Analogs: Synthesis and Properties. // Abstracts of XXIII International Conference on Photochemistry, Cologne, Germany, 29 July - 3 August 2007. P. 472.

58. Barachevsky V.A., Belikov N.E., Lukin A.Yu., Laptev A.V., Shvets V.I., Valova T.M., Krayushkin M.M., Demina O.V.. Varfolomeev S.D., Khodonov A.A. Photochromic Behavior of Retinal Analogs. // Abstract Book of XXIIntl IUPAC International Symposium on Photochemistry, Gothenburg, Sweden, 28 July - 1 August 2008, PI50, P. 278.

59. Беликов H.E., Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Барачевский В.А., Демина О.В.. Швец В.И., Ходонов А.А., Краюшкин М.М. Аналоги бис-гетероарилэтенов как новые термически необратимые фотохромные материалы. // Тезисы докладов XII Международной научно-технической конференции Наукоемкие химические технологии-2008. Волгоград, 9-11 сентября 2008 г. С. 131-132.

60. Ходонов А.А., Демина О.В.. Беликов Н.Е., Звездин К.В., Лаптев А.В., Лукин А.Ю., Варфоломеев С.Д., Швец В.И., Барачевский В.А. Синтез и спектральные свойства

фотохромных производных витамина А. // Сборник тезисов Международной конференции «Нанофотоника», Ужгород (Украина), 28 сентября - 3 октября 2008 г., С-2.

61. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Земцов Р.В., Звездин К.В., Ходонов A.A., Швец В.И., Барачевский В.А., Варфоломеев С.Д., Демина О.В. / Синтез и свойства фотохромных аналогов витамина А // Материалы конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Новый Свет, АР Крым, Украина, 2009, С. 107-108.

62. Демина О.В., Лаптев A.B., Беликов Н.Е, Лукин А.Ю., Земцов Р.В., Варфоломеев С.Д., Ходонов A.A. Исследование спектральных свойств производных изоксазолов, содержащих фотохромную метку. // Материалы Международной конференции «Органическая нанофотоника 2009», 21-28 июня 2009, С-Петербург, 2009, С. 131.

63. Khodonov A.A., Laptev A.V., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Zemtsov R.V., Zvezdin K.V., Shvets V.l., Barachevsky V.A., Varfolomeev S.D., Démina O.V. Synthesis and Properties of Photochromic Retinal Analogs. // Materials of 16th European Symposium on Organic Chemistry, 12-16 July 2009, Prague, Czech Republic, P 1.244, P. 311.

64. Беликов H.E., Лаптев A.B., Земцов Р.В., Лукин А.Ю., Демина O B , Барачевский В.А., Краюшкин М.М., Швец В.И., Ходонов A.A. Синтез и спектральные свойства диарилэтеновьтх аналогов ретиналя. // Материалы Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, 28 сентября - 1 октября 2009 г., Москва, 2009, Т. 2, С. 21.

65. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Земцов Р.В., Ходонов A.A., Швец В.И., Барачевский В.А., Демина О.В. Синтез и фотохромные свойства полиеновых производных спиропиранов. // Материалы Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, 28 сентября - 1 октября 2009 г., Москва, 2009, Т. 2, С. 126.

66. Демина О.В.. Лаптев A.B.,. Беликов Н.Е, Лукин А.Ю., Земцов Р.В., Ходонов A.A., Варфоломеев С.Д. Исследование спектральных свойств производных изоксазолов, содержащих фотохромную метку. // Материалы Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, 28 сентября - 1 октября 2009 г., Москва, 2009, Т. 1, С. 184.

67. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Земцов Р.В., Звездин К.В., Ходонов A.A., Швец В.И., Барачевский В.А., Демина О.В. Исследование фотохромных свойств полиеновых производных спиропиранов. // Материалы IX ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика», 9-11 ноября 2009 г., Москва, С. 132.

68. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Швец В.И., Демина О.В., Варфоломеев С.Д., Бричкин С.Б., Николенко Д.Ю., Разумов В.Ф., Ходонов A.A. Новые модели фотосинтетических систем: методы получения и свойства. // Материалы Международного симпозиума «Advanced Science in Organic Chemistry», 21-25 июня 2010, Мисхор, Крым, С-125, С. 217.

69. Лукин А.Ю., Лаптев A.B., Беликов Н.Е., Фомин М.А., Звездин К.В., Демина О.В.. Швец В.И., Ходонов A.A. Разработка методов синтеза фотохромных аналогов ретиналя. // Материалы Международного симпозиума «Advanced Science in Organic Chemistry», 21-25 июня 2010, Мисхор, Крым, С-133, С. 225.

70. Демина О.В.. Лаптев A.B., Беликов Н.Е., Лукин А.Ю., Швец В.И., Ходонов A.A., Варфоломеев С.Д. 3,5-3амещенные изоксазолы и 1,2,4-оксадиазолы и их биологическая активность. // Материалы Международного симпозиума «Advanced Science in Organic Chemistry», 21-25 июня 2010, Мисхор, Крым, С-61, С. 153.

71. Khodonov A.A., Laptev A.V., Zvezdin K.V., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Fomin M.A., Shvets V.l., Brichkin S.B., Nikolenko D.Yu., Razumov V.F., Barachevsky V.A., Varfolomeev S.D., Demina O.V. New hybrid photochromic materials for optical switching. // Abstracts of 4 International Conference on Optical Optoelectronic and Photonic Materials and Application. Hungary, Budapest, August 15-20, 2010, A-0098, P. 110-111.

72. Barachevsky V.A., Demina O.V., Laptev A.V., Belikov N.E., Lukin A.Yu., Zvezdin K.V., Fomin M.A., Shvets V.l., Varfolomeev S.D., Khodonov A.A. Study of spectral properties of isoxazole derivatives with photochromic label. // Abstracts of 6 International Symposium on Organic Photochromism, Japan, Yokohama, October 17-21, 2010, P. 188.

73. Звездин K.B., Демина O.B.. Лаптев A.B., Беликов H.E., Лукин А.Ю., Фомин М.А., Швец В.И., Варфоломеев С.Д., Ходонов A.A. Изучение спектральных свойств производных изоксазола с фотохромной меткой // 10-я молодежная конференция ИБХФ РАН Биохимическая физика, 8-10 ноября 2010 г. С. 74.

74. Фомин М.А., Демина О.В., Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Швец В.И., Варфоломеев С.Д., Ходонов A.A. Синтез новых производных 3-пиридилизоксазолов с потенциальной антиагрегационной активностью. // 10-я молодежная конференция ИБХФ РАН Биохимическая физика, 8-10 ноября 2010 г. С. 246.

75. Fomin М.А., Demina O.V., Laptev A.V., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Shvets V.l., Varfolomeev S.D., Khodonov A.A. Antiaggregatory agents of 3,5-substituted isoxazoles and their 4,5-dihydro derivatives. //Materials of VI Moscow International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development", Moscow, March 21-25, 2011, part 1, P. 55-56.

76. Фомин M.A., Демина O B.. Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Швец В.И., Варфоломеев С.Д., Ходонов A.A. Синтез новых производных 3-(3-пиридил)изоксазолов с потенциальной антиагрегационной активностью. // Тезисы докладов и стендовых сообщений ХХШ зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-10 февраля, 2011, С. 85.

77. Laptev A.V., Demina O.V.. Khodonov A.A., Belikov N.E., Lukin A.Yu., Fomin M.A., Shvets V.l., Varfolomeev S.D. Synthesis and study of spectral properties of isoxazole derivatives with photochromic label. // Materials of International Congress on Organic Chemistry, dedicated to the 150th anniversary of the Butlerov's theory of chemical structure of organic compounds. September 18-23, 2011, Kazan, Russia, P-129, P. 373.

78. Laptev A.V., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Fomin M.A., Demina O.V.. Shvets V.l., Khodonov A.A. Study of substituted spirobenzopyrans formylation process. // Materials of the 17th European Symposium on Organic Chemistry (ESOC-17), July 10-15, 2011, Crete, Greece. P2.041.

79. Demina O.V.. Laptev A.V., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Fomin M.A., Shvets V.l., Varfolomeev S.D., Khodonov A.A. Antiaggregatory Activities of 5-Substituted 3-(3-pyridyl)isoxazoles and Their 4,5-Dihydroderivatives. // Materials of the 23rd International Congress on Heterocyclic Chemistry, July 31 - August 4 2011, Glasgow, UK, P2.20, P. 236.

80. Demina O.V.. Laptev A.V., Lukin A.Yu., Belikov N.E., Fomin M.A., Shvets V.l., Khodonov

A.A. Study of Substituted Spirobenzopyran Formylation Process. // Materials of the 23rd International Congress on Heterocyclic Chemistry, July 31 - August 4 2011, Glasgow, UK, P4.ll, P. 273.

81. Беликов H.E., Лаптев A.B., Лукин А.Ю., Фомин М.А., Демина О.В.. Левин П.П., Швец

B.И., Ходонов A.A. Сравнение спектральных свойств фотохромных аналогов ретиналя. // Материалы Всероссийской конференции "Фотоника органических и гибридных наноструктур" Черноголовка, 5-9 сентября 2011 г., С. 38.

82. Демина О.В.. Лаптев A.B., Беликов Н.Е., Лукин А.Ю., Фомин М.А., Швец В.И., Варфоломеев С.Д., Ходонов A.A. Изучение спектральных свойств производных изоксазола с фотохромной меткой. // Материалы Всероссийской конференции "Фотоника органических и гибридных наноструктур" Черноголовка, 5-9 сентября 2011 г., С. 56.

83. Фомин М.А., Демина О.В.. Лаптев А.В., Беликов Н.Е., Лукин А.Ю., Швец В.И., Левин П.П., Ходонов А.А. Изучение фотохромного поведения производных 5-винил-6'-нитро-спиробензопирана. // Материалы Всероссийской конференции "Фотоника органических и гибридных наноструктур" Черноголовка, 5-9 сентября 2011 г., С. 158.

84. Ходонов А.А., Беликов Н.Е., Лаптев А.В., Лукин А.Ю., Фомин М.А., Демина О.В., Левин П.П., Швец В.И. Синтез и спектральные свойства формильных производных замещенных спиробензопиранов. // Материалы Всероссийской конференции "Фотоника органических и гибридных наноструктур" Черноголовка, 5-9 сентября 2011 г., С. 162.

85. Звездин К.В., Ходонов А.А., Беликов Н.Е., Лаптев А.В., Лукин А.Ю., Фомин М.А., Демина О.В.. Левин П.П., Бричкин С.Б., Николенко Д.Ю., Швец В.И. Новые гибридные фотохромные материалы для оптических переключателей. // Материалы Всероссийской конференции "Фотоника органических и гибридных наноструктур" Черноголовка, 5-9 сентября 2011 г., С. 67.

86. Khodonov А.А., Demina O.V.. Laptev A.V., Belikov N.E., Lukin A.Yu., Fomin M.A., Shvets V.I., Varfolomeev S.D. Synthesis and Study of Spectral Properties of Labelled Isoxazole Derivatives. // Materials of Russian-French Joint Symposium on Organic Photochromes" Phenics in Russia" October 6-8, 2011, Chemogolovka, Russia, PP-3, P. 50.

87. Khodonov A.A., Belikov N.E., Demina O.V.. Laptev A.V., Lukin A.Yu., Fomin M.A., Levin P.P., Shvets V.I. Synthesis and Comparison of Properties of Photochromic Retinal Analogs. // Materials of Russian-French Joint Symposium on Organic Photochromes "Phenics in Russia" October 6-8, 2011, Chemogolovka, Russia, PP-4, P. 51.

88. Демина О.В., Лаптев А.В., Беликов Н.Е., Лукин А.Ю., Фомин М.А., Швец В.И., Варфоломеев С.Д., Ходонов А.А. Изучение спектральных свойств производных изоксазола с фотохромией меткой. // Тезисы докладов Международного симпозиума «Нанофотоника 2011» 3-8 октября 2011 г., Кацивели, Крым, Украина, С-4.

89. Лукин А.Ю., Лаптев А.В., Беликов Н.Е., Фомин М.А., Звездин К.В., Швец В.И., Демина О.В.. Бричкин С.Б., Николенко Д.Ю., Ходонов А.А. Синтез и исследование спектральных свойств новой гибридной фотохромной системы «спиропиран - квантовые точки CdSe» // Тезисы докладов Международного симпозиума «Нанофотоника 2011» 3-8 октября 2011 г., Кацивели, Крым, Украина, С-25.

90. Demina O.V., Laptev A.V., Belikov N.E., Lukin A.Yu., Shvets V.I., Varfolomeev S.D., Levin P.P., Khodonov A.A. Study of spectral properties of labeled isoxazole derivatives. Материалы 3-й Международного Симпозиума имени академика А.Н. Теренина "Молекулярная Фотоника" 24-29 июня 2012 г. Репино, Санкт-Петербург, Россия, С. 193.

91. Khodonov А.А., Laptev A.V., Belikov N.E., Lukin A.Yu., Demina O.V.. Shvets V.I., Levin P.P. Study of spectral properties of Substituted Formyl Spirobenzopyrans. Материалы 3-й Международного Симпозиума имени академика А.Н. Теренина "Молекулярная Фотоника" 24-29 июня 2012 г. Репино, Санкт-Петербург, Россия, С. 196.

92. Khodonov А.А., Laptev A.V., Belikov N.E., Lukin A.Yu., Shvets V.I., Demina O.V.. Levin P.P. Study of Photochromic Properties of 5-vinylspirobenzopyran Derivatives. Материалы 3-й Международного Симпозиума имени академика А.Н. Теренина "Молекулярная Фотоника" 24-29 июня 2012 г. Репино, Санкт-Петербург, Россия, С. 197.

93. Демина О.В.. Лукин АЛО., Лаптев А.В., Беликов Н.Е., Карпова М.Ю., Варфоломеев С.Д., Ходонов А.А. Антиагрегационные средства на основе 3,5-замещенных изоксазолов и их 4,5-дигидропроизводных. Материалы Международной Конференции «Биология -наука XXI века» 24 мая 2012 года» 24 мая 2012 года, РЭУ им. Г.В. Плеханова, Москва, С. 225-226

94. Демина О.В., Лаптев А.В., Лукин А.Ю., Беликов Н.Е., Варфоломеев С.Д., Швец В.И., Ходонов А.А. Влияние 3,5-замещенных изоксазолов и их производных на агрегацию тромбоцитов человека. Материалы Конгресса гематологов России. // Гематология и трансфузия 2012, Т. 57(3) прил. С.105.

95. Демина О.В.. Беликов Н.Е., Котова Я.Н., Пантелеев М.А., Швец В.И., Варфоломеев С.Д., Ходонов А.А. Сравнительные характеристики отмытых тромбоцитов человека, полученных разными способами. Материалы Конгресса гематологов России. // Гематология и трансфузия 2012, Т. 57(3) прил. С. 106.

96. Belikov N.E., Laptev A.V., Lukin A.Yu., Demina O.V.. Levin P.P., Shvets V.I., Khodonov A.A. Comparison of Properties of Photochromic Retináis. // Materials of 7th Phenics -Internatonal Network Symposium. Nantes, Loire Atlantique, France, November 28th - December lsl 2012, P. P6

97. Demina O.V.. Belikov N.E., Laptev A.V., Levin P.P., Shvets V.I., Varfolomeev S.D., Khodonov A.A. Study of spectral properties of labeled isoxazole derivatives. // Materials of 7th Phenics - Internatonal Network Symposium. Nantes, Loire Atlantique, France, November 28th-December 1st 2012, P. P7

98. Zvezdin K.V., Belikov N.E., Laptev A.V., Lukin A.Yu., Demina O.V.. Levin P.P., Shvets V.I., Brichkin S.B., Spirin M.Yu., Khodonov A.A. New hybrid photochromic materials for optical switching. // Materials of 7th Phenics - Internatonal Network Symposium. Nantes, Loire Atlantique, France, November 28,h-December 1st 2012, P. P8.

99. Demina O.V.. Belikov N.E., Laptev A.V., Lukin A.Yu., Shvets V.I., Varfolomeev S.D., Khodonov A.A. Photochromic labelled aggregation inhibitors of human plasma thrombocytes. Synthesis and study of spectral properties. // Materials of VII Moscow International Congress "Biotechnology. State of the Art and Prospects of Development", Moscow, March 19-22, 2013, parti, P. 84-85.

100. Demina O.V.. Belikov N.E., Varfolomeev S.D., Khodonov A.A. Synthesis of Isoxazoles with Photochromic Label. // Book of Abstracts of XV International Conference on Heterocycles in Bioorganic Chemistry (Bio-Heterocycles-2013), May 27-30, 2013, Riga, Latvia, P. 68 (poster PO-19).

101. Беликов H.E., Демина O.B.. Лукин А.Ю., Левин П.П., Швец В.И., Варфоломеев С.Д., Ходонов А.А. Синтез и изучение спектральных свойств фотохромно-меченных ингибиторов агрегации тромбоцитов плазмы крови человека // Сборник тезисов докладов на II всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики». Черноголовка, 19-24 мая 2013 г. С. 173.

102. Демина О.В.. Беликов Н.Е., Лукин А.Ю., Левин П.П., Швец В.И., Варфоломеев С.Д., Ходонов А.А. Синтез фотохромно-меченных ингибиторов агрегации тромбоцитов плазмы крови человека и изучение их спектральных характеристик. // Сборник тезисов докладов 1-ой Российской конференции по медицинской химии. Москва. 9-12 сентября 2013 г. С. 215.

Список сокращений

АА - арахидоновая кислота, СОХ - циклооксигеназа, СОХ-1 и СОХ-2 - изоформы СОХ, DMSO - диметилсульфоксид, EPI - адреналин, Fg - фибриноген, GPCR - G-protein coupled receptors, NCS - N-хлорсукцинимид, PRP - плазма, обогащенная Тц, TBAF -тетрабутиламмоний фторид, TP-рецепторы - рецепторы TxAj, TxS -тромбоксансинтетаза, НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты, Тц -тромбоциты.

Демина Ольга Викторовна Агрегация тромбоцитов человека: поиск путей ее регуляции и коррекции Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Усл.п.л. 3 Подписано в печать 13.03.2014 Заказ № 156 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, доктора химических наук, Демина, Ольга Викторовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет тонких химических технологий

имени М.В. Ломоносова

ДЕМИНА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

АГРЕГАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА: ПОИСК ПУТЕЙ ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ И КОРРЕКЦИИ

На правах рукописи

05201

02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

Научный консультант:

академик РАН, профессор Швец В.И.

Москва-2014

Содержание

Содержание...............................................................................................................................2

Список сокращений..................................................................................................................3

Введение....................................................................................................................................5

Глава 1. Современные тенденции в дизайне новых антиагрегационных средств...........12

1.1. Структурно-функциональная модель тромбоцита.......................................................13

1.2. Мембраносвязанные рецепторы тромбоцитов..............................................................29

1.3. Эйкозаноиды как модуляторы ответов тромбоцитов...................................................39

1.4. Возможные пути регуляции каскада арахидоновой кислоты синтетическими физиологически активными веществами.............................................................................52

1.5. Синтетические тромбоцит-активные вещества............................................................55

1.6. Замещенные изоксазолы, как новый класс тромбоцит-активных соединений.........84

Глава 2. Методы синтеза производных изоксазола и его 4,5-д и гидроаналогов...............95

2.1. Общие сведения...............................................................................................................95

2.2. Основные направления и подходы к получению соединений с изоксазольным скэффолдом.............................................................................................................................97

2.2.1. Реакции 1,3-дикарбонильных соединений или их эквивалентов с гидроксиламином или его гидрохлоридом (путь А)...........................................................98

2.2.2. Реакции [3+2]-циклоприсоединения нитрилоксидов к алкинам или алкенам. Общие сведения....................................................................................................................153

2.2.3. Реакционная способность и методы получения и генерации нитрилоксидов......156

2.2.4. Хемо-, регио- и стереоселективность реакции [3+2]-циклоприсоединения нитрилоксидов. Влияние структуры реагентов и условий проведения процесса..........164

2.2.4.1. Реакционная способность нитрилоксидов в реакции [3+2]-циклоприсоединения с производными алкинов и алкенов...............................................165

2.2.4.2. Региоселективность процесса [3+2]-циклоприсоединения нитрилоксидов с производными алкинов и алкенов.......................................................................................167

2.2.4.3. Стереоселективность процесса [3+2]-циклоприсоединения нитрилоксидов

с производными алкенов......................................................................................................286

2.3. Синтез производных изоксазолов, содержащих пиридиновый фрагмент..............296

2.4. Синтез 5-замещенных 3-пиридил-1,2,4-оксадиазолов...............................................305

2.5. Синтезы меченых ингибиторов агрегации Тц............................................................308

2.5.1. Методы введения тритиевой метки в молекулу ингибиторов агрегации Тц........309

2.5.2. Синтезы ингибиторов агрегации Тц, содержащих фрагмент ретиноевой кислоты..................................................................................................................................310

2.5.3. Синтезы ингибиторов агрегации Тц, содержащих фотохромные метки..............312

2.6. Подтверждение структур синтезированных веществ класса замещенных изоксазолов физико-химическими методами анализа. Анализ взаимосвязи строения синтезированных соединений и их физико-химических и спектральных

характеристик........................................................................................................................318

Глава 3. Антиагрегационная активность 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов. Кинетические закономерности процесса...........................................................................384

3.1. Исследование антиагрегационой активности 3,5-замещенных изоксазолов и их 4,5-дигидропроизводных in vitro.........................................................................................387

3.2. Определение структуры фармакофорного фрагмента антиагрегационных

средств класса 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов......................................................402

Глава 4. Исследование механизма действия 3,5-замещенных изоксазолов....................406

Материалы и методы исследования....................................................................................419

Выводы..................................................................................................................................455

Список использованной литературы..................................................................................457

Список сокращений и обозначений

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДМСО, DMSO - диметилсульфоксид

ДМФА, DMF -диметилформамид

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия

НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты

Р-рецепторы - рецепторы простаноидов;

ТГФ, THF - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

Тц - тромбоциты

Уф-Вид - спектроскопия в ультрафиолетовой-видимой областях ЭПР - электронный парамагнитный резонанс ЯМР - ядерный магнитный резонанс АА - арахидоновая кислота Ас - ацетил

ACS - American Chemical Society AC, AdC - аденилатциклаза ADP - аденозиндифосфат ADP-аза - аденозиндифосфатаза

Aliquat 336 - триоктил-(тридецил)бензиламмоний хлорид ATP - аденозинтрифосфат Bn - бензил

BOC - трет-бутилоксикарбонил

BRET - резонансный перенос энергии биолюминесценции Burgess соль - метил М-(триэтиламмониосульфонил)карбамат СаМ - кальмодулин

(с-)АМР - (циклический) аденозинмонофосфат CAN - Ceric ammonium nitrate CAS - Chemical Abstracts Service CAT - хлорамин-Т

cGMP - циклический гуанозин-3',5-монофосфат

cod - циклоокта-1,5-диен

СОХ - циклооксигеназа;

Ср* - пентакис-метилциклопентадиен

DABCO - 1,4-диазабицикло[2.2.2]октан

DAG - 1,2-диацилглицерин

DAST - диэтиламиносульфотрифторид

DDQ - Dichlorodicyanoquinone

DIB - PhI(OAc)2

DIEA, DIPEA - диизопропилэтиламин DME - 1,2-диметоксиэтан

DMTMM - 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиний хлорид

DTS - плотная трубчатая система

EPI - адреналин (эпинефрин)

Fg - фибриноген;

FMO Frontier molecular orbital

FRET резонансный перенос энергии флуоресценции

G-белки - GTP- связывающие регуляторные белки, в том числе GA, G„ Gs, Gp, Gp (Gq) GDP - гуанозиндифосфат

GPCR(s) - рецептор(ы), связанный(е) с G-белком GP - гликопротеин

GTP - гуанозинтрифосфат

HETE - гидроксиэйкозатетраеновая кислота

ННТ - 12-гидрокси-(52, 8Е,10Е)-гептадекатрненовая кислота

HOMO - высшая занятая молекулярная орбиталь

НРЕТЕ - гидропероксиэйкозатетраеновая кислота

ЮОС -Intramolecular oxime-olefin cycloaddition

INOC -Intramolecular nitrile oxide cycloaddition

ITP, IP3 - инозит-1,4,5-трифосфат

LCMS - тандемная система ЖХ-масс-спектрометрия

LT - лейкотриены

LUMO - низшая свободная молекулярная орбиталь

МАРК - митоген-активированная протеинкиназа

MDA - малоновый диальдегид

MIF - Macrophage migration inhibitory factor

MLCK - киназа легких цепей миозина

MPase - миозин-фосфатаза

NaAsc - натриевая соль аскорбиновой кислоты

NBS - JV-бромсукцинимид

NCS - JV-хлорсукцинимид

PAF - фактор активации тромбоцитов

PAI - ингибитор активации плазминогена

PC - фосфатидилхолин;

PDGF - митогенный фактор (фактор роста, производимый тромбоцитами)

PG(s) - простагландин(ы), в том числе серий D, Е, G, Н, I: PGD2, PGEb PGG2 , PGH2,

PGI2 (простациклин;

PI - фосфатидилинозит

PI3K - фосфатидилинозит-3-киназа

PIP5K - фосфатидилинозит-4-фосфат-5-киназа

PIFA - PhI(OCOCF3)2

PIP2 - фосфатидилинозитдифосфат

PIP3 - фосфатидилинозиттрифосфат

PKC - протеинкиназа С

PLA2 - фосфолипаза А2

PLC - фосфолипаза С

РРР - бестромбоцитарная плазма крови человека

PRP - обогащенная тромбоцитами плазма крови человека

Ру - пиридин

ROS - активные формы кислорода 0~0

R,R-DBFOX/Ph+ NiX2*6H20 -

рп 7ГР/

scC02 - суперкритическая С02

SPAAC - strain-promoted alkyne-azide cycloadditions

SPANOC - strain-promoted alkyne-nitrile oxide cycloadditions

SPS, SPOS - твердофазный органический синтез

Tf20 - ангидрид трифторметансульфокислоты

Ts - Tosyl

и-TsOH - и-толуолсульфокислота TxA2 - тромбоксан A2 TxB2 - тромбоксан В2 TxS - тромбоксансинтетаза vWF - фактор Виллебранда

Введение

Разработка отечественных инновационных, конкурентоспособных лекарственных препаратов для медицинской науки и практики, общественного здравоохранения и развития отечественной фармацевтической промышленности представляет несомненную актуальность и важность.

Для создания новых лекарственных средств, обладающих высокой эффективностью и минимальными побочными эффектами, необходим выбор мишени -белка-рецептора или фермента, который включен в патологический процесс и играет в нем главную роль или одну из главных ролей. Для определения мишеней необходимо знать, какие рецепторно-ферментные системы включены в патологические процессы, механизмы их функционирования и стадии прохождения сигнала в клетках для получения физиологического ответа. Расшифровка механизма функционирования жизненно важных рецепторно-ферментных систем, включающих высокоспецифичные белки - рецепторы во внешней клеточной мембране и группу сопряженных с ними ферментных систем и ионных каналов, и разработка эффективных методов их регуляции является фундаментальной научной и практической задачей.

Молекулярное распознавание лиганда (активатора или ингибитора) мишенью -рецептором является первой стадией практически всех процессов, протекающих в биологических системах. Геометрическая и химическая комплементарность малых молекул-лигандов с макромолекулярными биологическими структурами-мишенями -белками (рецепторами, ферментами), определяют пути передачи сигнала в клетках или пути метаболизма, вызывая, таким образом, физиологический ответ. Идентификация критических стадий передачи сигнала позволяет моделировать физиологический ответ клетки, выявляя возможные мишени - ферменты и/или рецепторы для создания новых синтетических ингибиторов и/или антагонистов или активаторов и/или агонистов, которые будут эффективны для лечения и предотвращения различных патологий человеческого организма.

Система гемостаза человека является одной из наиболее важных объектов исследования, так как до сих пор смертность от заболеваний сердечно-сосудистой системы, таких как тромбозы, инфаркты и инсульты, занимает первое место в мире. Накопление экспериментальных и теоретических знаний в области биохимии крови позволило выявить роль тромбоцитов (Тц) в системе гемостаза: они являются критическим звеном процесса нормального или патологического тромбообразования, так как агрегация Тц человека с образованием первичного «белого тромба» в месте повреждения сосуда является ключевой стадией процесса. Спонтанное

тромбообразование, приводящее к инфарктам, инсультам или к мгновенной смерти, возможно при патологиях сердечно-сосудистой системы. Поиск эффективных путей и средств целенаправленной коррекции системы гемостаза человека является одной из важнейших и актуальнейших проблем биоорганической химии, физико-химической биологии и медицины.

Агрегация Тц представляет собой яркий пример физиологического ответа и является удобной моделью для исследования антиагрегационной активности синтетических и природных соединений для выявления общих закономерностей механизма действия веществ на сигнальные пути тромбоцита и для выявления фармакофорных фрагментов молекулы, позволяющих создать новые лекарственные препараты с меньшими побочными эффектами. Наиболее вероятными объектами-мишенями действия антиагрегационных средств являются мембранные рецепторы, как начальное звено цепи передачи сигнала в клетку, и/или ферменты, участвующие в передаче сигнала по цепи: тирозинкиназы, фосфолипазы, ферменты каскада арахидоновой кислоты (АА). Наиболее важными рецепторами - мишенями Тц являются рецепторы тромбина, рецепторы коллагена, рецепторы АБР и рецептор тромбоксана Аг (ТхАг). Особое внимание уделяется рецептору ТхАг, поскольку ТхАг считается одним из мощных активаторов агрегации, опосредованно увеличивающим агрегацию, вызванную более сильными активаторами - тромбином и АОР. ТхАг и простациклин (РвЬ) - продукты метаболизма арахидоновой кислоты, входящей в состав фосфолипидов мембран клеток, играют важную роль в поддерживании системы гемостаза в норме: соотношение концентраций ТхАг, синтезируемого Тц, и РвЬ, синтезируемого клетками эндотелия, важно для тонуса кровеносных сосудов и предотвращения патологического тромбообразования. Эффект АБР, тромбина и ТхАг при определенных патологиях (диабет, гиперлипидемия, заболевание коронарной артерии) может привести к эндотелиальной дисфункции, характеризующейся понижением синтеза сосудорасширяющих и антиагрегационных факторов: простациклина и расслабляющего фактора, синтезируемого эндотелием. Разработанные ранее антиагрегационные средства, например, хорошо известный аспирин, в основном являются нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП), воздействующими на циклооксигеназу - первый фермент каскада арахидоновой кислоты, предотвращая синтез её метаболитов, в том числе ТхАг и РвЬ. По химической природе большая часть НПВП - гетероциклические соединения, и в настоящее время фармацевтические фирмы ведут разработки антиагрегационных средств на основе различных классов гетероциклических соединений, таких как

производные имидазола, индола, пиридина и т.д. Известно, что подобные ингибиторы изоформы 1 циклооксигеназы (СОХ-1) обладают рядом побочных действий, приводя к дисфункции системы гемостаза при длительном применении. В настоящее время наиболее перспективными прототипами антиагрегационных средств являются антагонисты рецепторов Тц, в том числе и рецептора ТхАг (ТР-рецептора), или ингибиторы двойного действия, одновременно воздействующие на ТР-рецептор и тромбоксансинтетазу (Тхв), на ТР рецептор и 5-липоксигеназу или на ТР рецептор и рецептор лейкотриена D4. Процесс взаимодействия Тц с потенциальными антиагрегационными средствами и их прототипами различной химической природы требует особого изучения для установления фармакофорных фрагментов молекул, позволяющих создать новые, более эффективные лекарственные препараты.

При установлении механизма действия биологически активных соединений часто используется стандартный прием - введение в молекулу лиганда различных меток (радиоактивных, флуоресцентных, фотохромных) или зондов с последующим анализом процесса связывания с генерированием определенного физического сигнала, пропорционального количеству связанного меченого лиганда. Особое значение для структурно-функциональных исследований биологических мишеней и других субстратов в последние годы приобрели новые типы меток, превосходящие по своим характеристикам уже ранее известные. Для установления механизма действия потенциальных антиагрегационных средств класса 3,5-замещенных изоксазолов, предложенных в данной работе, были созданы и разработаны методы синтеза нового типа фотохромных меток на основе спйропиранов, обладающих бинарным набором 2-х различных типов аналитических сигналов (поглощение в области 560-600 нм и индукция флуоресценции у фотоиндуцированной мероцианиновой формы). Такие исследования очень актуальны, так как совмещение в одной молекуле фотохромной метки и «адресного» фрагмента позволяет определить конкретные мишени действия исследуемого класса веществ, что очень важно для разработки новых лекарственных препаратов, необходимых для лечения и профилактики ряда тяжелых заболеваний.

Таким образом, разработка новых антиагрегационных средств на основе гетероциклических соединений, с учетом требований современной науки несомненно является актуальной задачей. Целью настоящей работы является:

- целенаправленный дизайн'молекул и разработка методов синтеза новых ингибиторов агрегации в ряду 5-замещенных 3-пиридилизоксазолов и их 4,5-дигидропроизводных,

- изучение механизма действия этого класса ингибиторов.

Реализация этой цели включала в себя решение комплекса следующих задач:

4. Исследование кинетических особенностей процесса агре�