Моделирование адгезионных взаимодействий клетка-клетка в сдвиговом потоке жидкости: приложение к описанию кинетических закономерностей агрегации тромбоцитов человека и латексных иммуноконъюгатов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ВЕРХУОА Владислав Витальевич

МОДЕЛИРОВАНИЕ АДГЕЗИОНШХ ВЗДИЮДВЙСТВИИ КЛЕТКА-КЛЕТКА В СДВИГОВОМ ПОТОКЕ ЮДКОСТ1: ПРИЛОЖЕНИЕ К ОПИСАНИЮ КИНЕТИЧЕСКИХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ЛАТЕКСНЫХ ЙЫЫУНОКОНЫГАТОВ.

02.00.15 химическая кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1992

/с , / ■ ■

Раоота выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета и в отделе биокинетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальна оппонента:

доктор химических наук С.Д.Варфоломеев кандидат химических наук П.В.Вржещ

доктор химических наук Б.И.Курганов

кандидат физико-математических наук С.Д.Захаров

Ведущая организация:

Институт химической физики РАН

Защита состоится _ в 16 часов на заседании

специализированного совета К.053.05.58 по химическим наукам при Химическом факультете Московского государственного университета по адресу: 119899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, аудитория СХА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета Московского государственного университета.

Автореферат разослан

^¿¿¿¿.у'_ 5992 года.

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук

И.А. АСрамонкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Различные формы клеточной активности обусловлены адгезионными взаимодействиями клетка-клетка и клетка-субстрат. Эти взаимодействия в значительной мере определяют процессы фертилизации, морфогенеза, пролиферации,

цитодифференцировки и метастазирования. Кинетика протекания адгезионных процессов определяет конечный результат таких приспособительных реакций как тромбообразование и защита организма от генетически и экологически чужеродного материала. Адгезия существенным образом зависит как от свойств клеточной мембраны, состава среды и внешних, сил, так и от аффинности и поверхностной концентрации адгезивных рецепторов. Изучение агрегации в потоках жидкости является тонким инструментом для исследования внутриклеточных биохимических процессов, определяющих адгезивные свойства клеток.

Несмотря на большое количество работ, посвященных описанию процессов коагуляции в коллоидных системах, с одной стороны, и выяснению кинетических механизмов специфического лиганд рецепторного взаимодействия, с другой, до настоящего времени не создано цельной теории, описывающей кинетику обусловленных адгезионными свойствами клеток процессов агрегации в биологических системах.

Целью работы явилось определение функциональной взаимосвязи между физико-химическими характеристиками суспензии клеток •и экспериментально регистрируемыми параметрами агрегации.

Научная новизна. Предложен и теоретически разработан новый подход к исследованию адгезионных взаимодействий биологических объектов в суспензиях в потоке жидкости. Установлена функциональная взаимосвязь мевду экспериментально определяемой начальной скоростью агрегации суспензий и физико-химическими характеристиками системы. Получены критерии устойчивости дублетов клеток в сдвиговом потоке жидкости. В качестве способа дискриминации параметров адгезионного взаимодействия клетка-клетка предложена аппроксимация полученных зависимостей для скорости агрегации уравнением Хилла и определены его параметры. В рамках подхода установлено, что для образования прочного дублета тромбоцитов в физиологических условиях достаточно одной 'фиОриногеновой связи.

Практическая ценность работы. Предложенная в работе модель способна описывать адгезионные взаимодействия 1п т1то (клетка-клетка, клетка-поверхность, вирус-клетка) и в биотехнологии

- г -

(адгезия микроорганизмов, аффинное разделение клеточных суспензий, иммобилизация эндотелиальных клеток в искусственных сосудах и др.). В рамках модели проведена теоретическая интерпретация результатов исследования агрегации тромСоцитов в стандартных оптических агрегометрах, используемых в клинике. Разработана и изготовлена лазерная установка со строго контролируемыми условиями сдвигового' потока, обеспечивающая высокочувствительную регистрацию в реальном масштабе времени процессов агрегации и позволяющая дискриминировать параметры адгезионного взаимодействия биологических объектов в суспензиях. Разработан количественный метод исследования агглютинации латексных ишуноканъюгатов в потоке, обладающий высокой антигенной чувствительностью.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VI Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Вильнюс, 1988), Научной конференции МФТИ (Долгопрудный, 1989), х Обьеданенном симпозиуме биохимических обществ СССР - ГДР "Механизм регуляции клеточной активности" (Ташкент, 1989), 1-м и 2-м Всесоюзных школах-семинарах "Тромбоцит как тест-система физиологических и патологических состояний человека" (Москбз, 1990, Ташкент, 1991), 2-м Научно-методическом семинаре "Иммуноцитохимические метода, моноклональные антитела и лектины в онкологии, гематологии и клинической иммунологии" (Киев, 1991), 4-м Всесоюзном съезде специалистов по клинической . лабораторной диагностике (Ивано-Франковск, 1991), Научно-техническом семинаре Российского общества "Знание" "Лазеры в биологии и медицине" (Москва, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, 3 работы находятся в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4-х глав, в которых представлены теоретические расчеты, экспериментальные данные и их-обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы из 284 наименований. Работа изложена на 490 страницах и включает 3 таблицы и 46 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Формулировка и описание модели.

Межклеточная адгезия в настоящей работе рассматривается как результат взаимодействия двух подсистем - химической и механической. Рецепторы (К) и специфические корецепторы к ним (Ь>, расположенные на поверхности каждой из клеток, составляют химическую подсистему. При столкновении двух таких клеток в потоке,

н и ь, находящиеся на разных клетках, образуют специфический комплекс к.ъ, связывающий клетки. Механической подсистемой является

сдвиговый шток, сближающий клетки до расстояния, при котором

стерически возможно образование межклеточных связей, и разносящий

их, если за время взаимодействия клеток в потоке этих' связей образовалось недостаточное количество. ,

В первом приближении клетки рассматриваются как жесткие

неинэрщюняые сфзрк одшакововго радиуса о, равномерно

диспергированные по объему. Частота столкновений (т) таких сфер в единице объема

16 -- .г

Я>=— 11 )

где с - сдвиговая скорость, N - число частиц в единице объема, е -эффективность столкновений. Начальная скорость агрегации суспензии

КЛьГКА N2

fue. I. Декартова (x,y,s) н сферическая (г,в,(р) системы координат для моделирования траекторий клеток в сдвиговом потоке.

V, соответствующая стадии дублвтоооразования клеток, равна г/г. В случае течения простого сдвига (Рис.!) скорость жидкости в потоке при г-4;» (и), тензор скорости деформации штока (Е) к угловая скорость твердотельного вращения (П) выражаются следующим соразом:

f О 0/2 О"

и=(0у,0,0); Е=|о/2 О 0 ; £>(0,0,45/2). 1 0 0 0.

Движение клеток описывается уравнениями траекторий та центров, учитывающими как неспецифическио силы взаимодействия между

клетка?™: гидродинамические lí)v> электростатические

вандерваальсовн (í ) и "стерические" (Г„), обусловленные полисахаридным покрытием клетки - гликокаликссм, так и 'специфическую кошоненту силы, связанную с механической деформацией межклеточных связей

-эг С(г)

— = (1 -А(г) )Сгз1л взхпфсоБф + - £(г) (2а)

в t ЫЩо

(1 -Б(г) )Сз1песозев1пфсозф (20)

ев

<П

В(г) 2 2

— = - Й(8ЛЛ ф-соэ ф) - Сз1п <р (2в)

2

где т) - вязкость жидкости, г (г - суша внешних сил,

А(г), В(г) -и С(г) - табулированные гидродинамические функции.

Рассмотрение неспецифической компоненты проведено для физических параметров характерных для тромбоцитов на основе трехслойной модели клеточной поверхности. Слой А толщиной ~7нм состоит из гидрофобной области (гидрофобные сегменты интегральных белков и углеводородные цепи фосфолипидвнх молекул) и двух внешних гидрофильных подслоев, содержащих полярные части лшшдных молекул и белковых сегментов.. Слой В толщиной "Юнм содержит полисахаридам цепи с эффективной концентрацией углеводных остатков ~0,24 М (1,5 остатка на 1 нм2 поверхности). Слой ■ В представляется как внеклеточная водная среда, содержащая относительно низкие концентрации (<Ю~4М) мукополисахаридов и других компонентов внеклеточного мактрикса, опосредущего межклеточную адгезию.

Было получено, что суммарная кривая энергии неспецифического взаимодействия не имеет барьера и характеризуется при (г о) = 23 нм небольшим энергетическим минимумом, значение которого (~Ы) сравнимо с энергией хаотического броуновского движения. При расстояниях (г-2о)<20 нм (удвоенная толщина гликокаликса, 2й) энергия отталкивания резко возрастает и затрудняет сближение клеточных мембран. При (г-2с)>26 нм взаимодействие тромбоцитов определяется, главным образом, вандерваальсовыми силами, а электростатические и стерические факторы являются несущественными.

Процесс образования континуально распределенных по всей зоне контакта межклеточных связей между клетками I и 2 (Рис. 2) представлен в два этапа: диффузионное сближение реагирующей пары к такому пространственному положению (образование т.н. "столкновительного" комплекса Е...I), при котором относительное расстояние и ориентация молекул позволяет протекать второму этапу -

собственно химической реакции образования КЬ:

'

Показано, что диффузионные константы скорости первого этапа (к., ,1с,) и механохимические константы скорости второго этапа (к3,к4) определяются следующими выражениями:

4тс

4%

ШШК&х+а^Г) " ХпСкГЬНад+а^Г) 0-1 2Сс"

кз=кзоет»>

2Д-

к2=-

О М

1 2бо2

(1-(г0-г)/2с-оов(э/с))

(4)

4 40 Чо М

(1-(г0-г)/2с-соз(з/с))

где ъъ. - эффективные коэффициенты латеральной диффузии, Ц0,

- внутренние константы, ан и а^ -эффективные радиусы к и ь, С -

КЛЕТКА «

жесткость

комплекса

га,,

КЛЕТКА Й2

Рис. 2. Область контакта пары клеток, связанных межклеточными рецептор -корецепторными ЕС, связями

а происходит благодаря упругой силы, определили

^ = -в„-,

характерный размер недеформированной нь, о - феноменологический коэффициент, з - координата дуги.

Плотности латеральных потоков J определяли как скорость переноса молекул через единицу длины дуги. Учитывался вклад в потоки двух основных типов сил: упругой силы, сдвигающей Ю, для уменьшения избыточной энергии в направлении значения координаты в , соответствующей недеформированному состоянию связи, и диффузионной силы, стремящейся восстановить однородную поверхностную концентрацию молекул. Положив, что плотности потока являются линейными функциями обобщенных сил для каждого типа молекул, предполагая при этом, что движение га. в направлении к действию тангенциальной составляющей

я

га.

а3

Зь!6

лт

=

»[1] ев

(5)

-(1-(г -г)/2о-оов(в/оЛз1п(в/о)[НЬ]

Таким образом, реакция образования межклеточных связей и, описывается системой уравнений:

»[Е]

о\

е[Ъ\

<»[Е.

+ —Л- = - кЛН][Ь] + — [К.. .1]

аз 1 2 .

■+ — - = - к.ШШ + -2

1 2

.13

<П

<п

= гк^шзш

(1с2-Ис3)[Н—Ы

Л га.]

+ —^ = к, №...13 аз 13

кДШ

.со следующими граничными

,дВ

э=0 оа 8=110

г=0

=0,

а[й...1]

э=0

Эз

=0, [И. э=0

■ Ь]

= [Е13 8=-л:с/г

•= о 8=тсо/г

и начальными условиями:

Ш(С,бМК]0, [1] (0,з)=[ЬЗо, [Р... .1] (о,з )=0, [Ий)(0,в)=0.

Специфическую компоненту силы удерживающую клетки в дуолете,

положили равной алгебраической суше проекций на ось дублета

нормальных составляющих гь, создаваемых каждой связью: %о/г

¡ьХ=-Шгв[ [КБ] (1-(г0-г)/2с-соя(з/с ) )сов2(г/с)з1п(з/с , (Г) о

Равновесный анализ модели. Равновесный анализ модели проведен в случае малоподвижных рецепторов ври избытке одного' из типов молекул (например, [й30»Ш0>. Получено выражение для .равновесного пространственного распределения связей [кь] (з>:

[РЬ]е(а)=-

2[Ь],

(.3)

%егр

'2ба

-(1-(г0-ге}/2с-ооа(Б/о) )£

+ 1

М

где степень адгезивности %=к40/к30(1+к2/к1Ш0), ге - равновесное межклеточное расстояние в дуолете, определяемое балансом сил, действующих на клетку. Зависимости, задаваемые (8), являются сечениями горообразного графика для №3^ в пространстве (Рис. 3). Характерный радиус такого тора определяется значением г0 - по мере уменьшения межклеточные связи смещаются в направлении от оси дуолета к периферии зоны контакта, при геыс тор вырождается. Максимальная концентрация РЛ наблюдается на краю контактной зоны, что соответствует ряду экспериментальных данных. Ширина зависимости

г

(8) существенным образом зависит от экспоненциального члена, в первую очередь от коэффициента до2/ьт, влияние предэкспоненты выражено в меньшей степени.

S 2U,

ч—т

Рис. 3. Межклеточные их связи концентрируются на краю контактной зоны в области наименьшей деформации is >. Показаны зависимости равновесной концентрации RL от значения cosis/e) при различных значениях жесткости связей 2бс2/И=Ю4 (I), 105 (2), IQ6 (3). Ш7 (4) X=LQ~7, го-ге/2о=0.05

В предельных случаях слабой ) и сильной (Х'<1) адгезивности получены и проанализированы аналитические выражения для гм, г0 и суммарного числа межклеточных связей в дублете пь.

Рассмотрение в рамках теории устойчивости условий существования связанного дублета в потоке при показало, что движение клкток в дублете носит колебательный характер. Разрыв связей (возрастающая амплитуда колебаний) происходит поэтапно: сначала рвутся связи, расположенные ближе к краю контакта, и потому подвергающиеся большей деформации. Дублет будет устойчив в

сдвиговом потоке в случае сильной адгезивности ;

при

одновременном выполнении двух услоеий: ге.-0.55го и 0<.5*1сгпь. Полученная опенка значения прочности дублета почти на три порядка превышает оценку прочности, сделанную в рамках статического подхода, основанного на простом балансе сил. ато отражает вклад динамики процесса образования и разрыва связей при взаимодействии клеток и приводит к выводу о необходимости существенно больших, чем в статическом подходе, критических значений г^ для полного разделения дублета.

Численное моделирование взаимодействия клеток.

Анализ численного решения систем (2), (б) позволяет выделить два основных типа траекторий клетки Н2: замкнутые (Образуются

комплексы кх, удерживающие клетки в связанном состоянии) и разомкнутые. Причем последние наблюдаются в двух случаях: а) клетки вообще не сближаются да расстояния г0; б) при <р>%/2 происходит сближение, начинает идти химическая реакция, однако, по мере вращения дублета при ср<т;/2 образовавшиеся связи рвутся под действием и клетки расходятся. Оуществют также критические (переходные) траектории между замкнутыми и разомкнутыми. На этих I траекториях происходит образование и последующий разрыв связей, что приводит, в конечном счете, к изменению траектории клетки N2, таким образом, что удаляясь при ф=ю довольно далеко от клетки N1 (г-2оэд), она все же заходит в область тг/2<ф<.0 (гь<0). К уже только в этой области происходит образование такого количества связей, которое оказывается достаточным для удержания в последующем кр<-тс/2) клеток в дублете..

При образовании связанного дублета клеток можно выделить следующие особые случаи. При относительно низких сдвиговых ■скоростях (качественно: |гь|=)г о~Мсг/юн)) сближение клеток происходит до расстояния 24. Это сближение довольно медленное, и образовавшиеся связи успевают сместиться из центра на периферию зоны контакта, где создается их повышенная концентрация.- При большой скорости сдвига СГ1«(о2Л)й)) сближение -

быстрое, до межклеточного расстояния . г-2с«2<1, однако, образовавшиеся связи в центре контакта рвутся, так и не успев сместиться. Основная масса связей при этом иногда образуется уже при о«р<%/2, когда клетки начинают несколько расходиться (г-2с=2<г). Наблюдаются затухающие колебания "клеток в дуолете. Если связей в равновесном состоянии накапливается достаточно много (пь»1), то амплитуда колебаний Дг мала (¿г«г -2о). Если связей мало (например, при низких концентрациях л и Ь) и при этом I^М*»! ■ то

амплитуда колебаний довольно большая (Дг^г -2с) и г »г . .

о е

Последнее состояние можно считать переходным между связанным и несвязанным дублетами.

При вращении дублета происходит накопление адгезионных связей в зоне контакта, обусловленое процессами переноса сеооодшх рецепторов. Картина накопления существенным образом зависит от величины коэффициента латеральной диффузии связей: при понижении возрастает концентрация комплексов ы, на периферии контактной зоны. Скорость накопления определяется значениями и При относительно низких коэффициентах диффузии <ок«сгй) на процесс накопления накладывается модуляция, обусловленная изменением г во

время вращения дублета. Такая аккумуляция комплексов RL может играть роль in' vivo. в процессах фагоцитоза, высвобождения эндогенных гранул, поляризации внутриклеточных структур относительно адгезионного контакта при морфогенезе, цитодифференцировке.

Определение эффективности столкновений.

Эффективность столкновений клеток в сдвиговом потоке определялась численно методом частиц. В плоскости х=:с0 задавалась равномерная сетка из начальных координат (x0,y0,z0> центров клеток N2 (Рис. П", удовлетворяющих условиям:

zo/c=-20, у0>0, zQ-0, ((y0/o}2+(z0/c)£)°-5<2, и просчитывалась траектория движения, определяемая (2) и (6) для каждого узла сетки. Сечение захвата А(у0,гп) определялось как область, являющаяся геометрическим местом начальных координат центров клеток N2, которые после взаимодействия с клеткой N1 образовывали дублет. Интегрированием - по области к и суммированием по четырем октанам получали значения эффективности столкновений:

з

е = —f Un dA, (9)

8с G .

А

где п - вектор нормали к поверхности клетки N1.

Важными параметрами, характеризующих столкновение клеток в потоке являются среднее время их взаимодействия tti¡ и

Рис. 4. Зависимости гидродинамически контролируемого среднего времени взаимодействия t* ! 1; клеток и относительного количества клеток s* (2), сблизившихся на расстояние (г,-2с) в сдвиговом потоке, от величины этого расстояния при о=Ю"6м,о=102сек~1 ,т]=!0"~^Па*сек

относительное количество клеток !s *), сблизившихся до критического межмеморашого расстояния (г,-2з) (Рис. 4). В случае протекания химической реакции между их поверхностями t. можно принять равным времени, в течение которого клетки находятся

на расстоянии, стерически допускающем образование межклеточной связи (т.е. при г£г ). Било показано, что безразмерная величина ^ся^ практически инвариантна относительно о и существенным образом зависит от (г0-2о). Максимальный рост и е* наблюдается при г -2с*20-100 нМ. Этот диапазон расстояний соответствует, с одной стороны, размерам адгезивных белковых рецепторннх комплексов, с другой - микровыпячиваниям и псевдоподиям ряда клеток. Значительное увеличение в* при росте (г -2с) подчеркивает возможное биологическое значение клеточных псевдоподий для процессов адгезии и агрегации: при характерном размере псевдоподий I мкм 8* возрастает в сдвиговом потоке почти на порядок.

Зависмости е от величины сдвиговой скорости для различных параметров системы являются однотипными (Рис. 5). На зависимостях условно можно выделить две области: вначале область медленного (логарифмиче ского), а затем - резкого уменьшения ("й-6) эффективности столкновений практически до нуля при возрастании а. В первой области е равно своему максимальному значению, а именно е*. Из совокупности полученных зависимостей следует важный вывод: эффективность'столкновений в первой области для жестких клеток любых размеров и адгезив-значения е для латексных конъюгатов при ных свойств зависит

СПС]=0.3 мкг/мл, [ГФ]-,,,,=0.05 мг/мг Л: только-от величины г .

суш, _ о

т}(Па«сек)=Ю (о), 3*10 0 (□), 10 ^ (Д). Обращает на себя внимание очень слабая зависимость е от аффинности рецепторов: при варьировании констант ц ,

Рис. 5. Зависимости эффективности столкновений £/е* от величины сдвиговой скорости й при различных значениях вязкости т}. Кривые - теоретически рассчитанные для жестких клеток в континуальной постановке задачи: о=2, к =Ю-7сек~1, к40=Югсек~1,

%твв=вь=1СГ /сек' 1К30=[Ь]0=Ю> 4м~2.

6=10 Н/м, го/с=2.05, е=10~6М, т)(Па*с<эк)=1 (I), Ю-1 (2), Ю~г (3), Ю-3 (4). В этих же координатах приведены экспериментальные

кдо в пределах, которые соответствуют изменению константы "равновесия на 12 порядков, значение с0 5 (значение а, при котором £=е*/2) возрастает-менее, чем на порядок. В то же время, в среднем, изменение любого другого из вышеперечисленных параметров системы на .порядок вызывает аналогичные изменения 0о 5.

Взаимодействие упругих деформируемых клеток.

Специфическое взаимодействие упругих деформируемых клеток в сдвиговом потоке рассмотрено в случае малоподвижных рецепторов. Упругие свойства описывались интегральным модулем Юнга Е и коеффивдентом Пуассона |1, что является удовлетворительным для малых клеток, таких как тромбоциты, с хороио развитыми цитоскелетными структурами. Анализ взаимодействия проведен аналитически в рамках гидродинамической теории смазки (гидродинамические взаимодействия считаются существенными только при (г-2о)->0) и контактной теории линейной упругости Герца.

Из самосогласованной системы уравнений (10) определена динамическая деформация (и(з,1;)«с) клеток при столкновении:

со

О

т = Щ5 §5 [зй3 й ]' р(3"*®)=0, эмо,Шбз=о,

в'+з

(Ю)

^ -л

1Т

где К(х) является полным эллиптическим интегралом первого рода, р(з',1;) - возмущенный профиль давления в прослойке жидкости между клетками, Н(зЛ )=(г(1;)-2о)-1-зг/с+и(8,1;) - форма возмущенного профиля поверхностей клеток, а - относительная скорость центров масс клеток. Получено значение максимальной деформации клетки, соответствующей точке наибольшего контакта з=0: и=Е/(1-цг)т|а. На основе вычисленной динамической деформации определялись возмущения, вносимые деформацией в неспецифическое и специфическое взаимодействия, а затем вычислялась эффективность столкновений е.

На зависимостях для в от величины сдвиговой скорости (Рис. 6), как и в случае жестких клеток, можно выделить две области: вначале область медленного, а затем - резкого уменьшения эффективности, столкновений практически до нуля. Степень упругости клеток (Е) существенным образом влияет на начальную скорость агрегации, значительно уменьшая е при высоких сдвиговых скоростях. Получена

Рис. 6. Рассмотрение взаимодействия клеток с учетом их упругих свойств. Показана зависимость эффективности столкновений а от величины сдвиговой скорости в при различных значениях жесткости

0.6-

0.0

0.2.

0.4

связей: в(Н/м)=10~4 (I), 10~а (2), Ю-2 (3). с=1мкм, 71=Ю~3 Па*сек, [К]о=[1.]о=1014м~г,

^=10 14м2/сек, к^Ю^сек 1 к,п=Ю7сек-1, к ^тп-2^"1

.9

,-4

10

100 1000

-1

ЬСЛ , Л.

0=2, го/с=2.02, :

с, сек

сильная зависимость эффективности столкновений в первой области для упругих клеток не только от г0, как в случае жестких клеток, но и от размера клеток (о), вязкости среды (17) и жесткости связей (б) (Рис. 6). От других физико-химических параметров системы эта зависимость выражена слабо и практически совпадает с полученной для жестких клеток.

' Вероятностное рассмотрение процесса образования связей.

Следствием перехода от континуального описания процесса образования межклеточных связей к дискретной постановке задачи явилось рассмотрение пространственно - временной вероятности этого процесса. Вычисления были проведены для адгезионного взаимодействия тромбоцит - тромбоцит, обусловленного образованием межклеточных фибриногеновых связей (Н-Р-Ю. Эффективность столкновений в этой постановке задавалась выражением:,

где р^.^.у) - вероятность образования прочного, дублета как функция времени от начала реакции ъ, продолжительности взаимодействия клеток и реакционного объема контакта V, - плотность функции распределения числа столкновений по ^ и V.

Было получено аналитическое выражение для среднего времени взаимодействия клеток в сдвиговом потоке: Определена

кинетика образования и объемная концентрация И-Р-Е, образовавшихся за время в' двух случаях. А. Процессы образования и-Р на тромбоците и столкновение тромбоцитов начинаются синхронно ^И;.,):

(II)

ÎRPR](ti) = [F]0(1 + la~i:S)/2(3exp((a+(j)ti)-(a+^)/:,pexp((a-p)tl)) (12)

c^-O.SUk^+iCjpKR^+k^j,), (Ма2-0.5к.,р1с2|ЛШ02Г°-5, константа

скорости оОразоБания и распада r-f к^куНг1 с-1, 1c_1f=0.5*10~2c_1 , константа скорости образования rf-r В. До момента

столкновения t»^ установилось определенное соотношение между 1RP] и [r] 7=[нл/(ш0-(ш), если 2*[rp]ï[R]0, или 7=1 [r)0-{rf] )/[rf], если [r]0<2*[rp):

[Rl0-y(exp((7-i ¡/(7+1 jk^CR]^)-! )

[RPR](t,t1)=--- при 7>1

- (7+1 ) (7'ехр( (7-1 )/(7+1 )k2p[R]0ti)-l )

[Rl^j,^ (13)

[RPRJ (t,t±)= --- при 7=1.

atR^kgptj+A

Рассматривая образование R-F-R как неоднородный марковский процесс, непрерывный во времени и дискретный в пространстве, было определено, что плотность распределения связей по контактам взаимодействующих тромбоцитов носит пуассоновский характер, а вероятность образования прочного дублета клеток равна:

г11<[RïR](t,t.)vN,)m

P(t,tl,v)=1- 2--- exp(-[RPR3{t,ti)vNÂ)1 (14)

m=0 m!

где лд- - число Авогадро, g - число RFR-связей, необходимых для удержания тромбоцитов в прочном дублете в сдвиговом потоке.

Аппроксимация зависимостей уравнением Хилла.

Из ' выражения (II) численным интегрированием рассчитаны

зависимости эф$ективностей столкновений тромбоцитов от концентраций

фибриногена J в растворе (случай А, Рис. 7) и поверхностных

рецепторов r в области контакта (случай Б, Рис. 8). Зависимости

носят насыщаемый характер и могут аппроксимироваться уравнением

Хилла: *

х d(e/e ),

s=8 —-- i П=4Х0 ç--(15)

xg ^ + xn dx ' 0.5

где z0 5 - концентрация агента, при котором s/s =0.5, n -

коэффициент Хилла. Были получены аналитические выражения для

([P]Q)0 5 и ([R]0)0 с и определены соответствующие значения

nem=i;39 и nslR)=2.57.

Показано, что увеличение сдвиговой скорости g ингибируе?

ТЯГ

.-2

10"

10

10-" 10

,-r

Iff

г*

10

,-5

[F]o,m

10-

эффективности e/8* от

Рис. 7. Зависимости

столкновений концентрации фибриногена р при различных значениях сдвиговой скорости о. Кривые - теоретически рассчитанные при Ш0=1.6»1(Г3 М, б(сек-1)=40 (I), 120 (2), 400 (3), 1200 ( 4). Символы -экспериментальные значения е для отмытых тромбоцитов при [дда=20 мкМ, о(сек-1)=Ю (О), 100 (□), 1000 (Д).

агрегацию даже при максимально возможной концентрации рецепторов в

области контакта №3 =1,6*10"

.-3,

М,

числу рецепторов на клетке

что соответствует максимальному "6»Ю4 (Рис. 9). в области низких значений сдвиговой скорости максимальное значение е=в* достигаеться при более низких концентрациях [К30 (<Ю_4М). Нами определено, что важной особенностью процесса дискретного образования связей является существенно более медленное уменьшение эффективности столкновений (~0~1) при увеличении сдвиговой скорости, чем при кон-

е/е

эффективности s/e* от

тинуальной постановке задачи..

Рис. 8. Теоретически

расчитанные зависимости столкновений концентрации рецепторов фибриногена R в области контакта для различных значений сдвиговой скорости о при 7=1: G(ceK~1 )=40 (i), I20 (2), 400 (3), I200 (4), 4000 (5).

0,8

0,4

Мо-И'н

Получен безразмерный параметр q=(27NAvk2J,[R]^)/(G(7+i )2), который может служить качественным критерием кинетического поведения агрегирующих тромбоцитов: при q«i е/е*«[, при q=0.475 е/е*=0.5, при q»I s/e*^I. Максимум величины d(e/s*)/d[R30 наблюдается при q=0.706.

Анализ зависимостей эффективности столкновений в случае конкурентного связывания ингибитора агрегации I . с рецептором фибриногена и в терминах уравнения Хилла позволил получить аналитическое выражение для (Ш0)0 ^ и коэффициента Хилла:

к

п=41п2 з-

А1

¡16)

где КА1 - константа ассоциации ингибитора, о - число молекул I, связывающееся с к, и определить его максимальное значение, равное 2.773.

8/8

Рис. 9. Зависимости эффективности столкновений в/г* от величины сдвиговой скорости о для различных концентраций рецепторов фибриногена н. Кривые - теоретически рассчитанные при вероятностном рассмотрении: 7=1, (I), 3.3*Ю~4 (2),

(5). Символы -значения е для тромбоцитов в плазме крови при [АДФНмкМ)=1 (0), 3- (Д), 8 (□), 20 (О).

3.3*10"* (4), 10 экспериментальные

3.3*10 5

Шо(М)=10 3 Ю-4 (3),

з,о з,;

!д С , 1СК"1)

Анализ функциональной зависимости эффективности столкновений в терминах уравнения Хилла предложен для дискриминации валентности лиганда и числа связей необходимых для удержания двух клеток в дублете в сдвиговом потоке. Показано, что степень нелинейности и, следовательно, коэффициент Хилла получаемых зависимостей для е возрастает как при увеличении ь, так и при росте g. При и=2 и коэффициенты Хилла гЫ.60§0,5 и 3.1в случаях зависимостей в от концентрации лиганда или рецепторов, соответственно.

Оптические характеристики суспензий.

В рамках теории Релея-Ганса-Дебая рассмотрены оптические характеристики суспензий тромбоцитов человека и полистирольных латексных иммуноконъюгатов. Установлена Функциональная взаимосвязь между полученными ' наш теоретическими величинами и турбидаметрически регистрируемыми параметрами агрегации, в первую

очередь, начальной скоростью агрегации. Рассчитаны значения сечений светорассеяния для единичных клеток (частиц латекса) и агрегатов различнго размера и формы. Учтены поцравки в эффективные сечения светорассеяния при турОидиметрической регистрации, обусловленные эффектом светорассеяния в нулевой угол (вперед). На ряде примеров показано, что образование агрегатов различной формы не должно существенно изменить оптические характеристики суспензий. Рассчитаны параметры суспензии, удовлетворяющие условию однократного светорассеяния.

Экспериментальная часть.

Процессы агрегации в сдвиговом потоке жидкости исследовались турбидимэтричоски на изготовленой нами экспериментальной установке. В качестве зондирующего излучения использовалось излучение Не-Не лазера низкой интенсивности (0.5 мВт). Сдвиговый поток Куэттовского типа формировался в кюветном отделении в узком зазоре между неподвижной оптически прозрачной поверхностью кюветы и внутренней фторопластовой мешалкой цилиндрической формы, .приводимой во вращении шаговым двигателем. Регистрировались начальные скорости агрегации суспензии отмытых тромбоцитов человека, богатой тромбоцитами плазмы крови, а также полистирольных латексных иммуноконъюгатов (о=0.6 мкм) к полисахариду менингококка серогрушш А. Агрегация тромбоцитов инициировалась добавлением в перемешиваемую суспензию индуктора агрегации аденозиндифосфата (АДФ), агрегация латексных коныогатов инициировалась добавлением раствора полисахарида. По начальной скорости агрегации в рамках предложенной модели рассчитывалась эффективность столкновений.

Определение параметров взаимодействия тромбоцитов.

Функциональный характер зависимостей, эффективности столкновений от концентрации адгезивного белка фибриногена р (Рис. 7) согласуется с теоретическим рассмотрением в рамках предложенной модели. Максимальное значение в для отмытых тромбоцитов достигается в области насыщения и равно 0.28Ю.02. Из совокупности экспериментов был определен коэффициент Хилла п8(р)=!-2*0.2. Полученная величина хорошо согласуется с теоретическим значением в приближении, когда для образования прочного дублета достаточно одной (§=1) межклеточной связи (п£ -39).

Зависимости эффективности столкновений от концентрации ДЦФ (£([АДф])) имеют гиперболический вид и аналогичены теоретически рассчитанным зависимостям е([1?]0) (Рис. 8). Максимальное значение е-наблюдается в области высоких концентраций индуктора (>Ю мкМ), где

достигается насыщение, и составляет 0.32+0.02. Среднее значение

коэффициента Хилла для зависимостей еЦАДФЗ), полученных при ч -I

значениях а=Ю-Ю,3сек составляет п£(Ддф)=1.6±0.2. Используя литературные данные по зависимости числа активированных рецепторов фибриногена и на поверхности тромбоцита от концентрации АДФ, рассчитали значения коэффициентов Хилла для £(Ш0), равные пс(к)=3.3-3.0. Полученные значения пс(Н) хорошо согласуется с теоретически рассчитанной величиной коэффициента Хилла 2.57 в случае .§=1. Анализ полученных зависимостей и ряда литературных данных позволяет сделать заключение о достаточности одной фибриногеновой связи для образования прочного дублета тромбоцитов в физиологических условиях кровеносного русла, а также дать оценку нижнего предела ее прочности Н.

Значения эффективности столкновений тромбоцитов от величины сдвиговой скорости при различных концентраций АДФ (Рис. 9) . плавно уменьшаются при высоких значениях б практически до нуля. Область снижения е для исследуемых концентраций 4ДФ в рамках модели соответствует 4*Ю3-1.2*!04 функционально активных рецепторов фибриногена на клетку. Значения е в области снижения обратно пропорциональны величине сдвиговой скорости, что свидетельствует о проявлении дискретного характера процесса образования межклеточных фибриногеновых связей.

Эффективность столкновений в области плато е=0.32±0.02 меньше теоретически рассчитанной в приближении жестких клеток. В рамках модели этот факт может свидетельствовать о деформируемости тромбоцитов при столкновении, следствием которой является разрыв связей и отскок клеток друг от друга во втором полупериоде их взаимодействия. На основании сравнения экспериментальных зависимостей с теоретическими кривыми дана приближенная оценка величины жесткости комплекса и-Р-и и модуля Юнга тромбоцитов: е~ю~3 н/м, Е"Ю6 Па.

Определение параметров агрегации латексннх иммуноконъюгатов.

Для оптимизации характеристик и повышения чувствительности латексных иммуноконъюгатов были изучены закономерности адсорбции 7-глобулиновой фракции (ГФ) менингококковой агглютинирующей сыворотки на поверхность латекса (Л), содержащей, в основном, к полисахариду (ПС) менингококка серогруппы А и определены оптимальные услоеия для исследования агрегации. Показано, что максимальное количество адсорбированной ГФ (0.04 мг /мг Л)

соответствует примерно одному монослою молекул в плотной

упаковке на поверхности частицы Л.

Данные по адсорбции коррелируют с результатами изучения начальной скорости агрегации латексных конъюгатов при добавлении ПС. Максимальное значение эффективности столкновений наблюдалось при суммарном количестве ГФ в суспензии (0.05 мг/мг Л), соответствующему максимальному заполнению поверхности Л. При дальнейшем повышении концентрации ГФ в суспензии наблюдается практически одинаковое для всех значений о медленное уменьшение е, видимо обусловленное блокировкой молекул ПС, находящихся как в растворе, так и связавшихся с адсорбированными на поверхности частиц Л, молекулами из раствора.

Зависимости эффективности столкновений от поверхностной концентрации ГФ в диапазоне 0=30-300 сек"1 лианеризуются в координатах Хилла. Коеффициент Хилла составляет 2,5-3.0, что соответствует теоретически рассчитанному значению п=2.57. Это соответствие означает в .рамках модели, что при данных гидродинамических условиях и вязкости среды (т)=1(Г"Па*сек) для образования прочного дублета латексных коньюгатов достаточно одной ПС связи. К аналогичному выводу приводит также анализ в терминах Хилла зависимостей эффективности столкновений от концентрации добавляемого в суспензию ПС в диапазоне 0=30-300 сек-1 (Рис. 10). Экспериментально определяемые коэффициенты Хилла составляют для этих зависимостей 1.3-1.6.

0.0 -0.5

-1.0 -Г. 5

-2.0 -2.5

Рис. 10. Количественное определение антигена по агрегации латексных имму-ноконъюгатов в сдвиговом потоке. Экспериментальные зависимости эффективности столкновений £ конъюгатов от концентрации полисахарида менингококка серо-группы А: [ГФ1сумм=0.05 мг/мг I, о(сек 1)=30 (О), 100 (О), 300 (Л).

-13

-12 -II -10 -9 -8 -? 1£ШС1,(М>

Следует особо отметить, что оптимизацией характеристик

адсорбции и подбором условий агрегации в сленговом потоке достигнута воспроизводимая чувствительность латексных конъюгатов на лазерной установке М ПС в растворе (Рис. ¡0), что сравнимо

с чувствительностью иммуноферментного анализа. Используемый метод-обеспечивает большой диапазон линейности, определяемый гидродинамическими условиями, для зависимости е от концентрации ПС (два порядка по антигену), что позволяет быстро <3-5 мин) и количественно определять антиген в исследуемой биологической ¡падкости.

Значения эффективности столкновений от величины сдвиговой скорости .при различных вязкостях раствора представлены на Рис. 5. Значения эффективности столкновений е латексных конъюгатов в области "плато" 5=0.45+0.02 соответствуют эффективной величине (г0-2о) для жестких частиц, кашли являются частицы Л, равной ~32 нм. В области 'высоких значений сдвиговой скорости происходит уменьшение е.' Это уменьшение ослее резкое, чем при теоретическом рассмотрении е- случае дискретного' образования связей, однако, несколько более медленное, чем в континуальной постановке задачи. На основании этого факта можно предположить, что начальный специфический этап взаимодействия частиц, обусловленный образованием специфических связей ,-ио-г^а по-видимому,

облегчает последующее неспецифическое взаимодействие сегменов ПС с поверхностью Л, приводящее к отклонению зависимостей в сторону "континуальности".

Снижение е начинается тем раньше при росте ч, чем выше вязкость раствора, что в рамках модели.свидетельствует о физическом разрыве специфических связей, либо, что более вероятно, механической десорбции 1е0 с поверхности Л. Полученная оценка прочности составляет г-™10"12 К, что существенно ниже прочности специфических сьязеа п коррелирует с величиной прочности адсорбции белков на лслистиролькые поверхности. При значениях гидродинамических сил превышающих оценку гь, были исследованы зависимости £ от поверхностной концентрации РФ, и получено качественное соответствие сделанному теоретически выводу о росте коэффициентов Хилла при росте д.

ВЫВОДЫ.

I. Впервые предложена и проанализирована теоретическая модель адгезионного взаимодействия клетка-клетка в сдвиговом' потоке жидкости, учитывающая процессы латерального переноса комплементарных рецепторов и корецептороз ' белковой природы,

кинетику образования межклеточных специфических связей, их механохимиче ские характеристики, а также неспецифические взаимодействия мевду клетками.

2. На основании модели определена кинетика накопления, равновесная концентрация и пространственное распределение адгезионных связей в зоне контакта. В рамках теории устойчивости определена прочность дублета клеток в сдвиговом потоке.

3. Методами численного моделирования рассчитаны траектории движения и определена эффективность столкновений клеток. Получена функциональная взаимосвязь между физико-химическими характеристиками клеток и начальной скоростью агрегации суспензии в сдвиговом потоке.

4. В явном виде получено уравнение для начальной скорости агрегации тромбоцитов, учитывающее вероятностный характер распределения фнбриногеновых связей по контактам столкнувшихся тромбоцитов. В качестве подхода для дискриминации параметров адгезионного взаимодействия клетка-клетка предложена аппроксимация полученных зависимостей для скорости агрегации тромбоцитов уравнением Хилла и определены его параметры.

5. Изготовлена экспериментальная лазерная установка, обеспечивающая строго контролируемые условия сдвигового штока, и подобраны оптимальные режимы ее работы для исследования агрегации биологических обьектов. В рамках теории Релея-Ганса-Дебая установлена взаимосвязь между изменением оптических характеристик и начальной скоростью агрегации суспензии.

6. Изучена агрегация суспензии тромбоцитов человека в сдвиговом потоке жидкости. Показано, что результаты эксперимента подтвервдают предложенную в работе теоретическую модель адгезиошйа взаимодействий. На основании анализа экспериментальных данных в рамках модели показано проявление деформируемости тромбоцитов при столкновении и установлено, что для образования прочного дублета клеток в физиологических потоках достаточно одной фибриногеновой связи.

7. Изучена агрегация латексных иммуноконъюгатов к полисахариду менингококка в сдвиговом потоке и на основании модели дискриминированы параметры их адгезионного взаимодействия. Определено, что процесс образования полисахаридных связей носит континуальный характер, показана возможность механической десорбции иммуноглобулинов при разделении дублетов.

8. Разработан количественный метод определения антигена,

основанный на турбидпметрической регистрации агглютинации латексных иммуноконъюгатов в потоках жидкости, обладающий высокой чувствительностью (5*IQ-13 М в случае полисахарида менингококка серогруппы А), экспрессностью и широким диапазоном линейности но антигену.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Вржещ П.В., Верхуиа В.В., Варфоломеев С.Д. Уравнение скорости агрегации тромбоцитов. // Дскл. АН сССР. 1990. T.3I3. С.726-729.

2. Вржещ П.В., Верхуша В.В., Варфоломеев С.Д. Кинетика агрегации тромбоцитов. // Биофизика. 19У0. Т.35. Еып.1. С. 637-641.

3. Верхуша В.В., Вржещ П.В., Варфоломеев С .Д. Математическое описание кинетики агрегации тромбоцитов. // Вестник АМН. 19Э1. N10. С.20-28.

4. Вржещ П.В., Татарзшцев А.В., Ершов Д.З., Верхуша В.В. Полиферментная система синтеза тромбоксана &2 в тромбоцитах, кинетика агрегации тромбоцитов. // Материалы VI Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология". Вильнюс. 1988. C.J3.

5. Вржещ П.В., Верхуша В.В., Зайцев С.В., Варфоломеев С. Д. Кинетика агрегации тромбоцитов в градиентном потоке. // Труды Московского физико-технического института. Лен. в ВИНИТИ. 1989. о.45-50.

6. Вржещ П.В., Татарщщев А.В., Ершов Д.У., Верхуша В.В. Кинетическое описание явления суперкоок»рзтя5н:с,и при агрегации тромбоцитов. // Тезисы докладов '.-сьединеннсго симпозиума биохимических обществ СССР - ГДР ".'Л'химгмы регуляции клеточной активности". Ташкент. 1989. С.;.Я.

7. Лебедев Е.С., Верхуша В.В., Ершов Д.Э., Татаринцев А.В., Тургиев А.с., Вржещ П.В. Исследование кинетики агрегации тромбоцитов. Создание агрегометров и их промышленное производство. // Тезисы докладов 4-го Всесоюзного съезда специалистов по клинической лабораторной диагностике. Москва. 1991. C.1U3-104.

8. Vrzheshch Р.Т., Verkhusha V.V., Varfolomeyev S.D. Kinetic description of the initial stage of platelet aggregation in the shear flow. // J. Theor. Biol. 1992. in press.

9. Verkhusha V.V., Vrzheshch P.V., Staroverov V.M., Varfolomeyev S.D. Cell-cell adhesion in the shear flow. // J. Chem. Biochem. Kinetics. 1992. V.2. in press.

10. Potanin A.A., Verkhusha V.V., Vrzheshch P.V. Coagulation of elastic particles in shear flow: application to biological cells. // J. Coll. Int. Sci. 1992. in press.