Аналитические погрешности при определении холестерина плазмы крови в популяционных исследованиях и способы их уменьшения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РСйСР ПО ДЕЛАМ НАУКИ И ВЫСШЕЙ ПИСШ

МОСКОВСКИЙ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УДК 643.0:647.928

КАРИКОВА Ирина Николаевна _

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ПОГРЕШНОСТИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ХОЛЕСТЕРИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ В ПОПУЛЯЩОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ И СПОСОБЫ ИХ УМЕНЬШЕНИЯ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 199Г

•V /

■ ^

Л - '

Работа выполнена в отделе стандартизации биохимических мот дов исследований Института профилактики вдинфекционных забо.гова1; Всесоюзного научно-исследовательского центра прсф-лактичес» медицины ЫЗ СССР.

Научные руководите: доктор биологических наук В.Н.Малахов кандидат химических наук В.И.Дворкин

Официальные ошоненти: доктор химических наук, профессор И.А.Василенко кандидат химических наук, старший научный, сотрудник С.Н.Ланин

• Ведущая организация - Институт элвмвнгоорганических совдинв! им. акад. А.Н.Несмеянова.

Защита состоится "19й июня_19Э1 г. в часов на засе;

кии специализированного совета К,063.41.04 в Московском инстит; тонкой химической технологам имени М.В.Ломоносова (117571, Моем пр-кт Вернадского, 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ ] Ы.В.Ломоносова (119831, Москва, Малая Пироговская, I).

Автореферат разослан "17 " мая_"1991 г.

Учений секретарь специализированного совета кандидат химических наук

И. А. Ефимова

¿остановка задачи. В настоящее время в широких масштабах проводятся популяционные исследования так называемых факторов ряща (повишенное артериальное давление, повышенный уровень общего холестерина1 в крови, курение и т. д.) у людей, отобрашшх случайным образом из населения (при этом образуются группы, называемые выборками из популяций). Наличие факторов риска уboj 'шввет вероятность возникновения сердечно-сосудистых заболевания и уровень смертности от них.

Один из важнейших факторов риска - содержание общего холестерина в сыворотке крови обследуемых: очень малые изменения его среднего содеркания в сыворотках крови выборки вызывают резкое изменение в смертности от сердечно-сосудистых заболеваний у обследуемых этой выборки. Поэтому важно точно выявлять различил мевду параметрами распределений содержаний общего холестерина исследуемых выборок. Между тем из-за больших масштабов исследований (число сывороток в одном исследовании может достигать десятков тысяч) анализ общего холестерина проводят в разных лабораториях упрощенными и разными методами, имеющими отличные друг от друга систематические погрешности, что является одной из главных причин арте-фактных различий в формах распределений полученных результатов и смещения их средних друг относительно друга. Это приводит к н^лра-вилышм выводам при интерпретации результатов, полученных из разных лабораторий.- Осуществляемые При приведении популяциогшых исследования меры по стандартизации применяемых методов (использование единого образца сравнения, контроль качества и т.п.) позволяют ограничить различия в систематических погрешностях, вызванных многими причинами, но не влиянием присутствия мешающих компонентов.

Одно из важнейших отличий популящокных биохимических исследований от принятых в аналитической химии исследовании совокупности объектов состоит в том, что в популяционных биохимических исследованиях,как правило, не обязательно получать точные значения дер-хагай основного вещества в индивидуальных объектах,. а достаточно . установить параметры распределения общего холестерина в выборке. Кромо того, в популяционных биохимических исследованиях трудно использовать стандартные способы устранения влияния мешавдих компонентов в каждой сыворотке, определение которых само rio с«бе

I. Холестерин содержится в сыворотке крови в свободной и этерифи-цировьннсй формах. ОСщгЯ холестерин - суммарное содержание свободного и этерифицировакного холестерина.

сложно и дорого.

Актуальность теш определяется, таким образом, сггецифичностьи объекта и задач гопуляционных биохимических исследований. Актуальным является учет и уменьшение различий в результатах определения холестерина, возникающих из-за применения разных методов его определения для выборок с различными распределениями содержаний мешающих компонентов, изучаемых в рамках одного популяционного исследования. Сходные задачи возникают и в других областях аналитической химии биологических объектов, биохимии и т.д.

Актуальной является также разработка методических подходов к оценке влияний тех мешающих компонентов, традиционные способы оценки которых оказываются неприменимы к такому специфическому объекту, как сыворотка крови.

Цель и задачи исследования: целы) настоящей работы являлась разработка способов уменьшения систематических погрешностей методов определения общего холестерина в сыворотке крови, обусловленных применением разных методов, при популяционных исследованиях.

Достижение указанной цели потребовало решения следующих задач:

(а) - разработка способа уменьшения систематических погрешностей при определении содержания общего холестерина в популящкшш исследованиях, основанного на внесении поправок в ходе градуировга методик;

(б) - разработка способа сопоставления результатов массовые определений общего холестерина, полученных разными методиками;

(в) - определение содержания общего холестерина в выборке и; популяции методиками, наиболее часто используемыми в популяционшс исследованиях, и оценка значимости различий полученных распределений содержаний;

(г) - определение содержаний компонентов сыворотки крови, мешаю щих определению общего холестерина, и оценка значимости и величин их влияния;

В этой части работы (г) решались методические задачи:

- разработка методики определения 7-дегидрохолестеринв в сыворот ке крови человека с целью оценки влияния его присутствия на метод определения общего холестерина;

- разработка методики определения холестерина и его эфиров присутствии триацилглицеридов высокой концентрации на основе ВЭЖХ

Научная новизна работы:

I. Впервые разработана методика одновременного определения хс

лэстэрзша и его эфиров в присутствии значительных количеств три-ащшглшдеридов с помощью ВЭЖС, включающая обработку образцов сыворотки крови триглицеридлипазой, на которую получено авторское свидетельство.

2. Разработана и апробирована методика определения 7-дегидрозоле сторина в сыворотке крови человека на основе ВЭЖХ. Показано, что содержание этого вещества в сыворотке крови человека невелико и практически не влияет на определение общего холестерина.

3. Впервые для оценки влияния мешающих компонентов на результаты анализа применен способ многомерного линейного регрессионного анализа со случайными регрессорами, основанный на результатах исследования большого числа сывороток. С помощью этого способа оценено влияние различных компонентов сыворотки крови (эфиров холестерина, общего белка, билирубина, триацилглицеридов, глюкозы) на определение общего холестерина разными методиками.

4. Впервые обнаружено, что присутствие холестерина в сыворотке крови в форме эфира арахидоновой кислоты занижает результаты определения общего холестерина химическими методами, не предусматривающими гидролиза эфиров холестерина, основанными на реакции Ли-бермана-Бурхарда, в отличие от известного завышеная результатов из-за присутствия холестерина в форме эфяров других кислот. Показано, что присутствие триацилглицеридов ^анижьет результаты определения общего холестерина изученными ферментными методами.

Практическая ценность работы состоит в следупцем: I. Методика определения холестерина и его эфиров может использоваться при определении этих веществ в сыворотках крови с высоким содерханием триацилглицеридов.

" 2. Методика определения 7-дегидрохолестерина может использоваться при определении этого вещества в сыворотках крови человека.

3. Разработанный подход к оценке влиямгй мешапщи компонентов на определение содержания основного веществ, основанный на использовании многомерного линейного регрессионного анализа со случайными регрессорами данных анализа большого числа объектов, мохет Сыть ' применен для оценки влияний в объектах, для которых приготовление Образцов известного состава затруднено. В частности, он был применен в лаборатории биофизических методов диагностики НИИ физико-химической медицины ЫЗ РСФСР для выяснения мешающих влияний при определении суммарного содержания общего холестерина и триацилглицеридов разработанным в этой лаборатории флуоресцентным методом.

- б -

4. Предложен простой способ сопоставления•результатов массовых определений общего холестерина, полученных двумя разными методиками (I и 2), в двух выборках (А и В) с неконтролируемым распределением содержаний мешающих компонентов.

Способ включает: а) определение содержаний общего холестерина одной из методик (2) в малой подвнборкэ из выборки (А), проанализированной другой методикой (I); б) нахождение с помощью регрессионного анализа уравнения связи между результатами, полученными этими методиками, по данным измерения общего холестерина обеими методиками в малой подвыборке; в) последующий пересчет по найденному уравнению с^язи остальных результатов определения общего холестерина в выборке В.

Способ мокет быть использован в различных областях аналитической > мии к биохимии для сопоставления данных, полученных разными методами, ь частности, он был использован при сопоставлении содержаний гормонов крови, измеренных в лаборатории биохимии факторов риска НИЗ ВНИГЛ! МЗ СССР и Медицинской академии в Кракове.

б. Предложен экспрессный способ уменьшения систематических ло-грешностей методик определения общего холестерина, используемых в одном популяционном исследовании, основанный на введении расчетного поправочного коэффициента или использовании для градуировки образца сравнения на основе сыворотки крови с контролируемым содержанием общего холестерина и мешавдих компонентов. Способ может применяться в лабораториях, проводящих, массовые определения общего холестерина.

На защиту выносятся:

1. Методика одновременного определения холестерина и ого эфиров в сыворотке крови человека с помощью ВЭЖХ в присутствии многократного избытка триацилглицеридов, включающая предварительный ферментативный гидролиз триацилглицеридов.

2. Методика определения 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека, основанная на предварител ;ом концентрировании, отделении с помощью ВЭЖХ более полярных органических компонентов и последущем фотомэтрировании раствора в УФ-области.

3. Применение способа многомерного линейного регрессионного анализа со случайными регрессорами для оценки влияния мешающих компонентов на результаты анализа веществ, для которых невозможно получить адекватные стандартные образцы состава.

' 4. Простой статистический способ сопоставления результатов мае-

совых популяционшх определений общего холестерина разными методиками в двух выборках с ноконтролируекьгм содержанием мешающих компонентов, основанный на статистическом исключении влияния различия методик и неконтролируемых мешакщих компонентов.

Б. Экспрессный градуировочный способ уменьшения систематических погрешностей методик массовых определений общего холестерина, основанный на введении расчетного поправочного коэффициента или использовании для градуировки образца сравнения на основе сыворотки крови контролируемого состава.

Апробация работы и публикации: результаты работы били долоквны на мездународном симпозиуме "Хроматография в биологии и медицкле" (Москва, 1986 г.), на Всесоюзных совещаниях по стандартизации бдо-химических методов исследования (Фрунзе, 1986 г., Нальчик, 1989 г.), семинар» отдела стандартизации биохимических методов исследований; межотделелческой конференции Института профилактики неинфекционных заболеваний ВНИЦПМ МЗ СССР; семинаре кафедры аналитической химии Московского института тонкой химической технологии (1991 г.). Основное содержание работы представлено в 9 публикациях, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем работа: Диссертация состоит из вводения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, выводов и приложения. Диссертация изложена Ha./ßß-стр., содержит35 рисунков и /J таблиц. Библиография включает/iß? наименований работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ

Исследуемая выборка состояла из 374 сывороток крови одной из типичных популяций.

, В качестве образцов сравнения использовали растворы холестерина ß безводном этаноле или изопропаноле (ОС) и слитые донорские сыворотки крови (ОСС), приготовленные и аттестованные в отделе стандартизации биохимических методов исследований ВНИЦ JIM ЬВ СССР.

Определение общего холестерина в сыв: .огкзх поводили методами: I. Метод экстракционный химический с гидролизом эфнров холестерина (Duncan I.W., Mather A., Cooper G.R., 1980). Выбор его был обусловлен тем, что метод обладает высокиш правильностью и воспроизводимость» и является общелринятым для получения действительных значений (далее обозначен MC).

2. Прямой (без предварительной обработки образца) химический, основанный на реакции холестерина с сэрной кислотой в присутствии уксусной кислоты и уксусного ангидрида (Ilea S., 1962), с градуи-

- 8 -

ровной по ОС (Метод AI) и по ОСС (Метод А2).■

3. Экстракционный (с предварительной обработкой образца изопропа-нолом) химический на автоанализаторе "Technlcon" (согласно инструкции к автоанализатору AAII), градуированный по ОС (Метод BI) и по ОСС (Метод В2).

4. Ферментный на автоанализа торе "Hitachi", градуированный по ОСС (метод С2). Значения, принятые в качестве полученных методом CI (градуировка по ОС), рассчитывали по данным независимого эксперимента .

5. Ферментный на автоанализаторе "Centrilichem", градуированный по водным ОС (Метод DI) и по ОСС (Метод D2).

Ферментные методы основаны на гидролизе эфиров холестерина и окислении образующегося холестерина с помощью ферментов и последующем определении выделявдегося шроксида водорода по реакции с 4-аминоантипиринэм и фенолом.

Выбор методов A-D ("рутинных") определялся тем, что их обычно используют при массовых определениях: общего холестерина.

Определение содержания мешающих компонентов проводили: свободного холестерина, триацилглицеридов и глюкозы - ферментными методами на автоанализаторе "Hitaciii-705" (наборы, реагентов фирмы "Wako"); билирубина - фотометрированием щелочного азопигменга (Fog J., 1958); общего белка - биуретовым методом (Henry- E.J., 1964); индивидуальных эфироз холестерина - методом ВЭЖХ на обращенной фазе C-I8 (образцы с повышенным содержанием триацилглицеридов анализировали согласно разработанной . нами методике); 7-дегидро-холестерин - с помощью разработанной нами методики на основе ВЭЯХ.

Расчеты проводили на ЭВМ "IBM PC-XT" (с использованием статистических программ "SPSS РС+", "Statgraphic") и "Реалите 2000".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Разработка новых аналитических методик:

Методика определения 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека состоит в гидролизе эфиров водно-спиртовым раствором КОН, экстракции гексаном, отборе и высушивании органической фазы, растворении осадка в малом количестве изопропанола и хроматографи-ровании на колонке с обращенной фазой C-I8, с фотометрированием при 282 нм. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацэтонит-рил-изопропанол=35:65 (по объему). Предел обнаружения метода составляет 0,05 мкМ, относительное стандартное отклонение - 0,04.

Мэтодика определения холестерина и его эфиров в присутствии

триацилглицеридов в высокой концентрации, заключается в обработке образца сыворотки крови триглицеридлипазой с целью гидролиза три-ацилглицеридов, экстракции изопропанолом, центрифугировании и хро-матографироваяии надосадка с. фотометрированием при 205 нм. Использовали те не условия хроматографнрования, что и в методике определения 7-дегидрохолестерина. На методику получено авторское свидетельство.

2. Результата определения общего холестерина разными методами в сыворотках крови. Характеристики полученных распределений содержаний общего холестерина в исследуемой выборке приведены в табл. I. В случае кавдого из методов распределения оказались близкими к нормальному, что дало возможность применения разработанной для нормальных распределений статистических методов обработки.

Таблица I

Характеристики распределений содержаний общего холестерина, полученных исследуемыми методами.

параметры метод с, ММ в.мМ асимметрия эксцесс а Р

МО 5.6Б 1,06 0,63 2,15 > 5% <0,0001

• А1 5,73 1,08 0,60 1.71 > 20% <0,0001

А2 5,50 1,03 0,50 1,19 ■ > 20% <0,0001

В1 5,98 1.Н 0,48 0,52 > 5Я <0,0001

В2 5,50 1,00 0,52 0,96 > 5% <0,0001

С2 5,60 1,09 0,58 1,92 > 20% 0,0024

' И Б,29 0,96 1,34 -2,25 > 20% <0,0001

Б2 5; 25 0,96 -0,20 -3,23 > 20% <0,0001

Здесь С- среднее значение распре делени; содержаний; в - стандартное отклонение; а - уровень значимое.и выполнения гипотезы о нормальности распределения (гипотеза принималась при аУЬ%): р -вероятность того, что средняя величина распределения не отличается от действительной.

Средние величины результатов определения общего холестерина, полученных рутинными методиками, отличаются от среднего действительных значений содержания общего холестерина и друг от друга статистически значимо, т.е. каждая из этих методик имеет систематические погрешности, без учета которых сравнение результатов, полученных

разными методиками, некорректно. Кроме того, распределения различается по форме, т.е. имеют разные асимметрии и эксцессы.

Результаты расчетов коэффициентов уравнений линейной регрессия вида С0= аС_.+ Ъ (где С0 и С^ - действительное и измеренное рутинным методом 3 содержание общего холестерина, соответственно) приведены в табл.2. Линейность зависимости подтверждена анализо» остатков.

Таблица 2.

Результаты расчета уравнений линейной регрессии между значениями общего холестерина, полученными рутинными методами и МС?

Метод 5Г г а Ь.мМ

А1 0,063 0,939 1,061 -0,42

А2 0,031 0,967 • 1,053 -0,13

В1 0,052 0,896 1,053 -0,63

В2 0,026 0,950 1,096 -0,37 .

С1 0,062 - 1,034 -0,05

сг 0,038 • 0,939 1,021 -0,06

ш 0,034 0,888 1,128 -0,26

ш 0,022 0,913 1,090 -0,10

#зр МС составляло 0,017.

3. Способ оценки влияния мвшаюсмх компонентов на результа1 определения общего холе стерта разными методами. Предложен спосс оценки влияний мешающих компонентов ' на метода определен! основного вещества, заключающийся в предварительном определении большом числе образцов содержания общего холестерина руткнш методом З (С^). ЫС (Сд) и мешающих компонентов (С^) и последуют! нахождении зависимости:

ггсгс0Л ^.С^.

где <1. - величина, связанная с присутствием в пробе неизвэстн мешающих компонентов, коэффициент (ниже называется коэффкцие том влия1щя) показывает величину влияния 1-го мешающего компонен на метод 3.

Коэффициента к^ и определяли методом многомерного линей регрессионного анализа со случайными регрессорами. Одновремэа проверяли принятые, гипотезы о взаимной независимости и линейности связи величин С, и 1Ь (анализом остатков и друг

способами), а также оценивали погрешности определения величин к^.

В отличие от известных способов нат.окдения коэффициентов (Бэрнштейн И.Я., Каминский Ю.Л., 1983), предусматривающих изготовление образцов известного состава, применение такого способа позволяет определять коЕффицшнты к^ и ^ в случаях, когда приготовить образцы известного состава затруднительно (например, в случае сыворотки крови).

4. Мешающие компоненты и их влияние на результата определения общего холестерина. Мешающие компоненты балл отобраны в основном по литературным данным: общий белок, билирубин, гриацилглицериды, глюкоза, айфы холестерина, 7-двгидрохолестерин.

Проведение измерения показали, что содержание 7-дегидрохолесте-ринэ в сыворотках крови человека мало, и влияние этого вещества на метода определения общего холестерина незначимо.

Содержание остальных перечисленных мешвнцих компонентов измерили во всех сыворотках исследованной выборки. • Методом многомерного линейного регрессионного анализа получены следующие уравнения вида (I) для исследуемых методов:

%Г п-1Сбил + 3-7Рпхс " ^ахс ~ <2>

Ив!- 1,9-Ю-гСбел + Ю.30бил- 7,3.10-гС0 - 3,0Ра1С '

°СГ 7-1'1°;3сбел " 7'4Сбил ЬЗР^ - 1,З.Ю-гС0 - 1,04 (4)

%Г 2'1Рахс+ ^лхс* 2'2Р0Л1С- ^(Г ^.З-Ю"3^ - 0,77 (5

где Сбил, Сд и С?г- содержание билирубина, общего холестерина и триацилглицеридов, соответственно, в мЧ, С0дл - содержание белка в г/л, Рахс, Рмс. Ролхс. Рд^д - соответственно отношения содержаний эфиров холестерина: арахидоната, линолеата, олеата и пальмита-та к содержанию общего холестерина. Содержание эфиров холестерина рассматривали в преобразованной форме - в виде отношения к содержанию общего холестерина, - поскольку между ними л содержанием общего холестерина существует линейная зависимость, что противоречит принятому для математических расчетов предположению о независимости регрессоров.

В уравнения включены составляющие с коэффициентами, отжчягии-

мися or О достоверно (р > 0,90). Влияние глюкозы оказалось незначимым для всех методов в исследованом диапазоне содержаний.

Гипотеза о линейном характере связи Dj с величинами Cq, С <5 ил' °бел- рахс- рпхс- ролхс рлхс 10Р°Ш0 выполняется, что было проверено анализом остатков при регрессионном анализе.

Уравнения (2-5) содержат новую информацию о мешапцих компонентах: а) присутствие холестерина в виде эфира арахидоновой кислоты занижает результаты определения общего холестерина исследованными химическими методами, в отличив от присутствия его в виде эфиров других кислот; б) присутствие триацилглицеридов оказывает влияние на исследованные ферментные методы; в) индивидуальные эфиры холестерина влияют на ферментные методы.

В то же время известные из литературы коэффициенты влияния (например, билирубина и общего белка) совпали с рассчитанными нами.

5. Способ сопоставления результатов, полученных разными методиками. Для сопоставления результатов определения общего холестерина в выборках, проанализированных разными методами, предложен способ приведения распределений всех полученных данных к сопоставимым, т.е. либо пересчет всех распределений результатов к тем, которые были бы получены МО, либо аналогичный пересчет распределений определенных разными методами значений общего холестерина друг к другу.

Для этого необходимо провести определение содержания общего холестерина С0 МО (или сравниваемым рутинным методом) в случайной малой яодвыборке из анализируемой рутинным методом J выборки, найти вид зависимости:

С0 = f(Cd) (6),

гдо Cj - значения общего холестерина, полученные методом j, и пересчитать результаты определения общего холестерина рутинным методом к действительным (или получе:. им другим рутинным методом) по отой формуле. Зависимость (6) находили с помощью регрессионного анализа с учетом случайных ошибок измерений как С.., так и CQ.

После пересчета выборки можно сравнивать с применением обычных статистических методов.

С использованием описанного способа наш был проведен пересчет распределений содержаний общего холестерина, полученных рутинными методами, в исследованной выборке, к действительному по формуле (6). Объем подвыборки составлял 10О проб. Распределения значений содержания общего холестерина, полученных рутинными методами, и

пересчитанных к действительным по формулам вида Сд = Г(С^), совпали с распределением значений общего холестерина, полученных МО, в широком диапазоне содержаний. Результата такого пересчета проиллюстрирована на рисунке на примере метода 01.

Зависимость погрешности пересчета от объема подвыборки для подбора его в конкретной задаче нашли с. помощью математического моделирования.....

--МС :----метод

■ -- - распределение значений содержания общего

холестерина, полученных методом М и пересчитанных к действительным по (6).

Предложенный способ позволяет сравнивать значения общего холестерина, полученные разными методами, в выборках с любыми распределениями мешающих компонентов и общего холестерина.

6. Способы градуиров!си, позволяющие уменьшить систематические погрешности методов определения общего холестерина. 'Для близких по содержанию мешаюцих компонентов и общего холе стерши популяций можно уменьшить систематические погрешности рутикных методов определения общего холестерина, градуируя эти методы определеннмм

образом. •

При определении содержания об/даго холестерина в массовых исследованиях часто используется градуировка по одному образцу сравнения, например, в большинстве методов с применением автоанализаторов, однако целенаправленный выбор состава матрицы образца сравнения при этом не проводится.

6.1. Градуировка методов определения общего холестерина по одному образцу сравнения. Поскольку уравнения регрессий С^=аС (градуировка по ОС) имеют значительный свободный член, вообще говоря, градуировка по одному образцу сравнения не может привести к полному устранению расхождений между результатами определения общего холестерина рутинными методами и МС. Тем не менее, градуировка по одному ОСС уменьшает систематические погрешности вблизи точки пересеченля прямых, построенных по уравнениям регрессии (градуировка по ОСС) с прямой С^=Сд. Положение этой точки определяется содержанием общего холестерина к мешающих компонентов в ОСС. Пользуясь уравнениями регрессий, приведенными в табл. 2, легко показать, что при использованном в работе ОСС (неконтролируемого состава) точка пересечения лежит в области 2-4 мЫ. В других областях концентраций существенный выигрыш в правильности отсутствует.

Довольно часто в популяционвых исследованиях изучаются средние величины распределений результатов, поэтому в этой главе ш рассмотрели способ коррекции именно этих величин. В этом случаэ целью градуировки является смещение среднего распределений звачений общего холестерина, полученных рутинным методом, к среднему распределения действительных величин.

Пусть С^ - среднее значение результатов определения общего холестерина, полученных рутинным методом, в выборке; Ср - среднее действительных значений общего холес. ,рина в той же выборке. Тогда для пересчета С^ к Ср можно в процессе градуировки умножить все С^ на коэффициент

а.| - С^, СП

соответствующий данному методу анализа.

Описанный способ пересчета с применением коэффициента а^ можно осуществить по меньшей мере в двух вариантах: а) В первом варианте способа следует приписать ОС концентрацию

сос - ароо- <0)

где Сос - действительное содержание общего холестерина в ОС.

Вычисленные по (7) коэффициенты а^ и их стандартные отклонения для исследованных методов J для исследованной выборки имеют следующие значения: метод А1 - 0,987 (в=0,007); В1 - 0,948 (в=0,005); 01 - 1,025 (в=0,004); М - 1,071 (в=0,004).

б) Во втором варианте способа предлагается использовать для градуировки ОСС с заранее заданным составом матрицы, для которого выполняется услови .

Варианта состава ОСС, удовлетворяющие реиешпо системы уравнений (9), пригодны для всех четирвх исслодуемых рутинных методов.

С точке зрения уменьшения можсорийной погрешности анализа предпочтительно применение градуировки по ОСС по сравнении с 00 (по нашим дшным, мэксерийные о.с.о. гютоверно зтиэныяастся в этом случае с 0,034-0,063 до 0,020-0,026 ми разных рутинных методов).

Очевидно, что в реальной ситуации величины а^. для каждой вновь исследуемой популяции неизвестны, и применение градуировки по образцам сравнения для уменьшения систематических погрешностей возможно только в том случае,. когда межио с достаточной точностью оценить эти величины до начала исследования.

Проще всего принять одну и ту же величину а^ для широкого круга исследуемых популяций. Возможность этого определяется рпзбросом величин амежду популяциями, который мы оценшп. следугшмм образом. Били собраны литературные данные о содержании мегаодих компонентов и общего холестерина в сыворотках крови различных популяций (число популяций составляло от II до 80 для разных параметров); рассчитаны мекпопуляционшэ средние значения для каждого метанцего компонента и общего холестерина, их стандартные отклонения, (средние значения для каждой популяции при этом рассматривали как единичные измерения). На основе этих данных и ранее наГл^чных коэффициентов ^ и оценили средние

коэффициенты а^ (а_. р) и их стандартные отклонения для совокупности популяций белого взрослого населэния (табл. 3)

2.Поправку к результатам можно вносить как в предложенной мультипликативной, так и в других формах (например, аддитивной). В'случпе незначительной коррекции (СССр)/^ « 0,1) форма

поправк-л несущественна. В противном случае мультипликативная коррокимя лучше соответствует логнормальному распределению определяемого компонента в популяции.

О)

Были сделаны приближенные оценки величин а^ для других, кроме описанных выше, популяций. Для детских популяций они мало отличались от найденных нами а^ р. Для популяций обследуемых с заболеваниями, приводящими к сильному изменению содержания одного из мешалцих компонентов, значения а^ значительно отличаются от а^ р.

Величины а .

«) ■

Таблица 3. и стандартные отклонения для нкх.

метод /I В1 С1

0,986 0,923 1,002 1,056

в 0,017 0,029 0,039 0,036

6.2. Градуировка по нескольким образцам сравнения. Способы уменьшения систематических погрешностей при градуировке по нескольким ОСС аналогичны использованием в 6.1 с той разницей, что в случав нескольких ОСС коррекция возможна во всем диапазоне концентраций общего холестерина. Правда, во многих случаях целью исследования является лишь оценка средних значений распределений, для чего применение одного ОСС вполне достаточно. Коэффициент аналогичный а^ для случая одного ОСС, имеет вид:

Р^С) г (10)

а) первый вариант компенсации систематических погрешностей в ходе градуировки (без учета состава ОСС) заключается в

заключается

приписывании каздому ОС содержания общего холестерина С*

ос,п"

сос,п = ^(С0с,п),С0с,п

(П)

где Сос - действительное содержание г'щего холестерина в п-ом ОС б) второй вариант способа заключается в нахождении составов матриц ОСС, для которых выполняются условия:

. ^ - о00. га^

В случае линейной зависимости Ср (ОСС) для компенсации систематических погрешностей, связанных с различиями в методах определения общего холестерина.

Расчеты на показали достоверного снижения можсерийной вариации результатов по сравнению с градуировкой по одному ОСС.

^<соо.п>

(12

Г (С.,) достагочно двух ОС

Предложенным способом уменьшения систематических погрешностей следует пользоваться с осторожностью - только для сходных по содержанию мешающих компонентов и общего холестерина популяций. Если имеются сомнения относительно близости распределений мешающих компонентов в сравниваемых популяциях, надежнее пользоваться сопоставлением результатов с помощью пересчета.

Несмотря на указанные ограничения использования способа уменьшения систематических погрешностей в ходе градуировки, он может найти широкое применение, так как: а) значительно чаще других при популяционных исследованиях факторов риска изучают однотипные популяции; б) градуировка по одному я тому же ОСС мокет использоваться для компенсации систематических погрешностей двух или более рутинных методов, если для них удается найти сочетание концентраций млиакщих компонентов и общего холестерина, удовлетворяющих уравнениям (Э).

Основные результата работы • I. Разработаны новые методики анализа:

- методика одновременного определения холестерина и его эфяров в присутствии значительных количеств триацилглицеридсв с помощью ВЭЮС, отличающаяся от существующих предварительным ферментативным гидролизом триацилглицеридов. Предел обнаружения 0,04 мМ, относительное стандартное отклонение - 0,04.

- методика определения 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека с помощью ВЭИ после ' предварительного концентрирования. Предел обнаружения - 0,05 мкМ, относительное стандартное отклонение - 0,04.

2. Разработан способ оценки влияния мешающих компонентов на определение основного вещества с использовашюм линейно. регрессионного анализа. Проведена оценка влияния различных компонентов сыворотки крови на определение общего холестерина. Показано, что значимым является влияние эфиров холестерина, • общего бежа, билирубина, триацилглицеридов.

3. Показано, что содержание 7-дегвдрохолестерина в сыворотке крови человека невелико и практически не влияет на результаты определения общего холестерина.

4.Предложен простой статистический способ сопоставления результатов массовых определений общего холестерине) разными методиками в выборках с неконтролируемым содержанием мешающих компонентов.

5. Предложен экспрессный способ уменылекия систематических

погрешностей методик массовых определений общего холестерина - для случая близки,! по концентрациям общего холестерина и мэшащих' компонентов популяций, - в ходе градуировки.

6. Показано, что градуировка методов определения общего холестерина по сывороточному образцу сравнения приводит к значительному (по сравнению с градуировкой по раствору чистого холестерина) уменьшению мексерийной погреиности анализа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хрсматографическое определение содержания нейтральных липидов в крови / Вавкушевская H.H., Дворкин В.И., Золотов H.H., Малахов В.Н. // Мевдународный симпозиум "Хроматография в биологии и медицине": Тез. докл. - Ы., 1986. - С. 77-78.

2. Л ". 1377733 СССР, МНИ4 G 01 33/48. Способ определения липидов в сыворотке или плазме крови / Вавкушевская И.Н.. Дворкин В.И., Золотов H.H., Малахов В.Н. (СССР). - 4 с.

3. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови прямым химиче шм методом с применением сыворотки крови в качестве образца сравнения // Ж. аналит. химии. - 1990. - Т. 45. » I. - С. 181-187.

4. Каринова H.H., Дворкин .В.И., Золотов H.H. Определение содержания холестерина и его эфиров методом ВЭЖХ в сыворотке крови с высоким содержанием триацилглицеридов // Я. аналит. химии. - 1989. - Т. 44, Л II. - С. 2104-2107.

5. Каринова И.Н., Дворкин В.И. Хроматографическое определение 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека // Ж. аналит. химии. - 1989. - Т. 44, * 10. - С. 1902-1905.

6. Дворкин В.И., Каринова И.Н., Айду Ф.А. Сравнение ьыборок, 'проанализированных разными методами, при биохимических исследованиях. - U., 1990. - 28 о. - Деп. в ВИНИТИ 04.01.90, ü 207Э-В90.

*'. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Метода определения холестерина

// I. аналит. химии. - 1990. - Г. 45, * 5. - С. 837-857. В. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Уменьшение систематических погрешностей популяционных биохимических • исследований при градуировке на примере определения холестерина. - М., 1991. -27 с. - Деп. В ВИНИТИ 24.01.91, * 400-B9I 9. Karinova I.D., Dvorkin V.l. Estimation of influenoes eoma eub-stanoes on the reeulte of determination oi v..e sum (TOt-TC) by the iluoreoenee method /Phyaioc-ohemioal Азрс-ots ot Medioina Reviews.- У.З.- Part 1,- Harwcod Aoad. Publ., 1991.- P. 66-72.