Аналитические аспекты популяционных биохимических исследований тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ
|
Дворкин, Владимир Ильич
АВТОР
|
||||
|
доктора химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1995
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.02
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
Р Г Б ОД 1 7 МН>
На правах рукописи УДК 543.0
ДВОРКИН Владимир Ильич
АНАЛИТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОПУЛЯЦИОННЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
02.00.02 - Аналитическая химия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Москва - 1995
Работа выполнена в Отделе стандартизации и контроля каче< лабораторных исследований Государственного научно-исследоват< ского центра профилактической медицины Минздравмедпрома РФ (Ди] тор Центра - профессор Р.Г.Оганов, Руководитель Отдела - д.( В.Н.Малахов)
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Доктор химических наук, профессор Давыдова Светлана Леонидовна Доктор химических наук, профессор Нейман Евгений Янович. Доктор химических наук, профессор Филимонов Лев Николаевич.
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Московская медицинская-академия им. И.М.Сеченова
Диссертационного совета Д 139.04.01 в Государственном нау исследовательском и проектном институте редкометаллической про! ленности "ГИРЕДМЕТ" (Москва, Б. Толмачевский пер., 5).
С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале Государстве! го научно-исследовательского и проектного института редкомета. ческой промышленности "ГИРЕДМЕТ" (Москва, Б.Толмачевский пер.,
Автореферат разослан " & » 1995 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук
Защита состоится
засед;
Александрова ]
Постановка задачи. В настоящее время в широких масштабах проводятся популяционные исследования, в которых изучают так называемые факторы риска (повышенное артериальное давление, ' повышенное содержание холестерина и триацилглицеридов в сыворотке крови, курение и т.д.) у людей, отобранных случайным образе:.: из населения (при этом образуются группы, называемые выборками из популяций). Наличие факторов риска повышает вероятность сердечно-сосудистых заболеваний и уровень смертности от них.
Пспуляциохт::.!:: бисхжлпеск::тк исследованиями (П.Б.И.) называют определение содержания различных веществ в биологических жидкостях обследуемых при популяционных исследованиях. Определяют концентрации липидов, глюкозы, креатинина, мочевой кислоты, электролитов, гормонов и других веществ, а также активность ферментов, в сыворотке (плазме) крови, ряда веществ в моче и т.д. Важнейшими параметрами, определяемыми в популяционных исследованиях сердечнососудистого профиля, является содержание липидов - общего холестерина (ХС), триацилглицеридов (ТГ), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС-ЛВП) - в сыворотке крови. Даже малые изменения среднего содержания этих веществ в сыворотке крови выборки влекут за собой резкие изменения заболеваемости и смертности, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями, в этой выборке. Поэтому необходимо выявлять весьма малые различия между параметрами распределений липидов исследуемых выборок. Между тем из-за больших масштабов П.Б.И. (число проб в одном исследовании достигает десятков.тысяч) разные выборки исследуют в разных лабораториях в разное время с использованием разных и упрощенных методов анализа, имеющих отличные друг от друга систематические погрешности. Это является важнейшей причиной артефактных различий в средних значениях и формах распределений между сравниваемыми выборками, влекущих за собой неправильную интерпретацию результатов популяционных исследований. Эсуществляемые при П.Б.И. мероприятия по стандартизации применяемых методов анализа (внутрилабораторный и внешний контроль качест-за, использование единого образца сравнения и т.д.) позволяют лишь уменьшить систематические погрешности, но сделать их пренебрежимо ¿алыми не удается. Различия же, связанные с влиянием присутствия летающих компонентов за счет этих мероприятий не уменьшаются вов-:е. Однако при организации П.Б.И. и обработке их результатов пог-
решностями анализа необоснованно пренебрегают.
Одной из важнейших целей национальной программы "Высокий хс лестерин", проводимая в США в 1991-93 г., было уменьшение как сл^ чайных, так и систематических погрешностей единичного определена холестерина в клинико-диагностических лабораториях до 3 отн%. Эч задача не была решена из-за принципиальной неустранимости системе тических погрешностей используемых методов анализа. Решение подоС ной задачи, хотя бы лишь для совокупностей проб, неизвестно.
Важнейшее отличие П.Б.И. от большинства исследований совокуг ностей, проводимых в аналитической химии, состоит в том, что П.Б.И. обычно не требуется точно определять содержание веществ индивидуальных объектах: достаточно установить параметры их рас пределений в выборках. Используя эту особенность можно предложит способы уменьшения погрешностей П.Б.И. без дорогостоящего и I всегда возможного повышения качества анализа индивидуальных про( В то же время специфика объекта - сыворотки крови - затрудняет ж пользование ряда стандартных методических приемов, используемых аналитической химии. .
Актуальность темы. таким образом, определяется спецификой зг дач П.В.И. и объекта исследования. К 80-м годам возможности повь шения качества П.Б.И. с использованием обычных приемов (улучшен! характеристик используемых методов) были практически исчерпаны, то время как требования заказчиков таких исследований продолжа; расти; решение этой проблемы стало весьма актуальным. Актуалы также разработка методических подходов к оценке влияний мешакмц! компонентов и поиску математических моделей, описывающих результ; ты анализа, для такого специфического объекта, как сыворотка крс ви.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования Я1 лялась разработка и практическая реализация способов уменьшен! систематических погрешностей П.Б.И. при определении содержав! липидов в сыворотке крови.
Достижение этой цели потребовало решения следующих основш задач:
- разработка способа уменьшения систематических погрешност( П.Б.И. в ходе градуировки метода;
- разработка способов сопоставления результатов исследования выб( рок, проанализированных разными методами;
- поиск математических моделей, адекватно описывающих результаты П.Б.И.;
- разработка процедуры коррекции результатов П.Б.И. с использованием результатов исследования стандартных образцов;
- построение системы стандартизации и контроля качества П.Б.И., позволяющих практически использовать разработанные способы.
Решение этих основных задач потребовало решения следующих методических задач:
- разработка методик определения 7-дегидрохолестерина, холестерина и его эфироз в сыБорстхс :;рси:: человека методом ВЭЖХ;
- разработка способов оценки ряда метрологических характеристик стандартных образцов сыворотки крови человека, критичных для П.В.И.
Наущзя крвизна работы:
1. Разработаны способы сопоставления результатов исследования выборок, полученных разными методами в разных лабораториях:
- с использованием результатов анализа подвыборок;
- с учетом информации о распределении мешающих компонентов;
- по результатам анализа стандартных образцов состава.
2. Для описания результатов П.Б.И. применены линейные модели ковариационного анализа," хорошо описывающие также результаты межлабораторных экспериментов в при определении липидов.
3. Разработаны оригинальные методики определения 7-дегидрохолестерина, холестерина и его эфиров в сыворотке крови человека методом ВЭЖХ;
4. Предложен и апробирован способ оценки влияния мешающих компонентов на результаты анализа, состоящий в многомерном регрессионном анализе со случайными регрессорами результатов исследования большого числа проб.
Практическая ценность работы состоит в следующем:
1. Программа стандартизации и контроля качества П.Б.И., разработанная с учетом результатов работы и осуществляемая ГНИЦ ПМ, позволила существенно улучшить качество определения липидов в выборках .
2. Линейные модели ковариационного анализа, хорошо описывающие результаты П.Б.И, применяются в ГНИЦ ПМ иЗ РФ как при анализе и коррекции результатов П.Б.И., так и при интерпретации результатов межлабораторных экспериментов в клинической химии.
3. Предложенный способ сопоставления результатов анализа вы-
борок, исследованных разными методами и (или) в разных лабораториях, основанный на пересчете результатов анализа по данным, полученным при исследовании подвыборки, может быть использован в разных областях аналитической химии. В частности, он был использова! при сопоставлении результатов определения гормонов крови, измеренных в лабораториях ГНИЦПМ и Медицинской академии в Кракове.
4. Разработанный способ оценки влияний мешающих компоненте! на определение основного вещества, состоящий в многомерном регрессионном анализе со случайными регрессорами результатов исследования большого числа проб, может быть применен для оценки влияний ! объектах, для которых приготовление образцов заданного состава затруднено. Он был использован для выявления мешающих влияний пр! определении суммарного содержания холестерина и триацилглицеридо; флуоресцентным методом, разработанным в НИИ физико-химической медицины МЗ РФ.
5. Разработанные методики определения 7-дегидрохолестерина, холестерина и его эфиров методом ВЭЖХ могут применяться при определении этих веществ в сыворотке крови человека.
На защиту выносятся:
1. Программа стандартизации и контроля качества популяционньс липидных исследований, в том числе оригинальные алгоритмы внутри-лабораторного и внешнего контроля качества анализа.
2. Экспрессный градуировочный способ снижения погрешностер методик массовых определений холестерина, основанный на введет» расчетных коэффициентов или использовании для градуировки образцг сравнения специального состава.
3. Способ сопоставления результатов анализа выборок, исследованных разными методами и (или) в разных лабораториях, основании} на пересчете результатов анализа по данным, полученным при исследовании подвыборки.
4. Способ оценки влияний мешающих компонентов на определение основного вещества, состоящий в многомерном регрессионном анализ« со случайными регрессорами результатов исследования большого числг проб.
5. Данные статистического анализа результатов определения ли-пидов в сыворотке крови, показавшего, что они хорошо описываются I рамках не применявшихся ранее в аналитической химии моделей ковариационного анализа и, несколько хуже, дисперсионного анализа пос-
ле шкалирования.
6. Способы апостериорной коррекции результатов П.Б.И. исследований по данным, полученным при анализе стандартных образцов состава.
7. Оригинальные методики определения холестерина, эфиров холестерина и 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека.
Апробация работы и публикации: результаты работы были доложены на пленуме правления всесоюзного общества кардиологов (Москва, 1983г.), международной конференции по профилактической кардиологии (Москва, 1985г.), на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986г.), IV Всесоюзном съезде кардиологов (Москва, 1986г.), международном симпозиуме "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1986г.), XI международной конференции по аналитической атомной спектроскопии (Москва, 1990:г.), 2-й Всесоюзной конференции "Математические методы и ЭВМ в аналитической химии" (Москва, 1991г.), 5 конференции по применению компьютеров в аналитической химии (Иена, Германия, 1992г.), Европейском биохимическом' конгрессе (Ницца, Франция, 1993г.,), Международной всрече по хемометрике (Нидерланды, 1994), П-Х Всесоюзных совещаниях по стандартизации биохимических методов исследований (1983-1991г.), Московском городском семинаре по аналитической химии (1993г.), нескольких узкоспециализированных конференциях по профилактической кардиологии. Основное содержание работы представлено в 40 публикациях, список которых приведен в конце автореферата.
Глава 1. Обзор литературы
Вначале рассматривали методы определения веществ, чаще всего определяемых при П.Б.И., и объекты анализа.
Поскольку наиболее масштабные популяционные исследования проводятся в области кардиологии, чаще всего измеряют содержание ли-пидов (общего холестерина, триацилглицеридов, холестерина липопро-теидов высокой плотности) в сыворотке (плазме) крови человека, что определяется их важной ролью в патогенезе атеросклероза. Кроме того, иногда определяют целый ряд других веществ в сыворотке крови и моче - N8, К Са, глюкозу, этанол и т.д.
Результаты пробоотбора и пробоподготовки заметно влияют на результаты -анализа. Единственным способом борьбы с этим явлением
является унификация пробоотбора, которая проводится во всех П.Б.И.
Далее рассматриваются методы определения липидов в сыворотж крови, причем наибольшее внимание уделяется общему холестерин} (ХС) - веществу, на примере определения которого выполнены многие исследования в диссертации.
Проводится классификация методов определения ХС. Наиболее подробно рассматриваются "рутинные" методы анализа, чаще всего используемые при П.Б.И. из-за их дешевизны (прямые химические с использованием реактива Либермана-Бурхарта, ферментные), а также методы сравнения1 (химические методы с предварительным отделение* ХС, масс—спектрометрия с изотсппим розч^авлсписм/. литературные данных следует, что все рутинные методы подвержены влияниям матрицы, т.е. имеют скрытые систематические погрешности, связанные, частности, с влиянием мешающих компонентов на результаты анализа. В качестве метода сравнения целесообразно использовать модифицированный метод Абеля-Кендала, включающий щелочной гидролиз эфироЕ ХС, экстракцию ХС гексаном, выпаривание экстракта досуха и фотометрическое определение продуктов реакции ХС с реактивом Либермана-Бурхарта .
Для определения холестерина липопротеидов высокой плотноста (ХС-ЛВП) используют те же методы, что и для определения ХС. Отличие заключается в предварительной обработке сыворотки крови реагентами, селективно осаждающими другие классы липопротеидов (липопротеидов низкой и очень низкой плотности). Для этого чаще всегс
П I /ч ,
используют смеси Мп -гепарин и фосфовольфрамовая кислота.
Этим методам, кроме дополнительных связанных с процедурой осаждения погрешностей присущи те же погрешности, что и методам определения ХС. В качестве метода сравнения выбран тот же метод, что у
при определении ХС, после ультрацентрифугирования и обработки про-
2+
бы Мп -гепариновой смесью.
Определение триацилглицеридов (ТГ) в сыворотке крови проводят в основном химическими и ферментными методами. Для этих методоЕ характерны несколько худшие, по сравнению с аналогичными методами определения ХС, метрологические характеристики. Дополнительной
'"Под методами сравнения подразумеваются методы анализа, служащие для поверки по ним других методов и утвержденные в таком качестве.
проблемой является присутствие в сыворотке крови заметного количества свободного глицерина, определяемого вместе с ТГ в ряде методов. Общепринятый метод сравнения отсутствует и, по-видимому, должен выбираться из числа экстракционных химических методов.
Далее рзссмгтриЕахзтся описанные в литературе программы стандартизации и контроля качества П.Б.И. Наиболее известные из них -программы Центра по контролю заболеваний, Атланта, США (CDC)г В максимальном варианте предусматривалась унификация используемых методов анализа и способов их градуировки, единые градуировочные материалы и стандартные образцы (СО) в виде замороженной сыворотки крови, внешний и ънутрилабораторный контроль качества анализа. Другая большая программа, включающая более ста лабораторий проводится Европейским липидным референсным центром Всемирной организации здравоохранения, Прага-Гейдельберг (ЕЛРЦ ВОЗ). В ней предусмотрена только периодическая внешняя оценка качества анализа с использованием лиофилизированных СО. Известны еще несколько программ, предназначенных в основном для контроля качества клинических анализов, в рамках которых•иногда проводятся П.Б.И. Эти программы отличаются от программы ЕЛРЦ ВОЗ меньшей интенсивностью, а также более низким статусом..
Критический анализ показал, что все эти программы построены по схемам, обычно применяемым для исследования индивидуальных проб и не учитывающим специфики П.Б.И. При усреднении результатов исследования нескольких десятков или сотен проб случайные погрешности усредняются л ими обычно можно пренебречь. В то же время даже незначительные в. случае анализа индивидуальных проб систематические погрешности, не выявляемые в ходе текущего контроля качества, могут приводить к неправильным выводам при нахождении среднего значения для выборки. Как следует из рассмотрения используемых в П.Б.И. рутинных методов анализа, источниками таких погрешностей могут быть эффект использования разных методик в лабораториях,, исследующих разные выборки, межсерийная вариация результатов анализа при небольшом числе серий, различия в градуировочных образцах и аппаратуре, используемых при исследовании разных выборок и т.д.
Делается вывод, что разработка и внедрение способов уменьшения и учета таких погрешностей является актуальной, но практически не затронутой в литературе темой исследования.
Глава 2. Материалы и методы
В этой плаве детально описаны использованные в работе мстодь анализа (как известные из литературы, так и специально разработанные), стандартные образцы и т.д.
Методы анализа
Применяли следующие методы определения ОХС.
Рутинные методы. Метод А: прямой химический метод с реактиво1 Либермана-Бурхарда. Метод В: экстракционный химический метод < использованием автоанализатора AA-II ("Technicon", США) Метод С: ферментный метод - наборы реактивов фирмы "Wako" - с двухволново; регистрацией на автоанализаторе "Hitachi-705". Метод D: ферментньн метод - наборы реактивов фирмы "Boehringer", кат. N 237574 - с регистрацией поглощения на центробежном ■ анализаторе "Centrifichem' ("Baker", США). Метод сравнения. Действительное содержания ОХС определяли модифицированным методом Абеля-Кендала (см. выше).
ХС-ЛВП определяли следующими рутинными методами: методы А и 1 определения ХС после обработки пробы Мп - гепариновой смесью i
отделения осадка. Метод сравнения: тот же, что и для ХС, посл<
------------------
ультрацентрифугирования и обработки'пробы Мп - гепариновой смесью
Определение ТГ проводили химическим методом Готтфрида, включающим экстракцию смесью изопропанол-гептан, щелочной гидролиз, окисление глицерина до формальдегида и фотометрическое 'определеши продукта его реакции с ацетилацетоновым реактивом (метод А) и ферментным (глюкозоксидазным) методом (метод В). В качестве метод; сравнения использовали метод А.
Описаны также методы определения общего белка, билирубина, использованные в работе.
Кроме известных их литературы методов описаны специально разработанные хроматографические методики. .
Методика одновременного определения свободного холестерина сложных эфиров холестерина методом ■ ВЭШХ включала ферментативны: гидролиз триацилглицеридов в присутствии триглицеридлипазы, экстракцию изопропанолом, разделение на колонке С18 с подвижной фазо: изопропанол - ацетонитрил (65 :35 по объему) и фотометрическое оп ределение при 206 нм.
Для определения 7-дегидрохолестерина была разработана методика
включающая щелочной гидролиз эфиров 7-дегидрохолестерина, экстракцию гексаном, упаривание экстракта досуха, растворение осадка в изопропаноле и фотометрическое определение при 282 нм после разделения в тех же условиях, что и при определении свободного холестерина и его эфиров (см.выше).
Использованные в работе стандартные образцы (СО) представляли собой донорскую сыворотку крови, обогащенную при необходимости-ли-пидной фракцией, получаемой методом спиртового осаждения, стерилизованную фильтрацией, разлитую по флаконам, замороженную и хранившуюся при -80°С. Аттестацию СО проводили методами сравнения (см. выше). Указанные СО были зарегистрированы в качестве госудаствен-ных (ГСО 6120-91).
В данной главе описаны также принципы формирования выборок проб, на которых проводилось исследование, представлявших собой сыворотку крови, взятую у обследованных, выбранных случайным образом из различных популяций; использованные образцы сравнения; схемы контроля качества анализа и т.д.
Глава 3. Уменьшение систематической погрешности на стадии градуировки
Уменьшение погрешностей, связанных с влиянием матрицы при использовании разных методов анализа для разных выборок, проще всего может быть достигнуто на стадии градуировки при использовании образцов сравнения соответствующего состава. Такой способ часто называют "градуировкой по адекватным образцам сравнения". Он обычно предполагает близость состава этих образцов сравнения и анализируемых проб. Однако при П.Б.И. в выборку входят пробы разного'состава и неясно, какой состав должен иметь "адекватный" образец сравнения. Можно было бы потребовать близости его состава к усредненному составу проб исследуемой выборки, однако такое требование избыточно (см. ниже). Таким образом понятие "адекватности" образцов сравнения при популяционных биохимических исследованиях не вполне определено и подлежит обсуждению. Ниже образцы сравнения, содержащие, наряду с определяемым веществом, другие компоненты матрицы исследуемых проб, называются образцами сравнения сложного состава (ОСС) в отличие от образцов сравнения, содержащих только определяемое вещество или его раствор (обозначаемых как ОС).
а. Оценка влияния мешающих компонентов.
Для дальнейшего необходимо было выяснить зависимость резуль татов, получаемых рутинными методами, от истинного содержания оп ределяемого компонента (0К) и мешающих компонентов (МК). Предполо жим, что в пробе, кроме 0К, могут находиться I известных МК с кон центрациями с^. Необходимо найти зависимость
I
D = СН ~ с0 = Е k-j С: + d, (1)
i=l
где Cjj - концентрация OK, измеренная рутинным методом, с - истин ная или найденнная методом сравнения концентрация, d - величина связанная с возможным присутствием в пробах неизвестных МК. Дале предполагается d и const.
Найти величины k^ можно по меньшей мере двумя способами.' Известный из литературы способ предполагает исследование искусст венных смесей, с последующим расчетом к^ методом многомерного ли нейного регрессионного анализа (МЛРА) с известными значениями per рессоров. При этом объем эксперимента можно оптимизировать извест ными методами планирования эксперимента. I
Однако такой способ не позволяет найти d. Кроме того, он непри меним в тех случаях, когда приготовить образцы известного 'состав не удается, например из-за трудности воспроизведения естественно формы вхождения МК в пробу. Именно так обстоит дело с сыворотко крови, рассматриваемой в настоящей работе: часть компонентов ее липиды, апобелки, - входят в состав липопротеидов, которые практи чески невозможно воспроизвести искусственно. Определить ^ и d мо жно, измерив Cpj, Cq и с^ в достаточно большом числе проб. Естест венно, для этого необходимо иметь способ определения Cq и с^. Рас чет к^ в этом случае можно проводить методом МЛРА со случайным регрессорами. При расчетах методом МЛРА необходимо проверить при нятые гипотезы о взаимной независимости с^ и о линейности связ величин с^ и D (анализом остатков или другими способами), а такж оценить погрешности определения величин к^.
Таким способом и оценивали влияния МК па определение ХС мето дами A-D. В 370 пробах сыворотки крови определяли ХС методами А-и методом сравнения, а также МК - доля эфиров холестерина, три ацилглицериды, билирубин, общий белок, 7-дегидрохолестерин. Был найдены следующие зависимости (рутинный метод анализа указан
- И -
скобках):
(A) 1>3,59Рпхс-5,25.10-3сбел+10,8сбил-1193Рахс+0.283;
(B) 0=6,59.10-3сбел-1,62Рахс+0,695Рлхс+2106Ролхс-0,110со-0.359;
(С> ЕИ8.22-Ю-3сбел-7,Юсбил+1,ЗЗРгас+1,25Р0ДХС-2,77•10"2с0-1,108;
(Б) 0=2100Рахс+1,58Рлхс-0,367стг+2,07Ролхс-4,48-10 Зс0-0,734,
Здесь Б = сн- с0 в ммоль/л, Р^, Р^, Ролхс, Рпхс- отношение "содержания эфиров ХС - арахидоната, линолеата, олеата, пальмитата -к содержанию ХС, стр- содержание ТГ мМ, концентрация общего
белка в г/л, С£ИЛ - содержание билирубина в ммоль/л. В уравнения включены все МК, влияние которых выявляется с р>0,2^ .
б. Состав ОС для случая градуировки по одному ОС. Этот часто' встречающийся на практике способ градуировки состоит в том, что аналитический сигнал измеряют для одного образца сравнения, а прямолинейный градуировочный график проводят через полученную точку и начало координат. Так градуируют, в частности, многие автоанализаторы.
В этом случае можно в ходе градуировки устранить смещение среднего содержания ОК в исследуемых популяциях.
Вводится обозначение гп = с0/сп, где сд - среднее содержание ОВ в выборке, найденное п-м рутинным методом, с0 - среднее действительное содержание. Предполагается, что величина «п для исследуемой популяции известна или может быть достаточно точно оценена до начала исследования. Тогда для приведения сп к с0 можно в процессе градуировки умножить все результаты на коэффициент 5П. Сделать это можно по меньшей мере двумя способами.
Ш Приписать ОС концентрацию определяемого компонента с^ , равную з^-Сдс (сдС~ содержание ОВ в ОС). Такая операция эквивалентна арифметическому пересчету результатов популяционного исследования; (И) Использовать для градуировки ОСС, состав которого ' удовлетво-
2
При' проверке гипотез здесь и ниже приводятся величины доверительной вероятности р (часто обозначаемой и как а), так что гипотезы отвергаются при р<0,05.
ряет уравнению^ I
V1 с
С1 + йк =
(2)
для каждого к-го рутинного метода. Преимущество использования ОСС состоит в том, что для компенсации систематических погрешностей двух или нескольких рутинных методов может использоваться один и тот же ОСС, состав которого (концентрации МК и ОБ) удовлетворяет уравнениям (2) для этих методов. Кроме того, показано, что градуировка по ОСС приводит к снижению межсерийного разброса данных. В работе рассчитаны величины б^ и для исследованной выборки. Анализ системы четырех уравнений вида (2), соответствующих всем рассмотренным рабочим методам показал наличие ее решений с положительными значениями с^ и Сд в широком диапазоне концентраций ОХС.
В работе собраны данные о концентрациях ХС и МК в разных выборках, найден-оптимальный состав ОСС для случая исследования выборок ,с неизвестным <5^ и оценены возникающие при этом погрешности.
в. Состав ОС для случая градуировки по нескольким ОС находится аналогично тому, как это сделано для одного ОС.
Уменьшение погрешностей на стадии градуировки целесообразно при дюбых П.Б.И. вне зависимости от способов последующей обработки данных как для учета погрешностей, связанных с влиянием МК, так и для снижения межсерийной составляющей погрешности. Этот подход используют в программе стандартизации и контроля качества П.Б.И. (см. ниже) . Однако из-за различий в распределении МК в разных выборках такой способ не приводит к полному устранению систематических погрешностей, связанных с использованием разных методов анализа, лишь уменьшая их. Для снижения и учета всех видов систематических погрешностей были разреши1аны другие приемы.
•3
Поправку к результатам можно вносить как в предлагаемой мультипликативной, так и в других формах (напр., аддитивной). В случае незначительной коррекции, т.е. при (с^- сд)/сд<0,1 форма поправш-несущественна. В противном случае мультипликативная коррекция лучше соответствует логнормальному распределению определяемого компонента в исследуемой популяции, обычному при П.Б.И..
Глава 4. Сравнение выборок, исследованных разными методами.
Как указано выше, из экономических соображений при организации многих П.Б.И. не удается унифицировать методики анализа: лаборатории, исследующие разные выборки, применяют разными методами, используют разные образцы сравнения, реактивы, оборудование и т.д. Сопоставление полученных в таких условиях результатов П-.Б.И. требует учета различий метрологических показателей применяемых методик. В данной главе рассматриваются некоторые способы такого учета для случая, когда число сравниваемых выборок невелико.
Решаемую задачу можно сформулировать как сравнение результатов исследования двух (в простейшем случае) выборок, проанализированных разными методами и (или) оценивание истинного распределения определяемого компонента в исследуемых выборках. При решении основное внимание обращается на трудно устранимые расхождения между результатами, получаемыми по разным методикам, связанные с матричным влиянием анализируемых проб ("мешающих компонентов"). Методики, используемые для анализа выборок, называются рутинными. МС -метод сравнения, предполагающийся несмещенным.
Очевидно, для сравнения результатов исследования выборок, проанализированных рутинными методами, необходимо "привести их к общему знаменателю", т.е. либо пересчитать все результаты к тем, которые были бы получены МС, либо результаты, полученные разными методами, пересчитать к какому-либо одному рутинному методу. Подход в обоих случаях одинаков. Предложено делать это следующим образом: измерить истинную концентрацию определяемого компонента Сд методом сравнения в случайной подвыборке (выборке из выборки) из проанализированной рутинным методом (Н) выборки, найти зависимость
с0 = Г(сН) ' ^
где с^ - результаты, полученные методом Н, и пересчитать результаты анализа по этой формуле. Нахождение такой зависимости - задача одномерного регрессионного анализа, причем при расчетах необходимо учитывать случайную погрешность измерений как Сд, так и с^. Очевидно, что точность пересчета при этом зависит от объема подвыбор-ки.
Если задача "приведения" всех результатов к полученным несмещенным методом не ставится, то вместо Сд можно взять результаты, полученные каким-либо одним из рутинных методов.
ь 85
После пересчета по уравнению (уравнениям) вида (3) результатов исследования всех рассматриваемых выборок их можно сравнивать с применением обычных статистических методов.
Эффективность такого способа проверяли на примере случайной выборки объемом 374 пробы, в каждой из которых определяли содержание ХС методами А-0 и МС. Средние значения, полученные разными методами, так же как и форма распределений, достоверно различались. Пересчеты проводили с подвыборкой объемом 100 проб. Зависимости (3) оказались близки к линейному виду Сд = а-с^ + Ь. Как и ожидалось, пересчитанные результаты практически совпадали с полученными МС, что проиллюстрировано на рис. 1 для метода Малые различия на краях пересчитанного и истинного распределений связаны отклонениями от линейного характера связи и практически не влияют на характеристики распределения.
Был исследован также м.э вопрос о зависимости пог- : решности пересчета по формуле (3) от объема подвы-борки. Для этого было проведено математическое моделирование с использованием метода Монте-Карло, результаты которого показаны на рисунке 2. Факти-тически графики на рис. 2 характеризуют соотношение цена:погрешность пересчитанных результатов П.Б.И.
Для случая, когда погрешности обусловлены только мешающими компонентами
и распределение всех или части МК в исследуемых выборках известно, предложен другой способ уменьшения погрешностей, состоящий в расчете сверток соответствующих распределений. Такой подход, детально рассмотренный в тексте, имеет более узкую область применения, чем универсальный способ нахождения зависимости вида (3) и соответствующего пересчета результатов.
Данный способ сопоставления результатов П.Б.И. успешно испо-
о
ео
с: п о к га 0.1
2.59
ю, :с
ХС' ммоль/л
Рис.
1. Нормализованные распределения результатов определения ХС
------ метод О; - - МС;
------- результат пересчета.
к 16
о
У
я
11
Т \
(Л
14
о
о
о 10 20 30 4С 50 60 70 80 »0 Объем подвыборки
Рис. 2. Результаты математического моделирования зависимости
погрешностей пересчета по формуле (1) от объема подвыборки: --среднего значения;---- ¿'г дисперсии.
льзовали при обработке результатов определения ряда гормонов в ходе международного исследования (разные лаборатории использовали разные методы анализа) при объеме подвыборки п=20.
Способ пересчета по формуле (3) может применяться во всех случаях, когда сравниваемые выборки известны до начала исследования и их число невелико. В противном случае объем дополнительных исследований, необходимых для его реализации, резко растет и его применение становится нерентабельным. Способы сопоставления результатов исследования сывороток в такой ситуации рассмотрены ниже.
Глава 5. Математические модели, описывающие результаты П..Б.И.
Для оценки результатов П.Б.И. важное значение имеет вид возникающих при их выполнении аналитических погрешностей. Этот вопрос исследован в рамках известных из литературы моделей дисперсионного анализа и не использовавшихся ранее в аналитической химиии моделей ковариационного анализа и изложен в терминах общей линейной модели.
С математической точки зрения задача сравнения результатов, полученных при исследовании СО совместно с пробами разных выборок идентична задаче о сравнении результатов, полученных в разных лабораториях (можлабораторный эксперимент), т.к. без потери общности можно считать, что одна лаборатория исследует одну выборку.
Г>ыли обсчитаны результаты определения ХС и ТГ в СО (см. выше), полученные в 6 лабораториях. План межлабораторного эксперимента (МЭ) показан на рис. 3. Для каждой лаборатории были отобраны серии анализа, в которых анализировали один и тот же набор СО (от 7 до 24 серий). В каждой с^ерии анализировали 4 (иногда 3) СО. В |).!иных лабораториях исследовали разные наборы СО; при этом диапа-чон содержаний ХС и ТГ в СО, анализируемых в каждой из лаборатории, был достаточно широк. В каждой серии для каждого СО проводили от ?. до А измерений.
1'ис. 3. План межлабораторного эксперимента
Межлабораторный эксперимент проводили в рамках программы стандартизации и контроля качества популяционных липидных исследований (см. гл. 7). В математический анализ включали лишь результаты, удовлетворительные по данным как внутрилабораторного, так и внешнего контроля качества, что предопределило отсутствие грубых ошибок в данных.
Структура проведенного МЭ давала возможность оценивать и межлабораторные (разброс результатов от лаборатории к лаборатории), и внутрилабораторные (разброс результатов между сериями анализа, случайные ппгрежест«) эффекты. Поэтому ь математические модели были включены вое эти эффекты. Расчеты проводили в рамках двух ос-
новных моделей.
1. Традиционным методом дисперсионного анализа после шкалирования;
2. Методом ковариационного анализа.
Дисперсионный анализ проводили в рамках модели со случайными эффектами . у
Т^1 " * + <1 ! "Ц + *цк + еЦИ. (4)
где: 1 - номер лаборатории; ^ - номер серии в лаборатории; к - номер СО; 1 - номер повторного измерения СО; х - постоянный эффект (среднее значение величин ~ Результат 1-го из-
мерения содержания ХС или ТГ в к-м СО в ,]-и серии в 1.-й лаборатории. хК - результат аттестации к-го СО; ^ - эффект лаборатории; - эффект серии; эффект СО; случайная погрешность;
В данном случае'шкалирование проводили путем деления полученных в ходе МЭ результатов анализа каждого СО (у^^) на результат аттестации этого СО (хк).
Расчеты приводили как в рамках полной модели (-1), так и з более простых (при фиксированном 1, т.е. для индивидуальных лабораторий) моделях. При расчетах в рамках полной модели (4) как для ХС, так и для ТГ все включенные в модель эффекты достоверно (р<0,001) отличались от 0.
При расчетах для индивидуальных лабораторий оказалось, что эффекты серии и СО достоверно (р<0,001) отличаются от 0 во всех лабораториях и для ХС, и для ТГ, за исключением лаборатории 6 (ТГ, эффект серии, р » 0,8).
Ковариационный анализ, так же как дисперсионный, приводили а) индивидуально для каждой лаборатории и б) для всей совокупности данных.
а) Индивидуально для каждой лаборатории расчеты проводили в рамках модели
узк1=«о + (5)
л=1.2.....Л; к=1,2.....К- 1=1,2.....
Здесь: индексы ^,к,1 - те же, что и в модели (4); Л - количество серий анализа, выполненных в рассматриваемой лаборатории; К^ - количество СО, проанализированных в ¿-й серии; количество измерений к-го СО в ¿-й серии; о^ и ^ - соответственно свободный член и угловой коэффициент уравнения линейной регрессии для ,}-й серии; С^- результат аттестации к-го СО (среднее значение, полученное не-
тодом сравнения); случайная ошибка, полученная при 1-м изме-
рении к-го СО в ¿-й серии анализа; У^- значение концентрации ХС или ТГ, полученное при 1-м повторном измерении к-го СО в ¿-й серии
анализа.
При проведении расчетов учитывали погрешности, возникающие из-за неоднородности дисперсий (гетероскёдастичности) проведенных измерений, а также из-за имеющейся погрешности аттестации СО (случайный регрессор).
При расчетах в рамках модели (5), проверяли гипотезы: Н^: р^ = р2 ~ ■ ~ PJ■ Проверка равенства угловых коэффициентов уравнений линейной регрессии в разных сериях;
Н2|Н1: = д2 =...= = О ПРИ условии принятия гипотезы Н^. Проверка равенства свободных членов уравнений линейной регресии в разных сериях в случае, когда гипотеза о равенстве угловых коэффициентов не отвергается.
Н3: д^ = д2 =-• = = Безусловная проверка равенства свободных
членов уравнений линейной регресии в разных сериях.
Л
Н, : а, = 0 (а- .= £«:/). Проверка равенства нулю среднего ^ и IСР / Л
свободного члена, т!е. отсутствия постоянной составляющей погрешности в данной лаборатории.
1 3
Не: Ра — 1 (р< = Е Проверка равенства единице среднего
3 О • '-Р V • -г ^=1 "
углового коэффициента, т.е. отсутствия пропорциональной составляющей погрешности в данной лаборатории.
Проверку гипотез проводили путем построения соответствующих Г- критериев для гипотез Н^-Нд и t - критериев для гипотез Н^ и Н^ (гипотезу Н2|Н1 проверяли вместо Нд в случаях выполнения Н^). Гипотезы не отвергались (+) или отвергались (-) с уровнем доверительной вероятности 0,05. В абсолютном большинстве случаев гипотезы Н^- Н^ отвергались. Таким образом, модель (5) хорошо описывает межсерийные эффекты. .
б) Расчеты для всех лабораторий (для всей совокупности данных) проводили в рамках модели
= "1 + *ГСк + «и + Рц Хк + (6)
1=1,2-----I; з=1,2.....к=1,2.....К^; 1=1,2.....Ьщ.
Здесь: индексы Л.^.к,! - те же, что и в модели (4); I - количество
лабораторий; ^ - количество серий анализа, выполненных в 1-й лаборатории; К^ - количество СО, проанализированных в .¡-й серии 1.-й лаборатории; количество измерений к-го СО в ,]-й серии в 1-й
лаборатории; т)^ и г^ - соответственно свободный член и угловой коэффициент уравнения линейной регрессии для 1-й лаборатории; а^ и
- соответственно свободный член и угловой коэффициент уравнения линейной регрессии для .¡-й серии в 1-й лаборатории; С^ - результат аттестации к-го СО (среднее значение, полученное методом сравнения); случайная ошибка, полученная при 1-м измерении
к-го СО в _]~й серии анализа в з.-й лаборатории; значение ко-
нцентрации ХС или ТГ, полученное при 1-м повторном измерении к-го СО в ,]"-й серии анализа в 1-й лаборатории.
Проверяли следующие -гипотезы: Н^: /з11 = =...= #21 = ^22 =-• = Проверка равенства угловых коэффициентов уравнений линейной регрессии во всех сериях; Н^: а^ = =■■■- «21 ~ а22 =-•-= аи- Безусловная проверка равенства свободных членов уравнений линейной регресии во всех сериях.
Н^: р^ - р2 ■р|• Проверка равенства свободных членов уравнений линейной регресии в разных лабораториях.
^ ср3^ ^ ' **Р°веРка равенства нулю среднего сво-
бодного члена, т.е. отсутствия постоянной составляющей погрешности во всех лабораториях, рассматриваемых в совокупности. Нд: 71 = г2 =...= г1. Проверка равенства угловых коэффициентов уравнений линейной регрессии между лабораториями.
Нд: = 1 (т4 ср =.Е Проверка равенства единице среднего
углового коэффициента, т.е. отсутствия пропорциональной составляющей погрешности во всех лабораториях, рассматриваемых в совокупности.
Гипотезы Н£ и Н^ были отвергнуты. Результаты проверки гипотез (Н6 - Н9) и оценки величин т^ср (ч1ср, ср) приведены в
табл. 1. Как видно, гипотезы Н^ - Ну отвергаются как для ХС, так и для ТГ. Гипотезы Нд и Нд не отвергаются для обоих параметров.
Таким образом, имеется достоверный межлабораторный разброс как угловых коэффициентов, так и свободных членов, т.е. и постоянная, и пропорциональная составляющие погрешности изменяются от лаборатории к лаборатории. Не выявлено общих для всех лабораторий
Табл. I. Результаты ковариационного анализа (модель (6))
I "бЦ5^-^! Н7(1,1.ср=0) Н8(*1=72=-=г 1> Н9(г1,ср= =1)
V ш гл Г Р * Г» е ■4- 71,ср Р +
ХС 6 12,2 <0,001 -1-1,5 0,46 0,7 + 16,7 <0,001 - 0,994 0,38 0,7 +
тг 5 57,5 <0,001 - +4,6 0,52 0,6 + 56,2 <0,001 - 0.959 0,46 0,6 +
постоянной и пропорциональной составляющих погрешности.
Пра сравнении результатов, полученных в рамках моделей (4) и
в рамках моделей (5) и (6) было показано, что:
2
- судя по величинам Н , показывающим, насколько модель описывает имеющиеся данные, модели ковариационного анализа лучше описывают получешше результаты 0.97-0.99 против 0.7-0.8 при дисперсионном анализе);
' - модели дисперсионного и ковариационного анализа взаимно дополняют друг друга, причем последний дает больше информации о структуре имеющихся погрешностей. ■
Более высокая эффективность ковариационных моделей объясняется спецификой рутинных методов анализа, имеющих как пропорциональные погрешности градуировки, так и аддитивные погрешности измерения при контрольных опытах.
Межлабораторный эксперимент был проведен на замороженных СО сыворотки крови человека. Возникает вопрос о том, применимы ли полученные в нем результаты к обычным популяционным пробам, т.е об адекватности СО. Адекватность исследуемых СО и проб типичных выборок проверяли в специальных опытах.
Таким образом, результаты П.Б.И. хорошо описываются моделями ковариационного анализа типа (5,6) и, несколько хуже, моделями дисперсионного анализа типи (4). Предварительные результаты показали, что такие модели хорошо описывают и результаты других измерений, по крайней мере в анализе органических веществ.
Глава 6. Математические .'¿сдсли результате:: П.Б.И. и их использование при обработке результатов исследования
Как было указано, общепринятый подход не предполагал дополнительных манипуляций с результатами П.Б.И., полученными в лабораториях, имеющих удовлетворительную оценку по данным ВНЕК. Однако при таком подходе возможны артефакты или потеря информации, связанные с различиями в используемых методиках и другими причинами. Учет таких погрешностей с использованием подвыборок, как это было предложено выше (глава 4) практически возможен лишь при малом числе сравниваемых выборок, которые к тому же должны быть известны до начала исследования. В большинстве реальных популяционных исследований в медицине количество выборок составляет десятки и сотни и часть выборок делается уже в ходе исследования. В этих случаях предложено проводить коррекцию результатов П.Б.И. по данным, полученным при анализе СО. При этом предполагается, что адекватные СО (пробы ВНЕК) распределены среди проб исследуемых выборок случайным образом, как это сделано в программе ГНИЦПМ (глава 7).
Предложенный подход применяли при исследовании популяций, определение липидов в которых было включено в вышеописанную программу стандартизации и контроля качества. Это проспективное наблюдение за жителями г. Ташкента (ежегодное, в течение 5 лет обследование "1000 человек) и выборочное обследование летчиков гражданской авиации; определяли ХС, ТГ и ХС-ЛВП. Расчеты проводили в рамках моделей 4 и 6, в которых индекс 1 относился не к лаборатории, а к выборке, совместно с которой анализировался СО. Адекватность используемых СО и ПП предварительно проверяли, что позволяло принять гипотезу об одинаковых погрешностях анализа СО и ПП.
Оказалось, что для ХС и ТГ все включенные в модели эффекты достоверны и модель (6) описывает данные несколько лучше модели (4). В случае ХС-ЛВП межвыборочные эффекты в модели (6) лежат на грани достоверности. Апробировались следующие способы коррекции результатов П.Б.И. по результатам анализа СО. - Коррекция типа Д. Посерийная коррекция в рамках с модели (6) 2].,]т = ^^т ~ ■ где ^пГ Результат анализа ш-й пробы
1-й выборки в ,]'-й серии, - скорректированное значение 2 —т,
а. 1 и - оценки эффектов сь .= и р: ^.
- Коррекция типа В. Посерийная коррекция в рамках модели (4)
2Ьш= 2цтАо • В:у = ^-Ср/№кГ относительное смещение в .¡-й серии для 1-й выборки число измерений).
- Коррекция типа С. Повыборочная коррекция в рамках модели (6) Ziш= , где результат анализа ш-й ПП 1-й выборки,
скорректированное значение т?^ и - оценки эффектов и г^ соответственно.
- Коррекция типа ¡). Повыборочная коррекция в рамках модели (4)
21*пГ Чп/Ч' г«е ВГ.^-Ж/^^^кГ относительное смещение для 1-й выборки. '
Было показано, что критерием эффективности того, или иного способа коррекции можно считать изменение дисперсии выборки при коррекции. Увеличение дисперсии свидетельствует о неудачном выборе процедуры коррекции.
Оказалось, что для ХС и ТГ наилучшие результаты дает коррекция типа А и.тти, и некоторых случаях, В. Для ХС-ЛВП коррекция типов А и С в большинстве случаев приводило к сильному увеличению дисперсий выборок, что связано с малым диапазоном концентраций СО и проявляющейся в этом случае неустойчивостью моделей ковариационного анализа. Для ХС-ЛВП оптимальной оказалась коррекция типа В.
В процессе коррекции были устранены явные артефакты, связанными с аналитическими погрешностями.
Таким образом, в рассмотренных случаях процедура, состоящая в оценке погрешностей в рамках моделей (4) и (6) и коррекции результатов П.Б.И. по тому из типов А-Б, который приводит к минимальной дисперсии выборок, приводила к существенному снижению погреностей.
Глава 6. Программа стандартизации и контроля качества П.Б.И.
В данной глава описана программа стандартизации и контроля качества П.Б.И., разработанная и проводимая Отделом стандартизации и контроля качества биохимических исследований Государственного научно-исследовательского центра профилактической медицины МЗ РФ, ниже обозначаемого аббревиатурой ГНИЦПМ, в которой автор являлся ответственным исполнителем. В разное время в программе участвовали более 30 лабораторий.' Определяемые параметры - содержание липидов (ХС, ТГ и ХС-ЛВП) в сыворотке крови. Некоторое время контролирова-
лись методы определения Иа и К в моче обследуемых.
В рамках программы реализован комплекс мероприятий, обеспечивающих необходимое для П.Б.И. качество анализа:
- унификация пробоотбора;
- частичная унификация рутинных методов анализа;
- использование.единых образцов сравнения (ОС) для градуировки рутинных методов, при чем состав ОС подбирается в таким образом, чтобы минимизировать влияния мешающих компгшрнтоз (с:-:, выше);
- унифицированный алгоритм внутрилабораторного контроля (ВНУК) и использование для этой цели единых стандартных образцов (СО);
- внешний контроль качества анализа (ВНЕК), предполагающий как периодическую оценку характеристик анализа, так и использование его результатов при интерпретации результатов П.Б.И.
В тексте детально описана деятельность ГНИЦПМ (разработка документации, изготовление, аттестация и рассылка СО и ОС, обработка поступающих из лабораторий данных и т.д. и работа лабораторий (единые методики пробоотбора и пробоподготовки, допускаемые к использованю рутинные методы, схемы анализа).
Отдельно рассмотрена схема внутрилабораторного контроля качества, существенно, отличающаяся от описанных в литературе и основанная на комбинации правил фильтрации данных по картам средних и по картам интервалов подгрупп (размахов).
Принципиальным .отличием от известных зарубежных программ метрологического обеспечения П.Б.И. является использование в программе ГНИЦМ оригинальной схемы внешнего контроля качества (ВНЕК).
Обычной целью ВНЕК является объективная оценка правильности и воспроизводимости анализов, выполняемых в лабораториях, и .состоит в периодической оценке получаемых "вслепую" рбзулокдюь исследования СО. В рассматриваемой программе результаты ВНЕК используются, кроме того, для апостериорной оценки и возможного пересчета результатов популяционных исследований в целом. Это обусловило некоторые отличия используемого дизайна ВНЕК от используемого в других программах.
В каждой серии анализа анализируют содержимое одного флакона СО с нормальной и одного флакона с повышенной концентрацией определяемых веществ. Из каждого флакона отбирают по две аликвоты, которые распределяют среди популяционных проб случайным образом. Флаконы разных СО одного типа чередуют случайным образом.
Использований такой схемы заставляет использовать нестандартный алгоритм текущей оценки результатов анализа, т.к. за фиксированный промежуток времени выполняется разное число серий анализа. (общепринятый алгоритм оценки, применяемый при фиксированном числе измерений, предполагает неудовлетворительными те результаты, которые превышают принятый критерий для смещения или для стандартного отклонения). Раздельно оценивают смещение и компоненты вариации анализа.
а) Оценка смещения.
Для каждой 1-й лаборатории оценивается относительное смещение В^, усредненное по всем исследованным за оцениваемый период СО ВНЕК. Оценка производится по алгоритму, показанному на рис. 4, где Т^ - "критерий стандарти-ртизации" (см. ниже), а (±Т)^ - доверительный интервал для величины относительного смещения вокруг нулевого значения последнего . Сначала абсолютная величина оценки относительного смещения В^ сравнивается с Т^.Если она меньше, то смещение признается удовлетворительным. В противном случае выясняется, лежит ли В- в интервале (±Т^). Если нет, то смещение признается неудовлет- Рис. 4. Алгоритм оценки смещения, ворительным, и лаборатория должна принять меры для его улучшения. В противном случае информация считается недостаточной и оценка смещения откладывается до получения результатов за следующий период и производится по совокупности данных за оба периода и т.д. Процедура повторяется до получения однозначной оценки.
Выбор величины Т^ представляет собой поиск компромисса между часто завышенными требованиями организаторов П.Б.И. и реальными возможностями лабораторий. В описываемой программе Т^ рассчитывается как минимальное смещение от нуля, которое можно достоверно (р<0,05) зарегистрировать при типичных характеристиках анализа в
"хороших" лабораториях (т.е. хорошо оборудованных лабораториях, имеющих квалифицированный персонал и опыт проведения анализов), оцениваемых в ходе пилотного исследования, при среднем (1=5) числе серий за период оценки. Сравнение описанного алгоритма ВНЕК для смещения с общепринятым проведено в таблице 2.
Таблица 2. Сравнение двух алгоритмов ВНЕК
Алгоритм Условие ~ ицёжа-гелгашг смещения t a »4
ибщеприня^й алгоритм со стандартными наборами СО, пользуемый в программах CDC и ЕРЛЦ В > Т Неудовлетворительно ? < 0,50[
В * Т Удовлетворительно ? <0,05 0,50 <0,50
Алгоритм с переменным числом СО, исследуемым за период оценки, применяемый в программе ГНИЦПМ В>Т, ВаТ* Неудовлетворительно
Т*аВ>Т Данных недостаточно 0,05 <0,50j
В з Т Удовлетворительно ? 0,50
fЗдесь а и (3 - доверительные вероятности первого и второго рода.
Величины Т^ рассчитываются в рамках модели дисперсионного анализа, аналогичной модели (4).
б) Оценка компонентов вариации.
Рассчитывается оценка соответствующего стандартного отклонения и доверительный интервал для него. Далее проверяется, превышает ли рассчитанная величина соответствующий критерий стандартизации достоверно (или, что то же самое, превышает ли нижняя граница доверительного интервала этот критерий). Если да, то работа лаборатории за оцениваемый период считается неудовлетворительной по данному показателю. Критерии стандартизации здесь - оцененые в ходе пилотного исследования о.с.о. для внутри- и межсерийной вариации для хорошо работающих лабораторий.
Рассматриваемая программа.функционирует уже более 10 лет и продемонстрировала высокую эффективность: качество работы участвующих в ней лабораторий очень высокое. Схема ВНЕК позволяет использовать полученные в ходе контроля данные при обработке результатов П.С.И.
* » »
Таким образом, в ходе исследований были разработаны, апроби-
рованы и внедрены в практику способы уменьшения ранее не учитываемых погрешностей популяционных биохимических исследований.
Как было сказано выше, схожие по постановке задачи исследования проводятся и в других областях аналитической химии. Очевидно, предложенные методические приемы могут быть успешно использованы во всех подобных случаях, естественно, с учетом их специфики.
Основные результаты работы
1. Разработаны новые методики анализа:
- методика определения холестерина и его эфиров в присутствии значительных количеств триацилглицеридов с помощью ВЭЖХ, отличающаяся предварительным ферментативным гидролизом триацилглицеридов.
- методика определения 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека с помощь» ВЭЖХ после предварительного концентрирования. Предел обнаружения 0,05 мкмоль/л, относительное стандартное отклонение 0,04.
2. Показано, что содержание 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека невелико и не влияет на определение холестерина.
3. Разработан метод оценки влияния мешающих компонентов на результаты анализа с использованием метода регрессионного анализа со случайными регрессорами. Оценено влияние мешающих компонентов на определение общего холестерина в сыворотке крови человека и показано, что значимым является влияние эфиров холестерина, общего белка, билирубина и триацилглицеридов.
4. Предложен способ уменьшения погрешностей популяцонных липи-дных исследований, пригодный для случая близких по концентрации -холестерина и мешающих компонентов выборок, в ходе градуировки.
5. Предложен способ обеспечения сопоставимости результатов исследования выборок, пробы которых проанализированы разными методами, состоящий в наховдении связи мевду результатами исследования подвыборок этими методами и перечета результато по найденным зависимостям.
6. Показано, что градуировка методов определения липидов по сывороточному образцу сравнения приводит к значительному - по сравнению с градуировкой по растворам чистых веществ - снижению межсерийной погрешности анализа.
7. Показано, что результаты популяционных липидных исследований, так же как и результаты межлабораторных экспериментов в клинической биохимии, хорошо описываются в рамках моделей ковариаци-
онного анализа.
8. Предложен способ оценки погрешностей исследования выборок, состоящий в нахождении коэффициентов уравнений линейных моделей, описывающих результаты исследования стандартных образцов состава, и учета их вклада в общую погрешность.
9. Предложен способ уменьшения погрешностей исследования выборок, состоящий пересчете результатов их исследования по уравнениям, описывающим результаты исследования стандартных образцов. Эффективность такого способа продемонстрирована ка примере исследования жителей г. Ташкента и летчиков гражданской авиации.
10. Разработана и реализована программа стандартизации и контроля качества популяционных липидных исследований, обеспечивающая существенное повышение качества анализа и возможности учета систематических погрешностей, в которой применены оригинальные алгоритмы внутрилабораторного и внешнего контроля качества анализа.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Малахов В.Н., Дворкин В.И., Заикин Е.В.Стандартизация биохимических исследований в кооперативных программах // Пленум правления всесоюзного Общества кардиологов: Тез. докл.- М., 1983.- С. 49-50.
2. Дворкин В.И., Малахов В.Н.// Внутрилабораторный контроль методов определения общего холестерина,триглицеридов и холестерина ли-попротеидоввысокой плотности, выполняемых с использованием анализатора АА-П./Методические вопросы профилактики сердечно-сосудистых заболеваний - М., 1983. - С. 111-117.
3. Дворкин В.И., Малахов В.Н., Заикин Е.В., Третьякова И.П., Галкина И.Л. Оценка относительного "межфасовочного" стандартного отклонения стандартных образцов состава // Ж. аналит.химии. - 1985. - т.40, N/12. - С. 2117-2124.
4. Малахов В.Н., Дворкин В.И., Заикин Е.В.Достоверность результатов популяционных исследований: влияние погрешностей измерений // Международная конференция по профилактической кардиологии: Тез. докл. - М. , 1985. - С. .19.
5. Дворкин В.И..Малахов В.Н., Заикин Е.В. Система внешнего контроля качества популяционных биохимических исследований // Там же, С. 104.
6. Malakhov V.N., DvorkinV.I., Shakhov J.A. et al. Standardization andQuality Control in Population Lipid Investigation // CVD Epidemiology Newsletter - 1985. - N 38. - P. 19-20.
7. Заикин E.В, Дворкин. В.И., Малахов В.Н. Дисперсионный анализ результатов большого числа серий измерений, калибруемых по нескольким стандартам. - М., 1985. Деп. ВИНИТИ N 8917-В85.
8. Малахов В.Н., Дворкин В.И., Заикин Е.В. и др. . Стандартизация массового анализа липидов плазмы крови в исследованиях по кардиологии в СССР: научный подход к обеспечению высокой сопоставимости результатов, получаемых в разных лабораториях // V Всесоюзный биохимический съезд: Тез. докл. - М., Наука, 1986. - Т. 3. - С. 119.
9. Malakhov V.N., ZaikinE.V., DvorkinV.I. Population Studies: Validity nf the Results and Effect of Analytical Errors // Preventive Cardiology. Proceedings of the International Conference on
Preventive Cardiology. - M., 1985. - V.l. - P. 71-79. 10. Хайдукова И.JI., Дворкин В.И., Малахов В.Н. Сопоставимость результатов определения а-холестерина при разделении липопротеидов плазмы крови гепарин-марганцевои и вольфрамо-магниевой смесями // Jía6. дело. 1986,- N 11. С. 687-689.
И. Малахов В.Н., Дворкин В.И. Результаты популяционных исследований в профилактической кардиологии: возможные артефакты // IV Всесоюзный съезд кардиологов: Тез. докл. - М., 1986. - С. 153.
12. Вавкушевская И.Н., Дворкин В.И., Золотов H.H., Малахов В.Н. Хроматографическое определение содержания нейтральных липидов крови // Хроматография в биологии и медицине: Тез. докл. - М., 1986.-Q 77—70
13. A.c.1377733 СССР,.МКИ4 G 01 33/48. Способ подготовки сыворотки или плазмы крови для анализа липидов методом хроматографии / Вавкушевская И.Н., Дворкин В.И., Золотов H.H., Малахов В.Н. - 4 с.
14. Zaikin E.V., Dvorkin V.l. A Need to Consider Interrun Variation inProcessing Data of Population BiocemicalSyudies and Blood Serum Samples Distribution Through Analitical Runs // CVD Epidemiology Newsletters. - 1987. - N 42. - P. 44-45.
15. Заикин fc.ts., Дворкин В.И. Автоматизированная система стандартизации и контроля качества популяционных биохимических исследований (АСУ "Стандартизация") // ЭВМ в аналитической химии. - М., ГЕОХИ АН СССР. - 1987..- С. 9-10.
16. Олферьев A.M., Кудинова А.О., Заикин Е.В. и др. Характеристика спектра липопротеидов крови пилотов гражданской авиации// Космическая биология и авиакосмическая медицина. - 1988 - N 3 - С. 27-31.
17. Заикин Е.В., Дворкин В.И., Шкинев A.B., Абрамов A.A. Учет методических погрешностей при популяционных липидных исследованиях в г-. Ташкенте //II Съезд кардиологов Узбекистана: Тез. докл. - Ташкент: 1988. - С. 112.
18. Дворкин В.И., Заикин Е.В., Малахов В.Н., Шкинев A.B. Липидные исследования в кооперативной программе "Эпидемиология ИБС и атеросклероза в рячпичннх регионах страны". Качество анализов и проблемы интерпретации результатов. // Эпидемиология ишемической болезни сердца и атеросклероза в различных регионах СССР. Таллинн: 1989.-С. 44-45.
19. Левкович O.A., Махмудов Б.А., Абрамов A.A., Дворкин В.И., Заикин Е.В.Динамика показателей липидного обмена у мтачин 40-59 лет в связи с первичной многофакторной профилактикой ИБС среди неорганизованного населения г. Ташкента // Всесоюзный симпозиум "Многофакторная профилактика ишемической болезни сердца": Тез. докл. -Томск: 1989. - 4.1. - С. 83-84.
20. Каринова И.Н., Дворкин В.И., Золотов H.H. Определение содержания холестерина и его эфиров методом ВЭШХ в сыворотке крови с высоким содержанием триацилглицеридов // Ш аналит. химии. - 1989. -Т. 44, N 11. - С. 2104-2107.
21. Каринова И.Н., Дворкин В.И. Хроматографическое определение 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека // Ж. аналит. химии. - 1989. - Т. 44, N 10. - С. 1902-1905.
22. Минченко Б.И., Заикин Е.В., Малахов В.Н. Стандартизация и контроль качества определения натрия, калия и кальция в моче // Профилактика артериальной гипертонии. Иваново: 1989. - С.101-106.
23. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови прямым химическим методом с применением сыворотки крови в качестве образца сравнения // Ж. аналит. химии. - 1990. Т. 45, N 1. - С. 181-187.
24. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Методы определения холестерина (обзор) //Ж. аналит. химии - 1990. - Т. 45, N5. - С. 837-857.
25. Дворкин В.И., Каринова И.Н., Айду Ф.А. Сравнение выборок, проанализированных разными методами, при биохимических исследованиях. - Деп. в ВИНИТИ 04.04.90., N 2079-В90,
26. Dvorkin V.I., Timonin I.M., Minchenko B.I. Structure and Mathematical Model for the results of Na and К determination in ' the urine by phlame photometry in population studies//XI Conference on Analytical Atomic Spectroscopy: Abstracts - Moscow: 1990.- P. 154.
27. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Популяционные биохимические исследования. Сравнение выборок, исследованных разными методами. // Ж. аналит. химии. - 1991. - Т. 46, N 6. - С. 1045-1056.
28. Dvorkin V.I., Karinova I.N. Possible Ihfluence of Interfering Serum Components // Physicochemical Aspects of Medicine. Rewies (Ed. by Jr.M.Lopukhin). V.3, Part 2. A Fluorescent Assay for Atherogenic Pub.GmBH, U.K. - 1991. - P. 66-71.
29. Перова H.B., Rywik S., Sznajd J. и др; Сравнительный анализ профиля липопротеидов крови случайных выборок популяций// C0R VASA. - 1991. - Т. 33(3). - С. 177-187.
30. Дворкин 6.И. Метрологическая аттестация флуоресцентного метода определения (ХС+ТГ) // Флуоресцентные методы исследования и клинической диагностики. - М. :. 1991,- Вып. 2. - С. 15-16.
31. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Оценка влияния некоторых компонентов сыворотки крови на результаты определения (ХС+ТГ) флуоресцентным методом // Там же. - С. 20-21.
32. Дворкин В.И. Ковариационная модель для результатов межлабораторных экспериментов, учитывающая структуру анализа и ее применение при популяционных биохимических исследованиях // 2 Всесоюзная конференция "Математические методы и ЭВМ в аналитической химии": Тез. докл. - М., 1991. - с. 35.
33. Dvorkin V.I. Data Processing in the Interlaboratory Experiment by the Analysis-of-Covariance // 5 Conference Computer Application in Analytical Chemistry: Workbook. - Iena, 1992. - CL15.
34. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Популяционные биохимические исследования. Уменьшение систематической погрешности на стадии градуировки на примере определения холестерина '// И. аналит.химии. -1992. - Т. 47, вып.7. - С. 1200-1210.
35. Дворкин В.И., Маграчева Е.Я., Олферьев A.M. и др. Аналитические характеристики флуоресцентного определения показателя (м;;остерии + триглицериды) в сыворотке крови // Клиническая лабораторная диагностика. - 1992. - N 5-6. - С. 43-46.
36. Дворкин В.И. Выявление погрешностей определния общего холестерина и триацилглицеридов в сыворотке крови.' Обработка данных межлабораторного эксперимента методом ковариационного анализа // Ж. аналит.химии. - 1993. - Т. 48. - С. 1127-1142.
37. Dvorkin V.I. Data Processing in the Interlaboratory Test by Analysis of Covariance // Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. - 1994. - V. 22. - P. 127-146.
38. Dvorkin V.I. An Original Way of the Management of Data Derived from the External Quality Assessment of Biochemical Analysis // Annales de Biologie Clinique. - 1993. - V. 51. - P. 396.
39. Константинов В.В., Жуковский Г.С., Смирнова И.П., Дворкин В.И. и др. Ишемическая болезнь сердца и факторы риска у мужчин в зависимости от этнической принадлежности в различных климато-географических зонах (кооперативное исследование) // Научно-практическая конференция "Актуальные вопросы профилактики неинфекционных заболевании: Тез. докл. - М.: 1993. - Т. 1. - С. 62.
