Аналитические погрешности при определении холестерина плазмы крови в популяционных исследованиях и способы их уменьшения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РСФСР ПО ДЕЛАМ НАУКИ И ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ

МОСКОВСКИЙ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ИМЕНИ Ы.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УДК 643.О:54?.928

КАРИНОВА Ирина Николаевна

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ПОГРЕШНОСТИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ХОЛЕСТЕРИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ В ПОПУЛЯШОНШХ ИССЛЕДОВАНИЯХ И СПОСОБЫ ИХ УМЕНЬШЕНИЯ

02.СХ3.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой стеаени кандидата химических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в отделе стандартизации биохимических мето дов исследований Института профилактики шинфекционных заскшэвани Всесоюзного научно-исследовательского центра профилактически медицшш МЗ СССР.

Научные руководители: доктор биологических наук В.Н.Малахов кандидат химических, наук В.И.Дворкин

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор И.А.Василенко кандидат химичэских наук, старший научный сотрудник С.Н.Ланин

Ведущая организация - Институт эламентоорганических соединени им. акад. А.Н.Несмеянова.

Защита состоится " 19 " июня_1991 г. в 14 часов на засеДЕ

нии специализированного совета К 063.41.04 в Московском институт тонкой химической технологии имени М.В.Ломоносова (117571, Ыосквг пр-кт Вернадского, 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ ю М.В.Ломоносова (119831, Москва, Малая Пироговская, I).

Автореферат разослан "17 " мая_"1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

I). А. Ефимова

Постановка задачи. В настоящее время в широких масштабах проводятся '. популяционные исследования так называемых факторов риска (повышенное артериальное давление, повышенный уровень общего холестерина* в крови, курение и т. д.) у людей, отобранных случайным образом из населения (при этом образуются группы, называемые выборками из популяций). Наличие факторов риска уве/ чивает вероятность возникновения сердечно-сосудистых заболеваний и уровень смертности от них.

Один из важнейших факторов риска - содержание общего холестьри-ка в сыворотке крови обследуемых: очень малые изменения его среднего содержания в сыворотках крови выборки вызывают резкое изменение в смертности от сердечно-сосудистых заболеваний у обследуе-шх этой выборки. Поэтому вакно точно выявлять различия меаду параметрами распределений содержаний общего холестерина исследуемых выборок. Между тем из-за больших масштабов исследований (число сывороток в одном исследовании может достигать десятков тысяч) анализ общего холестерина проводят в разных лабораториях упрощенными и разными методами, имеющими отличные друг от друга систематические погрешности, что является одной из главных причин врте-фактных различий в формах раотредэлений полученных результатов и смещения их средних друг относительно друга. Это приводит к неправильным выводам при интерпретации результатов, полученных из разных лабораторий. Осуществляемые При приведении популяционных исследований меры по стандартизации применяемых методов (использование единого образца сравнения, контроль качества и т.п.) позволяют ■ ограничить различия в систематических погрешностях, вызванных многими причинами, но не влиянием присутствия мешающих компонентов.

Одно из важнейших отличий популяционных биохимических исследований от принятых в аналитической химии исследовании совокупности объектов состоит в том, что в популяционных биохимических исследованиях, как правило, не обязательно получать точные значения дер-каний основного вещества в индивидуальных объектах,, а достаточно установить параметры распределения общего холестерина в выборке.

Кроме того, в популяционных биохимических исследованиях трудно использовать стандартные способы устранения влияния мешанках компонентов в каждой сыворотке, определение которых само по себе

I. Холестерин содержится в сыворотке крови в свободной и этерифи-цированноЛ формах. Обздй холестерин - суммарное содержание свободного и этершфцировакяого холестерина.

сложно и дорого.

Актуальность теш определяется, таким образом, специфичностью объекта и задач популяционных биохимических исследований. Актуальным является учет и уменьшение различий в результатах определения холестерина, возникающих из-за применения разных методов его определения для выборок с различными распределениями содержаний мешапдих компонентов, изучаемых в рамках одного популяционного исследования. Сходные задачи возникают и в других областях аналитической химии биологических объектов, биохимии и т.д.

Актуальной является также разработка методических подходов к оценке влияний тех мешающих компонентов, традиционные способы оценки которых оказываются неприменимы к такому специфическому объекту, как сыворотка крови.

Цель и задачи исследования: цэльй настоящей работы являлась разработка способов уменьшения систематических погрешностей методов определения общего холестерина в сыворотке крови, обусловленных применением разных методов, при популяционных исследованиях.

Достижение указанной цели потребовало решения следующих задач:

(а) - разработка способа уменьшения систематических погрешностей при определении содержания общего холестерина в популяционных исследованиях, основанного на внесении поправок в ходе градуировки методик;

(б) - разработка способа сопоставления результатов массовых определений общего холестерина, полученных разными методиками;

(в) - определение содержания общего холестерина в выборке из популяции методиками, наиболее часто используемыми в популяционных исследованиях, и оценка значимости различий полученных распределений содержаний;

(г) - определение содержаний компонентов сыворотки крови, мешающих определению общего холестерина, и оценка значимости и величины их "влияния;

В этой части работы (г) решались методические задачи:

- разработка методики определения 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека с целью оценки влияния его присутствия на методы определения общего холестерина;

- разработка методики определения холестерина и его эфиров в присутствии триацилглицеридов высокой концентрации на основе ВЭЖХ.

Научная новизна работа:

I. Впервые разработана методика одновременного определения хо-

лестерина и его эфиров в присутствии значительных количеств триацилглицеридов с помощью ВЭЖХ, включающая обработку образцов сыворотки крови триглицеридлипазой, на которую получено авторское свидетельство.

2. Разработана и апробирована методика определения 7-дегидро-холестерина в сыворотке крови человека на основе ВЭЖХ. Показано, что содержание этого вещества в сыворотке крови человека невелико и практически не влияет на определение общего холестерина.

3. Впервые для оценки влияния мешавдих компонентов на результаты анализа применен способ многомерного линейного регрессионного анализа со случайны;® регрессорами, основанный на результатах исследования большого числа сывороток. С помощью этого способа оценено влияние различных компонентов сыворотки крови (эфиров холестерина. общего белка, билирубина, триацилглицеридов, глюкозы) на определение общего холестерина разными методиками.

4. Впервые обнаружено, что присутствие холестерина в сыворотке крови в форме эфира арахидоновой кислоты занижает результаты определения общего холестерина химическими методами, не предусматривающими гидролиза эфиров холестерина, основанными на реакции Ли-бермана-Бурхарда, в отличие от известного завышения результатов из-за присутствия холестерина в форме эфиров других кислот. Показано, что присутствие триацилглицеридов ганижьет результаты определения общего холестерина изученными ферментными методами.

Практическая ценность работа состоит в следупцем: I. Методика определения холестерина и его эфиров может использоваться при определении этих веществ в сыворотках крови с высоким содержанием триацилглицеридов.

• 2. Методика определения 7-дегидрохолестерина может использоваться при определении этого вещества в сыворотках кроьи человека.

3. Разработанный подход к оценке влияний мешаодш компонентов на определение содержания основного вещесть.., основанный на использовании многомерного линейного регрессионного анализа со случайными регрессорами данных анализа большого числа объектов, может Сыть применен для оценки влияний в объектах, для которых приготовление образцов известного состава затруднено. В частности, он Сил применен в лаборатории биофюических методов диагностики НИИ физихо-хн-мической медицины ИЗ РСФСР для выяснения мешающих влияний при определении суммарного содержания общего холестерина и триацилглицеридов разработанным в этой лаборатории флуоресцентным методом.

4. Предложен простой способ сопоставления•результатов массовых определений общего холестерина, полученных двумя разными методиками (I и 2), в двух выборках (А и В) с неконтролируемым распределением содержаний мешающих компонентов.

Способ включает: а) определениь содержаний общего холестерина одной из методик (2) в малой подвыборке из выборки (А), проанализированной другой методикой (I); б) нахождение с помощью регрессионного анализа уравнения связи между результатами, полученными 'этими методиками, по данным измерения общего холестерина обеими методиками в малой подвыборке; в) последующий пересчет по найденному уравнению с^язи остальных результатов определения общего холестерина в выборке В.

Способ может быть использован в различных областях аналитической / "эши к биохимии для сопоставления данных, полученных разными методами, и частности, он был использован при сопоставлении содержаний гормонов крови, измеренных в лаборатории биохимии факторов риска №3 ВНШТ7Ы МЗ СССР и Медицинской академии в Кракове.

Б. Предложен экспрессный способ уменьшения систематических ло-грешностей методик определения общего холестерина, используемых в одном популяционном исследовании, основанный на введении расчетного поправочного коэффициента или использовании для градуировки образца сравнения на основе сыворотки крови с контролируемым содержанием общего холестерина и мешающих компонентов. Способ может применяться в лабораториях, проводящих, массовые определения общего холестерина.

На защиту выносятся:

1. Методика одновременного определения холестерина и его эфиров в сыворотке крови человека с помощью ВЭЖХ в присутствии многократного избытка триацилглицеридов, включающая предварительный ферментативный гидролиз триацилглицеридов.

2. Методика определения 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека, основанная на предварител :ом концентрировании, отделении с помощью ВЭЖХ более полярных органических компонентов и последующем фотометрировании раствора в УФ-области.

3. Применение способа многомерного линейного регрессионного анализа со случайными регрессорами для оценки влияния мешающих компонентов на результаты анализа веществ, для которых невозможно получить адекватные стандартные образцы состава.

' 4. Простой статистический способ сопоставлсшя результатов мае-

совых популяционных определений общего холестерина разными методиками в двух выборках с неконтролируемым содержанием мешающих компонентов, основанный на статистическом исключении влияния различия методик и неконтролируемых мешающих компонентов.

Б. Экспрессный градуировочный способ уменьшения систематических погрешностей методик массовых определений общего холестерина, основанный на введении расчетного поправочного коэффициента или использовании для градуировки образца сравнения на основе сыворотки крови контролируемого состава.

Апробация работы и публикации: результаты работы были долокэны на международном симпозиуме "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1986 г.), на Всесоюзных совещаниях по стандартизации биохимических методов исследования (Фрунзе, 1985 г., Нальчик, 1989 г.), семинаре отдела стандартизации биохимических методов исследований; межотделвнческой конференции Института профилактики неинфекционных заболеваний ВНИЦПМ МЗ СССР; семинаре кафедры аналитической химии Московского института тонкой химической технологии (1991 г.). Основное содержание работы представлено в 9 публикациях, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из вводения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, выводов и приложения. Диссертация изложена на/^2стр., содержитрисунков и таблиц. Библиография вклпчает/j>j> наименований работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исслсдуемая выборка состояла из 374 сывороток крови одной из типичных популяций.

, В качестве образцов сравнения использовали растворы холестерина 6 безводном этаноле или изопропаноле (ОС) и слитые донорские сыворотки крови (ОСС), приготовленные и аттестованные в отделе стандартизации биохимических методов исследований ВНИЦ ПМ IS СССР.

Определение общего холестерина в сыв<. .отках проводили методами: I. Метод экстракционный химический и гидролизом эфиров холестерина (Duncan I.W., Mather A., Cooper G.R., 1980). Выбор его был обусловлен тем, что метод обладает вьгсокзаги правильностью я воспроизводимостью и является общепринятым для получения действительных значений (далее обозначен МС).

2. Прямой (без предварительной обработки образца) химический, 'основанный на реакции холестерина с сэрной кислотой в присутствии уксусной кислоты и уксусного ангидрида (Ilea S.. 1962), с градун-

- 8 -

ровкой по 00 (Метод AI) и по ОСС (Метод А2).'

3. Экстракционный (с предварительной обработкой образца изопропа-нолом) химический на автоанализаторе "Technlcon" (согласно инструкции к автоанализатору AAII), "градуированный по ОС (Метод BI) и по ОСС (Метод В2). '

4. Ферментный на автоанализаторе "Hitachi", градуированный по ОСС (метод С2). Значения, принятые в качестве полученных методом CI (градуировка по ОС), рассчитывали по данным независимого эксперимента.

5. Ферментный на автоанализаторе "Centrifichem", градуированный по водным ОС (Метод DI) и по ОСС (Метод 1)2).

Ферментные методы основаны на гидролизе эфиров холестерина и окислении образующегося холестерина с помощью ферментов и последующем определении выделяющегося пэроксида водорода по реакции с 4-аминоантипирином и фенолом.

Выбор методов A-D ("рутинных") определялся тем, что их обычно используют при массовых определениях общего холестерина.

Определение содержания мешающих компонентов проводили: свободного холестерина, триацилглицеридов и гликозы - ферментными методами на автоанализаторе "Hitachi-705" (наборы, реагентов фирмы "Wako"); билирубина - фотометрироввнием щелочного азопигмента (Fog J., 1958); общего белка - биуретовым методом (Henry- R.J., 1964); индивидуальных эфироз холестерина - методом ВЭЖХ на обращенной фазе C-I8 (образцы с повышенным содержанием триацилглицеридов анализировали согласно разработанной . нами методика); ?-дегидро-холестерин - с помощью разработанной нами методики на основе ВЭКХ.

Расчеты проводили на ЭВМ "IBM PC-XT" (с использованием статистических программ "SPSS РС+", "Statgraphic") и "Реалите 2000".

: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Разработка новых аналитических методик:

Методика определения 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека состоит в гидролизе эфиров водно-спиртовым раствором КОН, экстракции гвксаном, отборе и высушивании органической фазы, растворении осадка в малом количестве изопропанола и хроматографи-ровании на колонке с обращенной фазой C-I8, с фотометрированием при 282 нм. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонит-рил-изопропанол=35:65 (по объему). Предел обнаружения метода составляет 0,05 мкМ, относительное стандартное отклонение - 0,04.

Методика определения холестерина и его эфиров в присутствии

триацилглицеридов в высокой концентрации, заключается в обработке образца сыворотки крови триглицеридлипазой с целью гидролиза триацилглицеридов, экстракции изопропанолом, центрифугировании и хро-матографировании надосадка с „ фотометрированием при 205 нм. Использовали те же условия хроматографирования, что и в методике определения 7-дегидрохолестерина. На методику получено авторское свидетельство.

2. Результаты определения общего холестерина разными методами в сыворотках крови. Характеристики полученных распределений содержаний общего холестерина в исследуемой выборке приведены в табл. I. В случае каждого из методов распределения оказались близкими к нормальному, что дало возможность применения разработанной для нормальных распределений статистических методов обработки.

Таблица I

Характеристики распределений содержаний общего холестерина, полученных исследуемыми методами.

параметры метод С, мМ а ,мМ асимметрия ЭКСг-цесс а Р

МС 5,66 1,06 0.63 2,15 > 5Х <0.0001

AI 5,73 1,08 0,60 I.7Í > 20* <0,0001

А2 5,60 1,03 0,50 I.I9 > 20S <0.0001

BI 5,98 1,11 0.48 0,52 > 5% <0.0001

В2 5,50 1,00 0,52 0,96 > Ь% <0,0001

С2 5,60 1,09 0,58 1,92 > 20% 0.0024

' DI Б,29 0,96 1,34 -2,25 > 20% <0,0001

D2 5;25 0,96 -0.20 -3,23 > 20* <0,0001

Здесь С- среднее значение распределен!« :одержаний; о - стандартное отклонение; а - уровень значимости выполнения гипотезы о нормальности распределения (гипотеза т/ринималась при а>5Ж); р -вероятность того, что средняя величина распределения не отличается от действительной.

Средние величины результатов определения общего холестерина, полученных рутинными методиками, отличаются от среднего действительных значений содержания общего холестерина и друг от друга статистически значимо, т.е. каждая из этих методик имеет систематические погрешности, без учета которых сравнение результатов, полученных

разными методиками, некорректно. Кроме того, распределения различаются по форме, т.е. имеют разные асимметрии и эксцессы.

Результаты расчетов коэффициентов уравнений линейной регрессии вида С0= аСд.+ Ъ (где С0 и С^ - действительное и измеренное рутинным методом ^ содержание общего холестерина, соответственно) приведены в табл.2. Линейность зависимости подтверждена анализом остатков.

Таблица 2.

Результаты расчета уравнений линейной регрессии мэжду значениями общего холестерина, полученными рутинными методами и МО?

Метод 3Г Г а Ъ.мМ

А1 0,063 0,939 1,061 -0,42

А2 0,031 0,967 • 1,053 -0,13

Б1 0,052 0,896. 1,053 -0,63

В2 0,026 0,950 1,096 -0,37 .

С1 0,062 - 1,034 -0,06

сз 0,038 : 0,939 1,021 -0,06

0,034 0,888 1,128 -0,26

Ь2 0,022 0,913 1,090 -0,10

*зг МС составляло 0,017.

3. Способ оценки влияния мешающих компонентов на результат! определения общего холестерина разными методами. Предложен слосо> оценки влияний мешающих компонентов на метода определени основного вещества, заключающийся в предварительном определении большом числе образцов содержания общего холестерина рутинны методом ;} (С), N0 (Сд) и мешающих компонентов (С^) и последующе нахождении зависимости:

В;ГСГС0=■ ( где й- - величина, связанная с присутствием в пробе неизвестно мешащих компонентов, коэффициент к^ (ниже называется коэффицие* том влияния) показывает величину влияния 1-го мошаодего компонен-) на метод д.

Коэффициенты к^ и й^ определяли методом многомерного линейж регрессионного анализа со случайными регрессорами. Одновремеш проверяли принятые, гипотезы о взаимной независимости и линейности связи величин Сч и ^ (анализом остатков и друг:

- И -

способами), а также оценивали погрешности определения величин к^.

В отличив от известных способов нахождения коэффициентов к^ (Бэрнштейн И.Я., Каминский Ю.Л., 1983), предусматриваших изготовление образцов известного состава, применение такого способа позволяет определять коэффициенты к^ и ^ в случаях, когда приготовить обрвзда известного состава затруднительно (например, в случае сыворотки крови).

4. Мешающие компоненты и их влияние на результаты определения общего холестерина. Мешающие компоненты были отобраны в основном по литературным данным: общий белок, билирубин, триацилглицериды, глюкоза, эфиры холестерина, 7-дегидрохолестерин.

Проведение измерения показали, что содержание 7-дегидрохолестерина в сыворотках крови человека мало, и влияние этого вещества на методы определения общего холестерина незначимо.

Содержание остальных перечисленных мешающих компонентов ' измерили во всех сыворотках исследованной выборки.

Методом многомерного линейного регрессионного анализа получены следующие уравнения вида (I) для исследуемых методов:

П'1Сбил + 3-7Рпхс " г-9Рахс " Я-11 <2)

1.э-1о^оЛл+10.30^-7.з.1о-®с0 - з.арш0 ' '

+ ^лхс + 2'бРолхс '" (3)

%= 7,1.10-3С09Л - 7.4Сат + 1.3?^ - 1,3.10-% - 1,04 (4)

%= 2'1Рахс+ 2-2Р0ЛХС~ °-05С0- 4.3-Ю-3СТГ - 0.77 (5)

где Сбил, С0 и Стг- содержание билирубина, общего холестерина и триацилглицеридов, соответственно, в мЧ, Сб0Л - содержание бвлкв в г/л, Рахс. Рлхс. Ролхс. Рцхс - соответственно отношения содержаний эфиров холестерина: арахидоната, линолеата, олеата и пальмита-та к содержанию общего 70лестерина. Содержание эфиров холестерина рассматривали в преобразованной форме - в виде отношения к содержанию общего холестерина, - поскольку между ними л содержанием общего холестерина существует линейная зависимость, что противоречит принятому для математических расчетов предположению о независимости регрессоров.

В уравнения включены Составляющие с коэф$ициентвмя, отличавши-

мися от О достоверно (р > 0,90). Влияние глюкозы оказалось незначимым для всех методов в исследованом диапазоне содержаний.

Гипотеза о линейном характере связи ^ с величинами Сд, ССил,

°бел- рахс- рпхс- ролхс рлхс Х0Р°Ш0 ВШ10лняется- чт0 было ПР0®0" рено анализом остатков при регрессионном анализе.

Уравнения (2-5) содержат новую информацию о мешающих компонентах: а) присутствие холестерина в виде эфира арахидоновой кислоты занижает результаты определения общего холестерина исследованными химическими методами, в отличие от присутствия его в виде эфиров других кислот; б) присутствие триацилглицеридов оказывает влияние на исследованные ферментные методы; в) индивидуальные эфиры холестерина влияют на ферментные методы.

В то же время известные из литературы коэффициенты влияния (например, билирубина и общего белка) совпали с рассчитанными нами.

5. Способ сопоставления результатов, полученных разными методиками. Для сопоставления результатов определения общего холестерина в выборках, проанализированных разными методами, предложен способ приведения распределений всех полученных данных к сопоставимым, т.е. либо пересчет всех распределений результатов к тем, которые были бы получены МС, либо аналогичный пересчет распределений определенных разными методами значений общего холестерина друг к другу.

Для этого необходимо провести определение содержания общего холестерина С0 МС (или сравниваемым рутинным методом) в 'случайной малой подвыборке из анализируемой рутинным методом о выборки, найти вид зависимости:

С0 •= Г (О)) . (6).

гдо С^ - значения общего холестерина, полученные методом ;), и пересчитать результаты определения общего холестерина рутинным методом к действительным (или получе:. им другим рутинным методом) по этой форлулэ. Зависимость (6) находили с помощью регрессионного анализа с учетом случайных ошибок измерений как С^, так и Сд.

После пересчета выборки можно сравнивать с применением обычных статистических методов.

С использованием описанного способа нами был проведен пересчет распределений содержаний общего холестерина, полученных рутинными методами, в исследованной выборке, к действительному по формуле (6). Объем подвыборки составлял 100 проб. Распределения значений содержания общего холестерина, полученных рутинными методами, и

пересчитанных к действительным по формулам вида Сд = г(С^), совпали с распределением значений общего холестерина, полученных МС, в широком диапазоне содержаний. Результаты такого пересчета проиллюстрированы на рисунке на примере метода М.

Зависимость погрешности пересчета от объема подвыборки для подбора его в конкретной задаче нашли с. помощью математического моделирования. .....

--МС '----метод Б1

• -- - распределение значений содержания общего

холестерина, полученных методом 01 и пересчитанных к действительным по (6).

Предложенный способ позволяет сравнивать значения общего холес-тергша, полученные разными методами, в выборках с любыми распределениями мэшагацих компонентов и общего холестерина.

6. Способы градуировки, гозволявдне уменьшить систематические погрешности методов определения общего холестерина. 'Для близких, по содержанию мешающих компонентов и общего холестерина популяций можно уменьшить систематические погрешности рутинных методов определения общего холестерина, градуируя вти методы определена,м

образом.

Прл определении содержания общего холестерина в массовых исследованиях часто используется градуировка по одному образцу сравш-ния, например, в большинстве методов с применением автоанализаторов, однако целенаправленный выбор состава матрицы образца сравнения при этом не проводится.

6.1. Градуировка методов определения общего холестерина по одному образцу сравнения. Поскольку уравнения регрессий С0=аС^+Ъ (градуировка по ОС) имеют значительный свободный член, вообще говоря, градуировка по одному образцу сравнения не может привести к полному устранению расхождений между результатами определения общего холестерина рутинными методами и ЫС. Тем не менее, градуировка по одному ОСС уменьшает систематические погрешности вблизи точки пересеченля прямых, построенных по уравнениям регрессии (градуировка по 0С0) с прямой Положение этой точки опреде-

ляется содержанием общего холестерина и мешающих компонентов в ОСС. Пользуясь уравнениями регрессий, приведенными в табл. 2, легко показать, что при использованном в работе ОСС (неконтролируемого состава) точка пересечения лежит в области 2-4 мЫ. в других областях концентраций существенный выигрыш в правильности отсутствует.

Йэво.шно часто в популяционных исследованиях изучаются средние величины распределений результатов, поэтому в этой главе мы рассмотрели способ коррекции именно этих величин. В этом случае целью градуировки является смещение среднего распределений значений общего холестерина, полученных рутинным методом, к среднему распределения действительных величин,

Пусть С^ - среднее значение результатов определения общего холестерина, полученных руганным методом, в выборке; Сд - среднее действительных значений общего холес. -рина в той же выборке. Тогда для пересчета С^ к Сд можно в процессе градуировки умножить все С^ на коэффициент

сц * Vе.1' (7)

соответствующий данному методу анализа.

Описанный способ пересчета с применением коэффициента а^ можно осуществить по меньшей мере в двух вариантах: а) В первом варианте способа оледует приписать ОС концентрацию

Сос-<\)Сос- (8)

где Сос - действительное содержание общего холестерина в ОС.

Вычисленные по (7) коэффициенты а^ и их стандартные отклонения для исследованных методов 3 для исследованной выборки имеют следующие значения: метод А1 - 0,987 (в=0,007); В1 - 0,948 (в=0,005); С1 - .1,025 (¡5=0,004); Ш - 1,071 (в=0,004).

б) Во втором варианте способа предлагается использовать для градуировки ОСС с заранее заданным составом матрицы, для которого выполняется услови .

I 1-а.

+ Ч " С0 "о^ (Э)

Варианты состава ОСС, удовлетворянг.ие решению системы уравнений (9), пригодны для всех четырех исследуемых рутшпшх методов.

С точке зрения уменьшения межсерийной погрешности анализа предпочтительно применение градуировки по ОСС по сравнении с ОС (по нашим данным, межсерийные о.с.о. достоверно уменьшаются в атом случав с 0,034-0,0в3 до 0,020-0,026 для разных рутинных методов).

Очевидно, что в реальной ситуации величины а^ для каждой вновь исследуемой популяции неизвестны, и применение градуировки по образцам сравнения для уменьшения систематических погрешностей возможно только в том случае,. когда мсжно с достаточной точностью оценить эти величины до начала исследования.

Проще всего принять одну и ту же величину а^ для широкого круга исследуемых популяций. Возможность этого определяется разбросом величин а, между популяциями, который мы оценил!. следущим образом. Бкли собраны литературные данные о содержании мотапвдх компонентов и общего холестерина в сыворотках крови различных популяций (число популяций составляло от II до 80 для разных параметров); расочитаны межпопуляционнне средние значения для каждого мешающего компонента и общего холестерина, их стандартные отклонения (средние значения для каздой популяции при этом рассматривали как единичные измерения). На основе этих данных и ранее наГдпчных коэффициентов Ц ^ и с!^ оценили средние коэффициенты а^ (а^ р) н их 'стандартные отклонения для совокупности популяций белого взрослого населения (табл. 3)

2.Поправку к результатам можно вносить как в предложенной мультипликативной, тек и в других формах (например, аддитивной). В случае незначительной коррекции ((СС0)/С0 « 0,1) форма

пмгрглжл несущественна. В противнем случае мультипликативная коррекция лучше соответствует логнормальному распределении определяемого компонента в популяции.

Были сделаны приближенные оценки величин о^ для других, кроме описанных выше, популяций. Для детских популяций они мало отличались от найденных нами а^ р. Для популяций обследуемых с заболеваниями, приводящими к сильному изменению содержания одного из мешающих компонентов, значения а^ значительно отличаются от а^ р.

Величины а. _

Таблица 3. и стандартные отклонения для них.

метод А1 В1 С1 Ш

ЙЗ.Р 0,986 0,923 1,002 1,066

в 0,017 0,029 0,039 0,036

6.2. Градуировка по нескольким образцам сравнения. Способы уменьшения систематических погрешностей при градуировке по нескольким ОСС аналогичны использованньм в 6.1 о той разницей, что в случае нескольких ОСС коррекция возможна во всем диапазоне концентраций общего холестерина. Правда, во многих случаях целью исследования является лишь оценка средних значений распределений, для чего применение одного ОСС вполне достаточно. Коэффициент аналогичный а^ для случая одного ОСС, имеет вид:

Р3(С) - ¿(С.,)/^ (10)

а) первый вариант компенсации систематических погрешностей в ходе градуировки (без учета состава ОСС) заключается в приписывании каждому ОС содержания общего холестерина С*с д:

' Р^С,

ос,п

"ос,п*-сос,п

(И)

где Сос - действительное содержание г'щего холестерина в п-ом ОС б) второй вариант способа заключается в нахождении составов матриц ОСС, для которых выполняются условия:

1 <М°оо „Ы

2 ЦЛ + <Ц = Сос • Д 00 »п-

1-1 « 1 3 ос

В случае линейной зависимости Сд - * достаточно двух ОС (ОСС) для компенсации систематических погрешностей, связанных с различиями в методах определения общего холестерина.

Расчеты не показали достоверного снижения мо«серийной вариации результатов по сравнению с градуировкой по одному ОСС.

(12

Предложенным способом уменьшения систематических погрешностей следует пользоваться с осторожностью - только для сходных по содержанию мешающих компонентов и общего холестерина популяций. Если имеются сомнения относительно близости распределений ?дашахших компонентов в сравниваемых популяциях, надежнее пользоваться сопоставлением результатов с помощью пересчета.

Несмотря на указанные ограничения использования способа уменьшения систематических погрешностей в ходе градуировки, он может найти широкое применение, так как: а) значительно чаще других при популяционных исследованиях факторов риска изучают однотипные популяции; б) градуировка по одному и тому же ОСС может использоваться для компенсации систематических погрешностей двух или более рутинных методов, если для них удается найти сочетание концентраций мешающих компонентов и общего холестерина, удовлетворявших уравнениям (9).

Основные результаты работы

1. Разработаны новые методики анализа:

- методика одновременного определения холестерина и его эфиров в присутствии значительных количеств триацилглицеридов с помощью ВЭЖХ, отличающаяся от существующих предварительным ферментативным гидролизом триацилглицеридов. Предел обнаружения 0,04 мМ, относительное стандартное отклонение - 0,04.

- методика определения 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека с помощью ВЭЖХ после ' предварительного концентрирования. Предел обнаружения - 0,05 мкМ, относительное стандартное отклонение - 0,04.

2. Разработан способ оценки влияния мешающих компонентов на определение основного вещества с использованием линейно. регрессионного анализа. Проведена оценка влияния различных компонентов сыворотки крови на определоние общего холестерина. Показано, что значимым является влияние эфиров холестерина,• общего белка, билирубина, триацилглицеридов.

3. Показано, что содержание 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека невелико и практически не влияет на результаты определения общего холестерина.

4.Предложен простой статистический способ сопоставления результатов массовых определений общего холестерина разными нетодикшли в выборках с неконтролируемым содержанием мешающих компонентов.

5. Предложен экспрессный способ уменьшения систематических

погрешностей методик массовых определений общего холестерина - для случая близких по концентрациям общего холестерина и мешающих' компонентов популяций, - в ходе градуировки.

S. Показано, что градуировка методов определения общего холестерине по сывороточному образцу сравнения приводит к значительному (по сравнению с градуировкой по раствору чистого холестерина) уменьшению мексерийной погрешности анализа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хрсматографическое определение содержания нейтральных липидов в крови / Вавкушевская И.Н., Дворкин В.И., Золотов H.H., Малахов В.Н. // Международный симпозиум "Хроматография в биологии и медицине": Тез. докл. - М., 1986. - С. 77-78.

2. Л ". 1377733 СССР, МКИ4 G 01 33/48. Способ определения липидов в сыворотке или плазме крови / Вавкушевская И.Н., Дворкин В.И., Золотов H.H., Малахов В.Н. (СССР). -4с.

3. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови прямым химиче ом методом с применением сыворотки нрови в качестве образца сравнения // Ж. аналит. химии. - 1990. - Т. 45, * I. - С. I8I-I87.

4. Каринова И.Н., Дворкин В.И., Золотов H.H. Определение содержания холестерина и его эфиров методом ВЭЖХ в сыворотке крови с высоким содержанием триацилглицеридов // Я. аналит. химии. - 1989..- Т. 44, * II. - С. 2104-2107.

5. Каринова И.Н., Дворкин В.И. Хроматогрвфическое определение 7-дегидрохолестерина в сыворотке крови человека // Ж. аналит. химии. - 1989. - Т. 44, * 10. - С. 1902-1905.

6. дворкин В.И., Каринова И.Н., Айду Ф.А. Сравцэние ьыборок, 'проанализированных разными методами, при биохимических исследованиях. - М., 1990. - 28 с. - Деп. в ВИНИТИ 04.04.90, » 207Э-В90.

г>. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Метода определения холостерина

// Я. аналит. химии. - 1990. - Т. 46, * Б. - С. 837-857. Ü. Дворкин В.И., Каринова И.Н. Уменьшение систематических погрешностей популяционных биохимических • исследований при градуировке на примере определения холестерина. - М., 1991. -27 с. - Деп. в ВШШИ 24.01.91, * 400-B9I; 9. K&rinova I.H., Dvorfcin V.l. Katinsation of influenoeB воте eub-stanoen on the results oi determination of 1..0 aum (TG+TG) by the fluoreoenoe method /PhyBioo-ohemioal Aspects of Medicine ReviewB.- V.3.- Part 1.~ Harwcod Aoad. РиЫ., 1991.- P. 66-72.