Анализ микроструктуры водных крахмальных систем методами электронной микроскопии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

УДК 664.2.059.22 на правах рукописи

Р Г 5 ОД

ФИЛАТОВА Анна Григорьевна •

-1 фев гсоо

АНАЛИЗ МИКРОСТРУКТУРЫ водных КРАХМАЛЬНЫХ СИСТЕМ МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Специальность 02.00.02 — Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2000 г.

Работ;] выполнена в Институте биохимической физики им. Н. М. Эмануэля РАН, Институте элементоорганичесхих соединений им. Л. Н. Несмеянова РАН, Институте химической физики им. Н. Н. Семенова.

Научный руководитель — заслуженный деятель пауки

н техники РФ, доктор химических наук, профессор 10. А. Клячко

Научный консультант — кандидат химических наук,

ведущий научный сотрудник В. К. Латов

Официальные оппоненты — доктор химических наук

В. Д. Копылова,

— доктор химических наук К. 3. Гумаргалиева

Ведущая организация — Институт биохимии

им. А. Н. Баха

Защита состоится __ 2000 г. в . . . .

часов в аудитории __ на заседании диссертационного совета К-063.45.02. б Московской Государственной технологической академии (Москва, Ж-4, ул. Земляной Вал, д. 73).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной технологической академии.

Автореферат разослан « »_ 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических паук,

доцент Касьяненко Г. Р.

ГЙТ- А -/¿Г Г)

АНАЛИЗ МИКРОСТРУКТУРЫ ВОДНЫХ ДИСПЕРСИЙ И КРИОГЕЛЕЙ КРАХМАЛА

Актуальность темы

Крахмал является одним из наиболее распространенных веществ в 1астительном мире. Широкое распространение крахмала в природе, его во-юбновляемость как растительного сырья, относительная легкость приме-[ения различных технологий для физико-химической, энзиматической,тер-югидромеханической модификации крахмала позволяют получить продукты с >азличными физико-химическими,функциональными и потребительскими ¡войствами. Крахма^л играет решающую роль- в определении структуры мно-■их пищевых продуктов, очень важной как для потребителей, так и для [роизводителей. Структура - это важнейший фактор, регулирующий вкусо-1ые качества большей части пищевых продуктов. Понимание взаимосвязи [ежду структурой крахмала и другими компонентами пищевых систем тлеет юлыгое значение для контроля свойств крахмалосодержащих продуктов.

В последние годы в пищевой промышленности широко используются ароматизаторы, которые вносятся в пищевые продукты с целью улучшения [х„ органолептических свойств. Актуальной задачей является изучение 1лияния ароматообразующих веществ на структуру крахмальных систем. Ра-¡ее при исследовании сорбционной способности криотекструктуратов крах-1ала было показано, что необратимая сорбция наблюдается в случае сое-(инений, содержащих н-октильную углеводородную цепь. Поэтому представ-шет интерес изучить влияние этих соединений на структуру криотексту-)ата крахмала.

В настоящее время для изучения структуры биополимерных систем ши-юко используется электронная микроскопия. Особенностью метода элект-ганной микроскопии является необходимость использования особой препа-)ативной техники для подготовки объекта к анализу. При электронномик->оскопическом исследовании систем биополимер-вода приходится учитывать :о обстоятельство, что точные количественные методы анализа, используемые в современных приборах, ограничиваются неопределенностями, связными о подготовкой объекта к анализу. Поэтому необходимо изучить газможности препаративной техники электронной микроскопии применитель-ю к водным крахмальным системам.

Цели и задачи исследования .. Изучение влияния ароматообразующих веществ на микроструктуру и по-¡ерхностный состав криогелей кукурузного крахмала.

!. Определение микроструктуры набухших зерен и дисперсий клейстеризо-

ванного крахмала.'

3. Изучение возможностей криостата к РЭМ о целью исключения артефан тов, вызванных разрушающим действием электронного пучкз, а также влик нием препаративной техники на структуру образца. ' .

Для этого мы считали необходимым:

- изучить возможности криостата РУПИК к РЭМ 100У, позволяющего иссле довагь образец без артефактов применительно к различным биополимернь системам - белкам и полисахаридам.

- определить оптимальный режим работы криостата для получения информ; ции о реальной структуре водосодержащего объекта.

- изучить возможности криостата РУПИК к РЭМ 100У для уменьшения лс кального нагрева электронного пучка в процессе исследования термочувс твительнах полимерных систем.

г- сравнить различные препаративные методы, использующие низкотемперг турную фиксацию структуры образца, на примере водных дисперсий и геле биополимеров. С этой целью дополнительно.привлекались методы термичес кого анализа и рентгенографии.

- выявить структурные закономерности при набухании, клейстеризащ водных дисперсий крахмала, криогелей крахмала методами РЭМ, ПЭМ и СВ

- определить влияние ароматообразующих соединений на микрострукту! криогелей крахмала, используя различные структурные методы: электро; ную микроскопию, рентгенографию и рентгеновскую фотоэлектронную спек' роскопию.

- определить на какой стадии получения криогеля крзхмала происх< дит изменение его структуры, вызванное добавлением к золю ароматообр; зующих веществ. Для этого использовались различные методы электронш микроскопии: РЭМ и СТМ.

Научная новизна

Впервые методом электронной микроскопии, методами термическо: анализа и рентгенографии определены условия препарирования водн! крахмальных систем. Установлено, что крахмальные системы с концентр, цией полимера 20£ и более могут быть препарированы методом заморажив, ния-выоушивания без появления артефактов препарирования, а системы меньшей концентрацией полимера необходимо исследовать с применени криостатов, поддерживающих температуру; образца -130 -140" С.

Впервые изучены методологические возможности криостатов для пол 'чения безартефактной структуры дисперсий набухших зерен крахмала, ди

- Б -

ероий волокон целлюлозы, гелей желатины при исследовании этих систем етодами РЭМ и ПЭМ.

Впервые изучена микроморфология криогелей крахмала,( содержащих азЛичные ароматообразующие соединения, методами электронной' микроско-ии, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии и рентгенографии, огласно данным, полученным ранее Методом газовой хроматографии, наи-олыпая сорбция криогелей крахмала наблюдается для н-октилацетата 95%), наименьшая для н-бутилацетата (38%). В нашей работе показано, го н-октилацетат оказывает наибольшее влияние на структуру криогелей /курузного крахмала, н-бутилацетат практически не вызывает заметных вменений в структуре образца.

Впервые рентгенографическим методом изучено структурообразование риогелей крахмала в процессе ретроградации. Определена степень крис-злличности криогеля крахмала, содержащего н-октилацетат, и исходного, ээ ароматообразующего соединения. В процессе структурообразования риогелей определена продолжительность индукционного периода, которая звисит от наличия или отсутствия ароматообразующих соединений в сис-эме.

Впервые методом РФЭС установлено, что ароматообразующее соединение зтается в системе при длительном хранении криогеля крахмала на возду-э и в условиях вакуума, что представляет интерес при разработке тех-шогий, связанных с применением ароматизаторов в пищевой промышлен-зсти.

Практическая значимость работы

Изучены возможности электронномикроскопического метода о исполь-эванием криостатов применительно к пищевым системам.• Показано, что о мощью криостатов можно проводить экспресс-анализ структуры пищевых ютем, что позволяет проводить аналитический контроль качества пище-к продуктов, так как структура и свойства взаимосвязаны.

Изучено влияние различных ароматообразующих соединений на струк-ФУ криогелей кукурузного крахмала. Показано, что методами РЭМ и РФЭС зжно дать количественную характеристику влияния ароматообразующих со-(инений, вызывающих модификацию структуры поверхности криогеля крах-зла. В течение длительного времени структура модифицированной поверх-зсти сохраняется, а ароматообразующее соединение не улетучивается из зиогеля при помещении образца в высокий вакуум.

Разработанный метод аналитического контроля может быть рекомендо-щ для производства пищевых продуктов.

Реализация результатов исследования

Изучение криогенной препаративной техники на примере водных крахмальных систем позволили определить условия препарирования биополимеров, содержащих воду. Показано, что при электронномикроскопическоь исследовании систем биополимер-вода определяющим фактором являете? концентрация полимера в системе. В зависимости от концентрации полимера необходимо выбирать условия препарирования, позволяющие исключит! артефакты,вызванные замораживанием образца. Разработанный метод можне рекомендовать научным лабораториям, исследующим структуру гелей, дисперсий, растворов биополимеров.

Изучение различных режимов работы криостата РУ1ШК и РЭМ 100У I определение надежности отдельных узлов приставки в процессе работь позволили внести некоторые конструктивные изменения в криостат РУПИК; что в дальнейшем были учтены при серийном производстве приборов н; Сумском ПО "Электрон" (Украина). Апробация работы.

Результаты работы докладывались на следующих онференциях и симпозиумах :

1) на 2— Международном симпозиуме "Строение, свойства, качестве древесины" (Москва-Мытыщи, Россия,1996 г.); на 16 -- Российской конференции по электронной микроскопии (Москва, Черноголовка, '1996 г.); н; 10 -- Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопш (Москва, Черноголовка, 1997 г.); на 17 -- Российской конференции пс электронной микроскопии, (Москва, Черноголовка, 1998 г.);на 11— Всероссийском симпозиуме по растровой электронной микроскопии (Черноголовка,. 1999 г).

Публикации, по. результатам исследований опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и заключения. Работ; изложена на 95 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы, < графиков, 19 рисунков. Список литературы включает 139 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Обзор литературы посвящен методическим аспектам криогенной техники при электронномикроскопическом исследовании систем биополимер-вода Известно, что кри'ометоды в электронной;микроскопии могут быть использованы как для фиксации структуры образца в процессе препаративны; операций, так и с целью предотвращения изменения структуры объекта по,

действием электронного пучка. В обзоре кратко описаны различные формы низкотемпературной фиксации структуры водосодержащего образца, которые по мнению авторов этих работ позволяют уменьшить размеры кристалликов льда при замораживании образца. Приводится оценка возможностей каждого метода в плане получения информации о реальной структуре объекта при исследовании его в электронном микроскопе. Обсуждаются работы, в которых замораживание образца позволяет уменьшить радиационный и термический эффект электронного пучка при исследовании его методами растровой (РЭМ), просвечивающей (ПЭМ) электронной микроскопии, а также методом рентгеноспектрального микроанализа (РСМД).

Рассматриваются различные источники возможных артефактов при исследовании образца с использованием криотехники. В обзоре литературы приводятся в основном те работы, которые оказали влияние на развитие препаративной 'техники при исследовании биополимррных систем методами ПЭМ и РЭМ. На основании литературных данных определены цели и сформулированы зкадачи исследования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

II. Вторая глава диссертации посвящена методическим аспектам исследо-вапния биополимерных систем в РЭМ с использованием криостатов. Рассматриваются два методических вопроса применения криостатов:

1) как способ препарирования водосодержащего образца,

2) как защита образца от термического действия электронного пучка в процессе исследования. ' '

Объекты и методы исследования

Для установления общего характера полученных закономерностей в эксперименте использовались различные водные биополимерные системы; эти системы являются неравновесными, поэтому они восприимчивы к действию препаративной техники.

В качестве объектов исследования были выбраны следующие системы:

1) дисперсии целлюлозы МипкЬе11, фирма "Ралас1а" (Швеция) различной концентрации (5%, 10%, 20%, 30%),'

2)дисперсии измельченного свекольного жома с концентрацией полимера в системе (5%, 20%).

3) дисперсии набухших зерен кукурузного и картофельного крахмала (5%).

4) гели желатины различной концентраций (2%, 5%, 10%, 20%).

В качестве вспомогательных объектов исследования применялись термочувствительные полимерные системы с металлосодержащими кластерами.

Использовался нафтоиленимидобензимидазол (ПНИБ), взятый как полимерна: магрицз, в которую через общий раствор вводились различные количеств; эквимольной смеси -капролактама и диацетилферроцена.

Образцы исследовались в растровом электронном микроскопе S-2500 фирма Hitachi, (Япония), а также РЭМ-100У с криоприставкой РУ1ШК, которая вмонтирована в колонну микроскопа. Приставка имеет криомикротом который позволяет производить послойное исследование структуры образц при температуре -100 - -150" С. Толщина срезов составляет 0,1-0,5 мкм Перенос замороженного образца в колонну микроскопа производится в сре де жидкого азота, что исключает нагрев образца при контакте его с теп лым воздухом. Образцы исследовались как с напылением электропроводяще го.слоя золота, так и без напыления. Слой золота толщиной 20 нм нано сили в колонне микроскопа с помощью лазерной установки, приспособлен ной для этой цели. Исследование одного и того же участка образца про водили как методом РЭМ, так и методом ПЭМ. В эксперименте с использо ванием метода ПЭМ на поверхность замороженного образца в колонне мик роскопа наносили углеродо-платиновую реплику толщиной 50-80 нм, кото рую затем изучали в просвечивающем электронном микроскопе ЭМ - 12 (Украина).

Известно, что при замораживании водосодержащего образца возникно вение артефактов обусловлено образованием кристалликов льда., Поэтом для контроля качества низкотемпературной фиксации образца использовал ся метод термического анализа. С помощью индикатора ИСК (П.0. "Элект рон", Украина), по термограммам определяли наличие или отсутстви кристалликов льда в системе при замораживании образца. Скорость заме раживания, определенная с помощью индикатора ИСК для всех исследовал ных нами образцов составила 100 град/с. Для измельчения образца ис пользовался диспергатор УЗДН-А в режиме цилиндрического или экспоне^ циального концентратора при частоте 22 кГц.• В эксперименте также npt менялись следующие приборы препаративного назначения: Ultratom II (Швеция) для получения ультратонких срезов; криогенная вакуумная устг новка BAF-901 (Balzers, Швеция).

■ Исследовались различные режимы работы электронного микросюл РЭМ-ЮОУ с криоприставкой РУПИК для выбора оптимальных условий получ< ния РЭМ-изображения для различных водных биополимерных систем: диспе] сии целлюлозы, свекольного жома, крахмала и гелей желатины. Иеуче! условия препарирования образца криометодами. Показано, что метод зам< раживания-высушивания можно использовать для водных систем с локальн)

концентрацией полимера 20% и выше. В этом случае артефакты препарирования не возникают. При локальной концентрации полимера ниже 20% необходимо исследовать дисперсии и гели биополимеров в криостате при температуре -130" - 150" С в зависимости от природы полимера и его кон-цетрации в системе.

Методом РЭМ и ПЭМ с использованием криостагз определена микроструктура водных дисперсий целлюлозы Munkteil, свекольного жома, дисперсий набухших зерен картофельного крахмала, а также гелей желатины.

Для изучения возможностей криостата с целью уменьшения термического действия электронного пучка на объект были выбраны полимерные системы с меташюсодержащими кластерами. Методом ПЭМ было показано, что размер кластеров зависит от температуры прогрева образца. Термо-чувтвительные полимерные системы с меташюсодержащими кластерами можно исследовать методом РЭМ без артефактов, если образец охлажден до температуры -130" С. Если эти обрззцы исследовать в растровом электронном микроскопе без криостата, то наблюдается изменение структуры образца вследствие локального нагрева под действием электронного пучка.

В рзботе установлено, что растровые электронные микроскопы с крп-остатами могут быть использованы для' проведения экспресс-анализа структуры водных пищевых систем.

III. Третья глава посвящена сканирующей туннельной микроскопии водных дисперсий клейстеризованного. крахмала. Применение СТМ для изучения структуры поверхности позволяет получить изображение биополимерных систем с более высоким разрешением, чем в РЭМ. Сканирующая туннельная микроскопия дает возможность' получения трехмерного изображения, в отличие от ПЭМ и РЭМ. Математическая обработка полученных ре7 зультатов устраняет случайные шумы и помехи, связанные с работой туннельного микроскопа. Кроме того, при исследовании в СТМ не происходит нагрева образца и, следовательно, разрушения его структуры.В эксперименте исследовались дисперсии клейстеризованного картофельного и кукурузного крахмала. Картофельный крахмал был выбран для отработки препаративной методики применительно к СТМ, т.к. он ранее был изучен методом лазерной корреляционной спектроскопии.

Для исследования микроструктуры этих крахмальных систем 0,1% дисперсий нативного крахмала нагревали на водной бане до температуры 30" С и выдерживали при данной.температуре в течение 20 мин. В предварительных экспериментах, выполненных с помощью дифференциального сканирующего калориметра ДАШ-4 (ИБП, РАН, Пущино), было установлено, что

прй данной температуре процесс клейстеризации О, IX нат'ивных дисперсш крахмала полностью завершен.

Структура дисперсий клейстеризованного крахмала исследовалась методами СТМ и ПЭМ. Препарирование объектов для ПЭМ осуществлялось согласно методикам, используемым при исследовании биологических и синтетических полимеров. В эксперименте использовался сканирующий туннельный микроскоп фирмы "Omicron" (Германия), этот прибор может работав каь; на воздухе, так и.в сверхвысоком вакууме. Для установления туннельного контакта в СТМ "Ornicron" в специальных окнах задаются основные параметры: значения величины туннельного тока, напряжения смещени: и глубины обратной связи. Структура кластеров дисперсий клейстериэованного крахмала в режиме "постоянного расстояния между зондом и поверхностью. Образцы исследовались на воздухе.

В работе определены размеры кластеров конечной длины для исследо ванных крахмальных систем (400-500 нм). Имеет место корреляция данны сканирующей туннельной микроскопии.и просвечивающей электронной мик роскопии, а также данных, полученных ранее методом лазерной корреляци онной спектроскопии. Для изучения влияния ароматообразующего веществ на структуру кукурузного крахмала были приготовлены два образца - ис ходный 3% золь и золь, содержащий 1 ммоль н-октйлацетата.

Методом СТМ также определены размеры кластеров клейстеризованног кукурузного крахмала (500-800 нм),которые представляют собой компакт ные частицы анизодиаметрической формы. В образцах золя, обработанног н-октилацетатом, структура кластеров изменяется. Наблюдаются кластеры имеющие рыхлую структуру. Кластер состоит из более мелких структурны элементов сферической формы, размер которых составляет приблизительн 50 нм. Полученные результаты показывают, чтомолекулярно-организовкан ные системы полисахаридов начинают формироваться в золе. Эти супрамс лекулярные структуры претерпевают изменения в присутствии н-октилаце тата; наблюдается разрыхление кластеров на стадии золя.

IV. Четвертая глава посвящена изучению микроструктуры и' поверхностнс го состава криогелей кукурузного крахмала. Большинство продуктов питг ния представляют собой гели. Однородность структуры гелей крахмале способность прочно удерживать влагу делает их . удобными объекта* для изучения сорбции ароматизаторов, а также металлосодержащих соед! нений.

Криогели кукурузного крахмала получали из 3Z золя замораживание при температуре -18" С с последующим оттаиванием в течение 24 часо!

1ля изучения микроструктуры образовавшейся криогубки и влияния на нее (обавок ароматообразующих соединений гидрофобных веществ выбрано 5 об-)азцов: исходный криогель и 4 образца криогеля, полученных заморажива-1ием 40 мл 3% золя крахмала, содержащего 1 ммоль органического вещест-ia. В качестве' ароматообрззующих соединений выбраны н-октилацетат, i-бутилацетат, 2-деканон и н-октанол-1.

В настоящей работе влияние ароматообразующих соединений на струк-■уру и поверхностный состав криогелей кукурузного крахмала изучали ме-■одамй растровой электронной микроскопии (РЭМ), рентгенографии и рент--■еновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС).

Объекты исследовались в растровом электронном микроскопе S-2500" )ирмы Hitachi (Япония) в режиме вторичных электронов. Препарирование >бъектов было выполнено методом замораживания-высушивания. Условия-[репарирования определяли методом термического анализа с помощью инди-атора ИСК, который позволяет определять наличие или отсутствие крис-'алликов льда при замораживании водосодержащего образца. Анализ Полуниных нами термограмм показал, что при замораживании криогеля крачма-:а со скоростью 100 град/с и последующим высушиванием замороженного (бразца в вакууме при температуре -80-90" С артефакты, вызванные крис-аплизацией и рекристаллизацией льда, не возникают. Установлена нами :орреляция результатов, полученных из днфрактограмм для лиофильно внушенных образцов и влажных криогелей.

В таблице I представлены данные, полученные из дифрактограмм для ;вух образцов исходного криогеля:влажного и лиофильно высушенного, в 'аблице II представлены аналогичные данные, полученные для криогеля, Сработанного н-октилацетатом, где 2Q - угол отражения, d - межплос-:остное расстояние, J - интенсивнсть.

Полученные дифрактограммы показывают,что нет заметных различий в ¡труктуре влажных криогелей и криогелей,препарированных методом замо-еживания-высушивания.Дополнительно выявленный рефлекс в табл.II у :риогеля,обработанного ароматизатором,имеет очень слабую интенсивность [ может быть объяснен удалением растворителя в процессе высушивания, что позволяет определить пик слабой интенсивности.

Таблица I

Исходный криогель без обработки ароматизаторами через 7 суток хранени

II -------- -Г— II 1 1 2 8 | 1 1 сЗ А | | н

1! 1 || Влажный . | II 1 II 1 п 1 1 5.60 | 17.20 | 20.20 | 1 1 15.781 | 5.155 | 4.396 | 1 163' 245 213

II 1 || Замораживание- | II высушивание | II 1 г 1 5.60 | 17.20 | 22.20 | 1 1 15.781 | 5.155 | 4.291 | 192 208 229 ||

Таблица II

Криогель, обработанный н-октилацетатом.

и 1 II 1 1 2 е | 1 с1 А ■ | II

II 1 || Влажный | II 1 II. 1 II I 1 5.60 | 17.70 • | 22.30 | 1 1 15.781 | 5.011 | 3.986 | 1 124 237 287

II 1 || Замораживание- ( || высушивание | II 1 п.. , . _ _________ I 1 5.50 | 9.90 | 17.40 | 20.10 | 1 1 16.068 | 8.934 | 5.096 | 4.418 • | » 80 74 150 142 „II

Рентгенографическое исследование было выполнено на автоматизирс ванном дифрактометре "Дрон-3", управляемом персональной ЭВМ. Дифрак тограммы получали от влажных образцов'.криогелей крахмала. Использове лрсь излучение Си К 0) =115418 А), монохроматизированное графитовым мс нохронометром; параметры генератора 40 кВ*20 мА; шаг сканирован!-:

0,05",.скорость сканирования 2"/мин. Обработка дифрактограмм - вычитание фона, нахождение пиков (20, - угол отражения), расчет межплоскостных расстояний (с!) - проводилось по стандартной программе управления дифрактометром ЖДУ. ' •

Анализ поверхности методом РЕЭС проводили на приборе ХБАМ-вОО, фирмы Кга^э (Великобритания). Метод РФЭС основан на явлении фотоэффекта с использованием характеристического рентгеновского излучения и позволяет определить энергии электронных уровней на основании измеренных кинетических энергий фотоэлектронов. Запись спектров осуществляли в вакууме порядка 10 Па. В качестве возбуждающего излучения применяли характеристическую линию магния К^(Ьу=1253,6 эВ). Мощность рентгеновского пучка не превышала 60 Вт, при этом деструкция образца не наблюдалась. Обработку РФЭС-спектров проводили при помощи пакета программ ОБ-800. Подзарядку образцов учитывали по компоненте углерода с наименьшей энергией связи (285,0 эВ).

Метод РЭМ (в режиме вторичных электронов) и метод РЕЮ позволяют получить информацию . о микроструктуре и составе поверхностного слоя толщиной 5 -.20 нм. Электронномикроскопическое исследование структуры криогелей кукурузного крахмала показало, что характер надмолекулярной организаций для всех пяти образцов криогелей иммеет большое сходство. Было обнаружено два типа пор: мелкие, диаметром от 1 до 15 мкм и крупные, достигающие 60 - 70 мкм. Что касается стенок криогубки, то в этом случае наблюдаются различия для каждого образца. Структура поверхности исходного криогеля однородна и имеет менее развитый рельеф, чем образцы, содержащие ароматообразующие соединения. Характерной особенностью для криогелей с добавками является,наличие крупных анизодиаметрических образований, размеры которых' составляют от 0,5 до 5 мкм. Наиболее сильное влияние на структуру поверхности криогеля оказывает н-октила-цетат, наименьшее - н-бутилацетат,' что можно объяснить большой разницей в сорбции криогелями этих ароматообразующих соединений (98% и 38% соответственно, согласно данным хроматографического метода, полученным ранее). Из электронных микрофотографий определена плошдць стенок криогеля, занимаемая структурами с развитым рельефом поверхности. Для криогеля с н-октилацетатом она составляет 20-25% от площади всей поверхности, а для криогеля с 2-деканоном и н-октанолом-1 - 10-13%.

При исследовании образцов методом^РФЭС поверхностное содержание крахмала и ароматообразующего соединения определяли из соотношения интегральных интенсивностей отдельных углеродных компонент. В работе

приводятся РФЭС-линии CIs исходного криогеля крахмала и криогеля, содержащего н-октилацетат. Разложением РФЭС - линии на вклады от отдельных химических групп можно выделить компоненты, обусловленные присутствием атомов, связанных с атомами углерода (СС, Есв=285,'0-эВ), с одним (СО, Есв=286,5 эВ) и двумя (С00, Есв=288,0 эВ) атомами кислорода.

Данные анализа РФЭ-спектров показывают,• что обработка исходного 3% золя крахмала н-октилацетатом приводит к существенным изменениям в поверхностном составе криогеля. В РФЭС-линии углерода CIs существенно усиливается вклад компоненты СС (Есв=285,0 эВ), интенсивность компоненты крахмала существенно снижается. Результаты количественного анализа показывают, что 20 - 25% поверхности криогеля крахмала в модифицированных образцах покрыто слоем.н-октилацетата. Данные РФЭС и РЭМ дополняют друг друга, что позволяет получить большую информацию о,

структуре модифицированной поверхности криогеля крахмала. Методами

i

РФЭС и РЭМ показано, что появление крупных анизодиаметрических образований на поверхности стенок криогеля можно объяснить сорбцией аромато-образующих соединений.

Результаты, полученные методом РФЭС показывают, что исследованные нами ароматообразующие соединения, добавленные к 3% золю крахмала, не улетучиваются из криогубки при длительном хранении и при помещении образцов в высокий вакуум.

Представлял интерес изучить взаимодействие металл-биополимер на модельных системах - криогелях кукурузного крахмала. Известно, что характер взаимодействия ионов металла с биополимерными системами может оказать большое влияние на физиологическую активность образующихся комплексов. В работе исследовали методом РЭМ и РФЭС сорбцию металлосодержащих соединений. На примере криогелей крахмала, обработанных 5% раствором FeCl , показано, что после отмывки образцов дистиллированной водой, на поверхности криогубки обнаружены металлосодержалще кластеры различных размеров. Их средняя поверхностная концентрация, определенная методом РФЭС,' в исходном криогеле и криогеле, обработанном н-окти-лацетатом, оказалась практически одинаковой и составила 2 ат.%, что совпадает с данными электронной микроскопии. Энергия связи уровня FeCl 2рЗ/2 (711,4-711,5 эВ)совпадает с величиной, приводимой в литературе для чистого Fe (711,5 эВ). Следовательно, химическое взаимодействие между металлосодержащими частицами и крахмалом не происходит.

Рентгенографический метод позволяет изучить структуру влажных криогелей в объеме. Основная цель исследования - проследть структуро-

образование криогелей кукурузного крахмала при хранении, выявить влияние на структуру ароматообразующих соединений. Полученные результаты показывают, что на дифрактограммах всех свежеприготовленных криогелей кукурузного крахмала отсутствуют дифракционные пики, характерные для кристаллических структур. При хранении исходных криогелей при температуре 10"С. в течение 7 и 14 суток на дифрактограммах появляются дифракционные пики, характерные при отражении рентгеновских лучей от кристаллических областей. Наиболее сильные .пики на дифрактограммах этих образцов сооветствуют межплоскостным расстояниям сЛ=16,068 А; с!2=5,155 А; с!3=4552 А. Для криогелей крахмала, обработанных н-октилацетатом, наблюдаются изменения в дифракционной картине после хранения образцов в течение 8-10 суток. Для зерен крахмала получены следующие значения межплоскостных расстояний:. сИ=5,754 А; <12=5,039 А; с!3=3,801 А; с14=4,39б А. Следовательно, наблюдаются значительные различия в структуре зерен крахмала и криогелей, полученных при замораживании - оттаивании 3% золя крахмала. Степень кристалличности, определенная из диф-рактограмм, для исходного криоегеля и криогеля, обработанного н-октилацетатом, составляет 8% и 5% соответственно. Можно полагать, что н-октилацетат сорбируется криогелем во всем объеме и влияет на укладку цепей молекул крахмала.

Данные литературы показывают, что перевод полимерных систем в область, где термодинамическому равновесию соответствует кристаллическое состояние полимера, начало кристаллизации связано с возникновением кристаллических зародышей, т.е. с наличием более или менее продолжительного индукционного периода. На основании результатов полученных из дифрактограмм следует, что индукционный период исходного криогеля крахмала составляет 5-7 суток. Для криогелей крахмала с н-октилацетатом индукционный период несколько больше и составляет 8-10 суток, что, по-видимому, можно объяснить наличием примесей - ароматических добавок.

Исследование криогеля крахмала методами РЭМ, СТМ, РФЭС и рентгенографии показало, что наибольшее влияние на структуру криогеля оказывает н-октилацетат. В этом случае в золе образуются надмолекулярные ассоцпагы полисахаридов с н-октилацетатом. На стадии криотекстурирова-ния такие.надмолекулярные ассоциаты могут упрочняться за счет некова-лентных связей между полисахаридами. _Имеет место корреляция результатов, полученными различными методами исследования структуры. Совпадение результатов, полученных для влажных образцов и лиофильно высушен-

ных, показывает, что препарирование не вносит артефактов. Электронно-микроскопический метод с использованием методологически обоснованной криотехники позволяет выявить реальную структуру водных крахмальных систем.

Таким образом, в работе проведено исследование различных крахмальных систем - дисперсий набухших зерен крахмала, дисперсий клейсте-ризованного крахмала, криогелей крахмала методами растровой и просвечивающей микроскопии, а также сканирующей туннельной микроскопии. Полученные результаты позволяют установить закономерности структурообра--зования этих биополимерных систем.

ВЫВОДЫ

1. Проведено электронномикроскопическое исследование различных водных биологических систем - гелей и растворов полисахаридов и белков. Данное исследование включало в себя качественный и колличествен-ный ананализ:определение химического состава и надмолекулярной структуры, а также получение информации о морфологической и кристаллической структуре исходных и модифицированных объектов.

2. Впервые изучены методологические вопросы применения криоскопии в растровой электронной микроскопии систем биополимер-вода. Показано, что при исследовании водных биополимерных систем: дисперсий набухших зерен крахмала, дисперсий целлюлозы, гелей желатины с концентрацией полимера в системе менее 20% необходимо использовать криостат, позволяющий поддерживать температуру образца -140 - -130 С. В этом случае артефакты препарирования не возникают.

3. Методами электронной микроскопии, рентгенографии и термического анализа установлено," что биополимерные системы с концентрацией полимера более 20% могут быть исследованы без артефактов, если используется стандартная препаративная техника замораживания-высушивания.

4. Показано, что при исследовании термочувствительных полимерных систем с металлосодержащими кластерами криостат позволяет защитить образец от локального нагрева и изменения структуры вследствие термического действия электронного пучка.

5. Впервые проведено исследование дисперсий клейстеризованного картофельного крахмалз методом сканирующей туннельной микроскопии. Определены условия препарирования образцов и получения СТМ-изображения этих крахмальных систем.

6. Определены размеры кластеров конечной длины - около 500 нм -для дисперсий клейстеризованного картофельного крахмала. Данные сканирующей туннельной микроскопии коррелируют о данными просвечивающей электронной микроскопии.

7. Впервые методами растровой электронной микроскопии и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии исследована в водной среде сорбция ароматизаторов н-октилацетата,' н-октаноДа, 2-деканона и н-бутила-цетата криогелями кукурузного крахмала. Показано, что в результате обработки поверхности криогеля соединениями с углеводородными заместителями н-С возникают надмолекулярные ассоциаты криогеля кукурузного ксахмалз с зроматообг.^/юпшми соединениями оазмером 0.3 - 0.5 мкм. ко-

торые в случае н-октилацетата занимают 25% площади стенок криогеля у 10 - 13% в случае н-октанола и 2-деканона. Результаты свидетельствуют о гидрофобном характере сорбции органических веществ криогелями крахмала. Показано, что ароматообразующие соединения не улетучиваются ие образца в условиях высокого вакуума.

8. Методом СТМ определен этап получения криогеля крахмала, на котором происходит процесс разрыхления структуры.

9. Рентгенографическим методом определена степень кристалличноси зерен кукурузного и картофельного крахмала, а также криогелей кукуруз? ного крахмала без обработки и с обработкой н-октилацетатом. Для исходного криогеля степень кристалличности составляет 5 - 8%, для криогелг с н-октилацетатом 2 - 5%, для зерен кукурузного и картофельного крахмала 25% и 20% соответственно.

10. Впервые рентгенографическим методом определена продолжительность индукционного периода криогелей кукурузного крахмала, исходногс .и содержащего н-октилацетат, в процессе ретроградации. Показано, чтс добавление ароматообразувдей добавки увеличивает индукционный период < 5-7 суток до 8 - 10 суток.

11. Изучена сорбция физиологически активных ионов железа с с криогелями кукурузного крахмала. Средняя поверхностная концентрация, определенная методом РФЭС, в исходном и модифицированном криогеле составляет 2 ат.%, что совпадает с данными электронной микроскопии. Показано, что химическое взаимодействие между металлосодержащими частицам и крахмалом не происходит.

12. Основным результатом данной работы является научно-экспериментальное обоснование применения современных форм электронно-микроскопического метода водно-полимерных систем в интересах пищевой промышленности и науки.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. А.Г.Филатова, И.И.Чемерис, В.К.Латов, Е.М.Белавцева, Ю.А.Кляч-. Методические аспекты исследования в растровом электронном микрос-пе водных суспензий целлюлозы. Заводская лаборатория.• (Диагностика териалов),1997г.2, о.33.

2. А.Г.Филатова, И.О.Волков, Н.И. Крикунова, Т.А.Мишарина, Р.В.Го-вня. Микроструктура и поверхностный состав криогелей крахмала. Из-стия АН (серия химическая).2000 г.,Ы 2, с.54.

3. А.Г. Филатова, В.К.Латов, И.И.Чемерис, Е.М.Белавцева. Исследо-ние структуры водных суспензий целлюлозы криометодами электронной кроскопии (ПЭМ, РЭМ, СТМ).2— Международный симпозиум "Строение", ойства, качество древесины" 1996г., Москва-Мытыщи, Россия, с.33.

4. А.Г.Филатова, И.И.Чемерис, И.И.Пономарев, Ю.А.Клячко. Методиг ские особенности исследования в РЭМ полимерных систем с металлосо-ржащими кластерами. 16— Российская конференция по электронной мик-)скопии, Черноголовка, 1996г., с.130.

5. И.И.Чмерис, А.Г.Филатова, В.К.Латов. Криометоды РЭМ применись но к исследованию суспензий биополимеров. 16-- Российская конфе-¡нция по электронной микроскопии. Черноголовка,1996г., с.243.

6. Ю.А.Вакал, А.Н.Кныш, П.А.Павленко, Ю.В.Шестаков, Ю.В.Каменс-ш, А.Г.Филатова, Е.М.Белавцева. Растровый туннельный микроскоп ЭМТ-100. 10— Российский симпозиум по растровой электронной микроско-ш и аналитическим методам.Черноголовка, 1997г., с.7.

7. А.Г.Филатова, А.И.Лапшин, Н.И.Крикунова, Т.А.Мишарина, Р.В.Го-эвня. Методические аспекты исследования структуры криогелей крахмала РЭМ. 10-- Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии аналитическим методам. Черноголовка, 1997г., с.98.

8. А.Г.Филатова, И.О.Волков, Т.Л.Бабаян, В.К.Латов, Ю.А. Клячко. зучение сорбции РеСЬ на поверхности криогеля крахмала. 17— Российс-зя конференция по электронной микроскопии. Черноголовка, 1998г.,с299.

9. А.Г.Филатова, М.В.Гришин, Б.Р.Шуб, В.П.Юрьей. Сканирующая тун-эльная микроскопия дисперсий клейстеризованного крахмала. 11— Все-эссииский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналити-еским методам. Черноголовка, 1999г., с.

' 10. Е.М. Белавцева, И.О.Волков, А.Г.Филатова, Р.В.Головня, .И.Крикунова, Т.А.Мишарина. Микроструктура и поверхностный состав риогелей крахмала. Методические аспекты. 11— Всероссийский симпозиум о растровой электронной микроскопии и аналитичеаским методам. Черно-

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР КРИОМЕТОДЫ В ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ СИСТЕМ ■ БИОПОЛИМЕР-ВОДА.

1.1. Способы замораживания водных биополимерных систем.

1.1.1. Введение криопротекторов.

1.1.2. Замораживание при высоком давлении.

1.1.3. Разбрызгивание микрокапель в криосреду.

1.1.4. Эмульсионный метод.

1.1.5. Замораживание в струе пропана.

1.1.6. Замораживание в жидком гелии.

1.2. Устранение разрушающего действия электронного пучка на объект.

ГЛАВА II. МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ

В РЭМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРИОСТАТОВ.

2.1. Материалы и методы исследования.

2.1.1. О выборе препаративного метода.

2.1.2. Выбор режима работы в РЭМ с использованием криостатов.

2.1.3. Выбор криосреды.

2.2. Результаты и обсуждение.

2.2.1. Водные суспензии целлюлозы.

2.2.2. Дисперсии картофельного крахмала.

2.2.3. Гели желатины.

2.2.4. Полимерные системы с металлосодержащими кластерами.

ГЛАВА III. СКАНИРУЮЩАЯ ТУННЕЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ ВОДНЫХ ДИСПЕРСИЙ

КЛАСТЕРИЗОВАННОГО КРАХМАЛА.

3.1. Материалы и методы.

3.2. Результаты и обсуждение.

ГЛАВА IV. ИССЛЕДОВАНИЕ КРИОГЕЛЕЙ КУКУРУЗНОГО КРАХМАЛА.

4.1. Материалы и методы.

4.2. Влияние ароматизаторов на структуру криогеля кукурузного крахмала.

4.2.1. Методы растровой электронной микроскопии и сканирующей туннельной микроскопии.

4.2.2. Метод рентгеновской электронной микроскопии.

4.2.3. Метод рентгенографии.

- з

4.2.4. Изучение сорбции ионов железа на поверхности криогеля кукурузного крахмала методами РЭМ и РФЭС.

Крахмал является одним из наиболее распространенных веществ в растительном мире. Он является запасным веществом растений, участвующим в их метаболизме. Крахмал состоит из двух полисахаридов, разветвленных макромолекул амилопектина и линейных макромолекул амилозы, причем содержание последней в крахмалах обычно составляет 23-28% Предполагается, что в зависимости от соотношения полисахаридов крахмала, их тонкой структурной организации, а также морфологических особенностей нативных зерен крахмала, зависят сроки созревания растений и промышленное использование крахмала и крахмалосодержащего сырья.

Возобновляемость крахмала как промышленного сырья, его широкое распространение в природе, относительная легкость применения различных технологий для физической, химической, энзиматической, термогидромеханической модификации крахмала предопределило получение продуктов с различными физико-химическими, функциональными и потребительскими свойствами.

В настоящее время крахмал и крахмалосодержащее сырье широко используются в пищевой промышленности в качестве гелеобразователей, загустителей пен и эмульсий, его высокая водоудерживающая способность и способность образовывать комплексные соединения с ароматическими веществами определяют его использование в составе различных вареных колбас, улучшителей хлеба и хлебобулочных изделий, вкусоароматических пищевых добавок. Кроме того, крахмал широко используется в непищевых технологиях, в частности, при производстве кровезаменителей, биодегра-дируемых материалов, различных клеев и многих других материалов.

Крахмал играет решающую роль в определении структуры многих пищевых продуктов, очень важной как для потребителей, так и для производителей. Структура - это важнейший фактор, регулирующий вкусовые качества большей части пищевых продуктов. Желаемую структуру системы, содержащей крахмал, получают в результате тех изменений, которым подвергают крахмал в процессе технологических операций. Будущее производства крахмала зависит не только от усовершенствования оборудования для производства, но и в первую очередь от знаний о зерне крахмала, его строении и составе, физико-механических свойствах и коллоидном поведении компонентов зерна в водных системах, генетики и селекции сортов различного сырья, являющегося источником крахмала. .Понимание взаимосвязи между крахмалом и другими компонентами пищевых систем имеет большое значение для контроля свойств крахмалосодержалдах продуктов.

В последние годы в пищевой промышленности широко используются ароматизаторы, которые вносятся в пищевые продукты с целью улучшения их органолептических свойств. Представляет интерес изучить влияние ароматизаторов на структуру крахмальных систем. - В настоящее время для изучения структуры биополимерных систем эффективно используется электронная микроскопия. Особенностью метода электронной микроскопии является необходимость использования препаративной техники для подготовки объекта к исследованию.

При электронномикроскопическом исследовании систем биополимер-вода приходится учитывать то обстоятельство, что точные количественные методы анализа, используемые в современных приборах, ограничиваются неопределенностями, связанными с подготовкой объекта к анализу. Источником неопределенностей является методика приготовления образцов -действия, лежащие между естественным состоянием образца, и состоянием, в котором производится его анализ. Обычно препарирование биологического объекта включает в себя: изъятие образца из водной среды, перенос в высокий вакуум, разлом или разрез, обработку химическими соединениями. Кроме того образец в процессе исследования подвергается радиационному и термическому действию электронного пучка. При таком воздействии на образец различных факторов не должно происходить перераспределение или утрата материала в образце, в нем должны сохранятся первоначальные связи. Поэтому представляет интерес использовать не только один метод - электронно-микроскопический, но и привлекать другие методы исследования структуры. В настоящей работе при исследовании структуры криогет лей крахмала дополнительно привлекались методы ренгеновской фотоэлектт ронной спектроскопии и ренгенографии, а также метод термического анализа. Публикации, выполненные за достаточно большой период времени, показывают, что универсальной методики препарирования биополимеров не существует. Однако, авторы отмечают, что некоторые методы, связанные с замораживанием образца, приближаются к универсальным. Криометоды в настоящее время получили признание, но и они требуют большой осторожности при выборе условий препарирования. Кристаллизация растворителя в полимерной системе может явиться источником артефактов. В настоящей работе методическим вопросам криогенного препарирования уделяется большое внимание. Поэтому считаем необходимым посвятить литературный обзор вопросам подготовки объекта к исследованию в электронном микроскопе с использованием криотехники.

- 6

В настоящей диссертационной работе ставились следующие задачи:

1) Изучение возможностей криостатов при исследовании водных суспензий и гелей биополимеров методами растровой и просвечивающей электронной микроскопии.

2) Изучение желатинизированных дисперсий крахмала методом, сканирующей туннельной микроскопии.

3) Изучение структуры криогелей кукурузного крахмала методом РЭМ с использованием криометодов.

Таким образом, при исследовании структуры водных крахмальных систем - набухших зерен крахмала, желатинизированных дисперсий крахмала, криогелей крахмала - нами использовались методы растровой и просвечивающей электронной микроскопии, а также сканирующей туннельной микроскопии.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучены методологические вопросы применения криоскопии в растровой электронной микроскопии систем биополимер-вода. Показано, что при исследовании водных биополимерных систем: дисперсий набухших зерен крахмала, дисперсий целлюлозы, гелей желатины с концентрацией полимера в системе менее 20% необходимо использовать криостат, позволяющий поддерживать температуру образца -140 - -130 С. В этом случае артефакты препарирования не возникают.

2. Методами электронной микроскопии, рентгенографии и термического анализа установлено, что биополимерные системы с концентрацией по-' лимера более 20% могут быть исследованы без артефактов, если используется стандартная препаративная техника замораживания-высушивания.

3. Показано, что при исследовании термочувствительных полимерных систем с металлосодержащими кластерами криостат позволяет защитить образец от локального нагрева и изменения структуры вследствие термического действия электронного пучка.

4. Впервые проведено исследование дисперсий клейстеризованного картофельного крахмала методом сканирующей туннельной микроскопии. Определены условия препарирования образцов и получения СТМ-изображения этих крахмальных систем.

5. Определены размеры кластеров конечной длины - около 500 нм -для дисперсий клейстеризованного картофельного крахмала. Данные сканирующей туннельной микроскопии коррелируют с данными просвечивающей электронной микроскопии.

6. Впервые методами растровой электронной микроскопии и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии исследована в водной среде сорбция ароматизаторов н-октилацетата, н-октанола, 2-деканона и н-бутила-цетата криогелями кукурузного крахмала. Показано, что в результате обработки поверхности криогеля соединениями с углеводородными заместителями н-С возникают надмолекулярные ассоциаты криогеля кукурузного крахмала с ароматообразующими соединениями размером 0,3 - 0,5 мкм, которые в случае н-октилацетата занимают 25% площади стенок криогеля и 10 - 13% в случае н-октанола и н-октилметилкетона. . Результаты свидетельствуют о гидрофобном характере сорбции органических веществ криогелями крахмала. Показано, что ароматообразующие соединения не улетучиваются из образца в условиях высокого вакуума.

7. Методом СТМ определен этап получения криогеля крахмала, на ко

- 88 тором происходит процесс разрыхления структуры.

8. Рентгенографическим методом определена степень кристалличности зерен кукурузного и картофельного крахмала, а также криогелей кукурузного крахмала без обработки и с обработкой н-октилацетатом. Для исходного криогеля степень кристалличности составляет 5-8%, для криогеля с н-октилацетатом 2-5%, для зерен кукурузного и картофельного крахмала 25% и 20% соответственно.

9. Впервые рентгенографическим методом определена продолжительность индукционного периода криогелей кукурузного крахмала, исходного и содержащего н-октилацетат, в процессе ретроградации. Показано, что добавление ароматообразующей добавки увеличивает индукционный период с 5-7 суток до 8 - 10 суток.

10. Изучена сорбция физиологически активных ионов железа с с кри-огелями кукурузного крахмала. Средняя поверхностная концентрация, определенная методом РФЭС, в исходном и модифицированном криогеле составляет 2 ат.%, что совпадает с данными электронной микроскопии. Показано, что химическое взаимодействие между металлосодержащими частицами и крахмалом не происходит.

11. Основным результатом данной работы является научно-экспериментальное обоснование применения современных форм электронно-микроскопического метода водно-полимерных систем в интересах пищевой промышленности и науки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При исследовании структуры сухих зерен крахмала методом РЭМ вопросы препаративной техники для таких объектов не возникают. Этим, по-видимому, можно объяснить то обстоятельство, что большинство работ по электронной микроскопии крахмальных систем посвящено изучению структуры нативных ненабухших зерен крахмала. Однако водные системы крахмала представляют большой научный и практический интерес. Поэтому разработка препаративной техники в растровой электронной микроскопии водных крахмальных систем является весьма актуальной задачей. В настоящей работе показано, что трудности, связанные с препарированием этих систем, могут быть преодолены при использовании криогенной электронной микроскопии.

В ранних работах, посвященных электронномикроскопическому исследованию набухших зерен крахмала, растворов и гелей крахмала, препарирование образцов проводилось криометодами в условиях, разработанных Моором для биологических объектов(127,128). Отсутствие методологически обоснованной препаративной криотехники для систем биополимер-вода не позволило в этих работах избежать артефактов, вызванных препарированием образца. Проведенная нами работа на ряде биополимерных систем позволила определить условия препарирования криометодами, позволяющими исключить артефакты. Показано, что в зависимости от локальной концентрации полимера в системе используется тот или иной препаративный метод. Если локальная концентрация полимера высокая, то можно использовать метод замораживания-высушивания. Этот метод также пригоден и для сильно разбавленных растворов.

При исследовании водосодержащих образцов с концентрацией полимера ниже 20% использование криостатов позволяет получить информацию о реальной структуре растворов, гелей, суспензий биополимеров.В этом случае нет необходимости повышать скорость замораживания, применяя сложные приемы, описанные в литературе. Другим аспектом применения криостатов является возможность защитить органический объект от радиационного и термического действия электронного пучка. Литературные данные и полученные нами результаты показывают, что для термочувствительных полимерных систем применение криостатов весьма эффективно при исследовании объектов методами ПЭМ, РЭМ и РСМА.' Что касается сканирующей туннельной микроскопии, то образец в процессе исследования в СТМ не изменяет свою структуру. В работе изучены условия препарирования дисперсий клейстеризованного крахмала, которые могут быть использованы в эксперименте комбинированного растрового электронного микроскопа, сочетающего возможности РЭМ и СТМ.

На примере криогелей кукурузного крахмала показаны возможности криогенной электронной микроскопии. В работе проведено исследование структуры криогелей кукурузного крахмала, содержащих различные арома-тообразующие соединения. Показано, что характер надмолекулярной организации модифицированной поверхности криогеля крахмала зависит от природы ароматообразующих соединений. Наибольшее влияние на структуру криогеля крахмала оказывает н-октиладетат, наименьшее - н-бутилацетат. Привлечение других структурных методов - рентгенографии, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии - позволило сопоставить данные электронной микроскопии с результатами этих методов. Это позволило получить информацию о реальной структуре исходного и модифицированного криогеля кукурузного крахмала. Показано, что структура модифицированного криогеля крахмала сохраняется в течение длительного времени хранения в холодильнике, ароматообразующее вещество не улетучивается в условиях высокого вакуума. Полученные данные могут представлять интерес при разработке технологий для пищевой промышленности.

Необходимо отметить две концепции, касающиеся перспектив развития криотехники в электронной микроскопии водосодержащих объектов. Первая - это увеличение скорости замораживания микрообъекта. Этой концепции в основном придерживались зарубежные исследователи в ранних работах. Вторая концепция касается условий препарирования замороженного объекта. Отдельные работы последних лет и наши исследования показывают, что использование криостатов, поддерживающих температуру образца в диапазоне -130-150". С в процессе препаративных операций, позволяет избежать артефактов и выявить реальную структуру водных биополимерных систем. Использование криостатов в электронной микроскопии может также рассматриваться как способ защиты органического объекта от радиационного и термического действия электронного пучка.

В настоящее время имеются определенные трудности при использовании криогенной электронной микроскопии(129,130). Решение технических проблем позволит в дальнейшем использовать криометоды при исследовании широкого круга объектов.

1. Binnig G., Rohnsr H. Helv. Phys. Acta. 1982. v.55. p.726

2. Strosdo I.A., Feenstra R.M., Fern A.P. Phys. Rev. Lett. 1987. v.58. p. 1668

3. Kuk Y., Sulverman R.I. Rev. Sei. Instrum. 1989. v.60. p. 165

4. МасловаН.С., Панов В.И. Успехи физич. наук. 1989. т. 157.в.1. с.185

5. Amrein М., Stasiak A., Gross Я., Stoll Е., Travaguni G. Sei. 1988. v.240. p.514

6. Wiesendanger P., Guntherord H.L In: "Scaiming Tunneling Microscopy II. Further Application and Related Scanning Techniques". 1992. Springer-Veriag. Berlin, Heidelberg, New-York.

7. Wickoff R.N.S. Sei. N.Y. 1946. v.104. p.36.

8. Anderson T.F. Am. Natural. 1952. v.86. p.91.

9. Остриков M.C., Духина Т.П., Левис М. Журн. научн., прикладн. фотографии и кинематогр. 1964. т.9. с.254

10. Steere R.L. J. Biophys. Biochem. Cytol. 1957. v.3. p.45

11. Moor H. Z. Zeilfoisch. 1964. b.62. s.546

12. Mazw P. Sei. 1970. v.168. p.939

13. Mazur P., Schmidt LI. Cryobiology. 1967. v.3. p.365

14. Hoerr N.L. Anatom. Record. 1936. v.65. p.293

15. MacKenzie A.P., Luyet B.C. Biodynamica. 1958. v.9. 147

16. Luyet B.C. Pysical Res. 1939. v.56. p.1244

17. Пушкарь H.C., Белоус A.M. В кн."Введение в криобиологию". 1975. Киев."Наукова Думка"

18. Luyet B.G. Biodynamica. 1969. v.10. p.277

19. Riele U. Z. Sehr. Chemie-Ing.-Techn. 1968. b.40. s.213

20. Barnes W.H., Matthews F.W. Biodynamica. 1939. 44. p.l

21. Meryman H.T. Biodynamica. 1958. v.8. p.6922.' Кулешова JI.Г, Моисеев В.А., Иткин Ю.А. Криобиология, криоме-дицина. 1976. т.2. с.27

22. Moor Н., Kistler J., Mutter М. Experientia. 1976. v.32. p.805

23. Blacrmann M Advans Physics. 1958. v.7. p. 189

24. DowellL.G., Rinfret A.P. Nature (London). 1960. v.188. p.1144

25. Pease D.C. J. Ultrast. Res. Д967. v.21. p.75

26. Lepault L., Dubochet J. J. Ultrastr. Res. 1980. v.72. p.223

27. Franks F. Asquith M.A., Hammond C.C, Skaer Я. J. Microsc. 1977. v.10. p.223

28. Leibo S.P., Farrant J., Masur P. Hunna N. L, Smith L.M. Cryo-biology. 1970. v.6. p.315

29. Moor H, Hoechlle M. 7th Internat. Congr. Electr. Micr. Gre-riobl. 1970. v.l. p.445

30. Воротилин A.M., Корчиков С.Д., Гордиенко JI.B. Криобиология, криомедицина. 1976. т.2. с.65

31. Moor Н. Ergebnisse der Hochvakuum Technik und der Physik. 1971. b.2. s.35

32. Bachmann Z., Schmitt W.W. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1971. v.68. p. 116

33. Plattner H.W., Fischer M, Schmitt W.W., Bachmann Z. J. Cell. Biol. 1972. v.53. p.l 16

34. Bachmann L. Schmitt W.W., Hammel R., Lederer К Makromol. Chemie. '1975. v. 176. p.2603

35. Menold R., Luttge В., Kaiser W. Adv. CeU. Interface Sei. 1976. v.5. p.281

36. Фихте Б. А., Заичкин Э.И. Сб. 882 Всесоюзная конф. электр. микроск. 1971. т.З. с.206. "Наука".М.

37. Buchheim W. Natwwiss. 1972. b.59. s.121

38. Buchheim W. Kieler Milchwirtsch. Foisch. 1972. b.24. s.97

39. Buchheim W., Hermansson A.M. J. Microsc. 1980. v. 123. p. 115

40. Krause I.P., Buchheim W., Smidt G. In: "Food Proteins. Structure and Functionality". Ed. Schwenke K.D., Mothes R. Weinheim. New York. Basel. Cambridge. Tokyo. VCH. 1993. p.304

41. Moor.H., fustier J., MuUer M. Experimentia. 1976. v.32. p.805

42. Etysaeter A., Espevik Y., Kopstad G. J. Ultrastmct. Res. 1980. v.73. p.93

43. Варнаков А.Л. Цитология. 1982. т.24. с.622

44. Fernandez-Moran H. Ann. N.Y. Acad. Sei. I960, v.85. p.689

45. Hauser J.E., Reese T.S., Landis D.M.D. Cold Spring Harb. Sim-pos. Quant. Biology. 1975. v.40. p. 17

46. Engsheim H.P. Biochem. Biophys. Acta. 1972. v.265. p.339

47. Белавцева E.M., Титова Е.Ф. Высокомол. Соедин. 1972. т. 14. с. 1659

48. Castello M.K, Cariess J.M. J. Microscopy. 1978. v.112. p. 17

49. Белавцева E.M., Чемерис Й.И. Биофизика. 1979. т.24. с. 172

50. Белавцева Е.М., ЧемерисИ.И., Кабанова Т. А., Радченко Л.Г. Биофизика. 1983. т.28. с.958

51. PurzH.J., Schlawne М., Buchtemann A. Acta Histochemica. 1981. b.23. s.89

52. Purz H.J.,Grobe A. Faserforsch. Text. 1969. b.20. s.219

53. Слонимский ГЛ., Китайгородский А.И., Белавцева ЕМ., Толстогу-зов В.Б., Мальцева И.И. Высокомолек. Соединения. 1968. т. 10 Б. с.640

54. Белавцева Е.М., Радченко Л.Г., Титова Е.Ф., Шалыгин Г.Ф. Биофизика. 1984. т.39. с.79556

55. Филатова А.Г., Лапшин А.И., Крикунова Н.И., Мишарина ТА., Головня Р.В. Юый Всеросс. Симпозиум по РЭМ. 1997. Черноголовка.

56. Belavtseva Е.М., Titova E.F., Lozinsky V.l., Vainerman E.S., Rogozhin S. V. Colloid Polymer Sei. 1984. v262. p.775

57. Lozinsky V.I., Morosova S.A., Vainerman E.S., Titova E.F., Shtilman M.I., Belavtseva E.M., Rogozhin. S.V. Acta Polymerica. 1989. v. 40. p.8

58. Винникова Л.Г., Белавцева Е.М., Латов B.K., Лапшин А.И. Биофизика. 1993. т.38. с.279

59. Claser R.M., Hayward S.B. 9th Internat. Congr. Electron Microscopy. Toronto. 1978. v.3. p.70

60. Bomben J.L., Sing С.J., Hayes T.L. Cryobiology. 1983. v.20.p. 574

61. Белавцева Е.М., Ибрагимова Н.У., Вагабов М.З., Шилов И.Л. Биофизика. 1994. т.39. с.795

62. Филатова А.Г., Чемерис И.И.,Латов В.К.,Клячко Ю.А. Ж. Заводская Лаборатория (Диагностика материалов). 1997. N2. с.33

63. Стоянова И.Г., Белавцева Е.М. Известя АН СССР (сер.физич.). '1959. N6. с.754

64. Unwin Р.N.T., Henderson N.J. Mol. ВЫ. 1975. v.94. p.425 Biol.

65. Knapek S. Ultramicroscopie. 1982. v.10. p.7167.' Lefranc G., Knapek S., Dietrich I. Ultramicroscopie. 1982. v.10. p. Ill

66. Лосева Т.Н., Гладышев Г.Д. Сб. "Аппаратура и методы рентгеновского анализа". 1975. вып. 17. Машиностроение, Москва.

67. Castaining R. Adv. in Electronic and Electron Phys. N.Y. Acad.Press. 1960. v.13. p.317

68. Филиппов M.H. Известия АН (сер. физич.). 1993. т.57. с. 165

69. Белавцева Е.М., Кинаев Я.Я., Уварова Н.В., Филатова Е.Г., Филиппов М.Н. 72ой Всесоюзный Симпозиум по РЭМ. Звенигород. 1991. с. 100

70. Филатова А.Г., Чемерис И.И., Пономарев И.И., Клячко Ю.А. 16ая Российская Конфер. Электронной микроскопии. Черноголовка. 1996. с.130

71. Стоянова И.Г., Некрасова ТА., Бирюзова В.И. Докл. АН СССР. I960, с. 195

72. Ward P.R., Mitchell R.F. J. Phys. E. Sci. Inst. 1972. v.5. p.160

73. NagataN., Ichihama L Jap. J. Appl. Phys. 1977. v. 11. p. 1139

74. Спивак Г.В., Pay Э.И., Карелин H.M., Мишустина И.Е. Известия АН СССР (сер.физич.). 1977. т.41. с.2238

75. Amrein М., Durr R., Stasiak A., Gross Н., Travaglini G. Science. 1989. v.243. p.1708.

76. Марихин В. А., Мясникова JI. Л. В кн.: "Надмолекулярная структура полимеров". 1977. Изд.:"Химия". Ленинград.

77. Sleyter U.R, Robards А.К J. Microsc. 1977. v.111. p.77

78. Оболонкова E.C., Роговина Л.3., Дмитриева А.А., Белавцева Е.М., Слонимский ГЛ. Коллоидный Журн. 1974. т.36. с.284

79. Nei Т. In: "Principles and Techniques of Scanning Electron Microscopy. Biological Applications". Ed. Hayat M.A. Van

80. Nostrand Reinhold Company. New York. 1974. v.2. p. 113

81. Соколов B.H., ЮрковецД.И., Разгулина O.B., Мельник В.Н. Ж. Заводская Лаб. (Диагностика материалов). 1997. 9. с.31

82. Gerber Ch., Binning G., Fuchs H., Marti 0., Rohrer R. Rev. Sci. Instrum., 1986. v.57. p.221

83. Theimer W. Zeitschr.Naturforsch.1960. B.15b. s.346

84. Tomka L, Bohonek I., Spuhler A., Ribeaud M.J. Photogr.Sci. 1975. v.23. p.97.

85. Титова E.P.,Белавцева Е.М. Биофизика. 1984. т.29. с.334.

86. Сенкевич С. И. ,Белавцева Е.М.,Каменская, Э.В. Ж.В.Х.О. им.Менделеева. 1979. т.24. с. 547.

87. Кабанова Т.А., Белавцева Е.М., Клячко Ю.А. Ж.В.Х.О. им.Менделеева. 1982.т.27.с.105.

88. Binnig G., Rohrer Н. Phys.Rev.Letters.1982. v.49.p.47.

89. Binnig G., Rohrer H., Gerber Ch., Weibel E. Appl.Phys.Letters. 1982. v.40. p. 178.

90. German M.L.,Blwnenfeld A.L.,Yyryev V.P.,Tolstogusov V.B. Car-bohydr. Polymers. 1989. v.11.p. 139.

91. German M.L., Blumenfeld A.L., Genin Ya.V.,Yuryev V.P., Tolstogusov V.B. Carbohydr.Polymers. 1992. v.18. p.27.

92. Brenton V.,TissierI.P.,Korolezuk I.,Mciingannatt J.F. Reolod-gy and microstructure ofmalse starch gels. Buck of Abstracts. Plant polysacharides symposium. Nantes. France. 1996.

93. Richter M., Augustat S.,Schierbaum F. Aus gewählte methoden der Starkechemie.VEB. Fachbuchferlag. 1969.

94. Holl C.E. J.Biophys. Biochem. Cytol. 1956. v.2.p.625.

95. Belavtzeva E.M.,Radchenko L.G.,Tur D.R.,Schirina T.A"Korshak V.V.,Vinogradova S.V. Acta Polymerica. 1983.b.34.s.569.

96. Де Жен П. Идеи скейлинга в физике полимеров. Ред.Лифпшц И.Н. М.Мир. 1982.368 с.

97. Purz H.J., Schlawne М., Buchteman A. Acta Histochemica. 1981. b.23.s.89.

98. Толстогузов В.Б. Новые формы белковой пищи. М. Агропромиздат. 1987. 326с.

99. Flory R.J. Faraday Discuss.Chem.Sos. 1974.v.57.p.7.

100. Папков С.П. Студнеобразное состояние полимеров. М. Химия. 1974. с.24.

101. Busk G.C. Food. Technol. 1984. v.35. p.59.

102. Shenouda S.E. Adv.Food.Res.1980.v.26.p.275.

103. Navarro A.S.Martmo M.N. .Zaritzky N.E. Scanning. 1994. v. 16. p. 76.

104. Navarro A.S., Martino .M.N., Zaritzky N.E. J.Food. Engin. 1995. v.26. p.481.

105. Ferrero C.Martino M.N.Датitzky N.E. Int. J.Food. Sei. and Technol. 1993. v.28. p.481.

106. Lozinsky V.L, Vamerman E.S.,Titova E.F.,Belavtseva E.M.,Ro-gozhin S. V. Colloid.Polymer.Sei. 1984. v.262. p. 769.

107. Gallant D.J.,Bouchert B.,Buleon A.,Perez S. Europ.J. Clinical. Nutrition. 1992. v.46.( Suppl.2).p.3.

108. Юрьев И. П. ,Богатырев А .Н, Маслова Т.Д. ,Немировская И.Е. "Термопластическая экстузия. Научные основы,технология,оборудование". "Ступень". 1994.С.56.

109. Химия технология крахмала. М. Пищепромиздат. 1956. 579с.

110. Miles M.J.Morris Y.J.,Ring S.J. Carbohidr.Res. 1985. v. 135. p.257.

111. Wirzburg O.B. Starch in food industry. Handbook of Food Additives. Ed. Furia T.F. Cleveland : CRS press. 1972. ch.8.

112. Рихтер M., Аугустат 3. ,ШирбаумФ. Избранные методы исследования крахмала. М. Пищевая промышленность. 1975. гл.З.

113. Головня Р.В., Мишарина Т.А. Известия АН (серия химич.). 1992. N6. с.1257.

114. Golovnya R.V., Misharina I.A. Abstracts 5 Warburg Aroma Symp. Eisenach. Germany. 1997.p.31.

115. Мишарина T.A., Крикунова H.И., Головня P.B. Известия АН (серия химич.). 1998. N10,с.1943.

116. Golovnya R. V.Misharina I.A.5TereninaM.B. Nahrong. 1998.b.42. s.380.

117. Нефедов В.И. Рентгенозлектронная спектроскопия химических соединений. М. Химия. 1984.

118. Пушкарь Н.С.,Белоус A.M.,Цуцаева A.A. Криобиология и криоме-дицина. 1976. т.2. с.З.

119. Китайгородский А.И. Рентгеноструктурный анализ мелкокристаллических и аморфных тел. Гос. Изд. технико-теоретической литературы. М. Л. 1952. 588с.

120. Папков С.П. Процессы студнеобразования в полимерных системах. Изд.Саратовского Университета. 1985.Т.1. с.5.

121. Измайлова В.Н., Пчелин В.А., Абу Алис. Докл. АН СССР. 1965. т. 164. с. 131.

122. Rogozhin S. V.,Belavtseva Е.М., Vainerman Е.S.,Radchenko L.G.,Pivovarov P.P,Golovina Т.О.,Pertsevoy P.V. Nahnmg. 1984. b.28.c.165.

123. Morris V.J. Trends Food Sei. Technol. 1990. p.2.

124. Титова' Е.Ф. ,Белавцева E.M.Толстогузов' В.Б. Биофизика. 1974. т. 1. с. 10.

125. Агога К.А.,Lesser A. J.Mc.Carthy Т. J. Macromolecules. 1998. v.31. р.4614.

126. Tsuchida Е. Macromol. Symp. 1998. v. 131/ p. 155.

127. Moor H.5Muhlethalter К.,Waldiner H.,Frey-Wissling A. J.Biop-hys. Biochem.Cytol.1961.v.10.p.1

128. Grobe A.,Maron R. 3Purz H. Faserf'orsc. Textil- 95 tech.1966.ь.17.s.457

129. Maron R.,Grobe A.,Purz H. Second international symposium on viscose technical questions.1967. Stokholm.

130. Emmerik P.T.,Smolders C.A.,Geymayer W. J.Eur.Po-lym.1973.v.9.p.309

131. Huttman E.3 Preim K., Magdanz H.,Borger K., Purz H. J.Plaste und kautschuk. 1970.b.'17.s.202

132. MacKenzie A.P., Luyet B.J. J.Biodynamica.l967.v.l0.p.206

133. Luyet B.3 Rasmussen D. J. Criobiology.1967.v3.p.383

134. Rasmussen D., MacKenzie A.P. J.Phys.Chem.l971.v.75.p.967

135. Сенькевич С.А. Электронная микроскопия как метод анализа высокомолекулярных соединений в соках и винах.1980.Москва.с.34

136. Олехнович А.А. Аналитико-структурные преобразования гелевых систем полисахаридов красных морских водорослей.1984.Москва.с.98