Анализ взаимодействия доменов репликативного белка А человека с частичными ДНК-дуплексами методами ограниченного протеолитического расщепления и аффинной модификации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ПЕСТРЯКОВ ПАВЕЛ ЕФИМОВИЧ

АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДОМЕНОВ РЕПЛИКАТИВНОГО БЕЛКА А ЧЕЛОВЕКА С ЧАСТИЧНЫМИ ДНК-ДУПЛЕКСАМИ МЕТОДАМИ

ОГРАНИЧЕННОГО ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ И АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ

02 00 10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск, 2007 г

003069675

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель

д х н , проф Лаврик Ольга Ивановна

Официальные оппоненты дхн, проф Карпова Галина Георгиевна

д б н , проф Рубцов Николай Борисович

Ведущая организация

Московский государственный университет им МВ Ломоносова, химический факультет

Защита состоится « 24 » мая

2007 г в 12

,30

часов

на заседании диссертационного совета Д 003 045 01 при

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

по адресу 630090, Новосибирск-90, пр Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « 20 » апреля_2007 г

Учбный секретарь диссертационного совета дхн

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Процессы репликации, репарации и рекомбинации ДНК играют ключевую роль в хранении и реализации генетической информации, поэтому их исследование является важным для понимания фундаментальных основ жизнедеятельности клетки Эти процессы реализуются сложноорганизованными машинами, в которых участвует большое количество ферментов и белковых факторов К числу ключевых белков репликации и репарации ДНК относится эукариотический аналог БЗВ-белков, репликативный белок А (ЯРА), связывающий с высоким сродством структуры ДНК, содержащие одноцепочечные участки Взаимодействие 11РА с ДНК приводит к формированию нескольких типов комплексов, отличающихся ориентацией белка относительно ДНК, при этом в процессах репликации и репарации происходит переход от одного типа комплекса к другому ЯРА содержит несколько доменов, способных связывать ДНК и различные белки, что позволяет формировать сложные белок-нуклеиновые ансамбли и координировать взаимодействие ключевых ферментов и белковых факторов с ДНК Таким образом, изучение разных типов взаимодействия 11РА со структурами ДНК, участвующими в репликации и репарации, необходимо для понимания механизмов регуляции и координации этих процессов и является, безусловно, актуальной задачей Несмотря на большой интерес к исследованию строения комплексов ЯРА с различными структурами ДНК, ряд вопросов, касающихся механизма их формирования, остается невыясненным Например, не установлено расположение доменов белка в комплексе с ДНК и механизм координации их ДНК-связывающей активности Кроме того, актуальной задачей является выяснение роли доменов и субъединиц белка, не отвечающих за высокоаффинное связывание ЯРА с ДНК-субстратом Применение рентгеноструктурного анализа и метода ядерного магнитного резонанса до сих пор не позволило решить эти проблемы, также не определена трехмерная структура полноразмерного ЯРА В этой связи для решения поставленных задач актуальным является использование одного из наиболее перспективных методов биоорганической химии - метода аффинной модификации, позволяющего исследовать сложные и динамичные белок-нуклеиновые комплексы

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействия доменов репликативного белка А человека с частичными ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репликации и репарации ДНК Решены следующие задачи 1) методами фотоаффинной модификации и ограниченного протеолитического расщепления изучено расположение и ориентация субъединиц и доменов белка относительно ДНК, 2) с использованием мутантных форм белка, лишенных некоторых

доменов, исследованы механизмы образования комплексов RPA с частичными ДНК-дуплексами, определена роль отдельных доменов и изучено их взаимодействие с ДНК; 3) с использованием мутантных форм RPA, имеющих определенный субъединичный состав, исследована роль отдельных субъединиц RPA во взаимодействии с ДНК и поддержании его функциональной активности в модельной системе репликации SV-40

Научная новизна и практическая ценность работы.

Комплексное применение методов фотоаффинной модификации и ограниченного протеолитического расщепления RPA и его мутантных форм впервые позволило выявить роль субъединиц и ДНК-связывающих доменов этого белка во взаимодействии со структурами ДНК, имитирующими интермедиаты процессов репликации и репарации ДНК Показана общность архитектуры комплексов RPA с одноцепочечной ДНК и частичными ДНК-дуплексами, которая заключается в "полярной" ориентации субъединиц RPA относительно ДНК Впервые обнаружены непосредственные контакты субъединицы р14 с одноцепочечной ДНК, что позволяет говорить о существовании ранее неизвестного способа связывания RPA с ДНК, а также показано участие субъединицы р14 в формировании специфического "полярного" комплекса RPA с ДНК Выводы, полученные в результате исследования структуры комплексов RPA с ДНК, подтверждены исследованием функциональной роли субъединиц белка в процессах репликации Показано, что нарушение взаимодействия RPA с ДНК, вызванное отсутствием субъединицы р14 и/или р32, приводит к блокированию ключевых стадий репликации ДНК Понимание фундаментальных принципов взаимодействия RPA с различными структурами ДНК необходимо при разработке методов активации и блокирования процессов метаболизма ДНК в клетке.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 5 статьях и 15 тезисах докладов Результаты работы были представлены на международных конференциях: «Weimar conference of genetics Regulation of genome replication and genome repair», Веймар, Германия, 2000, 3rd International conference on bioinformatics of genome regulation and structure, Новосибирск, 2002, «Targeting RNA artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference», Новосибирск, 2003, «Chemical and biological problems of proteomics», Новосибирск, 2004, «International conference on chemical biology», Новосибирск, 2005, CSHL meeting «Eukaryotic DNA replication», Колд Спринг Харбор, США, 2005, «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2006

Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы Она изложена на 125 стр и включает 39 рисунков, 1 таблицу и список цитируемой литературы из 147 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Структурная организация комплексов |}рд с частичными ДНК-дуплексами

Гетеро гримерный решшкативныЁ белок А (ЯРА), состоящий из субъединиц с молекулярными массами 70, 32 и 14 кДа (р70, р32 и р14, соответственно; рис. 1), безусловно, является ключевым фактором процессов репликации и репарации ДНК на этапе ресинтеза. Поэтому несомненный интерес представляет изучение комплексов ЯРА с промежуточными структурами ДНК, образующимися в этих процессах. Частичные ДНК-дуплексы с выступающими одноцепочечиыми участками лучше имитируют такие формы ДНК, чем одноцепочечные олигонуклеотиды, поскольку 3'-конец содержащегося в них праймера может использоваться ДНК-пол и м ераз а м и для синтеза новой цепи ДНК, комплементарно выступающему участку одноцепочечной матрицы.

[>70 I

р7(1М1> р?0А ¡171)]]

р71)С.

р32М 11321) р32("П> р32 -—■

ри с

Рис, I. Схематическое изображение суЬъедшпщ НРА и сое ¡ являющих их доменов.

В первой части работы было проведено детальное исследование укладки субъединиц и доменов ЯРА на ДНК-структуры, представляющие собой частичные ДНК-дуплексы и одноцепочечные олигонуклеотиды. 1Д. Взаимодействие доменов КРА с одноцепочечиыми участками ДНК-дуплексов

При протеолитическом расщеплении КРА трипсином образуется ограниченное число хорошо разделяемых фрагментов ИРА, наличие которых в профиле протеолитического расщепления зависит от присутствия в растворе ДНК (рис. 2; структуры ДНК, использованные в работе представлены в табл. 1).

Таблица I. Структуры ДНК, использованные при проведении о ера ничейною протеоли I ическо! и расщепления НГА

Обозначение Структура

ДЦ-1 3' -СССССАС<5А5АСТТААС5АССТАСАйесТТТС/

ДЦ-5 5' -1) (т) .лзсссстктстсалттсстамтвттсоаиииз,.

3' -ссоссас<за(засттаас6асстасааестгтс/

ДЦ-9 5' -а (т) »айбссстйстс теааттсстошм'еттсшлла,

ДЦ-17 5' - а (Т), рЛСОСССГ йстстсааттссттсатсттсоалас^ 3' -сс5<хасеа0аст1аа5басстасаа6стттс/

ДЦ-33 5' -а (т> „ дссссетастстйадттсс т&затот тснааао* 3' -сс(ксасаа5асттаасвасстасааестгтсу

Обоз на-чмт Структуре

ОЦ-5 5'-а(тьд-3'

ОЦ-9 Ъ' -а т

ОЦ-17 5'-а(Т)15А-Э'

оцзз 5'-а(Т) «а-З'

А

В

Ф 1 2 3 4 5 6 7 S M

р70

5*!

5а

ï__--- Уа/УЬ

ш— ^ 12 .

' 1 2 3 4 S 6 7.

----

р70 I 3

ЛГ<£>

2 3 4 5 6 7 S

I>14

=:78 " V"

р14 —

р70

Гз

=78 -~9а/9Ь

V 12

V-»

в отсутствие ДНК

ДЦ-9 9ит

дц-зз

ЗЗнт

шшшо

Рис. 2 Анализ профилей протеолитического расщепления RPA трипсином в отсутствие ДНК (А) и в присутствии частичных ДНК-дуплексов ДНК-9 (Б) и ДНК-33 (В) (продукты ограниченного протеолитического расщепления анализировали гель-электрофорезом по Лэммли и окрашиванием кумасси G-250) Реакционные смеси ( 10 мкл) содержали 5 мкг RPA, 43 пмоль ДНК (для (А) и (В)) и трипсин (дорожки 1-8-22,43,58,86,172,430,860 и 1725 пмоль соответственно) Справа указаны положения субьединиц RPA и их протеолишческих фраг ментов На дорожке M представлено разделение белков-маркеров молекулярных масс, на дорожке RPA- реакционной смеси без добавления трипсина

Таблица 2. Фрагменты протеолитического расщепления ИРА трипсином (указаны позиции аминокислотных остатков, соответствующих границам фрагмента)

(Под термином "профиль протеолитического расщепления" мы подразумеваем набор пептидных фрагментов, образуемых при протеолитическом расщеплении белка на определенную глубину). Это позволило применить метод ограниченного

протеолитического расщепления для изучения поверхностей взаимодействия RPA с ДНК и конформационных переходов, происходящих при связывании На первом этапе работы была проведена идентификация протеолитических фрагментов RPA, образующихся на разных стадиях расщепления (табл 2) Для этого применяли методы иммуноблотинга с использованием 7 типов моноклональных антител, специфически распознающих различные участки субъединиц RPA, и автоматическое секвенирование пептидов по Эдману Полученные данные позволили определить положения сайтов расщепления и пути протеолитического расщепления субъединиц RPA Из данных, представленных на рис 2, видно, что пути протеолитического расщепления RPA, находящегося в комплексе с ДНК, действительно

Эбозна-Чение Мол масса, кДа Границы фрагмента

фР1 55 р70(1-489)

фр2 53 р70(1-473)

фрЗ 51 р70(168-616)

фр4 49 р70(1-431)

фр 5а 41 р70(1-367)

фр 56 35 р70(168-489)

фрб 30 р70(345-616)

ФР7 28 р32(39-270)

фр8 25 р70(390-616)

фр 9а 21 р70(432-616)

фр 96 21 р70(168-354)

фр 10 19 р70(1-167)

фрП 18 р70(1-163)

фр12 14 р32(43-171)

фр.5б

4 raras

Рис. 3. Модель изменения пути растепления субьеднакцы р70 ¡il'A и зявисимост и от укладки доменов ¡)7Ü А, р70В и p7ÛC ira одни цепочечные участки частичных ДНК-дуплексов. Схематически представлены субьсдиннна р70 я сс протеоиитпческие фрагменты фр.З и фр.5(5. Серыми стрелками показано расположение некоторых сайтов расщепления, рядом со стрелками отражено влияние частичных ДНК-дуплексов на доступность этих сайтов, а также предполагаемое расположение доменов RPA в комплексе с ДНК,

отличаются от таковых для свободной формы белка. Кроме того, число сайтов расщепления и их доступность в комплексе RPA с частичными ДНК-дуплексами меньше, чем в комплексе с однопе почечным и олигонуклеотидами (данные не представлены), что, несомненно, говорит об особенном характере взаимодействия RPA с этими ДНК-структурами. Анализ профилей протеолитнческого расщепления свободной формы RPA и RPA, находящегося в комплексах с различными ДНК-дуплексами, показывает, что наблюдаемая разница в пути растепления отражает последовательное изменение доступности сайтов протеолиза в составе ДНК-сВЯЗЬшающих доменов субъединицы р70 (рис.3). Это происходит по мере увеличения длины одно цепочечного участка ДНК. Можно проводить аналогии между способами образования комплексов RPA с частичными ДНК-дуплексами и одноцепочечной ДНК (оцДНК) (Bastin-Shanower et.ai, 2001). В формировании и тех и других комплексов основную ДНК-связывающую роль играют домены р70А и р70В. Связывание RPA с коротким одноиепочечным участком ДНК в составе модельных структур, например ДЦ-9, обеспечивается тандемом этих доменов, что приводит к экранированию домена р70В и линкерной области между доменами р70В и р70С от действия протеаз. Конформационные изменения, происходящие при этом, приводят к увеличению числа разрывов в домене р70С. Сам ДНК-связывающий домен р70С участвует в непосредственных взаимодействиях только с более длинными однонепочечными участками модельных ДНК -ДЦ-17 и ДЦ-33, при этом блокируются протеолитические сайты в его составе. Следует отметить, что использованные а работе структуры ДНК не приводят к значительному экранированию линкерной области между доменами р70А и p70NTD, Таким образом, N-концевой домен субъединицы р70, по-видимому, не связывается непосредственно с ДНК.

Согласно {Gomes et.al., 1996) связывание RPA с одно цепочечным и о л и го н у к леот и да м и сопровождается значительными изменениями в скорости и характере п ротеол ит ич ее ко го расщепления субъединицы р32 вследствие связывания содержащегося в ней домена p32D с ДНК. Отсутствие такого эффекта при проведении ограниченного расщепления RPA, находящегося в комплексах с частичными ДНК-дуплексами (рис. 2), говорит о том, что при связывании таких ДНК-струкгур домен p32D не принимает участия в контактах с о дно цепочечной выступающей частью ДНК. Отсутствие контакта p32D с одноцепочечной ДНК отличает комплексы RPA с частичными ДНК-дуплексами от комплексов с оцДНК. 1.2. Ориентированное взаимодействие субъединиц RPA с одноцепочечной ДНК

Для изучения укладки субъединиц RPA на одноцепочечной ДНК мы провели фотоаффинную модификацию белка 30-звенными оли гонуклеотидами, несущими фотореакционноспособную группировку в различных положениях цепи (рис. 4). Введение остатка 4-тиоурацила, фотореагента с "нулевой длиной линкера", в положения +8, +16 и +22 относительно 5'-конца позволило выявить белковые субъединицы, непосредственно контактирующие с соответствующими участками олигонуклеотида.

ДНК-проба 2

- * + '6

ДНК-проба 1

8

I 2 3 4 5

р70-ДНК —

р32-ДНК — р14-ДШС —

свободния_ ДНК

ДНК-проба 3

,_Щ2

1 2 3 4 5

RPA, мкМ 0J2ns2\5 1 j

0.25 1 0.125 0.5 2

0.25 1 0.125 0.5

Рис. 4. Aim.un продуктов фотоаффинной модификации [1РА цЦн оцеп очечным и олигонуклеотидами, несущими ф<ггореакиион неспособную группу в разных положениях относительно э'-конца (радиоавтограф!. Реакционные смеси содержали КРА н 0.3 мкМ

радиоактивномеченую Д НК-втруюуру (ДНК-лроба-п, и=1, 2 или 3). После УФ-облучения продукты модификации анализировали гель-электрофорезом по Лэммли. Слева указаны положения продуктом модификации КРА.

Данные по модификации белка, проведенной в условиях формирования комплексов со стехиометрией связывания 1:1 (рис. 4, дорожки 1 и 2), свидетельствуют о специфической ориентации субъединиц

RPA на одноцепочечной ДНК. Доля мечения субъединицы р70 при переходе от 5'-концевой к 3'-концевой трети олигояуклеотида снижается с 91 до 41% (под термином доля мечения субъединицы мы понимаем отношение количества радиоактивных продуктов мечения этой субъединицы к общему количеству продуктов мечения гетер отри мер а RPA). В то же время, доля мечения р32 возрастает от 0 до 49%. Данные фотоаффинной модификации указывают на "полярность" расположения субъединиц RPA на о дно цепочечной ДНК н находятся в полном соответствии с принятой моделью взаимодействия белка с ДНК. На основании данных настоящей работы, в совокупности с данными {Lavrik et.ai, ¡998, Kolpashchikov et.al., 2001), можно говорить о том, что ДНК-связывающий домен p32D субъединицы р32 связывается вблизи З'-конца оцДНК, а домены р70А, р70В, р70С субъединицы р70 располагаются преимущественно вблизи 5'-конца ДНК.

1.3. Расположение субъединиц RPA относительно области перехода одноцепочечной ДНК вдвуцепочечную (оцДНК-дцДНК)

В работах {Lavrik et.al., I99S, Lavrik ai.al.. 1999) было проведено фотоаффинное мечение RPA ДНК-структурами, несущими фотоактивную группу на 3'-конце олигонуклеотида-праймера. Было показано, что в комплексах RPA с частичными ДНК-дуплексами с областью перехода ОцДНК-дцДНК взаимодействуют субъединицы р32 и р70. Мечения малой субъединицы (р 14) использованными наборами фотореагентов достичь не удалось, причиной чего могло быть экранирование этой субъединицы с помощью р32 и р70, которые непосредственно взаимодействуют с областью перехода оцДНК-дцДНК. В настоящей работе была предпринята попытка провести модификацию субъединицы р!4 ДЬÎK-дуплексами (табл. 3), в которых фотоактивная группа была присоединена к 3'-концевому остатку dUMP

Таблица 3. Структуры ДНК, использованные в экспериментах при проведении

фотивфф и (IНФЙ модкфика иии.

Обозначение структура

Д11К-1 3 ' -ACAATATCGGGGATGG- 5 ' 5' -d (Т) 35 AGTGTTATAGCCCCÏACC-3'

ДНК'2 3'-CACATATCGGGGATGG-5' 5'-ggttcgatatcgtagttctagtgtatagcccctacc-3'

днк-10 3'-cacatatcggggatgg-5' 5'-tcgtagttctagtgtatagcccctacc-3 '

днк-ю 3'-CACATATCGGGGATGG-5' 5'-TGGTTCGAÏATCGTAGTTCTAGTGTATAGCCCCTACC-3 '

днк-зо 3'-CACATATCGGGGATGG-5' 5r -ТТТТТГТ TITTGGT TCGATATCGTAGTTCTAûT GTATAGCCCCTACC-3 '

кДа 1 2 3 4 5 6 7 8

97.4

р70-ДНК —= 66

** W

т » ■■■и тШШ Ш

pol ß-ДНК —|

р32-ДНК — 30

21.5-

14.3

FAB-n-dUTP, л- 4 9 11 13

pul р + + + + + + + + RPA .+.+.+.+

Рис. 5, Анализ продуктов модификации ДНК-полнмеразы [') (pol (5) и КРА фотоакпшнымн ДНК-дуплексами, несущими па З'-коние остаток FAB-lt-dUMP (радиоавтограф). После присоединения остатка FAB-u-dUMPк3-кониу 5'-["Р]-мечеиого праймера ДНК-структуры Д] 1К-2 (0.5 мкМ) с помощью pol (3, к реакционным смосям добавляли RPA (дорожки 2, 4, 6 и В) до концентрации 0.7 шМ, затеи облучали УФ-светоы. Анализ продуктов .чодификацли проводили гель-электрофорезом по J1 ЭММ л и. Слева указаны положения продуктов модификации RPA, pol (3 и маркеров молекулярных масс.

линкерами различной длины. Для получения таких ДНК-структур были использованы четыре аналога dUTP (FAB-n-dUTP, n=4, 9, 11, 13), характеризующиеся различной длиной линкера между арилазидогруппой и гетероциклическим основанием. Три из этих аналогов были использованы в качестве субстратов для синтеза ДНК впервые. Результаты проведенной нами фотоаффинной модификации RPA (рис. 5} согласуются с полученными ранее данными (Lavrik et.ai, ¡999). Независимо от длины линкера, связывающего фотоактивную группу с 3'-кондом праймера, модификации подвергаются только две субъединицы RPA - р70 и р32. Мечения субъединицы р14 указанным набором фотоактивных структур не наблюдали.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что в комплексах RPA с частичными ДНК-дуплексами субъединица р70 образует непосредственные контакты с одно цепочечным участком, субъединица р32 располагается вблизи области перехода оцДНК-дцДНК, а субъединица р 14 значительно удалена от З'-конца праймера. Осуществить модификацию этой субъединицы не удается даже при использовании фотореагентов со значительной длиной линкерной группы. 1.4. Домены RPA, взаимодействующие с областью перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечную

Для получения информации о доменах RPA, которые взаимодействуют с областью перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечную а комплексах RPA с частичными ДНК-дуплексами, мы

использовали комбинацию двух подходов На первой стадии проводили модификацию RPA фотоактивным ДНК-дуплексом, несущим реакционноспособную группу в 3'-конце праймера, после чего на второй стадии меченый RPA подвергали ограниченному протеолитическому расщеплению Полученные в первой части работы данные о путях протеолитического расщепления RPA позволили идентифицировать меченые белок-нуклеиновые конъюгаты и проанализировать домены RPA, подвергшиеся модификации Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что кроме доменов р70С и p32D ни один из других доменов не подвергался модификации фотоактивной ДНК (данные не представлены) Таким образом, при связывании частичного ДНК-дуплекса с протяженным одноцепочечным участком поверхность взаимодействия RPA с областью перехода оцДНК-дцДНК сформирована доменами р70С и p32D Другие домены RPA непосредственно с 3'-концом праймера не контактируют

2. Роль индивидуальных доменов RPA и их взаимодействие при связывании частичных ДНК-дуплексов

Как следует из предыдущих разделов, применение метода фотоаффинной модификации оказалось очень успешным для определения "архитектуры" комплексов RPA с ДНК Для детального изучения роли отдельных доменов RPA в связывании с частичными ДНК-дуплексами и характера организации междоменных взаимодействий этот метод был использован совместно с применением мутантных форм RPA, представляющих собой несколько комбинаций ДНК-связывающих доменов (табл 4)

Таблица 4. Мутантные формы ЯРА, представляющие собой комбинации ДНК-связывагощи\ доменов (остатки аминокислот, соответствующие границам фрагмента, указаны индексом к обозначению субъединиц)

2.1. Домены ИРА, участвующие в формировании комплексов

При проведении

фотоаффинной модификации нативного ЯРА и его мутантной формы АВОО»р14 частичными ДНК-дуплексами, несущими одноцепочечные участки разной протяженности (рис 6), соотношение интенсивностей мечения субъединиц практически не отличалось (сравн дорожки 2-5 и 7-10 на рис. 6А и 6Б, а также 2-5 и 6-8 на рис 6В и 6Г) Например, в комплексах АВОО«р14 с ДНК-30 со стехиометрией связывания 1 1 модификации, как и в случае нативного ИРА, преимущественно подвергается остаток субъединицы р32 (р324з_171) — домен р32Б (рис 6А, 6Б, дорожки 2,3 и 7,8) В комплексах с ДНК-10 фотореагент, присоединенный протяженным линкером, модифицирует преимущественно

Обозначение Структура

ABOD-pM p701gi.6i6*p3243-i7i*pl4

АВ р70]81Д22

OD«pl4 p70436-6i6*p3243-!7i*pl4

D*pl4 p3 243_i7i»pl4

А

ДНК-30, фою))ся1еш, присоединенный протяженным

линкеров]

«Да

SZT 47.5

'7 РР1. гя

-------- ..„АВ-ДНК

----... »рзг-яик

M

h.D-ДНК

; да&&

ь

кДа 8во_

ег.сг

ДНК-30, фотореагент с "нулевой дли л ой линкера"

it rît) i«ra

„Р70.ДНК -»A ВС-ДНК

И4.

p- * ■'■■■

и

1,4*

4 AS .ДНК

НвмЬшшё IJHÉÉe j

'IV Ай&^Ф

un» W VV w S ¥V v Vtf bttV (fVVV Y

3 RPA C-D-PA4

J- 0-Д11К

в

ДИК-10, фотореагент, присоединенный протяженным

кДа ЛПНКСриМ

ад. о ' | J ' • " ' ' •

S2.D 47.5

щм

>7 rj ' I le '

......_........,_р70-Д11К

......*......... * А ВС-ДНК

.....*АЭ-ДНК

--- Ч-Р32-ДИК

I Ы|*с-днк

-^¡j^sss ¿SSS

SS.Q_ 62 .(Г

1Г в 3S-5.

25.Ц_

ДНК-10, фотореагент с "нулевой длиной линкера"

F т I * га и pi pj п. р, 1« г

I t

L.

)

d. ■ ; i

г.—.........

f-----------

ч Р70.ДНК ■»ABC-ДНК

»AB-pHK j рзг-днк

br

, D-ДНК

Рис, 6, Анализ продуктов фотоаффннгкш модификации мутантных форм RPA, предо и пли ю щих собой комби нами и ДНК-связывающих доменов (радиоавтограф). Реакционные смеси содержали RPA или его мутантную форму, 0,5 мкМ радиоактивномеченую ДНК-структуру (ДНК-10 или 30), несущую на 3'-конце праймера фотоактивный остаток FAP-dUMP (фотореагент, присоединенный протяженным линкером) или sdUMP (фотореагент с "нулевой длиной линкера"). После УФ-облучения продукты модификации анализировали гель-электрофорезом пр Л эммли. Слева указаны положения бел кои-маркеров молекулярных масс, справа -продуктов модификации RI'A и его мутантных форм.

субъединицу р70 нативного белка и ее остаток р70ш.616 (ABC) мутантной формы ABC*D*pl4 (рис. 6В, дорожки 2-5 и 6-9). В аналогичных комплексах фотореагентом с "нулевой длиной линкера" метятся р32 и р70 в случае нативного белка и остатки этих субъединиц в случае ABC-D*pl4 (рис. 6Г, дорожки 2-5 и 6-9). Данные фотоаффинного мечения показывают, что архитектура целого ряда комплексов, образованных мутантной формой ABC-D-p 14 и нативным RFA с частичными ДНК-дуплексами, совпадает. Таким образом, для связывания ДНК и образования комплекса RPA-ДНК с расположением остатков субъединиц, повторяющим расположение субъединиц нативного белка, достаточно четырех ДНК-связываюших доменов р70А, р70В, р70С и p32D в комплексе с субъединицей р14.

2.2. Домены М*А, отвечающие за ориентированное взаимодействие с переходом одноцепочечной ДНК в двуцепочечную

При проведении модификации мутантных форм мы использовали ДНК-дуплексы, несущие фотореагенты, различающиеся расстоянием между гетероциклическим основанием 3'-концевого нуклеотидного звена праймера и фотоактивной группой Остаток эсШМР является реагентом с "нулевой длиной" линкера, в то время как остаток РАР-сЮМР представляет собой фотореагент, "присоединенный протяженным линкером" Анализ модификации мутантной формы ОБ'рМ показывает, что в комплексах с ДНК-10 остаток субъединицы р32 занимает положение, способствующее более тесному его контакту с З'-концом праймера, о чем свидетельствуют данные модификации с использованием фотореагента с "нулевой длиной линкера" Если же фотоактивная группа соединена с З'-концом праймера протяженным линкером, то она оказывается удаленной от остатка субъединицы р32 и модифицирует находящийся на одноцепочечном участке остаток субъединицы р70 В комплексе ОБ«р14 с ДНК-30 РАР-сШМР-содержащая ДНК-структура образует фотопришивки к остаткам обеих субъединиц, а бсШМР-содержащая - только к р32 Таким образом, данные экспериментов по модификации мутантной формы 00»р14 свидетельствуют о специфической ориентации остатков субъединиц относительно области перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечную Домен р70С, не обладающий высоким сродством к оцДНК, все же "предпочитает" связываться с одноцепочечной частью ДНК-дуплекса в некотором отдалении от З'-конца праймера, а домен р32Б контактирует с областью перехода оцДНК-дцДНК Такое расположение доменов ЯРА характерно как для нативного белка, так и для АВОБ*р14 Таким образом, наличие тандема ДНК-связывающих доменов р70А и р70В не является необходимым для специфического взаимодействия с областью перехода оцДНК-дцДНК, основной характеристикой которого является ориентированное расположение р70С и р320 относительно З'-конца праймера

Литературные данные (Ко1ра5Ис1пкоу е/ о/, 1999) свидетельствуют о крайне невысоком сродстве отдельно взятой субъединицы р32 к ДНК В экспериментах, проведенных в настоящей работе методами "задержки в геле" и фотоаффинной модификации, не было зафиксировано комплексов частичных ДНК-дуплексов с мутантной формой Б»р14, представляющей собой комплекс из ДНК-связывающего домена р32Б и субъединицы р14 (данные не представлены) По-видимому, вариант связывания, согласно которому домен р32Б формирует поверхность взаимодействия с областью перехода оцДНК-дцДНК, может реализоваться только в присутствии других ДНК-связывающих доменов При этом, как показывает характер

модификации мутантной формы СЮ'рМ вполне достаточно взаимодействия двух доменов - р320 и р70С

Таблица 5. Мутантные формы ИРА, представляющие собой комплексы химерной субъединицы МВР-р70 с малыми субъедшшцами белка (для каждой мутантной формы ЯРА указан ее субъединичный набор)

3. Роль малых субъединиц RPA

Данные биохимических исследований показывают, что основная ДНК-связывающая активность RPA относится к большой субъединице р70 Роль малых субъединиц RPA изучена в гораздо меньшей степени, хотя известно, что для жизнедеятельности клетки необходимы все три гена, кодирующие субъединицы RPA (Brill et al, 1991) Для того, чтобы изучить роль субъединиц р14 и р32 во взаимодействии RPA с интермедиатами процессов метаболизма ДНК, было проведено исследование с использованием мутантных форм RPA, содержащих разный набор субъединиц Большая субъединица в белках была представлена химерной конструкцией мальтозо-связывающего белка (МВР) с р70 RPA - МРВ-р70 (табл 5)

Анализ препаратов мутантных форм RPA показал, что обе малые субъединицы (р32 и р14) могут связываться с р70 независимо друг от друга, кроме того, отсутствие отдельных субъединиц в мутантных формах RPA, и наличие остатка МВР, не влияет на укладку индивидуальных доменов мутантных белков (данные не представлены)

3.1. Участие субъединиц р32 и р14 в связывании RPA с ДНК

Результаты экспериментов, проведенных методом "задержки в геле", показывают, что все мутантные формы белка формировали стабильные комплексы как с кольцевой одноцепочечной ДНК фага М13 (данные не приведены), так и с 32-звенным олигонуклеотидом (рис 7) Несомненно, это связано с тем, что три из четырех ДНК-связывающих доменов RPA расположены в субъединице р70, химерная форма которой (МВР-р70) присутствовала во всех белках На примере mRPA показано, что наличие в мутантных формах остатка МВР не влияет на ДНК-связывающую активность полного гетеротримера Полученные данные свидетельствуют о том, что сродство к ДНК мутантных форм МВР-р70 и mRPAAp32, лишенных субъединицы р32, ниже, чем у нативного RPA, что связано с отсутствием в их структуре ДНК-связывающего домена p32D Однако сродство к ДНК димерного белка mRPAApl4 (рис 7), в котором находятся все 4 ДНК-связывающих домена, но отсутствует субъединица р14, все равно меньше чем гетеротримерной формы mRPA, что говорит об участии и

Обозначение Структура

mRPA (МВР-р70) 'р32*р14

mRPAA32 (МВР-р70) *р14

mRPAAH (МВР-р70) -р32

KMmRR 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ¡213 1415

белок-нуклеиновые комплексы

¿m - чшт

Ko м не in рация ^ V

белка, мкМ ^ ^ ^

V Ъ

Sa к ^

»

Ь Ь

•А'

Рис. 7. Анализ ДНК-свнзывающен активности RPA и его мутаитиы! форм, проведенный методом "задержки в геле" с использованием радиоактивном еч ей ого одиоцепочечного 32-звенвого олигонуклеотида (радиоавтограф). Реакционные емсси ( 10 мкл) содержали RPA (дорожка R) или одну изэтомутантных форм (дорожки mR. 1-15), или МБР (дорожка М), 100 фмоль 5'-["Р]-меченого олигонуклеотида d(T)0. Реакционная смесь, анализ которой представлен на дорожке К, не содержала белка. Справа показано положение несвязанной ДНК и ее комплексов сбелками.

малой субъединицы (р!4) в связывании с ДНК. Результаты экспериментов по модификации RPA одно цепочечным и фотоактивными о л и го ну кле оти дам ¡5 (см. рис. 4) также подтверждают ДНК-связывающую роль этой субъединицы. Напомним о том, что продукты мечепия RPA с молекулярной массой 25 кДа, которые соответствуют белок-нуклеиновым конъЕогатам, содержащим р14, наблюдали независимо от положения фотоактивного остатка sdUMP в структуре олигонуклеотида. Следует подчеркнуть, что доказательство существования комплекса RPA-ДИК, в котором с одно цепочечной ДНК контактирует субъединица р14, получено впервые.

Анализ взаимодействия мутантных форм с частичными ДНК-дуплексами проводили методом фотоаффинного мечения. При проведении модификации фотоактивными частичными ДНК-дуплексами, несущими реакционноспособную группу на З'-конце праймера, нами было обнаружено, что наличие остатка МБР не влияет на ориентированное взаимодействие субъединиц гетеротримерной формы niRPA с областью перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечную (рис. 8). При связывании mRPA с фотоактивным ДНК-дуплексом, несущим одноцепочечный участок размером в 30 нуклеотидных звеньев, модификации 3'-концом праймера подвергается субъединица р32, так же, как и в нативном белке. Однако при меЧении мутантной формы mRPAApl4, несмотря на наличие в белке субъединицы р32, ее эффективной пришивки к З'-концу праймера не

) 2 3 4 5 6 7 а 9 к) и п в 14 16

мвр-р7С-днк-р70-ДНК - т щ '1

рзг-днк -| цф я Ш *ч

концентраими \ белка. мкМ К

ь и / / г / у <<у

Рис. 8. Анализ продуктов фотоаффинной модификации КРА и еп> мутанты х форм, проведенный с использованием ДНК-дуплекса с 30-звенным выступающим одноцепочечным участком (радиоавтограф). Реакционные смеси содержали [1РА (дорожки 2-4) или одну из его мутантных форм (дорожки 5- [ 6), или МНР (дорожка I), рвдиоактивномеченый ! мкМ ДНК-дуплекс, несущий на 3'-конце праймера фотоактивный остаток 5(ЩМР, После УФ-облучения продукты модификации анализировали гель-электрофорезом по Лэммли. Слева указаны положения продуктов модификации ЯРА и его мутантвых форм.

происходит. Таким образом, результаты наших исследований показывают, что для эффективного взаимодействия субъединицы р32 с областью перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечную необходимо присутствие в белке как субъединицы р70, о чем было сказано выше, так и малой субъединицы р14.

Согласно предложенной нами модели взаимодействия ЯРА с частичными ДНК-дуплексами ДНК-связывающие домены субъединицы р70 ответственны за удержание белка на ДНК-субстрате за счет связывания с одноцепочечным участком ДНК, а субъединица р 14 исполняет роль своеобразного "связующего" звена между р70 и р32, обеспечивая укладку субъединицы р32 в область перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечную и определяя, таким образом, "полярность" связывания ЯРА в его комплексе с ДНК.

3.2, Роль субъединиц р32 и р14 КРА в репликации ДНК

Участие ЯРА в процессе репликации ДНК необходимо на этапах инициации репликации и элонгации. Для того, чтобы проверить способность мутантных форм с определенным субъединичным набором выполнять функции нативного КРА в процессах репликации ДНК мы проводили эксперименты в модельной системе 5У-40. В этой системе синтез ДНК осуществляется белками экстракта клеток 2935 человека (с

использованием геликазы вируса SV40 - Т-антигена (Tag) и плазм ид ной ДНК, содержащей сайг инициации репликации этого вируса. Ключевыми партнерами RPA s модельной системе являются Tag и Д H К - п о л и мер аза-а-праймаза (pol-a-prim), осуществляющая синтез РНК-праймера и его элонгацию на начальном этапе репликации. Результаты экспериментов, проведенных методом соосаждения (данные не представлены), показали, что все химерные мутантные формы RPA способны взаимодействовать с Tag и pol-a-prim. Следовательно, отсутствие в белках малых субъединиц кардинально не влияет на эту способность.

RPA является необходимым репликативным фактором, поэтому в клеточных экстрактах, истощенных по RPA, репликации плазмидной ДНК не происходит. Продукты синтеза ДНК в системе наблюдаются при добавлении рекомбинантного нативного RPA. Как показано в нашей работе, в присутствии гетеротримерной мутантной формы (mRPA) синтез ДНК также возобновлялся, хотя выход продуктов синтеза был ниже, чем в случае нативного белка (рис. 9). Мутантные белки, в которых отсутствовала хотя бы одна из субъединиц, не обладали способностью поддерживать синтез ДНК в системе.

ÎDCWfrr 90% - ■ 80% • ■ 70% . ■ 60% - ■ 50% -40% -

30% - ' 20% - ■ 10% - ■

0% - 1

-ППпгт-■ГЛтспГЛ a

и нал тируемый белок, il моль

Ъ Ъ

- £ CD ~

-А? о

« 7

-ta 11 11 13 к

/

V I--

*8

Рис. 9. Анализ уровня синтеза ДНК в модельной системе репликации SV-40 в присутствии нативного RPA и его мутантных форм. Уровень синтеза оценивали по включению радиоактивномечеяых NTP и dNTP в кислотонерастворимые продукты синтеза ДНК, проведенного белками экстракта S100 клеток человека 293S, истощенного по RPA, в присутствии анализируемой мутантной формы RPA, плазмидной ДНК pUC-HS, содержащей сайт инициации репликации ДНК вируса SV-40, и вирусной геликазы-Tag. За ! 00% принимали уровень синтеза, наблюдающийся

В присутствии 5 пмоль нативно(Й R.PA.

Представленные данные свидетельствуют о том, что для выполнения RPA своей роли в репликации ДНК нужна не только субъединица р70, вносящая основной вклад в ДНК-связывающую активность белка и в его способность взаимодействовать с Tag и pol-a-prim, но и две малые субъединицы гетеротримера.

В совместных экспериментах с коллегами из группы К, Вайсхарта (Германия) было показано, что все мутантные формы поддерживали расплетание двуцепочечной ДНК. катализируемое Tag, хотя активность этих белков уступала активности нативного RPA. В последующих экспериментах мы проверили способность мутантных форм КРА поддерживать синтез РНК-праймера, проводимый праймазными субъединицами pol-a-prim на предварительно раскрученном кольцевом ДНК-субстрате, и способность поддерживать элонгацию вновь синтезированного РНК-праймера ДНК-полимеразой а из состава pol-a-prim. В ходе экспериментов было показано, что в реакции инициации синтеза РНК-праймера и в реакции его элонгации только гстеротримерная мутантная форма (mRPA) способна заменить нативный RPA (рис. 10). Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что обе субъединицы р 14 и р32 необходимы для эффективной работы RPA на стадиях инициации и элонгации репликации ДНК. Присутствие только одной из этих субъединиц в комплексе с р70 не способно обеспечить необходимую функциональную активность мутантноЙ формы. А Б

К 1 2 3 4 5 R К 1 2 3 4 5 R

_продукты

синтеза

Pite. 10. Анализ продуктов синтеза РНК-праймера, катализируемого ираймазой (А), и продуктов элокгашш РНК-ДНК-пранмера, катализируемой ДНК-полнмеразой а. в присутствии RPA ИЛИ его мутантных форм (радиоавтограф). Реакционные смеси (кроме дорожки К) содержали М BP (дорожка I ) или нативный RPA (дорожка R)кяи одну из его мутантных форм (дорожки 2-5) и дополнительно Tag, топоизомеразу 1, pol-a-prim и предварительно расплетенную шшмидную ДНК pUC-HS (А) или праГшированную плазмидную ДНК pUC-ÍIS (К), Реакцию проводили в присутствии смеси немеченых и радиоактивномеченых NTP (А) или NTP и dNTP (Б), после чего иуклеошдный материал выделяли ианилнзиропали денагурпруюшим гель-электрофорезом.

продукты синтеза

Суммируя результаты экспериментов, проведенных с использованием мутантных форм RPA с разным субъединичным составом, можно сказать, что несмотря на способность МВР-р70 и mRPAAp32 связываться с ДНК и pol-cc-prim, этого оказывается недостаточно .аля проявления функциональной активности такого комплекса (табл. 6). Можно предположить, что на рассматриваемых стадиях синтеза ДНК роль субъединицы р32 заключается как в организации белок-белковых взаимодействий с pol-a-prirn, так и s ориентированном взаимодействии гетеротримера RFA с ДНК-субстратом. С другой стороны, в присутствии в модельной системе репликации ДНК гетеродимерного белка mRPAApM, который содержит обе субъединицы, опосредующие взаимодействия с pol-a-prim, но который не способен ориентировано взаимодействовать с ДНК-субстратом, синтеза ДНК также не происходит. Можно предположить, что с потерей "полярности" укладки субъединиц на ДНК-субстрат белок теряет и свою способность поддерживать синтез и элонгацию РНК-праймера.

Таблица 6. Сравнение свойств нативкого !íl'Л и cío мутантных форм, представляющих coñoii комплексы химерной субъединицы MBF-p70 с малым» субъединицами р32 и р14 К l'A.

RPA. mRPA МВР-р70 mRl>AAp32 mRPAApl4

Свитый а и не кольцевой ошоцепочечвой ДНК фата М13 + + + + +

Ьелок-белковые взаимодействии с Т-антнгеаом и Д НК-п ил н мер азой-a-i 1ра йм а зой + + + + +

Участие в реакции Т-антигси-ja висим ото расплетания ПЛЭМИДНОЙ ДНК pUC-HS + + + + +

Участие в синтезе PliK-праймсра, катализируемом нриймазои + + - - -

Участие в злонгвнни 1'НК-ДНК-«раймера, катализируемой ЗНК-полнмеразой а + + - - -

Итогом настоящей работы явилось исследование механизмов взаимодействия репликатианого белка А с ДНК и белковыми партнерами в процессах репликации ДНК. Следует сказать, что взаимодействие КРА с ДНК является динамичным процессом, в котором задействованы все субъединицы белка, включая малую субъединицу р 14. Архитектура образующихся комплексов зависит от типа связываемой ДНК и внешних условий, что потенциально может быть использовано в координации и регуляции процессов метаболизма ДНК в клетке. При этом высокая стабильность комплексов не всегда отражает их функциональную активность в этих процессах. Знания о принципах взаимодействия КРА с

различными структурами ДНК могут быть использованы при разработке методов активации и блокирования процессов репликации, репарации, а также синтеза теломер

ВЫВОДЫ

1 Изучено расположение субъединиц репликативного белка A (RPA) в его комплексах, образованных с одноцепочечной ДНК.

• Показано, что в комплексах, образованных по типу RPA30, субъединицы гетеротримера RPA ориентированы в направлении от 5'- к 3'-концу С помощью метода фотоаффинного мечения установлено, что 5'-концевой и центральный участки одноцепочечного олигонуклеотида непосредственно контактируют с субъединицей р70, а 3'-концевой участок -с субъединицей р32.

• Впервые выявлены контакты субъединицы р14 репликативного белка А с одноцепочечной ДНК

2 С помощью методов фотоаффинной модификации и ограниченного протеолитического расщепления исследованы особенности формирования комплексов RPA с частичными ДНК-дуплексами, несущими 5'-выступающий одноцепочечный участок

• Показано, что если размер одноцепочечного участка ДНК-дуплекса больше пяти, но меньше девяти нуклеотидных звеньев, связывание происходит с доменами А и В субъединицы р70, а ДНК-связывающий домен р70С контактирует с одноцепочечным участком, если его длина превышает шестнадцать нуклеотидных звеньев

• Установлено, что субъединица р32 расположена вблизи З'-конца праймера и не взаимодействует с одноцепочечным участком ДНК-дуплекса

3 Изучена роль отдельных доменов RPA в механизме образования его комплексов с частичными ДНК-дуплексами, содержащими 5'-выступающий одноцепочечный участок

• Показано, что домены p70NTD, p32N, p32CTD не оказывают влияния на ориентированное связывание гетеротримера RPA с ДНК

• Установлено, что белок, состоящий из ДНК-связывающих доменов р70С и p32D, а также субъединицы р14, способен связывать частичные ДНК-дуплексы При этом домен р70С контактирует с одноцепочечным участком вблизи его перехода в двуцепочечный, а домен p32D - с 3'-концом праймера, что соответствует ориентации этих ДНК-связывающих доменов в составе полного гетеротримера RPA.

4 Исследована роль малых субъединиц ЯРА во взаимодействии с ДНК и поддержании функциональной активности ИРА в модельной системе репликации БУ-40

• Показано, что мутантная форма ЯРА, в составе которой отсутствует субъединица р14 или р32, сохраняет ДНК-связывающую активность и способность взаимодействовать с Т-антигеном и ДНК-полимеразой-а-праймазой

• Установлено, что ЯРА, лишенный субъединицы р14, способен связывать одноцепочечную ДНК, но в его комплексах с частичными ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репликации ДНК, субъединица р32 не контактирует с областью перехода одноцепочечного участка ДНК в двуцепочечный

• Показано, что для проявления функциональной активности ЯРА на стадиях инициации синтеза РНК-праймера и его элонгации требуется присутствие всех трех субъединиц гетеротримера

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1 Колпащиков Д М, Пестряков Л Е. Власов В А , Ходырева С Н, Лаврик О И

Исследование взаимодействая репликативного фактора А человека с ДНК с применением новых фотореакционноспособных аналогов dTTP // Биохимия 2000. Т 65 С. 194-198.

2 Pestrvakov Р. Weiss hart К, Khodyreva S N, Nasheuer H -P, Lavrik ОI Domains

of human replication protem A contactmg the З'-end of the primer // Proceedings of the Third International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure Novosibirsk IC&G 2002 V 4 P. 28-30

3 Pestrvakov P E. Wemhart К, Schlott В, Khodyreva S N, Kremmer E, Grosse F,

Lavrik ОI, Nasheuer H -P Human replication protein A The C-terminal RPA70 and the central RPA32 domains are mvolved m the interactions with the З'-end of a primer-template DNA // J. Biol Chem 2003 V 278 P 17515-17524

4 Pestrvakov PE. Khlimankov D Yu, Bochkareva E, Bochkarev A , Lavrik ОI

Human replication protem A (RPA) bmds a primer-template junction in the absence of its major ssDNA-bmdmg domams // Nucleic Acids Res 2004 V 32 P 1894-1903

5 Weisshart K, Pestrvakov P. Smith R.W, Hartmann H, Kremmer E, Lavrik О,

Nasheuer H -P Coordmated regulation of replication protein A activities by its subunits pl4 and p32 // J Biol Chem 2004 V.279 P. 35368-35376

6 Пестряков TIE. Красикова ЮС, Петрусева ПО, Ходырева СП, Лаврик

О И Роль субъединицы р14 репликативного белка А в процессе связывания с одноцепочечной ДНК//Докл. АН 2007 Т 412 С. 118-122

7 Пестряков П Е. Красикова ЮС, Петрусева И О, Ходырева СН, Лаврик О И Роль субъединицы р14 репликативного белка А в процессе связывания с одноцепочечной ДНК // Труды международной конференции «Физико-химическая биология» Новосибирск APTA 2006 С 147-148

Изд лиц ИД № 04060 от 20 02 2001 Подписано к печати и в свет 19 04 06

Формат бумаги 60x84 Печ л 1,1 Уч-изд л 1,1 Тираж 100 Заказ № 32 Институт неорганической химии им А В. Николаева СО РАН Просп Акад Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ SSB-БЕЛКОБ В ПРОЦЕССАХ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА ДНК.

1.1. СТРОЕНИЕ SSB-БЕЛКОБ.

1.1.1. ГОМОТЕТРАМЕРНЫЕ SSB-БЕЛКИ.

1.1.2. ГОМОДИМЕРНЫЕ SSB-БЕЛКИ.

1.1.3. ГЕТЕРОТРИМЕРНЫЕ SSB-БЕЛКИ, РЕПЛИКАТИВНЫЙ БЕЛОК А.

1.1.4. SSB-БЕЛКИ ДРУГОГО СУБЪЕДИНИЧНОГО СТРОЕНИЯ.

1.2. ОСОБЕННОСТИ ДОМЕННОЙ СТРУКТУРЫ SSB-БЕЛКОБ И МЕХАНИЗМ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ДНК.

1.2.1. ОВ-ДОМЕН - ОСНОВА СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ SSB-БЕЛКОБ.

1.2.2. ДРУГИЕ ДОМЕНЫ SSB-БЕЛКОБ.

1.2.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ SSB-БЕЛКОБ С ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК.

1.3. УЧАСТИЕ SSB-БЕЛКОБ В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ.

1.3.1. SSB-БЕЛКИ В ПРОЦЕССАХ РЕПЛИКАЦИИ, РЕПАРАЦИИ И РЕКОМБИНАЦИИ ДНК.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. МАТЕРИ АЛЫ.

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. АРХИТЕКТУРА КОМПЛЕКСОВ RPA С МОДЕЛЬНЫМИ ДНК.

3.1.1. ОСОБЕННОСТИ КОНФОРМАЦИИ RPA В ЕГО КОМПЛЕКСАХ С ДНК (ПО

ДАННЫМ МЕТОДА ОГРАНИЧЕННОГО ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ).

3.1.2. ОРИЕНТИРОВАННОЕ РАСПОЛОЖЕНИЕ СУБЪЕДИНИЦ RPA В РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ЕГО КОМПЛЕКСОВ С ДНК (ПО ДАННЫМ МЕТОДА ФОТОАФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ).

3.1.3. КООРДИНАЦИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДОМЕНОВ RPA С ЧАСТИЧНЫМИ ДНК-ДУПЛЕКСАМИ (ПО ДАННЫМ МЕТОДА ФОТОАФФИННОЙ

МОДИФИКАЦИИ).

3.2. РОЛЬ МАЛЫХ СУБЪЕДИНИЦ RPA В СОСТАВЕ ГЕТЕРОТРИМЕРА.

3.2.1. СТРУКТУРНАЯ РОЛЬ СУБЪЕДИНИЦ Р32 И Р14.

3.2.2. УЧАСТИЕ СУБЪЕДИНИЦ Р32 И Р14 В ПРОЦЕССЕ СВЯЗЫВАНИЯ ДНК.

3.2.3. РОЛЬ СУБЪЕДИНИЦ Р32 И Р14 В ПРОЦЕССЕ РЕПЛИКАЦИИ ДНК.

Исследование механизмов хранения и реализации генетической информации является одной из важнейших фундаментальных задач современной биохимии и молекулярной биологии. На данный момент значительный прогресс достигнут в изучении строения и свойств ДНК-полимераз, играющих ключевую роль в этих процессах, однако свои специализированные функции в репликации и репарации ДНК у эукариот ДНК-полимеразы осуществляют в тесном взаимодействии с другими ферментами и белковыми факторами, такими как репликативный белок A (RPA), репликативный фактор С (RFC), ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), флэп-эндонуклеаза (FEN-1), апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза-1 (АРЕ1), ДНК-гликозилазы, ДНК-лигазы, поли-(АОР-рибозо)-полимераза-1 (PARP-1) и др. Системы репликации и репарации ДНК в настоящее время следует рассматривать как взаимосогласованные функциональные ансамбли белков. Таким образом, важным направлением является изучение белков и факторов репликации и репарации ДНК, которые осуществляют регулирующую и координирующую функции в этих ансамблях.

Объектом нашего исследования является эукариотический SSB-белок -репликативный белок А, являющийся ключевым фактором метаболизма ДНК, участвующим в репликации, репарации и рекомбинации ДНК. В процессах репликации и репарации RPA, с одной стороны, стабилизирует структуры ДНК, содержащие одноцепочечные участки, а с другой, координирует взаимодействие других белковых факторов с ДНК. Динамичная природа взаимодействий RPA с ДНК и белками-партнерами обусловлена особенностями структуры гетеротримера RPA, состоящего из субъединиц р70, р32 и р 14, в которых различают сразу несколько доменов, потенциально способных взаимодействовать с нуклеиновой кислотой. Взаимодействие RPA с ДНК сопровождается формированием нескольких типов комплексов, которые отличаются расположением и ориентацией белка относительно ДНК, при этом переход одного типа комплекса в другой происходит на стадиях ферментативных превращений ДНК. Таким образом, изучение разных типов взаимодействия RPA со структурами ДНК, участвующими в репликации и репарации, вносит неоценимый вклад в исследование путей регуляции и координации этих процессов и является, безусловно, актуальной задачей. К настоящему моменту достаточно хорошо исследованы комплексы RPA с одноцепочечной ДНК, однако взаимодействие RPA с частичными ДНК-дуплексами с выступающим 5'-одноцепочечным участком, которые имитируют субстраты ДНК-полимераз, изучено в гораздо меньшей степени. Остается открытым ряд вопросов о механизме формирования образующихся комплексов, координации ДНК-связывающей активности разных доменов и, наконец, функциональной роли доменов и субъединиц белка, не отвечающих за высокоаффинное взаимодействие с ДНК-субстратом. Таким образом, исследование "архитектуры" комплексов ЯРА с частичными ДНК-дуплексами, а также механизма их формирования представляет значительный интерес и является актуальным.

Физические методы исследования отдельных белков и комплексов белков с лигандами, такие как рентгеноструктурный анализ (РСА) и метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), зарекомендовали себя в качестве наиболее информативных подходов. В то же время каждый из этих методов имеет свои ограничения. Например, метод рентгепоструктурггого анализа не всегда применим из-за проблем при кристаллизации сложных биологических комплексов. Кроме того, РСА, как правило, не дает представлений о динамике взаимодействия белков с лигандом. Метод ЯМР является достаточно дорогим в связи с необходимостью использовать большие количества исследуемого биополимера, кроме того, существуют очень жесткие ограничения на размер изучаемого объекта. В связи с этим, одним из наиболее приемлемых подходов является метод фотоаффинной модификации.

Метод фотоаффинной модификации основан на введении в молекулу лиганда реакционноспособной группы, не влияющей драматическим образом на специфическое узнавание и связывание его ферментом. Подход предполагает образование специфического комплекса аналога лиганда с биополимером и последующее ковалентное присоединение аналога лиганда к аминокислотным остаткам, формирующим активный центр белка или находящимся в непосредственной близости от активного центра. Полученные структурные данные позволяют сделать вывод о расположении и организации участков связывания субстратов в молекуле биополимера. Подход наиболее эффективен при изучении сложных многосубстратных ферментов и надмолекулярных структур. Комбинация фотоаффинной модификации с другими биохимическими подходами, такими как метод ограниченного протеолитического расщепления, а также метод сайт-направленного мутагенеза, позволяет эффективно изучать механизмы междоменного и межсубъединичного взаимодействия в белках и их комплексах с лигандами. Использование широкого спектра фотоаффинных реагентов, обладающих самой различной эффективностью и селективностью модификации биополимера, открывает возможности исследования комплексов различной структуры и сложности. Данный подход позволяет фиксировать относительно нестабильные комплексы белка с лигандом, являющиеся промежуточными в динамичных процессах репликации и репарации ДНК.

Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействия доменов репликативного белка А человека с частичными ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репликации и репарации ДНК.

В ходе исследования планировалось решить следующие задачи.

• Методами фотоаффинной модификации и ограниченного протеолитического расщепления изучить структурную организацию ("архитектуру") комплексов RPA с частичными ДНК-дуплексами, то есть расположение и ориентацию субъединиц и доменов белка относительно ДНК.

• С использованием мутантных форм белка, лишенных некоторых доменов, исследовать механизмы образования комплексов RPA с частичными ДНК-дуплексами, определить роль отдельных доменов репликативного белка А и изучить взаимодействие этих доменов.

• С использованием мутантных форм RPA с определенным субъединичным составом выяснить роль отдельных субъединиц RPA во взаимодействии с ДНК и поддержании его функциональной активности в модельной системе репликации SV-40.

выводы

1. Изучено расположение субъединиц репликативного белка А (ИРА) в его комплексах, образованных с одноцепочечпой ДНК.

• Показано, что в комплексах, образованных по типу КРАЗО, субъединицы гетеротримера 11РА ориентированы в направлении от 5'- к З'-концу. С помощью метода фотоаффшшого мечения установлено, что 5'-концевой и центральный участки одноцепочечного олигонуклеотида непосредственно контактируют с субъединицей р70, а З'-концевой участок - с субъединицей р32.

• Впервые выявлены контакты субъединицы р!4 репликативного белка А с одноцепочечной ДНК.

2. С помощью методов фотоаффинной модификации и ограниченного иротеолитического расщепления исследованы особенности формирования комплексов 11РА с частичными ДНК-дуплексами, несущими 5'-выступающий одноцепочечный участок.

• Показано, что если размер одноцепочечного участка ДНК-дуплекса больше пяти, но меньше девяти нуклеотидных звеньев, связывание происходит с доменами А и В субъединицы р70, а ДНК-связывающий домен р70С контактирует с одноцепочечным участком, если его длина превышает шестнадцать нуклеотидных звеньев.

• Установлено, что субъединица р32 расположена вблизи 3'-конца праймера и не взаимодействует с одноцепочечным участком ДНК-дуплекса.

3. Изучена роль отдельных доменов КРА в механизме образования его комплексов с частичными ДНК-дуплексами, содержащими 5'-выступающий одноцепочечный участок.

• Показано, что домены р70ШТ>, р32Ь1, р32СТО не оказывают влияния на ориентированное связывание гетеротримера КРА с ДНК.

• Установлено, что белок, состоящий из ДНК-связывающих доменов р70С и р320, а также субъединицы р14, способен связывать частичные ДНК-дуплексы. При этом домен р70С контактирует с одноцепочечным участком вблизи его перехода в двуцепочечный, а домен р32Э - с З'-концом праймера, что соответствует ориентации этих ДНК-связывающих доменов в составе полного гетеротримера КРА.

4. Исследована роль малых субъединиц ЯРА во взаимодействии с ДНК и поддержании функциональной активности ЯРА в модельной системе репликации БУ-40.

• Показано, что мутантная форма 11РА, в составе которой отсутствует субъединица р14 или р32, сохраняет ДНК-связывающую активность и способность взаимодействовать с Т-антигеном и ДНК-полимеразой-а-праймазой.

• Установлено, что 11РА, лишенный субъединицы р14, способен связывать одноцепочечную ДНК, но в его комплексах с частичными ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репликации ДНК, субъединица р32 не контактирует с областью перехода одноцепочечного участка ДНК в двуцепочечный.

• Показано, что для проявления функциональной активности ЯРА на стадиях инициации синтеза РНК-праймера и его элонгации требуется присутствие всех трех субъединиц гетеротримера.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итогом настоящей работы явилось исследование механизмов взаимодействия репликативного белка А с ДНК и белковыми партнерами в процессах репликации ДНК. В первой части работы получены принципиально новые результаты в области исследования архитектуры комплексов RPA как с одноцепочечпыми олигонуклеотидами, так и с модельными ДНК-структурами, имитирующими интермедиаты репликации и репарации ДНК на этапе ресинтеза. Общность в архитектуре комплексов RPA с этими двумя видами ДНК заключается в том, что ДНК-связывающие домены большой субъединицы р70 вносят определяющий вклад во взаимодействие с одноцепочечным участком ДНК, тем самым, обеспечивая необходимое сродство белка к ДНК-структуре. Для обоих типов связывания характерна "полярная" ориентация субъединиц RPA относительно ДНК, которую определяет специфическая укладка субъединиц р70 и р32. Основное отличие комплексов RPA с одноцепочечной ДНК и частичными ДНК-дуплексами заключается в положении субъединицы р32. Если в случае оцДНК эта субъсдиница непосредственно взаимодействует с одноцепочечным участком, то в комплексах RPA с ДНК-дуплексами она размещается в районе перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечную.

В ходе исследования, направленного на изучение роли доменов RPA в связывании модельных ДНК-структур, были получены данные, позволившие пролить свет на механизм образования комплексов RPA с ДНК-структурами, имитирующими интермедиаты процессов репликации и репарации ДНК. Было обнаружено, что в связывание рассмотренных форм ДНК вовлечены домены р70А, р70В, р70С и p32D RPA. Домены р70А и р70В связывают одноцепочечные участки ДНК-структур. В комплексах RPA с протяженной оцДНК домены р70С и p32D также могут находиться в контакте с оцДНК, однако при взаимодействии с частичными ДНК-дуплексами эти домены оказываются расположены в области перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечную. В таких комплексах домен р70С занимает место на одноцепочечном участке, a p32D непосредственно контактирует с З'-концом праймера. Наличие тандема основных ДНК-связывающих доменов р70А и р70В не является необходимым для специфического b ориентированного взаимодействия RPA с частичными ДНК-дуплексами. Показано, что домены p70N, p32N, р32С RPA не принимают участия в процессе связывания с ДНК.

Особый интерес представляют результаты исследования роли малых субъединиц белка, которая долгое время оставалась неясной. В настоящей работе показано, что для достижения наибольшей ДНК-связывающей активности RPA требуется наличие в белке всех трех субъединиц. Более того, для формирования комплекса RPA с ДНК-дуплексами, в котором субъединица р32 специфически ориентирована относительно области перехода одноцепочечной ДНК в двуцепочечиую, необходимо участие малой субъединицы р14. В отсутствие этой субъединицы способность RPA к "полярной" укладке на ДНК теряется. В работе впервые обнаружены непосредственные контакты субъединицы р14 с ДНК, что позволяет говорить о существовании ранее не описанного способа связывания белка с ДНК, который может играть важную роль в динамическом процессе взаимодействия RPA с ДНК.

Очевидно, что полученные результаты отражают лишь часть существующих функциональных связей между субъединицами RPA. Несомненно, что в процессах метаболизма ДНК, таких как репликация и репарация, кроме взаимодействия RPA с ДНК-субстратом принципиальное значение имеют и белок-белковые взаимодействия. Поэтому во второй части работы был проведен анализ роли субъединиц RPA в процессе репликации ДНК в модельной системе SV-40. Партнерами RPA в этом процессе являются ключевые белки процесса инициации репликации - вирусный Т-антиген, представляющий собой геликазу, и ДНК-полимераза-а-праймаза, осуществляющая синтез РНК-праймера и его элонгацию на начальном этапе репликации. Отсутствие в RPA субъединиц р14 и р32, как вместе, так и порознь, кардинально не влияет на способность белка поддерживать стадию Т-антиген-зависимого расплетания двуцепочечной ДНК. В то же время, мутантные формы RPA, лишенные субъединицы р32 и/или р 14, ие способны обеспечивать синтез РНК-праймера и его элонгацию - стадий, катализируемых ДНК-полимеразой-а-праймазой. На данном этапе можно предположить, что отсутствие малых субъединиц мешает образованию продуктивного тройного комплекса pol-a-prim^HK-cyôcTpa^RPA. В формировании такого комплекса особую роль должны играть белок-белковые взаимодействия р32 и р70 с pol-a-prim и участие этих субъединиц, а также р14 в ориентированной укладке RPA на ДНК-субстрат. С потерей "полярности" в укладке субъединиц белок теряет свою способность поддерживать синтез и элонгацию РНК-праймера. Полученные данные свидетельствуют о том, что для выполнения RPA его роли в репликации ДНК нужна не только ДНК-связывающая активность отдельных субъединиц, но и необходима координированная работа полного гетеротримера.

1. Wold M.S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism // Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 61-92.

2. Lohman T.M., Ferrari M.E. Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein: multiple

3. DNA-binding modes and cooperativities // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 527-570.

4. Cha T.A., Alberts B.M. The bacteriophage T4 DNA replication fork. // J. Biol. Chem. 1989. V.264. P. 12220-12225.

5. Kim Y.T., Richardson C.C. Bacteriophage T7 gene 2.5 protein: an essential protein for DNAreplication//Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993 V. 90. P. 10173-10177.

6. Perales C., Cava F„ Meijer W.J.J. Enhancement of DNA, cDNA synthesis and fidelity at hightemperatures by a dimeric single-stranded DNA-binding protein // Nucleic Acids Res. V. 31. P. 6473-6380.

7. Chase J.W, Williams K.R. Single-stranded DNA binding proteins required for DNA replication//Annu. Rev. Biochem. 1986. V. 55. P. 103-136.

8. Zou Y., Liu Y., Wu X., Shell S.M. Functions of human replication protein A (RPA): from DNAreplication to DNA damage and stress responses // J. Cell. Physiol. 2006. V. 208. P. 267-273.

9. Kelly T.J., Simancek P., Brush G.S. Identification and characterization of a single-stranded

10. DNA-binding protein from the archaeon Methanococcus jannaschii // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998. V. 95. P. 14634-14639.

11. Philipova D., Mullen J.R., Maniar H.S., Lu J., Gu C., Brill S.J. A hierarchy of SSB protomersin replication protein A // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 2222-2233.

12. Genschel J., Litz L., Thole H„ Roemling U., Urbanke C. Isolation, sequencing and overproduction of the single-stranded DNA binding protein from Pseudomonas aeruginosa PAO // Gene. 1996. V. 182. P. 137-143.

13. Purnapatre K., Varshney U. Cloning, over-expression and biochemical characterization of the single-stranded DNA binding protein from Mycobacterium tuberculosis // Eur. J. Biochem. 1999. V. 264. P. 591-598.

14. Sancar A., Williams K, Chase J., Rupp W. Sequences of the ssb gene and protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981. V. 78. P. 4274-4278.

15. Weiner J.H., Bertsch L.L., Kornberg A. The deoxyribonucleic acid unwinding protein of Escherichia coli. Properties and functions in replication. // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 1972-1980.

16. Yang C„ Curth U., Urbanke C„ Kang C.-H. Crystal structure of human mitochondrial single-stranded DNA binding protein at 2.4 A resolution // Nat. Struct. Biol. 1997. V. 4. P. 153-157.

17. Curth U., Urbanke C., Greipel J., Gerberding H., Tiranti V., Zeviani M. Single-stranded-DNA-binding proteins from human mitochondria and Escherichia coli have analogous physicochemical properties // Eur. J. Biochem. 1994. V. 221. P. 435-443.

18. Eggington J.M., Haruta N., Wood E.A., Cox MM. The single-stranded DNA-binding protein of Deinococcus radiodurans // BMC Microbiol. 2004. V. 4. P. 2.

19. Witte G., Urbanke C., Curth U. Single-stranded DNA-binding protein of Deinococcus radiodurans: a biophysical characterization //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 1662-1670.

20. Robbins J.B., McKinney M.C., Guzman C.E., Sriratana B„ Fitz-Gibbon S., Ha T., Cann I.K The euryarchaeota, nature's medium for engineering of single-stranded DNA-binding proteins // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 15325-15339.

21. Murzin A.G., Brenner S.E., Hubbard T., Chothia C. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures // J. Mol. Biol. 1995. V. 247. P. 536-540.

22. Iftode C„ Daniely Y., Borowiec J.A. Replication protein A (RPA): the eukaryotic SSB // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1999. V. 34. P. 141-180.

23. Bochkarev A., Pfuetzner R.A., Edwards A.M., Frappier L. Structure of the single-stranded-DNA-binding domain of replication protein A bound to DNA // Nature. 1997. V. 385. P. 176-181.

24. Bochkareva E., Korolev S., Lees-Miller S.P., Bochkarev A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA // EMBO J. 2002. V. 21. P.1855-1863.

25. Lin Y., Robbins J.B., Nyannor E.K., Chen Y.H., Cann I.K. A CCCH zinc finger conserved in a replication protein a homolog found in diverse Euryarchaeotes // J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 7881-7889.

26. Bochkareva E., Frappier L., Edwards A.M., Bochkarev A. The RPA32 subunit of human replication protein A contains a single-stranded DNA-binding domain // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 3932-3936.

27. Mer G., Bochkarev A., Gupta R„ Bochkareva £., Frappier L., Ingles C.J., Edwards A.M., Chazin W.J. Structural basis for the recognition of DNA repair proteins UNG2, XPA, and RAD52 by replication factor RPA // Cell. 2000. V. 103. P. 449-456.

28. Bochkarev A., Bochkareva E., Frappier L., Edwards A.M. The crystal structure of the complex of replication protein A subunits RPA32 and RPA 14 reveals a mechanism for single-stranded DNA binding // EMBO J. 1999. V. 18. P. 4498-4504.

29. Chedin F„ Seitz E.M., Kowalczykowski S.C. Novel homologs of replication protein A in archaea: implications for the evolution of ssDNA-binding proteins // Trends Biochem. Sci. 1998. V. 23. P. 273-277.

30. Kerrl.D., Wadsworth R.I., Cubeddu L„ Blankenfeldl W., Naismith J.H., White M.F. Insights into ssDNA recognition by the OB fold from a structural and thermodynamic study of Sulfolobus SSB protein //EMBO J. 2003. V.22. P. 2561-2570.

31. Wadsworth R.I., White M.F. Identification and properties of the crenarchaeal single-stranded DNA binding protein from Sulfolobus solfataricus //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 914920.

32. Theobald D.L., Milton-Fry R.M., Wuttke D.S. Nucleic acid recognition by OB-fold proteins // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2003. V. 32. P. 115-133.

33. Singleton M.R., Scaife S„ Wigley D.B. Structural analysis of DNA replication fork reversal by RecG // Cell. 2001. V. 107. P. 79-89.

34. Mitton-Fry R.M., Anderson E.M., Hughes T.R., Lundblad F., Wuttke D.S. Conserved structure for single-stranded telomeric DNA recognition // Science. 2002. V. 296 P. 145-147.

35. Bochkarev A., Bochkareva E. From RPA to BRCA2: lessons from single-stranded DNA binding by the OB-fold // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. V. 14. P. 36-42.

36. Raghunathan S„ Kozlov A.G., Lohman T.M., Waksman G. Structure of the DNA binding domain of E. coli SSB bound to ssDNA // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 648-652.

37. Bycroft M., Hubbard T.J.P., Proctor M., Freund S.M.V., Murzin A.G. The solution structure of the SI RNA binding domain: a member of an ancient nucleic acid-binding fold // 1997. Cell. V. 88. P. 235-242.

38. Shamoo Y., Friedman A.M., Parsons M.R., Königsberg W.H., Staitz T.A. Crystal structure of a replication fork single-stranded DNA-binding protein (T4 gp32) complexed to DNA // Nature. 1995. V. 376. P. 362-366.

39. Antson A.A. Single-stranded RNA-binding proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. V. 10. P. 87-94.

40. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 235-242.

41. Carter A.P., Clemons W.M. Jr., Brodersen D.E., Morgan-Warren R.J., Hartsch T., Wimberly B.T., Ramakrishnan V. Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit//Science. 2001. V. 291. P. 498-501.

42. Bochkareva E., Belegu V., Korolev S., Bochkarev A. Structure of the major single-stranded DNA-binding domain of replication protein A suggests a dynamic mechanism for DNA binding //EMBO J. 2001. V. 20. P. 612-618.

43. Bogden C.E., Fass D., Bergman N„ Nichols M.D., Berger J.M. The structural basis for terminator recognition by the Rho transcription termination factor // Mol. Cell. 1999. V. 3. P. 487-493.

44. Peersen O.B., Ruggles J.A., Schullz S.C. Dimeric structure of the Oxytricha nova telomere end-binding protein a-subunit bound to ssDNA //Nat. Struct. Biol. 2002. V. 9. P. 182-187.

45. Savvides S.N., Raghunathan S., Futterer K., KozlovA.G., Lohman T.M., Waksman G. The C-terminal domain of full-length E. coli SSB is disordered even when bound to DNA // Protein Sci.2004.V. 13. P. 1942-1947.

46. Grishin N. V. Treble clef finger a functionally diverse zinc-binding structural motif // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 1703-1714.

47. Matthews J. M„ Sunde M. Zinc fingers folds for many occasions // IUBMB Life. 2002. V. 54. P.351-355.

48. Krishna S. S., Majumdar I., Grishin N. V. Structural classification of zinc fingers: survey and summary // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 532-550.

49. Lachenmann M. J., Ladbury J. E„ Dong J., Huang K., Carey P., Weiss M. A. Why zinc fingers prefer zinc: ligand-field symmetry and the hidden thermodynamics of metal ion selectivity // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 13910-13925.

50. Park J.S., Wang M., Park S.J., Lee S.H. Zinc finger of replication protein A, a non-DNA binding element, regulates its DNA binding activity through redox // J. Biol. Cliem. 1999. V. 274. P. 29075-29080.

51. Kelman Z., Pietrokovski S., Hunvitz J. Isolation and characterization of a split B-type DNA polymerase from the archaeon Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 28751-28761.

52. Komori K,. Ishino Y. Replication protein A in Pyrococcus furiosus is involved in homologous DNA recombination // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 25654-25660.

53. Bochkareva E., Korolev S., Bochkarev A. The role for zinc in replication protein A // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 27332-27338.

54. Bujalowski W., Overman L.B., Lohman T.M. Binding mode transitions of Escherichia coli single strand binding protein-single-stranded DNA complexes. Cation, anion, pH, and binding density effects // J. Biol. Chem. 1988. V. 163. P. 4629-4640.

55. Kozlov A.G., Lohman T.M. Kinetic mechanism of direct transfer of Escherichia coli SSB tetramers between single-stranded DNA molecules // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 1161111627.

56. Bastin-Shanower S.A., and Brill S.J. Functional analysis of the four DNA binding domains of replication protein A. The role of RPA2 in ssDNA binding // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 36446-36453.

57. Treuner K., Ramsperger U., Knippers R.J. Replication protein A induces the unwinding of long double-stranded DNA regions // Mol. Biol. 1996. V. 259. P. 104-112.

58. Blackwell L.J., Borowiec J.A., Masrangelo I.A. Single-stranded-DNA binding alters human replication protein A structure and facilitates interaction with DNA-dependent protein kinase// Mol. Cell. Biol. 1996. V.16. P.4798-807.

59. Lohman T.M., Overman L.B. Two binding modes in Escherichia coli single strand binding protein-single stranded DNA complexes. Modulation by NaCl concentration // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 3594-3603.

60. Gomes X. V., Henrichen L.A., Wold M.S. Proteolytic mapping of human replication protein A: evidence for multiple structural domains and a conformational change upon interaction with single-stranded DNA // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 5586-5595.

61. Kim C„ Wold M.S. Recombinant human replication protein A binds to polynucleotides with low cooperativity // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 2058-2064.

62. Lohman T.M., Bujalowski W. Effects of base composition on the negative cooperativity and binding mode transitions of Escherichia coli SSB-single-stranded DNA complexes // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 6167-6176.

63. Davey M.J., O'DonnellM. Mechanisms of DNA replication // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000.1. V. 4. P. 581-586.

64. Stauffer M.E., Chazin W.J. Structural mechanisms of DNA replication, repair, and recombination//J. Biol. Chem. 2004.V. 279. P. 30915-30918.

65. Kur J., Olszewski M„ Dlugolecka A., Filipkowski P. Single-stranded DNA-binding proteins (SSBs) sources and applications in molecular biology // Acta Biochim. Pol. 2005. V. 52. P. 569-574.

66. Yuzhakov A., Kelman Z, Hunvitz J., O'Donnell M. Multiple competition reactions for RPA order the assembly of the DNA polymerase delta holoenzyme // EMBO J. 1999. V. 18. P. 6189-6199.

67. Maga G., Stucki M., Spadari S., Hubscher U. DNA polymerase switching: I. Replication factor С displaces DNA polymerase alpha prior to PCNA loading // J. Mol. Biol. 2000. V. 295.P.791-801.

68. Carty M.P., Levine A.S., and Dixon K. HeLa ccll single-stranded DNA-binding protein increases the accuracy of DNA synthesis by DNA polymerase alpha in vitro // Mutat. Res. 1992. V. 274 P. 29-34.

69. Maga G., Frouin I., Spadari S., Hubscher U. Replication protein A as a "fidelity clamp" for DNA polymerase alpha. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 18235-18242.

70. Cann I.K., Ishino S., Yuasa M., Daiyasu H., Toh H., Ishino Y. Biochemical analysis of replication factor С from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus // J. Bacterid. 2001. V. 183. P. 2614-2623.

71. Benkovic S.J., Valentine A.M., Salinas F. Replisome-mediated DNA replication // Annu. Rev. Biochem. 2001. V. 70. P. 181-208.

72. Хлиманков Д.Ю., Речкунова H.A., Лаврик О.И. Репликативный комплекс эукариот: изучение структуры и функции методом аффинной модификации // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 311-327.

73. Essers J., Houtsmuller A.B., van Veelen L., Paulusma C., Nigg A.L., Pastink A., Vermeiden W., Hoeijmakers J.H., Kanaar R. Nuclear dynamics of RAD52 group homologous recombination proteins in response to DNA damage // EMBO J. 2002. V. 21. P. 2030-2037.

74. Riedl Т., Hanaoka F., Egly J.M. The comings and goings of nucleotide excision repair factors on damaged DNA // EMBO J. 2003. V. 22. P. 5293-5303.

75. Arunkumar A.I., Stauffer M.E., Bochkareva E., Bochkarev A., Chazin W.J. Independent and coordinated functions of replication protein A tandem high affinity single-stranded DNA binding domains // J. Biol. Chem. 2003. V. 17. P. 41077-41082.

76. Carlini L., Curth U., Kindler В., Urbanke C., Porter R. D. Identification of amino acids stabilizing the tetramerization of the single stranded DNA binding protein from Escherichia coli // FEBS Lett. 1998. V. 430. P. 197-200.

77. Weisshart K., Taneja P., Fanning E. The replication protein A binding site in simian virus 40 (SV40) T antigen and its role in the initial steps of SV40 DNA replication // J. Virol. 1998. V. 72. P. 9771-9781.

78. Golub E.I., Gupta R.C., Haaf Т., Wold M.S., Radding C.M. Interaction of human rad51 recombination protein with single-stranded DNA binding protein, RPA // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5388-5393.

79. He Z, Brinton B.T., Greenblatt J., Hassell J.A., Ingles C.J. The transactivator proteins VP 16 and GAL4 bind replication factor A // Cell. 1993. V. 73. P. 1223-1232.

80. Gajiwala K.S., BurleyS.K. Winged helix proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. V. 10. P. 110-116.

81. Braun K.A., Lao Y., He Z., Ingles C.J., Wold M.S. Role of protein-protein interactions in the function of replication protein A (RPA): RPA modulates the activity of DNA polymerase alpha by multiple mechanisms // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 8443-8454.

82. Stauffer M.E., Chazin W.J. Physical interaction between replication protein A and Rad51 promotes exchange on single-stranded DNA J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 25638-25645.

83. Лаврик О.И., Захарепко A.JI., Прасад P., Власов B.A., Богачев B.C., Фавр A. dNTP, ковалентно присоединенные к ДНК-полимеразам через основание, активны в реакциях нуклеотидильного переноса // Молекулярная биология. 1998. Т. 32. С. 621-628.

84. Колпащиков Д.М., Захаренко A.JI., Дежуров С.В., Речкуиова Н.И., Ходырева С.Н., Дектерев С.Х., Литвак В.В., Лаврик О.И. Новые реагенты для аффинной модификации Tte-ДНК-полимеразы//Биоорганическая химия. 1999. Т. 25. С. 129-136.

85. Wlassoff W.A., Kimara M., Ishihama A.J. Functional organization of two large subunits of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe RNA polymerase II. Location of the catalytic sites // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 5104-5113.

86. Dornreiter I., Hoss A., Arthur A. K., Fanning E. SV40 T antigen binds directly to the large subunit of purified DNA polymerase alpha // EMBO J. 1990. V. 9. P. 3329-3336.

87. Stadlbauer F., Brueckner A., Rehfuess C., Eckerskorn C., Lottspeich F., Forster V., Tseng, B.Y., Nasheuer H.P. DNA replication in vitro by recombinant DNA-polymerase-alpha-primase//Eur. J. Biochem. 1994. V. 222. P. 781-793.

88. Strausfeld U„ Richter A. Simultaneous purification of DNA topoisomerasc I and II from eukaryotic cells // Prep. Biochem. 1989. V. 19. P. 3748.

89. Kenny М.К., Schlegel П., Furneaux Н., Hurwitz J. The role of human single-stranded DNA binding protein and its individual subunits in simian virus 40 DNA replication // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 7693-7700.

90. Kolpashchikov D.M., Weisshart K., Nasheuer H.P., Khodyreva S.N., Fanning E., Favre A., Lavrik O.I. Interaction of the p70 subunit of RPA with a DNA template directs p32 to the 3'. end of nascent DNA//FEBS Lett. 1999. V. 450. P. 131-134.

91. TanejaP., GuJ., PengR., Carrick R„ Uchiumi F., Ott R.D., Gustafson E„ Podust V.N., and Fanning E. A Dominant-negative Mutant of Human DNA Helicase В Blocks the Onset of Chromosomal DNA Replication Hi. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 40853-40861.

92. Henricksen L.A., Umbricht С.В., Wold M.S. Recombinant replication protein A: expression, complex formation, and functional characterization // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 11 Hill 132.

93. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 277. P. 680-685.

94. Swain M., Ross N.W. A silver stain protocol for proteins yielding high resolution and transparent background in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels // Electrophoresis. 1995. V. 16. P. 948-951.

95. Hennig L. WinPep software // BioTechniques. 1999. V. 26. P. 1170-1172.

96. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular cloning: A laboratory Manual (2nd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, N.Y. 1989.

97. Mitina R.L., Doronin S.V., Dobrikov M.I., Tabaladze D.R., Levina A.S., Lavrik O.I. Human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Affinity labeling of the primer binding site // FEBS Lett. 1992. V. 312. P. 249-251.

98. Doronin S. V., Dobrikov М.1., Buckle M„ Roux P., Вис Ы, Lavrik O.l. Affinity modification of human immunodeficiency virus reverse transcriptase and DNA template by photoreactive dCTP analogs // FEBS Lett. 1994. V. 354. P. 200-202.

99. Doronin S.V., Dobrikov M.I., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling of DNA polymerase alpha DNA primase complex based on the catalytic competence of a dNTP reactive analog // FEBS Lett. 1992. V.313. P. 31-33.

100. Лаврик О.И., Хлгшапков Д.Ю., Ходырева С.Н. Репликативный комплекс эукариот и его исследование с помощью аффинной модификации // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. С. 563-572.

101. Хлиманков Д.Ю., Речкунова Н.А., Лаврик О.И. Репликативный комплекс эукариот: изучение структуры и функции методом аффинной модификации // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 311-327.

102. Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling technique for studying DNA replication andDNA repair//Curr. Med. Chem. 2005. V. 12. P. 641-655.

103. Назаркина Ж.К., Пышный Д.В., Пышная И.А., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Использование модифицированных флэп-структур для исследования белков системы эксцизионной репарации оснований // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 1613-1622.

104. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие)// М.: Наука. 1981. С. 56-59.

105. Lavrik O.I., Kolpashchikov D.M., Nasheuer Н.Р., Weissharl К, Favre A. Alternative conformations of human replication protein A are detected by crosslinks with primers carrying a photoreactive group at the 3'-end // FEBS Lett. 1998. V. 441. P. 186-190.

106. Kolpashchikov D.M., Khodyreva S.N., Khlimankov D.Y., Wold M.S., Favre A., Lavrik O.l. Polarity of human replication protein A binding to DNA // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29 P. 373-379.

107. Mass G., Nelhanel Т., Kaufmann G. The middle subunit of replication protein A contacts growing RNA-DNA primers in replicating simian virus 40 chromosomes // Mol. Cell. Biol. 1998. V.18.P. 6399-6407.

108. Mass G., Nethanel Т., Lavrik O.l., Wold M.S., Kaufmann, G. Replication protein A modulates its interface with the primed DNA template during RNA-DNA primer elongation in replicating SV40 chromosomes // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 3892-3899.

109. Favre A., Saintome C„ Fourrey J.L., Clivio P., Laugaa P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions // J. Photochem .Photobiol. B. 1998. V. 42. P. 109-124.

110. Brill S.J., Stillman B. Replication factor-A from Saccharomyces cerevisiae is encoded by three essential genes coordinately expressed at S phase // Genes Dev. 1991. V. 5. P. . 589— 1600.

111. Heyer W.-D., Rao M.R.S., Erdile L.F., Kelly T.J., Kolodner R.D. An essential Saccharomyces cerevisiae single-stranded DNA binding protein is homologous to the large subunit of human RPA //EMBO J. 1990. V. 9. P. 2321-2329.

112. Kneissl M., Putter V., Szalay A.A., Gritmmi F. Interaction and assembly of murine pre-replicative complex proteins in yeast and mouse cells // J. Mol. Biol. 2003. V. 327. P. 111128.

113. Walter J., Newport J. Initiation of eukaryotic DNA replication: origin unwinding and sequential chromatin association of Cdc45, RPA, and DNA polymerase alpha // Mol. Cell. 2000. V. 5. P. 617-627.

114. Nuss J.E., Alter G.M. Denaturation of replication protein A reveals an alternative conformation with intact domain structure and oligonucleotide binding activity // Protein Sci. 2004. V. 13. P. 1365-1378.

115. Lin Y.L., Chen C., Keshav K.F., Winchester E., Dutta A. Dissection of functional domains of the human DNA replication protein complex replication protein A // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P.17190-17198.

116. Wyka I.M., Dhar K., Binz S.K., Wold M.S. Replication protein A interactions with DNA: differential binding of the core domains and analysis of the DNA interaction surface // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 12909-12918.

117. Wobbe C.R., Weissbach L., Borowiec J.A., Dean F.B., Murakami Y., Bullock P., Hunvitz J. Replication of simian virus 40 origin-containing DNA in vitro with purified proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987. V. 84. P. 1834-1838.

118. Wold M.S., Kelly T.J. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. V. 85. P. 2523-2527.

119. Brill S.J., Stillman B. Yeast replication factor-A functions in the unwinding of the SV40 origin of DNA replication//Nature. 1989. V. 342. P. 92-95.