Белково-липидная пора, образуемая колицином Е1 в бислойных липидных мембранах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СОБКО Александр Александрович

БЕЛКОВО-ЛИПИДНАЯ ПОРА, ОБРАЗУЕМАЯ КОЛИЦИНОМ Е1 В БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2006

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Антоненко Юрий Николаевич кандидат биологических наук Котова Елена Аврамовна

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор химических наук Чизмаджев Юрий Александрович кандидат химических наук Мелик-Нубаров Николай Сергеевич

Защита состоится 21 февраля 2006 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501 001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", ауд.501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Автореферат разослан 20 января 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совет кандидат химических на

_ -Смирнова Инна Григорьевна

хоа& А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ионные каналы, образованные белками в мембранах клеток и внутриклеточных органелл, играют ключевую роль во многих жизненно важных процессах. Вследствие большой сложности, детальные механизмы функционирования природных ионных каналов до сих пор неясны, что делает актуальным изучение модельных каналов с целью понимания принципов их функционирования. Среди модельных ионных каналов, образованных трансмембраяными спиралями коротких пептидов, выделяют три типа: (1) простейший канал грамицидина А, который образован двумя одиночными спиралями мономеров данного пептида, ассоциированными своими Т^-концами; (2) каналы, стенки которых состоят из олигомеризованных трансмембранных спиралей молекул каналоформера (классическим примером такого типа является канал аламетицина); и (3) белково-липидные поры - в этом случае стенки канала состоят как из трансмембранных белковых молекул, так и из интеркалированных между ними липидных головок (каналы этого типа образуют магаинин и некоторые другие антимикробные пептиды).

Достигнутые успехи в понимании функционирования модельных пептидных каналов позволяют перейти к следующему этапу, а именно: к изучению более сложных модельных каналов, образованных белками. Удачным примером такого белка является колицин Е1, каналообразующий домен которого очень похож по структуре на соответствующий домен антиапоптотического белка Вс1-Хь.

Несмотря на то, что колицин Е1 изучен достаточно подробно, многие аспекты его функционирования, в частности, вопрос о структуре самого ионного канала до сих пор остаётся открытым. Мы предположили что пора, образуемая кояицином, является не просто белковой порой, но включает в себя и липидные молекулы, подобно поре, образуемой пептидом магаинином. В рамках модели белково-липидной поры можно легко объяснить свойства колициновых каналов, которые необъяснимы с точки зрения модели чисто белковой поры.

Цель и задачи исследования. Выяснение механизма работы ионного канала колицина Е1 путём исследования каналообразующей активности колицина в плоских бислойных липидных мембранах (БЛМ) и липосомах, а также параметров одиночных каналов колицина в зависимости от физико-химических свойств мембраны, создание модели функционирования канала.

В работе исследовались:

1 Влияние спонтанной кривизны мембраны на активность колицина в трёх экспериментальных системах: индуцированный колицином интегральный электрический ток через плоскую БЛМ, одиночные каналы колицина и индукция проницаемости липосом.

2 Особенности формирования одиночных каналов колицина Е1

3. Влияние ионов кальция, химической и фотохимической обработки на канапообразующую активность колицина Е1.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что ионный канал колицина Е1 образуется в бислойной липидной мембране по механизму тороидальной белково-липидной поры, иными словами, молекулы липидов непосредственно участвуют в формировании стенок канала. Этот вывод основан на четырёх линиях доказательств, а именно: зависимость каналообразующей активности колицина от спонтанной кривизны мембраны, быстрая индукция колицином трансмембранной миграции липидов, значительное изменение ионной селективности и аномально сильное падение проводимости одиночных каналов колицина в отрицательно заряженной мембране. Обоснованность модели тороидальной поры для канала колицина Е1 подтверждена и результатами исследования влияния ионов кальция, а также модификации структуры мембран на каналообразующую активность колицина Е1. Впервые обнаружена активация каналов колицина при фотохимической и химической обработке липидной мембраны. Подробно изучены свойства одиночных каналов колицина Е1. Впервые обнаружено состояние высокой проводимости, проявляющееся в мембранах большой толщины, определен диаметр каналов колицина Е1

Выявленные закономерности каналообразования колицина углубляют понимание механизмов функционирования природных каналов, что имеет большое значение для медицины, так как нарушение работы ионных каналов является причиной большого числа патологий. Кроме того, исследование фотосенсибшшзированной модификации колицина Е1 может рассматриваться как модель фотодинамической индукции апоптоза.

Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 3 статьи Результаты диссертации были представлены на 5 научных конференциях, в том числе на международных конференциях "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке" (Москва, 2005) и "49-ый съезд Биофизического общества" (Лонг Бич, США, 2005).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и включает Введение, Литературный обзор, Результаты и их обсуждение, Материалы и методы, Выводы и Список цитируемой литературы из 140 ссылок. В работе содержится 54 рисунка и 2 таблицы.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

В Литературном обзоре проанализированы имеющиеся в литературе данные о некоторых существенных свойствах БЛМ (толщина, спонтанная кривизна, поверхностный заряд), влиянии этих свойств на работу ионных каналов различных типов, обсуждено влияние различных соединений на трансмембранную миграцию липидов в модельных мембранах и методы измерения такой миграции, дано описание структуры и свойств ионного канала колицина El, факторов, влияющих на его функционирование в БЛМ.

В Экспериментальной Части описаны объекты и методы исследования.

Измерение активности колицина проводили как на липосомах, так и на плоских БЛМ. Плоские липидные мембраны формируют в маленьком отверстии между двумя заполненными водным раствором отсеками, в которых размещают электроды. Такую систему используют для изучения ионной проницаемости мембраны при встраивании в неё каналоформера. Эта методика позволяет регистрировать изменения проводимости мембраны, индуцированные одиночными молекулами каналоформера. Для определения электрической проводимости БЛМ применялся метод фиксации напряжения, в котором на мембрану подавали постоянную разность потенциалов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Колицин El - это канадообразующий токсиноподобный белок, обладающий бактерицидным действием по отношению к E.coli и некоторым близким организмам. Его токсическое действие основано на встраивании во внутреннюю мембрану клетки, что вызывает индукцию ионной проводимости.

Рис.1. А - конформация связанного с мембраной колицина Е1 в отсутствие потенциала; Б - при приложении потенциала.

Сорбированный на мембрану белок принимает конформацию, представленную на рис.1А [ХгАйшоу е1 а1., 1999]. При приложении к БЛМ трансмембранного потенциала

определённого знака колицин Е1 образует ионные каналы.

Потенциалозависимость каналообразования можно наблюдать по уровню индуцированного колицином Е1 тока, протекающего через плоскую липидную мембрану. После добавления белка в раствор, омывающий мембрану с с^-стороны, через некоторое время после подачи положительного потенциала к аз-стороне ячейки появляется проводимость. При приложении отрицательного потенциала к аз-стороне ячейки проводимость исчезает практически до нуля и возвращается к прежним значениям при очередной подаче положительного потенциала (рис.2) Характерная потенциалозависимость колицина является удобным маркером, помогающим чётко фиксировать, что данные изменения проводимости БЛМ обусловлены именно молекулами колицина.

Процесс перехода колицина в проводящее состояние подробно изучался в работах [<3ш й а1., 1996, Г)ш й а1., 1994, Клепкег й а1., 2000]. Согласно модели Слатина я соавторов, каналообразование сопровождается транслокацией нескольких а-спиралей колицина на противоположную сторону мембраны (рис.1Б). Авторы модели полагают, что в открытом состоянии канала четыре а-спирали находятся в трансмембранном положении Однако, в этом заключено противоречие, ибо четырёх а-спиралей явно недостаточно для формирования столь значительных по размеру пор

I, НА

Г

1,С

и, мВ80 о ■во

1, с

О 10 20 30 40 50 во

Рис.2. Потенциалозависимая проводимость БЛМ, индуцированная колицином Е1

Рис.3. Вверху - образование тороидальной поры магаинином. Внизу - два примера липидов с положительной и отрицательной спонтанной кривизной.

Мы предположили, что канал колицина Е1 может формироваться по принципу тороидальной белково-яипидной поры, который был предложен для объяснения порообразующей способности небольших амфипатичных пептидов (например магаинина, рис.3). В данной модели ионный канал образован не только олигомеризованными трансмембранными спиралями пептидов, но и полярными головками липидов. Изначально предложенная для пептидов, тороидальная модель впоследствии была применена и для объяснения функционирования некоторых каналообразующих белков, например, таких как апоптотические белки Ьах и В случае образования тороидальной поры молекулами белков нет необходимости в их олигомеризации, если белки содержат достаточное количество трансмембранных спиралей.

Важным доказательством функционирования канала как тороидальной белково-липидной поры является влияние спонтанной кривизны (СК) образующих мембрану липидов на активность каналообразования. Спонтанная кривизна липидов зависит от соотношения площади полярной головки и гидрофобной частя мембраны: она положительна в случае, если соотношение площади головки к площади хвоста больше единицы, и отрицательна в противоположном случае. Как видно из модели тороидальной поры, липиды с положительной спонтанной кривизной должны облегчать образование каналов, в то время как липиды с отрицательной спонтанной кривизной - ингибировать этот процесс. Поэтому доказательство образования колицином белково-лшшдных пор мы начали с изучения влияния СК образующих мембрану липидов на активность порообразования колицина.

s

Влияние СКлипидов на каналообразунпцую активность колицина Е1

Для проверки гипотезы, является ли ионный канал колицина Е1 белково-липидной порой, было изучено влияние веществ, изменяющих СК, на индуцированную колицином проводимость БЛМ. Добавление к омывающему мембрану раствору миристоиллизофосфатидилхолина (М-ЛФХ), липида с положительной СК, вызывало значительную стимуляцию проводимости мембраны (Рис.4А). В случае же добавления к омывающему раствору олеиновой кислоты, соединения с отрицательной СК, наблюдалось

значительное снижение

индуцированной колицином

проводимости (Рис.4Б). Важно отметить, что в обоих случаях после добавок сохраняется

потенциалозависимость индуцированной колицином

проводимости.

Так как интегральный ток есть сложный параметр, зависящий не только от числа каналов, но и от времени жизни и амплитуды одиночного канала, важно было изучить влияние М-ЛФХ и олеиновой кислоты на свойства одиночных каналов. Подробно исследование одиночных каналов колицина описано ниже, пока же отметим, что данные Рис.4. Влияние лизолипида (А) и олеиновой ^^ не влияют на амплитуду й кислоты (Б) на индуцированную колицином

проводимость БЛМ. время жизни одиночного канала. Это

означает, что изменения интегральной проводимости, наблюдаемые при варьировании СК, обусловлены исключительно изменением числа одиночных каналов, т.е. числа образующих каналы молекул колицина.

Пора, образуемая колицином в БЛМ, достаточно велика, что позволяет проходить через неё даже таким объёмным молекулам как карбоксифлуоресцеин (КФ) [Kayalar and Duzgunes, 1986]. В липосомах КФ находится в концентрации самотушения, поэтому при его вытекании в раствор через образованные колицином поры флуоресценция КФ разгорается В настоящей работе мы измерили индуцированное колицином Е1 вытекание КФ из липосом в

О 100 200 300 400 500

tc

t, С

мембранах, содержащих липиды с различной СК. Оптимизация условий эксперимента позволила сделать вывод, что наиболее удачным параметром для характеристики активности колицина является скорость вытекания красителя, в то время как амплитуда вытекания (она составляла 10-17%) слабо изменяется при варьировании условий эксперимента. Для описания кинетики вытекания был выбран параметр 1\а - время, за которое вытекает половина КФ по сравнению с максимально возможным в этих условиях вытеканием (при t=oo). Этот параметр существенно уменьшался при изменении концентрации колицина от 10 нМ (t|/2 = 180 с) до 40 нМ (ti/2 = 10 с). Скорость индуцированного колипином вытекания КФ существенно увеличивалась в присутствии М-ЛФХ, что согласуется с эффектом на индуцированный колицином ток через БЛМ. Время полувыхода КФ падало с 200 с до 20 с при увеличении концентрации М-ЛФХ в диапазоне 0-12 мкМ (концентрация колицина 10 нМ). Действующие концентрации М-ЛФХ близки к тем, что были эффективны в экспериментах на плоских БЛМ. Следует отметить, что сам М-ЛФХ не индуцировал вытекание КФ

Рис.5. Вытекание КФ из липосом различного липидного состава.

А. О-ЛФХ/ДОФХ/ДОФГ (2:5:3), кривая 1; ДОФХ/ДОФГ (7:3), кривая 2; ДОФЭ/ДОФГ (7 3), кривая 3 Б. ДФФХ/ДФФГ (7.3), кривая 1; ДФФХ/ДФФС (7:3), кривая 2.

Для дальнейшего изучения влияния СК на каналообразующую активность колицина были приготовлены липосомы из липидов с различной СК. На рис. 5А представлены кинетики индуцированного колицином вытекания КФ из липосом, содержащих олеоил-лизофосфатидилхолин (О-ЛФХ) или диолеоилфосфатидилэтаноламин (ДОФЭ), в сравнении с липосомами, сформированными из смеси диолеоилфосфатидилхолина и диолеоилфосфатидилглицерина (ДОФХ/ДОФГ, 70/30 мол. %). Известно, что лизофосфатидилхолин, имеющий относительно большую полярную липидную головку и только один гидрофобный хвост, характеризуется высоким значением положительной СК, в то время как ДОФЭ с маленькой полярной головкой и двумя гидрофобными хвостами

характеризуется высоким значением отрицательной СК ДОФХ имеет практически нулевую СК. В сравнении с липосомами, содержащими ДОФХ, индуцированное колицином вытекание КФ ускорялось в присутствии О-ЛФХ (рис. 5А, кривая I) и замедлялось в присутствии ДОФЭ (рис 5А, кривая 3) Следует отметить, что помимо медленной фазы, кинетика вытекания КФ из липосом, состоящих из ДОФЭ/ДОФГ, содержала и быстрый ответ, который не мог быть разрешён в наших условиях (рис. 5А, кривая 3). Как видно из рис 5Б, выход КФ из липосом, сформированных из смеси дифитаноилфосфатидилхолина и дифитаноилфосфатидилсерина (ДФФХ/ДФФС ,7:3), значительно медленнее, чем из липосом, сформированных из смеси дифитаноилфосфатидилхолина и

дифитаноилфосфатидилглицерина СДФФХ/ДФФГ, 7:3). Эти наблюдения находятся в соответствии с различиями в площади полярных гидратированных головок фосфатидилглицерина и фосфатидилсерина [Kleinschmidt and Tamm, 2002]

Также нами были выполнены эксперименты по влиянию кардиолипина на индуцированное колицином вытекание КФ. Кардиолипин характеризуется значительной отрицательной СК, так как имеет четыре углеводородных хвоста. Тем не менее этот липид не оказывал существенного влияния на выход КФ. Это может быть связано с тем, что размер кардиолипина слишком велик для встраивания его в тороидальную пору Подобное отсутствие влияния кардиолипина наблюдалось также в работе [Basanez et а!., 2002] на белке Вах, при этом, как и в нашей системе, влияние других липидов на активность бежа строго коррелировало с их СК.

Мы проверили влияние изменяющих СК агентов на связывание колицина с БЛМ Связывание белка измерялось по тушению флуоресценции триптофановых остатков при взаимодействии белка с липосомами, содержащими бромированный липид, который, как известно [Zakharov et al, 1999], является эффективным тушителем триптофановой флуоресценции. Мы измеряли падение флуоресценции при взаимодействии колицина с липосомами, содержащими бромированный липид, в присутствии М-ЛФХ, олеиновой кислоты и без добавок. Сравнение данных позволяет сказать, что изменяющие СК вещества не влияют на связывание колицина с БЛМ. Таким образом, изменение активности колицина под действием модифицирующих СК агентов связано непосредственно с увеличением числа молекул, образующих канальное состояние, а не с изменением связывания колицина с БЛМ.

Тороидальная модель колицинового канала

Подобное влияние липидов с различной СК на активность каналов колицина дает нам возможность предложить модель тороидальной белково-липидной поры для функционирования канала колицина Е1. Возможная структура такого канала представлена

на рисунке б Как видно из схемы, особенностью канала является то, что его стенки состоят не только из трансмембранных спиралей белка, но и из интеркалированных между ними головок липидных молекул.

Важным преимуществом занной схемы является то. что она позволяет понять, как можно образовать ионный канал, имея небольшое число трансмембранных ос-спиралей. В литературе отсутствуют примеры образованных трансмембранными а-спиралями каналов с числом сс-спиралей меньше пяти. В то время как, согласно общепринятой модели Слатина с соавторами, в трансмембранном положении находятся 4 ос-спирали колицина. Если же принять во внимание, что канал образуется не только пептидными спиралями, но и липидными головками, становится понятно, как можно обойтись небольшим количеством спиралей для создания ионного каната с диаметром, позволяющим проходить столь крупным молекулам, как карбоксифлуоресцеин и кальцеин.

Так как в структуре поры находится липид, то вещества, образующие такие поры, облегчают трансмембранную миграцию

липидов (или флип-флоп). Флип-флоп нами измерялся по методу, основанному на регистрации флуоресценции пирен-меченого липида (ПиФХ). Изначально пирен-меченый липид находился на внешней стороне липосом, при этом в спектре флуоресценции липосом проявлялись два пика, соответствующие флуоресценции мономеров и эксимеров пирена. При трансмембранной миграции липида, индуцированной

колицином, ПиФХ

перераспределяется между

внутренней и внешней сторонами липосом, вследствие чего соотношение флуоресценции эксимерной и мономерной форм пирена уменьшается. Наши данные показали, что добавка колицина в концентрации 250 нМ приводит к почти равному распределению пирен-меченого липида между двумя монослоями БЛМ в течение 10 минут. Известно, что многие вещества

I

В

Рис.б. Схема образования колицином Е1 тороидальной поры в бислойной липидной мембране. (А) Закрытое состояние поры после связывания колицина с БЛМ. (Б) Тороидальная конфигурация поры в открытом состоянии.

способны индуцировать флип-флоп липидов, однако только каналоформеры, образующие тороидальную пору, способны вызывать столь быстрый флип-флоп. Для контроля мы проверили в наших условиях действие грамицидина А на флип-флоп липидов Даже в присутствии очень высоких концентраций пептида (3 мкМ) трансмембранное движение ПиФХ не наблюдалось в изучаемой временной шкале. Тахим образом, быстрый флип-флоп липидов под действием колиотна Е1 служит ещё одним доказательством образования канала колицина Е1 по механизму белково-липидной поры.

Измерение одиночных каналов колицина Е1

Следующим этапом работы было изучение одиночных каналов колицина Е1. На рисунке 7Б представлена типичная запись одиночных каналов колицина Е1 в мембране, сформированной из раствора лштида в декане. Как видно из рисунка, колицин образует два канальных состояния- малое (проводимость 65 пС, время жизни 3,5 с) и большое (проводимость 600 пС, время жизни 0,2 с) Важно отметить, что состояние высокой проводимости никогда не появлялось до открытия хотя бы одного малого канала, т е для открытия большого (600-пС) канала требовалось существование состояния низкой проводимости. Это предполагает, что состояние высокой проводимости формируется из уже существующего 60-пС канала. Действительно, количественный анализ вероятности появления 600-пС каналов показал, что вероятность открытия 600-пС канала пропорциональна среднему числу активных 60-пС каналов. Два состояния проводимости проявляют одинаковую потенпиалозависимость, характерную для индуцированного колицином макроскопического тока.

0 5 10 15 20 о 5 10 15 20

I. = I, С

Рис.7. Зависимость свойств одиночных каналов колицина Е1 от растворителя мембраноформирующего раствора. Мембрана сформирована из раствора ДФФХ в сквалене (А) или «-декане (Б).

Следует отметить, что большие каналы колицина были обнаружены в нашей работе впервые, несмотря на длительное изучение колицина различными группами. Поиск причин,

по которым эти каналы не наблюдались ранее, показал, что образование больших каналов связано с толщиной мембраны. Это было обнаружено в экспериментах на мембранах, приготовленных различными способами. Записи каналов на рис. 7Б произведены на

мембране, сформированной из

раствора ДФФХ в декане. Такая мембрана содержит растворитель между монослоями, а потому несколько толще, чем не содержащая растворитель мембрана (рис.7А),

которая формируется из раствора липида в

Липид Растворитель

Сквален Гексадекая Декан

ДОФХ (С18:1) - - 0.25 ± 0.1

ДЭкФХ (С20-1) <0.01 2.5 ± 0.3 46 ±4

ДЭрФХ (С22:1) 4 ± 2 Нет каналов Нет каналов

ДНФХ (С24.1) Нет каналов - -

Таблица 1. Вероятность открытого состояния (в %) 600-

пС каналов в мембранах различного состава (нормировано

на число 60-пС каналов).

ДЭкФХ - диэйкозаноилфосфатидилхолин,

ДЭрФХ - диэрукоилфосфатидилхолин,

ДНФХ - динервоноилфосфатидилхолин.

сквалене. Как видно из рисунка, большие каналы появляются в более толстой мембране.

Известно, что мембраны, сформированные из раствора липида в гексадекане, содержат растворитель, причем толщина таких мембран является промежуточной между значениями толщины мембран, сформированных из растворов липида в декане или сквалене [Вепг е! а1, 1975; СЬегпуэЬеу ег а!., 2003] В наших экспериментах колицин Е1 образовывал 600-пС каналы в мембранах, сформированных из раствора ДФФХ в гексадекане, однако вероятность открытия состояния высокой проводимости в таких мембранах была значительно ниже, чем в более толстой мембране, сформированной из раствора липида в декане.

Чтобы убедиться, что появление больших каналов не связано с присутствием растворителя в мембране, мы изменяли толщину мембраны и путём использования серии липидов, различающихся только длиной жирнокислотных остатков. В таблице 1 просуммированы данные о вероятности открытия больших каналов колицина в мембранах различного состава. Как видно из таблицы, вероятность открытия больших каналов колицина Е1 резко увеличивается с ростом толщины мембраны. В очень толстых мембранах каналы колицина Е1 вообще не образуются, по-видимому, из-за большой разницы между длиной трансмембранных спиралей и толщиной гидрофобной части мембраны.

Изучение одиночных каналов колицина Е1 позволяет представить ещё две линии доказательств образования каналов колицина по механизму белково-липидной поры.

1. Изменение ионной селективности каналов при переходе от нейтральной к отрицательно заряженной мембране.

Измерения селективности каналов в присутствии градиента концентрации хлорида калия показали, что в нейтральной мембране (ДФФХ) как большой, так и малый каналы

Ра

колицина имеют анионную селективность. Соотношение проводимости хлора и калия ~

составило 3.6±0 8 для 60-пС и 7.2±0.6 для 600-пС канала.

Из-за малой проводимости одиночных каналов колицина в отрицательно заряженной мембране (ДФФГ), их селективность была измерена на уровне интегрального тока. Измерения показали, что в этих условиях соотношение проводимости ионов хлора к ионам

Ра

калия — составляет 0 29±0.02, то есть в отрицательно заряженной мембране анионная

селективность меняется на катионную. Столь существенное изменение ионной селективности канала колицина подтверждает предположение о непосредственном включении головок липидных молекул в стенки ионного канала.

2. Изменение проводимости одиночного канала при переходе от нейтральной к отрицательно заряженной мембране.

О 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 ДФФГ, мол. % ДФФГ, мол.%

Рис.8. Зависимость проводимости малых (А) и больших (Б) одиночных каналов колицина от мольной доли анионного (ДФФГ) липида.

На рис. 8 представлена зависимость проводимости малого (рис. 8А) и большого (рис. 8Б) каналов колицина Е1 от мольной доли ДФФГ в мембране. Видно, что проводимость 600-пС проводящего состояния уменьшается вдвое в чистом ДФФГ по сравнению с чистым ДФФХ, в то время как проводимость 60-пС состояния уменьшается десятикратно. Полученные данные позволяют объяснить значительные различия в известных из литературы значениях проводимости одиночных каналов колицина (7-60 пС) [Cramer et al., 1995, Cleveland et al., 1983; Raymond et al., 1985; Bishop et al., 1986; Liu et al., 1986]

различным содержанием анионных липидов в БЛМ, поскольку проводимость малых каналов очень сильно зависит от их содержания.

Так как литературные данные по размеру канала колицина сильно разнятся, нами был оценен диаметр каналов. Для оценки размера 50-пС и 600-пС каналов мы воспользовались методом, предложенным Красильниковым и соавторами [Krasilnikov et al., 1992, 1998; Vodyanoy and Bezrukov, 1992; Merzlyak et al., 1999]. Суть метода состоит в добавлении в омывающий мембрану раствор неэлектролитов (сахаров или полиэтиленгликолей (ПЭГ)) с различной молекулярной массой. Неэлектролиты с диаметром больше, чем диаметр канала, практически не попадают в канал, в то время как неэлектролиты, диаметр которых сравним с диаметром ионного канала или меньше его, попадают в ионный канал и "затыкают" его, что проявляется в уменьшении его проводимости.

Мы измерили зависимость проводимости одиночных каналов от гидродинамического радиуса молекул неэлектролитов. Эта зависимость, нормированная на проводимость одиночного канала в отсутствие неэлектролита (Л/Ло), представлена на рис 9 Тот факт, что кривая 2, соответствующая 600-пС каналам, сдвинута вправо по сравнению с кривой 1, соответствующей 60-пС каналам, говорит о том, что диаметр 60-пС канала меньше диаметра 600-пС канала. Считается, что максимальный размер канала равен минимальному размеру неэлектролита, который яе входит в канал [Krasilnikov et al., 1998] и таким образом не влияет на проводимость одиночного канала. Следовательно, максимальный радиус канала соответствует излому на кривой зависимости Л/Л о от г Из кривых 1 и 2 рис.9 мы получили значения 12 А и 16 А для диаметров 60-пС и 600-пС каналов, соответственно.

Известно, что наличие анионных липидов в БЛМ приводит к сдвигу

поверхностного потенциала мембраны в отрицательную сторону, что уменьшает поверхностную концентрацию хлорид-ионов. Однако, как показано в работе [Aguilella et al., 2001], в условиях высокой ионной силы для каналов такого большого диаметра наличие анионных липидов в мембране не должно приводить к падению

2 4 6 8 10 12 14 16 18

О

- г, А

Рис 9 Зависимость отношения проводимости одиночных каналов в присутствии неэлектролита к контрольному эксперименту (А/Ао) для малых (чёрные кружки) и больших (белые кружки) каналов колицина Е1 от гидродинамического радиуса (г) молекулы неэлектролита.

проводимости канала, связанному с изменением поверхностной концентрации ионов.

По-видимому, значительное снижение проводимости одиночных каналов колицина Е1 в отрицательно заряженной мембране обусловлено изменением геометрии канала. Действительно, интеркаляция отрицательно заряженных молекул ДФФГ между положительно заряженными а-спиралями должна уменьшить электростатическое отталкивание между ними, и, вследствие этого, диаметр поры. Это предположение находится в соответствии с расчётами работы гете1 ег а1., (2003), которые показали, что диаметр белково-липидной поры значительно изменяется с изменением заряда образующих её а-спиралей.

Анализ полученных нами результатов по влиянию заряда липидов на проводимость канала колицина Е1 говорит о существенной роли молекул липида в структуре этого канала. В пользу такого заключения свидетельствуют данные об отсутствии влияния заряда мембранных липидов на проводимость чисто белковых каналов большого диаметра.

Важным преимуществом модели тороидальной поры является то, что она позволяет объяснить изменение активности каналообразования колицина Е1 при различных воздействиях на БЛМ. В следующих разделах приведены два подобных примера: инактивация колицина под действием ионов кальция и активация при химической и фотохимической модификации БЛМ.

Липид-зависимая инактивация колициновых каналов ионами кальция

Роль ионов кальция в формировании ионных каналов колицина долгое время оставалась неизученной, так как во многих исследованиях при изучении колицина ионы кальция присутствовали в буферном растворе, омывающем мембрану (для большей её стабильности), при этом влияние кальция на сами каналы не учитывалось и не изучалось.

1,5 1,0

0,5

0.0

0 40 80 120 0 40 ВО 120 160

t, С t, с

Рис.10. Влияние хлорида кальция на индуцированный колицином El ток через БЛМ. А. Мембрана сформирована из раствора ДФФГ. Концентрация СаСЬ: 33 мкМ (кривая 1), 82 мкМ (кривая 2), 330 мкМ (кривая 3), 5 мМ (кривая 4). Б. Мембрана сформирована из раствора ДФФХ. Концентрация СаСЬ 5 мМ.

I, НА «■ СаСЦ Б

-80 мВ

1-80 мв

Наши данные показывают, что в случае БЛМ, состоящих из ДФФГ, добавление Са2+ в омывающий мембрану раствор приводит к уменьшению индуцированного колицином Е1 тока (рис.ЮА) Подобное подавление проводимости не вызвано изменением амплитуды и времени жизни одиночного канала, не связано с десорбцией колицина с поверхности мембраны Таким образом, данное снижение проводимости обусловлено уменьшением числа образующих канальное состояние молекул белка. В случае, если мембрана сформирована из нейтрального липида (ДФФХ), кальций не влияет на индуцированную колицином проводимость БЛМ (рис.ЮБ). Этот результат доказывает, что действие ионов кальция на каналы колицина опосредовано липидом.

Как было показано выше, канальная активность колицина Е1 весьма чувствительна к СК: каналообразование усиливается при увеличении положительной СК и уменьшается в противоположном случае Основываясь на этом, можно заключить, что влияние кальция на каналы колицина обусловлено связыванием катионов с отрицательно заряженными липидными головками, что приводит к уменьшению отталкивания между ними и увеличению отрицательной СК Это, в свою очередь, приводит к уменьшению числа действующих каналов в мембране при той же величине приложенного потенциала.

Влияние химической и фотохимической модификации мембраны на каналообразование колицина Е1

Исходя из описанной выше зависимости активности и свойств колициновых каналов от липидного состава мембраны, можно было предположить, что химическая модификация БЛМ приведет к изменению каналообразования колицина. Мы измерили активность колицина на содержащей ненасыщенные липиды мембране,

предобработанной бромосукцинимидом (МВЭ). Чтобы оставшийся в растворе реагент не взаимодействовал с колицином, перед добавкой белка

НА 8 7 6 5 4 3 2 1 О

-п +колиЦин Е1 ,, '1, пА Г г ' I I 60 50 40 / 30 / 20 / 10 / 0 /

400 800 1200 + колицин Е1 У

О 20 40 60 80 I, С Рис.11. Влияние предобработки БЛМ, сформированной из смеси ДОФХ/ДОФГ, (инкубация со 130 мкМ КВв в течении двух минут) на индукцию тока колицином Е1 Вставка: контрольный эксперимент с ДОФХ/ДОФГ мембраной без предобработки МЗБ (кривая 1). Кривая 2 показывает эффект 100-секундного предосвещения БЛМ видимым светом в присутствии 1 мкМ АШсБз на индукцию тока колицином Е1.

в омывающий мембрану раствор добавляли избыток триптофана. Из рис.11 видно, что после добавления колицина Е1 к предобработанной мембране ток возрастает ао очень больших значений (нескольких наноампер) после некоторой лаг-фазы (30 с). Контрольный эксперимент, в котором мембрана не подвергалась предобработке ЫВЭ, приведён на вставке к рис.11, кривая 1. Существенно, что значительно активированный под действием КВЭ гок остается потенциалозависимым. Аналогично влиянию N88, фотодинамическая предобработка БЛМ (освещение мембраны в присутствии фотосенсибилизатора) также увеличивала канальную активность колицина. Как видно из вставки к рис.! I, 100-секундное предосвещение ДОФХ/ДОФГ мембраны в присутствии фотосенсибилизатора А1Рс8з значительно ускоряло индукцию тока колицином Е1 (кривая 2) по сравнению с контрольным опытом (кривая 1).

Известно, что N135 реагирует с двойными связями ненасыщенных жирнокислотных остатков липидов с образованием бромгидринов [Сагг й а1., 1996]. По-видимому, бромгидрины подвергаются гидролизу, аналогично хлоргидринам [Рапавепко е1 а!., 2003], что приводит к образованию лизолипида. Появление лизолипидов в мембране значительно увеличивает положительную СК, чем, по всей вероятности, и объясняется значительная стимуляция индуцированного колицином тока после обработки мембраны N88.

Аналогичная стимуляция тока после фотохимической обработки мембраны может быть также объяснена увеличением положительной СК Дело в том, что под действием активных форм кислорода, образующихся в результате возбуждения фотосенсибилизатора, происходит разрушение двойных связей ненасыщенных липидов, которое приводит к исчезновению изгиба жирнокислотного хвоста, обусловленного цис-положением двойной связи

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что каналообразукяцая активность колицина Е1 существенно зависит от спонтанной кривимы липидов мембраны.

2. Обнаружена индукция быстрой трансмембранной диффузии липидов под действием колицина Е1.

3 Показано значительное изменение селективности каналов колицина Е1 при переходе от нейтральной к отрицательно заряженной мембране.

4. Показано, что колицин Е1 индуцирует образование двух типов одиночных каналов в плоских бислойных липидных мембранах. Обнаружено состояние высокой проводимости, проявляющееся в мембранах большой толщины. Выявлено аномально сильное уменьшение проводимости одиночных каналов колицина с ростом содержания отрицательно заряженных липидов в мембране. Определен радиус каналов колицина Е1.

5 На основании полученных данных доказано, что колицин Е1 образует ионные каналы по механизму тороидальной белково-липидаой поры, в формировании стенок которой непосредственно участвуют головки молекул липидов. Таким образом, белково-липидная пора может формироваться не только короткими антибактериальными пептидами, но и таким сравнительно крупным белком как колицин Е1.

6. Показано подавление каналообразующей активности колицина Е1 под действием ионов кальция, что, в рамках модели тороидальной поры, хорошо объясняется изменением спотанной кривизны липидов вследствие нейтрализации зарядов липидных головок.

7. Обнаружена активация каналов колицина Е1 после химической и фотохимической модификации бислойной липидной мембраны, которая, по всей вероятности, также связана с изменением спонтанной кривизны липидов.

Основные результаты диссертации излажены в слеоующих публикациях:

1. Sobko A.A., Kotova Е.А., Antonenko Y.N., Zakharov S.D., Cramer W.A. (2004) Effect of lipids with different spontaneous curvature on the channel activity of coiicin EI: evidence in favor of a toroidal pore. FEBS Lett:, 576, 205-210.

2. Sobko A.A., Vigasina M.A., Rokitskaya T.I., Kotova E.A., Zakharov S.D., Cramer W.A., Antonenko Y.N. (2004) Chemical and photochemical modification of coiicin El and gramicidin A in bilayer lipid membranes. J. Membrane Biology, 199, 51-62.

3. Собко А.А., Котова E.A., Захаров С.Д., Кремер У, Антояенко Ю.Н. (2006) Липид-зависимая инактивация каналов котщина Е1 ионами кальция. Биохимия, 71, 121-126.

4. Собко А.А., Котова Е.А., Антоненко Ю.Н., Захаров С.Д., Крамер В.А. Активация ионных каналов колицина Е1 в бислойных липидных мембранах при фотосенсибшшзированном окислении и химической модификации липидов. Ш Съезд биофизиков России, Воронеж, ВГУ, 24-29 июня 2004 г., Тезисы докладов, V 53, 457.

5. Sobko А.А., Vigasina М.А., Kotova Е.А., Zakharov S D, Cramer W.A., Antonenko Y.N. Chemical and photochemical modification of coiicin El and gramicidin A in bilayer lipid membranes. Vienna, Austria, 6-11 September 2003, Abstracts of the 10th ESP Congress.

6. Erukova V.Yu., Sobko A.A., Rokitskaya T.I., Kotova E.A., Antonenko Yu.N., Zakharov S.D., Cramer W.A. Simultaneous electrical and optical measurements of coiicin El ion channels. Biophys. J., 86 (1), part 2, 547a, Biophysical Society 48lh Annual Meeting, Baltimore, MD, USA, 14-18 February 2004.

7 Sobko A.A., Kotova E.A., Antonenko Yu.N., Zakharov S.D., Cramer W.A. Mechanism of ion pore formation by coiicin El: insight from the dependence of channel activity on lipid bilayer curvature. Biophys. J., 88 (1), part 2, 248a, Biophysical Society 49th Annual Meeting, Long Beach, California, USA, 12-16 February 2005.

8 Sobko A.A., Antonenko Yu.N., Zakharov S.D., Cramer W.A. Giant coiicin El channels. Biophys. J., 88 (1), part 2, 249a, Biophysical Society 49th Annual Meeting, Long Beach, California, USA, 12-16 February 2005.

9. Sobko A.A., Kotova E.A., Zakharov S D, Cramer W.A, Antonenko Yu.N Regulation of coiicin El ion channel activity by lipid bilayer curvature Международная конференция "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке", 21-23 февраля 2005, Тезисы докладов, стр. 63.

Подписано в печать У?- О/. 2006 года, Заказ N2 3 ■ Формат 60х90/16. Усл. печ. л. . Тираж ЮР экз. Отпечатано на ризографе в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ.

г ¥

I I

I

I

2,00Cß

fobs

1435

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Спонтанная кривизна липидов и её влияние на функционирование ионных каналов.

1.1.1 Образование тороидальной белкоео-липидной поры антимикробными пептидами.

1.1.2 Влияние СК на различные типы ионных каналов.

1.2 Влияние толщины мембраны на функционирование ионных каналов.

1.3 Электростатические взаимодействия на поверхности мембраны.

1.4 Флип-флоп липидов.

1.5 Влияние липидного состава мембраны на функционирование природных каналов.

1.6 Структура и функция белкового токсина колицина Е1.

1.6.1 Биологическая роль колицинов.

1.6.2 Структура белка и взаимодействие с мембраной.

1.6.3 Особенности связывания колицина с БЛМ.

1.6.4 Размер поры в мембране и её структура.

2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 Влияние спонтанной кривизны образующих мембрану липидов на каналообразующую активность колицина е1.

2.1.1 Мулътиканалъная активность колицина Е1 на плоских мембранах.

2.1.2 Вытекание карбоксифлуоресцеина из липосом.

2.1.3 Измерение связывания колицина с БЛМ.

2.1.4 Спонтанная кривизна мембраны и тороидальная модель.

2.2 Индукция флип-флопа липидов колицином Е1.

2.3 Одиночные каналы колицина Е1 в липидной мембране.

2.3.1 Два состояния проводимости каналов колицина Е1.

2.3.2 Влияние толщины мембраны на образование одиночных каналов колицина Е1.

2.3.3 Влияние СК на канальную активность колицина Е1.

2.3.4 Влияние анионных липидов на проводимость одиночных каналов колицина Е1.

2.3.5 Ионная селективность одиночных каналов колицина Е1.

2.3.6 Оценка размера 60-пС и 600-пС каналов.

2.4 Зависимости селективности и проводимости одиночных каналов колицина Е1 от липидного состава мембраны.

2.4.1 Изменение ионной селективности каналов при переходе от нейтральной к отрицательно заряэюенной мембране.

2.4.2 Изменение проводимости одиночного канала колицина Е1 при переходе от нейтральной к отрицательно заряженной мембране.

2А Модель образования тороидальной белково-липидной поры колицином Е1.

2.6 Влияние ионов кальция на образование каналов под действием колицина Е1.

2.6.1 Влияние ионов кальция на индуцированный колицином ток через БЛМ.

2.6.2 Влияние ионов кальция на связывание колицина с мембраной.

2.6.3 Влияние ионов кальция на одиночные каналы колицина Е1.

2.6.4 Одновременные измерения связывания колицина и его каналообразования с помощью флуоресцентного микроскопа.

2.6.5 Влияние кальция в рамках модели тороидальной поры.

2.7 Фотохимическая и химическая модификация Б JIM и её влияние на активность колицина Е

2.7.1 Флуоресценция триптофанов колицина Е1 при химической и фотохимической модификации.

2.7.2 Влияние химической и фотохимической модификации на

Щ индуцированный колицином интегральный ток через БЛМ.

2.7.3 Активация индуцированной колицином проводимости БЛМ при химическом и фотохимическом воздействии.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Используемые реактивы.

3.2 Используемые методы.

ВЫВОДЫ.

Ионные каналы, образованные белками в мембранах клеток и внутриклеточных органелл, играют ключевую роль во многих жизненно важных процессах. Понимание механизмов функционирования природных каналов имеет большое значение для медицины, так как нарушение работы ионных каналов является причиной большого числа патологий.

Вследствие большой сложности, детальные механизмы функционирования природных ионных каналов до сих пор неясны, что делает актуальным изучение модельных каналов с целью понимания принципов их функционирования. Среди модельных ионных каналов, образованных трансмембранными спиралями коротких пептидов, выделяют три типа: (1) простейший канал грамицидина А, который образован двумя одиночными спиралями мономеров данного пептида, ассоциированными своими N-концами; (2) каналы, стенки которых состоят из олигомеризованных трансмембранных спиралей молекул каналоформера (классическим примером такого типа является канал аламетицина); и (3) белково-липидные поры - в этом случае стенки канала состоят как из трансмембранных белковых молекул, так и из интеркалированных между ними липидных головок (каналы этого типа образуют магаинин и некоторые другие антимикробные пептиды).

Достигнутые успехи в понимании функционирования модельных пептидных каналов позволяют перейти к следующему этапу, а именно: к изучению более сложных модельных каналов, образованных белками. Удачным примером такого белка является колицин Е1, каналообразующий домен которого похож по структуре на соответствующий домен антиапоптотического белка Bcl-XL.

Несмотря на то, что колицин Е1 достаточно подробно изучен, многие аспекты его функционирования, в частности, вопрос о структуре самого ионного канала до сих пор остаётся открытым. Мы предположили что пора, образуемая колицином, является не просто белковой порой, но включает в себя и липидные молекулы, подобно поре, образуемой пептидом магаинином. В рамках модели белково-липидной поры можно легко объяснить свойства колициновых каналов, которые необъяснимы с точки зрения модели чисто белковой поры.

В настоящей работе изучаются различные аспекты каналообразования колицина Е1 и на основании полученных данных доказывается, что канал колицина Е1 образуется по механизму тороидальной белково-липидной поры.

1 Обзор литературы

Биологические мембраны являются важной частью клетки. Они отделяют клетку от окружающей среды, управляют обменом веществ между клеткой и её окружением [1]. Также следует отметить, что с мембраной связаны многие клеточные ферменты, играющие важную роль в метаболизме и регуляции работы клетки.

На настоящей момент мембрану наиболее часто рассматривают в рамках жидкостно-мозаичной модели Сингера и Николсона. Согласно этой модели, мембрана представляется как фосфолипидный бислой, в который погружены белки, способные свободно диффундировать в нём. Несмотря на то, что эта модель в последнее время стала подвергаться уточнениям, она до сих пор служит основой для большинства мембранных исследований. Из интересных уточнений этой модели стоит отметить исследования, говорящие о существовании доменов различного состава в пространственно-разделенных областях мембраны, а также существование мембрано-связанного цитоскелета.

Липидный состав мембран крайне разнообразен, причём причины этого разнообразия до сих пор остаются до конца не выясненными. Из множества липидов различной природы наиболее распространёнными являются глицерофосфолипиды. В них одна из гидроксильных групп глицерина связана с полярной головкой остатка фосфорной кислоты, а две другие - с гидрофобными остатками жирных кислот.

Из-за большого разнообразия липидов в живых клетках, в экспериментах часто используют модельные мембраны с заданным липидным составом, что позволяет проводить эксперименты на мембранах с заданными физико-химическими свойствами. Среди бислойных модельных мембран можно выделить 2 основных типа: это плоские бислойные липидные мембраны и липосомы. Плоские липидные мембраны формируют в маленьком отверстии между двумя отсеками, заполненными водным раствором. В противоположных отсеках обычно размещают электроды. Такую систему часто используют для изучения электрических параметров БЛМ, в первую очередь ионной проницаемости, индуцированной различными соединениями. Эта методика позволяет фиксировать изменения проводимости мембраны, индуцированные одиночными молекулами каналоформера. В отличие от плоских БЛМ, липосомы, или липидные везикулы, позволяют измерять только интегральную активность каналоформеров. Однако их важным преимуществом является стабильность (работать с липосомами молено в течение нескольких дней) и простота получения.

Как было отмечено выше, одна из важных функций мембраны состоит в осуществлении взаимодействия клеток с внешней средой, что, в частности, выражается в переносе различных ионов и молекул через мембрану. Эту функцию осуществляют находящиеся в мембране переносчики и каналы. Поэтому изучение механизмов действия каналов важно для понимания происходящих в клетке процессов. Известно, что на свойства ионных каналов сильно влияют физико-химические свойства мембраны. Одним из подходов к изучению функционирования каналов является их изучение в модельных мембранах с чётко заданными липидным составом, и, как следствие, физико-химическими свойствами мембраны. Варьируя эти свойства и наблюдая изменения свойств канала, молено попытаться понять механизм функционирования ионного канала. Для нашей работы будут валены следующие свойства БЛМ: толщина мембраны, спонтанная кривизна образующих мембрану липидов, поверхностный заряд. В следующих частях Обзора литературы будут подробно рассмотрены как сами свойства БЛМ, так и влияние, которое они могут оказывать на различные типы ионных каналов.

Выводы

1. Установлено, что каналообразующая активность колицина Е1 существенно зависит от спонтанной кривизны липидов мембраны.

2. Обнаружена индукция быстрой трансмембранной диффузии липидов под действием колицина Е1.

3. Показано значительное изменение селективности каналов колицина Е1 при переходе от нейтральной к отрицательно заряженной мембране.

4. Показано, что колицин Е1 индуцирует образование двух типов одиночных каналов в плоских бислойных липидных мембранах. Обнаружено состояние высокой проводимости, проявляющееся в мембранах большой толщины. Выявлено аномально сильное уменьшение проводимости одиночных каналов колицина с ростом содержания отрицательно заряженных липидов в мембране. Определен радиус каналов колицина Е1.

5. На основании полученных данных доказано, что колицин Е1 образует ионные каналы по механизму тороидальной белково-липидной поры, в формировании стенок которой непосредственно участвуют головки молекул липидов. Таким образом, белково-липидная пора может формироваться не только короткими антибактериальными пептидами, но и таким сравнительно крупным белком как колицин Е1.

6. Показано подавление каналообразующей активности колицина Е1 под действием ионов кальция, что, в рамках модели тороидальной поры, хорошо объясняется изменением спонтанной кривизны липидов вследствие нейтрализации зарядов липидных головок.

7. Обнаружена активация каналов колицина Е1 после химической и фотохимической модификации бислойной липидной мембраны, которая, по всей вероятности, также связана с изменением спонтанной кривизны липидов.

8. Влияние химической и фотохимической модификации триптофановых остатков колицина Е1 на его каналообразующую активность выявило значительную роль триптофанов в образовании и стабилизации ионного канала.

1. Геннис Р. 1997. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. "Мир", Москва.ф 2. Haque,M.E., B.R.Lentz. (2004) Roles of curvature and hydrophobic intersticeenergy in fusion: studies of lipid perturbant effects. Biochemistry, 43, 3507-3517.

2. Chernomordik,L.V., G.B.Melikyan, Y.A.Chizmadzhev. (1987) Biomembranefusion: a new concept derived from model studies using two interacting planar lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta, 906, 309-352.

3. Allende,D., S.A.Simon, T.J.Mcintosh. (2005) Melittin-induced bilayer leakagedepends on lipid material properties: evidence for toroidal pores. Biophys. J., 88, 1828-1837.

4. Ramsammy,L.S., H.Brockerhoff. (1982) Lysophosphatidylcholine-cholesterolcomplex. J. Biol. Chem., 257, 3570-3574.

5. Карпунин,Д.В., С.А.Акимов, В.А.Фролов. (2005) Формирование пор вплоских липидных мембранах, содержащих лизолипиды и холестерин. Биологические мембраны, 22, 429-432.

6. Fuller,N., C.R.Benatti, R.P.Rand. (2003) Curvature and bending constants for ^ phosphatidylserine-containing membranes. Biophys. J., 85, 1667-1674.

7. Chernomordik,L.V., E.Lekina, V.Frolov, P.Bronk, J.Zimmerberg. (1997) Anearly stage of membrane fusion mediated by the low pH conformation of influenza hemagglutinin depends upon membrane lipids. J. Cell. Biol, 136,81-93.

8. Hamill,O.P., B.Martinac. (2001) Molecular basis of mechanotransduction inliving cells. Physiol. Rev., 81, 685-740.

9. Peter,B.J., H.M.Kent, I.G.Mills, Y.Vallis, P.J.Butler, P.R.Evans, H.T.McMahon. (2004) BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science, 303, 495-499.

10. Matsuzaki,K. (1999) Why and how are peptide-lipid interactions utilized forself-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. Biochim. Biophys. Acta, 1462, 1-10.

11. Matsuzaki,K., O.Murase, N.Fujii, K.Miyajima. (1996) An antimicrobialpeptide, magainin 2, induced rapid flip-flop of phospholipids coupled with pore formation and peptide translocation. Biochemistry, 35, 1136111368.

12. Ludtke,S.J., K.He, W.T.Heller, T.A.Harroun, L.Yang, H.W.Huang. (1996)

13. Membrane pores induced by magainin. Biochemistry, 35,13723-13728.

14. Matsuzaki,K., K.Sugishita, N.Ishibe, M.Ueha, S.Nalcata, K.Miyajima,

15. R.M.Epand. (1998) Relationship of membrane curvature to the formation of pores by magainin 2. Biochemistry, 37, 11856-11863.

16. Valcarcel,C.A., S.M.Dalla, C.Potrich, I.Bernhart, M.Tejuca, D.Martinez,

17. F.Pazos, M.E.Lanio, G.Menestrina. (2001) Effects of lipid composition on membrane permeabilization by sticholysin I and II, two cytolysins of the sea anemone Stichodactyla helianthus. Biophys. J., 80, 2761-2774.

18. Yang,L., T.A.Harroun, T.M.Weiss, L.Ding, H.W.Huang. (2001) Barrel-stavemodel or toroidal model? A case study on melittin pores. Biophys. J., 81, 1475-1485.

19. Basanez,G., A.E.Shinnar, J.Zimmerberg. (2002) Interaction of hagfishcathelicidin antimicrobial peptides with model lipid membranes. FEBS Lett., 532, 115-120.

20. Malev,V.V., L.V.Schagina, P.A.Gurnev, J.Y.Talcemoto, E.M.Nestorovich,

21. S.M.Bezrukov. (2002) Syringomycin E channel: a lipidic pore stabilized by lipopeptide? Biophys. J., 82, 1985-1994.

22. Saint,N., H.Cadiou, Y.Bessin, G.Molle. (2002) Antibacterial peptide pleurocidin forms ion channels in planar lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta, 1564, 359-364.

23. Henzler Wildman,K.A., D.K.Lee, A.Ramamoorthy. (2003) Mechanism of lipidbilayer disruption by the human antimicrobial peptide, LL-37. Biochemistry, 42, 6545-6558.

24. Kristan,K., Z.Podlesek, V.Hojnik, I.Gutierrez-Aguirre, G.Guncar, D.Turk,

25. J.M.Gonzalez-Manas, J.H.Lakey, P.Macek, G.Anderluh. (2004) Pore formation by equinatoxin, a eulcaryotic pore-forming toxin, requires a flexible N-terminal region and a stable beta-sandwich. J. Biol. Chem., 279, 46509-46517.

26. Bezrukov,S.M., R.P.Rand, I.Vodyanoy, V.A.Parsegian. (1998) Lipid packingstress and polypeptide aggregation: alamethicin channel probed by proton titration of lipid charge. Faraday Discuss., Ill, 173-183.

27. Lewis,J.R., D.S.Cafiso. (1999) Correlation between the free energy of achannel-forming voltage-gated peptide and the spontaneous curvature of bilayer lipids. Biochemistry, 38, 5932-5938.

28. Lundbaek,J.A., O.S.Andersen. (1994) Lysophospholipids modulate channelfunction by altering the mechanical properties of lipid bilayers. J. Gen. Physiol., 104, 645-73.

29. Bruno,M.J., R.E.Koeppe, O.S.Andersen. (2004) Modification of gramicidinchannel function by poly-unsaturated fatty acids. Biophys. J. 48th Annual Meeting Biophysical Society, 1988-Pos.

30. Lundbaek,J.A., P.Birn, A.J.Hansen, R.Sogaard, C.Nielsen, J.Girshman,

31. Epand,R.F., J.C.Martinou, S.Montessuit, R.M.Epand, C.M.Yip. (2002) Directevidence for membrane pore formation by the apoptotic protein Bax. Biochem. Biophys. Res. Commun., 298, 744-749.

32. Basanez,G., J.C.Sharpe, J.Galanis, T.B.Brandt, J.M.Hardwiclc, J.Zimmerberg.2002) Bax-type apoptotic proteins porate pure lipid bilayers through a mechanism sensitive to intrinsic monolayer curvature. J. Biol. Chem., 277,49360-49365.

33. Terrones,0., B.Antonsson, H.Yamaguchi, H.G.Wang, J.Liu, R.M.Lee,

34. A.Herrmann, G.Basanez. (2004) Lipidic pore formation by the concerted action of proapoptotic BAX and tBID. J. Biol. Chem., 279, 3008130091.

35. Epand,R.F., J.C.Martinou, S.Montessuit, R.M.Epand. (2002) Membraneperturbations induced by the apoptotic Bax protein. Biochem. J., 367, 849-855.

36. Epand,R.F., J.C.Martinou, M.Fornallaz-Mulhauser, D.W.Hughes, R.M.Epand.2002) The apoptotic protein tBid promotes leakage by altering membrane curvature. J. Biol. Chem., 277, 32632-32639.

37. Yuan,C., RJ.O'Connell, P.L.Feinberg-Zadek, L.J.Johnston, S.N.Treistman.2004) Bilayer thickness modulates the conductance of the BK channel in model membranes. Biophys. J., 86, 3620-3633.

38. Williamson,I.M., S.J.Alvis, J.M.East, A.G.Lee. (2002) Interactions ofphospholipids with the potassium channel KcsA. Biophys. J., 83, 20262038.

39. Powl,A.M., J.M.East, A.G.Lee. (2003) Lipid-protein interactions studied byintroduction of a tryptophan residue: the mechanosensitive channel MscL.Biochemistry, 42, 14306-14317.

40. Perozo,E., A.Kloda, D.M.Cortes, B.Martinac. (2002) Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat. Struct. Biol., 9, 696-703.

41. Garavaglia,M., S.Dopinto, M.Ritter, J.Furst, S.Saino, F.Guizzardi, M.Jakab,

42. C.Bazzini, V.Vezzoli, S.Dossena, S.Rodighiero, C.Sironi, G.Botta, G.Meyer, R.M.Henderson, M.Paulmichl. (2004) Membrane thickness changes ion-selectivity of channel-proteins. Cell. Physiol. Biochem., 14, 231-240.

43. White,S.H. (2003) Translocons, thermodynamics, and the folding of membraneproteins. FEBSLett., 555, 116-121.

44. Lewis,B.A., D.M.Engelman. (1983) Lipid bilayer thickness varies linearly withacyl chain length in fluid phosphatidylcholine vesicles. J. Mol. Biol., 166,211-217.

45. Montal,M., P.Mueller. (1972) Formation of bimolecular membranes from lipidmonolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,3561-3566.

46. Mueller,P., D.O.Rudin, H.T.Tien, W.C.Wescott. (1963) Methods for theformation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution. J. Phys. Chem., 67, 534-535.

47. White,S.H. (1978) Formation of "solvent-free" black lipid bilayer membranesfrom glyceryl monooleate dispersed in squalene. Biophys. J., 23, 337347.

48. Benz,R., O.Frohlich, P.Lauger, M.Montal. (1975) Electrical capacity of blacklipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta, 394, 323-334.

49. Uhrikova,D., N.Kucerka, A.Islamov, A.Kuklin, V.Gordeliy, P.Balgavy. (2003)

50. Small-angle neutron scattering study of the lipid bilayer thickness inunilamellar dioleoylphosphatidyleholine vesicles prepared by the cholate dilution method: n-decane effect. Biochim. Biophys. Acta, 1611, 31-34.

51. Uhrikova,D., P.Balgavy, N.Kucerka, A.Islamov, V.Gordeliy, A.Kuklin. (2000)

52. Small-angle neutron scattering study of the n-decane effect on the bilayer thickness in extruded unilamellar dioleoylphosphatidyleholine liposomes. Biophys. Chem., 88, 165-170.

53. Chernyshev,A., K.M.Armstrong, S.Cukierman. (2003) Proton transfer ingramicidin channels is modulated by the thickness of monoglyceride bilayers. Biophys. J., 84, 238-250.

54. Mobashery,N., C.Nielsen, O.S.Andersen. (1997) The conformational preferenceof gramicidin channels is a function of lipid bilayer thickness. FEBS Lett., 412, 15-20.

55. Arndt,H.D., A.Knoll, U.Koert. (2001) Synthesis of minigramicidin ion channelsand test of their hydrophobic match with the membrane. Chembiochem., 2,221-223.

56. Weber,M.E., P.H.Schlesinger, G.W.Gokel. (2005) Dynamic assessment ofbilayer thickness by varying phospholipid and hydraphile synthetic channel chain lengths. J. Am. Chem. Soc., 127, 636-642.

57. Lee,A.G. (2004) How lipids affect the activities of integral membrane proteins.

58. Biochim. Biophys. Acta, 1666, 62-87.

59. Lee,M.T., F.Y.Chen, H.W.Huang. (2004) Energetics of pore formation inducedby membrane active peptides. Biochemistry, 43, 3590-3599.

60. Apell,H.J., E.Bamberg, P.Lauger. (1979) Effects of surface charge on theconductance of the gramicidin channel. Biochim. Biophys. Acta, 552, 369-378.

61. Zakharov,S.D., J.B.Heymann, Y.L.Zhang, W.A.Cramer. (1996) Membranebinding of the colicin El channel: activity requires an electrostatic interaction of intermediate magnitude. Biophys. J., 70, 2774-2783.

62. Lundbaek,J.A., A.M.Maer, O.S.Andersen. (1997) Lipid bilayer electrostaticenergy, curvature stress, and assembly of gramicidin channels. Biochemistry, 36, 5695-5701.

63. Martin,S.J., C.P.Reutelingsperger, A.J.McGahon, J.A.Rader, R.C.van Schie,

64. D.M.LaFace, D.R.Green. (1995) Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J. Exp. Med., 182, 1545-1556.

65. Kagan,V.E., G.G.Borisenko, B.F.Serinkan, Y.Y.Tyurina, V.A.Tyurin, J.Jiang,

66. S.X.Liu, A.A.Shvedova, J.P.Fabisiak, W.Uthaisang, B.Fadeel. (2003) Appetizing rancidity of apoptotic cells for macrophages: oxidation, externalization, and recognition of phosphatidylserine. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 285, LI-17.

67. Mcintyre,J.C., R.G.Sleight. (1991) Fluorescence assay for phospholipidmembrane asymmetry. Biochemistry, 30, 11819-11827.

68. Muller,P., S.Schiller, T.Wieprecht, M.Dathe, A.Herrmann. (2000) Continuousmeasurement of rapid transbilayer movement of a pyrene-labeled phospholipid analogue. Chem. Phys. Lipids, 106, 89-99.

69. Epand,R.F., J.C.Martinou, S.Montessuit, R.M.Epand. (2003) Transbilayer lipiddiffusion promoted by Bax: implications for apoptosis. Biochemistry, 42, 14576-14582.

70. Kol,M.A., A.N.van Laak, D.T.Rijkers, J.A.Killian, A.I.de Kroon, B.de Kruijff.2003) Phospholipid flop induced by transmembrane peptides in model membranes is modulated by lipid composition. Biochemistry, 42, 231237.

71. Valiyaveetil,F.I., Y.Zhou, R.MacKinnon. (2002) Lipids in the structure,folding, and function of the KcsA K+ channel. Biochemistry, 41, 1077110777.

72. Cramer,W.A., J.B.Heymann, S.L.Schendel, B.N.Deriy, F.S.Cohen, P.A.Elkins,

73. C.V.Stauffacher. (1995) Structure-function of the channel-forming colicins. Annual Review of Biophysics & Biomolecular Structure, 24, 611-641.

74. Lakey,J.H., S.L.Slatin. (2001) Pore-forming colicins and their relatives. Curr

75. Top Microbiol. Immunol., 257, 131-161.

76. Bullock,J.O., F.S.Cohen, J.R.Dankert, W.A.Cramer. (1983) Comparison of themacroscopic and single channel conductance properties of colicin El and its COOH-terminal tryptic peptide. J. Biol. Chem., 258, 9908-9912.

77. Musse,A.A., J.Wang, G.P.Deleon, G.A.Prentice, E.London, A.R.Merrill. (2006)

78. Scanning the membrane-bound conformation of helix 1 in the colicin El channel domain by site-directed fluorescence labeling. J. Biol. Chem., 281, 885-95.

79. Elkins,P.A., H.Y.Song, W.A.Cramer, C.V.Stauffacher. (1994) Crystallizationand characterization of colicin El channel-forming polypeptides. Proteins, 19, 150-157.

80. Elkins,P., A.Bunker, W.A.Cramer, C.V.Stauffacher. (1997) A mechanism fortoxin insertion into membranes is suggested by the crystal structure of the channel-forming domain of colicin El. Structure, 5, 443-458.

81. Heymann,J.B., S.D.Zakharov, Y.L.Zhang, W.A.Cramer. (1996)

82. Characterization of electrostatic and nonelectrostatic components of protein—membrane binding interactions. Biochemistry, 35, 2717-2725.

83. Zakharov,S.D., M.Lindeberg, Y.Griko, Z.Salamon, G.Tollin, F.G.Prendergast,

84. W.A.Cramer. (1998) Membrane-bound state of the colicin El channel domain as an extended two-dimensional helical array. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 4282-4287.

85. Zakharov,S.D., M.Lindeberg, W.A.Cramer. (1999) Kinetic description ofstructural changes linked to membrane import of the colicin El channel protein. Biochemistry, 38, 11325-11332.

86. Lindeberg,M., S.D.Zakharov, W.A.Cramer. (2000) Unfolding pathway of thecolicin El channel protein on a membrane surface. J. Mol. Biol, 295, 679-692.

87. Slatin,S.L., X.Q.Qiu, K.S.Jakes, A.Finkelstein. (1994) Identification of atranslocated protein segment in a voltage-dependent channel. Nature, 371, 158-161.

88. Jakes,K.S., P.K.Kienker, A.Finkelstein. (1999) Channel-forming colicins:translocation (and other deviant behaviour) associated with colicin la channel gating. Q. Rev. Biophys., 32, 189-205.

89. Tory,M.C., A.R.Merrill. (1999) Adventures in membrane protein topology. Astudy of the membrane-bound state of colicin El .J. Biol. Chem., 274, 24539-24549.

90. Kienker,P.K., X.Qiu, S.L.Slatin, A.Finkelstein, K.S.Jakes. (1997)

91. Transmembrane insertion of the colicin la hydrophobic hairpin. J. Membr. Biol., 157, 27-37.

92. Zakharov,S.D., T.I.Rokitskaya, V.L.Shapovalov, Y.N.Antonenko,

93. W.A.Cramer. (2002) Tuning the membrane surface potential for efficient toxin import. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 8654-8659.

94. Shirabe,K., F.S.Cohen, S.Xu, A.A.Peterson, J.W.Shiver, A.Nakazawa,

95. W.A.Cramer. (1989) Decrease of anion selectivity caused by mutation of Thr501 and Gly502 to Glu in the hydrophobic domain of the colicin El channel. J. Biol. Chem., 264, 1951-1957.

96. Bullock,J.O., E.R.Kolen, J.L.Shear. (1992) Ion selectivity of colicin El: II.

97. Permeability to organic cations. J. Membr. Biol, 128, 1-16.

98. Raymond,L., S.L.Slatin, A.Finkelstein. (1985) Channels formed by colicin Elin planar lipid bilayers are large and exhibit pH-dependent ion selectivity. J. Membr. Biol., 84, 173-181.

99. Uratani,Y., W.A.Cramer. (1981) Reconstitution of colicin El intodimyristoylphosphatidylcholine membrane vesicles. J. Biol. Chem., 256, 4017-4023.

100. Kayalar,C., N.Duzgunes. (1986) Membrane action of colicin El: detection bythe release of carboxyfluorescein and calcein from liposomes. Biochim. Biophys. Acta, 860, 51-56.

101. Merrill,A.R., W.A.Cramer. (1990) Identification of a voltage-responsivesegment of the potential-gated colicin El ion channel. Biochemistry, 29, 8529-8534.

102. Bruggemann,E.P., C.Kayalar. (1986) Determination of the molecularity of thecolicin El channel by stopped-flow ion flux kinetics. Proc. Natl. Acad. Set USA, 83, 4273-4276.

103. Peterson,A.A., W.A.Cramer. (1987) Voltage-dependent, monomeric channelactivity of colicin El in artificial membrane vesicles. J. Membrane. Biol., 99, 197-204.

104. Slatin,S.L. (1988) Colicin El in planar lipid bilayers. Int. J. Biochem., 20, 737744.

105. Levinthal,F., A.P.Todd, W.L.Hubbell, C.Levinthal. (1991) A single trypticfragment of colicin El can form an ion channel: stoichiometry confirms kinetics. Proteins, 11, 254-262.

106. Bullock,J.O. (1992) Ion selectivity of colicin El: modulation by pH andmembrane composition. J. Membr. Biol., 125, 255-271.

107. Schendel,S.L., Z.Xie, M.O.Montal, S.Matsuyama, M.Montal, J.C.Reed. (1997).

108. Channel formation by antiapoptotic protein Bcl-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94,5113-5118.

109. Chernomordik,L.V., S.S.Vogel, A.Sokoloff, H.O.Onaran, E.A.Leikina,

110. J.Zimmerberg. (1993) Lysolipids reversibly inhibit Ca(2+)-, GTP- and pH-dependent fusion of biological membranes. FEBS Lett., 318, 71-76.

111. Chizmadzhev,Y.A., D.A.Kumenko, P.I.Kuzmin, L.V.Chernomordik,

112. J.Zimmerberg, F.S.Cohen. (1999) Lipid flow through fusion pores connecting membranes of different tensions. Biophys. J., 76, 2951-2965.

113. Chizmadzhev,Y.A. (2004) The mechanisms of lipid-protein rearrangementsduring viral infection. Bioelectrochemistry, 63, 129-136.

114. Kleinschmidt,J.H., L.K.Tamm. (2002) Structural transitions in short-chain lipidassemblies studied by (31)P-NMR spectroscopy. Biophys. J., 83, 9941003.

115. Lee,M.T., W.C.Hung, F.Y.Chen, H.W.Huang. (2005) Many-Body Effect of

116. Antimicrobial Peptides: On the Correlation Between Lipid's Spontaneous Curvature and Pore Formation. Biophys. J., 89, 4006-4016.

117. Chen,Z. R.P.Rand. (1997) The influence of cholesterol on phospholipidmembrane curvature and bending elasticity. Biophys. J., 73, 267-276.

118. Hung,W.C., F.Y.Chen, H.W.Huang. (2000) Order-disorder transition inbilayers of diphytanoyl phosphatidylcholine. Biochim. Biophys. Acta, 1467, 198-206.

119. Epand,R.F., N.Umezawa, E.A.Porter, S.H.Gellman, R.M.Epand. (2003)1.teractions of the antimicrobial beta-peptide beta-17 with phospholipid vesicles differ from membrane interactions of magainins. Eur. J. Biochem, 270, 1240-1248.

120. Cleveland,M.V., S.Slatin, A.Finkelstein, C.Levinthal. (1983) Structure-functionrelationships for a voltage-dependent ion channel: properties of COOH-terminal fragments of colicin El. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 37063710.

121. Bishop,L.J., F.S.Cohen, V.L.Davidson, W.A.Cramer. (1986) Chemicalmodification of the two histidine and single cysteine residues in the channel-forming domain of colicin El .J. Membr. Biol., 92, 237-245.

122. Liu,Q.R., V.Crozel, F.Levinthal, S.Slatin, A.Finkelstein, C.Levinthal. (1986) Avery short peptide makes a voltage-dependent ion channel: the critical length of the channel domain of colicin El. Proteins, 1, 218-229.

123. Krasilnikov,O.V., R.Z.Sabirov, V.I.Ternovsky, P.G.Merzliak,

124. J.N.Muratkhodjaev. (1992) A simple method for the determination of the pore radius of ion channels in planar lipid bilayer membranes. FEMS Microbiol. Immunol, 5, 93-100.

125. Krasilnikov,O.V., J.B.Da Cruz, L.N.Yuldasheva, W.A.Varanda, R.A.Nogueira.1998) A novel approach to study the geometry of the water lumen of ion channels: colicin la channels in planar lipid bilayers. J. Membr. Biol, 161, 83-92.

126. Vodyanoy,I., S.M.Bezrukov. (1992) Sizing of an ion pore by access resistancemeasurements. Biophys. J., 62, 10-11.

127. MerzlyakJP.G., L.N.Yuldasheva, C.G.Rodrigues, C.M.Carneiro,

128. O.V.Krasilnikov, S.M.Bezrukov. (1999) Polymeric nonelectrolytes to probe pore geometry: application to the alpha-toxin transmembrane channel. Biophys. J., 77, 3023-3033.

129. Красильников,О.В., Ж.Б.Де Круз, Р.А.Ногуейра. (1998) Как измеритьдиаметр каждого входа у ионного канала, регистрируя только его проводимость? Биофизика, 43, 299-303.

130. Alcaraz,A., E.M.Nestorovich, M.Aguilella-Arzo, V.M.Aguilella, S.M.Bezrukov. (2004) Salting out the ionic selectivity of a wide channel: the asymmetry of OmpF. Biophys. J., 87, 943-957.

131. Красильников,О.В., В.И.Терновский, В.З.Сабиров, Р.К.Зарипова,

132. Б.А.Ташмухамедов. (1986) Катион-анионная селективность стафилотоксиновых каналов в липидном бислое. Биофизика, 31, 606-610.

133. Borisenko,V., M.S.Sansom, G.A.Woolley. (2000) Protonation of lysineresidues inverts cation/anion selectivity in a model channel. Biophys. J., 78, 1335-1348.

134. Starostin,A.V., R.Butan, V.Borisenko, D.AJames, H.Wenschuh, M.S.Sansom,

135. G.A.Woolley. (1999) An anion-selective analogue of the channel-forming peptide alamethicin. Biochemistry, 38, 6144-6150.

136. Bredin,J., N.Saint, M.Mallea, D E, G.Molle, J.M.Pages, V.Simonet. (2002)

137. Alteration of pore properties of Escherichia coli OmpF induced by mutation of key residues in anti-loop 3 region. Biochem. J., 363, 521528.

138. Garcia-Saez,A.J., M.Coraiola, S.M.Dalla, I.Mingarro, G.Menestrina, J.Salgado.2005) Peptides derived from apoptotic Bax and Bid reproduce the poration activity of the parent full-length proteins. Biophys. J., 88, 39763990.

139. Rostovtseva,T.K., V.M.Aguilella, I.Vodyanoy, S.M.Bezrukov, V.A.Parsegian.1998) Membrane surface-charge titration probed by gramicidin A channel conductance. Biophys. J., 75, 1783-1792.

140. Aguilella,V.M., S.M.Bezrukov. (2001) Alamethicin channel conductancemodified by lipid charge. Eur. Biophys. J., 30, 233-241.

141. Bezrukov,S.M., I.Vodyanoy. (1993) Probing alamethicin channels with water-soluble polymers. Effect on conductance of channel states. Biophys. J., 64, 16-25.

142. Ropele,M., G.Menestrina. (1989) Electrical properties and moleculararchitecture of the channel formed by Escherichia coli hemolysin in planar lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta, 985, 9-18.

143. Rostovtseva,T.K., E.M.Nestorovich, S.M.Bezrukov. (2002) Partitioning ofdifferently sized poly(ethylene glycol)s into OmpF porin. Biophys. J., 82, 160-169.

144. Menestrina,G., S.M.Dalla, M.Comai, M.Coraiola, G.Viero, S.Werner,

145. D.A.Colin, H.Monteil, G.Prevost. (2003) Ion channels and bacterial infection: the case of beta-barrel pore-forming protein toxins of Staphylococcus aureus. FEBSLett., 552, 54-60.

146. Zemel,A., D.R.Fattal, A.Ben Shaul. (2003) Energetics and self-assembly ofamphipathic peptide pores in lipid membranes. Biophys. J., 84, 22422255.

147. Qiu,X.Q., K.SJakes, P.K.Kienker, A.Finkelstein, S.L.Slatin. (1996) Majortransmembrane movement associated with colicin la channel gating. J. Gen. Physiol., 107, 313-328.

148. Qiu,X.Q., K.SJakes, A.Finkelstein, S.L.Slatin. (1994) Site-specificbiotinylation of colicin la. A probe for protein conformation in the membrane. J. Biol. Chem., 269, 7483-7488.

149. Kienker,P.K., K.S.Jakes, A.Finkelstein. (2000) Protein translocation acrossplanar bilayers by the colicin la channel-forming domain: where will it end? J. Gen. Physiol., 116, 587-598.

150. Zakharov,S.D., W.A.Cramer. (2002) Insertion intermediates of pore-formingcolicins in membrane two- dimensional space. Biochimie, 84, 465-475.

151. Schibli,D.J., R.F.Epand, H.J.Vogel, R.M.Epand. (2002) Tryptophan-richantimicrobial peptides: comparative properties and membrane interactions. Biochem. Cell Biol., 80, 667-677.

152. Rokitskaya,T.I., M.Block, Y.N.Antonenko, E.A.Kotova, P.Pohl. (2000)

153. Photosensitizer binding to lipid bilayers as a precondition for the photoinactivation of membrane channels. Biophys. J., 78, 2572-2580.

154. Rokitskaya,T.I., S.D.Zakharov, Y.N.Antonenko, E.A.Kotova, W.A.Cramer.2001) Tryptophan-dependent sensitized photoinactivation of colicin El channels in bilayer lipid membranes. FEBSLett., 505, 147-150.

155. Verza,G., L.Bakas. (2000) Location of tryptophan residues in free andmembrane bound Escherichia coli alpha-hemolysin and their role on the lytic membrane properties. Biochim. Biophys. Acta, 1464, 27-34.

156. Malovrh,P., A.Barlic, Z.Podlesek, P.Macek, G.Menestrina, G.Anderluh. (2000)

157. Structure-function studies of tryptophan mutants of equinatoxin II, a sea anemone pore-forming protein. Biochem. J., 346 Pt 1, 223-232.

158. Valenzeno,D.P., M.Tarr. (1991) Membrane Photomodification and its Use to

159. Study Reactive Oxygen Effects. In Photochemistry and Photophysics. J.F.Rabek, editor. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, Boston, 137-191.

160. Ehrenberg,B., J.L.Anderson, C.S.Foote. (1998) Kinetics and yield of singletoxygen photosensitized by hypericin in organic and biological media. Photochem. Photobiol., 68, 135-140.

161. Krasnovsky,A.A., Jr. (1998) Singlet molecular oxygen in photobiochemical systems: IR phosphorescence studies. Membr. Cell Biol, 12, 665-690.1141. Ц)

162. Suga,H., K.Shirabe, T.Yamamoto, M.Tasumi, M.Umeda, C.Nishimura,

163. A.Nakazawa, M.Nakanishi, Y.Arata. (1991) Structural analyses of a channel-forming fragment of colicin El incorporated into lipid vesicles. Fourier-transform infrared and tryptophan fluorescence studies. J. Biol. Chem., 266, 13537-13543.

164. Palmer,L.R., A.R.Merrill. (1994) Mapping the membrane topology of theclosed state of the colicin El channel. J. Biol. Chem., 269, 4187-4193.

165. Malenbaum,S.E., A.R.Merrill, E.London. (1998) Membrane-inserted colicin Elchannel domain: a topological survey by fluorescence quenching suggests that model membrane thickness affects membrane penetration. J. Nat. Toxins, 7, 269-290.

166. Tory,M,C., A.R.Merrill. (2002) Determination of membrane protein topologyby red-edge excitation shift analysis: application to the membrane-bound colicin El channel peptide. Biochim. Biophys. Acta, 1564, 435-448.

167. Savige,W.E., A.Fontana. (1977) Modification of tryptophan to oxindolylalanineby dimethyl sulfoxide- hydrochloric acid. Methods Enzymol., 47, 442453.

168. Lundblad,R.L., C.M.Noyes. (1985) Chemical modification of tryptophan. In

169. Chemical reagents for protein modification. CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida. 47-71.

170. Spande,T.F., B.Witkop, Y.Degani, A.Patchornik. (1970) Selective cleavage andmodification of peptides and proteins. Adv. Protein Chem., 24, 97-260.

171. Carr,A.C., C.C.Winterbourn, J.J.van den Berg. (1996) Peroxidase-mediatedbromination of unsaturated fatty acids to form bromohydrins. Arch. Biochem. Biophys., 327, 227-233.

172. Panasenko,O.M., H.Spalteholz, J.Schiller, J.Arnhold. (2003) Myeloperoxidaseinduced formation of chlorohydrins and lysophospholipids from unsaturated phosphatidylcholines. Free Radic. Biol. Med., 34, 553-562.