Безреагентные биосенсоры на основе электрохимических реакций в гетерогенных системах

Трашин, Станислав Александрович

Безреагентные биосенсоры на основе электрохимических реакций в гетерогенных системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Трашин, Станислав Александрович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2008 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.15 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Безреагентные биосенсоры на основе электрохимических реакций в гетерогенных системах»

Автореферат диссертации на тему "Безреагентные биосенсоры на основе электрохимических реакций в гетерогенных системах"

00345ЬЬ13

На правах рукописи

ТРАШИН СТАНИСЛАВ АЛЕКСАНДРОВИЧ

БЕЗРЕАГЕНТНЫЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ В ГЕТЕРОГЕННЫХ

СИСТЕМАХ

02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

О 5 ДЕК 2008

МОСКВА - 2008

003455519

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

кандидат химических наук

Карякин А.А. Вагин М.Ю.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Ярополов А.И.

Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

доктор химических наук, главный научный сотрудник

Алпатова Н.М.

Институт физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН

Защита состоится 16 декабря 2008 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан 14 ноября 2008 года Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На сегодняшний день электрохимические биосенсоры являются наиболее дешевыми и простыми устройствами, позволяющими проводить экспрессный химический анализ с высокой чувствительностью и селективностью. Среди широкого круга их задач, можно выделить определение специфических биомолекул для целей клинической диагностики и пищевой промышленности.

Возможность проведения анализа без пробоподготовки, низкая стоимость, доступность и простота выгодно отличают биосенсоры от универсальных аналитических систем, например, хромато-масс-спектрометрии. При этом критически важными свойствами биосенсоров являются безреагентность, высокая селективность и операционная стабильность. Безреагентное определение биомолекул электрохимическими методами затруднено тем, что белки и нуклеиновые кислоты, а также их комплексы в основном не электроактивны, поскольку не содержат редокс-активных групп. Поэтому определение биомолекул с помощью биосенсоров требует разработки альтернативных подходов.

Одним из перспективных направлений в электроанализе является использование границы раздела несмешивающихся жидкостей для регистрации редокс-неактивных ионов. Белки и нуклеиновые кислоты содержат заряженные группы и могут быть рассмотрены в качестве полиэлектролитов. В связи с этим представляется возможным их детектирование на границе раздела несмешивающихся жидкостей.

С другой стороны, использование системы нанопор в инертной мембране перспективно для увеличения чувствительности электрохимической регистрации аффинного связывания биологических макромолекул, поскольку образование наноразмерных комплексов внутри нанопор будет блокировать поток ионов к поверхности электрода.

По принципу безреагентного анализа работают также биосенсоры третьего поколения, то есть амперометрические сенсоры на основе биоэлектрокатапиза с прямым обменом электрона между активным центром фермента и электродом. Это явление, открытое советскими учеными три десятилетия назад, в настоящее время интенсивно исследуют в связи с выделением новых типов оксидоредуктаз, развитием методов биоинженерии и созданием новых электродных материалов. Модификация поверхности имеет большое значение для повышения эффективности биоэлектрокатализа за счет облегчения коммуникации активного центра фермента с электродом.

Цель и задачи работы Целью работы являлось создание безреагентных биосенсоров для регистрации белков и нуклеиновых кислот на основе электродов, чувствительных к физико-химическим процессам на границах раздела фаз, а также создание лактозного бносенсора на основе высокоэффективного прямого биоэлектрокатализа ЦЦГ.

В задачи диссертации входило:

1) разработка высокостабильных и воспроизводимых электродов с поляризуемой границей раздела несмешивающихся жидкостей, предназначенных для регистрации биомолекул;

2) создание безреагентного ДНК-сенсора на основе ДНК-зонда, иммобилизованного на границе раздела несмешивающихся жидкостей;

3) получение и исследование электрохимической системы, чувствительной к экстракции белка из воды в органический растворитель;

4) регистрация биоаффинного взаимодействия на электроде, модифицированном инертным полимером с системой наноразмерных пор, и создание аптасенсора на тромбин;

5) изучение прямого биоэлектрокатализа целлобиозодегидрогеназами и повышение его эффективности за счет модификации поверхности электрода редокс-активными полимерами с целью получения более стабильных и чувствительных сенсоров на лактозу.

Научная новизна и практическая ценность работы. Создан безреагентный ДНК-сенсор на основе принципиально нового подхода - иммобилизации ДНК-зонда на границе раздела несмешивающихся жидкостей. Аналитические характеристики сенсора превосходят описанные в литературе. В частности, минимальная регистрируемая концентрация составила 1 • 10"s M, а селективность по отношению к последовательности нуклеотидов позволила зарегистрировать точечную мутацию, то есть замену одного азотистого основания другим. Сенсор может быть изготовлен простым и дешевым способом.

Получен электрохимический отклик в ответ на экстракцию белка в органический растворитель. Исследования по данному направлению проводятся впервые и вносят существенный вклад в изучение переноса заряда через границу раздела несмешивающихся жидкостей. Высокая чувствительность (до 5 A/M) и селективность взаимодействия ПАВ-белок открывают перспективы совмещения методов мицеллярной энзимологии и электроанализа для получения новых аналитических систем.

Впервые продемонстрирована возможность электрохимической регистрации образования комплекса аптамер-тромбин по блокированию потока ионов через систему нанопор в инертном изоляторе. Для этих целей разработаны электроды, экранированные пористыми полисилоксановыми матрицами. Используя преимущества данного подхода, возможно соз-

дание дешевых аптасенсоров, функционирующих без использования меченных биологических молекул.

Впервые показано увеличение эффективности биоэлектрокатализа целлобиозодегидро-геназой за счет модификации электрода полианилином, а также полианилином с включенными углеродными нанотрубками. На основе модифицированных электродов созданы безреагентные биосенсоры на лактозу, обладающие на порядок улучшенными значениями чувствительности и операционной стабильности. Полученные биосенсоры могут быть востребованы в пищевой промышленности для анализа лактозы в сложных матрицах.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на конференциях: 57th Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry (Edinburgh, United Kingdom, 2006), International congress on analytical science (Moscow, Russia, 2006), 11th International Conference on Electroanalysis (Bordeaux, France, 2006), Международная конференция молодых учёных «Ломоносов - 2006» и «Ломоносов - 2007» (Москва, Россия), II Всероссийская конференция по аналитической химии (Туапсе, Россия, 2007), NATO ASI «Sensors for Environment, Health and Security» (Vichy, France, 2007), Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, Россия, 2008), International Conference on Electrochemical Sensors (Dobogóko, Hungary, 2008).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 17 работ, в том числе 4 статьи в международных и отечественных журналах и 13 тезисов научных конференций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (165 наименований). Работа изложена на 130 страницах и содержит 46 рисунков и 8 таблиц.

Список сокращений

ЦВА - циклическая вольтамперограмма

Х.с.э. - хлоридсеребряный электрод

НФОЭ - о-нитрофенилоктиловый эфир

ПФТА - полифенотиазин, ДМФЦ - декаметилферроцен

ТДАТХФБ - тетрадодецилатаммония тетракис(4-хлорфеил)борат

ПВХ - поливинилхлорид

ПАВ - поверхностно-активное вещество

АОТ - аэрозоль ОТ, бис(2-этилгексил)сульфосукцината натрия

ДАП - додециламмония пропионат

ЦДГ - целлобиозодегидрогеназа

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цели и задачи.

В главе 2.1 описаны общие принципы устройства биосенсоров и их классификация.

Глава 2.2 содержит сведения о различных способах иммобилизации ДНК-зонда для создания сенсоров, чувствительных к специфическим фрагментам ДНК.

Глава 2.3 посвящена описанным в литературе сенсорам для безреагентного определения белков и нуклеиновых кислот.

В главе 2.4 рассмотрены физико-химические свойства границ раздела несмешиваю-щихся растворов электролитов и электрохимическая активность ионов на ней.

Глава 2.5 описывает особенности свойств и способы получения электродов, экранированных тонким слоем несмешивающейся с водой жидкости.

Глава 2.6 содержит сведения о приложениях систем с границей раздела несмешиваю-щихся жидкостей в энзимологии.

Глава 2.7 посвящена редокс-активности белков на электродах и явлению биоэлектрока-тализа.

Глава 2.8 содержит информацию о целлобиозодегидрогеназах, их структуре и свойствах, а также их применении для биоэлектрокатализа.

В работе в качестве рабочих электродов использовались дисковые графитовые и золотые электроды (0 = 2 мм), запрессованные в тефлон, пленарные графитовые пастовые электроды (0 = 2 мм), полученные методом трафаретной печати, и гидрофобные графитизиро-ванные ткани ЛШГ-240 (S = 1 см2).

Потенциодинамические исследования модифицированных электродов проводились в трехэлектродной ячейке с разделенным пространством всех электродов. В качестве электрода сравнения использовался хлоридсеребряный электрод в 1 М КС1 (х.с.э.), в качестве вспомогательного - стеклоуглеродный электрод большой площади.

Измерение импеданса проводили в специальной ячейке с цилиндрическим платиновым вспомогательным электродом, окружающим рабочий, либо в химическом стакане подходящего объема при использовании трёхэлектродных структур, изготовленных методом трафаретной печати.

Проточно-инжекционная система состояла из перистальтического насоса и инжектора с объемом пробы 50 мкл, соединенного с проточной амперометрической ячейкой типа wall-jet, в которую монтировался рабочий электрод. Скорость потока буферного раствора составляла 0.5 мл/мин.

В разделе 4, главах 4.1-4.3 изложены результаты работы и их обсуждение.

ХОС 0

©СО

Рис. 1. Структура ГТФТА.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Сенсоры на основе электродов, изолированных тонким слоем нссменшвающегося с водой органического растворителя

1.1. Электроды, изолированные тонким слоем органического растворителя, стабилизированного в виде геля

Граница раздела несмешивающихся жидкостей обладает уникальными свойствами. В частности, на ней можно регистрировать ток переноса редокс-неактивных ионов, который по характеру является фарадеевским, а по сути аналогичен переносу электронов через границу металл | раствор в традиционной электрохимии. Простейшим способом получения электрохимической системы с границей раздела несмешивающихся жидкостей является экранирование твердого электрода от водной фазы тонким слоем органического растворителя. В целях обеспечения переноса заряда через границу раздела твердого электрода и органического растворителя, в слой органической жидкости вводят гидрофобное электроактивное соединение. Для этого в работе использовали специально синтезированный олигомер фенотиазина - полифенотиазин (ПФТА, рис. 1). Наложение потенциала на электрод вызывает окисление ПФТА и одновременный перенос ионов через границу раздела несмешивающихся жидкостей для сохранения элеткронейтральности органической фазы. Описанный процесс схематически представлен на рис. 2-а.

В большинстве случаев биомолекулы не содержат редокс-активных групп, но имеют заряд на поверхности и могут быть рассмотрены в качестве полиэлектролитов. Благодаря этому появляется возможность провести их электрохимическую регистрацию по аналогии с переносом ионов через границу раздела несмешивающихся жидкостей (рис 2-6, в).

Для повышения стабильности системы и удобства её использования при работе с малыми объемами растворов, тонкий слой органического растворителя создавали на торцевых и пленарных

вода

органически и: электрод растворитель

СГ ПФТА -V

сг сг >-»ё

ПОТА**" ' .: ' Л

сг :

б ъ С" ПФТА

■Р Р \ ПФТА*^ ^¿ф» -.о V-

' -- (р.

ПФТА

■© ПФТА^.

«¡мй»» . . ....... ,

Рис. 2. Схема работы электрода, экранированного тонким слоем органической жидкости.

электродах. Стабильные и воспроизводимые электроды удалось получить с использованием нелетучего растворителя НФОЭ, стабилизированного в виде 5% ПВХ геля и нанесенного на планарные трсхэлектродные структуры, изготовленные методом трафаретной печати. Для уменьшения сопротивления геля в него добавляли гидрофобный электролит (0.01 М ТДАТХФБ).

Важным свойством поляризуемой границы раздела несмешивающихся жидкостей является зависимость редокс-потенциала от энергии Гиббса переноса иона из воды в органический растворитель. Вольтамперометрическое исследование электродов, модифицированных слоем геля, показало смещение потенциала редокс-активности ПФТА прямо пропорционально стандартной энергии Гиббса переноса аниона из воды в НФОЭ (рис. 3, 4). Кроме того, наблюдался близкий к нернстовскому сдвиг редокс-потенциала, составляющий около 40 мВ при уменьшении концентрации переносимого аниона в 10 раз. Таким образом, свойства электродов зависели от концентрации и природы фонового электролита.

Чувствительность электродов к потоку редокс-неактивных ионов через границу раздела двух жидкостей обуславливала их дальнейшее применение для иммобилизации заряженных биологических молекул и регистрации образования биоаффинных комплексов на примере взаимодействия комплементарных ДНК.

Е, В отн. х с э.

Рис. 3. Вольтамперограммы электрода, экранированного тонким слоем геля, содержащего 1 мг/мл ПФТА, в растворах ряда анионов.

Д^ереноса^'УР-В

Рис. 4. Зависимость потенциала редокс-активности от стандартной энергии Гиббса переноса аниона из воды в НФОЭ.

1.2. Регистрация специфической последовательности нуклеотидов па электродах, изолированных слоем гидрофобного геля

Для создания ДНК-сенсора на поверхности разработанных электродов, модифицированных слоем геля, иммобилизовали ДНК-зонд, обеспечивающий селективное распознавание комплементарного олигонуклеотида из раствора. ДНК-зонд представлял собой олигонуклеотид, модифицированный гидрофобным алкильным «якорем» С18Н37, благодаря которому он приобретал способность к адсорбции на границе раздела двух жидкостей. После иммобилизации проводили регистрацию ДНК-мишени, являющейся олигонуклеотндом с последовательностью, комплементарной к ДНК-зонду. Для этого измеряли спектры импеданса электродов с ДНК-зондом после выдерживания в растворе мишени. На рис. 5 показан градуировочный график, построенный по изменению проводимости при частоте приложенного потенциала 2.5 кГц.

2 О и

=г 0.1 и*

<ч

>1 <

0.01

10"

10"°

с,м

Рис. 5. Градуировочный график, построенный по изменению модуля комплексной проводимости при частоте приложенного потенциала 2.5 кГц от концентрации комплементарного олигонуклеотида.

В двойных логарифмических координатах график хорошо линеаризовался в диапазоне концентраций почти двух порядков, а минимальная определяемая концентрация составила 10 нМ, что превосходит характеристики описанных в литературе безреагентных подходов на основе поверхностного плазмонного резонанса и кварцевых микровесов. При инкубации в растворе полностью некомплементарного олигонуклеотида откликов не наблюдалось, что показывает отсутствие влияния неспецифических взаимодействий и адсорбции.

Важным свойством ДНК-сенсоров является чувствительность к присутствию точечных мутаций в олигонуклеотидах-мишенях. На рис. 6 показаны полные спектры импеданса в ко-

ординатах комплексной проводимости для серии электродов, а также разница в значении проводимости на частоте 2.5 кГц, где различия максимальны. Видно, что электроды в сериях хорошо воспроизводятся. Относительная ошибка составляла менее 5%. В пределах этой погрешности инкубация в растворе нуклеотида с точечной мутацией приводила к сигналам равным фоновым, полученным после выдерживания электродов в растворе буфера.

Таким образом, впервые создан безреагентный электрохимический ДНК-сенсор, превосходящий по своим аналитическим характеристикам ДНК-сенсоры на основе известных физико-химических принципов: поверхностного плазмонного резонанса и кварцевых микровесов.

V, кОм"1

Рис. 6. Регистрация точечной мутации: спектры электродов, инкубированных в растворе полностью комплементарного олигонуклеотида - (1), олигонуклеотида с точечной мутацией - (2) и растворе буфера - (3). Концентрация олигонуклеотида 5-10"7М, буфер рН 7.4, 0.1 М ЫаС1, 0.01 М№Н2Р04.

1.3. Электроактивность редокс-неактивных белков на границе раздела двух жидкостей Среди небольших по размеру редокс-неактивных белков встречаются важные аналиты, в частности, белки-меркеры различных заболеваний. Глобулы белков содержат заряженные группы на поверхности, поэтому представляется возможным зарегистрировать их по току ионов через границу раздела несмешивающихся жидкостей. Однако белки гидрофильны, вследствие чего их перенос в органическую фазу существенно затруднен по сравнению с ионами фонового электролита. Известно, что перенос белков может быть индуцирован ПАВ, находящимся в органическом растворителе. Наиболее изученной является система АОТ-изооктан, солюбилизирующая а-химотрипсин в обращенные мицеллы ПАВ. С использованием данной системы удалось зарегистрировать электроактивность редок-неактивного белка, выраженную в появлении пиков тока после инкубации электрода в растворе фермента (рис. 7). Появление отклика наблюдалось для двух различных редокс-компонентов органического слоя: ПФТА и декаметилферроцена. В отсутствие ПАВ, а также при использовании полярных органических растворителей характерного отклика системы не наблюдалось.

Е, В отн. х.с.э. Е, В отн. х.с.э.

Рис. 7. Вольтамперометрические отклики, полученные на 5 мг/мл а-химотрипсина (Мг=24 кДа).

Изооктан, 5 мМ АОТ, 0.03 мг/мл ПФТА (или 1 мМ ДМФЦ), рН 7.4, 0.1 М КС1, 0.01 М КН2Р04.

Было предположено, что отклик возникает в условиях экстракции белка в органическую фазу. Для подтверждения измерили активность а-химотрипсина в смытом с поверхности электрода слое изооктана после регистрации электрохимических откликов на белок. Найденная концентрация белка оказалась прямо пропорциональна его содержанию в инкубационном растворе и регистрируемым токам пиков редокс-активности (рис. 8). Таким образом, независимо показано, что регистрируемый отклик связан с переносом белка в органическую фазу. Кроме того, известно, что при высокой концентрации электролита белок

перестает экстрагироваться и выходит в воду вследствие разрушения электростатических взаимодействий ПАВ-белок. Подобно этому, электроактивность белка в предложенной системе не наблюдалась при использовании в 5 раз более концентрированного раствора буфера в качестве инкубационного раствора или фона в измерительной ячейке.

0.3 п

га

Щ 0.2.

о ю

о я к

а о.1 >я га X

40' 30 2010-0■

3 2

0.1 0.2 0.3 0.4 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Исходно бежа в растворе, мМ Найдено белка, мМ

Рис. В. Спектрофотометрические измерения концентрации белка в изооктане после инкубации в растворе химотрипсина различной концентрации. 5 мМ АОТ, рН 7.4,0.1 М КС1,0.01 М КН2Р04.

Наиболее важными характеристиками для целей анализа являются зависимость отклика от концентрации аналита и селективность. Зависимость токов пиков электроактивности электродов от концентрации белка представлена на рис. 9 в виде градуировочных графиков, полученных при двух разных концентрациях АОТ и при замене анионогенного АОТ катио-ногенным додециламмония пропионатом (ДАП). В первых двух случаях диапазон линейности составил более порядка величины, а ток пика при насыщающих концентрациях примерно на два порядка превышал фоновый. В случае ДАП наблюдаемые отклики на белок были значительно меньше относительно фонового тока. В условиях эксперимента а-химотрипсин имеет положительный заряд поверхности (р1 8.2, рН буферного раствора 7.4). Вследствие этого АОТ обеспечивает его эффективную экстракцию в органический растворитель за счет электростатических взаимодействий. При инкубации электродов в растворе а-лактальбумина, обладающего отрицательным зарядом глобулы при нейтральных рН, наблюдались токи значительно меньшие, чем для а-химотрипсина. И наоборот, токи для а-лактальбумина в присутствии катионогенного ПАВ были выше. Это указывает на важную роль взаимодействий ПАВ-белок для появления электрохимического отклика. Наибольшие чувствительность и величина токовых откликов наблюдались для цитохромома с, обладающего наибольшим значением р! и наименьшим размером глобулы, что обеспечивало наи-

лучшую экстракцию в изооктан в присутствии ЛОТ. Наименьшие отклики наблюдались для больших по размеру, а также содержащих углеводы белков. Токовые характеристики откликов и некоторые свойства изученных белков представлены в табл. 1.

Таким образом, с использованием электродов с границей раздела несмешивающихся жидкостей проведена количественная регистрация белков, не содержащих редокс-активных групп. Показано, что для достижения максимальных чувствительности и селективности необходимо обеспечивать специфичные взаимодействия белка и ПАВ.

100 80 60 40 20 04

(1) (2) (3)

• i

?" ". °

I i

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 С(а-химотрипсин), мМ

Рис. 9. Градуировочные графики при 5-10"3М ЛОТ - (1), Н0"3М АОТ - (2), 5-10"3М ДАП - (3). 0.03 мг/мл ПФТА в изооктане, рН 7.4, 0.1МКС1, 0.01М КН2Р04.

Таблица 1. Некоторые свойства белков и их отклики на границе раздела несмешивающихся жидкостей.

Белок Mr, Углеводы Pi Максимальный отклик, мкА Наклон начального участка, A/M

Цитохром Ц 124 Нет 100 220 5.1

а-Химотрипсин 24.0 Нет 8.8 100 1 9

а-Химотрипсин (ДАП) 0.1 (1 мг/мл белка) Отсутствует

Трипсин 23 8 Нет 10.0 80 1 5

а-Лактальбумин 14 2 Нет 48 25 0 29

а-Лактальбумин (ДАП) 0.61 (1 мг/мл) 6.1x10-'

Нативная пероксидаза из корней хрена 44.0 (-18% масс.) 7.9 5 -

Рекомбинантная пероксидаза 34.0 Нет 7.9 35 -

Рекомбинантная формиатдегидрогеназа 88.0 Нет 14.5 -

2. Регистрация образования комплекса аптамер-белок на электподе с системой нанопазмериых поп

В целях увеличения чувствительности регистрации аффинных взаимодействий ведутся попытки уменьшить чувствительный элемент до размеров, соизмеримых с биологическими молекулами. Одной из возможных реализаций этого подхода является электрохимическая регистрация аффинного связывания внутри нанопор инертной мембраны за счёт блокирования потока ионов. Описаны работы, в которых биорецептор иммобилизовали внутри единичной нанопоры, однако технические сложности создания и работы с такой системой ограничивают её применение. С другой стороны, известно, что полисилоксановые матрицы обладают свойствами полупроницаемых мембран благодаря системе наноразмерных каналов (нанопор), что открывает возможность формирования с их помощью нанопористых покрытий. Для этого на поверхность электрода наносили раствор винилтриэтоксисилана в ацетонитриле, в который добавляли стехиометрическое количество воды для его гидролиза. Сформировавшиеся покрытия тестировали методом циклической вольтамперометрии в присутствии ферроцианида.

ЦВА для системы микро- и наноэлектродов в условиях полусферической диффузии имеют те же особенности, что и ЦВА для микроэлектрода. В частности, ток выходит на стационарное значение, а не проходит через выраженный максимум, как в случае обычного электрода миллиметровых размеров. Стационарный ток мало зависит от скорости развертки потенциала, в то время как для обычного электрода ток возрастает прямо пропорционально корню квадратному из скорости развертки. В связи с этим можно оценивать качество получаемых силоксановых матриц с точки зрения наличия сквозных нанопор и отсутствия дефектов в покрытии. На рис. 10 сравниваются ЦВА для микроэлектрода и электрода, изолированного полисилоксановой мембраной. Форма ЦВА и отсутствие существенного влияния скорости развертки потенциала показывает, что на основе силоксанов удается получать нанопористые покрытия, экранирующие электрод.

В качестве рецептора для регистрации аффинного взаимодействия использовали модельную систему на основе аптамера против тромбина - олигонуклеотида, обладающего аффинностью к белку (тромбину). Аптамер иммобилизовали на золотые электроды с полисилоксановой матрицей за счет пришитой к аптамеру тиольной группы. Затем электрод выдерживали в растворе белка-мишени (тромбина). На рис. 11 представлены ЦВА электрода в присутствии ферроцианида, полученные после каждой стадии. Иммобилизация аптамера вызывала уменьшение токов на ЦВА, что, вероятно, связано с частичной блокировкой пор и элеткростатическим отталкиванием зарядов ферроцианида и аптамера. После

выдерживания в растворе белка-мишени пики редокс-активности полностью исчезают, что говорит о блокировании потока вещества к электроду. При проведении тех же операций на чистом золотом электроде пики редокс-активности ферроцианида сохраняются, и после образования комплекса удается добиться только 30 % уменьшения тока пика по отношению к начальному.

Таким образом, с использованием нанопористых матриц силоксанов продемонстрирована возможность регистрации аффинных взаимодействий без использования меченых биологических молекул.

Рис. 10. Сравнение свойств микроэлектрода (0=50 рм) и электрода, экранированного пористой полисилоксановой матрицей. 0.1 М KCl, 5-10""М K3Fe(CN)6+ 5-104М K4Fe(CN)6.

0.20.1

а o.o -0.1 -0.2

-1-•-1---1---1---1-»

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

E, В отн. х.с.э.

Рис. 11. Вольтамперограммы электрода, модифицированного полисилоксановой матрицей - (1), после иммобилизации аптамера - (2) и инкубации в растворе 1 мг/мл тромбина - (3). 0.1 М KCl, 0.01 М КН2Р04, pH 6.0, 5-Ю^М K,Fe(CN)6 + З-Ю^М K4Fe(CN)fi.

3. Прямой биоэлектрокатализ целлобиозодегидрогеназами

ЦДГ катализирует окисление ряда Сахаров. Наиболее активными субстратами являются целлобиоза и лактоза, что позволяет создавать на основе данного фермента биосенсоры для определения лактозы. ЦДГ является одним из немногих ферментов, способных к обмену электронами непосредственно с электродом без участия диффузионно-подвижных медиаторов. Физическая адсорбция ЦДГ на поверхности планарных электродов, изготовленных из графитовых паст, позволяет получить каталитические токи окисления лактозы. При этом существует два возможных пути для окисления активного центра, восстановленного в ходе каталитического акта (рис. 12). Реакция может протекать полностью на ФАД-домене, где двухэлектронный акцептор, например, бензохинон играет роль окислителя. Либо реакция окисления активного центра проходит при участии гем-домена и одноэлектронного акцептора, вместо которого может выступать электрод. В последнем случае для достижения максимально возможных токов и чувствительности необходимо обеспечить иммобилизованному ферменту благоприятную ориентацию и коммуникацию электрон-транспортной цепи фермента с поверхностью электрода. Для этих целей электрод модифицировали электроактивным полимером - полианилином, который, как известно, содержит в своей структуре остатки анилина, хинонов и азинов, то есть фрагменты потенциальных субстратов фермента. Их присутствие может улучшать коммуникацию и ориентировать фермент, обеспечивая максимальную скорость биоэлектрокатализа.

Рис. 12. Схема работы ЦДГ на графитовом электроде.

Для получения ферментных электродов ЦДГ иммобилизовали на поверхности чистых электродов и модифицированных полианилином путем электрополимеризации. Затем изготовленные электроды испытывали в системе проточно-инжекционного анализа.

Исследование зависимости тока окисления лактозы от приложенного к электроду потенциала показало, что в области 0 мВ величина тока примерно в 5 раз выше в случае иммо-

Медиаторный биоэлектрокатализ

Бензохинон, 2-х е' акцепторы

Целлобиоза лактоза

Прямой биоэлектрокатализ

билизации фермента на полианилин (рис. 13). При потенциале 300-400 мВ ток падает до значений меньших, чем при иммобилизации фермента на чистый графитовый электрод, что, вероятно, связано с частичным блокированием поверхности полианилином, находящимся при этих потенциалах в полностью окисленном состоянии. На электроде без фермента в обоих случаях во всем диапазоне потенциалов неспецифическое окисление лактозы зарегистрировано не было, то есть окисление наблюдалось только благодаря действию фермента, адсорбированного на электроде. Градуировочные графики на лактозу, полученные при 0 мВ, представлены на рис. 14. Чувствительность при использовании полианилина была более чем в 5 раз выше и составляла •см". Наблюдаемые константы Михаэлиса совпадали

для обоих электродов и находились в области 16.0 ± 1.5 мкМ. Пределы обнаружения также совпадали и равнялись 1 мкМ, что позволяет проводить определение низких концентраций лактозы, в том числе в сильно разбавленных растворах.

< в

0 5-

0 0-

-□- графит -•- полианилин

-200 0 200 400

Е, мВ отн. Х.С.Э. (0.1МКС1)

Рис. 13. Зависимость тока окисления 1мМ лактозы от потенциала для электрода, полученного на основе ЦЦГ из МлНегторЫ1ит.

20 40 60 80 100 С (лактоза), мкМ

Рис. 14. Градуировочные графики, полученные при 0 мВ.

Медиаторный биоэлектрокатализ не требует коммуникации электрон-транспортной цепи фермента и электрода, поэтому по его току можно оценить общую концентрацию активного фермента на поверхности. В присутствии бензохинона в качестве низкомолекулярного медиатора ток был примерно в 3 раза выше, чем для прямого биоэлектрокатализа. При этом в случае электродов с ЦЦГ, иммобилизованной на полианилин, ток в присутствии бензохинона был не выше тока, полученного для ЦДГ, адсорбированной на чистый электрод. Из этого следует, что количество ЦДГ на электроде с полианилином не превышает количество фермента на чистом электроде, в то время как ток прямого биоэлектрока-

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3 0 Рис. 15. Операционная стабильность ферментных электродов, исследованная в постоянном потоке 1мМ лактозы при 0 мВ для ЦЦГ, иммобилизованной на полианилин, и при +300 мВ для ЦДГ на немодифицированном электроде.

тализа при 0 мВ как минимум в 5 раз выше на модифицированном электроде. Таким образом, с применением полианилина удается достигнуть в 5 раз более высокой эффективности биоэлектрокатализа при одновременном уменьшении рабочего потенциала.

Важным свойством ферментных электродов является операционная стабильность. Её исследование проводили в постоянном потоке 1мМ лактозы в течение нескольких часов. Электрод на основе полианилина за 2 ч потерял лишь около 13 % от начального тока, а за 3 ч менее 20 % (Рис. 15). В случае фермента, иммобилизованного на чистую графитовую пасту, стабильность была значительно хуже - электрод уже за 2 ч терял более 50% от начального тока.

Благодаря высокой чувствительности к лактозе сенсоры на основе прямого биоэлектрокатализа ЦЦГ можно использовать для анализа молочных продуктов. Определение лактозы в молоке (Домик в деревне» 1% жирности проводили двумя способами. Первым способом из молока предварительно получали сыворотку, осаждая белок концентрированной уксусной кислотой и отделяя осадок центрифугированием, после чего сыворотку разбавляли в 104 раз буфером и проводили определение лактозы с помощью биосенсора. Вторым способом в 104 раз буфером разбавляли непосредственно молоко, после чего анализировали. В результате было найдено 5.2 и 5.6 г лактозы на 100 г молока соответственно, что было близко к значению 4.8 г, указанному производителем. Возможность точного определения лактозы в молоке без отделения сыворотки значительно упрощает процесс анализа.

Таким образом, за счет модификации поверхности полианилином достигнуты в 5 раз более высокие токи биоэлектрокатализа при одновременном уменьшении рабочего потен-

циала электрода до 0 мВ. Также в случае фермента, иммобилизованного на полианилин, показана высокая операционная стабильность электродов. Изготовленные биосенсоры на основе ЦЦГ можно использовать для безреагентного определения лактозы в молоке без стадии получения сыворотки.

Однако максимальные плотности токов, достигнутые на планарных электродах, были как минимум на порядок меньше токов получаемых на графите, а увеличение уровня шумов в результате модификации и резкая зависимость тока от потенциала ограничивало возможности применения электродов с полианилином. Для повышения сорбционной ёмкости и улучшения проводящих свойств полианилина изготовили электроды с включением УНТ в полимер. Для этого проводили электрохимический синтез полимера либо в присутствии УНТ, либо поверх предварительно адсорбированных УНТ. Иммобилизация ЦЦГ из £). яаиЫепеШ на поверхности обоих типов электродов приводила к появлению токов электрокаталитического окисления лактозы, превосходящих в 4-5 раз токи прямого биоэлектрокатализа на электродах, модифицированных УНТ (рис. 16), и более чем в 10 раз токи прямого биоэлектрокатализа на немодифицированных электродах. При этом отклики на лактозу мало зависели от потенциала в широком диапазоне его значений, а уровень шума на электродах с полианилином оказался примерно в 2 раза меньше, чем на электродах с УНТ.

Таким образом, с использованием композитов полианилина с УНТ удалось создать ферментные электроды для электроокисления лактозы, характеризующиеся рекордно высокими токами биоэлектрокатализа ЦЦГ, востребованные для разработки новых биосенсоров и биотопливных элементов.

Е, мВ отн. х.с.э. (0.1МКС1)

Рис. 16. Зависимость тока окисления 1мМ лактозы от приложенного потенциала для электрода на основе ЦЦГ из О. ¡аиЬгепеШ.

выводы

1. Разработаны стабильные и воспроизводимые электроды, экранированные тонким слоем органического растворителя. Системы обладали чувствительностью к концентрации и природе редокс-неактивных ионов, что обуславливало их применимость для регистрации биополимеров.

2. Создан безреагентный электрохимический ДНК-сенсор с пределом обнаружения МО"8 M и линейным диапазоном МО"8- 5-10'7М. Сенсор обладал высокой селективностью, позволяющей зарегистрировать точечную мутацию. По своим аналитическим характеристикам разработанный ДНК-сенсор превосходил датчики на основе поверхностного плазмонного резонанса и кварцевых микровесов.

3. Зарегистрирована электроактивность белков, не содержащих редокс-активных групп. Показано, что наблюдаемая электроактивность является результатом экстракции белков в органический растворитель. Чувствительность при регистрации белков достигала 5 A/M, а селективность определялась специфичностью их экстракции.

4. Предложен новый подход для регистрации образования аффинного комплекса, основанный на модификации электрода покрытием с системой наноразмерных пор. С использованием этого подхода создан аптасенсор на тромбин.

5. Показано увеличение эффективности прямого биоэлектрокатализа ЦЦГ за счет модификации поверхности электрода электроактивным полимером, нанотрубками и их композитом. При этом достигнуты в 5 раз более высокие токи окисления субстрата при уменьшении потенциала рабочего электрода до 0 мВ. Показана более высокая операционная стабильность ферментных электродов на основе полианилина. Продемонстрирована возможность использования биосенсора на основе ЦДГ для анализа лактозы в реальных объектах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. M.Yu. Vagin, S.A. Trashin. G.P. Karpachova, N.L. Klyachko, A.A. Karyakin. Protein extracting electrodes: Insights in the mechanism // Journal of Electroanalytical Chemistry, 2008, v. 623(1), p. 68-74.

2. C.A. Трашин. М.Ю. Вагин, Г.П. Карпачева, С.Ж. Озкан, А.А. Карякин. Новый метод электрохимической регистрации белков и нуклеиновых кислот // Нано- и микросистемная техника, 2008, т. 8, с. 49-54.

3. M.Yu. Vagin, S.A. Trashin. А.А. Karyakin, M. Mascini. Label-free detection of DNA hybridization at a liquid | liquid interface // Analytical Chemistry, 2008, v. 80, p. 1336-1340.

4. M.Yu. Vagin, S.A. Trashin. S.Zh. Ozkan, G.P. Karpachova, A.A. Karyakin. Electroactivity of redox-inactive proteins at liquid|liquid interface // Journal of Electroanalytical Chemistry, 2005, v. 584(2), p. 110-116.

5. S.A. Trashin. M.Yu. Vagin, A.A. Karyakin. Electrochemical detection of proteins by electrode shielded with liquid layer // 4th European Summer School on Electrochemical Engineering (ESSEE), September 17-22, 2006, Palic, Serbia and Montenegro. Abstracts p. 38.

6. S.A. Trashin. M.Yu. Vagin, A.A. Karyakin. Electrochemical detection of protein transfer through liquid|liquid interface // 57th Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry, August 27-September 1, 2006, Edinburgh, United Kingdom. Abstracts S6-P-30.

7. S A. Trashin. M.Yu. Vagin, A.A. Karyakin. Electrochemical detection of proteins by liquid | liquid interface // International congress on analytical sciences (ICAS), June 25-30, 2006, Moscow. Abstracts 3-P19.

8. M.Yu. Vagin, S A. Trashin. M. Mascini, A.A. Karyakin. DNA primary sequence detection by means of electrochemistry on liquid|liquid interface // International congress on analytical sciences (ICAS), June 25-30,2006, Moscow. Abstracts 3-P18.

9. S.A. Trashin. M.Yu. Vagin, A.A. Karyakin. Electrochemical detection of biomolecules by electrode shielded with liquid layer //11th International Conference on Electroanalysis (ESEAC), June 11-15, 2006, Bordeaux, France. Abstracts Pl-033.

10. Трашин C.A.. Вагин М.Ю., Карякин A.A. Регистрация взаимодействий ДНК при помощи границы раздела несмешивающихся жидкостей // Международная конференция молодых учёных «ЛОМОНОСОВ - 2006», 12-15 апреля, 2006, Москва. Тезисы докладов с. 48.

11. Trasliin S.A.. Vagin M.Yu., Karyakin A.A. Electrochemical detection of biomolecules using electrode shielded with thin liquid layer // International Summerschool in Bremen "Biosensing with channels' faster, smaller, smarter", July 28 - August 4, Bremen, Germany, 2005. Abstracts on CD.

12. Трашин C.A.. Вагин М.Ю. Электрохимическое определение редокс-неактивных белков при помощи границы раздела несмешивающихся жидкостей // Международная конференция молодых учёных «ЛОМОНОСОВ - 2007», 11- 14 апреля, 2007, Москва, Материалы докладов на CD (http://www.lomonosov-msu.ru/2007/).

13. Трашин С.А.. Вагин М.Ю. Электрохимическое определение редокс-неактивных белков при помощи электрода с тонким слоем органической жидкости // II Всероссийская конференция по аналитической химии с международным участием, 7-12 октября, 2007, Туапсе. Материалы конференции с. 102.

14. S. Trashin. М. Vagin. Electroanalys of redox-inactive proteins by liquid film-modified electrodes // NATO Advanced Study Institute. Sensors for Environment, Health and Security: Advanced Materials and Technologies, September 16-27, 2007, Vichy, France. Abstracts p.l 15.

15. И.А. Большаков, A.B. Борисова, М.Ю. Вагин, О.Г. Воронин, Н.А. Вавилова, А.А. Карякин, Е.Е. Карякина, С.В. Морозов, С.А. Трашин. Е.И. Яшина. Биокаталитические системы для создания биосенсорных технологий // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы», 6-7 декабря, 2007, Москва.

16. С.А. Трашин. А.А. Карякин. Разработка нового биосенсора на лактозу на основе прямого биоэлектрокатализа // Международная научно-практическая конференция биотехнология. Вода и пищевые продукты, 11-13 марта, 2008, Москва. S.3.25.

17. S.A. Trashin. D.V. Vinogradova, А.А. Karyakin, L. Gorton. Direct bioelectrocatalysis by cellobiose dehydrogenase on polyaniline and polyazine modified electrodes // International Conference on Electrochemical Sensors, October 5-10, 2008, DobogokO, Hungary. Abstracts p. 92.

Заказ № 93/11/08 Подписано в печать 12.11.2008 Тираж ISO экз. Усл. п.л. 1,25

^ ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 <7 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Трашин, Станислав Александрович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Биосенсоры

2.1.1. Принципы и определения

2.1.2. Классификация по типу трансдьюсера

2.1.3. Классификация по типу распознающего элемента

2.2. Методы иммобилизации ДНК зонда

2.3. Сенсоры для прямого определения белков и нуклеиновых кислот

2.3.1. Метод плазмонного резонанса

2.3.2. Трансдьюссеры на основе пьезокристаллов

2.3.3. Электрохимические методы

2.4. Границы раздела несмешивающихся жидкостей

2.4.1. Общие положения

2.4.2. Строение и свойства ГРНЭ

2.4.3. Равновесия на границе двух жидкостей

2.4.4. Термодинамическое описание. Уравнения Нернста

2.4.5. Поляризация границы несмешивающихся растворов электролитов

2.4.6. Кинетика переноса иона

2.4.7. Индуцированный перенос ионов

2.4.8. Адсорбция органических молекул на ГРНЭ

2.5. Граница раздела водной фазы и тонкой жидкой плёнки органического растворителя

Введение диссертация по химии, на тему "Безреагентные биосенсоры на основе электрохимических реакций в гетерогенных системах"

Одним из перспективных направлений в электроанализе является использование границы раздела несмешивающихся жидкостей для регистрации редокс-неактивных ионов . Белки и нуклеиновые кислоты содержат заряженные группы и могут быть рассмотрены в качестве полиэлектролитов. В связи с этим представляется возможным их детектирование на границе раздела несмешивающихся жидкостей.

По принципу безреагентного анализа работают также биосенсоры третьего поколения, то есть амперометрические сенсоры на основе биоэлектрокатализа с прямым обменом электрона между активным центром фермента и электродом. Это явление, открытое советскими учеными три десятилетия назад, в настоящее время интенсивно исследуют в связи с выделением новых типов оксидоредуктаз, развитием методов биоинженерии и созданием новых электродных материалов. Модификация поверхности имеет большое значение для повышения эффективности биоэлектрокатализа за счет облегчения коммуникации активного центра фермента с электродом.

Целью работы являлось создание безреагентных биосенсоров для регистрации белков и нуклеиновых кислот на основе электродов, чувствительных к физико-химическим процессам на границах раздела фаз, а также создание лактозного биосенсора на основе высокоэффективного прямого биоэлектрокатализа ЦДГ. В поставленные задачи входило:

- разработка высокостабильных и воспроизводимых электродов с поляризуемой границей раздела несмешивающихся жидкостей, предназначенных для регистрации биомолекул; создание безреагентного ДНК-сенсора на основе ДНК-зонда, иммобилизованного на границе раздела несмешивающихся жидкостей; получение и исследование электрохимической системы, чувствительной к экстракции белка из воды в органический растворитель;

- регистрация биоаффинного взаимодействия1 на электроде, модифицированном инертным полимером с системой наноразмерных пор, и создание аптасенсора на тромбин; изучение прямого биоэлектрокатализа целлобиозодегидрогеназами и повышение его эффективности за счет модификации поверхности электрода редокс-активными полимерами с целью получения более стабильных и чувствительных сенсоров на лактозу.

Научная новизна и практическая ценность работы. Создан безреагентный ДНК-сенсор на основе принципиально нового подхода - иммобилизации ДНК-зонда на границе раздела несмешивающихся жидкостей. Аналитические характеристики сенсора превосходили описанные в литературе. В частности, минимальная регистрируемая концентрация составила 1 • 10"8 M, а селективность по отношению к последовательности нуклеотидов позволила зарегистрировать точечную мутацию, то есть замену одного азотистого основания другим. Сенсор может быть изготовлен простым и дешевым способом.

Впервые показано увеличение эффективности биоэлектрокатализа целлобиозодегид-рогеназой за счет модификации электрода полианилином, а также полианилином с включенными углеродными нанотрубками. На основе модифицированных электродов созданы безреагентные биосенсоры на лактозу, обладающие на порядок улучшенными значениями чувствительности и операционной стабильности. Полученные биосенсоры могут быть востребованы в пищевой промышленности для анализа лактозы в сложных матрицах.

Заключение диссертации по теме "Катализ"

выводы

2. Создан безреагентный электрохимический ДНК-сенсор с пределом обнаружения о Я 7

1-10' M и линейным диапазоном 1-10" -5-10" М. Сенсор обладал высокой селективностью, позволяющей зарегистрировать точечную мутацию. По своим аналитическим характеристикам разработанный ДНК-сенсор превосходил датчики на основе поверхностного плазмонного резонанса и кварцевых микровесов.

5. Показано увеличение эффективности прямого биоэлектрокатализа ЦДГ за счет модификации поверхности электрода электроактивным полимером, нанотрубками и их композитом. При этом достигнуты в 5 раз более высокие токи окисления субстрата при уменьшении потенциала рабочего электрода до 0 мВ. Показана более высокая операционная стабильность ферментных электродов на основе полианилина. Продемонстрирована возможность использования биосенсора на основе ЦДГ для анализа лактозы в реальных объектах.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Трашин, Станислав Александрович, Москва

1. Э. Тернер, Биосенсоры: основы и приложения, ed. Э. Тернер, И. Карубе и Д. Уилсон. 1992, М.: Мир.

2. D.R. Thevenot, К. Toth, R.A. Durst, G.S. Wilson. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification // Pure and Applied Chemistry. -1999.-V.17(12).-P.2333.

3. S.M. Borisov, O.S. Wolfbeis. Optical biosensors // Chemical Review. -2008.-V. 108(2).-P.423.

4. A.A. Karyakin, Encyclopedia of sensors. Biosensors based on conductive polymers and electroactivepolycrystals. . 2006: Am. Sei. Publ. 329-351.

5. M.A. Cooper, V.T. Singleton. A survey of the 2001 to 2005 quartz crystal microbalance biosensor literature: applications of acoustic physics to the analysis of biomolecular interactions // Journal of molecular recognition. -2007.-V.20.-P. 154.

6. K. Länge, B.E. Rapp, M. Rapp. Surface acoustic wave biosensors: a review // Analytical and bioanalytical chemistry. -2008.-V.391.-P.1509.

7. J. Fritz. Cantilever biosensors // Analyst. -2008.-V.133.-P.855.

8. A. Heller, B. Feldman. Electrochemical glucose sensors and their applications in diabetes management // Chemical review. -2008.-V.108.-P.2482-2505.

9. N. Nikolaus, В. Strehlitz. Amperometric lactate biosensors and their application in (sports) medicine, for life quality and wellbeing // Microchim Acta. -2008.-V.160.-P. 1555.

10. T.M.-H. Lee. Over-the-counter biosensors: past, present, and future // Sensors. -2008.-V.8.-P.5535.

11. D. Hernandez-Santos, M. Diaz-Gonzalez, M.B. Gonzalez-Garcia, A. Costa-Garcia. Enzymatic genosensor on streptavidin-modifled screen-printed carbon electrodes // Analytical chemistry. -2004.-V.76(23).-P.6887.

12. N.C. Tansil, H. Xie, F. Xie, Z. Gao. Direct detection of DNA with an electrocatalytic threading intercalator// Analytical chemistry. -2005.-V.77.-P.126-134.

13. M. Steichen, C. Buess-Herman. Electrochemical detection of the immobilization and hybridization of unlabeled linear and hairpin DNA on gold // Electrochemistry Communications. -2005.-V.7.-P.416-420.

14. V. Laitala, A. Ylikoski, H.-M. Raussi, P. Ollikka, I. Hemmila. Time-resolved detection probe for homogeneous nucleic acid analyses in one-step format // Analitical biochemistry. -2007.-V.361 .-P. 126.

15. M.T. Castaneda, A. Merkocui, M. Pumera, S. Alegret. Electrochemical genosensors for biomedical applications based on gold nanoparticles // Biosensors & bioelectronics. -2007.-V.22.-P. 1961.

16. H. Cai, Y.Q. Wang, P.G. He, Y.H. Fang. Electrochemical detection of DNA hybridization based on silver-enhanced gold nanoparticle label // Analytica chimica acta. -2002.-V.469.-P.165.

17. X.C. Zhou, L.Q. Huang, S.F.Y. Li. Microgravimetric DNA sensor based on quartz crystal microbalance: comparison of oligonucleotide immobilization methods and the application in genetic diagnosis // Biosensors and bioelectronics. -2001.-V.16.-P.85.

18. F. Azek, C. Grossiord, M. Joannes, B. Limoges, P. Brossier. Hybridization assay at a disposable electrochemical biosensor for the attomole detection of amplified human cytomegalovirus DNA // Analitical biochemistry. -2000.-V.284.-P. 107.

19. J. Wang, G. Rivas, J.R. Femandes, J.L.L. Paz, M. Jiang, R. Waymire. Indicator-free electrochemical DNA hybridization biosensor // Analytica chimica acta. -1998.-V.375.-P.197.

20. T.M. Heme, M.J. Tarlov. Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces //J. Am. Chem. Soc. -1997.-V.119.-P.8916-8920.

21. D.-H. Jung, B.H. Kim, Y.K. Ko, M.S. Jung, S.K. Jung, S.Y. Lee, H.-T. Jung. Covalent attachment and hybridization of DNA oligonucleotides on patterned single-walled carbon nanotube films // Langmuir. -2004.-V.20.-P.8886.

22. H. Gu, X.D. Su, K.P. Loll. Electrochemical Impedance Sensing of DNA Hybridization on Conducting Polymer Film-Modified Diamond // The journal of physical chemistry B. -2005.-V.109.-P.13611.

23. Y.-D. Zhao, D.-W. Pang, S. Hu, Z.-L. Wang, J.-K. Cheng, H.-P. Dai. DNA-modified electrodes; part 4: optimization of covalent immobilization of DNA on self-assembled monolayers // Talanta. -1999.-V.49.-P.751.

24. B.P. Corgier, C.A. Marquette, L. Blum. Direct electrochemical addressing of immunoglobulins: Immuno-chip on screen-printed microarray // Biosensors and bioelectronics. -2007.-V.22.-P. 1522.

25. S. Cosnier. Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electrochemically polymerized films. A review // Biosensors and bioelectronics. -1999.-V.14.-P.443.

26. H. KorriYoussoufi, F. Gamier, P. Srivastava, P. Godillot, A. Yassar. Toward bioelectronics: Specific DNA recognition based on an oligonucleotide-functionalized polypyrrole // JACS. -1997.-V.119(31).-P.7388.

27. A. Ramanaviciene, A. Ramanavicius. Pulsed amperometric detection of DNA with an ssDNA/polypyrrole-modified electrode // Analytical and bioanalytical chemistry. -2004.-V.79(2).-P.287.

28. C.D. Riccardi, H. Yamanaka, M. Josowicz, J. Kowalik, B. Mizaikoff, C. Kranz. Labelfree DNA detection based on modified conducting polypyrrole films at microelectrodes // Analytical chemistry. -2006.-V.78 (4).-P.1139.

29. F. Davis, A.V. Nabok, S.P.J. Higson. Species differentiation by DNA-modified carbon electrodes using an ac impedimetric approach // Biosensors and bioelectronics. -2005.-V.20.-P.1531.

30. K. Krishnamoorthy, R.S. Gokhale, A.Q. Contractor, A. Kumar. Novel label-free DNA sensors based on poly(3,4-ethylenedioxythiophene) // Chemical communications. -2004.-V.7.-P.820.

31. A. Dupont-Filliard, A. Roget, T. Livache, M. Billon. Reversible oligonucleotide immobilisation based on biotinylated polypyrrole film // Analytica chimica acta. -2001.-V.449.-P.45.

32. J. Homola. Surface plasmon resonance sensors for detection of chemical and biological species // Chemistry review. -2008.-V.108.-P.462.

33. V. Silin, A. Plant. Biotechnological applications of surface plasmon resonance // Trends Biotechnol. -1997.-V.15(9).-P.353-359.

34. A. Otto. Excitation of nonradiative surface plasma waves in silver by method of frustrated total reflection // Zeitschrift fur physik. -1968.-V.216.-P.398.

35. C.K. O'Sullivan, G.G. Guilbault. Commercial quartz crystal microbalances theory and applications // Biosensors and bioelectronics. -1999.-V.14(8-9).-P.663.

36. K.A. Marx. Quartz crystal microbalance: A useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution-surface interface // Biomacromolecules. -2003.-V.4(5).-P.1099.

37. S. Bruckenstein, M. Shay. Experimental aspects of use of the quartz crystal microbalance in solution // Electrochimica acta. -1985.-V.30(10).-P.1295.

38. J. Rickert, A. Brecht, W. Gopal. QCM operation in liquids: Constant sensitivity during formation of extended protein multilayers by affinity // Analytical chemistry. -1997.-V.69(7).-P.1441.

39. H. Matsuura, F. Mizutani, Y. Hasebe, S. Uchiyama. Study on a highly sensitive determination method for protein in aqueous solution using a quartz-crystal microbalance // Bunseki kagaku. -2001.-V.50(12).-P.903.

40. F. Patolsky, A. Lichtenstein, I. Willner. Amplified microgravimetric quartz-crystal-microbalance assay of DNA using oligonucleotide-functionalized liposomes or biotinylated liposomes // JACS. -2000.-V.122.-P.418.

41. I. Willner, F, Patolsky, Y. Weizmann, B. Willner. Amplified detection of single-base* mismatches in DNA using microgravimetric quartz-crystal-microbalance transduction // Talanta. -2002.-V.56.-P.847.

42. X.L. Mao, L.J. Yang, X.L. Su, Y.B. Li. A nanoparticle amplification based quartz crystal microbalance DNA sensor for detection of Escherichia coli 0157:H7 // Biosensors and bioelectronics. -2006.-V.21.-P.1178.

43. E. Kim, K. Kim, H. Yang, Y.T. Kim, J. Kwak. Enzyme-amplified electrochemical detection of DNA using electrocatalysis of ferrocenyl-tethered dendrimer // Analytical chemistry.-2003.-V.75(21).-P.5665.

44. E. Palecek, S. Billova, L. Havran, R. Kizek, A. Miculkova, F. Jelen. DNA hybridization at microbeads with cathodic stripping voltammetric detection // Talanta. -2002.-V.56(5).-P.919.

45. J. Wang. Nanoparticle-based electrochemical DNA detection // Analytica chimica acta. -2003.-V.500(l-2).-P.247.

46. E. Palecek. Oscillographic polarography of highly polymerized deoxyribonucleic acid // Nature.-1960.-V.188.-P.656.

47. G. Chiti, G. Marrazza, M. Mascini. Electrochemical DNA biosensor for environmental monitoring // Analytica chimica acta. -2001.-V.427(2).-P.155.

48. F. Lucarelli, A. Kicela, I. Palchetti, G. Marrazza, M. Mascini. Electrochemical DNA biosensor for analysis of wastewater samples // Bioelectrochemistry. -2002.-V.58(l).-P.113.

49. J. Wang, A.J. Bard. Monitoring DNA Immobilization and Hybridization on Surfaces by Atomic Force Microscopy Force Measurements // Anal. Chem. -2001.-V.73.-P.2207-2212.

50. K. Kerman, Y. Morita, Y. Takamura, E. Tamiya. Label-free electrochemical detection of DNA hybridization on gold electrode // Electrochemistry communications. -2003.-V.5.-P.887.

51. K. Kerman, D. Ozkan, P. Kara, A. Erdem, B. Meric, P.E. Nielsen, M. Ozsoz. Label-free bioelectronic detection of point mutation by using peptide nucleic acid probe // Electroanalysis. -2003.-V.25(7).-P.667.

52. M. Vestergaard, K. Kerman, E. Tamiya. An overview of label-free electrochemical protein sensors // Sensors. -2007.-V.7.-P.3442.

53. F.A. Armstrong, Bioelectrochemisrty, ed. G.S. Wilson. 2002: Wiley-VCH: Weinheim. 11-29.

54. M. Tomschik, L. Havran, M. Fojta, E. Palecek. Constant current chronopotentiometric stripping analysis of bioactive peptides at mercury and carbon Electrodes. // Electroanalysis. -1988.-V. 10.-P.403.

55. J.A. Reynaud, B. Malfoy, A. Bere. The electrochemical oxidation of three proteins: RNAase A, bovine serum albumin and concanavalin A at solid electrodes // Journal of electroanalytical chemistry. -1980.-V.116.-P.595.

56. V. Brabec, I. Schindlerova. Electrochemical behaviour of proteins at graphite electrodes. // Bioelectrochemistry and bioenergetics. -1981.-V.8.-P.451.

57. K. Kerman, M. Vestergaard, M. Chikae, S. Yamamura, E. Tamiya. Label-free electrochemical detection of phosphorylated and non-phosphorylated forms of peptides based on tyrosine oxidation. // Electrochemistry communications. -2007.-V.9.-P.976.

58. M. Vestergaard, K. Kerman, M. Saito, N. Nagatani, Y. Takamura, E. Tamiya. A rapid label-free electrochemical detection and kinetic study of alzheimer's amyloid beta aggregation //JACS. -2005.-V.127.-P.11892.

59. E. Souteyrand, J.P. Cloarec, J.R. Martin, C. Wilson, I. Lawrence, S. Mikkelsen, M.F. Lawrence. Direct detection of the hybridization of synthetic homo-oligomer DNA sequences by field effect // The journal of physical chemistry B. -1997.-V.101.-P.2980.

60. B. Pejcic, R. De Marco. Impedance spectroscopy: Over 35 years of electrochemical sensor optimization // Electrochimica Acta. -2006.-V.51.-P.6217.

61. C. Gautier, C. Cougnon, J.F. Pilard, N. Casse. Label-free detection of DNA hybridization based on EIS investigation of conducting properties of fiinctionalized polythiophene matrix // Journal of electroanalytical chemistry. -2006.-V.587.-P.276.

62. J. Travas-Sejdic, H. Peng, P.A. Kilmartin, M.B. Cannell, G.A. Bowmaker, R.P. Cooney, C. Soeller. Label-free electrochemical DNA sensor based on functionalised conducting copolymer // Synthetic metals. -2005.-V.152.-P.37.

63. Y. Fu, R. Yuan, Y. Chai, L. Zhou, Y. Zhang. Coupling of a Reagentless Electrochemical DNA Biosensor with Conducting Polymer Film and Nanocomposite as Matrices for the Detection of the HIV DNA Sequences // Analytical letters. -2006.-V.39.-P.467.

64. Z. Li, Y. Chen, X. Li, T.I. Kamins, K. Nauka, R.S. Williams. Sequence-specific labelfree DNA sensors based on silicon nanowires // Nano Letters. -2004.-V.4.-P.245.

65. Z. Gao, A. Agarwal, A. Trigg, N. Singh, C. Fang, C.-H. Tung, Y. Fan, K.D. Buddharaju, J. Kong. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA // Analytical chemistry.-2007.-V.79.-P.3291.

66. W. Nernst. Uber die loslichkeit von mischkrystallen // Z.Phys.Chem. -1892.-V.9.-P.137-140.

67. V.E. Baur. Ein modell des elektrischen organs der fische // Zeitschrift fur elektrochemie. -1913.-V. 19.-P.590-592.

68. J. Koryta, P. Vanysek, M. Brezina. Electrolysis with an electrolyte dropping electrode // J. Electroanal. Chem. -1976.-V.67(2).-P.263.

69. Z. Samec. Electrochemistry at the interface between two immiscible electrolyte solutions (IUPAC Technical Raport) // Pure Appl. Chem. -2004.-V.76(12).-P.2147-2180.

70. M.A. Leich, G.L. Richmond. Recent experimental advances in studies of liquid/liquid interfaces // Faraday Discuss. -2005.-V.129.-P.1-21.

71. J.M. Kovaleski, M.J. Wirth. Lateral diffusion of acridine orange at liquid hydrocarbon/water interfaces // J. Phys. Chem. -1995.-V.99.-P.4091-4095.

72. G.M. Luo, S. Malkova, S.V. Pingali, D.G. Schultz, B.H. Lin, M. Meron, I. Benjamin, P. Vanysek, M.L. Schlossman. Structure of the interface between two polar liquids: Nitrobenzene and water // Journal of physical chemistry B. -2006.-V.110(10).-P.4527.

73. T. Kakiuchi. Limiting behavior in equilibrium partitioning of ionic components in liquidliquid two-phase systems // Analytical chemistry. -1996.-V.68(20).-P.3658-3664.

74. F. Reymond, D. Fermin, H.J. Lee, H.H. Girault. Electrochemistry at liquid/liquid interfaces: methodology and potential applications // Electrochimica acta. -2000.-V.45(15-16).-P.2647.

75. A.N. Frumkin. // Dokl. Acad. Nauk SSSR. -1952.-V.85.-P.373.

76. T. Kakiuchi, T. Kondo, M. Kotani, M. Senda. Ion permeability of dilauroylphosphatidylethanolamine monolayer at the polarized nitrobenzene/water interface // Langmuir. -1992.-V.8(1).-P.169-175.

77. J.A. Manzanares, R.M. Allen, K. Kontturi. Enhanced ion transfer rate due to the presence of zwitterionic phospholipid monolayers at the ITIES // J. Electroanal. Chem. -2000.-V.483(l-2).-P.188-196.«

78. T. Kakiuchi. Potential-dependent adsorption and partitioning of ionic components at a liquid liquid interface // J. Electroanal. Chem. -2000.-V.496(l-2).-P.137-142.'.

79. R.A. Iglesias, S.A. Dassie, A.M. Baruzzi. Adsorption of phenosafranin at the water vertical bar 1,2-DCE interface: a voltammetric approach // J. Electroanal. Chem. -2000.-V.483(l-2).-P.157-162.

80. G.P. Luis, M.J. ValenciaGonzalez, M.E. DiazGarcia. Enzymes in reverse micellar media // Anales de quimica. -1996.-V.92(5).-P.312-319.

81. T.K. De, A. Maitra. Solution behaviour of Aerosol OT in non-polar solvents // Adv. Colloid Interface Sci. -1995.-V.59.-P.95-193.

82. B.A. Andrews, D.L. Pyle, J.A. Asenjo. The effects of pH and ionic strength on the partitioning of four proteins in reverse micelle systems // Biotechnol. Bioeng. -1994.-V.43.-P. 1052-1058.

83. A. Shioi, M. Harada, H. Takahashi, M. Adachi. Protein Extraction in a Tailored Reversed Micellar System Containing Nonionic Surfactants // Langmuir. -1997.-V.13.-P.609-619.

84. V.M. Paradkar, J.S. Dordick. Mechanism of extraction of chymotrypsin into isooctane at very-low concentrations of aerosol ot in the absence of reversed micelles // Biotechnol. Bioeng. -1994.-V.43(6).-P.529-540.

85. B.D. Kelley, D.I.C. Wang, T.A. Hatton. Affinity-based reversed micellar protein extraction: II. Effect of cosurfactant tail length // Biotechnol. Bioeng. -1993.-V.42.-P.1209-1217.

86. B.D. Kelley, D.I.C. Wang, T.A. Hatton. Affinity-based reversed micellar protein extraction: I. Principles and protein-ligand systems // Biotechol. Bioeng. -1993.-V.42.-P.l 199-1208.

87. J.M. Woll, T.A. Hatton, M.L. Yarmush. Bioaffinity separations using reversed micellar extraction // Biotechnol. Prog. -1989.-V.5(2).-P.57-62.

88. A.J. Storm, C. Storm, J. Chen, H. Zandbergen, J.-F. Joanny, C. Dekker. Fast DNA Translocation through a Solid-State Nanopore 11 Nano letters. -2005.-V.5(7).-P.l 1931197.

89. J. Niedziolka, E. Rozniecka, J. Chen, M. Opallo. Changing the direction of ion transfer across o-nitrophenyloctyletherjwater interface coupled to electrochemical redox reaction // Electrochemistry Communications. -2006.-V.8.-P.917-921.

90. S. Amemiya, X. Yang, T.L. Wazenegger. Voltammetry of the phase transfer of polypeptide protamines across polarized liquid/liquid interfaces // J. Am. Chem. Soc. -2003.-V.125.-P.11832.

91. A.A. Karyakin, M.Y. Vagin, S.Z. Ozkan, G.P. Karpachova. Thermodynamics of ion transfer across the liquidjliquid interface at a solid electrode shielded with a thin layer of organic solvent // Journal of physical chemistry B. -2004.-V.108.-P.11591.

92. M. Shinshi, Т. Sugihara, Т. Osakai, М. Goto. Electrochemical Extraction of Proteins by Reverse Micelle Formation // Langmuir. -2006.-V.22.-P.5937-5944.

93. L.C. Clark, C. Lyons. Electrode system for continous monitoring in cardiovascular surgery // Ann. NY Acad. Sci. -1962.-V.102:-P.29.

94. K.P. Volkl, N. Opitz, D.W. Lubbers. Continuous measurement of concentrations of alcohol using a fluorescence-photometric enzymatic method // Fresenius zeitschrift fur analytische chemie. -1980.-V.301(2).-P.162.

95. S.R. Betso, M.H. Klapper, L.B. Anderson. Electrochemical studies of heme proteins. Coulometric, polarographic and combined spectroelectrochemical methods for reduction of the heme prostetic group in cytochrome с // JACS. -1972.-V.94.-P.8197.

96. M.J. Eddowes, H.A.O. Hill. A novel method for investigation of the electrochemistry of metalloproteins: cytochrome с // Journal of the chemical society-chemical communications. -1977.-V.21.-P.771.

97. P.M. Allen, H. Allen, O. Hill, N.J. Walton. Surface modifiers for the promotion of direct electrochemistry of cytochrome с // J. Electroanal. Chem. -1984.-V.178.-P.69-86.

98. L. Gorton, A. Lindgren, T. Larsson, F.D. Munteanu, T. Ruzgas, I. Gazaryan. Direct electron transfer between heme-containing enzymes and electrodes as basis for third generation biosensors // Analytica chimica acta. -1999.-V.400.-P.91.

99. H.A.O. Hill, N.J. Walton, I.J. Higgins. Electrochemical reduction of dioxygen using a terminal oxidase // FEBS Letters. -1981.-V.126.-P.282.

100. И.В. Березин, В.А. Богдановская, С.Д. Варфоломеев, М.Р. Тарасевич, А.И. Ярополов, Биоэлектрокатализ. Равновесный кислородный потенциал в присутствии лакказы. //Докл. АН СССР. -1978.-V.240.-P.615.

101. I.V. Berezin, S.D. Varfolomeev, M.V. Lomonosov. Principles of bioelectrocatalysis // Enzyme Eng. -1980.-V.5.-P.95-100.

102. М.Р. Тарасевич, B.A. Богдановская, В.С.Б. (ред.). Биоэлектрокатализ. Ферменты как катализаторы электрохимических реакций. В: Проблемы электрокатализа. // Москва, Наука. -1980.-Р.234-67.

103. S. Shleev, A. Jarosz-Wilkolazka, A. Khalunina, О. Morozova, A. Yaropolov, Т. Ruzgas, L. Gorton. Direct electron transfer reactions of laccases from different origins on carbon electrodes // Bioelectrochemistry. -2005.-V.67(l).-P.l 15.

104. S. Tsujimura, Т. Nakagawa, К. Капо, Т. Ikeda. Kinetic study of direct bioelectrocatalysis of dioxygen reduction with bilirubin oxidase at carbon electrodes // Electrochemistry. -2004.-V.72(6).-P.437.

105. S. Shleev, J. Tkac, A. Christenson, T. Ruzgas, A.I. Yaropolov, J.W. Whittaker, L. Gorton. Direct electron transfer between copper-containing proteins and electrodes // Biosensors and bioelectronics. -2005.-V.20(12).-P.2517.

106. А.И. Ярополов, В. Маловик, С.Д. Варфоломеев, И.В. Березин. Электровосстановление пероксида водорода на электроде с иммобилизованной пероксидазой // Докл. АН СССР. -1979.-V.249.-P.1399-401.

107. А.И. Ярополов, А.А. Карякин, С.Д. Варфоломеев. Биоэлектрокатализ феномен ускорения ферментами электродных процессов // Вестник МГУ. -1983.-V.24.-P.523-35.

108. А.И. Ярополов, А.А. Карякин, И.Н. Гоготов, Н.А. Зорин, С.Д. Варфоломеев, И.В. • Березин. Биоэлектрокатализ. Механизм окисления молекулярного водорода наэлектроде с иммобилизованной гидрогеназой // Докл. АН СССР. -1984.-V.274.-Р. 1434-7.

109. A.I. Yaropolov, A.A. Karyakin, S.D. Varfolomeyev, I.V. Berezin. Mechanism of H2-electrooxidation with immobilized hydrogenase // Bioelectrochem. Bioenerg. -1984.-V.12.-P.267-77.

110. A.A. Karyakin, S.V. Morozov, O.G. Voronin, N.A. Zorin, V.V. Perelygin, S. Cosnier. The limiting performance characteristics in bioelectrocatalysis of hydrogenase enzymes // Angewandte chemie-international edition. -2007.-V.46(38).-P.7244.

111. A.A. Karyakin, S.V. Morozov, E.E. Karyakina, N.A. Zorin, V.V. Perelygin, S. Cosnier. Hydrogenase electrodes for fuel cells // Biochemical society transactions. -2005.-V.33.-P.73.

112. C.X. Cai, J. Chen. Direct electron transfer of glucose oxidase promoted by carbon nanotubes // Analytical biochemistry. -2004.-V.332(l).-P.75.

113. A. Guiseppi-Elie, C.H. Lei, R.H. Baughman. Direct electron transfer of glucose oxidase on carbon nanotubes //Nanotechnology. -2002.-V.13(5).-P.559.

114. M.L. Yang, J. Wang, H.Q. Li, J.G. Zheng, N.Q.N. Wu. A lactate electrochemical biosensor with a titanate nanotube as direct electron transfer promoter // Nanotechnology. -2008.-V. 19(7).-P.article number 075502.

115. S. Zhao, K. Zhang, Y. Bai, W.W. Yang, C.Q. Sun. Glucose oxidase/colloidal gold nanoparticles immobilized in Nafion film on glassy carbon electrode: Direct electron transfer and electrocatalysis // Bioelectrochemistry. -2006.-V.69(2).-P.158.

116. F. Palmisano, P.G. Zambonin, D. Centonze. Amperometric biosensors based on electrosynthesised polymeric films // Fresenius J. Anal. Chem. -2000.-V.366.-P.586-601.

117. B.A. Gregg, A. Heller. Cross-linked redox gels containing glucose oxidase for amperometric biosensor applications // Analytical chemistry. -1990.-V.62.-P.258-263.

118. P.D. Hale, T. Inagaki, H.I. Karan, Y. Okamoto, T.A. Skotheim. A new class of amperometric biosensor incorporating a polymeric electron-transfer mediator // J. Am. Chem. Soc. -1989.-V.il 1.-P.3482-3484.

119. S. Cosnier. Electropolymerization of amphiphilic monomers for designing amperometric biosensors // Electroanalysis. -1997.-V. 9(12).-P.894-902.

120. S. Yabuki, H. Shinohara, M. Aizawa. Electro-conductive enzyme membrane // Journal of the chemical society-chemical communications. -1989.-V.14.-P.945-946.

121. T. Ruzgas, E. Csoregi, J. Emneus, L. Gorton, G. Marko-Varga. Peroxidase-modified electrodes: Fundamentals and application // Analytica chimica acta. -1996.-V.330(2-3).-P.123-138.

122. B. Palysa, A. Bokuna, J. Rogalskib. Poly-o-phenylenediamine as redox mediator for laccase // Electrochimica acta. -2007.-V.52(24).-P.7075-7082.

123. G. Henriksson, G. Johansson, G. Pettersson. A critical review of cellobiose dehydrogenases // Journal of Biotechnology. -2000.-V.78.-P.93-113.

124. M. Zamocky, R. Ludwig, C. Peterbauer, B.M. Hallberg, C. Divne, P. Nicholls, D. Haltrich. Cellobiose dehydrogenase a flavocytochrome from wood-degrading, phytopathogenic and saprotropic fungi // Current protein and peptide science. -2006.-V.7.-P.255.

125. K. Igarashi, M.F.J.M. Verhagen, M. Samejima, M. Schuleini, K.-E.L. Eriksson, T. Nishino. Cellobiose Dehydrogenase from the Fungi Phanerochaete chysosporium and Humicola insolens II The journal of biological chemistry. -1999.-V.274(6).-P.3338-3344.

126. L. Stoica, R. Ludwig, D. Haltrich, L. Gorton. Third-Generation Biosensor for Lactose Based on Newly Discovered Cellobiose Dehydrogenase // Analytical chemistry. -2006.-V.78.-P.393-398.

127. W. Harreither, V. Coman, R. Ludwig, D. ITaltricha, L. Gorton. Investigation of graphite electrodes modified with cellobiose dehydrogenase from the ascomycete myriococcum thermophilum // Electroanalysis. -2007.-V. 19(2-3).-P.172.

128. M.S. Rogers, G.D. Jones, G. Antonini, M.T. Wilson, M. Brunori. Electron-transfer from phanerochaete-chrysosporium cellobiose oxidase to equine cytochrome-c and pseudomonas-aeruginosa cytochrome c-551 // Biochemical journal. -1994 -V.298.-P.329-334.

129. M.D. Cameron, S.D. Aust. Kinetics and reactivity of the flavin and heme cofactors of cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium // Biochemistry. -2000.-V.39(44).-P. 13595-13601.

130. А.И. Бавер, H.B. Ковалёва, Г.А. Мишина, Л.П. Семёнова. // Химические волокна. -1977.-V.1.-P.54.

131. X. Liu, G. Bouchard, Н.Н. Girault, В. Testa, P.A. Carrupt. Partition coefficients of ionizable compounds in o-nitrophenyl octyl ether/water measured by the potentiometric method // Analytical chemistry. -2003.-V.75(24).-P.7036.

132. F. Scholz. Recent advances in the electrochemistry of ion transfer processes at liquidliquid interfaces // Annu. Rep. Prog. Chem. Sect. C. -2006.-V.102.-P.43-70.

133. G. Shul, M. Opallo. On transfer across liquid-liquid interface coupled to electrochemical redox reaction at carbon paste electrode // Electrochemistry communications. -2005.-V.7(2).-P.194-198.

134. H.J. Watts, D. Yeung, H. Parkes. Real-time detection and quantification of DNA hybridization by an optical biosensor // Analytical chemistry. -1995.-V.67.-P.4283-4289.

135. F. Caruso, E. Rodda, D.N. Furlong. Quartz crystal microbalance study of DNA immobilization and hybridization for nucleic acid sensor development // Analytical chemistry. -1997.-V.69.-P.2043-2049.

136. Y. Okahata, Y. Matsunobu, K. Ijiro, M. Mukae, A. Murakami, K. Makino. Hybridization of nucleic acids immobilized on a quartz crystal microbalance // J. Am. Chem. Soc. -1992,-V.l 14(21).-P.8299-8300.

137. S. Yamaguchi, T. Shimomura. Adsorption, immobilization, and hybridization of DNA studied by the use of quartz crystal oscillators // Analytical chemistry. -1993.-V.65.-P.1925-1927

138. G. Marrazza, I. Chianella, M. Mascini. Disposable DNA electrochemical biosensors for environmental monitoring // Analytica chimica acta. -1999.-V.387.-P.297-307.

139. S.R. Dungan, T. Bausch, T.A. Hatton, P. Plucinski, W. Nitsch. Interfacial transport processes in the reversed micellar extraction of proteins // Journal of colloid and interface science. -1991.-V.145(l).-P.33-50.

140. K. Naoea, K. Nodaa, T. Konishi, M. Kawagoea, M. Imai. Liquid-liquid extraction of a-lactalbumin using reverse micellar organic solvent // BioFactors. -2004.-V.22.-P.347~ 351.

141. Y. Sun, S. Ichikawa, S. Sugiura, S. Furusaki. Affinity extraction of proteins with a reversed micellar system composed of cibacron blue-modified lecithin // Biotechnology and bioengineering. -1998.-V.58(1).

142. O.A. Saleh, L.L. Sohn. An artificial nanopore for molecular sensing // Nano Lett. -2003.-V.3(l).-P.37-38.

143. J. Wang. Sol-gel materials for electrochemical biosensors // Analytica chimica acta. -1999.-V.399(l-2).-P.21.

144. W. Jin, J.D. Brennan. Properties and applications of proteins encapsulated within sol-gel derived materials // Analytica chimica acta. -2002.-V.461(l).-P.l.

145. E. Курицына. Сенсоры на основе наноразмерных пленок и структур электрокатализатора // Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. -2006.-Р.90.

146. Е. Luzi, М. Minunni, S. Tombelli, М. Mascini. New trends in affinity sensing: aptamers for ligand binding // Trends in analytical chemistry. -2003.-V.22(l 1).-P.810.

147. A. Bini, M. Minunni, S. Tombelli, S. Centi, M. Mascini. Analytical performances of aptamer-based sensing for thrombin detection // Analytical chemistry. -2007.-V.79(7).-P.3016.

148. J.W. Goding. Use of staphylococcal protein a as an immunological reagent//Journal of Immunological Methods. -1978.-V.20.-P.241.

149. I. Bjork, B.-A. Petersson, J. Sjoquist. Some physicochemical proprieties of protein A from Staphylococcus aureus II Eur. J. Biochem. -1972.-V.29.-P.579.

150. A. Morrin, A.J. Killard, M.R. Smyth. Electrochemical characterization of commercial and home-made screen-printed carbon electrodes // Analytical letters. -2003.-V.36(9).-P.2021.

151. M. Trojanowicz, A. Mulchandani, M. Mascini. Carbon nanotubes-modified screen-printed electrodes for chemical sensors and biosensors // Analytical letters. -2004.-V.37(15).-P.3185.

152. J. Wang, M. Musameh. Carbon nanotube screen-printed electrochemical sensors // Analyst. -2004.-V.129(1 ).-P. 1-2.

153. M. Trojanowicz. Application of conducting polymers in chemical analysis // Microchimica acta. -2003.-V.143.-P.75.

154. E.M. Genies, A. Boyle, M. Lapkowski, C. Tsintavis. Polyaniline: a historical survey // Synthetic metals. -1990.-V.36.-P.139-182.

155. E.M. Genies, M. Lapkowski, J.F. Penneau. Cyclic voltammetry of polyaniline: Interpretation of the middle peak // J. Electroanal. Chem. -1988.-V.249.-P.97.

156. G. Zotti, S. Cattarin, C. Comisso. Cyclic potential sweep electropolymerization of aniline. The role of anions in the polymerization mechanism // Journal of Elecrroanalytical Chemistry. -1988.-V.239.-P.387.

157. Y. Wei, Y.Sun, X. Tang. Autoacceleration and kinetics of electrochemical polymerization of aniline // The journal of physical chemistry. -1989.-V.93.-P.4878.

158. W.W. Focke, G.E. Wnek, Y. Wei. Influence of oxidation-state, pH, and counterion on the conductivity of polyaniline // Journal of physical chemistry. -1987.-V.91(22).-P.5831.

159. I. Willner, E. Katz. Integration of layered redox proteins and conductive supports for bioelectronic applications // Angewandte chemie-international edition. -2000.-V.39(7).1. P.1180.