Динамика молекул в неупорядоченных средах по данным Эхо-Детектируемого ЭПР нитроксильных спиновых зондов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

Кирилина Евгения Петровна

ДИНАМИКА МОЛЕКУЛ В НЕУПОРЯДОЧЕННЫХ СРЕДАХ ПО ДАННЫМ ЭХО-ДЕТЕКТИРУЕМОГО ЭПР НИТРОКСИЛЬНЫХ СПИНОВЫХ ЗОНДОВ

01.04.17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Новосибирск, 2005

Работа выполнена в Институте Химической Кинетики и Горения Сибирского Отделения Российской Академии Наук.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Сергей Андреевич Дзюба Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Александр Анатольевич Дубинский доктор физико-математических наук, профессор Петр Александрович Пуртов

Ведущая организация:

Казанский физико-технический институт РАН

Защита состоится 30 ноября 2005 г. в 16:30 часов на заседании диссертационного Совета К 003.014.01 в Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН.

Автореферат разослан 28__октября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

доктор химических наук,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Динамика молекул в неупорядоченных средах - стеклах и полимерах имеет иерархический характер и происходит в широком диапазоне времен корреляции. Построение полной картины молекулярных движений в неупорядоченных средах необходимо для решения фундаментальной задачи статистической физики -построения теории фазового перехода стекло-жидкость. Кроме того, понимание закономерностей молекулярной динамики в стеклах и полимерах имеет большое значение для решения практических задач материаловедения. Детальное исследование динамики молекул в неупорядоченных средах требует развития физических методов специфически чувствительных к молекулярным движениям в различных временных диапазонах.

Работа посвящена развитию и применению метода детектирования молекулярных движений при помощи эхо-детектированого электронного парамагнитного резонанса (ЭД ЭПР) нитроксильных спиновых зондов. Метод ЭД ЭПР обладает большим потенциалом для исследования ориентационной динамики молекул в диапазоне времен корреляции КЗ"6 -10'" с и позволяет исследовать движение радикальных примесных частиц, иммобилизованых в стеклах. В комбинации с методом спинового зонда позволяет получать уникальную информацию о локальной молекулярной подвижности спин меченых молекул белков и биополимеров.

Информация о молекулярных движениях извлекается на основании анализа вызванной движением спиновой релаксации. Интерпретация данных ЭД ЭПР требует развития теории спиновой релаксации вызванной движением и разработки способов определения параметров молекулярных движений.

Многочисленные данные нейтронного рассеяния, рамановской инфракрасной спектроскопии указывают на наличие в стеклах и полимерах коллективных мод движения -одновременных смещений большого количества молекул. Теория фазового перехода, разработанная Адамом и Гиббсом, также использует концепцию одновременно перестраивающихся кластеров для описания фазового перехода стекло жидкость1. Большой интерес представляет развитие экспериментальных методик позволяющих детектировать коллективные движения, определять их корреляционную длину.

Особый интерес представляет применение метода ЭД ЭПР для исследования динамики молекул в пептидах и белках. Развитие методов детектирования молекулярных движений в белках и белковых комплексах необходимо для понимания механизмов действия и каталитических функции белков в живых организмя* —

I

Основные цели работы:

1. Определение времен корреляции ориентационных движений молекул нитроксильных радикалов в органических стеклах при помощи метода ЭД ЭПР. Предполагалось определить масштаб времен корреляции и амплитуд, а также геометрию молекулярных движений методом сравнения экспериментальных ЭД ЭПР спектров с теоретическим расчетом.

2. Выявление связи между молекулярной динамикой спиновых зондов и движением молекул стеклообразной матрицы. Выявление зависимости параметров молекулярных движений от размеров и структуры нитроксильных спиновых зондов, стекла растворителя и температуры. Исследование коллективного характера молекулярных движений.

3. Применение метода ЭД ЭПР для исследования молекулярной динамики пептидов и белков. Изучение молекулярной динамики пептида трихогин при помощи ЭД ЭПР однократно и дважды меченых пептидов.

Научная новизна работы. Предложен метод определения масштаба времен корреляции ориентационных движений, который основан на сравнительном анализе спектров ЭД ЭПР различных ЭПР диапазонов. Впервые при использовании современных методов импульсного ЭПР в высоких полях определен масштаб времен корреляции ориентационных движений нитроксильного спинового зоида (соли Фреми в глицерине вблизи температуры стеклования), равный 10'7 - 10'10 с. При помощи разработанной программы для расчета и подгонки спектров ЭД ЭПР нитроксильных радикалов для ряда моделей ориентационных движений проведен расчет формы спектров ЭД ЭПР. Достигнуто согласие экспериментов и теоретических расчетов.

Впервые при помощи ЭД ЭПР продемонстрирован коллективный характер ориентационных движений молекул в стеклах. Исследована зависимость скорости анизотропной поперечной релаксации нитроксильных спиновых зондов от размера и свойств зонда, структуры нитроксильного кольца, размера и структуры заместителей, а также свойств стекла растворителя и темпертуры.

Исследованы молекулярные движения пептида трихогин ОА IV однократно и двукратно меченого нитроксильной спиновой меткой. Впервые продемонстрирована возможность исследования локальных и коллективных мод движения пептидов при помощи ЭД ЭПР однократно и дважды меченных пептидов.

Практическая ценность работы. Разработаный метод может быть использован для исследования молекулярной подвижности в стеклах и полимерах различного состава, а также при исследовании динамики белковых молекул. Созданная программа расчета и подгонки спектров ЭД ЭПР может быть применена для анализа экспериментальных данных

4

импульсного ЭПР различных диапазонов и позволяет определять параметры молекулярных движений и геометрию молекулярных движений. Полученные результаты о коллективном характере молекулярных движений в стеклах могут иметь большое значение при сравнении с теоретическими предсказаниями.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: VI International Voevodsky Conference «Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes», (Новосибирск, Россия, 21-25 июля 2002), International School on EPR spectroscopy and Free Radical Research (Мумбай, Индия, 1720 ноября, 2004) Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft fur Biophysik (Фрайбург, Гермапия, 12-15 сентяря, 2004), 5th Meeting of the European Federation of EPR Groups (Лисабон, Португалия, 7-11 сентября, 2003), 9th Chianti workshop, (Тиррения (Пиза), Италия 26 мая -1 июня, 2001), Specialized Colloque AMPERE: «EPR and ENDOR Spectroscopy of Metal Proteins and Spin-Labelled Proteins» (Лейден, Нидерланды 29 июня - 1 июля, 2005), EUROMAR conference EENC 2005 «Magnetic Resonance for the Future»( Вельтхофен, Нидерланды, 3-8 июля 2005), Final report clloquium of the DFG Priority Programme SPP 1051 High-field EPR in Biology and Physics (Хюнельд, Германия, 16-18 февраля, 2005), Euro-Summer School «Modern EPR Spectroscopy methodology and application in Physics, Chemistry and Biology» (Рити, Бельгия, 1-7 декабря, 2002), симпозиум «Современная химическая физика», (Туапсе, Россия, 18-29 сентября, 2000), Молодежная научная школа «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений», (Казань, 20-22 ноября, 2002).

Публякаяии. Основное содержание диссертации изложено в 4 статьях и 10 тезисах научных конференций и симпозиумов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, результатов и выводов и списка цитируемой литературы, включающего 70 наименований. Работа изложена на 104 страницах, содержит 5 таблиц и 29 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели, и задачи работы, а также дано краткое описание структуры диссертации.

В первой главе представлен обзор литературы по проявлению молекулярных движений в спектрах электронного парамагнитного резонанса. Рассмотрены описанные в литературе экспериментальные методики исследования молекулярных движений, основанные на анализе вызванной движением продольной и поперечной спиновой

5

релаксации. Проведен обзор теоретических методов расчета кинетики затухания спинового эха для различных моделей молекулярных движений. Подробно рассмотрены соотношения между параметрами молекулярных движений и скоростью, вызванной ими спиновой релаксации для случая быстрых и медленных молекулярных движений.

Вторая глава посвящена описанию феномена анизотропной спиновой релаксации, вызванной ориентационным молекулярным движением, а также метода расчета спектров ЭД ЭПР нитроксильных радикалов в рамках модели быстрых ограниченных ориентациоиных движений. Вследствие сверхтонкого взаимодействия со спином ядра азота и анизотропии спин-орбитального взаимодействия, ларморовская частота неспареного электрона зависит от ориентации молекулы нитроксильного радикала относительно внешнего магнитного поля. Молекулярные ориентационные движения приводят к флуктуациям ларморовской частоты и как следствие к спиновой

+Б

— 200нс

1/7-2А>1/Г2Б А _ — 400нс

А / 1 — 800нс

1 / 1 ~ — 1000нс

/ 1

/ К^з

о.зз

0.336

0.332 0.334 ВоГТ

Рисунок 1 Спектры ЭД ЭПР нитроксильного радикала стекле. Спектры записаны при помощи последовательности спинового эха я/2-т-.я. Спектры, записанные при разных значениях т, нормированы на максимум амплитуды

Изменение формы спектра при увеличении времени т - следствие анизотропии релаксации. Если амплитуда флуктуаций Дщ и время поперечной релаксации

корреляции движения тс удовлетворяют условию: (Лгатс)2« I и 1/Т2»1/Ть то скорость вызванной движением поперечной релаксации описывается следующим соотношением2:

— = Лсот Т,

(1)

Для малых углов отклонения а, Дсо2=Р(в,<р)а2, где Р(0,ср) фактор, зависящий от ориентации радикала относительно внешнего магнитного поля. Вид функции Р(0,<р) задается типом движения и определяет зависимость скорости релаксации от положения в спектре - т.е. анизотропию скорости релаксации. Во второй главе диссертации приведены аналитические выражения для функции ЩЭ.ср) для следующих моделей ориентациоиных движений: (¡) ориентационные колебания вокруг определенной оси в молекулярной системе координат; (и) модель изотропных ориентациоиных флуктуаций; (Ш) модель скачков между двумя положениями. Кроме того, рассмотрен механизм релаксации за счет флуктуации компонент g-тeнзopa. Получение выражения применимы для расчета спектров ЭПР в магнитных полях от 1 до 10 Тл.

В третьей главе описан метод определения временной шкалы и геометрии молекулярных движений, использующий возможности современного мультичастотного ЭД ЭПР. Показано, что в молекулярных стеклах вблизи температуры стеклования преобладают изотропные ограниченные ориентационные колебания с характерными временами в диапазоне 10"7 - Ю"10 с.

В методе ЭД ЭПР характерные времена движения извлекаются из анализа скорости релаксации, вызванной молекулярными движениями. При этом зависимость скорости релаксации от времени корреляции движения немонотонна. Скорость релаксации мала для очень быстрых движений (тс«1/Део) и возрастает с ростом времени корреляции. Максимум достигается для случая Да>Тс~1, и при дальнейшем увеличении времени корреляции (Тс>1/Дш) скорость релаксации падает. Такое поведение приводит к тому, что скорости анизотропной релаксации, измеренные экспериментально, допускают неоднозначную интерпретацию и могут быть объяснены как медленными, так и быстрыми ориентационными движениями.

Таблица 1 Результаты теоретических расчетов кинетик спадов сигнала двухимпульсного л/2-т-л спинового эха для нескольких моделей медленных ориенгациониых движений молекулы со спином 'Л и анизотропным g-тензором. тс время корряляции движения, параметры А, В, С зависит от величины внешнего магнитного поля Но: А=2уе(МН/Мв)2П/3, у, -электронное гиромагнитное отношение, I) - коэффицент ориентацнонной дифузии, МН/М9осНо угловой градиент Гамильнониана; В "2 (Р/тс)1/2,апс1 С =2(Р/т,2)ш, соответственно, где Р=2 у.

Модель движения Функция спада эха Ссылки

Броуновская диффузия (г< 1//0 ехр(-Лг'),ЛссН„г 3,4,5

Броуновская диффузия (г> УГ) юр (-Вт), ВесНс"2 3

Свободная диффузия ехр(-Ст), СосЯо"3 3

Скачки между двумя положениями, случайные скачки 3,4,6

Нами был развит критерий определения временного масштаба движения: экспоненциальный спад сигнала эха я квадратичная зависимость скорости релаксации 1/Тг от амплитуды флуктуаций ларморовской частоты Дсо могут служить доказательством режима быстрых движений Дсотс«1.

Действительно, в случае быстрых движений (Дштс«1) в соответствии с теорией магнитной релаксации Редфилда спад сигнала эха экспоненциально зависит от времени, и скорость поперечной релаксации определяется соотношением (1), т.е. скорость релаксации прямо пропорциональна квадрату флуктуации ларморовской частоты. В случае медленных движений кинетика затухания сигнала эха часто не описывается экспонентой, время фазовой памяти определяется типом случайного процесса. Хотя общее выражение, определяющее зависимость времени фазовой релаксации от времени корреляции и амплитуды движения, не может быть получено, медленные движения никогда не приводят одновременно к экспоненциальной кинетике спада эха и квадратичной зависимости времени фазовой памяти от Лез. Такой вывод может быть сделан на основании анализа имеющихся в литературе теоретических расчетов кинетики спада сигнала эха для медленных процессов (см. таблицу 1).

Для нитроксильных радикалов анизотропия ларморовской частоты определяется суперпозицией анизотропии зеемановского и сверхтонкого взаимодействия. При изекении резонансной частоты и магнитного поля спектрометра, изменяется в соответствующее число раз анизотропия связаная с анизотропией g-тензора. Вследствии этого, ориентационные движения одной и той же амплитуды а приводят к различной величине Дсо при детектировании спектров ЭПР различных диапазонов. Это позволяет исследовать зависимость скорости релаксации от амплитуды флуктуаций ларморовской частоты на основании сравнительного анализа кинетик спада сигнала эха при различных значениях внешнего магнитного поля.

Были проведены эксперименты ЭД ЭПР для нитроксильного радикала соль Фреми в стекле глицерина в S-(0.12 Т/3 ГГц), Х-(0.35 Т/9.5 ГГц), W-(3.5 Т/95 ГГц) и G-(6 Т/180 1Тц) диапазонах ЭПР при температуре 185 К (см. рисунок 2).

Было обнаружено, что кинетики спада эха экспоненциальны во всех использованых диапазонах. Квадратичность зависимости скорости анизотропной релаксации от амплитуды флуктуаций ларморовской частоты была проверена одновременной симуляцией спектров ЭД ЭПР, записаных в различных диапазонах в рамках модели быстрых движений. Эксперимеиально полученые спектры и результаты расчета приведены на рисунке 2. Достигнутое согласие расчета и эксперимента показывает, что анизотропная релаксация вызвана быстрыми движениями, времена корреляции которых удовлетворяют соотношению

ДЮТс«1.

S(/T Bf/T B(/T BofT

Рисунок 2 Спектры ЭД ЭПР нитроксильного радикала соль Фреми в глицерине, записанные в различных диапазонах ЭПР (S-(0.12 Т/3 ГГц), Х-(0.35 Т/9 5 ГГц), W-(3.5 Т/95 ГГц) и G-(6 Т/180 ГГц)) при температуре 185 К и расчет в рамках модели быстрых ограниченных изотропных ориентационных движений радикалов Спектры соответсвукнцие разным значениям времени задержки между импульсами т, нормированы на максимум амплитуды.

Было обнаружено, что ЭД ЭПР в высоких полях позволяет существенно увеличить чувствительность метода к геометрии ориентационного движения. Для молекул, обладающих анизотропным g-тензором спектры ЭПР W- и G- диапазонов обеспечивают высокое ориентационное разрешение, позволяющее точно определить оси, вокруг которых происходит ориентационное движение. Сравнение формы спектров ЭД ЭПР, зарегистрированных в глицерине, с расчетом показало, что молекулы спинового зонда совершают изотропные ориентационные флуктуации. Было также обнаружено проявление дополнительного релаксационного механизма за счет флуктуаций компонент g-тензора в спектрах ЭД ЭПР W- и G- диапазонов.

Четвертая глава посвящена исследованию механизмов ориентационных движений молекул в стеклах.

Анизотропная релаксация, наблюдаемая в спектрах ЭД ЭПР нитроксильных радикалов, является следствием стохастических переориентация нитроксильного фрагмента NO . А priory переориентация фрагмента NO- может быть результатом следующих процессов: (i) внутримолекулярных движений нитроксильного радикала; (ii) движений молекулы нитроксильного радикала как целого относительно клетки растворителя; (iii) коллективных ориентационных движений всей клетки, включая нитроксильный радикал.

Дня того чтобы определить, какой из указанных видов молекулярных движений приводит к анизотропной релаксации, была исследована зависимость скорости анизотропной

релаксации от характеристик спинового зонда и исследуемого стекла. Характеристикой, определяющей параметры внутримолекулярных движений, является структура нитроксильного радикала, поскольку характер конформационных переходов зависит от строения нитроксильного цикла. Для индивидуальных движений зонда в клетке растворителя определяющим фактором является соотношение размеров радикала и клетки растворителя. В отличие от этого для коллективных движений амплитуда и время корреляции определяются свойствами стекла и межмолекулярными взаимодействиями в стекле-растворителе. Из этих соображений была исследована зависимость скорости анизотропной релаксации от следующих факторов: (¡) структура нитроксильного цикла; (и) размер нитроксильного радикала; (ш) стекло-растворитель. Были проведены три серии экспериментов, в каждой из которых варьировался один из факторов, тогда как остальные оставались неизменными.

Для того чтобы количественно охарактеризовать скорость анизотропной релаксации мы использовали величину 1/Т2ап - разность скоростей релаксации между двумя позициями в спектре ЭПР (см. рис. 1)

1 1 1

0.30 025 0.20 £ 0.15 0.10 0.05 0.00

|Ь

|Ь

I

гЬ

Величина 1/Т2а„~а тс была измерена для нитроксильных радикалов различного строения и размера, представленных в таблице 2 и помещенных в ряд стеклующихся органических

растворителей.

Результаты экспериментов приведены на рисунках 3 - 6. На рисунке 3 представлены величины 1/Тгал для нитроксильных радикалов различной структуры, помещенных в стекло этанола при 77 К. Исследованы нитроксильные радикалы, имеющие шестичленные и пятичлеиные циклы, а также смежные циклы затрудняющие конформационные твист-переходы. Несмотря на различия в строении радикалов скорость анизотропной релаксации меняется лишь в пределах 20%.

На рисунке 4 представлены скорости анизотропной релаксации для нитроксильных радикалов различного размера в стеклах этанола (рис. 4а) и толуола (рис. 46) при 77К. Была изучена серия нитроксильных радикалов, отличающихся

II V УК VIII IX X XI

Нитроксильный радикал

Рисунок 3 Скорость анизотропной релаксации для нитроксильных

радикалов различного строения в стекле этанола при 77К. Нумерация радикалов согласно-таблице 2.

Таблица 2. Структура нитроксильных спиновых зондов

лишь размером заместителя в третьем положении нитроксильного цикла. Изменение размера радикалов от 3 до 50 А приводит лишь к незначительному измерению 1/Тг^, в пределах 10%. Зависимость скорости анизотропной релаксации 1ЛГ2ап от свойств стекла-растворителя проиллюстрирована на рисунке 5. Величина МТ^т измерена в ряде стекол-растворителей для

радикала Темпон (XI) при 77К.

I» IV V И IX XII Нитроксильный радикал

Нитроксильный радикал

Рисунок 4 Скорость анизотропной релаксации 1АГ2м для нитроксильных радикалов различного строения в стекле этанола (слева) и стекле толуола(справа) при 77К. Нумерация радикалов согласно таблице 2

Различие скоростей релаксации более чем на порядок демонстрирует определяющее влияние свойств матрицы на параметры ориентационного движения молекул зонда. Полученные экспериментальные факты позволяют исключить процессы внутри-

молекулярных конформационных переходов как причину анизотропии поперечной релаксации. Шестичленные и пятичленные нитроксильные радикалы, отличающиеся как жесткостью цикла, так и амплитудой переориентации МО- фрагмента при твист -конформационных переходах, тем ни менее демонстрируют близкие параметры

ориентационных движений в эксперименте. Также можно заключить, что ориентационные движения, вызывающие анизотропную релаксацию в спектрах ЭД ЭПР, не являются колебаниями молекул зонда в клетке молекул растворителя. Действительно, наличие массивных заместителей, увеличивающих размер молекулы зонда в несколько раз, должно приводить к заметному ограничению амплитуды колебаний в клетке, что противоречит экспериментальным наблюдениям. Таким образом, на основании полученых результатов можно заключить, что анизотропная

Рисунок 5 Скорость анизотропной

релаксации 1/Т^ для нитроксильного релаксация вызвана коллективными движениями, радикала Темпон в стеклах различного

состава при 77К включающими одновременную переориентацию

молекулярного кластера размером несколько нанометров. Модель коллективных движений

наилучшим образом согласуется с экспериментальными данными, объясняет независимость

12

параметров движения от структуры и размера спинового зонда и чувствительность к свойствам стекла-растворителя.

Сделанный вывод согласуется с многочисленными экспериментальными доказательствами существования коллективных мод движения в стеклах, получеными при помощи методов нейтронного и светового рассеяния.7

В пятой главе метод ЭД ЭПР применен для исследования молекулярной динамики пептида трихогин.

Трихогин, выделенный из организма Тпс1ю$егта 1оп^асЫаЫт, является линейным пептабоилом длиной 10 аминокислотных остатков и обладает антибиотическим действием. Предполагаемый механизм действия состоит в изменении проницаемости биологических мембран при растворении в ней трихогина за счет образования каналов или тетрамолекулярных кластеров8.

Движение атомов в белках является суперпозицией внутримолекулярных движений аминокислотных остатков, флукгуаций аминокислот вокруг положения равновесия, движения белкового скелета, флуктуации вторичной структуры белка и коллективных движений под влиянием окружающего растворителя. В связи с этим для исследования динамики молекул в белках необходимы методы, позволяющие отличать различные моды молекулярных движений.

Для того чтобы исследовать одновременно и локальные движения в молекулах пептида и коллективные движения белкового остова были проведены эксперименты ЭД ЭПР с однократно и дважды мечеными пептидами. В дважды меченом пептиде нитроксильные метки располагались на расстоянии трех аминокислотных остатков друг от друга.

Для однократно меченого пептида аналогично спиновым меткам в стеках анизотропную релаксацию вызывают ориентационные флуктуации анизотропного сверхтонкого взаимодействия и анизотропного g-тeнзopa. В дважды меченом пептиде неспареные электроны связаны диполь-дипольным взаимодействием, которое зависит от расстояния между радикалами, их взаимной ориентации, а также ориентации нитроксильной пары (т.е. к

13

к -ГГОАС 4,3 ¡Л---1=ТОАС4 ' Л 1 ч \ & \ Л.

1 V» V ^ ВоП-

0 1 2 3 4 : т, цС

Рисунок 6 Спад сигнала эха однократно (ГГОАС-4) и дважды (1ТОАС -4,8) меченного пептида трихогин в стекле хлороформ 30%' толуол 70% при 77К. Спады записаны для спектральных позиций указаных стрелками на врезке.

ориентации всего белкового фрагмента содержащего пару меток) во внешнем магнитном поле. В связи с этим спектры ЭД ЭПР нитроксильных бирадикалов обладают дополнительной чувствительностью к движениям белкового остова, изменяющим расстояние между метками или ориентация всего пептида.

Экспериментально обнаружено, что скорость релаксации в спектрах дважды меченого пептида существенно выше, чем скорость релаксации однократно меченого аналога (см. рисунок 6), что свидетельствует о наличии молекулярных движений, изменяющих расстояние между метками или их ориентацию.

монорадикал

бирадикал

О 325 0 335 0 345 О 355

\ -0 2 цс

1 ----12 ус

1 - 3 2 (1С

-О 2 )1С

---1 2)«:

034 ВцГТ

О 325 0 335 0 345 0 355 ВоЛ

Был проведен теоретический анализ проявления

X

2 различных типов движений в

£

о спектрах ЭД ЭПР однократно и § дважды меченого пептида. Проведен расчет спектров ЭД ЭПР для нескольких моделей

| движения (¡) независимые лока-%

е. льные ориентационные флук-^ туации каждой из меток в свободном объеме, предоставленном окружением; (и) ориентационные движения молекулы трихогина как целого или переориентация фрагмента белкового остова, содержащего обе метки; (ш) относительное трансляционное движение меток. Показано, что рассмотренные типы движений приводят к различной зависимости скорости релаксации от положения в спектре ЭПР, проявляются по-разному в спектрах ЭД ЭПР.

Наилучшее согласие теории и эксперимента обнаружено для модели переориентации белкового остова, содержащего обе метки. Таким образом, продемонстрирован потенциал метода ЭД ЭПР для изучения молекулярной подвижности белков.

Рисунок 4 Спектры ЭД ЭПР пептида трихогин однократно (1ТОАС-4) и дважды (1ТОАС-4,8) меченого нстроксильной спиновой меткой. Верх: эксперимент в смеси хлороформ.'толуол, 77К Спектры записаны при помощи импульсной последовательности я/2-т-я.(спектры записаные при при разных временах задержки между импульсами т нормированы на максимум ампитуды) Низ: расчет в рамках модели ориентационных движений белкового остова, содержащих обе

выводы

1. Проведены расчеты спектров ЭД ЭПР нитрокснльных моно- и биради калов в неупорядоченных средах в условиях быстрого ориентационного движения в диапазоне частот ЭПР 1-180 ГТц для следующих моделей движения: модель изотропных ориентационных флуктуаций, модель переориентации вокруг фиксированной оси в молекулярной системе координат, модель скачков между двумя положениями. Для бирдикалов рассмотрены модели независимых ориентационных движений нитроксильных фрагментов, ориентационное движение бирадикала как целого и трансляционное относительное движение нитроксильных фрагментов.

2. Методом мультичастотного ЭД ЭПР нитроксильных спиновых зондов исследована анизотропная парамагнитная релаксация, вызванная ориентационным молекулярным движением в стеклах. Получены оценки для времени корреляции движения 10"7 - 10"10 с. Достигнуто количественное согласие между экспериментальными спектрами ЭД ЭПР нитроксильных спиновых зондов в стекле глицерин и расчетом в рамках модели быстрых ограниченных ориентационных движений.

3. Исследована зависимость параметров ориентационного движения от структуры и размера нигроксильного зонда, стеклующегося растворителя. Обнаружено, что скорость анизотропной релаксации, вызванной ориентационным движением, не зависит от структуры и размера зонда и определяется свойствами стекла растворителя и температурой. Сделан вывод что, анизотропная релаксация вызвана коллективными переориентациями в стекле включающими одновременное движение кластера размером свыше 1 им.

4. Метод ЭД ЭПР спиновых зондов применен для исследования молекулярной динамики пептида трихогин меченного в одном и двух положениях нитроксильной спиновой меткой. Показано, что скорость анизотропной релаксации для дважды меченого пептида на порядок больше чем для однократно меченного. Показано, что анизотропная релаксация вызвана ориентационным движением белкового остова.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах

1. Е.Р. Kirilina, T.F. Prisner, M. Bennati, В. Endeward, S. Dzuba, M.R. Fuchs, K. Möbius and A. Schnegg. Molecular dynamics of nitroxides in glasses studied by multi-frequency EPR.// Magnetic Resonance in Chemistry. -2005.- V. 43. -P.19-129.

2. S.A. Dzuba, E.P. Kirilina, E.S. Salnikov, and L.V. Kulik. Restricted orientational motion of spin probes in molecular glasses: Comparative study of anisotropic relaxation in primary and stimulated ESE decays. // Journal of Chemical Physics. 2005.-V. 122. - P. 94702-94709.

3. E.P. Kirilina, I.A Grigoriev, and S.A. Dzuba. Orientational motion of nitroxides in molecular glasses: Dependence on the chemical structure, on the molecular size of the probe, and on the type of the matrix. // Journal of Chemical Physics.-V 121. - P. 12465-12471.

4. E.P. Kirilina, S.A. Dzuba, A.G. Maryasov and Yu.D. Tsvetkov. Librational dynamics of nitroxide in molecular glasses studied by echo-detected EPR.// Applied Magnetic Resonance.-2001,- V. 21,- P. 203-221.

5. E.P. Kirilina, S.A. Dzuba, I.A. Grigoriev and Yu.D. Tsvetkov. Properties of librational motion of guest spin probe molecules in molecular glasses as revealed with ED EPR.// Book of Abstracts of International VI Voevodsky conference Physics and Chemistry of Elementary Chemical processes, Novosibirsk, Russia, 21-25 July, 2002. -P. 160.

6. E.P. Kirilina, A. Schnegg, S.A. Dzuba, T.F. Prisner, K. Möbius. Molecular Dynamics in Glasses Studied by Pulsed Multi-Frequency EPR.// Book of Abstracts of International School on EPR spectroscopy and Free Radical Research.- Mumbai, India, 17-20 November, 2004,- P. 23

7. E.P. Kirilina, S A. Dzuba. Cooperative orientational motion in trichogin peptide studied by ED EPR of mtroxide spin probes.//Book of Abstracts of Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft fur Biophysik Freiburg, Germany, 12-15 September, 2004, -P. 119.

8. E.P. Kirilina, E V. Salnikov, S.A. Dzuba. Orientational molecular motion in glasses by means of pulse EPR: comparison of different glasses.// Book of Abstracts of 5th Meeting of the European Federation of EPR Groups, Lisbon, Portugal, 7-11 September, 2003,- P. 42

9. E.P Bagryanskaya, S.A. Dzuba. Orientational molecular motion in glasses.// 9lh Chianti workshop, Tirrenia (Pisa), Italy, May 26- June 1,2001, -P. 45.

10. Е.П. Багрянская. Изучение механизма ограниченых движений спиновых зондов в молекулярных стеклах.// Тезисы докладов ХП симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, Россия, 18-29 сентября, 2000,- Стр.11.

11. Е.П. Кирилина, Исследование коллективных ориентационных колебаний молекул в стеклах методом эхо-детектированного ЭПР спиновых зондов, Труды Российской молодежной научной школы «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений», Казань, 20-22 ноября, 2002, стр. 196-200

12. E.P Kirilina, S.A. Dzuba. A molecular dynamics study on mono and doubly labeled Trichogin GAIV. // Book of Abstracts of Specialized Colloque AMPERE: EPR and ENDOR Spectroscopy of Metal Proteins and Spin-Labeled Proteins, Leiden, The Netherlands, June 29 - July 1,2005, -P. 9

13. E.P. Kirilina, A. Schnegg, S.A. Dzuba, T. Prisner, K. Möbius. Orientational molecular Dynamics in glasses studied by pulsed multi-frequency EPR of Spin Probes.// Book of Abstracts of

EUROMAR conference EENC 2005 Magnetic Resonance for the Future, Veidhoven, The Netherlands, 3-8 July 2005. - P. 296.

14. Е.П. Кирилина. Свойства ограниченных ориентационных движений молекул в молекулярных стеклах методом ЭД ЭПР.// Материалы XLI Международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», 15-19 апреля, 2003.- Стр.18-19.

Дополнительная цитируемая литература.

1 G. Adam, J. Gibbs.// Journal Chemical Physics, 1965.-V.43.-P.139.

2 A. G. Redfield.//Academic Press: London, 1965; Vol. 1. Advan.Magn.Reson., P. 1-32.

3 L.J. Schwartz, A.E. Stillman, J.H. Freed.// J. Chem. Phys. 1982 - V.77,- P. 5410-5425..

4 G.M. Zhidomirov, K.M. Salhikov. //Soviet Physics JETP, 1969.-V.29.- P.1037-1040.

5 J.R Klauder, P.W. Anderson, Physical Review, 1962.-V.12.-P. 912-932.

6 P. Hu, S.R. Hartmann.//Physical Review B, 1974.-V.9. P. 1-13.

7 J Onuchic, Z. Luthey-Schulten, Annual Review of Physical Chemistry, 48, 545-600, (1997)

8 A. Milov, Y. Tsvetkov, F. Formaggio, S. Oancea, C. Toniolo, J. Raap.// Journal of Physical Chemistry B, 2003. -V. 49,- P.13719-3727.

Подписано к печати 25 октября 2005г.

Тираж 100 экз. Заказ № 1683. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

»21024

РНБ Русский фонд

2006-4 19662

Введение

1 Литературный обзор: Исследование молекулярных движений методом ЭПР

1.1 Динамика молекул в стеклах.

1.2 Скорость анизотропной релаксации и параметры движения.

1.3 Связь молекулярной подвижности зонда и матрицы.

1.4 Применение ЭД ЭПР нитроксильных спиновых зондов.

1.5 Методы расчета спектров ЭПР нитроксильных радикалов.

1.5.1 Медленные движения: уравнение Лиувилля.

1.5.2 Медленные движения: расчет процесса спектральной диффузии

1.5.3 Быстрые движения.

1.6 Дополнительные механизмы спиновой релаксации для нитроксильных радикалов в стеклах.

1.7 Постановка задачи.

2 Теоретическое описание спектров ЭД ЭПР нитроксильных радикалов

2.1 Спектры стационарного ЭПР.•.

2.2 Спектры ЭД ЭПР.

2.2.1 Либрационное движение.

2.2.2 Изотропное движение.

2.2.3 Скачки между двумя положениями.

2.2.4 Флуктуации главных значений g-тeнзopa т^ 2.3 Программа расчета и подгонки спектров стационарного и ЭД ЭПР.

3 Определение времени корреляции движения.

Мультичастотный ЭД ЭПР.

3.1 Экспериментальная часть.

3.2 Результаты и обсуждение.

Динамика молекул в неупрядоченых средах - стеклах и полимерах - имеет иерархический характер и происходит в широком диапазоне времен корреляции. Построение полной картины молекулярных движений является фундаментальной задачей статистической физики, кроме того, имеет большое значение для практических задач материаловедения. Детальное исследование динамики молекул в неупорядоченых средах требует развития физических методов специфически чувствительных к молекулярным движениям в различных временных диапазонах.

Настоящая работа посвящена развитию метода изучения молекулярной динамики в стеклах при помощи Эхо-Детектированого (ЭД) ЭПР нитроксильных спиновых зондов и применению этого метода для исследования молекулярных движений в стеклах и биоплимерах. Метод основан на измерении вызванной молекулярными движениями анизотропной поперечной спиновой релаксации, и позволяет детектировать ограниче-ные ориентционные колебания нитроксильных радикалов с временами Ю-6 — Ю-11 с и амплитудами до 0.5 рад.

Целью настоящей работы явилось определение параметров ориентационных движений молекул: определение времени корреляции ориентационных движений в стеклах, геометрии и оси ориентационных движений. Исследование пространственного характера молекулярной динамики - выявление корреляции в движении молекул зонда и матрицы. Большой интерес представляет применение разработанной методики к исследованию молекулярных движений в пептидах, выявление сходств и различий между динамикой молекул в стеклах и биополимерах.

Работа имеет следующую структуру: В главе 1 представлен обзор литературы, посвященной проявлениям молекулярных движений в спектрах ЭПР. Рассмотрены описанные в литературе экспериментальные методики и теоретические методы рачета формы спектров ЭПР в случае быстрых и медленных ориентационных движений радикалов. В Главе 2 описана теоретическая модель, использованная для расчета спектров ЭД ЭПР нитроксильных радикалов при помощи теории магнитной релаксации Рэдфил-да. Выведены аналитические выражения, определяющие ориентационную зависимость скорости поперечной релаксации для нескольких моделей быстрых ограниченых ориентационных движений. Приведен алгоритм работы программы расчета и подгонки спектров ЭД ЭПР.

В Главе 3 разаботанный теоретический аппарат применен для анализа экспериментально полученых спектров ЭД ЭПР нитроксильного радикала соль Фреми в стекле глицерина вблизи температуры стеклования. Возможности современного мультичастотного ЭД ЭПР использованы для определения временной шкалы и геометрии молекулярных движений. Показано, что вблизи температуры стеклования преобладают изотропные ограниченные ориентационные колебания с временами в диапазоне Ю-7 — Ю-10 с. Взаимосвязь динамики нитроксильных зондов и молекул стеклующейся матрицы является предметом Главы 4. Исследована зависимость параметров молекулярных движений от размера и формы нитроксильных зондов, свойств растворителя и температуры. Показано, что амплитуда и время корреляции ориентационных движений ниже температуры стеклования определяются лишь свойствами растворителя и не зависят от размера и формы нитроксильных зондов. Продемонстрировано, что наблюдаемые молекулярные движения в стеклах имеют существенно коллективный характер, т.е. включают одновременную переоринтацию кластера размером несколько нанометров. В Главе 5 продемонстрированы возможности метода ЭД ЭПР спиновых меток для исследования молекулярной динамики белков. На примере пептида трихогина СА IV, меченного в одной или двух позициях нитроксильной меткой, изучены динамические моды белкового остова, локальная подвижность метки и коллективные переориентции всей молекулы трихогина.

Раздел 6 содержит основные результаты работы и положения, выносимые на защиту.

5.5 Заключение

Молекулярные движения пептида трихогин были исследованы при помощи метода ЭД ЭПР нитроксильных спиновых меток. Параметры ориентационного движения молекул трихогина получены на основании анализа скорости анизотропной релаксации, вызванной ориентационным движением меток. Для однократно меченого пептида анизотропная релаксация вызвана флуктуациями g-тeнзopa и анизотропного сверхтонкого взаимодействия. Для двукратно меченного пептида флуктуации диполь-дипольного взаимодействия между метками приводят к дополнительной релаксации. Было обнаружено, что скорость анизотропной релаксации для двукратно меченного пептида существенно увеличена по сравнению с однократно меченым. Проведен теоретический расчет спектров ЭД ЭПР однократно и двукратно меченного пептида для моделей индивидуальных локальных переориентационных движений меток, модели ориентационного движения белкового остова и модели трансляционных флуктуаций меток. Сравнение экспериментальных ЭД ЭПР спектров с результатами расчета показало, что анизотропная релаксация в спектрах ЭД ЭПР спиновых меток вызвана коллективным ориентационным движением белкового остова. Определено произведение амплитуды на время корреляции движения а2тс = 1.6 * 10~14рад2с.

Показано, что метод ЭД ЭПР нитроксильных спиновых меток может быть применен для исследования молекулярной динамики белков.

Результаты и выводы

1. Проведены расчеты спектров ЭД ЭПР нитроксильных моно- и бирадикалов в неупорядоченных средах в условиях быстрого ориентационного движения в диапазоне частот ЭПР 1-180 ГГц для следующих моделей движения нитроксильных радикалов: модель изотропных ориентационных флуктуаций, модель переориентации вокруг фиксированной оси в молекулярной системе координат, модель скачков между двумя положениями. Для бирадикалов рассмотрены модели независимых ориентационных движений нитроксильных фрагментов, ориентационное движение бирадикала как целого и трансляционное относительное движение нитроксильных фрагментов.

2. Методом мультичастотного ЭД ЭПР нитроксильных спиновых зондов исследована анизотропная парамагнитная релаксация, вызванная ориентационным молекулярным движением в стеклах. Получены оценки для времени корреляции движения Ю-7 — Ю-10 с. Достигнуто колличественное согласие между эсперименталь-ными спектрами ЭД ЭПР нитроксильных спиновых зондов в стекле глицерина и расчетом в рамках модели быстрых ограниченных ориентационных движений.

3. Исследована зависимость параметров ориентационного движения от структуры и размера нитроксильного зонда, стеклующегося растворителя. Обнаружено, что скорость анизотропной релаксации, вызванной ориентационным движением, не зависит от структуры и размера зонда и определяется свойствами стекла растворителя и температурой. Сделан вывод, что анизотропная релаксация вызвана коллективными переориентациями в стекле включающими одновременное движение кластера размером свыше 1 нм.

4. Метод ЭД ЭПР спиновых зондов применен для исследования молекулярной динамики пептида трихогин меченного в одном и двух положениях нитроксильной спиновой меткой. Показано, что скорость анизотропной релаксации для дважды меченного пептида на порядок больше чем для однократно меченного. Показано, что анизотропная релаксация вызвана ориентационным движением белкового остова.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю Сергею Андреевичу Дзюбе за чуткое научное руководство, поддержку и помощь во всех начинаниях, формулировку научной задачи и замечтальное терпеливое отношение, а также за все чему я научилась. Сердечная благодарность Елене Григорьевне Багрянской -замечтельной маме и ученому за миллионы советов и неоценимую помощь во всех областях физики и жизни. Теплому коллективу лаборатории Химии и Физики Свободного Радикала, где так интересно и комфортно было работать. Александру Георгиевичу Марьясову за обсуждение теоретических вопросов магнитной релаксации, химической физики и теплое дружеское отношение. Александру Дмитриевичу Милову за огромное колличество советов и консультаций по постановке и проведению физико-химических экспериментов, Римме Ивановне Самойловой за живую и энергичную атмосферу в лаборатории, Леониду Кулику за помощь и поддержку. Хотелось бы отблагодарить весь высококвалифицированый коллектив Института Химической Кинетики и Горения, где так легко получить квалифицированый совет по любому вопросу химической физики, особенно Юрия Акимовича Гришина за советы и консультации по всем вопросом радиофизики, техники ЭПР, таможенного контроля и чуткую помощью. Особенную благодарность хотелось бы выразить секретарю кафедры химической физики Римме Ивановне Ратушковой за неоценимою помощь, душевную теплоту, энергию и поддержку.

1. P.G. Debenedetti, F.H. Stillinger. Supercooled liquids and the glass transition. //Nature.-2001,- V.-410.- P. 259-267

2. H.Z. Cummins, G. Li, Y.H. Hwang, G.Q. Shen, W.M. Du, J. Hernandez, N.J. Tao. Dynamics of supercooled liquids and glasses: comparison of experiments with theoretical predictions. //Zeitschrift fur Physik B.-1997. -V. 103. P. 501 - 519

3. J.N. Onuchic, Z. Luthey-Schulten, P.G. Wolynes. Theory of protein folding: the energy landscape perspective. //Annual Review of Physical Chemistry. -1997. -V. 48. P. 545-600

4. J. Wuttke, J. Hernandez, G. Li, G. Coddens, H.Z. Cummins, F. Fujara, W. Petry, H. Sillescu. Neutron and light scattering study of supercooled glycerol. // Physical. Review Letters. 1994. -V. -72. - P.3052-3055

5. G. Adam, J.H. Gibbs. On the temperature dependence of cooperative relaxation properties in glass-forming liquids. // Journal of Chemical Physics. 1965. - V.43. - P. 139-151

6. M. H. Cohen and G. S. Grest. Dispersion of relaxation rates in dense liquids and glasses.// Physical Review B. -1981. V.24. -P. 4091-4094

7. D. Kivelson, S.A. Kivelson, X. Zhao, Z. Nussinov, G. Taq'us. A Thermodynamic Theory of Supercooled Liquids as they Get Glassy. // Physica A. -1995. V. 219,- P. 27-38

8. T. Franosch, W. Gotze, M. R. Mayr, A. P. Singh. Evolution of structural relaxation spectra of glycerol within the gigahertz band . //Physical Review E. -1997. -V. 55. -P. 3183-3190

9. L.J Berliner. Spin Labeling: the Next Millennium. // Plenum Press. New York. - 1998.

10. G. Moro, J.H. Freed. Efficient computation of magnetic resonance spectra and related correlation functions from stochastic Liouville equations. //Journal of Physical Chemistry. -1980.-V. 84. P.2837 - 2840

11. G.L. Millhauser, J.H. Freed. Two-dimensional electron spin echo spectroscopy and slow motions. // Journal of Chemical Physics. -1984. V.81. - P. 37-48

12. S.A. Dzuba, Y.D. Tsvetkov . Magnetization transfer in pulsed EPR of 15N nitroxides: Reorientational motion model of molecules in glassy liquids. // Chemical Physics. 1988.-V. 120.-P. 291-298

13. S.A. Dzuba, A.G. Maryasov, K.M. Salikhov, Y.D. Tsvetkov. Superslow rotations of ni-troxide radicals studied by pulse EPR spectroscopy. // Journal of Magnetic Resonance. -1984. -V.58.-P. 95-101

14. S. A. Dzuba and Yu. D. Tsvetkov A. G. Maryasov. Echo-induced EPR spectra of nitroxides in organic glasses: model of orientational molecular motions near equilibrium position. // Chemical Physics Letters. 1992. - V.188.-P. 217-222

15. A.A. Dubinskii, G.G Maresch, H.W. Spiess. Two-dimensional electron paramagnetic resonance spectroscopy of nitroxides: Elucidation of restricted molecular motions in glassy solids.// The Journal of Chemical Physics.-1994.-V. 100.-P. 2437-2448

16. S.A. Dzuba. Libration motion of guest spin probe molecules in organic glasses: CW EPR and electron spin echo study. // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Bimolecular Spectroscopy.- 2000.-V. 56. -P. 227-234

17. J. Buitink, M.M.A.E. Claessens, M.A. Hemminga, and F.A. Hoekstra. Influence of water content and temperature on molecular mobility and intracellular glasses in seeds and pollen. // Plant Physiology. -1998. -V.l 18. -P. 531-541

18. S.A. Dzuba, H. Watari, Y. Shimoyama, A.G. Maryasov, Y. Kodera, A. Kawamori. Molecular motion of the cholestane spin label in a multibilayer in the gel phase studied using echo-detected EPR. // Journal of Magnetic Resonance A. -1995. V.l 15. - P. 80-86

19. D. A. Erilov, RBartucci, R.Guzzi, D. arsh, S.A. Dzuba, L. Sportelli. Echo-Detected Electron Paramagnetic Resonance Spectra of Spin-Labelled Lipids in Membrane Model Systems. // Journal of Physical Chemistry. 2004. - V. - 106. - P. 4501-4507

20. A. Barbon, M. Brustolon, E. E. van Faassen. Photoexcited spin triplet states in zinc phthalocyanine studied by transient EPR. // Physical Chemistry Chemical Physics. -2001. -V. 3.-P. 5342-5347

21. A. Kh. Vorobiev, V. S. Gurman, T. A. Klimenko. Rotational mobility of guest molecules studied by method of oriented spin probe. // Physical Chemistry Chemical Physics. 2000. V.-2.-P. 379 385

22. Z. Liang, Y. Lou, J. H. Freed. A multifrequency electron spin resonance study of T4 ly-sozyme dynamics using the slowly relaxing local structure model. // Journal of Physical Chemistry B. 2004. - V. 108. - P. 17649 -17659

23. A. Barbon, M. Brustolon, A.L. Maniero, M. Romanelli, L.-C. Brunei. Dynamics and spin relaxation of tempone in a host crystal. An ENDOR, high field EPR and electron spin echo study. // Physical Chemistry Chemical Physics. 1999. - V.-l. - P. 4015 - 4023

24. E.P. Kirilina, S.A. Dzuba, A.G. Maryasov, Yu. D. Tsvetkov. Librational Dynamics of Nitroxide Molecules in a Molecular Glass Studied by Echo-Detected EPR. // Applied Magnetic Resonance. 2001. -V. -21. - P. 203-221

25. S.A. Dzuba, Y.A. Golovina and Y. D.Tsvetkov. Echo-Induced EPR Spectra of Spin Probes as a Method for Identification of Glassy States in Biological Objects. //Journal of Magnetic Resonance. Series B.-1993. -V-101. -P. 134-138

26. H. Frauenfelder, B. H. McMahon, and P. W. Fenimore. Myoglobin: The hydrogen atom of biology and a paradigm of complexity. // Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 2003. -V. 100. - P. 8615-8617

27. J.H. Freed, G.V. Bruno, C. F. Polnaszek. Electron spin resonance line shapes and saturation in the slow motional region.// Journal of Physical Chemistry. 1971. - V.75. -P. 3385 -3399

28. G. Moro, J.H. Freed. Efficient computation of magnetic resonance spectra and related correlation functions from stochastic Liouville equations. //Journal of Physical Chemistry. -1980.-V. 84. P.2837 - 2840

29. K.A. Earle, J.K. Moscicki, A. Polimeno, J.H. Freed. A 250 GHz ESR study of o-terphenyl: Dynamic cage effects above Tc. // The Journal of Chemical Physics.-1997. -V.-106 -P. 9996-10015

30. A. Polimeno, J.H. Freed. Slow motional ESR in complex fluids: the slowly relaxing local structure model of solvent cage effects.// Journal of Physical Chemistry. -1995. V. 99. -P. 10995-11006

31. J.H. Freed, G.V. Bruno, C. F. Polnaszek. Electron spin resonance line shapes and saturation in the slow motional region.// Journal of Physical Chemistry. 1971. - V.75. -P. 3385 -3399

32. G.M. Zhidomirov, K.M. Salikhov. Contribution to the theory of spectral diffusion in magnetically diluted solids. // }K3T<&. 1969. - V. 29. - P. 1037-1040

33. J.R. Klauder, P.W. Anderson. Spectral diffusion decay in spin resonance experiments. // Physical Review. -1962. -V. 125. -P.912-932.

34. P. Hu, S.R. Hartmann. Theory of spectral diffusion decay using an uncorrelated-sudden-jump model.// Physical Review B. -1974. V. 9. -P 1-13

35. L.J. Schwartz, A.E. Stillman, J.H. Freed. Analysis of electron spin echoes by spectral representation of the stochastic Liouville equation. // The Journal of Chemical Physics. -1982.-V.- 77, P. 5410-5425

36. L.J. Libertini, O.H. Griffith. Orientation Dependence of the Electron Spin Resonance Spectrum of Di-t-butyl Nitroxide. // The Journal of Chemical Physics. -1970 -V. 53.- P. 1359-1367

37. S.V. Pashenko, P. Gast, A.J. Hoff. A high-field EPR study of the anisotropic spin echo decay of Qa in bacterial photosynthetic reaction centres. // Book of abstracts of 12th International Congress on Photosynthesis. -2001. -P. 83

38. D. Kurad, G. Jeschke, D. Marsh. Lateral ordering of lipid chains in cholesterol-containing membranes: high-field spin-label EPR.// Biophysical Journal. 2004.- V.-86.-P.264-271

39. A.G. Redfield. On the theory of relaxation processes. //IBM Journal of Research and Development. 1957.-V.-1 - P. 19-31

40. А.Д. Милов, K.M. Салихов, Ю.Д. Цветков. Спиновая диффузия в системе протонных спинов. // Физика твердого тела. 1973. - V.-1 -Р. 802-809

41. W.B. Mims. Electron spin echoes.// Electron Paramagnetic Resonance (под редакцией S. Geschwind ).-1972.- Plenum Press. New York.

42. M. Romanelli, L. Kevan. Evaluation and interpretation of electron spin-echo decay part I: Rigid samples.// Concepts in Magnetic Resonance. -1997.-V.9.- P.403 430

43. M. Romanelli, L. Kevan. Evaluation and interpretation of electron spin echo decay part II: Molecular motions.// Concepts in Magnetic Resonance. 1998. - V.10. -P. 1-18

44. A. Zecevic, G.R. Eaton, S.S. Eaton, M. Lindgren. Dephasing of electron spin echoes for nitroxyl radicals in glassy solvents by non-methyl and methyl protons.//Molecular Physics. -1998.-V.95.-P. 1255-1264

45. J.W. Peng, G. Wagner. Investigation of protein motions via relaxation measurements.// Methods in Enzymology. -1994.- V.239. P.563-596.

46. T. F. Prisner, A. van der Est, R. Bittl, W. Lubitz, D. Stehlik, K. Möbius. Time-resolved W-band (95 GHz) EPR spectroscopy of Zn-substituted reaction centers of Rhodobacter sphaeroides R-26.// Chemical Physics. 1995. - V.194.-P. 361-370

47. S. Weber, K. Möbius, G. Richter, C.W.M. Kay. The Electronic Structure of the Flavin Co factor in DNA Photolyase. //Journal American Academy of Science. -2001. V. 123. - P. 3790-3798

48. J.L. Du, К. M. More, S.S. Eaton, G.R. Eaton. Orientational dependence of electron-spin phase memory relaxation-times in copper(H) and vanadyl complexes in frozen solution. //Israely Journal of Chemistry. -1992. V. 32. - P. 351-355

49. W. Saalmueller, H. W. Long, G. G. Maresch, H. W. Spiess. Two-dimensional field-step ELDOR. A method for characterizing the motion of spin probes and spin labels in glassy solids. //Journal of Magnetic Resonance, Series A .-1995. V.l 17.-P. 193-208

50. V.K. Khlestkin, A.Y. Tikhonov. Synthesis ofpyrewmine and 1,3-bishydroxylamine deri -vatives from enone Mannich base methiodides. // Heterocyclic Communications. 2002. -V. 8. - P. 249-254 \\

51. Л.Б. Володарский, И.А. Григорьев, C.A. Диканов, B.A. Резников, Г.И. Щукин. Ими-дазолиновые нитроксильные радикалы.// Новосибирск. 1988. - Наука.

52. G. Jeschke, A. Koch, U. Jonas, A. Godt. Direct Conversion of EPR Dipolar Time Evolution Data to Distance Distributions.// Journal of Magnetic Resonance. -2002. -V.155.-P. 72-82

53. C. Toniolo, E. Benedetti. The polypeptide Зю-helix. //Trends in biochemical sciences. -1991.-V.16.-P. 350-353

54. C. Peggion, F. Formaggio, M. Crisma, R.F. Epand, R.M. Epand, C. Toniolo. Trichogin: a paradigm for lipopeptaibols. //Journal of Peptide Science. -2003. V. 9. - P. 679-689

55. C. Auvin-Guette, S. Rebuffat, Y. Prigent, B. Bodo. Trichogin AIV, an 11-residue lipopeptaibol from Trichoderma longibrachiatum.// Journal of the American Chemical Society. -1992. V. 114.-P. 2170 - 2174

56. A.D. Milov, Yu.A. Tsvetkov, F. Formaggio, M. Crisma, C. Toniolo, J. Raap. Self-assembling and membrane modifying properties of a lipopeptaibol studied by CW-ESR and PELDOR spectroscopies. //Journal of Peptide Science. -2003. V. 9. - P. 690-700W

57. V. Monaco, F. Formaggio, M. Crisma, C. Toniolo, P. Hanson, G. Milhauser. Orientation and immersion depth of a helical lipopeptaibol in membranes using TO AC as an ESR probe. //Biopolymers. -1999. V. 50. - P. 239-253

58. S.A. Dikanov, A.V. Astashkin, Yu.D. Tsvetkov. Modulation effects in the electron spin echo of trans bis-(2,2,5,5-tetramethyl-3-imidazoline-3-oxide-l-oxyl-4-il)ethylene biradicals. //Chemical Physics Letters. -1984. V. 105. - P. 451-455W 68.