Исследование молекулярной подвижности спиновых зондов и меток методами стимулированного электронного спинового эха и переноса намагниченности тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

00

Исаев Николай Павлович

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ПОДВИЖНОСТИ СПИНОВЫХ ЗОНДОВ И МЕТОК МЕТОДАМИ СТИМУЛИРОВАННОГО ЭЛЕКТРОННОГО СПИНОВОГО ЭХА И ПЕРЕНОСА НАМАГНИЧЕННОСТИ

01.04.17 - химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 о Ш 2012

НОВОСИБИРСК - 2012

005017224

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук Дзюба Сергей Андреевич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Проскуряков Иван Игоревич

доктор физико-математических наук Тарасов Валерий Федорович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт «Международный томографический центр» Сибирского Отделения Российской академии наук.

Защита диссертации состоится «25» мая 2012 г. в 15-00 на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 в ИХКГ СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИХКГ СО РАН.

Автореферат разослан «24» апреля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор химических наук

Онищук А. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Методы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) нитроксильных спиновых зондов и меток находят широкое применение для решения современных химико-физических и биофизических задач, что стимулирует развитие новых методик и подходов в ЭПР для получения большего количества информации об исследуемых системах.

В настоящей работе развиваются и исследуются возможности двух методов исследования молекулярной динамики с помощью импульсного ЭПР. Одна методика основана на исследовании релаксации сигнала стимулированного спинового эха (ССЭ). Она позволяет детектировать и определять механизм микросекундных переориентации на малые углы (0,1-1°), что недоступно для исследования другими методами и позволяет поэтому получать принципиально новую информацию. Другая методика основана на эффекте переноса намагниченности в спектре ЭПР. Этот эффект чувствителен к подвижности молекул по механизму вторичной релаксации по типу Джохари-Голдштейна. Природа этой подвижности в настоящее время активно обсуждается в литературе.

Основные цели работы

Основной целью данной работы являлось развитие методик электронного спинового эха и их приложение к изучению фундаментальных закономерностей подвижности молекул в неупорядоченных молекулярных средах и в биологических мембранах. Для этого в работе решаются следующие задачи:

• Использование стимулированного спинового эха для выявления

молекулярного механизма динамики в неупорядоченных молекулярных средах и биологических мембранах.

• Исследование возможностей метода переноса намагниченности в

спектрах ЭПР нитроксильных радикалов для изучения Р-релаксации по типу Джохари-Голдштейна.

Научная новизна работы

В работе впервые проведены систематические исследования малоугловой подвижности спиновых зондов и меток в различных матрицах и при различных температурах.

Для объяснения релаксации спинового эха впервые была предложена модель инерционных вращений.

Найденные методом ССЭ частоты вращения существенно отличных по размерам зондов в неупорядоченных молекулярных средах оказались одинаковыми, что позволило сделать вывод о коллективной природе обнаруженных движений.

Исследование подвижности методом переноса намагниченности впервые было проведено для спиновых зондов существенно различного размера, что позволило определить характерный масштаб релаксации Джохари-Голдштейна.

Исследование динамики модельных мембран в гелевой фазе с помощью ССЭ позволило выявить появление коллективных движений липидов при криогенных температурах, а также неизвестный до этого эффект усиления холестерином молекулярной подвижности в глубине мембраны.

Практическая значимость

В работе показано, что метод стимулированного эха чувствителен к коллективным молекулярным переориентациям в малом масштабе углов, что дает возможность получения новой динамической информации для сложных биологических систем.

Полученная в настоящей работе информация об иерархии и характерном временном и пространственном масштабах молекулярных

переориентации в неупорядоченных молекулярных средах важна для понимания природы стеклообразного состояния.

Обнаруженный эффект усиления холестерином молекулярной подвижности внутри мембраны важен для понимания фундаментальных основ функционирования биологических мембран.

Личный вклад соискателя. Соискатель участвовал в постановке задач, обсуждаемых в данной диссертации, принимал непосредственное участие в организации и проведении экспериментов, в обработке экспериментальных данных, в анализе полученных результатов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждались на физико-химических семинарах Института химической кинетики и горения СО РАН, а также на 6 международных и 4 всероссийских научных конференциях: Sendai-Berlin-Novosibirsk Seminar on Advanced EPR 2006, Novosibirsk, Russian Federation // Asia-Pacific EPR/ESR Symposium, August 24-27, 2006, Novosibirsk, Russian Federation // XIX Симпозиум «Современная Химическая Физика», 2007, Туапсе, Россия // XXVI Симпозиум по химической кинетике, 2008, Черноголовка, Россия // 42nd Annular International Meeting of Electron Spin Resonance Spectroscopy Group of the Royal Society of Chemistry", 2009, Norwich, England // Tenth International Supramolecular School on Biophysics, 2009, Rovinj, Croatia // International Youth Scientific School, 2009, Kazan, Russian Federation // Всероссийская молодежная школа с международным участием «Магнитный резонанс в химической и биологической физике», 2010, Новосибирск, Россия // Asia-Pacific EPR/ESR Symposium, 2010, Jeju, Republic of Korea // EUROMAR, 2011, Frankfurt am Main, Germany.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении описана актуальность исследования молекулярной динамики и сделан краткий обзор возможностей метода ЭПР.

В первой главе представлена первая часть литературного обзора, которая состоит из четырех разделов. В первом разделе излагаются результаты исследования молекулярной динамики в стеклообразных матрицах методами диэлектрической и ЯМР спектроскопии. Вводится понятие а и р-релаксации. Во втором разделе описаны результаты по исследованию стеклообразных состояний методами ЭПР. В третьем разделе приведено описание свойств биологических мембран, сделан обзор различных методов исследования их структуры и молекулярной динамики. В четвертом разделе представлены данные по молекулярной подвижности мембран, полученные методами ЭПР.

Во второй главе приведена вторая часть литературного обзора, где описаны существующие теоретические подходы для объяснения релаксации в импульсной последовательности ССЭ (л/2-т-л/2-Т-я/2-т-эхо) нитроксильного радикала вследствие молекулярных переориентаций. Приведена структура и описана специфика анизотропии спектра нитроксильного радикала. Указано, что для малых углов поворота имеет место линейная зависимость между изменением Ларморовской частоты Аа> и углом поворота а . Для поворотов вокруг оси X:

ha>(l)~a(t)Rx(0,<p), (1)

где величина Rx (в, (р) - характеризует величину анизотропии и определяется следующим выражением:

KM, , - --(2>

| (А>х sin исо< <fr+ Л~т sin" tf sin" ip + A'u cosr fí) )

где Яхх, gyy, &zz и Axx, Ayy, Azz- главные значения g-тензора и тензора СТВ в молекулярной системе координат, а 9 и <р - углы поворота между лабораторной и молекулярной системами координат. Чтобы получить выражения для поворотов относительно осей Y и Z в выражении (2) надо

сделать циклическую перестановку X, У, Ъ и одновременно $\Х\0 са$,(р,

ътвътср, соъв.

Различные типы молекулярных движений приводят к различным типам дефазировки спинового эха, что позволяет различить их по зависимости релаксации эха в последовательности ССЭ при увеличении задержек Тит. Наносекундные ограниченные либрации с временем корреляции тс«т,Т приводят к следующей зависимости ССЭ:

в которой зависимость от величины Т отсутствует.

Если движения происходят на временах, больших чем т, то есть в микросекундном диапазоне, вызванная ими релаксация ССЭ будет сильно зависеть от типа этих движений. Так, например, броуновская угловая диффузия вокруг оси X приводит к следующему спаду ССЭ:

где Их — коэффициент вращательной диффузии вокруг оси X.

Третья глава посвящена исследованию подвижности нироксильных спиновых зондов в молекулярных стеклах орто-терфенила и глицерина при помощи стимулированного спинового эха. В качестве спиновых зондов были использованы следующие нитроксильные радикалы, сильно отличающиеся по размерам:

Е(т, Т)=ехр(-2Их2 (в, <р)<сг> г. г)

(3)

(4)

I

и

III

IV

В настоящей работе для интерпретации экспериментальных результатов впервые была предложена новая модель релаксации ССЭ вследствие медленных инерционных вращений с постоянной угловой частотой. Данный тип движений вокруг оси X приводит к следующей зависимости ССЭ:

Е(2т + Т) ос ехр(-1 Ях{в,(р) | П0т(г + Т)) >(5)

где П0 — параметр, описывающий среднюю частоту вращений. Если частоты вращений распределены по лоренцовскому контуру, то £10 совпадает с полушириной этого контура. Зависимость (5) является экспоненциальным спадом по т с линейным ростом скорости спада от Т, при выполнении условия Т»т, что почти всегда верно для последовательности ССЭ.

336 338 340 342 344 346 Магнктнаа поле, мТ

vo ^. v

500

1000

1000

г, нс

Рис. 1 (а) Спады сигнала эха для Т=0 (двухимульсный эксперимент) в трех положениях спектра, указаных на вставке, (б) Аналогично (а), для Т=8мкс (трехимпульсный эксперимент). (в) Полулогарифмический график отношения кинетик спадов в положениях 1 и 3 спектра на рис. 1(a), для двух различных значений Т, и их линейная 150 2Ó0 250 300 350 400 450 аппроксимация. Зависимости приведены для J- нитроксила II в глицерине при 220К

Спады ССЭ, измеренные при варьировании т и постоянной величине Т, для различных по анизотропии спектральных положений представлены на рис. 1а,б. Анизотропия положений уменьшается с ростом номера. Из рис 1.а,б

видно, что большая анизотропия соответствует более быстрой релаксации. Видимые осцилляции появляются из-за сверхтонкого взаимодействия неспаренного электрона с протонами окружения. Несмотря на то, что анизотропия в положении 3 примерно в 5 раз меньше, чем в положении 1, релаксация в этом положении медленнее всего в два раза. Это объясняется тем, что большой вклад в релаксацию помимо ориентационных движений радикала дает движение протонов окружения. Этот вклад в релаксацию является изотропным.

Чтобы убрать все изотропные вклады и выявить анизотропную часть релаксации, спад кинетики сигнала спинового эха в положении 1 спектра был поделен на кинетику спада в положении 3. Эти положения были выбраны из-за наибольшей разницы в степени анизотропии. Деление сильно подавляет протонную модуляцию, видимую в спадах ССЭ (рис. 1в). Полученные зависимости в полулогарифмическом масштабе могут быть

аппроксимированы прямой линией. Это означает, что вклад движений в релаксацию носит

экспоненциальный характер и может быть описан при помощи одного параметра — анизотропной скорости релаксации \У(Т). Для всех образцов линейный вид

зависимостей отношения кинетик спадов оставался неизменным. Данный вид зависимости ССЭ не может быть вызван броуновской угловой диффузией, которая приводит к квадратичной

?', МКС

Рис. 2 Значения анизотропной части скорости релаксации \У(Т), полученной из линейной аппроксимации логарифма отношения спадов, показанной на рис.1, для радикала II в стеклообразном глицерине для различных температур. Зависимости м01уг быть удовлетворительно аппроксимированы прямыми линиями.

зависимости спада ССЭ от т в полулогарифмическом масштабе согласно выражению (4).

На рис. 2-3 представлены температурные зависимости W(T) от величины Т для различных спиновых зондов в различных изучаемых матрицах.

Наблюдаемые при низких температурах отрицательные значения могут быть объяснены эффектом мгновенной диффузии, который появляется из-за изменения локального магнитного поля на неспаренном электроне радикала вследствие переворота спина соседнего радикала СВЧ импульсом последовательности (эффект становится заметным при концентрациях более 1 мМ). Данный эффект зависит только от концентрации и типа импульсной последовательности и не зависит от температуры и, таким образом, не влияет на интерпретацию данных по подвижности.

б

2-2-

9-

X >"чС

265 К а

Ч,'

263 К.^Г"'' о

260К-«-

4---«

а—255 К

—*—* * * *250 К

—--" " 230К

Т. мкс

Т. МКС

Рис. 3 То же самое, что на рис.2, для различных радикалов в стеклообразном орто-терфе

Все зависимости на рис. 2-3 могут быть аппроксимированы прямыми линиями, что может быть проинтерпретировано присутствием двух типов молекулярных движений.

Вертикальный сдвиг зависимостей \У(Т) при повышении температуры может быть связан с появлением быстрых наносекундных либраций, чей вклад в релаксацию ССЭ согласно выражению (3) не зависит от Т. Данный тип движений был обнаружен ранее в экспериментах двухимпульсного эха и был интерпретирован как имеющий аналогичную природу, что и ангармонические колебания, обнаруженных методами нейтронного рассеяния и Мессбауэровской спектроскопии.

Появление вклада в скорость анизотропной релаксации \У(Т), который линейно увеличивается с ростом Т и возрастает при повышении температуры, находится в согласии с моделью инерционных вращений — см. формулу (5).

Из величины тангенса угла наклона зависимостей \У(Т) на рис. 2-3 можно при помощи выражений (5) и (2) получить температурную зависимость средней скорости инерционного вращения нитроксильных радикалов £20- Эти данные представлены на рис. 4. Можно видеть, что полученные скорости вращения лежат в кГц диапазоне.

Зная величину средней частоты вращений, можно оценить среднюю амплитуду переориентации, наблюдаемых в эксперименте. Для самых высоких измеренных температур амплитуда составила немногим более градуса. Этот экспериментальный результат говорит о том, что данным методом можно исследовать элементарный акт молекулярного вращения.

Геометрические размеры и химическая структура исследуемых в данной главе нитроксильных радикалов существенно отличаются. Однако динамическая картина, наблюдаемая методом стимулированного спинового эха, существенно не меняется. Это говорит о том, что исследуемые переориентации носят коллективный характер, и в них также участвует кластер близлежащих молекул.

4,5 4,6 4,7 4.8 4.9 5,0

1 000/Т, ки

3.7 3,8 3,9

10ОО/Г, К1

Рис. 4 Аррениусовский график для значений частот вращения, полученных из углов наклона прямых на рис.2-3 для глицерина (а) и орто-терфенила (б).Ромбами обозначен нитроксил I, квадратами — нитроксил II, звездами — нитроксил III, закрашенными кругами нитроксил IV, треугольниками соль Фреми из работы [Dzuba 2005].Для сравнения приведены угловые частоты диэлектрической а-релаксации 2nfD (полые круги) из работы [Schneider 1998] для глицерина и работы [Johari 1970] для орто-терфенила. Прямые линии показывают, что зависимости приблизительно линейны. Можно также видеть, что скорости вращения для радикала I немного больше по сравнению с другими радикалами.

Интересно сопоставить эти значения с данными диэлектрической спектроскопии по а-релаксации для чистых матриц (рис. 4). Видно, что коэффициент вращательной диффузии 2nfD (где fD — дебаевская частота релаксации, полученная из максимума положения пика а-релаксации) имеет другую температурную зависимость. Если ввести т0~ 2 х 10~4с для глицерина и т0 ~ 8 х Ю^с для орто-терфенила, то величина îî02t0 будет близка к 2nfD. Возможно, этот факт говорит о том, что диффузия происходит за счет последовательности инерционных вращений на углы порядка £Î0T0.

Четвертая глава посвящена исследованию молекулярной подвижности с помощью эффекта переноса намагниченности из одной сверхтонкой компоненты нитроксила в другую вследствие изменения проекции спина ядра азота. Измерения проводились при помощи двух импульсных последовательностей. Первая двухчастотная последовательность переноса намагниченности ИЛИ ПН (ГСнакачка-Т-я/2д„ект-Т-71де1е1ст-Т-ЭХО)

детектирует распространение

инвертированной импульсом накачки намагниченности из центральной компоненты в низкопольную при помощи двухимпульсной последовательности на детектирующей частоте, как показано на рис. 5. Вторая - одночастотная последовательность инверсии-

восстановления (ИВ) на частоте накачки (^нака1жа~Т-7г/2накачка-Т-7Гиакачка-Т-ЭХО) " была использована для исследования скорости восстановления инвертированной намагниченности в центральной компоненте.

В предыдущих работах по исследованию подвижности нитроксильных спиновых зондов в стеклообразных матрицах с помощью ПН было показано, что изменение проекции спина ядра азота, приводящее к эффекту ПН, может происходить из-за сильного изменения направления оси квантования и последующего переквантования, вследствие переориентации нитроксила на большие углы, в среднем а>п/3. Все экспериментальные данные хорошо описывались моделью переориентаций между двумя неэквивалентными ориентациями с существенной разницей в заселенности. Было показано, что время сближения кинетик ПН и ИВ характерному времени тс, за которое происходит переориентация молекул. Под сближением понимается следующее: сближение зависимостей ПН и ИВ в масштабе —1п(1-Е(Т)) на одну логарифмическую единицу, где Е(Т) - экспериментальная зависимость ПН или ИВ, нормированная на единицу делением на соответствующую аппаратную функцию, записанную в отсутствие первого инвертирующего импульса последовательности. Найденная таким образом частота переориентаций оказалось близкой к частоте диэлектрической Р-релаксации, что позволило

накачка

Магнитное поле, мТ

Рис. 5 Положение импульсов накачки и детектирования в ЭД спектре эксперимента переноса 7намагниченности.

получить новую информацию о молекулярном механизме этого типа движения.

Оказалось, что экспериментальные зависимости ГТН и ИВ в виде -1п(1-Е(Т)) для радикалов I и П сходились на одну логарифмическую единицу при всех измеренных температурах, что дало возможность измерения тс. Однако для радикала III измерить величину тс удалось только выше 255К, так как при более низких температурах зависимости ПН и ИВ не сходились на доступных для измерения временных промежутках (рис. 6).

6 5 4

3 2 1 О -1

-20 0 20 40 60 80 100120

Г

Т. мкс

0 20 40 60 80 100 120

Т, мкс

8-; 4 3-| 2-; п| о;

.11—г..

-го о

¿0 ЙС- 80 10С 1?.0140160 Т. мкс

Рис. 6 Временные зависимости -1п(1-Е(Т)/ Ео(Т)) для нитроксила III в орто-терфениле, где Е(Т) -экспериментальная зависимость ПН или ИВ, нормированная на единицу делением на соответствующую аппаратную функцию, записанную в отсутствии первого инвертирующего импульса последовательности. Вертикальная линия соответствуют сближению зависимостей на одну логарифмическую единицу.

Полученные величины тс были сопоставлены с данными диэлектрической спектроскопии о положении максимума пиков а- и Р-релаксации (рис. 7). Найденная временная шкала переворотов спина ядра азота для радикалов I и II при температурах выше температуры стеклования соответствует их вовлечению в Р-релаксацию. Изменение характера движения при температурах ниже температуры стеклования для зондов I и II может быть объяснено тем, что движения происходят в индивидуальных клетках, и соответствуют высокочастотному краю пика р-релаксации.

^ 6,0-

о

А

)-N

/ \

;,и -н—.—,—.—,—.—,—i—,—.—|——I—,—.—|—.—г—

3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0

юоок/т

Рис. 7 Аррениусовский график зависимости скорости переноса намагниченности tr в орто-тер фениле для нитроксила I - круги, нитроксила II - треугольники, нитроксила III - квадраты. Также на графике приведены литературные данные [Wagner 1999] по а- (ромбы) и р- (звезды) релаксации в чистом орто-терфениле. Видно, что линейные аппроксимации всех зависимостей пересекаются в одной точке. Ниже температуры стеклования для нитроксилов I и II проведены прямые линии, чтобы подчеркнуть изменение температурного поведения.

Найденная временная шкала переворотов ядра азота для радикала 1П на рис. 7 заметно отличается от данных для радикалов I и II. Это позволяет сделать вывод о том, что большие размеры радикала III приводят к тому, что молекулярные движения на пространственном масштабе, имеющей локальный характер, Р-релаксации не могут приводить к эффективным переориентациям радикала III, и только более медленный тип движений, близкий к а-релаксации, происходящей на больших пространственных масштабах, может изменять его пространственную ориентацию. Этот результат дает важную информацию о пространственном масштабе Р-релаксации.

В пятой главе описано применение метода стимулированного спинового эха к исследованию подвижности модельных биологических мембран из ненасыщенного липида 1-пальмитоил-2-олелоил-фосфохолина:

о

о

о

В качестве спиновых зондов были использованы спин-меченые в 5м и 16м положении стеариновые кислоты:

5-ДОКСИЛ-стеариновая кислота (5-ДСК), 16-ДОКСИЛ-стеариновая кислота (16-ДСК).

Были приготовлены ориентированные липидные бислои на стеклянных подложках, так как литературные данные свидетельствовали о неоднородности продольной и поперечной подвижности липидов.

Чтобы выделить вклад анизотропной части скорости релаксации, кинетика спада сигнала эха в положении 1 спектра на рис. 8а была поделена на кинетику спада в положении 2. Данная процедура совпадает с процедурой, изложенной в главе 3. Результат деления представлен на рис. 86 для Т=0 и 4 мкс. Оказалось, что протонная модуляция, видимая в спадах ССЭ на рис. 8а также сильно подавляется этой процедурой (как об этом

говорилось в главе 3). Полученные зависимости могут быть аппроксимированы прямыми линиями. Тангенс угла наклона этих прямых, как и в предыдущей главе, был обозначен ^У(Т).

Полученные температурные зависимости величин ,№(Т) для 5-ДСК и 16-ДСК представлены на рис. 9. На каждом рисунке представлены зависимости для параллельной и

ьоо

Рис. 8 (а) Нормированные спады сигнала эха по т при Т=4 мкс в двух позициях спектра, показанных на вставке, (б) полулгарифический график зависимости отношения кинетик этих спадов и спадов при Т=0 и 4 мкс, и их линейные аппроксимации. Для удобства восприятия зависимости сдвинуты по вертикали. Температура 145 К, образец 5ДСК в перпендикулярной ориентации.

перпендикулярной ориентации внешнего магнитного поля

относительно нормали мембраны. Можно

заметить, что

ориентационной зависимости в поведении практически не наблюдается. Все

зависимости могут быть хорошо аппроксимированы прямыми линиями.

Отрицательные значения W(T) могут быть объяснены

Г

р.,

^ 117 К

Т, мкс Т. МКС

Рис. 9 Температурная зависимость скорости анизотропной релаксации >У(Т) для 5-ДСК (вверху) и для 16-ДСК (внизу) в ориентированных бислоях ПОФХ для параллельной и перпендикулярной ориентации нормали бислоя относительно внешнего магнитного поля.

эффектом мгновенной диффузии, как и в главе 3.

Увеличение отсечения при Т=0 свидетельствует о наличии быстрых движений и находится в согласии с литературными данными по динамике различных спин-меченых молекул в липидных бислоях.

Линейный рост \У(Т) с увеличением задержки Т говорит о наличии в исследуемой матрице микросекундных переориентаций. Они появляются одновременно с быстрыми наносекундными либрациями, и могут быть объяснены моделью инерционных вращений. Можно видеть, что ориентационная динамика в мембране ПОФХ имеет гетерогенный характер, и появляется при температуре около 120 К для 5-ДСК и около 80 К для 16-ДСК. Из увеличения угла наклона зависимостей W(T) была найдена величина средней частоты вращений Результат представлен на рис. 10.

Зная среднюю частоту вращений, можно оценить их амплитуду, наблюдаемую в эксперименте. Она составляет величину порядка одного градуса при самых высоких измеренных температурах.

В данной главе были описаны результаты

примененного впервые подхода к исследованию молекулярной динамики липидных бислоев в

8 9 10 11 1000/Т, К"1

Рис. 10 Скорости вращения, полученные из углов линейной аппроксимации зависимостей на рис.26-27 для 5ДСК (квадраты) и 16ДСК (круги). Линии нарисованы для удобства восприятия.

микросекундном диапазоне на сверхмалые углы. К сожалению, полученные результаты сложно сравнить с литературными данными из-за разницы в чувствительности методов. Так, например, метод твердотельной ЯМР спектроскопии перестает быть чувствительным к ориентационным движениям в липидах при температурах около 240К.

Шестая глава посвящена исследованию влияния холестерина на молекулярную подвижность липидов в многослойных неориентированных везикулах из ненасыщенного липида ПОФХ. Структура холестерина приведена на рис. 11. Исследовано два типа образцов: чистый липид и липид в смеси с холестерином в молярном соотношении 1:1.

В качестве спиновых зондов были взяты следующие спин-меченые липиды:

Рис. 11 Структура холестерина

1-пальмитош1-2-олеоил-глицеро-3-фосфо(ТЕМРО)холин, 1-пальмитоил-2-стеароил-5-ООХУЬ-п1ицеро-фосфохолин,

1- палъмитоил-2-стеароил-Ю-ООХУЬ-глицеро-фосфохолин, 1- пальмитоил-2-стеароил-16-ПОХУ1^глицеро-фосфохолин.

Определение W(T) проводилась так же, как в предыдущей главе. Экспериментальные температурные зависимости '\У(Т) для всех образцов могут быть аппроксимированы прямыми линиями (рис.12), что может быть объяснено одновременным наличием в системе 2х типов движения: быстрых либраций и медленных инерционных вращений.

Из представленных на рис. 12 зависимостей видно, что присутствие холестерина по-разному влияет на подвижность в различных положениях липидного бислоя. Также можно видеть, что он по-разному влияет на быстрые и медленные движения, детектируемые стимулированным эхо. Для положения метки в полярной головке и 5-м положении ацильной цепи холестерин увеличивает интенсивность быстрых либраций и очень сильно подавляет медленные вращения, что можно видеть из параллельности зависимостей W(T). Для 10-го положения спиновой метки ситуация меняется: холестерин ускоряет быстрые движения и практически не меняет скорости медленных вращений. Для 16-го положения спиновой метки в ацильной цепи холестерин значительно усиливает оба типа движений.

Т.мкс

т, мкс

Рис. 12 Температурные зависимости анизотропной скорости релаксации \У(Т) для спин-меченых липидов 1 чистом ПОФХ (слева) и ПОФХ с холестерином в молят ном соотношении 1:1 (справа)

Усиление холестерином быстрых либрации может быть объяснено упорядочивающим эффектом холестерина, который способствует распутыванию цепей жирных кислот липидов, что может способствовать усилению либраций. Эффект усиления холестерином быстрых либраций был обнаружен ранее для насыщенных липидов при помощи двухимпульсной последовательности.

Подавление медленных вращений в полярной головке, и в 5м положении ацильной цепи может быть объяснено конденсирующим эффектом холестерина, который состоит в том, что глобальная структура бислоя в присутствии холестерина становится жестче.

По нашим данным, эффект усиления холестерином движений в глубине мембраны (для 16го положения) раньше в литературе не был описан, несмотря на большое количество статей по исследованию молекулярных движений в мембранах. Мы предполагаем, что эффект усиления холестерином динамики в липидном бислое появляется из-за специфики движений, видимых при помощи ЭСЭ. Данный метод чувствителен к малоамплитудным переориентациям порядка 0,1-1°, невидимым для методов 2Н ЯМР и стационарного ЭПР. Обнаруженное усиление движений может быть объяснено тем, что холестерин влияет на динамику липидов только жестким стерольным остовом, как схематически показано на рис.13. В центре же бислоя может оказаться больше свободы для малоугловых молекулярных движений.

Рис. 13 Схема предполагаемого механизма влияния холестерина на микросекундные переориентации,

видимые методом ССЭ. Вблизи полярной головки мембраны присутствие жесткого стерольного скелета подавляет коллективные переориентации неполярных хвостов. Но после Юго положения стерольный скелет заканчивается и общая свобода для движений увеличивается по сравнению с мембраной без холестерина.

Цитированная литература

Dzuba S.A., Kirilina Е.Р., SaJnikov E.S., Kulik L.V. Restricted orientational motion of nitroxidesin molecular glasses: Direct estimation of the motional time scale basing on the comparative study of primary and stimulated electron spin echo decays// Journal of Chemical Physics. - 2005. - Vol. 122 - P.094702

Johari G.P., Goldstein M. Viscous liquids and the glass transition. II. Secondary relaxations in glasses of rigid molecules // Journal of Chemical Physics. - 1970. - Vol. 53. - P. 2372-2388 Schneider U., Lunkenheimer P., Brand R., Loidl A., Dielectric and far-infrared spectroscopy of glycerol // Journal ofNon-Ciystalline Solids - 1998. - Vol. 235. P. 173-179 Wagner H., Richert R. Equilibrium and Non-Equilibrium Type p-Relaxations: d-Sorbitol versus o-Terphenyl // Journal of Physical Chemistry B. - 1999. - Vol. 103. - 4071

выводы

1. Предложена модель инерционного вращения спиновых зондов и меток в молекулярных стеклах и биологических мембранах, которая находится в согласии с данными метода стимулированного спинового эха.

2. Для молекулярных стекол показано, что частоты вращения существенно отличных по размерам зондов одинаковы, что позволяет сделать вывод о коллективной природе обнаруженных движений.

3. Метод переноса намагниченности в стекле орто-терфенила для различных по размерам зондов показал, что небольшие по размеру зонды принимают участие в движениях с характерными временами Р-релаксации Джохари-Голдштейна, в то время как объемный зонд исключается из этих движений, и его подвижность обуславливается только а-релаксацией. Это дало дополнительное подтверждение тому, что перенос намагниченности чувствителен к Р-релаксации, а также позволило оценить пространственный масштаб релаксации Джохари-Голдштейна.

4. Показано, что молекулярная подвижность в виде быстрых стохастических либраций и инерционного вращения в липидных бислоях из

ненасыщенного липида ПОФХ появляется при очень низких температурах: -80 К в глубине мембраны и —120 К вблизи ее поверхности. 5. Показано, что присутствие холестерина в мембране усиливает быстрые наносекундные либрации по всей ее глубине. Вблизи поверхности мембраны холестерин подавляет медленные инерционные вращения, что может быть объяснено конденсирующим эффектом холестерина. В глубине мембраны присутствие холестерина эти вращения усиливает, что может быть объяснено большей свободой для движений из-за того, что стерольный остов здесь заканчивается.

Основные результаты опубликованы в следующих работах

1. Isaev N.P., Dzuba S.A. Fast Stochastic Librations and Slow Rotations of Spin Labeled Stearic Acids in a Model Phospholipid Bilayer at Cryogenic Temperatures //J. Phys. Chem. B. - 2008. — Vol. 112.-P. 13285-13291

2. Isaev N.P., Kulik L.V., Kirilyuk I.A., Reznikov, V. A., Grigor'ev, I. A., Dzuba, S. A. Fast stochastic librations and slow small-angle rotations of molecules in glasses observed on nitroxide spin probes by stimulated electron spin echo spectroscopy // J. Non-Cryst. Solids. - 2010. - Vol. 356. - P. 1037-1042

3. Isaev N.P., Syryamina V.N., Dzuba S.A. Influence of Cholesterol on Molecular Motions in Spin-Labeled Lipid Bilayers Observed by Stimulated ESE // Appl. Magn. Reson. - 2010. - Vol. 37. - P. 405-413

4. Isaev N.P., Syryamina V.N., Dzuba S.A. Small-Angle Orientational Motions of Spin-Labeled Lipids in Cholesterol-Containing Bilayers Studied at Low Temperatures by Electron Spin Echo Spectroscopy // J. Phys. Chem. B. - 2010. -Vol. 114.-P. 9510-9515

5. Isaev N. P.; Dzuba S. A. Nitrogen nuclear spin flips in nitroxide spin probes of different sizes in glassy o-terphenyl: Possible relation with alpha- and beta-relaxations // J. Chem. Phys. - 2011. - Vol. 135. - P. 094508

Автореферат

Формат бумаги 60*84 1/16, Объем 1,25 п. л., тираж 120 экз. Заказ №200

Отпечатано в типографии ЗАО РИЦ «Прайс-курьер», г. Новосибирск, ул. Кутателадзе, 4г, оф. 310, тел. (383) 330-7202

61 12-1/910

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ КИНЕТИКИ И ГОРЕНИЯ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ИСАЕВ НИКОЛАЙ ПАВЛОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ПОДВИЖНОСТИ СПИНОВЫХ ЗОНДОВ И МЕТОК МЕТОДАМИ СТИМУЛИРОВАННОГО ЭЛЕКТРОННОГО СПИНОВОГО ЭХА И ПЕРЕНОСА НАМАГНИЧЕННОСТИ

01.04.17 - химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: д. ф. - м. н., проф. Дзюба С.А.

НОВОСИБИРСК-2012

Содержание

Введение 5

Глава 1. Литературный обзор I: исследование молекулярных движений в 8 неупорядоченных средах

1.1 Исследование молекулярной динамики в стеклообразных 8 средах

1.2 Методы ЭПР нитроксисльных спиновых зондов для 11 исследования динамики в неупорядоченных средах

1.3 Биологические и модельные мембраны и методы 16 исследования их молекулярной подвижности

1.4 Исследование подвижности и в мембранах методами ЭПР 21

Глава 2 Литературный обзор II: Теоретическое описание спадов 26 стимулированного эха

2.1 Введение 26

2.2 Спектр нитроксильного радикала 26

2.3 Расчет изменения Ларморовской частоты спина электрона из- 30 за переоринетаций молекулы

2.4 Расчет релаксации двухимульсного и стимулированного 31 спинового эха

2.6 Постановка задачи 35

Глава 3. Исследование подвижности нитроксильных спиновых зондов в 37 молекулярных стеклах глицерина и орто-терфенила методом ССЭ

3.1 Введение 37

3.2 Модель медленных инерционных вращений 38

3.3 Эксперимент 39

3.4 Результаты 40

3.5 Обсуждение 46

3.6 Заключение 52

Глава 4. Исследование подвижности в орто-терфениле методом 53 переноса намагниченности.

4.1 Введение 53

4.2 ЭПР измерения 54

4.3 Интерпретация эффекта переноса намагниченности 56

4.4 Результаты 58

4.5 Обсуждение 62

4.6 Выводы 66

Глава 5. Исследование подвижности спин-меченых стеариновых кислот 67 в мембранах методом анализа релаксации спадов ССЭ

5.1 Введение 67

5.2 Эксперимент 68

5.3 Результаты 69

5.4 Обсуждение 75

5.5 Выводы 79

Глава 6. Исследование влияние холестерина на подвижность спин- 80 меченых липидов

6.1 Введение 80

6.2 Эксперимент 81

6.3 Результаты 83

6.4 Обсуждение 86

6.5 Заключение 91

Выводы 92

Благодарности 93

Список литературы 94

Введение

Динамика молекул в биологических системах определяет многие важные протекающие в них процессы. На данный момент существует множество методов исследования молекулярной подвижности в широком диапазоне амплитуд и времен корреляции - такие как диэлектрическая спектроскопия, рассеяние света, нейтронное рассеяние, спектроскопии ядерного магнитного и электронного парамагнитного резонанса, деполяризация флуоресценции и другие. Однако несмотря на широчайшие исследовательские возможности, некоторые закономерности движений на молекулярном уровне до сих пор не поняты.

Джохари и Голдштейном [1оЬап 1970] было обнаружено, что динамика в неупорядоченных средах имеет два различных типа движений. Если первый тип объяснялся вязкостной релаксацией, то природа второго типа движений, названного релаксацией Джохари-Голдштейна не ясна до сих пор, несмотря на десятилетия интенсивных исследований различными методами. Данный тип движений был обнаружен в широком спектре всевозможных матриц от стекол простых органических растворителей до полимеров и белков. Проблема состоит в том, что применяемые методы исследования не были достаточно чувствительны к молекулярному механизму переориентаций.

Для биологических макромолекул динамика непосредственно связана с их структурой и функционированием. Методы, специфически чувствительные к определенному типу движений, могли бы выявлять детали структуры макромолекулы и ее локального окружения, помочь понять особенности ее функционирования.

Таким образом, развитие новых методов исследования молекулярной динамики, чувствительных к недоступным ранее типам движений, является актуальным направлением для современной науки.

Метод стационарного электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) успешно используется для изучения динамики в разнообразных системах в течение долгого времени [НиЬЬе1 1969]. В настоящее время актуальность данного метода только усиливается из-за прогресса в области химического присоединения стабильных радикалов (в основном нитроксильных), или, по-другому, спиновых меток, к молекулам белков, что позволяет исследовать их конформации через

локальную подвижность спиновых меток [Hubbel 2000, Möbius 2005]. Замечательной особенностью данного метода является то, что он применим при физиологических температурах, что позволяет получать структурную информацию о биологических макромолекулах в нативных условиях.

Импульсный ЭПР в настоящее время чаще всего используется для определения структурных особенностей биологических макромолекул. Данный метод имеет свои минусы: эффект электронного спинового эха (ЭСЭ) можно наблюдать только в сильно иммобилизованных матрицах, что для биологических объектов означает их глубокую заморозку. Однако информативность методов импульсного ЭПР в значительной степени перекрывает этот существенный недостаток. Наиболее часто используемым на данный момент методом ЭПР является метод двойного электрон-электронного резонанса (ДЭЭР) [Milov 1981, Jeschke 2002], который позволяет определять расстояния в нанометровом диапазоне (2-8 нм) между двумя парамагнитными частицами. В качестве последних чаще всего выступают спиновые метки [Steinhoff 2004] или другие парамагнитные центры в белке [Kay 2007]. Измерение нескольких расстояний между различными частями белка позволяет получать существенную информацию о его конформации, а так же ее изменениях вызванных функционированием белка. Также крайне популярным методом является двойной электрон-ядерный резонанс (ДЭЯР), который позволяет исследовать расположение магнитных ядер вокруг парамагнитной частицы. Данный метод оказался особенно полезным для изучения кластеров металлов в фотосинтетических белках [Kulik 2007].

Структурные методы ДЭЭР и ДЭЯР требуют возможности наблюдения спинового эха на больших временах, что требует медленной релаксации. При повышении температуры методы теряют свою информативность из-за ускорения продольной и поперечной релаксации спина электрона, возникающего вследствие молекулярной подвижности. Это приводит к уменьшению временного интервала, на котором можно проводить структурные исследования методами ДЭЭР и ДЭЯР. Таким образом, спиновая релаксация во многих случаях является нежелательным эффектом в импульсном ЭПР. С релаксацией борются, понижая температуру и заменяя атомы водорода в окружении парамагнитной частицы на атомы дейтерия, так как движения протонов матрицы около парамагнитной частицы является эффективным механизмом релаксации. Взаимодействие

неспаренного электрона с атомами дейтерия примерно в 7 раз слабее, что существенно увеличивает время релаксации.

Поскольку причиной ускорения релаксации являются молекулярные переориентации, то было показано, что негативный ранее эффект спиновой релаксации можно использовать для изучения молекулярной подвижности [МПШашег 1984, ишЪа 1992] в наносекундном временном масштабе. На этой временной шкале в исследованных иммобилизованных системах, таких как органические стекла [КшНпа 2001], или биологические мембраны при низких

л

температурах [Еи1оу 2004], происходят молекулярные ангармонические колебания в клетке молекул окружения. Исследуя их можно получить информацию о локальной жесткости матрицы вблизи спиновой метки. Дальнейшее развитие данный метод получил в работе [БгиЬа 2005], где была показана принципиальная возможность исследования при помощи импульсного ЭПР микросекундных переориентаций нитроксильных радикалов. Это может быть использовано для изучения более глобальных коллективных молекулярных переориентаций. Специфика импульсного ЭПР состоит в уникальной чувствительности к малоугловым молекулярным движениям на углы порядка 0,11°, которые недоступны для исследования другими экспериментальными подходами, а также к их молекулярному механизму переориентаций.

Таким образом, развитие методов исследования молекулярной подвижности при помощи релаксации ЭСЭ и их приложение может дать возможность получения принципиально новых экспериментальных данных о подвижности и структуре на молекулярном уровне в стеклообразных матрицах и биологических системах.

Глава 1. Литературный обзор I: исследование молекулярных движений в неупорядоченных средах

1.1 Исследование молекулярной динамики в стеклообразных средах

Стеклообразными средами называют вещества в твердом неупорядоченном состоянии. В них отсутствует дальний порядок в расположении атомов или молекул. При этом в ближайшем окружении молекулы межмолекулярные углы и расстояния несильно отличаются от их значений в кристалле.

Для описания стеклообразных сред вводится понятие температуры стеклования Тё, которая отделяет твердое стекло от сильновязкой жидкости. Так как стеклование не является фазовым переходом, то температура стеклования имеет формальное определение, как температура, при которой характерное время структурной релаксации больше времени проведения эксперимента, что

3 12

соответствует временам корреляции движения 10 с или вязкости 10 Па*с.

Ориентационные движения, такие как вращения, в неупорядоченных стеклообразных средах удобнее всего исследовать методом широкополосной диэлектрической спектроскопии [Кгешег 2002], в котором исследуется частотная зависимость комплексной диэлектрической проницаемости:

е(ш) = е'(ш) + ¿е"0). Максимум частотной зависимости е"(ш) соответствует совпадению частоты электрического поля и скорости ориентационной релаксации 1/тд, которая порядка обратного времени вращения. Обычно для визуализации экспериментальных зависимостей используют величину тангенса диэлектрических потерь = е"(ш)/е'(ш). Широкополосная

диэлектрическая спектроскопия чувствительна к переориентациям в диапазоне КГ'М^с1.

В 1940-е годы было установлено, что частотная зависимость диэлектрических потерь для полимеров имеет не один максимум, а два. Это было объяснено различиями в подвижности остова полимера и боковых групп. Однако в работе Джохари и Голдштейна было показано, что в стеклах простых органических растворителей диэлектрические потери также имеют два максимума[ДоЬаг1 1970]. Второй, более высокочастотный, пик, также как и в полимерах имел значительно меньшую амплитуду и был заметно шире, что, по-видимому, мешало его более раннему обнаружению. Согласно принятой терминологии, низкочастотный максимум соответствует а-релаксации, а высокочастотный р-релаксации.

При повышении температуры пики а- и Р-релаксации сближаются, и примерно при температуре стеклования пик Р-релаксации становится неразличимым на фоне пика а-релаксации.

Природа низкочастотного пика а-релаксации определена, так как температурная зависимость времен ориентационной релаксации td, получаемой из экспериментов по диэлектрической релаксации очень хорошо коррелирует со значениями вязкости, что говорит о том, что это структурная релаксация [Rôssler 1990]. Для низкомолекулярных жидкостей хорошо работает формула Стокса-Энштейна-Дебая для вращательной подвижности молекул:

4 77

т = з пакт'

где г - время корреляции, г\ - коэффициент динамической вязкости, а -характерный размер молекулы. Это соотношение хорошо описывает экспериментальные данные, начиная от малых значений вязкости вплоть до состояния стекла.

Высокочастотный максимум Р-релаксации имеет другую температурную зависимость и характеризуется меньшей энергией активации. Этот тип релаксации обнаружен во всех исследуемых органических стеклах [Haddad 1978, Johari 1986, Hansen 1997], в пластических [Parthasarathy 1983] и жидких [Parneixa 1987, Vallerien 2006] кристаллах и полимерах [Williams 1971, Roland 2004]. Он не связан с внутренней конформационной динамикой молекул или иной спецификой строения молекул, так как он сходным образом появляется и в низкомолекулярных стеклах, где нет внутренних степеней свободы, и в намного более сложных полимерах.

Таким образом, экспериментальные результаты по диэлектрической спектроскопии показывают, что ß-релаксация скорее всего является общим свойством всех неупорядоченных сред.

Однако метод диэлектрической релаксации обладает серьезным недостатком - он нечувствителен к механизму молекулярных движений. Также он не различает движения кластеров молекул от движений всех молекул среды в целом. Таким образом, несмотря на информативность в широчайшем частотном диапазоне, данный метод оставляет некоторые важные вопросы открытыми.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) также широко используется для исследования подвижности в стеклообразных средах [Böhmer 2001]. Молекулярные реориентации проявляют себя в спин-решеточной релаксации ядер Ti согласно следующей формуле:

где тс - время корреляции движения, а ш - Ларморовская частота исследуемого ядра.

Так как функция корреляции магнитного диполь-дипольного взаимодействия, вызывающего релаксацию, в методе ЯМР спадает быстрее, чем функция корреляции вектора электрического дипольного момента, то время тс, определяемое из ЯМР [Blochowicz 1999] в несколько раз меньше, чем время т0, определяемое диэлектрической спектроскопией. Но так как изменения в масштабах времен корреляции вблизи температуры стеклования идет на многие порядки, то эта разница в логарифмическом масштабе практически не видна, и данные двух методов хорошо согласуются.

При температуре ниже температуры стеклования характерные времена первичной а-релаксации существенно больше времени ЯМР эксперимента, поэтому в низкотемпературной области вклад в релаксацию ядер дает только процесс ß-релаксции. При прохождении точки бифуркации (объединения) двух типов релаксций, меняется температурная зависимость Ть так как происходит переход с режима ß-релаксации к режиму а-релаксации, у которой энергия активации больше [Schnauss 1992, Hinze 1996], что приводит к излому на зависимостях времен продольной релаксации ядер.

Также были выполнены многочисленные теоретические работы, в которых были сделаны попытки объяснить природу динамического перехода

при температуре стеклования [Adam 1965, Cohen 1981, Kivelson 1995, Lubchenko 2007]. Однако несмотря на большое количество как экспериментальных, так и теоретических работ в этой области, молекулярный механизм ß-релаксции до сих пор не ясен [Ngai 2007].

1.2 Методы ЭПР нитроксильных спиновых зондов для исследования динамики в неупорядоченных средах

Поскольку большинство молекул не парамагнитно, то для исследования их подвижности методами ЭПР требуется введение парамагнитных частиц, например, стабильных радикалов. Наиболее часто используемыми являются нитроксильные радикалы. В методе ЭПР выделяют два основных способа исследования молекулярной динамики при помощи нитроксильных радикалов: метод спиновых зондов и метод спиновых меток, которые отличаются по типу взаимодействия нитроксила с исследуемыми молекулами. Метод спиновых зондов заключается в том, что радикал растворяется в исследуемой матрице и повторяет ее движения. Метод спиновых меток - в том, что молекула радикала присоединяется к определенному месту исследуемой молекулы химической связью, что позволяет получать данные о подвижности различных частей макромолекул полимеров или белков.

Форма линий стационарного спектра ЭПР чувствительна к

11 п

переориентациям нитроксильного радикала в диапазоне 10" -10" с. Исследование молекулярной подвижности в стеклообразных матрицах показало появление при температурах выше температуры стеклования ангармонических движений с временами корреляции Ю"10-Ю"9с и амплитудой порядка десяти градусов [Paschenko 1999, Vorobiev 2000]. Также из формы линий можно получать информацию о более медленных движениях, вплоть до времен корреляции 10"7с [Freed 1972]. Однако в данном случае появляется неоднозначность в интерпретации формы спектра, так как использование различных моделей движения для симуляции спектров могут приводить к разнице в получаемых временах корреляции почти на порядок.

С целью расширения доступного для исследования методом ЭПР временного диапазона, был разработан метод переноса насыщения [Hyde 1970]. Данный метод основан на том, что в нем помимо основной гармоники модуляции поля Во, на которой происходит регистрация сигнала, используется еще одна, на которой происходит насыщение сигнала ЭПР. Последняя сдвинута на 90° по фазе относительно первой. Это приводит к стационарному состоянию, определяемому конкуренцией насыщения сигнала второй частотой и вращательной диффузией. Анализ ЭПР спектров переноса насыщения позволяет исследовать намного более медленные движения с временами корреляции до 10" З�