Доменная организация Cro репрессора бактериофага лямбда (по данным термодинамических исследований) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

Рогов Владимир Витальевич

УДК 577.962

ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Сго РЕПРЕССОРА БАКТЕРИОФАГА X (ПО ДАННЫМ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ)

02.00.10. - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

москва 1995

Работа.выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук С.А. Потехин

Официальные оппоненты:

доктор химических наук A.M. Копылов

кандидат физико-математических наук A.A. Макаров

Ведущая организация

Институт Оиоорганической химии РАН, Путинский филиал

И И

Защита диссертации состоится 2„8 ФЕВРАЛЯ 1995 г. в I5 часов на заседании специализированного совета Д.053.05.4? по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, В-234, Воробьевы горы, МГУ, химический Факультет, лабораторный корп."А", ауд.501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан ¿-6 'АН ЬАРЯ 1995 г.

Ученый секретарь / ^

специализированного совету' / "

кандидат химических на^к .V' И.Г. Смирнов;

7 - 7

/

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время проблема специфичности ДНК-белкового взаимодействия является одной из самых актуальных в молекулярной биологии, а вследствие становления и развития генотерапии она приобретает и особую практическую значимость. Становится необходимым уметь управлять специфичностью, то есть научиться конструировать новые или модифицировать уже известные регуляторные ДНК-узнающие белки с целью придания им способности опознавать те или шше наперед заданные последовательности ДНК.

Современные представления о процессе формирования внсокоспецифичного ДНК-белкового комплекса предполагают наличие глубоких конформационных изменений, происходящих со взаимодействующими макромолекулами. Поэтому исследование и моделирование ,ДНК-белковых взаимодействий требуют знания всех нюансов структуры белка, еб динамики и энергетики, так как именно уникальная пространственная структура является молекулярным базисом 1>ункциоияльноЛ активности белков. Только детальное понимание закономерностей Формирования и поддержания структуры белка может дать возможность целенаправленно изменять его функциональные свойства.

В этом светя представляется особо важным и актуальньм исследование термодинамических свойств ДНК-связыванцего белка и сопоставление этих свойств с особенностями его структуры. Полученная таким образом структурно - термодинамическая информация может служить основой для количественного анализа функциональной активности и влияния на эту активность возможных изменений первичной структуры белка.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в создашш адекватной модели структурно-термодинамической организации Сго реггресеора фага А. (Ого). Для этого был получен широкий набор мутантннх |£юрм Ого с повышенной термостабильностью и проведено сравнительное исследование их физико-химических свойств. На основе результатов исследования была предложена универсальная структурно-термодинамическая модель, объясняющая влияние каждой изученной аминокислотной замены на свойства данного белка.

Научная новизна. Б работе впервые показано, что небольшой глобулярный белок может содержать в своей структуре несколько

взаимодействующих кооперативных единиц (доменов), которые при определенных условиях способны проявлять себя независимым образом. Показано также, что в ходе тепловой денатурации его репрессора образуется промежуточный надмолекулярный комплекс, формирующийся из двух частично денатурированных молекул белка. Свойства этого комплекса объясняют неожиданно сильное влияние ряда аминокислотных замен на поверхности белковой глобулы на тепловую стабильность Сго.

Практическая значимость работы. Результаты работы могут представлять интерес для количественной интерпретации данных ДНК-белкового взаимодействия, для определения механизма влияния точечных аминокислотных замен на стабильность и кооперативность структуры белковых макромолекул и их функциональную активность. Полученные результаты могут быть использованы также в исследовании процессов формирования уникальной пространственной структуры белков (фолдинга).

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Химия белков" (Тбилиси, 1990), УП конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 199Г), Советско-германской рабочей встрече по биотехнологии (Пущино, 1993) и V летней школе по биофизике (Ровинь, Хорватия, 1994)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатные, работ.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на страницах и включает в себя рисунков. Диссертация состоит из

введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения. Работа завершается основными выводами и списком датируемой литературы.

II. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Г. Получение набора лутанткых форм Ого. Стабильность природного Сго (Сго_\у1;), как и большинства других ДНК-узнакхцих регуляторных белков, невелика. Однако, наиболее информативным для понимания влияния точечных аминокислотных замен на структуру и доменную организацию бежа является исследование его мутантных форм с существенными отличиями в стабильности. Поэтому, на первом этапе работы была поставлена задача получения набора термостабильных мутантных форм Сго.

Соответствующие гены были получены рекомбинацией фрагментов гена его, кодирующих отдельные известные стабилизирующие мутации. Из предоставленного нам другими лабораториями гена белка дикого типа и 3-х вариантов гена сго, кодирующих термостабилизированные формы белка:

1) Сго с аминокислотной заменой Уа155-Суэ (СгоУ55С);

2) Сго с двойной аминокислотной заменой СШб-Ьеи и Туг26-АБр (Сго01бЬ/У26Б);

*3) Сго с встроенными дополнительными р-поворотом и участком цепи второго мономера, формирующий в растворе стабильные мономеры (Сго_т),

нами были сконструированы еще б генов, содержащих те же аминокислотные замены, но в других сочетаниях:

1) Сго с заменой С1п16-Ьеи (СгоС}1бЬ);

2) Сго с заменой Туг2б~Азр (СгоУ26Б);

3) Сго с двойной заменой С.1п16-Ьеи и Уа155-Суз (Сго01бЬ/У55С);

*4) Мономерная форма Сго с аминокислотной заменой С1п16-Ъеи

(Сго_т<21бЬ);

*5) Мономерная форма Сго с шестью удаленными С-концевыми аминокислотами (Сго );

*6) Предыдущая "укороченная" мономерная форма Сго с заменой Г.1Ш б-Ьеи (Сго_т(316Ь_г).

Кроме того, путем введения терминирующих кодонов ТСА внутрь кодирующей последовательности, были получены две формы (фрагмента) Сго с нолипептидной цепью, укороченной с С-конца на 12 остатков: Фрагент белка Сго_«Н (Сго_щг1;_1;) Фрагмент белка СгоСИбЪ (СгоС16Ь_1).

5 данной работе представлены результаты исследования 1гроизь.>динх Сго репрессора о точечными аминокислотными заменами. Исследование мономерных: форм белка выведено за рамки диссертации.

ЕсоМ

Есой!

А)

ЕсоМ Ш16-Р „ (У55-С)

I-I—-УШ/Щ Лигироеоние ^-,

НмсНП ВотН1 у ВатН1 Нт<Ш

ЕсоЯ!

(016-1)

Нтс1Ш

Б)

123 4567 89 10 - ' \ / \ л Л /-V /~\ >

Рисунок 1. А) Схема получения рекомбинантного гена его, кодирующего белок Сго<216Ь/У55С.

Б) Электрофореграмма содержания белков в рекомбинантных клонах после индукции ГРТС.

Дорожки: 1 и 4 - Сго_уИ вместе с СгоУ55С как маркеры электрофоретической подвижности. Молекулярная масса 01*07550 в два раза больше Cгo_wt из-за ковалентной связи между субъедапшцами.

2-3 й 5-10 - тестируемые клоны; клоны на дорожках 5 и 7 содержат исходный белок Сго_т<3161,_1;, клоны на дорожках 3, 6, 9 и 10 содержат рекомбинантный белок, перешитый 5-Б мостиком.

Для облегчения последующего определения нуклеотидных последовательностей полученных рекомбинантных генов фрагмент исходной плазмиды для экспрессии, содержащий ген белка Сго755С под

управляемым tac- промотором, был субклонирован в плазмиду pTZ18U. Данная плазмида содержит сайт начала репликации фага Í1 и при помощи фага-хелпера (К07 или R408) может быть легко получена ее одноцепочечная копия. В дальнейшем рекомбинантные гены получались на основе этой конструкции и присутствие в них определенных мутаций подтверждалось секвенированием.

Выбор рекомбинантных клонов проводили по подвижности экспрессируемого продукта в полиакриламидном геле. Использование генов мономерных форм Сго, резко отличающихся по электрофоре тической подвижности от Cro_wt, существенно упростило и ускорило работу. На рис. 1 показана схема эксперимента по конструированию, скринингу и экспрессии новых форм белка Сго.

Каждая мутантная форма Сго была выделена в количествах, достаточных для проведения физико-химических исследований (порядка 100 мг), и очищена до высокой степени гомогенности (> 98 %).

II. Структурные исследования мутпжшх форм Сго

Необходимым условием для проведения сравнительного термодинамического анализа мутантных форм бежа является устойчивость исходной нативной структуры к аминокислотным заменам. Если при введении замен структура белка значительно искажается, то количественная интерпретация термодинамических данных становится затруднительной или вообще невозможной. Поэтому методами кругового дихроизма (КД) и Н1-ЯМР кавдая мутантная форма Сго исследовалась на предмет выявления в ней значительных конформационных изменений по сравнению со структурой Cro_wt. Спектры КД некоторых форм Сго в сравнении со спектрами Cro_wt представлены на рис. 2.

tfavelenght (nin) Wavelength (nm)

Рисунок 2. Спектры кругового дихроизма некоторых форм Сго в 20 мМ ацетате калия, рН = 5,0.

A) в дальней (190-240 нм) ультрафиолетовой области;

Cro_wt (-), CroY26D (-----) и CroQ16L/Y26D (______);

B) в ближней (840-300 нм) ультрафиолетовой области; обозначения те же.

По результатам анализа спектров кругового дихроизма и ЯМР можно сделать два вывода:

а) все выделенные нами белки действительно являются производными Сго репрессора бактериофага X и

б) пространственные структуры этих, производных не отличаются существенно от структуры бежа дикого типа.

Тем не менее, термодинамические характеристики исследованных форм Сго сильно различаются.

III. Сравнительное термодинамическое исследование

Ввиду близости нативных структур всех исследованных форм Сго следовало ожидать, что их термодинамические параметры, как бы сильно они не варьировали от одной формы к другой, должны описываться единой термодинамической моделью. Для получения такой модели был тщательно исследован СгоУ55С. В этом белке из-за межсубъединичной дисульфидной связи, спонтанно образуемой двумя введёнными остатками цнетеина, разрушение третичной структуры белка не сопровождается диссоциацией полипептидных цепей и, как следствие, форма кривых плавления не должна зависеть от концентрации бежа.

а) Струтурно-термодинатческое исследование СгоУ55С

По аналогии с другими небольшими глобулярными белками можно было предположить, что нативная структура ковалентно-перешитой формы Сго должна разрушаться под действием температуры в одну стадию по мономолекулярному механизму:

(1)

где N соответствует нативной конформации бежа, а Б - денатурированной.

Однако температурные зависимости парциальной теплоемкости СгоУ55С имеют четкий бимодальный характер (рис. За). При этом сложность калориметрических кривых плавления нельзя объяснить наличием необратимых явлений, так как тепловая денатурация этого белка практически полностью обратима при нейтральных и кислых значениях рН. Форма кривых плавления белка зависит от величины рН: с понижением рН пики теплопоглощения сдвигаются в область более низких температур.

Модификация йодацетамидом уникальных цистеинов СгоУ55С приводит к радикальной трансформации кривой плавления - она становится похожей на кривую плавления Сго_му1,.

А) Б)

Temperature, К Temperature, К

В)

8.0 6.0 5,а 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0

ррм

Рисунок 3. А) Температурная зависимость молярной парциальной теплоемкости CroV55C в 20 мМ ацетате калия, рН=5,0;

Б) Температурные зависимости молярной эллиптично с ти CroV55C

(20 мМ ацетат калия, рН=5,0) на длине волны 222 нм (-------), на

длине волны 278 нм (_). Вставка: их производная по

температуре; обозначения те же.

Б) спектры Н -ЯМР 0roV550 при различных температурах (20 мМ ацетат калия, 0.150 М хлорид калия, рН=5,0). Соотнесения даны согласно Weber et al. (1986).

Температурные зависимости молярной эллиптичности в ультрафиолетовой области также указывают на то, что процесс денатурации CroV55C репрессора протекает в две разделенные по температуре стадии (рис. 36). Величины эллиптичности на двух длинах волн, 222 и 278 нм, характеризующие, соответственно, состояние вторичной и третичной структур белка, изменяются симбатно, что

говорит о постадийном распаде не только третичной, но и вторчной структуры СгоУ55С.

Анализ спектров Н1-ЯМР СгоУ55С, полученных при различных температурах, свидетельствует о сохранении отдельных резонансов в спектрах этого белка в условиях, при которых другие сигналы уже не наблюдаются (рис. Зв). Эти резонансы присутствуют в спектрах нативных Сго_и^ и СгоУ55С и соответствуют химическим сдвигам в области 5-6 м.д., характерным для р-структуры (остатки 49-57). Особо четко наблюдаются сигналы метальной группы остатка лейцина 42, находящегося в р-участке 2 (остатки 41-45).

Наличие двух явно выракенных стадий в температурных изменениях термодинамических и структурных характеристик белка может быть интерпретировано как постадийное выплавление двух кооперативных единиц, или доменов, образующих трехмерную структуру белка, по простейшей линейной схеме:

(2)

где I соответствует промежуточному состоянию структуры, отделенному от N и Б фазовым переходом первого. рода. Для СгоУ55С схему (2) можно записать как

аг)*~ (02)* (3)

где состояния, помеченные звездочкой, соответствуют ковалентно-перешитым димерам СгоУ55С.

Нами была сделана попытка установить границы этих единиц в структуре СгоУ55С путем получения и изучения его различных фрагментов. Было проведено химическое расщепление полипептидной цепи СгоУ55С ВгСМ по остатку метионина 12 (единственного в последовательности, кроме стартового) (рис. 4). Выделенный фрагмент (ВгСИ-фрагмент), содержащий две перешитые дисульфидной связью полипептидные цепи с 13 по 66 аминокислотный остаток СгоУ550, исследовался калориметрически. Как правило, удаление части полипептидаой цепи, участвующей в формировании кооперативной единицы, приводит к неспособности оставшихся элементов поддерживать еб исходную пространственную структуру. Это неизбежно должно отразиться на форме кривых плавления. Температурные зависимости удельной парциальной теплоемкости интактного Сго'/55С и его ВгСЫ-фрагмента представлены на рис. 5. Кривые плавления фрагмента содержат единственный пик теплопоглощения, расположенный в температурном диапазоне второго денатурационного перехода СгоУ55С, а анализ функций избыточного теплопоглощения показывает достаточно близкое соответствие их термодинамических параметров.

Таким образом, показано, что первый, низкотемпературный, переход в белке СгоУ55С связан с выплавлением Ы-концевых частей белка, тогда как во время второго, высокотемпературного,

А)

Ме1 12 Аг813

Ме1 12

Б)

С-епа (А1а66)

'С-еп(1 ('АЫбВ) Рисунок 4. А)

12 3

29.9 кБ —

12.3 кБ — 6.7 кБ -

•Аге13

положение метионинов 12 в структуре СгоУ55С; схематическая структура БгСН-фрагента. Б) электрофорез в ПААГ (градиент 15-30%) с ДСН: дорожки: 1) Маркеры молекулярных весов;

2) Сго_1^ вместе с СгоУ55С;

3) ВгСЛ-фрагмент СгоУ55С;

260 300 320 340 360 ЭВО Тещрегл1игв, К

Рисунок 5. Температурные зависимости молярных парциальных тегоюемкостей СгоУ55С (вверху) и его ВгСН-фрагмента (внизу) при рН=5,0 (80 мМ ацетата калия).

выплавляется структура, полипептидных цепей.

сформированная С-концевыми частями

Г*

С целью определения границ N-концевого домена полипептидаую цепь интактного CroV55C расщепляли по остатку цистеина 55 (с использованем DTNB-CN). Однако продукты такого расщепления образовывали нерастворимые агрегаты, что может указывать на неспособность этих фрагментов формировать стабильную третичную структуру. Была также предпринята попытка получения соответствующего N-концевого фрагмента in vivo. Для этого ген белка CroV55C модифицировался с введением терминирующего кодона вместо триплета, кодирующего 54-й аминокислотный остаток. Однако, несмотря на то, что секвенированием было подтверждено нахождение модифицированного гена под высокоэффективным промотором, соответствующий белковый продукт в клетках не накапливался. Даже введение в N-концевую часть фрагмента стабилизирующей аминокислотной замены Gln16 — Leu не привело к повышению его выхода, что также указывает на нестабильность синтезируемого полипептида.

Таким образом, исследования ковалентно-перешитой мутангной формы CroV55C приводят к выводу, что в этом белке содержатся две кооперативные единицы, существенно различающиеся по стабильности. Вместе с тем, взаимодействие мевду этими единицами носит сложный характер: в то время как С-концевой участок белка способен самостоятельно формировать и поддерживать третичную структуру, стабильность структуры N-концевых участков напрямую зависит от наличия в молекуле С-концевого домена.

С-КОНЦЕВОИ ДОМЕН

N-КОНЦБВЫЕ ДОМЕНЫ

Рисунок 6. Схема доменной организации CroV55C.

При сопоставлении термодинамической и структурной информации можно предположить, что кооперативные единиццы в CroV55C образованы следующим образом: две N-концевые части полипептидных цепей димэра образуют единый кооперативный домен, в то время как остальная часть молекулы, включающая ß-участки 2 и 3 мономеров, формирует С-концевой домен (рис 6).

Однако, эта простая и привлекательная модель не объясняет механизма кооперирования между достаточно удаленными друг от друга N-концевыми частями полипептидных цепей димера. Кроме того, она не объясняет необычайно сильного стабилизирующего эффекта замен Gln16 — Leu и Туг26 — Asp, расположенных на доступной растворителю поверхности N-концевых участков. И, наконец, детальный анализ формы калориметрических кривых плавления CroV55C показывает, что мономолекулярная секвентальная схема 3 недостаточно точно описывает истинный механизм денатурационного процесса.

Результаты термодинамического анализа указывают на то, что при переходе белка в промежуточное состояние должна происходить обратимая ассоциация ковалентно-перешигых полипептидных цепей CroV55C с образованием димера (Ig)^ по схеме

(Н2Г~1/2 (12>2 — (1>2) <4>

Если изменение стехиометрии в процессе денатурации действительно имеет место, форма кривых плавления должна зависеть

Б) 0

гво зоо 320 340 зво зео Temperature, К

гво 300 320 340 зво Temperature, К

Рисунок 7. А) Температурные зависимости молярных парциальных теплоемкостей белка CroV550 при различных концентрациях (20 мМ

ацетат калия, рН=5,0): 0.058 мМ (-), 0.160 мМ (_.._), 0.280

мМ (— -—.— ). Вставка: рассчитанные из схемы (5) функции парциальной теплоемкости при тех же концентрациях.

Б) Температурные зависимости молярной эллиптичности CroV55C на длине волны 278 нм (нормированной к [б] (гас) при различных

концентрациях белка: 0.034 мМ ( —*--), 0.160 мМ (-)

(20 мМ ацетат калия рН=5,0).

от концетрации белка, причем эта зависимость может быть предсказана для каждой конкретной модели денатурационного перехода. В частности, если верна модель, отражаемая схемой 4, то увеличение концентрации белка должно приводить к понижению температуры середины первого перехода (Тм1) и к росту температуры середины второго перехода (ТмП). Исследование концентрационной зависимости калориметрических кривых плавления СгоУ55С показало, что положение и форма пиков I и II при последовательном повышении концентрации изменяются в соответствии с предсказаниями (рис. 7а). Температурная зависимость молярной эллиптичности СгоУ55С на длине волны 278 нм изменяется при увеличении концентрации белка аналогичным образом (рис. 76).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А)--—-----

Б) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12

«аиВВВ

»« . V.« »я* МО ••

и

• Рисунок 8. Электрофореграммы, отражающие кинетику сшивания белка СгоУ55С глутаровым альдегидом при 2СГС (а) и 65 С (б) (20 мМ ацетат калия, рН = 5,0, 30 мМ хлорид калия). Концентрация белка в рабочей смеси = 0.5 мг мл.

А) Дорожки 1) Маркеры молекулярных весов;

2) Сго_т^ вместе с СгоУ55С (без обработки альдегидом);

3) Лизоцим куриного яйца, обработанный глутаровым альдегидом в тех же экспериментальных условиях;

4) Сго_у^, обработанный глутаровым альдегидом 20 мин;

5-12) СгоУ55С, обработанный глутаровым альдегидом 5-40

мин с интервалом 5 мин.

Б) Дорожки: 1) Маркеры молекулярных весов;

3) Сго_гс1;, обработанный глутаровым альдегидом 10 мин;

3) СгоУ55С, обработанный глутаровым альдегидом 1 мин;

4-12) СгоУ55С, обработанный глутаровым альдегидом 3-27 мин с интервалом 3 мин.

С целью проверки выводов, сделанных на основании анализа кривых плавления, была проведена фиксация промежуточной формы СгоУ55С бифункциональными сшивками. Растворы белка при температурах, соответствующих максимумам заселенности нативного (20°С), промежуточного (65? С) и денатурированного (9(Р С) состояний обрабатывались глутаровым альдегидом.

На рис. 8а представлена электрофореграмма продуктов реакции при 2СРС, показывающая, что при этой температуре СгоУ55С, как и Сго_ч»1;, в основном состоит из двух полипептидных цепей. Однако при 65°С (рис. 86) обработка глутаровым альдегидом СгоУ55С преимущественно фиксирует агрегаты массой а 30 кДа, что почти в точности соответствует молекулярной массе четырех полипептидных цепей. То есть, образуется надмолекулярный комплекс, состоящий из двух Б-Б перешитых димеров.

О) Струтурно-термодинамическое исследование Сго_иИ

Основываясь на сложном механизме денатурационного процесса Сго 7550, мы проводили исследования Сго_\>^ в широком интервале значений рН и концентраций белка.

Температурные зависимости молярной парциальной теплоемкости Сго_«К при концентрации = 0.2 мМ в буферах с различными значениями рН представлены на рис 9а. Как видно из рисунка, при нейтральных рН каждая функция Ср(Т) содержит основной пик теплопоглощения с максимумом в районе 40-45'°С и второй, минорный, пик при более высокой температуре. Понижение рН приводит к сдвигу обоих пиков в низкотемпературную область и одновременно к резкому снижению их амплитуды, так что второй пик практически невозможно обнаружить уже при рН 5,5. Исследование зависимости формы кривых плавления при фиксированном рН (рис. 96) от концентрации белка показали, что максимум первого пика в широком диапазоне концентраций от 0.054 до 0.540 мМ практически не сдвигается по температуре, хотя его форма изменяется. Положение второго пика и его амплитуда очень сильно зависят от концентрации белка. Когда последняя становится меньше 0.1 мМ, второй пик практически сливается с первым и на кривой теплопоглощения остается один широкий готе.

Т (К) ТетрегаЫге, К

Рисунок Э. А) Температурные зависимости молярной парциальнс теплоемкости при концентрации 0.180-0.200 мМ и различщ

значениях рН (20 мМ ацетат калия для рН=4,0-5,5 и 20 мМ фосфг калия для рН=6,0-7,0). Значения рН показаны цифрами на кривой.

Б) Температурные зависимости молярной парциальной теплоемкое-! Сго_и1 при рН=7,0 (20 мМ фосфат калия) и различных концентрациям

0.054 мМ (----), 0.098 мМ (-), 0.180 мМ ( — .. — ), 0.540 »

(ом ). Вставка: рассчитанные из схемы 6 кривые теплоемкое: белка при тех же концентрациях.

Анализ функций теплоемкости Сго^г показыает, что е) денатурационный процесс, как и денатурация Сго У55С, включает себя две стадии. Из сравнения энтальпий переходов следует, что ! первом этапе разрушается большая часть третичной структуры белк; Форма пика теплопоглощения и характер концентрационной зависимое температуры середины перехода (Тм) указывают, что на этой стад] диссоциации молекул на субъединицы не происходит. Разрушен оставшейся части структуры, сопрововдающееся диссоциацией белка ] денатурированные мономеры, происходит на втором этапе. Анал: концентрационной зависимости Тм второго перехода даёт основан: считать, что и в этом случав промежуточное состояние представля собой надмолекулярный комплекс (рис. 96, вставка).

в; (Мрутурго-термодиясшическое исследование белков СгоСНо]^, СгоУ26Т> и СгоСЦ61УГ26Т)

На рисунке 10 представлены температурные зависимости молярн парциальных теплоемкостей мутантных форм СгоСЛбЪ, СгоУ26Б Сго016Ъ/У26Б при различных значениях рН и концентрации белка = О мМ. В отличие от белка Сго_\у1;, при этой концентрации их крив плавления содержат единственный пик теплопоглощения. Тм этого пи для каждого из мутантных белков существенно выше, чем Тм перво перехода для белка дикого типа. В условиях, когда стабильное

280 300 320 340 360 380 т (к)

280 300 320 340 380 380 Т (К)

2В0 300 320 340 360 380 Тегпрега1иге, К

структуры всех форм Сго максимальна, Тм для Сго_иг находится при 45.б3С, тогда как и для Сго016Ъ, и для СгоУ26Б она на = 1^0 выше (61 и 62°С, соответственно). В случае двойной мутации, Сго 01б1/У26Б, максимум пика теплопоглощения находится при 77° С , то есть первый переход оказывается сдвинут на 32Рс и влияние замен на стабильность можно считать аддитивной. Понижение значений рН приводит к понижению стабильности мутантных форм, как и в случае Сго_у»1;.

Сравнение тепловых эффектов денатурации этих мутантных форм Сго показывает, что, приведенные к одной температуре, они практически не отличаются.

Это хорошо согласуется с предположением о близости структур исследуемых белков. Однако значения эффективных энтальпий, рассчитаные на основе модели мономолекулярного одностадийного перехода, имеют существенные различия. Если сравнивать их

Рисунок 10. А) Температурные зависимости молярной парциальной теплоемкости Сго016Ь при концентрации = 0.2 мМ и различных значениях рН.

Б) Температурные зависимости молярной парциальной теплоемкости СгоУЯбЮ при концентрации з 0.2 мМ и различных значениях рН.

В) Температурные зависимости молярной парциальной теплоемкости Сго01бЪ/У2б1) при концентрации а 0.2 мМ и различных значениях рН. Значения рН показаны цифрами на кривых.

с калориметрическими энтальпиями, то для Сго(316Ь и СгоУ2бР параметр й (отношение калориметрической и эффективной энтальпии, ~К=Ы1оа}), составляет 1.2 и 1.3, соответственно. При снижении рН параметр И увеличивается и при рН = 4.0 достигает 1.5. В случае Сго016Ь/У26Б параметр И возрастает еще больше и приближается к 1.6. Как известно, для одностадийных процессов типа

(5)

параметр й е- 1.58, поэтому можно предположить, что в случае Ото 016Ь/У26Б достигается полное кооперирование между двумя денатурационными переходами. В этом случае весь процесс денатурации адекватно описывается одностадийной бимолекулярной схемой (5). Данный вывод подтверждается наличием для этого белка концентрационной зависимости Тм, характерной для бимолекулярных процессов.

ГУ. Обсуждение полученных результатов

Исследование нескольких мутантных форм Сго показывает, что их денатурация - сложный■двухстадийный процесс, отражающий как наличие в структуре Сго двух идентичных полипептидных цепей, так и ее разбиение на две кооперативные единицы. Анализ всей совокупности полученных данных позволяет, однако, предложить единую модель, достаточно точно описывающую все сложные и, на первый взгляд, противоречивые .явления, наблюдающиеся при тепловой денатурации природной и всех исследованных мутантных форм Сго.

Эта модель подразумевает, что белок может находиться только в трёх равновесных состояниях: нативном, промежуточном (с неструктурированными Ы-концевыми частями молекулы) и денатурированном (димер или мономер в.зависимости от наличия или отсутствия межсубъединичной ковалентной связи).

Учитывая, что промежуточное состояние имеет тенденцию к образованию надмолекулярного комплекса, денатурацию белка можно представить схемой

ГГ2— 1/2(12)2-~ 21) (6)

(в случае СгоУ55С - схемой (4)).

В результате, независимо от наличия дисульфидного мостика, попарно соединяющего .С-концевые части полипептидных цепей, в промежуточном состоянии за счет взаимодействия двух пар полипептидов может образоваться одна и та же надмолекулярная структура. Стабильность этой структуры может зависеть от определенных аминокислотных замен в полипептидной цепи белка.

Введение стабилизирующих замен в Л-концевые части Сго приводит к увеличению Тм первого перехода. Так, сравнительное исследование белков СгоУББС и Сго01бЬ/У55С (имеющего одновременно и дисульфвдную ковалентную связь между мономерами, и стабилизирующую мутацию в И-концевой части) показало, что Тм второго перехода для этих белков не отличаются, тогда как Тм первого перехода для СгоСИ6Ь/У55С выше Тм1 для СгоУ55С на 16°С (рис. 11). Таким образом, можно заключить, что замены в а-спиральных частях молекулы повышают стабильность Н-концевого домена.

В случае СгоСИ 61/У26Б повышение Тм1 оказывается настолько большим, что две стадии денатурации кооперируются и промежуточное состояние вообще не реализуется. То есть, белок из димерного упорядоченного состояния прямо переходит в мономерное неупорядоченное.

В случае Сго_«1; аналогичное кооперирование и вырождение схемы (6) в одностадийную схему (5) происходит за счет понижения Тм второго перехода при уменьшении концентрации белка. На кривых плавления при нейтральном рН второй пик теплопоглощения сливается с первым при концентрации белка ниже 0.07 мМ (рис. 7). Тем не менее, вплоть до концентрации 0.035 мМ не происходит полного кооперирования двух процессов. Только при дальнейшем понижении концентрации белка стабильность промежуточного тетрамера становится меньше стабильности нативного димера и переход превращается в одностадийный процесс типа (5).

Таким образом, показано, что денатурация Сго репрессора фага X сопровождается образованием равновесного промежуточного состояния (надмолекулярного комплекса, формируемого двумя частично денатурированными димерами белка). Данный комплекс играет оущнствкнную роль в стабилизации нативного состояния Сго. Только.

Temperature. К

Рисунок 11. Температурные зависимости молярной парциальной теплоемкости СгоУ55С (вверху) и CroQ16b/Y55C (внизу) при рН=7,0 (20 Mid фосфат калия).

учитывая его существование и свойства можно анализировать и предсказывать влияние аминокислотных замен на стабильность и функциональную активность Сго.

вывода

1. Получен набор из 9 мутантных форм Сго репрессора фага X; оптимизированы условия выделения и очистки этих форм; наработаны их препараты высокой чистоты в количествах, достаточных для проведешя физико-химических исследований.

2. Методами сканирующей микрокалориметрии, спектроскопии кругового дихроизма и Н1-ЯМР проведено исследование свойств этих белков; показано, что введённые точечные аминокислотные замены не вызывают глобальных изменений в структуре Сго.

3. Показано, что Сго представляет собой сложную термодинамическую систему; в его структуре содержатся как минимум две кооперативные единицы (домены).

4. Определены границы кооперативных единиц по полипептидной цепи. Показано, что одна из них сформирована Ы-концевыми частями обеих субъедониц, а вторая образуется их С-концевыми участками (областью межсубъединичного контакта).

5. Впервые определен сложный механизм денатурации Сго, включающий образование промежуточного равновесного надмолекулярного комплекса; на основе этого механизма объяснено влияние точечных аминокислотных замен на стабильность белка.

6. Создана база для термодинамического анализа и моделирования ДНК-белковых взаимодействий.

1Я

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Грико Ю.В., Рогов В.В., Гителъзон Г. И. Влияние аминокислотной замены Val55-Cys на структурную организацию и стабильность Сго-репрессора фага X. Всесоюзный симпозиум "Химия белков", Тбилиси, 1990, тезисы, стр. 149.

2. G.I. ii 1 lelson, Yu.V. Griko, A.V. KurochMn, V.V. Rogov, V.P. Kutyslienko, M.P. Kirpichnlkov and P.L. Privalov. Two- stage thermal unfolding of [Cy^5 ]-substituted Сго repressor bacteriophage X. PEBS Letters, 1991, v.289, 2, pp. 201-204

3. Грико Ю.В., Рогов В.В., Кутышенко В.П., Веньяминов С.Ю. Влияние аминокислотных замен 16Gln-Leu и 26Tyr-Asp на структурно -термодинамические характеристики Сго-репрессора фага X. VII конференция по спектроскопии биополимеров, Харьков, Украина, 1991, тезисы, стр.72.

4. Griko Yu.V., Rogov V.V., and Privalov P.L. Domains in A. Cro repressor: a calorimetric study. Biochemistry, 1992, v. 31, pp. 12701 - 12705.

5. B.B. Рогов, Ю.В. Грико. Калориметрическое исследование аминокислотных замен 16Gln-Leu и 2бТуг-Азр на структурную организацию и стабильность Сго-репрессора фага X. Молекулярная биология, 1993, том 27, вып. 4, стр. 798-804

G. V.V.Rogov and V.V.FIllironov. Domain organisation of X Cro repressor. 5th International Summer School on Biophislca, Roving, Croatia, 1994, Book of abstracts, p. 91.