Экспериментальное определение и моделирование физико-химических свойств малых биологически активных молекул посредством оценки параметров липофильности

Шалаева, Марина Евгеньевна

Экспериментальное определение и моделирование физико-химических свойств малых биологически активных молекул посредством оценки параметров липофильности тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Шалаева, Марина Евгеньевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Омск МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Экспериментальное определение и моделирование физико-химических свойств малых биологически активных молекул посредством оценки параметров липофильности»

Автореферат диссертации на тему "Экспериментальное определение и моделирование физико-химических свойств малых биологически активных молекул посредством оценки параметров липофильности"

ШАЛАЕВА Марина Евгеньевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ И МОДЕЛИРОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МАЛЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ ПОСРЕДСТВОМ ОЦЕНКИ ПАРАМЕТРОВ ЛИПОФИЛЬНОСТИ

Специальность 02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

12 ДЕК 2013

005543888

ШАЛАЕВА Марина Евгеньевна

Специальность 02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Работа выполнена на кафедре «Физическая химия» федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный технический университет»

Научный руководитель: Кировская Ираида Алексеевна,

заслуженный деятель науки и техники РФ, доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты: Фисюк Александр Семенович,

доктор химических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Омский государственный университет им. Ф. М. Достоевского»

Дроздов Владимир Анисимович,

кандидат химических наук, старший научный сотрудник ФГБУН ИППУ СО РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджет-

ное учреждение науки Институт химии растворов им. Г. А. Крестова Российской академии наук

Защита состоится 30 декабря 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д212.178.11 при ФГБОУ ВПО «Омский государственный технический университет» по адресу: 644050, г. Омск, пр. Мира, 11, корпус 6, ауд. 340, тел./факс: (3812) 65-64-92, e-mail: dissolv_omgtu@omgtu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омского государственного технического университета.

Автореферат разослан 29 ноября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д212.178.11 кандидат химических наук, доцент

А. В. Юрьева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Коэффициент распределения (log/5) является важным параметром, характеризующим физико-химические свойства веществ в растворах, и широко применяется для моделирования поведения веществ в организмах и окружающей среде [1, 2]. Распределение и перераспределение вещества между липофильной (жироподобной) и водной фазами является составной частью биологических процессов, например, процессов перехода через мембраны клеток, состоящих из липидных слоев. Он служит одним из основных оптимизируемых параметров в процессе создания новых лекарств и часто входит в уравнения для количественных расчетов зависимости «строение вещества — свойство», которые используются при дизайне молекул с необходимыми транспортными характеристиками.

Несмотря на большие усилия, создание моделей и компьютерных программ для расчета log Р (logZ) для ионизованных молекул) остается сложной и пока нерешенной задачей, в частности, для новых органических соединений, способных к многочисленным конформационным состояниям в различных средах. Экспериментальные измерения величин log/1 и рКа, необходимые для совершенствования расчетных моделей, продолжают представлять существенные трудности. В частности, «классический» метод измерения log Р сопряжен с многоступенчатым, трудоемким экспериментом и ограничен величинами logP <3,5. Аналогичным образом, существующие методы определения констант ионизации (рКа) требуют длительных экспериментов и не позволяют проводить измерения для веществ с низкой растворимостью, что ограничивает изучение и интерпретацию молекулярных взаимодействий таких веществ в растворах.

Наконец, образование внутримолекулярных водородных связей (ВМВС) в органических молекулах в растворах представляет большой интерес в ходе дизайна новых лекарственных молекул с заданной мембранной проницаемостью. Существующие спектральные методы определения ВМВС неприменимы на стадии создания молекулярных лекарственных библиотек, состоящих из сотен вновь синтезированных веществ. В то время как параметры липофильности в системах октанол - вода и ал кап - вода могут быть использованы для характеризации внутри- и межмолекулярных взаимодействий, включая ВМВС, а также конфор-мационной структуры молекул.

Таким образом, исследованные в диссертационной работе экспериментальные и расчетные подходы к определению параметра log Р (log D) служат установлению корреляций «строение вещества - свойство» и являются необходимым компонентом процесса создания новых органических веществ с заданными свойствами.

Цель работы: Целью работы является разработка методов экспериментального и расчетного определения параметров межмолекулярных взаимодействий малых органических молекул в растворах для установления их пространственной структуры и определяемых этой структурой свойств, в процессе дизайна новых лекарственных веществ.

При исследовании были поставлены и решены следующие задачи:

1. Разработка нового метода измерения коэффициентов распределения на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который обеспечивает точное и высокопроизводительное определение липофильности нейтральных, слабокислотных и основных веществ различных структурных классов в интервале значений log/3 (logD) от -1,5 до 7.

2. Разработка высокопроизводительного метода измерения констант ионизации органических молекул (рКа), применимого также для малорастворимых веществ, при использовании многоканального капиллярного элекрофореза.

3. Идентификация образующихся внутримолекулярных водородных связей в малых органических молекулах в разбавленных растворах, моделирующих биологические среды, с помощью параметризации коэффициентов распределения в системах октанол — вода и толуол — вода.

4. Верификация результатов моделирования доминирующих молекулярных конформаций органических структур методом квантово-механических расчетов (COSMO-RS) путем сравнительного анализа расчетных и экспериментальных значений log/'.

Научная новизна

Разработан новый метод измерения липофильности на основе ВЭЖХ, позволяющий определять коэффициент распределения log Р (log D) молекул различных структурных классов в диапазоне log Р от -1,5 до 7, превышающем возможности «классических» измерений (по отношению концентраций в обеих фазах) на несколько порядков величин.

Показано, что модификация мобильной фазы октанолом приближает величины log к'„ к моделируемому параметру log Р. Предложено объяснение этого явления адсорбцией октанола на поверхности неподвижной фазы и влиянием на процессы удерживания, определяющие взаимодействия в ВЭЖХ.

Сравнением параметров сольватации показано, что межмолекулярные взаимодействия, возникающие в предложенной хроматографической (кинетической) системе, идентичны взаимодействиям в «классическом» (равновесном) эксперименте определения коэффициента распределения (logf) в системе октанол - вода.

Показано, что модификация мобильной фазы деактивирующим агентом де-циламином и использование цвитгерионного буфера МОПС (З-(Ы-морфолино) пропаносульфатная кислота) позволяет расширить применение метода для из-

мерения не только нейтральных, но также основных и слабокислотных веществ при физиологических значениях рН.

Впервые разработан метод измерения констант ионизации малорастворимых органических веществ при использовании многоканального капиллярного элекрофореза, позволяющий получать экспериментальные данные для веществ, ранее не доступных для измерений.

Показано, что добавки органического растворителя в процессе капиллярного элекрофореза позволяют получать данные, необходимые для расчета констант ионизации (рКа) малорастворимых органических веществ путем экстраполяции значений нрКа к водной среде.

Предложена методика измерения и схема интерпретации различия величин липофильности в системах октанол - вода и толуол - вода для идентификации возникновения ВМВС.

Показано, что расчеты конформационных состояний малых органических молекул в растворах методом COSMO-RS позволяют классифицировать наиболее стабильные ВМВС в данных системах.

Положения, которые выносятся на защиту

1. Метод экспериментального определения коэффициента распределения logf посредством измерения коэффициента удерживания веществ (logF) в хро-матографической системе SupelcosilLC-ABZ — метанол — вода — МОПС буфер. Подтверждение сходства межмолекулярных взаимодействий в «классическом» (равновесном) методе измерения и предлагаемой хроматографической (кинетической) системе посредством анализа параметров сольватации.

2. Установление возможности модификации взаимодействий в хроматографической системе посредством добавки октанола (Elog Р) и дециламина (ElogD) к подвижной фазе для воспроизведения межмолекулярных взаимодействий и условий распределения веществ между фазами в системе октанол — вода.

3. Обоснование применения добавок органического растворителя метанола в методе многоканального капиллярного электрофореза для определения констант ионизации (рКа) малорастворимых веществ путем экстраполяции значений £рКа к водной среде по методу Яшиды - Шедловского.

4. Предложенный метод идентификации образования внутримолекулярных водородных связей в малых органических молекулах посредством интерпретации разницы в липофильности в системах октанол - вода и толуол — вода (log Рокт - log P™) для описания предпочтительных конформационных состояний таких молекул в средах с низкой диэлектрической проницаемостью.

Практическая значимость работы

Разработан метод измерения коэффициента распределения на основе ВЭЖХ, позволяющий определять log Р различных классов вновь синтезированных органических веществ в течение нескольких минут, используя минимальные коли-

ч'ества вещества и предоставляя, таким образом, немедленную информацию для категоризации структурных свойств серий новых молекул и создания баз данных для моделирования свойств виртуальных молекул. Быстрое получение новых экспериментальных данных позволяет корректировать точность расчетных моделей в реальном времени и применять их для оптимизации молекулярных структур и придания желаемых свойств вещества на этапе молекулярного дизайна, исключая, таким образом, необходимость синтеза и тестирования тысяч веществ, не удовлетворяющих свойствам лекарства.

Предложенное использование органического растворителя при определении констант ионизации методом многоканального капиллярного электрофореза существенно расширило применимость этого метода, так как позволило проводить экспериментальное определение рКа для малорастворимых веществ, ранее недоступных для измерений ввиду сложности экспериментов и требований к образцу.

Показана возможность использования липофильности для детектирования образования внутримолекулярных водородных связей и оптимизации физико-химических свойств органических молекул, способных к формированию различных структурных конформаций, без проведения сложных спектральных исследований.

Проведено исследование точности и правильности описания молекулярных взаимодействий методом кванто-химического расчета и предложена схема ха-рактеризации ВМВС с использованием рассчитанных величин logP в системах октанол - вода и толуол - вода.

Представляемые методы в настоящее время широко применяются в разработке новых лекарственных препаратов в фармацевтической науке и промышленности, а также в отраслях, работающих с малыми органическими молекулами в биологических объектах и объектах окружающей среды.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях:

- The 14th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships 2002, Bournemouth, UK;

- The 16th European Symposium on QSAR and Molecular Modeling, 10-17 September 2006, Italy;

- Symposia «Computer-Aided Drug Design», 2010, Whistler, Canada;

- XIX International conference «Horizons in Hydrogen Bonding», 2011, Gettin-gen, Germany.

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 20 печатных работах, в том числе: 2 международных патента, 2 главы в книгах и 18 статей в ведущих международных научных журналах.

Индексы цитирования статей по ElogP и ElogD методам в международных научных журналах превышают 160.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и трех глав, включающих обзор литературы, главу по экспериментальным и расчетным методам, главу посвященную результатам исследования и их обсуждению, заключения и списка литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 30 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность и практическая значимость работы, сформулированы её цели и задачи, научная новизна, описаны основные результаты и приведены положения, выносимые на защиту.

В первой главе обобщены литературные данные о роли физико-химических свойств органических веществ в современном процессе дизайна новых лекарственных веществ и липофильности как ведущего параметра оптимизации активности и лекарственных свойств.

Во второй главе описаны используемые в работе экспериментальные и теоретические методы, включая, ВЭЖХ; «классический» метод измерения коэффициентов распределения log Р или log D как отношение концентраций в обеих фазах, а также автоматизированный, миниатюризированный метод измерения log Р и log D в системах октанол - вода и толуол - вода; многоканальный электрофорез, метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), а также расчетные методы моделирования физико-химических свойств ACDlabs log/*, logD и рКа, ClogP и COSMOTherm.

В третьей главе представлены результаты и обсуждение разработки экспериментальных и расчетных методов, включая методы измерения logP и logD с использованием ВЭЖХ; измерения констант ионизации рКа с помощью многоканального электрофореза; исследование формирования ВМВС в органических молекулах в растворах и методы их детектирования посредством ЯМР, log/5 октанол - толуол и COSMO-RS AlogP.

Разработка метода измерения коэффициентов распределения log Р с использованием ВЭЖХ (Elog/7)-

В результате детального анализа литературы посвященной разработке хро-матографических методов определения коэффициента распределения в системе октанол - вода были выявлены первоначальные условия для получения характеристик удерживания, моделирующих молекулярные взаимодействия в «классической» системе октанол — вода.

Так, использование деактивированной неподвижной фазы Supelcosil LC-ABZ и мобильной фазы, состоящей из воды, 20 ммоль МОПС буфера и 15-70 % метанола, позволило получить экстраполированные величины log А:«, удовлетворительно коррелирующие с log/5 для набора 27 фармацевтических молекул разнообразных структурных классов (рис. 1, уравнение (1)).

» /

у F ♦♦

•10 12 3 4 5 6

log К

Рис. 1. Коррелляция log Я и log ^ для набора 27 фармацевтических молекул в отсутствие октанола в мобильной фазе

у /

-1 о 1 2 з 4 s е

logC

Рис. 2. Коррелляция log Я и logii, для набора 27 фармацевтических молекул в присутствии октанола в мобильной фазе

logРокт = 1,0890 (±0,0969) log/t^- 0,5435 (±0,2768) (1)

N= 27, R2 = 0,835, R = 0,914, j = 0,556, F= 126, q2 = 0,808.

logP0KT = 1,1014 (±0,0389) log*;- 0,0045 (±0,0941) (2)

N= 27, R2 = 0,970, R = 0,985, s = 0,238, F= 803, q2 = 0,965.

При использовании добавки 0,25 % октанола к мобильной фазе корреляция значительно улучшается, что видно на рис. 2, а также из уравнения (2) и статистических данных. Мы предложили гипотезу об адсорбционном взаимодействии октанола с неподвижной фазой и удерживании некоторого количества октанола на поверхности неподвижной фазы, достаточного для модификации взаимодействий этой поверхности с элюирующими веществами. Такая модификация, как показывают наши результаты, приближает характер взаимодействий в кинетической системе ВЭЖХ к взаимодействиям, испытываемым веществом в «классической» равновесной системе октанол - вода.

Воспроизводимость полученных корреляций была проверена расширением набора изучаемых веществ и включением дополнительных структурных клас-

сов. Как показывает рис. 3, а также уравнение (3) и статистические данные, полученные для 36 веществ, корреляция продолжает оставаться очень тесной. Этот результат подтверждает, что выбранные условия метода, на самом деле, близко воспроизводят моделируемые условия «классической» равновесной системы и не зависят от выбора веществ.

Действительно, коэффициент корреляции близок к 1, что свидетельствует о сходстве баланса сил, воздействующих на молекулы в этих системах. При этом абцисса корреляции близка к 0 (0,13 для набора 36 веществ), что показывает практическое отсутствие систематического сдвига между значениями \ogk'w и logР, также подтверждая сходство взаимодействий в двух системах. Таким образом, уравнение (3) используется для получения величины коэффициента распределения из хроматографических данных (logfcy, и мы назвали эту величину ElogP.

log= 1Д021 (±0,0291) logAr^. + 0,1344 (±0,0653) (3)

N= 36, R2 = 0,977, R = 0,988, j = 0,251, F= 1434, g2 = 0,974.

log k'w определяется экстраполяцией величин log к', полученных при трех концентрациях метанола в подвижной фазе, к 0 % метанола, «исключая», таким образом, присутствие метанола в системе.

Было также проведено сравнение взаимодействий в двух системах путем анализа параметров сольватации [3], рассчитанных с использованием 35 исследованных веществ (табл. 1).

В уравнениях сольватации, приведенных ниже, R2 — молярная «рефрактив-ность», описывающая способность молекулы к взаимодействиям с растворителем через я'-электронные пары, л" - поляризуемость или способность к образованию диполя, I«'1, Y.Pi ~ суммарные кислотность и основность водородной связи, соответственно, и Vx — молекулярный объем рассчитанный с использованием фрагментов (McGowan volume).

log к'„ = 0,066 (±0,144) + 0,409 (±0,106) R2 - 0,955 (±0,078) тг\1 -- 0,038 (±0,109) £a2H - 3,092 (±0,101) + 3,484 (±0,127) Vx. (4) N= 35, R2 = 0,980, R = 0,990, s = 0,221, F= 288, q2 = 0,970.

л-♦ 1

и 1

•> о f г э « 5 6

Рис. 3. Корреляция log P и log k'*, для расширенного набора фармацевтических молекул различных структурных классов

Elog/'оет = 0,204 (±0,015) + 0,452 (±0,117) Лг - 1,053 (±0,086) л\1 -

- 0,041 (±0,120) Е«2Н - 3,410 (±0,111) + 3,842 (±0,104) Vx. (5)

N= 35, R2 = 0,980, R = 0,990, s = 0,244, F= 288, q2 = 0,968.

log Роет = 0,273 (±0,103) + 0,525 (±0,076) R2 - 1,034 (±0,056) /zf -

- 0,049 (±0,078) I«2H - 3,510 (±0,072) Y.Pi + 3,787 (±0,091) Vx. (6)

N= 35, R2 = 0,992, R = 0,996, j = 0,16, F= 705, qг = 0,968.

Рассмотрение сольватационных уравнений (4), (5) и (6) показывает, что коэффициенты, рассчитанные для \ogk'w и ElogP, очень близки к коэффициентам уравнения logP для тех же самых 35 веществ, а также к уравнениям log/3 для

613 веществ [3]. Более того, отношения ко-Таблица 1 , . ,

эффициентов, нормализованные к коэф-

Сольвагационные параметры фициенту Vx, практически идентичны для

для 35 исследованных веществ

полученных уравнении, что также говорит turopcmi ni i»;' ifi о сходстве результатов «классического» ме-

тода с предлагаемым хроматографическим.

При этом, как уже отмечалось, ВЭЖХ метод может быть легко автоматизирован для проведения больших объемов измерений в широком диапазоне величин, при использовании минимальных количеств веществ.

Подходы к определению log D для ионизованных веществ (ElogZ)).

Описанные выше исследования касались только веществ в неионизованном, нейтральном состоянии, в то время как большинство фармацевтических веществ являются основаниями. Поэтому следующий этап исследований был посвящен разработке метода для веществ, способных к ионизации при физиологических значениях рН и наиболее важных для дизайна лекарственных молекул.

Были испробованы несколько модифицирующих добавок, в том числе, цвит-терионные и анионные, с целью маскировки дополнительных взаимодействий ионизированных молекул с неподвижной фазой. В ходе этих исследований не удалось установить условия для одновременного измерения log D кислотных

1-02 ijoo 0.91 ООО 1.0199

3-bn»iaqu{nalln» 161 1.23 000 0.42 1.2193

З-сМапфЬта! 0.9! 1.06 0.G9 OI5 OB975

жМотторЬеа 1-06 163 1.04 ose 1.1724

иНофтн 0.12 101 ООО ou 1.0139

allapurtncil 1.41 1 £5 0.70 0.92 urn

Ьгоашярат 131 1.31 0.33 1.S2 1.9415

cafbamazeptm 2.15 207 052 1.13 I.CI06

cMocamfiiMtlrol IBS 0.72 0.34 209 2.0728

rletriznvnte 255 2ва ООО 108 2.6230

dexamrahiNiw 201 351 0.71 1.92 29132

dlarepam 208 1.57 at» 1.25 2.0739

estradiol 1SU 1.77 0 86 1.10 2.1988

fluconazole 231 2.80 0.47 1.65 2.0064

ghsmfulvlfi 175 269 0.00 ISO 2.3947

tiydnKortttflne 203 3.49 071 1,90 271176

ti<idrocoflM«№<21 -areiate US 2ЯЯ 0.46 2.16 3.0951

koazppafa 251 1ÎB 0.45 1.63 21141

kmnetropam 2.4« 165 OIZ 1.61 2J550

luiplBhafene 131 032 0.00 0.2Я 1.0654

nifedipine ISO 2)5 023 1.45 2.4915

tufunubne 1.13 (HIS o.fie 0.60 0.9669

pmtnholDae 2.21 310 an IM 27546

pndmsan 2.14 3.58 IX 1.89 2.71 IB

qulnellne 1.27 ОЛ7 ООО 0.54 1.0443

lestastenme 1.54 259 0.32 1.19 2.382?

lolnanate 2i7 Z2U oao 0.93 2.3949

sntipynne 1J2 1.50 ООО I.U 1.5502

btfooanle 2.41 225 ООО 1.12 25006

cafMne 150 1Ю □.00 из 1.3632

dMhybllfbestrat 1 £0 17S 1.2« 0.77 2.2410

meirankfazole las 1.60 a la 1.03 1.1919

nnnfuraaone ICS 1-79 040 1.08 1.2644

pentoxifylline 1.61 2.28 а оо I.M Z.0SM

Unamptanlrol 2.26 330 0.90 203 2.3204

и основных веществ при рН = 7,4 с той же точностью, как для нейтральных веществ. Так, удерживание кислот оказывалось неизменно слишком сильным. Тем не менее, добавление 0,15 % дециламина привело к достаточной деактивации остаточных силанольных групп на поверхности неподвижной фазы и позволило определить условия, дающие сходные результаты с ElogP методом для оснований. Этот метод назван Elog D, его уравнение (7) и статистические данные приведены ниже.

log Джт = 1,1267 (±0,0233) log л; + 0,2075 (±0,0430) (7)

N= 90, R1 = 0,964, R = 0,982,5 = 0,309, F= 2339, q2 = 0,962.

Рассмотрение уравнения Elog D, полученного для набора 90 лекарственных веществ' (здесь не приведено), для которых мы смогли найти в литературе или определить собственные экспериментальные величины log D_7.4, показывает корреляции, аналогичные Elog Р методу. В частности, коэффициент корреляции по-прежнему близок к 1, абсцисса несколько увеличилась, но близка к 0, а стандартное отклонение составляет 0,31.

Проведены исследования линейности экстраполяции log к', измеренных при содержании метанола в подвижной фазе от 70 до 15 % к водной среде для получения величины log Ai. Установлено, что при содержании метанола в подвижной фазе менее 20 % замедляется достижение равновесных условий в хромато-графической системе и требуется более 1000 объёмов колонки для достижения равновесия прежде, чем могут начаться измерения.

Установлены оптимальные скорости потока мобильной фазы для веществ с низкой, средней и высокой липофильностью. Показано, что правильность определения результирующего параметра log соблюдается с достаточной точностью при экстраполяции трех величин log к', выбранных в соответствующем интервале содержания метанола. Процентные значения содержания метанола в подвижной фазе в предложенных интервалах приведены в табл. 2.

Таблица 2

Скорость подвижной фазы и процентное содержание метанола для определения Elog PI Elog D

log ¡'on Скорость, мл/мин МеОН, %

-0,5...1 0^5 15,20,25

1...3 1 40,45,50

>3 2 60,65,70 '

Разработка метода измерения константы ионизации (рКа) органических веществ с использованием многоканального электрофореза.

Знание состояния ионизации вещества чрезвычайно важно для понимания его свойств, поскольку степень ионизации оказывает большое влияние на другие физико-химические свойства вещества, например, растворимость, липофиль-ность, способность к образованию водородных связей и т. д. К наиболее известным методам определения констант ионизации органических веществ относятся метод потенциометрического титрования, спектрофотометрический, определение через изменение растворимости, хроматографический и, сравнительно новый, электрофоретический метод. Несмотря на разнообразие методов, общими ограничениями являются низкая производительность, связанная с трудностью автоматизации измерений и, особенно, интерпретации полученных результатов, а также ограничения в применимости к тем или другим классам веществ; требования к растворимости.

Предлагаемый здесь метод определения константы ионизации (рКа) органических веществ основан на использовании прибора многоканального электрофореза, позволяющего проводить одновременное измерение, электрофорети-ческой мобильности в 96 капиллярах и автоматизированную обработку данных.

Существующий метод электрофоретического определения рКа основан.на регистрации изменения мобильности вещества в электрическом поле, в зависимости от степени ионизации. Основное уравнение, приведенное ниже, описывает зависимость мобильности /л^ от параметров капилляра ¿а, Ьи прикладываемого напряжения V, и разницы в миграции вещества <а и нейтрального маркера <ш.

Типичная электроферограмма для амфолитного вещества сульпирида показана на рис. 4, а. Расчет величины рКа осуществлялся из ионизационной кривой (рис. 4, б).

Для увеличения точности определения рКа мы разработали систему 24 буферов, расположенных на равных расстояниях в единицах рН от рН = 1,7 до 11,2. Таким образом, уменьшение инкремента измерений от 0,8 в системе 12 буферов до 0,4 в новой системе 24 буферов позволило в два раза увеличить точность измерения рКа.

Выбранные буферы приготовляются из следующих компонентов: фосфорная, муравьиная, борная кислота, ацетат натрия и фосфат натрия, с постоянной ионной силой 50 ммоль, путем добавления рассчитанных количеств НС1 или N8011. Сохранение постоянной величины ионной силы по всей шкале рН позво-

лило существенно уменьшить флуктуации значений мобильности при переходе от одной буферной системы к другой при изменении рН, что существенно повысило точность измерений.

тли

а б

Рис. 4. Электроферограммы сульпирида, полученные при нескольких значениях рН, где пик нейтрального маркера ДМСО помечен как * (а); график зависимости эффективной мобильности вещества/^, от рН (б)

І Ба

I-

у-0:997* «ОДИ

Я* «095» . у*

■X'

ятір р«« «>'■>• М «••»

Рис. 5. Сравнение величин рКа, измеренных в нашей работе с усредненными величинами, приведенными в литературе

Наконец, величины рКа, измеренные разработанным методом, были сравнены со значениями, приведенными в литературе (рис. 5). Необходимо отметить, что в литературных источниках нередко приводятся противоречащие данные, и некоторые литературные величины рКа отличаются друг от друга на несколько порядков. Поэтому обработка литературных данных требовала специальных исследований и, иногда, дополнительных измерений. Тщательно проверенные литературные и собственные экспериментальные рКа величины были усреднены, часто из 3-8 величин, для сравнения с результатами нового метода.

Одной из сложных проблем в измерении рКа является получение данных для веществ с низкой растворимостью. К сожалению, такие вещества составляют значительную часть фармацевтических библиотек. При их измерении часто наблюдаются характерные «плато» на месте пиков, а в некоторых случаях пики «пропадают», что может привести к ошибочным заключениям о характере ионизации.

Мы разработали метод определения рКа для веществ с низкой растворимостью посредством измерения мобильности при добавлении органического растворителя в элюент. Полученные таким образом величины *рКа с органическим растворителем затем экстраполируются к 0 % органического растворителя для получения *рКа в водной среде.

;Ркш = 1ркш+л,

:РКа+1оё[П20] = - + Ь.

Сравнение непосредственной линейной экстраполяции величин £рКа к 0 % метанола с экстраполяцией по методу Яшиды - Шедловского показало, что последний метод дает несколько более точные результаты.

гп В

* 7

4 8

15 18 1Г 1« ' 1000

Мог(г(р4у1|по (2° екрИайс зггге) Тптфтжгиг» (3е эбрваис

Е Мепзгтяс Ас<! (сзгЬшуГс айс)

"9 20

Рис. 6. Определение рКа экстраполяцией по методу Яшиды - Шедловского

Мы показали, что использование четырех точек (при содержании метанола 30, 40, 50 и 60 %) позволяет надежно определять рКа для веществ с низкой растворимостью. Удовлетворительные результаты были получены также и в случаях, когда растворимость, необходимая для проведения измерений, достигается только при 50 и 60 % метанола.

Характеризация внутримолекулярной водородной связи посредством использования коэффициента распределения log Л в системах октанол -вода и толуол - вода и квантово-механической расчетной модели COSMO-RS.

Систематический анализ Кембриджской Структурной базы данных (CSD) [4] показал, что большинство ВМВС приходится на 5-, 6-, и 7-членные кольца. При этом были выделены топологии наиболее распространенные в медицинской химии.

Конформационное состояние сложных органических молекул определяет характер их взаимодействий с окружающей средой и, в тоже время, зависит от свойств этой среды. Так, внутримолекулярные водородные связи обладают свойствами «хамелеона» и могут возникать, например, в средах с низкой диэлектрической постоянной (клеточные мембраны) и распадаться в средах, где такое состояние энергетически невыгодно (водные растворы).

Тем не менее, определение таких молекулярных взаимодействий нетривиально и часто опускается из рассмотрения, ввиду сложности как экспериментального подтверждения, так и моделирования.

Концепция применения log Р в системе с неполярным растворителем, например, алканом, для определения склонности вещества к образованию ВМВС была предложена Сейлером еще в 1974 г. [5] Однако, нам неизвестно систематическое применение этого подхода, что можно объяснить трудностью экспериментального определения logPoKT Для многих молекул, о чем сказано в главе 3, и гораздо большими трудностями определения logPanK.

Для изучения этого подхода мы выбрали 24 молекулы, представляющие 9 топологий, наиболее распространенных в CSD, как пояснялось выше. Некоторые из этих топологий и веществ представлены на рис. 7.

аЫаСЗа

н IS

(

aNaC3cC3a Н

Рис. 7. Примеры веикств, использованных для изучения образования ВМВС

Вещества, способные к образованию ВМВС, обозначены цифрами, а вещества сходного строения, но неспособные к образованию ВМВС, так называемые, контрольные вещества, обозначены буквами.

Литературные данные и наши собственные эксперименты показали, что измерения log Ралк осложняются чрезвычайно низкой растворимостью абсолютного большинства веществ в алканах, поэтому мы остановили свой выбор на толуоле (е = 2,3). Нами разработан автоматизированный миниатюризирован-ный метод для определения logPoicT и logРтоп из одного образца общим объемом 50 мкл, приготовленного из 30 ммоль раствора в диметилсулфоксиде (ДМСО).

Точность определения величин log Рокт и log Ртол приобретает здесь особое значение, так как разница этих величин является основным параметром. Для подтверждения точности измерений в автоматизированной системе мы одновременно провели другие доступные измерения, в частности, «классическое» определение log Рои- (SFJogZ)) и Elog Р (см. в главе 3). Наконец, мы провели вычисления величин log Рокт и log Р,„„ с помощью компьютерной квантово-механиче-ской системы COSMO-RS [6]. Все эти величины представлены в табл. 3.

Тщательный анализ данных, полученных для всех 24 веществ, показал, что разница между величинами Iog/^ и log/5^, назовём её Alog^, не служит индикатором ВМВС сама по себе. В тоже время, если сравнить Alog Р веществ, способных к образованию ВМВС, и контрольных веществ, обнаруживаются некоторые тенденции.

Таблица 3

Величины log Р„„ и log/3™, полученные экспериментально и рассчитанные методом COSMO-RS

octanol/water toluene/water ■jjlupnt/'waU"'

COSMO-RS 4 COSMO-RS

logP SFJogP ElogD i *• togP 8 SFJogP 9 ■Км! Ш SF AlogP

1 2.53 1.8 2.13 2.78 1.9 -0.25 -0.10

2 4.0 4444 4.25 5.05 4.4. -1.05 N/A

А 2.83 2.1» 2.68 2.44 1.6* 0.39 0.50

4 4.50 4444 4.58 5.49 4444 -0.99 N/A

в 3.05 2.1* 2.97 3.81 2.1' -0.76 0.08

В 3.17 1.91 2.58 3.76 1.96 -0.59 -0.05

10 1.49 1.43 1.76 1.57 0.71 -O.08 0.72

11 2.12 1.84 2.19 2.31 1.35 -0.19 0.49

D 2.01 1.76 1.84 1.09 0.13 0.92 1.63

18 0.26 -0.17 0.13 -0.38 -1.75 0.64 1.58

И 2.37 1.08 1.65 2.69 0.91 -0.32 0.17

Так, сравнительный анализ величин А^ Р в рассматриваемых парах веществ показал существование двух категорий:

I. Л^Р контрольного вещества > ВМСВ вещества;

II. Дк^Р контрольного вещества < h\ogP ВМСВ вещества.

В первой группе - вещества, способные к образованию ВМВС (1,2; 10,11 в приведенных здесь примерах) имеют величины log Рт0„ выше, чем величины log Рои-. Иными словами, эти вещества «предпочитают» толуол больше, чем октанол, по сравнению с контрольными веществами (здесь А и Д). Такое поведение можно объяснить тенденцией к образованию ВМВС и уменьшению общей полярности за счет связывания или «маскировки» донора и акцептора.

Во второй фуппе - вещества способные к ВМВС (18; 6 в приведенных здесь примерах), наоборот, имеют величины log Рокт выше, чем величины logРтш|, т. е. «предпочитают» октанол больше, чем толуол, что можно объяснить предпочтительностью развернутого состояния для этих молекул.

При этом расчетные значения Alog Р (COSMO-RS Alog Р) позволяют поместить те же вещества в те же категории, что и измеренные величины, подтверждая достаточную точность расчетов для этой задачи. Тщательное сравнение расчетных величин COSMO-RS log Р в системах октанол - вода и толуол - вода показало хорошее совпадение с измеренными значениями (более детально в [16]): например, R2 = 0,89 и RMSE = 0,29 для COSMO-RS AlogF.

Важность верификации расчетной модели экспериментальными данными состоит в том, то такая модель может быть затем уверенно использована для получения данных о веществах, представляющих сложности для экспериментальных измерений. Так, вещества 2 и 4 оказались за пределами измеряемых величин, ввиду слишком высокой липофильности и низкой растворимости. Тем не менее, расчетные величины COSMO-RS Alog.P позволяют провести оценку возможности формирования ВМВС в этих веществах.

Рассмотрим расчеты, проведенные для вещества 1 категории I, (значительная склонность к образованию ВМВС) и вещества 18 категории II, (незначительная склонность к образованию ВМВС).

Как видно из рис. 8, популяция конформации 1_1, с образованием ВМВС, представляет 100 %, практически, в любой среде, включая воду (w), октанол (о) и толуол ((). При этом значения log Рокт, logPT0J1 довольно высокие для 11, ввиду высокого сродства этой «свернутой» неполярной конформации к органической фазе. Эти же значения для конформации 1_2 гораздо ниже, так как эта конформация не образует ВМВС и её развернутая молекулярная форма чувствует себя лучше в водной фазе, по сравнению с органической. Но популяция такой формы 1_2 практически равна 0. Это означает, что конформация 11 является предпочтительной для этой молекулы.

Из сравнения величин AlogP0KT_TO„ для 1_1 и 1_2 можно продемонстрировать принцип распределения веществ в Категории I и II. Так, если считать 12 контрольным веществом для вещества 1_1, получается A log Р контрольного вещества (0,59) > AlogP образца (-0,18), и 1_1 попадает в Категорию I.

1_1

tog p^ = г.ъь log P^s 2.73

Population %: 99(w), 100(o). 100(t)

1,2

log P.«, " 0.86 log Piois 0.27

Population %= 0.4(w), 0(o), 0(t)

t8_l

log P„, =0.10 log Ptel = -0.67 AlogPetWMs<>.77 Population %: 21(w), lS(o), ll(t)

18_2

log Рдд - -0.13 IOgPwfS-1.14

Population*: 10(w). 4{o), 2(t)

1Я !

log K, =0.33 fog P,„ = -0.2S

Population70fw). 81(o|, 88(0

Рис. 8. Примеры расчета доминирующих конформаций для веществ 1 и 18. Показаны относительные популяции конформеров в воде (w), октаноле (о) и толуоле (t)

Сходные рассуждения можно провести для вещества 18, которое принадлежит к Категории II, вещества со слабой тенденцией к формированию ВМВС, согласно экспериментальным данным. Видно, что конформер 18_3, образующий ВМВС, имеет меньшие популяции в воде (w), октаноле (о) и толуоле (?), чем 1_1 и меньшее сродство к органической фазе по величинам log Л

Наконец, для подтверждения образования ВМВС в исследованных веществах были проведены измерения методом ЯМР. В частности, были определены величины и направление относительного химического сдвига обменивающегося протона (результаты приведены в табл. 4).

Таблица 4

Значения химического сдвига сигнала обменивающегося протона и расчетных величин COSMO-RS AlogP

COSMO-RS

6CDCI3 5CDC13 sample- AlogPcontrol- %НВ predicted Category 300K 8 CPCI3 control AiogPsample by topology17_

1 8.69 2.63 0.64 93 I

2 10.78 4.72 1.44 93 I

A 6.06_:_;_;_

4 12.12 8.44 0.4 90 I 6 7.64 3.96 0.17 90 I В 3.68_- _^_;_

10 10.37 4.36 1 85 1

11 10.44 4.43 1.11 85 I

D 6.01 _;_;_

12 6.1 0.58 -1.14 18 II

El 5.52_;_;_;_

15 9.24 4.66 0.44 81 I

16 11.76 7.18 1.47 81 I

F 4.58_ -_;_

18 3.9 0.6 -0.96 37 И

H 3.3 - _-_:_

Присутствие ВМВС в изучаемых веществах детектировалось химическим сдвигом обменивающегося протона, вовлеченного в ВМВС, который сдвигался вниз, по сравнению с контрольным веществом, у которого протон не был вовлечен в образование ВМВС.

Измерения химического сдвига сигнала обменивающегося протона проводили в хлороформе и ДМСО. Тем не менее, некоторые вещества имеют низкую растворимость в этих органических растворителях и не могли быть измерены. Понижающий химический сдвиг наблюдался для всех веществ, которые удалось измерить, кроме 12 и 18, вряд ли образующих ВМВС.

По результатам экспериментальных и расчетных определений Лlog Р, вещества 12 и 18 были также отнесены в категорию II. Все остальные вещества, для которых удалось получить ЯМР спектры, попадают в категорию I, также, как и в категоризации по А1оо Р.

1 ________

__ 1 1

1 ■

1 ■ П - 0 _

1 2 А 4 6 В 10 11 О 12 Е1 15 16 Р 18 Н

Рис. 9. Разницы величин СОБМО-ЯЗ Лкщ Р и химического сдвига сигнала обменивающегося протона между веществом, образующим ВМВС, и контрольным веществом

Графическое изображение этих результатов представлено на рис. 9. Здесь использованы расчетные значения AlogP COSMO-RS AlogP, поскольку они получены для всех веществ. Рис. 9, а представляет категоризацию по расчетным значениям COSMO-RS Alog Р, а рис. 9, б показывает категоризацию по данным ЯМР. Очевидно, COSMO-RS Alog Р и ЯМР данные показывают сходную параметризацию веществ в этом наборе и позволяют отнести те же вещества в те же категории.

Таким образом, мы показали, что ВМВС может быть идентифицирована каждым из рассмотренных методов, хотя каждый метод имеет свои ограничения. Наибольшие ограничения в рассмотренных экспериментальных методах накладывает низкая растворимость.

Предпринятая экстенсивная верификация расчетного подхода COSMO-RS позволяет использовать этот метод для идентификации ВМВС и конформаци-онных состояний веществ в различных средах, распространяя такой подход на виртуальные, еще не синтезированные вещества.

Применение перспективного моделирования позволяет значительно ускорить циклы дизайна новых лекарственных веществ, а также создавать молекулы с нужными свойствами.

Выводы

1. Разработан метод измерения липофильности на основе ВЭЖХ, позволяющий определять коэффициент распределения log/' / logD_7,4 нейтральных и основных молекул различных структурных классов в широком диапазоне величин (-1,5 до 7). При этом погрешность определения составляет s = 0,31.

2. Показана роль модифицирующих добавок октанола и дециламина к подвижной фазе метанол - вода в ВЭЖХ для моделирования межмолекулярных взаимодействий в «классической» системе распределения октанол - вода и для приближения взаимодействий в кинетической системе ВЭЖХ к взаимодействиям в равновесной системе октанол - вода (буфер).

3. Впервые разработан метод измерения констант ионизации малорастворимых органических веществ с помощью добавок органического растворителя в процессе многоканального электрофореза. Использование добавок позволило распространить применение этого метода к веществам с растворимостью менее 100 мкг/мл.

4. Предложены методика измерения величин дифференциальной липофильности в системах октанол - вода и толуол - вода, а также схема интерпретации полученных величин для детектирования ВМВС и доминирующих конформа-ционных состояний таких органических молекул в данных системах.

5. Посредством определения разницы в липофильности в системах окта-нол - вода и толуол-вода методом ядерного магнитного резонанса и квантово-механических расчетов COSMO-RS продемонстрировано сходство классификации образования внутримолекулярных водородных связей в изученном наборе 5-, 6-, 7-членных циклов, распространенных в молекулярных структурах медицинской химии.

6. Экспериментально подтверждены результаты квантово-механических расчетов энергетически выгодных молекулярных конформаций и показана применимость моделей метода COSMOTherm для предсказания внутримолекулярных водородных связей и доминирующих конформационных состояний органических структур в системах с низкой диэлектрической постоянной.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lipinski, С. A. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development / C. A. Lipinski, F. Lombardo, В. W. Dominy, P. J. Feeney // Adv. Drug. Del. Rev. - 1997. - No. 23. - P. 3-25.

2. Раевский, О. А. Дескрипторы водородной связи в компьютерном молекулярном дизайне / О. А. Раевский // Рос. хим. журн. - 2006. - № 2. - С. 97-107.

3. Abraham, M. H. Hydrogen Bonding. 35. Relationship between high-performance liquid chromatography capacity factors and water-octanol partition coefficients / M. H. Abraham, H. S. Chadha, A. J. Leo // Chromatogr. - 1994. - Is. 685. - P. 203-211.

4. Kuhn, B. Intramolecular hydrogen bonding in medicinal chemistry / B. Kuhn, P. Mohr, M. Stahl // Med. Chem. - 2010. - Is. 53. - P. 2601-2611.

5. Seiler, P. Interconversion of lipophilicites from hydrocarbon/water systems into the octanol/water system / P. Seiler // Eur. J. Med. Chem. - 1974. - No. 9. - P. 473-479.

6. Klamt, A. The COSMO and COSMO-RS salvation models / A. Klamt // Wiley Interdisciplinary Rev.: Сотр. Mol. Sci. - 2011. - No. 1. - P. 699-709.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Lombardo, F. ElogPoct: a tool for lipophilicity determination in drug discovery / F. Lombardo, M. Y. Shalaeva, K. A. Tupper, F. Gao, M. H. Abraham // J. Med. Chem. -2000, July. - Vol. 43. - No. 15. - P. 2922-2928.

2. Lombardo, F. ElogD(oct): a tool for lipophilicity determination in drug discovery. 2. Basic and neutral compounds / F. Lombardo, M. Y. Shalaeva, K. A. Tupper,

F. Gao // J. Med. Chem. - 2001, July. - Vol. 44. - No. 15. - P. 2490-2497.

3. EP Patent 1.126.277, 2001. Determination of logP coefficients via A RP-HPLC column / Lombardo F., Shalaeva M.Y., Tupper K. A.

4. EP Patent 1.239.280, 2002. ElogDoct: A tool for lipophilicity determination in drug discovery basic and neutral compounds / Lombardo F., Shalaeva M.Y., Tupper K.A.

5. Lombardo, F. Prediction of volume of distribution values in humans for neutral and basic drugs using physicochemical measurements and plasma protein binding data / F. Lombardo, R. S. Obach, M. Y. Shalaeva, F. Gao // J. Med. Chem. - 2002, June. - Vol. 45. - No. 13. - P. 2867-2876.

6. Shalaev, E. The effect of disorder on the chemical reactivity of an organic solid, tetraglycine methyl ester: change of the reaction mechanism / E. Shalaev, M. Shalaeva,

G. Zografi // J. Pharm. Sci. - 2002, Feb. - Vol. 91. - No. 2. - P. 584-593.

7. US Patent 6.548.307,2003. Determination of logP coefficients via a RP-HPLC column / Lombardo F., Shalaeva M.Y., Tupper K.A.

8-. Lombardo, F. In silico ADME prediction: data, models, facts and myths / F. Lombardo, E. Gifford, M. Y. Shalaeva II Mini Rev. Med. Chem. - 2003, Dec. -Vol. 3.-No. 8.-P. 861-875.

9. Lombardo, F. Prediction of human volume of distribution values for neutral and basic drugs. 2. Extended data set and leave-class-out statistics / F. Lombardo, R. S. Obach, M. Y. Shalaeva, F. Gao // J. Med. Chem. - 2004, Feb. - Vol. 47. - No. 5. -P. 1242-1250.

10. Lombardo, F. Physicochemical and Biological Profiling in Drug Research. ELogD7.4 20,000 compounds later: Refinements, Observations, and Applications / F. Lombardo, M. Shalaeva, B. Bissett, N. Chistokhodova// Pharmacokinetic Profiling in Drug Research. Biological, Physicochemical and Computational Strategies. - Zurich : Wiley-VCH Verlag Helvetica Chimica Acta, 2006. - P. 187-201.

11. Lee, P. H. In silico prediction of ionization constants of drugs / P. H. Lee, S. N. Ayyampalayam, L. A. Carreira, M. Shalaeva, S. Bhattachar, R. Coselmon, S. Poole, E. Gifford, F. Lombardo // Mol. Pharm. - 2007, July. - Vol. 4. - No. 4. - P. 498-512.

12. Zhu, Z. Tautomer stability and pKa evaluation / Z. Zhu, M. Shalaeva, M. P. Pol-lastri, R. V. Stanton //Abstracts of Papers, 234th ACS National Meeting, Boston, MA,

United States, August 19-23 (2007). - Washington D.C. : American Chemical Society, 2007.

13. Lombardo, F. The good, the bad and the ugly of distribution coefficients: current status, views and outlook / F. Lombardo, B. Faller, M. Shalaeva, I. Tetko, S. Tilton // Methods and Principles in Medicinal Chemistry. - New York : Wiley-VCH Verlag GmbH & Co., 2008. - Vol. 37 (Molecular Drug Properties).

14. Shalaeva, M. Measurement of dissociation constants (pKa values) of organic compounds by multiplexed capillary electrophoresis using aqueous and cosolvent buffers / M. Shalaeva, J. Kenseth, F. Lombardo, A. Bastin // J. Pharm. Sci. - 2008, July. - Vol. 97. - No. 7. - P. 2581-2606.

15. Guimaraes, C. R. W. Use of 3D Properties to Characterize Beyond Rule-of-5 Property Space for Passive Permeation / C. R. W. Guimaraes, A. M. Mathiowetz, M. Shalaeva, G. Goetz, L. Liras // J. Chem. Inf. Model. - 2012. - Is. 52. - P. 882-890.

16. Shalaeva, M. Integrating Intramolecular Hydrogen Bonding (IMHB) Considerations in Drug Discovery Using AlogP As a Tool / M. Shalaeva, G. Caron, Y. A. Abra-mov, T. N. O'Connell, M. S. Plummer, G. Yalamanchi, K. A. Farley, G. H. Goetz, L. Philippe, M. J. Shapiro // J. Med. Chem. - 2013. - Is. 56. - P. 4870-4879.

17. Кировская, И. А. Рентгенографические, электронно-микроскопические и спектроскопические исследования полупроводников системы ZnTe-CdSe / И. А. Кировская, М. В. Васина, М. Е. Шалаева и др. // Омский научный вестник.-2013.-№ 12.

18. Кировская, И. А. Химический состав и кислотно-основные свойства поверхности твердых растворов (ZnTe)x-(CdSe)^x / И. А. Кировская, М. В. Васина, М. Е. Шалаева и др. // Омский научный вестник. - 2013. — № 12.

19. Гаврилов, В. Ю. Характеристики измерения специфической поверхности систем различных составов / В. Ю. Гаврилов, В. Б. Фенелонов, В. И. Жей-вот, М. Е. Шалаева // Кинетика и катализ. - 1987. - № 28(4). - С. 959-964.

20. Intermolecular interactions in the sorbate-modified graphitized thermal carbon black system / V. I. Zheivot, M. E. Shalaeva, V. Yu. Gavrilov, V. B. Fenelonov, I. A. Ov-syannikova; V. V. Malakhov // Journal of Chromatography. - 1989. - 472(1). -P. 155-61.

21. Шалаева, M. E. Газохромагографические исследования углеродных адсорбентов. Углеродный волокнистый материал актилен / М. Е. Шалаева, В. И. Жей-вот, В. Б. Фенелонов, J1. И. Фридман, В. В. Малахов // Журнал аналитической химии. - 1993. - № 48(10). - С. 1608-1614.

22. Жейвот, В. И. Эффект наноструктуры на адсорбционные и хроматографи-ческие свойства углеродных адсорбентов / В. И. Жейвот, Е. М, Мороз, В. И. Зай-ковский, М. Е. Шалаева, В. В. Малахов, А. А. Цикоза // Доклады академии наук. -1995. -№ 343(6). - С. 781-784.

Печатается в авторской редакции Компьютерная верстка А. Ю. Угпиржа

Подписано в печать 28.11.13. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Отпечатано на дупликаторе. Усл. печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 701.

Издательство ОмГГУ. 644050, г. Омск, пр. Мира, 11; т. 23-02-12 Типография ОмГГУ

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Шалаева, Марина Евгеньевна, Омск

04201455089

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омский государственный

технический университет».

«Экспериментальное определение и моделирование физико-химических свойств малых биологически активных молекул посредством оценки

параметров липофильности»

Специальность 02.00.04 «Физическая химия»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: заслуженный деятель науки и техники РФ,

доктор химических наук, профессор Кировская Ираида Алексеевна

На правах рукописи

Шалаева Марина Евгеньевна

Омск-2013

Оглавление

Условные обозначения и сокращения ..........................................................6

Введение .............................................................................................7

Глава 1. Литературный обзор. Роль физико-химических свойств в современном процессе дизайна новых лекарственных молекул и липофильность как ведущий параметр.

1.1. Основные понятия и термины .........................................15

1.2. logP и logD - уникальный «инструмент» для ....................................17

исследования молекулярных свойств.

1.3. Применение липофильности в современном .......................................19

дизайне. Правило пяти Липинского

1.4. Экспериментальные методы измерения липофильности.........................22

1.4.1 Классический метод «встряхивания». .......................................22

1.4.2 Потенциометрическое титрование ........................................................24

1.4.3 Хроматографические методы измерения липофильности .....................25

1.5. Расчетные методы определения липофильности. logP и .......................

logD как молекулярный дескриптор, QSAR, QSPR . .......................29

1.6. Определение константы ионизации рКа ......................................................31

1.7. Внутримолекулярная водородная связь в .........................................34

контексте физиологических процессов, ее

роль, свойства и методы определения

1.8. Основные выводы по главе ..................................38

Глава 2. Описание разработанных экспериментальных методов (2.1 - 2.3) и дополнительных используемых методов (2.4 - 2.6)

2.1. Методика проведения хроматографических измерений .....................41

2.2. Методика проведения электрофоретических измерений ......................44

2.2.1 Приготовление планшетки с образцами для измерения .....................44

2.2.2 Измерение рКа ...........................................................................44

2.2.3 Анализ результатов измерений и расчет рКа ....................................46

2.3. Методика проведения автоматизированных измерений 1о§Р, 1о§Е) ......47

2.4. Методика проведения измерений 1о§Р, классическим методом ...48

2.5. Методика измерений методом ЯМР .............................................49

2.6. Расчетные методы. ................................................................50

Глава 3. Разработка методов для экспериментального определения и

моделирования физико-химических свойств молекул посредством оценки их липофильности.

3.1. Разработка метода измерения коэффициента распределения ...........

(1о§Р к^Б) с использованием высокоэффективной ............

жидкостной хроматографии (Е1о§Р, Е1о§Б). ................52

3.1.1 Выбор буфера ..................................................................................................54

3.1.2 1о^\у в качестве параметра липофильности...............................................55

3.1.3 Подходы к выбору веществ-проб необходимых для .......................................

валидации свойств системы ..................................59

3.1.4 Условия измерений веществ с низкой липофильностью..........................61

3.1.5 Проверка гипотезы добавки октанола ..........................................................64

3.1.6 Тестирование метода .....................................................................................66

3.1.7 Сравнительное изучение хроматографической и классической ....................

систем распределения с помощью параметров сольватации. ...............68

3.1.8 Диапазон измерений методом Ек^Р........................................................73

3.1.9 Е[о£> ................................................................................................................74

3.1.10 Оптимизация хроматографического метода для ........................................

ускорения измерений ....................................79

3.1.11 Мониторинг качества измерений.................................................................80

3.1.12 Основные выводы по разделу........................................................................81

3.2. Разработка метода измерения константы ионизации (рКа) .............

огранических веществ методом многоканального электрофореза..........82

3.2.1 Принципы электрофоретических измерений ................................................83

3.2.2 Система 24 буферов ........................................................................................85

3.2.3 Величины рКа приведенные в литературе .................................................85

3.2.4 Определение рКа в соединениях с несколькими .........................

ионизированными группами и близкими величинами рКа .....................91

3.2.5 Измерения рКа с использованием буферных смесей .........................

метанол/вода и сравнение с литературными значениями .....................96

3.2.6. Сравнение рКа полученных в водных буферах и буферных .........................

смесях метанол/вода ...................103

3.2.7 Дополнительные особенности измерений с использованием .........................

; буферных смесей метанол/вода ...................104

3.3. Характеризация внутримолекулярной водородной связи .........................

посредством использования коэффициента распределения .........................

^Р в системах октанол-вода и толуол-вода и .........................

экспериментальная валидация квантово-механических .........................

расчетов модели СО8МО-Я8. ..................108

3.3.1. Кросс валидация данных по липофильности ..............................................112

3.3.2. Определение А1о§Р ......................................................................................116

3.3.3 В алидация расчетной модели экспериментальными данными ................117

3.3.4 Подтверждение образования ВМВС методом ЯМР ..................................120

3.3.5 Категоризация по расчетным значениям СОБМО-КБ А1о§Р ..................124

3.3.6 Основные выводы по разделу

128

4 Основные выводы по работе

129

5 Список литературы

130

Условные обозначения и сокращения

ADME абсорбция, распределение, метаболизм, выведение

CHI хроматографический индех гидрофобности

CSD Кембриджская Структурная база данных

DMCO диметилсульфоксид

ВМВС внутри- молекулярная водородная связь

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

F критерий Фишера

logk логарифм фактора удерживания в хроматографии logD логарифм коэффициента распределения вещества между двумя фазами, когда вещество участвует во вторичном равновесии, например ионизации, в одной или обеих фазах logP логарифм коэффициента распределения вещества между двумя фазами, когда это вещество находится в нейтральном, неионизованном состоянии МЕЕКС микроэмульсионная электрокинетическая хроматография МОПС 3 -(N-морфолино) пропаносульфатная соль натрия п число наблюдений

рКа отрицательный логарифм константы ионизации вещества

q коэффициент линейной корреляции в условиях перекрестного контроля с выбором по одному

г коэффициент линейной корреляции 11М8Е корень из квадрата ошибки 8 стандартное отклонение ЯМР ядерный магнитный резонанс

С)8А11 количественные соотношения «структура - активность» С^БРЯ количественные соотношения «структура - свойство» У-Б экстраполяция значений рКа по методу Яшиды-Шедловского

Введение

Актуальность работы. Коэффициент распределения (^Р) является важным параметром, характеризующим физико-химические свойства веществ в растворах, и широко применяется для моделирования поведения веществ в организмах и окружающей среде [1,2]. Распределение и перераспределение вещества между липофильной (жироподобной) и водной фазами является составной частью биологических процессов, например, процессов перехода через мембраны клеток, состоящих из липидных слоев. Он служит одним из основных оптимизируемых параметров в процессе создания новых лекарств и часто входит в уравнения для количественных расчетов зависимости «строение вещества

- свойство», которые используются при дизайне молекул с необходимыми транспортными характеристиками.

Несмотря на большие усилия, создание моделей и компьютерных программ для расчета 1о£Р (^Б для ионизованных молекул) остается сложной и пока не решенной задачей, в частности, для новых органических соединений, способных к многочисленным конформационным состояниям в различных средах. Экспериментальные измерения величин 1о§Р и рКа, необходимые для совершенствования расчетных моделей, продолжают представлять существенные трудности. В частности, «классический» метод измерения 1о§Р сопряжен с многоступенчатым, трудоемким экспериментом и ограничен величинами 1о§Р<3,5. Аналогичным образом, существующие методы определения констант ионизации (рКа) требуют длительных экспериментов и не позволяют проводить измерения для веществ с низкой растворимостью, что ограничивает изучение и интерпретацию молекулярных взаимодействий таких веществ в растворах.

. Наконец, образование внутримолекулярных водородных связей (ВМВС) в органических молекулах в растворах представляет большой интерес в ходе дизайна новых лекарственных молекул с заданной мембранной проницаемостью. Существующие спектральные методы определения ВМВС неприменимы на стадии создания молекулярных лекарственных библиотек, состоящих из сотен вновь синтезированных веществ. В то время как параметры липофильности в системах октанол-вода и алкан-вода могут быть использованы для характеризации внутри- и межмолекулярных взаимодействий, включая ВМВС, а также конформационной структуры молекул.

Таким образом, исследованные в диссертационной работе экспериментальные и расчетные подходы к определению параметра logP (logD) служат установлению корреляций "строение вещества - свойство" и являются необходимым компонентом процесса создания новых органических веществ с заданными свойствами.

При исследовании были поставлены и решены следующие задачи:

коэффициентов распределения в системах октанол-вода и толуол-вода.

Научная новизна

Разработан новый метод измерения липофильности на основе ВЭЖХ, позволяющий определять коэффициент распределения logP (logD) молекул различных структурных классов в диапазоне logP от -1,5 до 7, превышающем возможности «классических» измерений (по отношению концентраций в обеих фазах) на несколько порядков величин.

Показано, что модификация мобильной фазы октанолом приближает величины logk'w к моделируемому параметру logP. Предложено объяснение этого явления адсорбцией октанола на поверхности неподвижной фазы и влиянием на процессы удерживания, определяющие взаимодействия в ВЭЖХ.

' Показано, что модификация мобильной фазы деактивирующим агентом дециламином и использование цвиттерионного буфера МОПС позволяет расширить применение метода для измерения не только нейтральных, но

также основных и слабокислотных веществ при физиологических значениях рН.

Предложена методика измерения и схема интерпретации различия величин липофильности в системах октанол-вода и толуол-вода для идентификации возникновения ВМВС.

Показано, что расчеты конформационных состояний малых

органических молекул в растворах методом СОБМО-КБ позволяют классифицировать наиболее стабильные ВМВС в данных системах.

Положения, которые выносятся на защиту

1. Метод экспериментального определения коэффициента распределения посредством измерения коэффициента удерживания

веществ (1о£к') в хроматографической системе SupelcosilLC-ABZ -метанол-вода-МОПС буфер. Подтверждение сходства межмолекулярных взаимодействий в «классическом» (равновесном) методе измерения и предлагаемой хроматографической (кинетической) системе посредством анализа параметров сольватации.

2. Установление возможности модификации взаимодействий в хроматографической системе посредством добавки октанола (Е^Р )и дециламина (Е1о§Б) к подвижной фазе для воспроизведения межмолекулярных взаимодействий и условий распределения веществ между фазами в системе октанол-вода.

3. Обоснование применения добавок органического растворителя метанола в методе многоканального капиллярного электрофореза для определения констант ионизации (рКа) малорастворимых веществ путем экстраполяции значений \,рКа к водной среде по методу Яшиды-Шедловского.

4. Предложенный метод идентификации образования внутримолекулярных водородных связей в малых органических молекулах посредством интерпретации разницы в липофильности в системах октанол-вода и толуол-вода (1о§Рокт-1о§Ртол) для описания предпочтительных конформационных состояний таких молекул в средах с низкой диэлектрической проницаемостью.

Практическая значимость работы

Разработан метод измерения коэффициента распределения на основе ВЭЖХ, позволяющий определять 1о§Р различных классов вновь синтезированных органических веществ в течение нескольких минут, используя минимальные количества вещества и предоставляя, таким образом, немедленную информацию для категоризации структурных свойств серий новых молекул и создания баз данных для моделирования свойств виртуальных молекул. Быстрое получение новых Экспериментальных данных позволяет корректировать точность расчетных

моделей в реальном времени и применять их для оптимизации молекулярных структур и придания желаемых свойств вещества на этапе молекулярного дизайна, исключая, таким образом, необходимость синтеза и тестирования тысяч веществ, не удовлетворяющих свойствам лекарства.

Предложенное использование органического растворителя при определении констант ионизации методом многоканального капиллярного электрофореза существенно расширило применимость этого метода, так как позволило проводить экспериментальное определение рКа для малорастворимых веществ, ранее не доступных для измерений ввиду сложности экспериментов и требований к образцу.

Проведено исследование точности и правильности описания молекулярных взаимодействий методом кванто-химического расчета и предложена схема характеризации ВМВС с использованием рассчитанных величин 1о§Р в системах октанол-вода и толуол-вода.

- The 14th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships 2002, Bournemouth, UK

- The 16th European Symposium on QSAR and Molecular Modeling, 10-17 September 2006, Italy.

- Symposia "Computer-Aided Drug Design", 2010, Whistler, Canada.

- XIX Int'l conference "Horizons in Hydrogen Bonding", 2011, Gettingen, Germany.

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 20 печатных работах, в том ч