Экстракция местных анестетиков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

ЧИБИСОВА Татьяна Викторовна

ЭКСТРАКЦИЯ МЕСТНЫХ АНЕСТЕТИКОВ: ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ПРИМЕНЕНИЕ В АНАЛИЗЕ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

3 Ш 2015

005569862

Воронеж-2015

005569862

Работа выполнена в ФГЪОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Научный руководитель: Суханов Павел Тихонович

доктор химических наук, доцент,

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный

университет инженерных технологий»

Официальные

оппоненты: Доронин Сергей Юрьевич

доктор химических наук, Институт химии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского», профессор кафедры аналитической химии и химической экологии Рудакова Людмила Васильевна доктор химических наук, ГОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко», заведующая кафедрой фармацевтической химии и фармацевтической технологии, доцент

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Защита диссертации состоится «01» июля 2015 г. в 15 часов 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.035.05 при ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19, конференц-зал

Отзывы на автореферат (в двух экземплярах), заверенные гербовой печатью учреждения, просим присылать ученому секретарю совета Д 212.035.05.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» и в сети Интернет на сайте ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» http://www.vsuet.ru. Автореферат размещен в сети Интернет на сайте Министерства образования и науки РФ: vak2.ed.gov.ru и ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» http://www.vsuet.ru «29» апреля 2015 г.

Автореферат разослан «14» мая 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

канд. техн. наук, доц. Седых В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Широкое применение местных анестетиков в фармацевтической промышленности, медицине и ветеринарии, а также возможное негатнвное воздействие на организм человека, обусловливает необходимость разработки экспрессных и надежных способов их извлечения и определения, в том числе селективного, в водах, лекарственных средствах, биологических объектах и пищевых продуктах.

Многокомпонентность объектов анализа обусловливает необходимость отделения местных анестетиков от мешающих и основных компонентов, составляющих матрицу анализируемого образца.

Решение задачи возможно с применением различных способов извлечения, концентрирования и разделения, в частности жидкостной экстракции. Экстракция применяется также для концентрирования исследуемых веществ из сильно разбавленных растворов. В современном химико-токсикологическом анализе экстракция рекомендуется для изолирования веществ из биологических объектов, для очистки вытяжек от примесей.

Основными преимуществами методов экстракционного концентрирования по сравнению с соответствующими безэкстракционными является высокая избирательность, возможность многократного уменьшения объема анализируемого раствора и отсутствие деструкции аналитов.

Сведения о количественных экстракционных характеристиках местных анестетиков органическими растворителями весьма ограничены. Для решения практических задач с применением жидкостной экстракции необходима разработка экстракционных систем, характеризующихся высокими количественными характеристиками (коэффициент распределения £), степень извлечения Я, %), а также способов детектирования веществ непосредственно в концентрате.

Работа выполнена в соответствии с планами НИР физической и аналитической химии ВГУИТ по теме «Теоретическое обоснование, разработка инновационных решений для совершенствования технологических процессов, средств их контроля и оценки экологической безопасности (№ ГР 01201253870, код ГРНТИ: 31.15.19)».

Результаты исследований включены в аннотационные отчеты научного Совета РАН по аналитической химии за 2011-2014 гг.

Цель исследования - изучение экстракции местных анестетиков из водных сред для извлечения, концентрирования и определения в объектах различной природы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: установление некоторых закономерностей экстракции анестетиков индивидуальными растворителями разных классов, их бинарными смесями, а также растворителями с добавлением сольвотропных реагентов;

обоснование новых экстракционных систем, обеспечивающих практически полное извлечение анестетиков из водных сред, полученных в результате подготовки объектов анализа;

•/ разработка способов определения анестетиков в концентратах при анализе водных сред и объектов со сложной многокомпонентной матрицей [фармацевтические препараты, биологические жидкости (урина, плазма крови) и материал (печень), пищевые продукты (молоко)].

Научная новизна

Впервые систематически изучена экстракция новокаина, лидокаина и анестезина растворителями разных классов. Установлены взаимосвязи экстракционных характеристик анестетиков со свойствами гомологического ряда алифатических спиртов. Предложены схемы межмолекулярного взаимодействия анестетиков с органическими растворителями на основе анализа ИК-спектров экстрактов и квантово-химических расчетов. Установлен состав комплексов анестетик — сольвотропный реагент.

Методом симплекс-решетчатого планирования эксперимента оптимизированы составы подвижной фазы, позволяющие селективно разделять анестетики методом хроматографии в тонком слое.

Оптимизированы условия изолирования анестетиков из биожидкостей. Обоснованы условия экстракционного концентрирования и последующего определения анестетиков в концентратах.

Практическая значимость

Разработан комплекс спектрофотометрических, потенциометри-ческих, хроматографических и хромато-масс-спектрометрических способов определения анестетиков в водных средах, фармацевтических препаратах, пищевых продуктах (молоко) и биообъектах (плазма крови, урина, печень) после экстракционного извлечения и концентрирования.

Новизна практических разработок подтверждена материалами патентов РФ (№№ 2517127, 2537179, 2546294), публикациями в информационных бюллетенях Воронежского ЦНТИ, получено положительное решение о выдаче патента по заявке № 2014117440 от 29.04.2014 года. Разработки апробированы в испытательной лаборатории ФГБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии № 97 Федерального медико-биологического агентства» (г. Воронеж).

Основные положения, представляемые к защите: S эффективные экстракционные системы для практически полного извлечения анестетиков из водно-солевых растворов; схемы межмолекулярного взаимодействия анестетиков с растворителями и сольво-тропными реагентами;

■S новые подвижные фазы для разделения анестетиков методом хроматографии в тонком слое;

■S комплекс способов определения анестетиков в водных средах, фармпрепаратах и биологических и пищевых объектах.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на конференциях различного уровня: на Втором Съезде аналитиков России (Москва, 2013), International Congress Industrial-Akademic Networks in Cooperation Activities for Pharmaceutical, Chemical and Food Fields (L'aquila, Italy,2014), XIV Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические тех-нологии-2012» (Тула, 2012), ХП Международной конференции «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2012), III Международной конференции «Современные методы аналитического контроля качества и безопасности продовольственного сырья и продуктов питания» (Москва, 2012), 78-80 Международных конференциях «HayKOBi здобутки молод1 -BupiuieHHK) проблем харчування людства в XXI столгпт» (Киев, Украина, 2012-2014), VI и VII Всероссийских конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012, 2013» (Санкт-Петербург, 2012, 2013), Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы химической науки и образования» (Чебоксары, 2012), V Всероссийской конференции с международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2013), IX Всеукраинской конференции по аналитической химии (Донецк, 2013), VI Всероссийской конференции по химической технологии (Москва, 2012), IX Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2014» (Калининград, 2014), XXII-XXIV Российской молодежной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии (Екатеринбург, 2012-2014), Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Инженерные технологии XXI века» (Воронеж, 2013), отчетных научных конференциях и семинарах ВГУИТ (2011-2015).

Публикации

Основное содержание диссертации опубликовано в 34 работах: 11 статьях, в том числе - 5 в журналах, входящих в перечень ВАК; 3 патентах РФ; тезисах 20 докладов конференций. Кроме того, получено 1 положительное решение о выдаче патента.

Объем н структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы (240 источников, в том числе 69 на иностранных языках) и приложения (представлено на 45 страницах, включает 2 таблицы и 14 рисунков). Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 31 рисунок и 35 таблиц.

Личный вклад соискателя состоит в постановке и выполнении эксперимента, активном участии в интерпретации результатов, написании статей, заявок на изобретения, подготовке докладов и выступлении на конференциях, апробации разработанных способов определения на реальных объектах.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы и перспективность применения экстракции и физико-химических методов анализа для определения анестетиков в водных средах, фармпрепаратах, биологических объектах и пищевых продуктах.

В обзоре Л1ггературы (ГЛАВА 1) приводится описание методов извлечения, разделения, концентрирования и определения местных анестетиков (МА) в различных объектах.

Проведенные библиографические исследования позволили сделать вывод об отсутствии систематических исследований в области извлечения, концентрирования и разделения МА. Не разработаны способы определения анестетиков непосредственно в концентратах.

ГЛАВА 2. Методика эксперимента. Представлены физико-химические свойства объектов исследования: а) новокаин, б) анестезин, в) лидокаин:

^ч-г^о' чнлсл •нс1 ^^г^о7 сн3

,Р ... — -о

мн_с-сн2-<сл. НС1

х=с и в) сл

снз

Препараты новокаина (Н), анестезина (А) и лидокаина (Л) соответствовали фармакопейной чистоте. Экстрагенты - спирты (этиловый С2, н-пропиловый С3, н-бутиловый С4, н-пентиловый С5, н-гексиловый С6, н-гептиловый С7, н-октиловый С*, н-нониловый С», изопропиловый ¡-С3, изобу-тиловый ьС4), диметилкетон (ДМК), ацетонитрил (АЦ), эфиры (этилацетат (ЭА), бутилацегтат (БА), пентилацетат (ПА), 1,4-диоксан (1,4-ДО)), гексан (Г),

6

изооктан (НО), хлороформ (ХЛ), 1,2-дихлорэтан (1,2-ДХЭ) - дважды дистиллированные и идентифицированные по показателям преломления. Для экстракции применяли также смеси растворителей. Сольвотропные реагенты (CP) - камфора (КФ) (квалификация фарм.), диметилфталат (ДМФ), диэтил-фталат (ДЭФ), дибутилфтапат (ДБФ), диоктилфталат (ДОФ), бензофенон (БФ), фенетол (Ф) и дифенил (ДФ) (квалификация ч.). Высаливатели -К2С03, (NII4)2S04, NaCl, KCl, Na2S04, K:S04 применяли перекристаллизованные из препаратов квалификации ч.д.а. Экстракты анализировали спектро-фотометрически в диапазоне длин волн 190 - 320 им (спектрофотометр Shimadzu UV Mini-1240, кварцевая кювета. / = 1 см). Для анализа концентратов применяли метод неводного потенциометрического тирования (потенциометр рН-150 М, хлоридсеребряный и платиновый электроды); хроматографию в тонком слое (пластины «Sorbfil», Россия), высокоэффективную жидкостную хроматографию («Милихром-5», УФ-детектор, колонка «Nucleosil Ci«»); газо-жидкостную хроматографию (газовый хроматограф Agilent Technologies, США; модель 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором, модель 5973 Network). ИК-Фурье спектры водных растворов, экстрактов и кристаллических препаратов анестетиков получали на спектрометре «Инфра-ЛЮМ ФТ-08» (Люмекс, частота 400 - 5000 см"').

Экстракцию изучали при 22 ± 1 °С и соотношении объемов водной и органических фаз (Г) 5:1. Коэффициенты распределения устанавливали в области линейности изотерм экстракции (мг/см3): 0,005 - 0,5 для новокаина, 0,03-3,0 для анестезина и 0,001 -0,1 для лидокаина.

Обработку экспериментальных данных и оценку достоверности результатов анализа проводили методами математической статистики при п = 3-5, Р = 0,95, программное обеспечение MS Excel).

ГЛАВА 3. Закономерное™ экстракции местных анестетиков

Исследована зависимость коэффициентов распределения анестетиков от pH среды, обоснован выбор высаливателя. Максимальные количественные характеристики достигнуты при экстракции соединений в щелочной среде и применении практически насыщенных растворов сульфата аммония и карбоната калия, обеспечивающих наибольшее высаливающее действие.

В системах с наиболее эффективным высаливателем (карбонат калия) изучена экстракция анестетиков индивидуальными растворителями (табл. 1).

Таблица 1. Коэффициенты распределения (£>) и степень извлечения (И.. %) анестетиков в системе экстрагент - водный раствор карбоната калия (п = 3. Р == 0.95)._

Экстрагент Новокаин Анестезин Лидокан

О Л О Я О Я

ЭА 75.0 ± 6.4 94 900 ± 85 99 57.7 ± 5.3 92

БА 34,4 ±2.8 87 450 ±45 99 38.8 ±3.0 89

ПА 20.1 ± 1,7 80 360 ±35 99 29,1 ±2.2 85

ДМ К 60.3 ± 4.8 92 285 ±23 98 55.0 ±5.0 92

АЦ 23,3 ± 1.9 82 36.6 ±3,0 88 77.8 ±7,1 94

1,4-ДО 6.6 ± 0.30 57 20.2 ± 1.7 80 2.30 ±0,15 32

ХЛ 96.0 ± 8.8 95 1250±105 99 120 ± 10 96

1,2-ДХЭ 80,3 ± 7.5 94 90.9 ± 8,8 95 38.8 ± 3.2 89

Г 0.90 ± 0,03 15 4.00 ± 0.30 44 18,5 ± 1.5 79

На основании анализа ИК-спектров экстрактов и результатов кванто-во-химических расчетов предложены схемы взаимодействия растворителей с анестетиками. Экстракция обусловлена образованием водородных связей анестетиков с молекулами растворителя (кетоны. спирты), рис. 1 а) и 1 б).

Опразокаинем «онпроОных спязсн с участием « мистика ио()ы » Эмктрифюьно-нукмфгиышс

нзииниОснстане

Л *

, &&

Рисунок 1 - Схемы взаимодействия анестезина с экстрагентом: а) диме-тилкетоном. б) этиловым спиртом в) хлороформом (красным цветом обозначены атомы кислорода, синим - азота, серым - углерода, белым - водорода).

Распределение в системах с неполярными растворителями (гек-сан. изооктан) обусловлено неспецифической сольватацией. Также возможно образование комплексов по механизму электрофильно-нуклеофильного взаимодействия (экстракция хлороформом. 1,2-дихлор-этаном), рис. 1 в).

Установлены корреляции между \gD анестетиков в системе алифатический спирт - водный раствор высаливателя и числом С-атомов в

молекуле спиртов (Ы), а также физико-химическими параметрами экст-рагентов (табл. 2), позволяющие проводить прогнозирование коэффициентов распределения анестетиков с надежностью 95 %.

Таблица 2. Корреляции между и числом С-атомов в молекуле спиртов (М). показателем преломления растворителей (п), параметром рас-творимостн Гильдебраида (5) и диэлектрической проницаемостью (е).

МЛ Корреляции Коэф. корреляции (Я2) Корреляции Коэф. корреляции (Яг)

Высаливатель - карбонат калия Высаливатель - сульфат аммония

Л ДО = -0,082-N + 2,433 0,9900 ДО = -0,095-N + 2,695 0,9891

ДО = -9,470 п + 15,31 0,9640 ДО = -10,66 п+ 17,19 0,9900

ДО = 0,332 5- 1,010 0,9690 ДО =0,373-6- 1,283 0,9872

ДО = 0,043-с + 1.350 0,9870 ДО = 0,048 е+ 1,480 0,9749

11 ДО = -0,114-N + 2,209 0,9939 ДО = -0,097-N + 1,9X0 0,9878

ДО =-13,38 п +20,42 0,9900 ДО = -11,37 п+ 17,46 0,9990

ДО = 0,466-6-2,748 0,9X00 ДО = 0,396 5-2,229 0,9901

ДО = 0,059 Е +0,716 ДО = -0,0034 с2 + 0,1573 е + 0,0619 0,9443 0,9808 ДО = 0,051 Е + 0,712 0,9651

л ДО = -0,073 N + 1,650 0,9890 ДО =-0,089 ^ + 1,580 0,9860

ДО = -8,461 п + 13,16 0,9680 ДО = -10,33 п+ 15,63 0,9580

Ый = 0,294 Й - 1,487 0,9580 ДО =0,361 5-2,264 0,9541

ДО = 0,038 Е +0,701 ДО = -0,0026 Е2 + 0,1122х + 0,2034 0,9302 0,9820 ДО = 0,046 Е +0,4 И 0,9860

Полученные зависимости позволяют прогнозировать коэффициенты распределения анестетиков с погрешностью не более 10 % по сравнению с экспериментально установленными. Например, в системе н. дециловый спирт- водный раствор карбоната калия, они равны для лидокаина 9,99; 10,2 и 8,32 [рассчитаны соответственно по зависимостям ^ Э = Дп), О =У(е) и £> = ДМ)]. Экспериментально установлен коэффициент распределения лидокаина при экстракции н. дециловым спиртом 9,4 ± 0,9, что согласуется с прогнозом по установленным закономерностям.

Индивидуальные растворители не позволили достичь практически полного извлечения новокаина и лидокаина из водных сред. Для повышения экстракционных характеристик, а также коэффициентов концентрирования (в том числе и в случае анестезина) изучали возможность применения бинарных смесей экстрагентов.

При экстракции анестетиков смесями алкилацетатов и спиртов установлен синергетический эффект (рис. 2).

о

в

и

ЧЛ и.'! О.Ь 0.8 3.0 I) Мол. л- лнлапетата

ал о/. о.ь ад ¡.о

Мол д. эшлапетата

Рисунок 2 - Синергетический эффект при экстракции новокаина по-молярными смесями этилацетата с нропиловым (1). бутиловым (2). гептиловым (3) спиртами, гексаном (4), ичоокганом (5); пунктир -линии аддитивности.

Синергетический эффект уменьшается в смесях на основе высших спиртов по сравнению со смесями состава н-пропиловый спирт -этилацетат. Так, при экстракции новокаина из водных сред смесью н-нониловый спирт - этилацетат коэффициенты распределения аддитивны.

Синергетический эффект уменьшается при переходе от новокаина к анестезину. Полярная 1МН;ггруппа обуславливает специфическую сольватацию анестетиков органическими растворителями. Аминогруппа проявляет по отношению к бензольному кольцу 'С-эффект сопряжения, который больше индукционного эффекта, направленного в противоположную сторону.

Присутствие другого заместителя в яс//?а-положении ослабляет С-эффект аминогруппы, в результате чего связи ТМ-Н ослабляются (сильнее у новокаина, чем анестезина), что способствует образованию Н-связи с молекулами электродонорных растворителей. Дополнительный активный центр в молекуле новокаина обуславливает больший синергетический эффект.

Антагонистический эффект (рис. 3) обусловлен вытеснением анестетиков менее активным растворителем [этилацетат и гексан (или 1,4-диоксан) соответственно] из сольватов с более эффективным экст-рагентом. Природа всаливания обусловлена различной растворимостью распределяемых соединений в воде (гидрофобностью). Экстракционные системы, характеризующиеся антагонистическим эффектом при экстракции анестетиков, могут быть применены как элюенты в обра-щенно-фазовом варианте жидкостной хроматографии. Смеси экстра-гентов с синергетическим эффектом можно применять для суммарного извлечения анестетиков из различных объектов.

о il.? О.-! 0,0 0.8 >.0 с 0.? 0,4 »,(. 0.8 1.0

Мол. д. этштцетата Мол. д. пзопрошшового спирта

Рисунок 3 - Антагонистический эффект при экстракции: новокаина ( I ) и лидокаина (2) смесями этилацетата и хлороформа и анестезина смесями изопропилового спирта с гексаном (3) и 1.4-диоксаном (4): пунктир - линии аддитивности.

Экстракция растворами сольвотропных реагентов. Повышение эффективности экстракционного извлечения при применении сольвотропных реагентов основано на образовании молекулярных комплексов с распределяемым веществом, которые легко переходят в органическую фазу.

Более устойчивые комплексы анестетиков образуются при применении камфоры (константы образования молекулярных комплексов новокаина К = 0,11 при экстракции н-пропиловым спиртом). При применении активных (кислородсодержащих) сольвотропных реагентов (камфора, диэтилфталат, бензофенон, фенетол) комплексы образуются за счет водородных связей, с сольвотропными реагентами, не содержащими атом кислорода, например, дифенилом, образуются менее прочные к- или а- комплексы (К = 0,04). В системах с сольвотропными реагентами образуются молекулярные комплексы состава 1:1.

Таблица 3. Зависимость лидокаина от числа С-атомов в молекулах диалкилфталатов при экстракции смесями с алкилацетатами (объемное соотношении 1:10).

Установлены зависимости анестетиков от числа С-атомов в молекулах диалкилфталатов, а также между и анестетиков, позволяющие прогнозировать коэффициенты распределения и константы образования молекулярных комплексов (табл. 3 и 4).

На ИК-спектрах экстрактов анестетиков установлены сдвиги характеристических полос поглощения по сравнению со стандартными

ЭКС Корреляции Коэф. корреляции (R7)

ЭА lgD = -0,019N+2,318 0,9790

БА lgD = -0,028-N +2,282 0,9700

ПА lg£> = -0.026-N +2,192 0,9850

значениями, обусловленные образованием водородных связей между анестетиком и экстрагентом, а также образованием я-комплексов.

Проведены

Таблица 4. Зависимость между и 1ц£> при ... „

' ь * ' квантово-химические

экстракции новокаина спиртами с добавлением

расчеты структур не-сольвотроппых реагентов. ^ " 'г

которых комплексов

«экстрагент - анестетик», а также «сольво-тропный реагент — анестетик» методом Хартри-Фока в базисе 6-31 О(ё.р) при помо-

CP Корреляции Коэф. корреляции (/?-')

КФ lgAT= -1,1 lllg£> + 0.905 0.9790

БФ lgK= -1.175- lg£>+ 0.907 0.9670

ДЭФ lgK =-0,906 lgD +0.407 0.9830

Ф lgK = -0.9191g£> + 0,279 0,9910

Дф lgK = -1.086lgD +0,406 0.9420

щи компьютерных программ Gaussian 09W и GaussView 5.0, рассчитана энергия взаимодействия молекул (рис. 4).

г)

Рисунок 4 - Возможные структуры оптимизированных комплексов анестезина с: а) фенетолом. б) диметилфталатом. в) камфорой, г) бензофеноном (красным цветом обозначены атомы кислорода, синим - азота, серым - углерода. белым — водорода).

Удлинение связи в комплексе по сравнению с исходной структурой молекул обусловлено ее участием в межмолекулярном взаимодействии, увеличение зарядов подтверждает увеличение поляризации связей (табл. 5). Длины водородных связей в комплексах с анестезином составляют 0,19556-0,22923 нм. Установлено, что наиболее устойчивые молекулярные комплексы образуются при взаимодействии анестезина с камфорой.

Таблица 5. Удлинение связей и увеличение зарядов Малликена ато-

мов при образовании молекулярных комплексов анестезина.

Связь, атом Удлинение связи, нм 10'4 Увеличение заряда Малликена, ед 10"2

С=0 связь в сложнозфирной группе анестезина, кислород 3,7-8,4 2,5-5.3

N-11 связь анестезина, азот 4,4-5,3 2.9-4,4

ОН связь воды, кислород, водород 3,4-7.8 5,4-7,8 2.6-6,3

С=0 связь камфоры, кислород 5.6 3.7

С=0 связь бензофенона, кислород 2,1 0.6

С=0 связь в сложноэфирной группе диметилфталата. кислород 1,3 0.7

С-О группа фенетола, кислород 7,1 1.3

ОН связь этилового спирта, водород 7,6 6.3

С=0 связь днметилкетона, кислород 5,7 2.8

Устойчивость комплексов понижается в ряду: камфора > бензо-фенон > диметилфталат > фенетол, что согласуется с экспериментально полученными данными (соответствующие константы образования молекулярных комплексов анестезина с сольвотропными реагентами 0,63 > 0,36 > 0,35 > 0,22). Экстракционная эффективность по отношению к анестезину также уменьшается в этом ряду. Например, при применении растворов сольвотропных реагентов в этилацетате (5 мае. %) получены следующие коэффициенты распределения: 3100 ± 280, 2480 ± 190, 2230 ± 180, 1760 ± 150. Установлены зависимости IgD и констант образования молекулярных комплексов анестезина с сольвотропными реагентами от величины энергии образования водородной связи в комплексах: lgD = -0,025 ¿;„яи + 2,8630 (R2 = 0,9618) и К = -0,0425-Е,тш - 0,4731 (R2 = 0,9851). Полученные зависимости позволяют прогнозировать коэффициенты распределения анестезина при применении других сольвотропных реагентов с погрешностью не более 10 %.

На основании полученных результатов выбраны наиболее эффективные системы для извлечения местных анестетиков из водных сред (бинарные смеси, характеризующиеся синергетическим эффектом и растворы сольвотропных реагентов в органических растворителях), которые применяли при разработке способов определения аначитов в многокомпонентных объектах анализа.

В ГЛАВЕ 4 приводятся способы концентрирования и результаты спектрофотометрического, хроматографического (ТСХ и ВЭЖХ), по-тенциометрического и хромато-масс-спектрометрического (ГХ-МС) определения анестетиков в концентратах. Способы апробированы на примере анализа водных сред, фармацевтических препаратов, биологических жидкостей и материалов, молока.

Определение МА в (Ьапмппепапатах

Экстракция II н-проп»ловым спиртом с добавлением камфоры

Рисунок 5 - Комплексная схема определения местных анестетиков.

14

Схема проведения анализа представлена на рис. 5. При определении местных анестетиков в биологических объектах в качестве экстра-гентов применяли растворы сольвотропных реагентов. Концентрирование анестетиков из водных сред и вытяжек из фармпрепаратов проводили эффективными бинарными смесями. Извлечение новокаина из молока и его концентрирование проводили после осаждения белков и жиров.

Раздельное определение анестетиков в концентратах в водных средах проводили хроматографически и потенциометрически.

Для разделения анестетиков методом ТСХ подвижные фазы выбирали исходя из природы аналитов.

Для оптимизации состава подвижной фазы применяли симплекс-решетчатое планирование эксперимента. Установлено, что для наиболее эффективного разделения анестезина, новокаина и лидокаина целесообразно применение подвижных фаз, содержащих 0,05 - 0,5 об. дол. диметилкетона, 0,1 - 0,45 об. дол. ацетонитрила и 0,4 - 0,8 об. дол. гексана. Введение в подвижную фазу трихлоруксусной кислоты (ТХУК) позволяет получить пятна анестетиков правильной формы.

Расшифровку хроматограмм проводили с применением сканер-технологий. Хроматограм-мы сканировали на планшетном сканере, изображение обрабатывали в программе «Денситометр «Сорбфил».

При потенциометриче-ском определении анестетиков в экстракте в качестве дифференцирующего растворителя применяли н-пропиловый спирт в смеси с гексаном и ледяной уксусной кислотой, титрант - раствор HCl в н-пропиловом спирте (рис. 6).

Хроматографический и потенциометрический способы определения с предварительным экстракционным концентрированием (табл. 6) воспроизводимы, характеризуются одинаковой точностью (Fpac < Fxa6ll, FTa6jl (0,95:2:3) = 9,55). Расхождения между результатами определения незначимы (tpac < W, W (0,95:4) = 2,78). Погрешность определения не превышает 10 %.

JE Л

Рисунок 6 - Дифференциальная кривая титрования лидокаина (1). анестезина (2) и новокаина (3 ).

Таблица 6. Определение МЛ в водных средах методом «введено - найдено»; п = 3, Р = 0,95. _

Вве- Потенциометрическое Хромато графическое

\1 дено, определение определение V

А мкг/с 1 м Найдено, мкг/см1 Я, % Д, % Найдено, мкг/см1 в,, % Д, % Г р.,в

50,00 47,50 ± 10,1 7,8 5,0 47,40 ± 6,45 5,0 5,2 2,57 0,03

11 25,00 22,9 ± 4,8 7,7 8,4 23,20 ±4,60 7,3 7,2 1,27 0,18

10,00 9,46 ± 2,40 9,8 10,0 9,50 ± 1,75 6,9 7,0 1,91 0,43

50,00 46,2 ± 10,4 8,3 7,6 47,90 ± 6,30 4,8 4,2 2,38 0,80

Л 25,00 23,1 ±5,4 8,6 7,6 23,50 ± 4,40 6,9 6,0 1,60 0,22

10,00 9,40 ± 2,60 ЮД 6,0 9,60 ± 2,20 8,4 4,0 1,50 0,18

50,00 46,60 ± 10,6 8,4 6,8 48,10 ± 6,31 4,8 3,8 2,40 0,69

А 25,00 22,8 ±5,9 9,5 8,8 23,80 ± 5,30 8,2 4,8 1,43 0,52

10,00 9,10 ±2,30 9,3 9,0 9,70 ± 2,00 7,8 6,0 1,19 0,28

МА в концентратах из фармпрепаратов определяли спектрофото-метрическим и хроматографическим способами (табл. 7).

Таблица 7. Определение местных анестетиков в фармацевтических

препаратах: п = 3, Р = 0,95.

М А Фармпрепарат Заявлено, мг/г СФ анализ концентрата ТСХ анализ концентрата

Найдено, мг/г 5„ % д, % Найдено, мг/г Я,, % А, %

Л 1 20 19,13 ± 2,80 6,3 5,3 18,90 ± 3,30 6,4 3,5 2,20 0,29

2 25 23,80 ± 3,50 4,3 4,3 23,10 ± 4,40 7,0 4,8 1,85 0,60

А 3 40 37,90 ± 4,80 4,7 4,4 37,70 ± 5,10 5,0 5,3 1,01 0,13

4 38,30 ± 4,50 4,3 4,8 38,00 ± 4,70 4,6 4,3 1,54 0,21

1 — мазь «Ауробин» (ОАО «Гедеон Рихтер»), 2 - крем «ЭМЛА» (ООО «Астра-ЗенекаФармасыотикалз»), 3 - «Гепариновая мазь» (ОАО «Нижфарм»), 4 -«Гепариновая мазь» (ЗАО «Аптайвитамины»), в скобках указан производитель

При спектрофотометрическом определении получены завышенные значения, что обусловлено влиянием соэкстрактивных веществ. Способы экспрессны - продолжительность анализа не превышает 20 и 40 мин для спектрофотометрического и хроматографического, результаты анализа сопоставимы с данными фармакопейных методик, основанными на потенциометрическом титровании извлечений, полученными после длительной, многостадийной пробоподготовки (Ррас < 1,84, 1рас<0,77).

При анализе объектов со сложной многокомпонентной матрицей местные анестетики предварительно изолировали различными растворителями. Установлено, что при однократном настаивании обеспечивается наибольшее изолирование новокаина и анестезина из биообъектов диме-тилкетоном, лидокаина — этилацетатом (табл. 8).

Для выбора объемного соотношения биожидкости с растворителями и продолжительности их контакта применяли методы планирования эксперимента (композиционные уни-форм-ротатабельные планы второго порядка 22). Для практически полного (> 98 %) изолирования анестетиков из плазмы крови достаточно соотношение объемов растворителя и биологической жидкости 2-3, продолжительность настаивания 11-13 мин.

Полное изолирование анестетиков из ткани печени установлено при настаивании по 45 минут при соотношении объемов рас-

Для концентрирования анестетиков из извлечений применена жидкостная экстракция. Анализ концентратов проводили хро-матографически или спектрофо-тометрически.

При определении новокаина в плазме крови методом ВЭЖХ применяли подвижную фазу аце-тонитрил метиловый спирт 0,025 моль/дм3 раствор КН:Р04 (рН 3,0) в соотношении 10:10:90. Время удерживания новокаина 5,73 мин (рис. 7). Количественное содержание устанавливали при 298 нм по градуировочному графика А = 2959,9 С + 0,1992 (Я2 = 0,9990).

При определении анестетиков методом ТСХ применяли пластины «Сорбфил», разделение проводили в потоке смеси дихлорме-

Таблица 8. Степень однократного изолирования (R'. %) МА из плазмы крови: /* = 1:1, т = 5 мин.

же н А Л

дм к 62 67 68

ЭА 42 65 74

АЦ 60 58 65

с, 45 56 36

i-C, 55 52 47

Г 48 46 40

(NH4)2so4 35 60 51

*f — соотношение водно-солевого раствора или органического растворителя и плазмы крови

творителя и биоматериала 2:1.

AI' I 1

•I

i

И» Ж»

. —Ihr

Рисунок 7 - ВЭЖХ-хроматограмма очищенного экстракта плазмы крови, содержащей новокаин.

танзтиловый спирт (1:1), коэффициенты подвижности новокаина и камфоры составили КГнов = 0,48 ± 0,03; РГкаыф = 0,85 ± 0,02.

Способ позволяет определить в плазме крови до 91 % новокаина. Минимально определяемая концентрация на уровне 0,25 мкг/см3. Погрешность определения не превышает 15 % (табл. 9).

Лидокаин в урине определяли спектрофотометрически и методом газо-жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

При спектрофотометрическом определении лидокаина в концентрате оптические плотности измеряли при 289 нм. Градуировочный график линеен в интервале 5-50 мкг/см3 (А = 6,625-С; И2 = 0,9990).

Таблица 9. Результаты определения новокаина в плазме крови; (п = 3; Р = 0,95)_

Введено, мг/см' Анализ концентрата методом ТСХ Анализ концентрата методом ВЭЖХ

Найдено, мг % Д, % Найдено, мг Б,, % Д, %

0,020 0,017 ±0,003 6,5 15,0 0,018 ±0,002 4,1 10,0 2,73 1,25

0,100 0,087 ±0,012 5,1 13,0 0,089 ±0,010 4,1 11,0 1,49 0,62

0,250 0,224 ± 0,038 6,3 10,4 0,225 ± 0,032 5,2 10,0 1,43 0,10

0,500 0,456 ± 0,057 4,6 8,8 0,453 ± 0,044 3,6 9,4 1,58 0,18

При определении методом ГХ-МС (по полному ионному току) пик на хроматограмме с временем удерживания 7,79 мин соответствует лидокаину.

Количественно лидокаин определяли по уравнению градуировоч-ного графика: Б= (1,93-С + 0,03) 105 , где Б - площадь хроматографиче-ского пика; С - содержание лидокаина в хроматографируемой пробе, нг. График линеен в интервале концентраций 4,0-10"9 - 4,0-10"7 г.

Результаты определения лидокаина в урине человека представлены в табл. 10.

Таблица 10. Определение лидокаина в урине; п = 3; Р = 0,95.

Введено, мг/см' Спектрофотометрическое определение Определение методом ГХ-МС Ир, V

Найдено, мг Б,, % Д, % Найдено, мг % Д, %

0,100 0,090 ± 0,020 8,2 10,0 0,092 ±0,013 5,2 8,0 2,45 0,41

0,500 0,460 ±0,061 4,9 8,0 0,470 ± 0,055 4,3 6,0 1,50 0,58

.1,250 1,180 ± 0,160 5,0 5,6 1,190 ± 0,110 3,4 4,8 2,73 0,25

2,500 2,300 ±0,242 3,9 8,0 2,320 ±0,210 3,3 7,2 1,75 0,30

По предложенной методике двукратной экстракцией максимально возможно определить в урине 95 % лидокаина. Минимально определяе-

мая концентрация на уровне 0,3 мкг/см3. Погрешность определения не превышает 10 %.

Определение анестезина проводили в очищенном тонкослойной хроматографией экстракте говяжьей печени, которая наиболее близка по составу к человеческой, методом газо-жидкостной хроматографии с МС-детектированием. Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,025 мин соответствует анестезину (рис. 8). Градуировочный график описывается уравнением: 8= (3,27-С + 0,99)104 , где Б - площадь хрома-тографического пика; С - содержание анестезина в хроматографируемой пробе, нг.

«ооооо 30 ООО о *ооооо ?ооооо госооо

1ОООО0

..Л. I

I О С ОО

Рисунок 8 - ГХ-МС хроматограмма (А) и масс-спектр (Б) очищенного экстракта из печени, содержащего анестезин.

При хроматографическом определении анестезина со спектрофо-тометрическим детектированием концентрат фотометрировали при 289 нм в смеси изопропиловый спиртэтилацетат (0,3:0,7 мол. д.). Уравнение градуировочного графика А = 943 с, (с - концентрация анестезина, мг/см3). Результаты представлены в табл. П.

Таблица 11. Результаты определения анестезина в ткани печени (п=3;

Введено, мг/г Анализ концентрата методом ТСХ Определение ГХ-МС Ррас. V

Найдено, мг 5„ % Д,% Найдено, мг Бг, % Д, %

0,010 0,008 ± 0,003 13,8 20,0 0,008 ± 0,002 9,2 20,0 2,42 0,00

0,050 0,042 ±0,019 16,7 16,0 0,043 ±0,010 8,6 14,0 3,40 0,21

0,100 0,090 ± 0,032 13,1 10,0 0,091 ±0,016 6,5 9,0 4,59 0,13

0,150 0,130 ±0,055 15,6 13,3 0,135 ± 0,018 4,9 10,0 9,50 0,40

0,250 0,220 ± 0,090 15,1 12,0 0,228 ± 0,034 5,5 8,8 8,38 0,40

Способ позволяет определить до 91 % анестезина в препарате печени. Чувствительность определения составляет 0,5 мкг/г. Погрешность определения не превышает 20 %. Способы определения анестетиков воспроизводимы, легко выполнимы и могут быть рекомендованы при проведении судебно-медицинской экспертизы.

Молоко содержит жиры и белки, с которыми могут связываться анестетики. Прямая экстракция изучаемых соединений из молока растворителями невозможна вследствие образования стойких эмульсий. Изоляты получали выделением белков и жиров в молоко при добавлении сульфата аммония и 0,1 моль/дм3 раствора НС1 (1 способ) или введением ацетонитрила (2 способ). Анализ экстрактов из изолятов молока проводили спектрофотометрическим и хроматографическим способами (табл. 12).

Таблица 12. Определение новокаина в молоке (введено 0,2 мг/см3

новокаина); п = 3, Р = 0,95.

Молоко 1 способ 2 способ р V

Найдено, мг/см' Б,, % Д,% Найдено, мг/см5 % д, %

1 0,170 ±0,040 8,7 15,0 0,183 ±0,050 10,1 8,5 1,43 0,94

2 0,193 ±0,035 6,7 3,4 0,195 ±0,064 12,1 2,5 3,00 0,13

3 0,181 ±0,038 7,7 9,5 0,190 ±0,059 11,4 5,0 2,08 0,61

4 0,185 ±0,041 8,2 7,5 0,192 ±0,053 10,2 4,0 1,68 0,50

5 0,173 ±0,043 9,2 13,5 0,187 ±0,055 10,8 6,5 1,75 0,94

1 - цельное (3,5 %), 2 - пастеризованное. (2,5 %), 3 - пастеризованное (3,2 %),

4 - ультрапастеризованное (2,5 %), 5 - ультрапастеризованное (3,2 %). В скобках

указана массовая доля жира.

При анализе молока по второму способу изоляты содержат большее количества новокаина, что обусловлено большим эффектом разрушения комплексов анестетика с белками и с жирами в присутствии ацетонитрила. Погрешность определения не превышает 15 % по первому способу и 9 % по второму.

ВЫВОДЫ

1. Систематически изучена экстракция новокаина, лидокаина и анестезина растворителями разных классов (простые и сложные эфиры, кетоны, нитрилы, алканы, хлорсодержащие соединения), их бинарными смесями, а также растворами сольвотропных реагентов из практически насыщенных растворов сульфата аммония и карбоната калия.

2. Установлены зависимости логарифмов коэффициентов распределения анестетиков от числа С-атомов в молекулах диалкилфталатов и алифатических спиртов; диэлектрической проницаемости, параметра растворимости Гильдебранда и показателя преломления экстрагентов. Проведены квантово-химические расчеты и предложены схемы межмолекулярного взаимодействия анестетиков с экстрагентами.

3. С применением методов математического планирования эксперимента оптимизированы составы трехкомпонентной подвижной фазы для разделения анестетиков методом хроматографии в тонком слое, рассчитаны условия эффективного изолирования местных анестетиков из биообъектов растворителями.

4. Предложены эффективные экстракционные системы для практически полного извлечения анестетиков из водных сред и их концентрирования (смеси, характеризующиеся синергетическим эффектом; растворы камфоры и бензофенона в органических растворителях).

5. Разработан комплекс экстракционно-спектрофотометрических, экстракционно-хроматографических (ТСХ, ВЭЖХ), экстракционно-хромато-масс-спектрометрических и экстракционно-потенциометри-ческих способов определения анестетиков в водных средах, фармацевтических препаратах, биологических объектах (урина, плазма крови, печень), а также пищевых продуктах (молоко). Способы характеризуются высокой чувствительностью (минимально определяемые концентрации не превышают 1 мкг/см3), погрешность определения - 3-20 %.

Основные публикации по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Коренман, Я.И. Экстракция новокаина из водных сред алифатическими спиртами с применением высаливателей [Текст] / Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. — 2012. - №4. — С. 92 - 95.

2. Коренман, Я.И. Коэффициенты распределения новокаина в системах алифатический спирт (С3 - С,) — сольвотропный реагент - вьтсаливатель - вода [Текст] / Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова, O.A. Пахомова // Журнал физ. химии. - 2013. - Т.87, №7. - С. 1239 - 1242.

3. Коренман, Я.И. Экстракционно-хроматографическое определение местных анестетиков в водных средах [Текст] / Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова, П.Т. Суханов, М.В. Зыбенко // Аналитика и контроль. - 2013. - Т.17, №4. -С. 465-471.

4. Коренман, Я.И. Определение новокаина в биологических жидкостях [Текст] / Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова, В.К. Шорманов, С.Г. Галушкин // Фармация. - 2014. - №4. - С. 8 - 13.

5. Суханов, П.Т. Синергизм и антагонизм при экстракции местных анестетиков из водных сред смесями растворителей [Текст] / П.Т. Суханов, Т.В. Чибисова, Я.И. Коренман // Журнал физ. химии. - 2014. - Т.88, №12. -С. 2012-2016.

Другие статьи

6. Anaesthesine and lidocaine distribution in the aliphatic alcohol - carbonate potassium - water chain [Text] / P. T. Sukhanov, T.V. Chibisova, M.V. Ivle-va, E.A. Chiegbu, E.A. Chigirin // Сборник материалов International Congress Industrial-Akademic Networks in Coopération Activities for Pharmaceutical, Chemical and Food Fields - L'aquila, Monteluco di Roio (Italy), 17-18 September, 2014. - L'aquila.-2014. - P. 36-40.

7. Коренман, Я.И. Извлечение новокаина из водных растворов алифатическими спиртами в присутствии сольвотропного реагента [Текст] / Я.И. Коренман, О.А. Пахомова, Т.В. Чибисова // Матер. Всерос. конф. с между-нар. участием «Современные проблемы химической науки и образования», T. II., Чебоксары. -2012. -С.143 - 145.

8. Коренман, Я.И. Экстракционно-спектрофотометрическое определение новокаина в молоке [Текст] / Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова // Матер. III Междунар. межвуз. конф. «Современные методы аналитического контроля качества и безопасности продовольственного сырья и продуктов питания», Москва. - 2012. - С. 107 - 109.

9. Чибисова, Т.В. Экстракционно-хроматографическое определение новокаина в плазме крови [Текст] / Т.В. Чибисова, С.Г. Галушкин, В.К. Шорманов, Я.И. Коренман // Матер. V Всерос. научно-практ. конф. студ., аспир. и молодых ученых с междунар. участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности», Бийск. - 2013. - С. 220 - 222.

10. Чибисова, Т.В. Экстракционное извлечение и хроматографическое определение анестезина и новокаина в мази «Меновазан» [Текст] / Т.В. Чибисова, П.Т. Суханов, Я.И. Коренман // Матер. V Всерос. научно-практ. конф. студ., аспир. и молодых ученых с междунар. участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности», Бийск. - 2013. - С. 216 - 219.

11. Чибисова, Т.В. Определение местных анестетиков в водных средах с применением предварительного экстракционного извлечения [Текст] / Т.В. Чибисова // Матер, конф. студ., аспир. и молодых ученых «Инженерные технологии XXI века», Воронеж. - 2013. - С. 99 - 103.

Патенты

1. Пат. 2517127, Россия, МПК7 G01N 33/15, B01D11/04. Способ экстракции новокаина из водных сред смесью фенетола и этилацетата / Коренман Я.И., Чибисова Т.В. - 2012153942/15/; Заявл. 14.12.2012; Опубл. 27.05.2014.

2. Пат. 2537179, Россия, МПК G01N 33/15, G01N 33/50, G01N 30/06.

Способ определения прокаина в плазме крови / Шорманов В.К., Коренман Я.И., Чибисова Т.В., Галушкин С.Г., Ярош К.Н. - 2013135819/15; Заявл. 30.07.2013; Опубл. 27.12.2014.

3. Пат. 2546294, Россия, МПК А61К 31/245, G01N 33/50, G01N 30/02.

Способ определения новокаина в биологическом материале / Шорманов В.К., Коренмаи Я.И., Чибисова Т.В., Галушкин С.Г., Ярош К.Н. -2013156726/15; Заявл. 19.12.2013; Опубл. 10.04.2015.

Некоторые тезисы докладов

1. Экстракционно-хроматографическое определение анестезина и красителя в таблетках «Беллалгин» [Текст] / П.Т. Суханов, Я.И. Коренман, В.К. Шорманов, Н.Ю. Санникова, Т.В. Чибисова, С.Г. Галушкин // Тез. докл. Второго Съезда аналитиков России, Москва. - 2013. - С.77.

2. Чибисова, Т.В. Извлечение новокаина из водных растворов алифатическими спиртами [Текст] / Т.В. Чибисова, О.А. Пахомова, Я.И. Коренман // Тез. докл. VI Всерос. конф. молодых ученых, аспир. и студ. с междунар. участием «Менделеев-2012, Санкт-Петербург. - 2012. - С. 594 - 595.

3. Чибисова, Т.В. Экстракционное извлечение и спектрофотометри-ческое определение новокаина в водных средах [Текст] / Т.В. Чибисова, М.В. Зыбенко, Я.И. Коренман // Тез.докл. VII Всерос. конф. с междунар. участием «Менделеев-2013», Санкт-Петербург. - 2013. - С. 170 - 172.

4. Суханов, П.Т. Экстракционно-потенциометрическое определение местных анестетиков в сточных водах стоматологических учреждений [Текст] / П.Т. Суханов, Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова // Тез. докл. IX Всерос. конф. по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2014» -Калининград, 22 - 28 июня 2014. - Калининград. - 2014 - С. 228.

Материалы диссертации также представлены в 16 тезисах докладов.

Соискатель благодарит д.х.н.\Коренмана Я.7Ц д. форм н. Шорманова В.К., д.л.и. Бутырскую Е.В. за научные консультации

и помои/ь на разных этапах выполнения работы

Подписано в печать 05.05.2015 г. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Гарнитура Тайме Ризография. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Заказ № 47 ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» (ФГБОУ ВПО «ВГУИТ») Отдел оперативной полиграфии ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» Адрес университета и отдела оперативной полиграфии: 394036 Воронеж, пр. Революции, 19