Электрохимические (био) сенсоры на основе Fe-Ni гексацианоферратов, полученных методом межфазного химического синтеза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

Борисова Анастасия Владимировна

Электрохимические (био)сенсоры на основе

Ре-№ гексацианоферратов, полученных методом межфазного химического синтеза

Специальности: 4844341

02.00.15 - кинетика и катализ 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2011

4844341

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Карякин Аркадий Аркадьевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Алпатова Нинель Михайловна Институт физической химии и электрохимии имени А.Н.Фрумкина РАН

доктор химических наук, профессор Карпачева Галина Петровна Институт нефтехимического синтеза имени А.В.Топчиева РАН

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН

Защита состоится «29» марта 2011 года в 15 часов 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «25» февраля 2011 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Требования современного анализа - это чувствительность, избирательность, дешевизна, простота и экспрессность. Электрохимические методы как нельзя лучше удовлетворяют указанным требованиям. По сравнению с другими аналитическими методами (слектрофотометрия, флуориметрия, люминесцентные методы) они просты и удобны в применении, не требуют пробоподготовки, а также позволяют осуществлять непрерывный мониторинг анализируемого вещества. Все эти преимущества позволяют отдавать предпочтение электрохимическим сенсорам в клинической диагностике, пищевой промышленности и контроле состояния окружающей среды.

С 80-х годов XX века для изготовления электрохимических сенсоров используют трафаретную печать. Этот дешевый и простой в исполнении метод обеспечивает простоту массового производства, низкую стоимость и высокую воспроизводимость получаемого продукта. За один шаг трафаретной печати можно получать целую матрицу не отличающихся друг от друга по свойствам сенсорных структур, электрохимические характеристики которых при этом приближены к свойствам классических торцевых дисковых электродов, дорогих в изготовлении и неудобных в применении.

Современные медицина и биология рассматривают пероксид водорода как важнейший метаболит, являющийся индикатором окислительного стресса и воспалительных процессов в организме. Кроме того, сенсоры на пероксид водорода находят широкое применение при конструировании биологических сенсоров, содержащих иммобилизованные оксидазы в качестве биочувствительного элемента. Эти ферменты катализируют окисление специфического субстрата кислородом воздуха, при этом кислород восстанавливается до пероксида водорода, концентрация которого позволяет судить о концентрации исходного субстрата. Таким образом, потребность в чувствительных, стабильных и воспроизводимых сенсорах на пероксид водорода чрезвычайно велика.

Наиболее чувствительным и селективным методом определения пероксида водорода является амперометрия с использованием электрохимически модифицированных берлинской лазурью электродов, позволяющих определять концентрации Н202 в широком (до 7 порядков) диапазоне. Для реализации массового производства пероксидных сенсоров возникает необходимость в исключении трудоемких электрохимических стадий модификации и в их замене на

неэлектрохимический синтез берлинской лазури на поверхности электрода. Такой метод позволит модифицировать одновременно целую матрицу электродов и, следовательно, автоматизировать процесс изготовления сенсоров. Кроме того, существует необходимость в дополнительной стабилизации каталитического покрытия, связанная с недостаточной для некоторых приложений операционной и механической стабильностью берлинской лазури. Этот процесс также целесообразно проводить без привлечения электросинтеза, ориентируясь на массовое производство.

Цель работы состояла в создании научных основ технологии производства высокоэффективных амперометрических сенсоров и биосенсоров, пригодной для массового производства, то есть лишенной трудоемких электрохимических стадий. Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

- создание планарных трехэлектродных сенсорных структур, обладающих максимальной проводимостью, а также электроактивностью в нейтральных растворах;

- разработка бестокового метода синтеза берлинской лазури на поверхности электрода и создание амперометрических сенсоров для определения пероксида водорода;

- стабилизация покрытий берлинской лазури на поверхности планарных электродов;

- иммобилизация ферментов на поверхности пероксидных сенсоров и создание соответствующих биосенсоров;

- адаптация сенсоров для применения в реальных объектах;

- изучение поведения сенсоров в тонкослойной ячейке для создания сенсорных систем, пригодных для анализа малых объемов биологических жидкостей, например, крови.

Научная новизна. Разработан метод межфазного химического синтеза берлинской лазури для исключения электрохимических стадий модификации электрода. Сенсоры на пероксид водорода, изготовленные с использованием предложенного метода, не уступают ни по аналитическим, ни по электрохимическим свойствам электродам, модифицированным электрохимическим осаждением. Предложены неэлектрохимические методы стабилизации пероксидных сенсоров с использованием проводящих полимеров, полиэлектролитов и гексацианоферратов переходных металлов. Показано, что совместный синтез берлинской лазури с органическими полимерами (полианилин, полипиррол, замещенные полипирролы) позволяет существенно улучшить как чувствительность, так и операционную

4

стабильность сенсоров на Н2О2. Путем послойного синтеза берлинской лазури и гексацианоферрата никеля на поверхности планарного электрода получен высокостабильный сенсор, демонстрирующий неизменный сигнал в жестких условиях непрерывной регистрации 1 мМ пероксида водорода в течение 50 минут.

Увеличением плотности ферментсодержащей мембраны создан глюкозный биосенсор, рабочий диапазон которого составляет от 1 до 20 мМ глюкозы. Разработан метод изготовления тонкослойной ячейки на поверхности биосенсора для уменьшения объема пробы до 1 мкл.

Практическая значимость. Получено несколько типов сенсоров для определения пероксида водорода, обладающих следующими преимуществами: низким пределом обнаружения (Ы0"? М), высокой чувствительностью (до 0.55 AM"1 см"2), широким диапазоном линейности градуировочного графика (МО"7 - МО"3 М) и высокой стабильностью (сенсор демонстрирует неизменный сигнал в присутствии 1 мМ Н202 в течение 50 минут). Показана применимость предложенных сенсоров на пероксид водорода для неинвазивной диагностики легочных заболеваний путем анализа конденсата выдыхаемого воздуха, а также для исследования общей антиоксидантной активности пищевых продуктов. Создан лактатный биосенсор, пригодный для методов неивазивного анализа, в частности, для определения лактата в поте человека. Разработан глюкозный биосенсор с верхним пределом обнаружения глюкозы 20 мМ и система экспрессного анализа малых объемов (1 мкл) цельной (неразбавленной) крови на данном биосенсоре. Показана возможность применения разработанной системы для создания персональных глюкозных тестов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Четвертом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты (Москва, 2008), Симпозиуме «The IIth International and The Iм Sino-Japan Bilateral Symposium on Electroanalytical Chemistry» (Changchun, 2007), Всероссийских конференциях по аналитической химии с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2007, 2009), Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2007, 2010), конференции «Meeting of the Electrochemical Section of the Polish Chemical Society» (Wlodowice, Poland, 2007), Первом Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008), Международных конференциях «Modern Electroanalytical Methods 2009» (Prague, Czechia, 2009) и

«Electrochemistry 2010: From microscopic understanding to global impact» (Bochum, Germany, 2010), Съезде аналитиков России и Школе молодых ученых «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе 5 статей в российских и зарубежных научных журналах и 19 тезисов докладов на всероссийских и международных научных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех основных разделов (литературный обзор, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка цитируемой литературы из 185 ссылок. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, включая 59 рисунков и 15 таблиц.

Список сокращений:

БЛ - берлинская лазурь

КВВ - конденсат выдыхаемого воздуха

ПРЦ - потенциал разомкнутой цепи

ПЭ - пленарный электрод

ПФС - перфторсульфонированный полимер

СУЭ - стеклоуглеродпый электрод

ЦВА - циклическая вольтамперограмма

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, сформулирована цель исследования и показана практическая значимость работы.

Обзор литературы

В главе 1 продемонстрирована важность определения пероксида водорода и дано описание соответствующих электрохимических сенсоров. Глава 2 посвящена структурным и электрокаталитическим свойствам берлинской лазури, а также методам ее синтеза и стабилизации. Показано, что берлинская лазурь является самым эффективным электрокатализатором восстановления пероксида водорода. В главе 3 отражены общие принципы устройства электрохимических биосенсоров, рассмотрены описанные в литературе глюкозные и лактатные биосенсоры.

Экспериментальная часть В главе 4 описаны материалы и методы, использованные в работе. Все электрохимические измерения проводили в трехэлектродной ячейке с разделенным пространством всех электродов. В качестве электрода сравнения

использовали хлорсеребряный электрод в Ш КС1 (х.с.э.), в качестве вспомогательного - стеклоуглеродный электрод большой площади.

Амиерометрическое определение Н202, лактата и глюкозы проводили в проточно-инжекционном режиме в 0.05М фосфатном буфере с 0.1М КС1 (рН 7.0), если не указано иное. Проточно-инжекционная система состояла из перистальтического насоса и инжектора, соединенного с проточной амперометрической ячейкой, в которую монтировали электрод. Измерение проводили при потенциале рабочего электрода 0 мВ (х.с.э.).

Для создания лактатного и глюкозного биосенсоров использовали лактатоксидазу (ЕС 1.1.3.2) из Pediococcus species и глюкозооксидазу (ЕС 1.1.3.4) из Aspergillus niger, соответственно.

Результаты и их обсуждение

Глава 5. Изготовление планарных сенсорных структур методом трафаретной печати. Применяемые в современном анализе электрохимические сенсоры функционируют преимущественно по трехэлектродной схеме, состоящей из рабочего (или индикаторного) электрода, вспомогательного электрода и электрода сравнения.

В работе была предложена схема расположения электродов, представленная на рисунке 1, наилучшим образом удовлетворяющая всем теоретическим требованиям. Изготовление трехэлектродных сенсорных структур, проводили на печатном станке с использованием проводящих и изоляционных паст различных производителей. Оптимизировали тип углеродной и серебряной паст, число наносимых слоев и их толщину, а также тип изолятора (УФ-отверждаемый или на основе растворителя).

Для оценки качества произведенных сенсорных структур проводили изучение их электрохимических характеристик в режиме циклической вольтамперометрии в растворе Kj[Fe(CN)6] и сравнивали с коммерчески доступными электродами DropSens (Испания). За величину отклика принимали плотность тока анодного пика окисления па циклической вольтамперограмме. Сравнение с коммерчески доступными электродами проводили по двум параметрам: по продолжительности диффузионного

I мм

Вспомогательный электрод

(углеродная паста) , Электрод сравнения (серебряная паста) Рабочий электрод (углеродная паста)

Изолятор

Контакты

Рис. 1. Схема расположения электродов трехэлектродной сенсорной структуры.

режима протекания реакции на электроде и по чувствительности и линейному диапазону определяемых концентраций ферроцианида калия.

На рисунке 2 приведены графики зависимостей величины тока пика от скорости развертки потенциала, полученные для разработанных в данной работе и для коммерчески доступных электродов. На обеих зависимостях видны два линейных участка. Начальный участок (до точки перегиба) характеризует диффузионный режим протекания реакции (электрохимический процесс в приэлектродном слое лимитируется диффузией аналита к поверхности электрода). Конечный участок (после точки перегиба) характеризует кинетический режим протекания реакции (электрохимический процесс в приэлектродном слое лимитируется кинетикой реакции). Видно, что для обоих электродов продолжительность диффузионного режима протекания реакции одинакова, а значит, разработанные нами электроды не уступают по данному параметру электродам, произведенным фирмой ОгорБег«.

Настоящая работа ОгорЗепв

ю

ОгорЗепэ Настоящая работа

Б = 5 мА М"'см"2

вцд = 2 мА М см"'

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35

V1'2, (мВ/с)1'2 Рис. 2. Зависимость тока пика от скорости развертки потенциала. К31Ре(СИ)61 0.1 мМ.

012345678

С(К3[Ре(СГд)6]),мМ

Рис. 3. Градуировочные графики определения Конг/ентрация К3[Ре1С1^)6], скорость развертки потенциапа 20 мВ/с.

Вольтамперометрическое определение гексацианоферрата калия проводили при постоянной скорости развертки потенциала 20 мВ/с, концентрацию Кз[Ре(СЫ)6] варьировали в диапазоне от 0.05 до 10 ммоль/л. По тангенсу угла наклона начальных участков градуировочных графиков (рис. 3) определяли чувствительность электродов. Как видно из рисунка, линейные диапазоны определяемых концентраций гексацианоферрата калия для произведенных нами электродов и электродов фирмы ОгорЭепв совпадают, тогда как по чувствительности электроды, произведенные в рамках настоящей работы, существенно превосходят коммерчески доступные (5 мА М"1 см"2 против 2 мА М"1 см"2).

Таким образом, произведенные в рамках настоящей работы сенсорные структуры не только не уступают по своим электрохимическим характеристикам коммерчески доступным электродам, но и превосходят последние по чувствительности к гексациапоферрату калия.

Глава 6. Межфазпый химический синтез берлинской лазури па поверхности электрода. Наиболее распространенные методы модификации электродов берлинской лазурью - это гальваностатический и потенциодинамический (обработка электрода в режиме циклической развертки потенциала) электрохимические методы. Однако, ни один из этих методов не может удовлетворить потребностям массового производства сенсоров. Наличие электрохимической стадии процесса модификации требует использования соответствующего электрохимического оборудования, что делает производство неудобным и трудоемким. Среди существующих методов неэлектрохимического синтеза берлинской лазури наиболее успешной стала модификация печатных (screen-printed) электродов путем выдерживания на их поверхности реакционной смеси, содержащей Fe3+ и Fe(CN)63" ионы [1]. В этом случает электрод выступает в качестве восстановителя образующегося комплекса Fe",[Fe"1(CN)6], что приводит к образованию берлинской лазури. Электрохимические свойства и аналитические характеристики получаемых таким способом сенсоров значительно уступают модифицированным электрохимически. Очевидно, что поиск альтернативного бестокового метода осаждения берлинской лазури является весьма актуальной задачей.

Около 10 лет назад в лаборатории проводящих полимеров Института нефтехимического синтеза имени А.В.Топчиева РАН был разработан метод пограничной полимеризации анилина [2]. Было показано, что при окислительной химической полимеризации анилина в присутствии дополнительно внесенного в реакционную среду субстрата протекают независимо друг от друга два процесса -полимеризация в объеме реакционной среды и полимеризация на границе раздела фаз по поверхности субстрата, где за счет концентрирования реагентов скорость реакции заметно выше. Таким образом, становится возможным осуществлять полимеризацию преимущественно на подложке, в то время как в растворе образуется лишь незначительное количество полимера. Методом пограничной полимеризации удается получать регулярные пленки полимера аналогично тем, какие получают в ходе электрополимеризации, однако, в отличие от последней, метод пограничной полимеризации не требует пи проводимости подложки, ни наложения внешнего потенциала.

Неотъемлемым требованием описанного подхода - концепции пограничной полимеризации - является протекание целевой реакции в объеме реакционной среды, в этом случае граница раздела фаз выступает как область концентрирования реагентов. В настоящей работе, по аналогии с пограничной полимеризацией, в применении для синтеза берлинской лазури будем использовать понятие межфазного синтеза, означающее проведение реакции получения берлинской лазури в присутствии границы раздела фаз.

Синтез БЛ проводили из смеси, содержащей Ре3+ и [Ре'"(СМ)6]3" ионы. Образующийся при смешении солей комплекс является сильным

окислителем (ПРЦ ~ 1 В), поэтому присутствие любых веществ, способных окисляться при таких потенциалах, приведет к осаждению берлинской лазури. Как уже отмечалось выше, использование в качестве восстановителя данного комплекса непосредственно самого электрода не приводит к получению регулярных пленок катализатора, а применение концепции пограничной полимеризации в этом случае невозможно, так как реакция не идет в объеме. Для осуществления протекания реакции в объеме раствора, было решено использовать внешний восстановитель комплекса Реш[Реш(СМ)6]. В качестве последнего нами были использованы некоторые органические соединения, а также пероксид водорода. На поверхность рабочего электрода наносили каплю реакционной смеси, содержащей по 2-4 мМ Ре3+ и [Реш(С1Ч)6]3' в фоновом электролите 0.1М КС1/0.1М НС1. После добавления Н202 (50200 мМ) реакционную смесь выдерживали в течение 2-40 минут.

Разработанный метод межфазного химического синтеза БЛ был применен для модификации планарных печатных электродов. Использование именно таких структур единственно перспективно для массового производства сенсоров в связи с простотой, дешевизной и воспроизводимостью изготовления. Осаждение БЛ на оптимизированные ранее (глава 5) печатные электроды привело к получению пленок электрокатализатора, не уступающих по своим характеристикам синтезируемым электрохимически. Об этом свидетельствуют одинаковые высоты пиков окисления-восстановления БЛ и разница между пиками по оси потенциалов, равная всего 30 мВ, что доказывает высокую регулярность структуры получаемых пленок катализатора (рис. 4). Последняя величина значительно ниже, чем для всех известных способов неэлектрохимической модификации электродов берлинской лазурью (~ 100 мВ).

Таким образом, был успешно разработан метод межфазного химического синтеза берлинской лазури на поверхности электрода, позволяющий получать пленки электрокатализатора такого же регулярного строения, как в случае электросинтеза.

Е, В [Н202], М

Рис. 4. Сравнение ЦВА планарных Рис. 5. Градупровочный график определения

электродов, модифицированных электрохи- Я202 в проточно-инжекционном режиме на

мическим и неэлектрохимическим способами, планарном электроде, модифицированном БЛ

0.1М HCl / О.Ш KCl, скорость развертки методом межфазного химического синтеза,

потенциала 40 мВ/с. Скорость потока 0.65 мл/мин.

Изучение аналитических характеристик полученных планарных пероксидных сенсоров в проточно-инжекционном режиме показало, что линейный диапазон определяемых концентраций Н202 составляет МО"7 - МО"3 М, а чувствительность анализа - 0.4 ± 0.05 А М"1 см"2 (рис. 5).

Таблица 1. Аналитические характеристики электрохимических сенсоров на основе берлинской лазури.

Сенсор Чувствительность, AM"1 см"2 Предел обнаружения, М Линейный диапазон определяемых концентраций Н202, М

СУЭ - э/х синтез БЛ [3] 0.6+0.05 МО"7 1-Ю"7- МО"3

ПЭ - бестоковый синтез БЛ [1] 0.23±0.02 МО"7 МО"7-5-Ю"5

ПЭ - бсстоковый синтез БЛ (настоящая работа) 0.4+0.05 1-Ю"7 1-10'7 -1-10"3

В таблице 1 приведено сравнение аналитических характеристик разработанных планарных сенсоров на пероксид водорода с известными ранее электрохимическими сенсорами на основе берлинской лазури. Видно, что новый метод модификации планарных электродов берлинской лазурью позволяет достичь существенного улучшения аналитических характеристик получаемых сенсоров по сравнению с

И

планарными электродами, модифицированными другими известными способами химического синтеза. По чувствительности определения пероксида водорода разработанные сенсоры лишь немногим уступают торцевым электродам, модифицированным БЛ электрохимически, имея при этом существенные преимущества по остальным параметрам: простота и дешевизна в изготовлении и использовании.

Глава 7. Стабилизация сенсоров на основе берлинской лазури. Известно, что берлинский белый - восстановленная форма БЛ, образующаяся в ходе катализа, -термодинамически нестабилен, кроме того, продукт восстановления Н202 -гидроксил-ионы - растворяют берлинскую лазурь. Среди известных способов стабилизации можно выделить два основных подхода: включение электрокатализатора в матрицу проводящего полимера и защита полимерами различной природы.

Для включения берлинской лазури в матрицу полимера проводили ее совместный синтез с соответствующим мономером. Было изучено стабилизирующее действие анилина, ортофенилендиамина, пиррола и его производных (таблица 2). Синтез проводили аналогично получению берлинской лазури с пероксидом водорода с той лишь разницей, что комплекс железа Ре"'[Реш(СГ*Гу в этом случае восстанавливали органическим соединением (концентрация 1-20 мМ), вызывая тем самым окислительную полимеризацию последнего.

Исследования показали, что совместный синтез БЛ со всеми используемыми полимерами позволяет получать пленки электрокатализатора такого же регулярного строения, как в случае электросинтеза (на рис. 6 в качестве примера приведена ДВА электрода, модифицированного БЛ, синтезированной совместно с полианилином). Более того, при одинаковом большом количестве осаждаемой БЛ (ГБл ~ Ю нмоль/см2) пленка, полученная методом межфазного химического синтеза, обладает даже более регулярной структурой (ДЕ == 30 мВ), чем в случае электрохимического синтеза (ДЕ к 60 мВ) (рис. 6).

Оценку операционной стабильности сенсоров на основе БЛ, синтезированной с полимерами, проводили в жестких условиях постоянного потока пероксида водорода с высокой концентрацией. Было показано, что сенсор на основе БЛ, синтезированной совместно с полианилином, демонстрирует стабильный отклик на протяжении не менее 40 мин, в то время как нестабилизированная берлинская лазурь теряет половину активности за это время (рис.7).

Е, В Время, мин

Рис. 6. ЦВЛ планарных электродов. Рис. 7. Ток восстановления перокснда

модифицированных БЛ. Гщ = 10 нмоль/см2; водорода на планарных электродах, модифици-

0.1 М HCl / 0.1 М КС!, скорость развертки рованных БЛ, при постоянном потоке 0.1 мМ

потенциала 40 мВ/с. Н2О2, pH 6.0, скорость потока 0.65 мл/мин.

Успешный синтез БЛ с полианилином и полипирролом, позволивший получить высокостабильные сенсоры на Н2О2, обусловил решение проанализировать влияние заместителя в исходных органических мономерах на стабильность и чувствительность модифицированных электродов. В качестве чувствительности в этом случае оценивали величину отклика на 0.1 мМ Н202, стабильность оценивали по времени абсолютной стабильности отклика с точностью до 5%. В таблице 2 представлены основные результаты проведенных экспериментов.

Исследованные соединения можно разделить на две группы. Мономеры 2, 3 и 4 характеризуются откликом соответствующего сенсора в диапазоне 53-58 мкА/см2, в то время как остальные - более высоким: между 60 и 80 мкА/см2. Этот факт может быть связан с гидрофобностью полимерной органической пленки, препятствующей взаимодействию Н202 с активными центрами берлинской лазури. Так, сенсоры, изготовленные с использованием заряженных полимеров 5 и 8 (образующих пленку с гидрофильными свойствами), демонстрируют самую высокую чувствительность - 71 и 80 мкА/см2. По этой же причине такие сенсоры обладают наихудшей стабильностью - 15 и 13 мин для полимеров 5 и 8, соответственно, объясняющейся высокой проницаемостью гидрофильной пленки для Н202. Видно, что пленки более гидрофобного характера (2, 3, 4) приводят к лучшей операционной стабильности получаемого сенсора - 23-32 мин.

Полученные данные свидетельствуют о том, что модификация электрода БЛ, синтезированной совместно с полианилином, приводит к получению наиболее стабильного (операционная стабильность составляет не менее 40 мин) и при этом высокочувствительного (токовый отклик на 0.1 мМ Н202 64 мкА/см2) сенсорного

13

покрытия. Чувствительность такого сенсора, определенная в проточно-инжекционном режиме, составляет 0.55+0.05 АМ"'см"2, а линейный диапазон определяемых концентраций Н202 - 4 порядка (1-Ю"7 - 1-Ю'3 М), что не хуже чем для стеклоуглеродного электрода, электрохимически модифицированного БЛ (таблица 3).

Таблица. 2. Стабильность и чувствительность сенсоров на основе пленок БЛ, синтезированной с различными полимерами.

Стабилизирующий агент 1н202. мкА/см2 Стаб., мин Стабилизирующий агент 1н202. мкА/см2 Стаб., мин

1 О 68+2 19+3 5 С2н, 1 К-|СИ,)г^Сй с,н5 80±6 15+2

2 (СН,), 1—соон 57±2 23±3 6 64+6 40+5

3 {^\-(СН2)4 —соон 53+2 32±4 7 0-кн2 68+6 12+2

4 [^\-(сн2)6— г/^ 58±2 25±4 8 НЙОз 71+4 13±2

Электрохимический синтез 60±2 6+2

Таким образом, модификация планарных электродов БЛ, полученной методом межфазного синтеза совместно с проводящими полимерами, позволяет создавать сенсоры для определения пероксида водорода, не уступающие по аналитическим характеристикам торцевым стеклоуглеродным электродам, модифицированным электрохимически. При этом операционная стабильность таких сенсоров значительно выше - датчик не инактивируется при постоянном потоке 0.1 мМ Нг02 минимум в течение 40 мин, в то время как нестабилизированная берлинская лазурь теряет половину активности за это время.

Послойное осаждение берлинской лазури и гексацианоферрата никеля. Среди стабилизаторов берлинской лазури огромный интерес представляют неорганические

поликристаллы, поскольку использование органических полимеров (как в случае их электрополимеризации на поверхности катализатора) не приводит к удовлетворительным результатам, так как не позволяет достичь долговременной стабильности при хранении из-за деградации полимера и нарушения его структуры в ходе высыхания-набухания. Неорганические соединения, такие как, например, гексацианоферраты переходных металлов, лишены указанного недостатка. Как наиболее близкий по строению БЛ, так и известный своей высокой механической стабильностью, нами был выбран гексацианоферрат никеля. Для стабилизации сенсоров было предложено послойное осаждение на электрод обоих цианоферратов, где в качестве основного чувствительного элемента выступает БЛ, а в качестве стабилизирующего буферного слоя - гексацианоферрат никеля. Получение обеих пленок проводили методом межфазного химического синтеза. Осаждение гексацианоферрата никеля осуществляли из реакционной смеси, содержащей по 0.51 мМ №С12 и К3[Ре(С1^)6] в фоновом электролите 0.5М КС1/0.1М НС1. Реакционную смесь выдерживали на электроде в течение 30 минут.

Для поиска оптимальных условий получения высокостабильного и в то же время высокочувствительного сенсора на Н202 варьировали толщину осаждаемого слоя БЛ (0.2 - 4 нмоль/см2) и число пар каталитического и буферного слоев (1 - 3). Толщину буферного слоя оставляли постоянной. Оптимизацию условий получения сенсора на основе БЛ, стабилизированной гексацианоферратом никеля, проводили на планарных печатных электродах. Для выбора оптимальных условий оценивали чувствительность и операционную стабильность сенсоров. Для этого проводили непрерывную регистрацию пероксида водорода с концентрацией 1мМ, которая в 10 раз выше, чем использовали для оценки стабильности сенсоров на основе чистой БЛ и синтезированной совместно с органическими полимерами. В ходе эксперимента фиксировали величину тока восстановления Н202 и остаточную активность сенсора через 1 час.

Было показано, что наилучшими характеристиками обладают сенсоры на основе двух пар каталитического и буферного слоев, так как осаждение одной пары гексацианоферратов приводит к получению электродов с невысокой чувствительностью, а трех пар - к существенному росту фонового тока, снижающего селективность сенсора.

На рисунке 8 приведен график зависимости чувствительности и стабильности сенсоров на основе двух пар чередующихся слоев БЛ и гексацианоферрата никеля от толщины слоя БЛ. Как видно из графика, оба параметра меняются асинхронно, и

можно выделить их оптимальное соотношение в районе Г ~ 3 нмоль/см2, где стабильность сенсора еще не существенно упала 95 % отклика через 1 час), а величина отклика на пероксид водорода максимальна (0.3 А М"1 см"2).

На рисунке 9 приведена зависимость тока в присутствии 1 мМ Н2О2 (концентрация в 10 раз выше аналогичной величины, используемой для оценки стабильности других пероксидных сенсоров) от времени для электродов, модифицированных только пленкой БЛ и двумя парами слоев БЛ/гексацианоферрат никеля. Из рисунка видно, что для пленки БЛ, стабилизированной гексацианоферратом никеля, отклик стабилен в течение 50 минут, в то время как в случае нестабилизированной БЛ за 20 минут теряется половина его начальной величины.

$ -0,25

-0,3

-0,4

1,0 1,5 2,0 2,5 30 3,5 4,0

10

50

60

Рис. 8.

'гег

Зависимость

остаточной

активности ¡гитарных сенсоров и величины отклика на 1 мМ Н2О2 от количества осажденной БЛ. Две пары каталитического и буферного слоев.

20 30 40 Время, мин Рис. 9. Зависимость тока восстановлении

1 мМ Н2О2 от времени на планарных электродах, модифгщированных стабилизированной гексацианоферратом никеля (1) и нестбилизированной (2) пленкой БЛ.

Из участков амперометрических кривых, где начинается снижение токового отклика, как тангенсы углов наклона в полулогарифмических координатах были рассчитаны константы инактивации (к^) соответствующих сенсоров. Было показано, что для БЛ, стабилизированной гексацианоферратом никеля, даже на участке инактивации сенсора к!п составляет (7±0.5)-10"4 мин"1, что на два порядка ниже, чем для нестабилизированной берлинской лазури - (6±0.5)-10"2 мин"1.

В завершение главы в таблице 3 приведены аналитические характеристики сенсоров на основе БЛ, стабилизированной различными способами, разработанными в настоящей работе. Стабильность определена как время сохранения отклика при

постоянном потоке 0.1 мМ или 1 мМ (в случае БЛ, стабилизированной гексацианоферратом никеля) Н202. Чувствительность определена как тангенс угла наклона градуировочного графика, полученного в проточно-инжекциопном режиме.

Таким образом, были разработаны неэлектрохимические методы стабилизации берлинской лазури, позволяющие создавать стабильные и при этом высокочувствительные сенсоры для определения пероксида водорода. Путем послойного синтеза берлинской лазури и гексацианоферрата никеля на поверхности планарного электрода получен наиболее стабильный сенсор, демонстрирующий неизменный сигнал в присутствии 1 мМ Н202 в течение 50 минут.

Таблица 3, Аналитические характеристики разработанных электрохимических сенсоров Оли определения Н2С>2.

Сенсор Чувствительность, АМ-'см"2 Линейный диапазон, М Стабильность, мин (конц. Н202 0.1 мМ)

СУЭ+БЛ э/х синтез 0.6±0.05 МО-'-ью--' 6±2

ПЭ+БЛ 0.4±0.05 МО-' - МО-3 5+2

ПЭ+БЛ/полианшшн 0.55+0.05 МО"7-МО"3 40+5

ПЭ+БЛ/ПФС 0.3+0.03 МО'6- МО"3 45+5

ПЭ+БЛ/гексацианоферрат никеля О.З+О.ОЗ МО"7- МО-3 50+5 (конц. Н2О2 1 мМ)

Глава 8. Анализ реальных объектов при помощи разработанных сенсоров на Н202. Применимость разработанных высокостабильных и чувствительных сенсоров была продемонстрирована на определении пероксида водорода в реальных биологических объектах и пищевых продуктах.

Анализ образцов конденсата выдыхаемого воздуха является ценным неинвазивным методом для диагностики и оценки степени тяжести различных легочных заболеваний. Был проведен анализ образцов, отобранных у здоровых (12 образцов) и больных бронхиальной астмой (9 образцов) людей. Определение пероксида водорода проводили в проточно-инжекционном режиме на планарпых электродах, модифицированных БЛ, синтезированной совместно с полианилином, как обладающих самой высокой чувствительностью по сравнению с другими разработанными в настоящей работе сенсорами (см. таблицу 3). В качестве

референсного метода применяли флуориметрическое определение с использованием пероксидазы хрена.

В таблице 4 представлены полученные результаты. Видно, что концентрация пероксида водорода, найденная в КВВ больных астмой пациентов, достоверно превосходит аналогичную величину для здоровых людей, а значит данный метод может быть использован для скрининга легочных заболеваний.

Таблица 4. Концентрация пероксида водорода в КВВ здоровых и больных бронхиальной астмой людей.

Концентрация Н202, мкМ

Пациенты Электрохимический Флуориметрическое

сенсор определение

Здоровые 2.0 ± 0.4 1.6 + 0.5

Больные бронхиальной астмой 4.5+1 4.0 + 0.7

Определение общей антиоксидантной активности пищевых продуктов. Еще одним примером применения разработанных пероксидных сенсоров для анализа реальных объектов служит изучение кинетики деградации пероксида водорода в присутствии пищевых продуктов, потенциально обладающих антиоксидантной активностью. В качестве исследуемых объектов были выбраны сухие соки сублимационной сушки, предоставленные научно-исследовательской лабораторией адаптационной медицины (Факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломопосова), и коммерчески доступные соки, приобретенные в розничных сетях. Для этого сенсор на основе БЛ, покрытой мембраной ПФС, помещали в раствор исследуемого объекта, затем добавляли пероксид водорода и следили за изменением его концентрации во времени. Разложение Н202 соответствовало кинетике псевдопервого порядка. Из тангенса угла наклона получаемых прямых определяли кинетическую константу к. Более высокая кинетическая константа свидетельствует о большей антиоксидантной силе исследуемого образца. Полученные данные представлены в таблице 5.

Соки сублимационной сушки были проанализированы на наличие антиоксидантной активности стандартным методом, основанным на регистрации продуктов перекисного окисления липидов (измерения проводились коллегами из лаборатории адаптационной медицины Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова). Полученные результаты можно представить в виде сравнительного ряда: бадан = клюква > свекла > облепиха > морковь, где экстракт бадана обладает наибольшей антиоксидантной активностью, а экстракт моркови

наименьшей. Сравнивая этот ряд с данными кинетического подхода (таблица 5), можно сказать, что за исключением экстракта клюквы, оба метода показали одинаковые результаты по сравнительной оценке общей антиоксидантной активности исследованных пищевых продуктов. Этот факт подтверждает возможность использования разработанного кинетического подхода для качественной оценки общей антиоксидантной активности.

Таблица 5. Анпшоксидантная активность соков сублимационной сутки и фруктовых соков российского производства.

Экстракты Соки

Образец kx 10'3, с"1 Образец к х 10'3, с1

Экстракт облепихи 2.2+0.3 Сок апельсиновый, Rich 1.2+0.3

Экстракт бадана 5.0+0.5 Сок апельсиновый, Добрый 0.4+0.1

Экстракт свеклы 2.1+0.4 Сок виноградный, Rich 1.7+0.2

Экстракт клюквы <0.01 Сок грейпфрутовьш, Rich 2.0±0.3

Экстракт моркови <0.01 Сок грейпфрутовый свежевыжатый 4.0+0.3

Таким образом, показан еще один пример (наряду с анализом конденсата выдыхаемого воздуха) применения разработанных сенсоров для определения пероксида водорода в реальных объектах.

Глава 9. Биосенсоры па основе разработанных сенсоров па Н202.

На основе планарных пероксидных сенсоров, модифицированных БЛ методом межфазного химического синтеза, путем иммобилизации фермента лактатоксидазы в гель у-аминопропилтриэтоксисилоксана из водно-органической среды с высоким содержанием органического растворителя был создан биосенсор для определения лактата. Определение лактата в модельных растворах в проточно-инжекционном режиме показало, что линейный диапазон определяемых концентраций составляет от 5-10'7М до 1-10"3М, чувствительность - 0.18 ± 0.05 AM'1 см'2. Для сравнения чувствительность коммерчески доступного электрохимического анализатора Biosen C_Line ниже на два порядка величины.

Такая высокая чувствительность и широкий рабочий диапазон разработанных биосенсоров позволяют использовать их в методах неинвазивного анализа. Был проведен анализ образцов потовых проб профессиональных спортсменов, отобранных до и после мышечной нагрузки. Проанализировано 8 образцов пота, отобранных у 4 спортсменов. В проточно-инжскционпую систему инжектировали образцы, разбавленные фосфатным буфером в 1000 раз, и фиксировали токовый отклик

19

(рис. 10). Концентрации лактата определяли по заранее построенному градуировочному графику. Показано достоверное увеличение концентрации лактата в поте спортсменов после физической нагрузки от 3 до 4 раз.

Для создания биосенсора на глюкозу на поверхности разработанных пероксидных сенсоров была иммобилизована глюкозооксидаза. Иммобилизацию проводили из смеси с высоким содержанием органического растворителя в мембране ПФС по методу [4]. Чувствительность сенсора в проточно-инжекционном режиме составила 25 + 5 мАМ"1см"\ линейный диапазон определяемых концентраций глюкозы-от МО'6 до М0"3М.

0,4. 0.3 0,2

0,0

1-10"

пот после нагрузки

5'10

и-

1-10'-|. |

шш

•5; I

пот до нагрузки

'I в 5II .Л и'Л

г !

\ II и и

5600

2000 2400 2800 5200

Время, с

Рис. 10. Амперометрическпе отклики на инжею/ни модельных растворов лактата и разбавленного пота в проточно-инжекционном режиме.

ш ю

5 О г с

И 6

о

5 2

а с

0

0 2 4 6 8 10 [Глюкоза], мМ / глюкозный биосенсор

Рис. 11. Амперометрическое определение глюкозы в крови в проточно-инжекционном режиме. Сравнение результатов со стандартным методом.

Полученный биосенсор был применен для анализа образцов венозной крови, отобранной у профессиональных спортсменов. В проточно-инжекционную систему инжектировали образцы крови, разбавленные фосфатным буфером в 50 раз. Сравнение полученных данных со стандартным методом - коммерчески доступным глюкозно-лактатным анализатором «ВюБеп С_1лпе» (Германия) - представлено на рисунке 11. Как видно из графика, данные достаточно хорошо коррелируют друг с другом, что свидетельствует о возможности применения разработанного глюкозного биосенсора для анализа такого сложного биологического объекта, как кровь.

С целью создания глюкозного биосенсора, пригодного для анализа цельной крови без разбавления, необходимо увеличить верхний предел определяемых концентраций глюкозы, так как ее содержание в крови лежит в диапазоне от единиц до десятков ммоль/л. Реализовать это становится возможным путем увеличения

диффузионных затруднений доставки субстрата к чувствительному элементу биосенсора. Для этого было предложено повысить концентрацию ПФС в ферментсодержащей мембране. Было показано, что верхний предел 20 мМ глюкозы при максимальной чувствительности сенсора достигается при содержании ПФС в мембране 2%.

Для уменьшения объема пробы, требующейся для анализа, а также для упрощения процедуры определения глюкозы, на поверхности биосснсора была разработана тонкослойная ячейка, предназначенная для доставки анализируемой жидкости на чувствительный элемент сенсора и представляющая собой резервуар объемом = 1 мкл (рис. 12). Всасывание анализируемой жидкости обеспечивали смачиванием стенки ячейки раствором ПАВ Тритон Х-100 в изопропаноле (от 0.005 до 0.2 об.%).

Аналитические характеристики глюкозных биосенсоров с тонкослойной ячейкой изучали путем всасывания в ячейку модельных растворов глюкозы в фосфатном буфере (0.15М NaCl, 0.05М КН2Р04, рН 7.0), с концентрациями в диапазоне 1 - 20 мМ. Для каждой концентрации использовали отдельный биосенсор. За величину отклика принимали величину стационарного тока, устанавливающегося через 10 с после наложения рабочего потенциала 0 мВ (х.с.э.) (рис.13). По результатам анализа строили калибровочную кривую. По тангенсу угла наклона градуировочного графика оценивали чувствительность анализа, которая в оптимальных условиях составила 7.5 ± 0.5 мА М"1 см"2.

вспомогательный | электрод

рабочий

электрод 1

электрод 1

сравнения |

полимерная ; подложка ........

i« h

и

I (

U:

Ф

» 2

г 2 g. 1'

< -г 2 — -3

-5

буфер

5 мМ

/ Í/ " ÑHiM"

1 // jf ^___----

20 мМ

/ — цельная кровь

30

Рис. 12. Строение трехэлектродной сенсорной структуры с интегрированной тонкослойной ячейкой.

10 20 Время, с

Рис. 13. Амперометрическое определение глюкозы на глюкозном бгюсенсоре в цельной крови. Рабочий потенциал ОмВ.

Разработанная методика экспрессного определения глюкозы в цельной крови была апробирована на 5 образцах венозной крови, отобранной у профессиональных спортсменов и пациентов НИИ пульмонологии. Полученные данные сравнивали с результатами проточно-инжекционного анализа (таблица 5), показавшего хорошую корреляцию со стандартным методом (рис. 11).

Из таблицы видно, что разработанные глюкозные тест-системы на основе биосенсора с интегрированной тонкослойной ячейкой позволяют адекватно анализировать цельную кровь, а значит, обладают большим потенциалом для применения как в клиническом анализе, так и во все более актуальной в последнее время персонифицированной медицине.

Таблица 5. Концентрация глюкозы в крови, найденная с помощью глюкозных биосенсоров с интегрированной тонкослойной ячейкой (объем цельной крови 1 мкл) и глюкозных биосенсоров в проточно-инжекционной системе.

Концентрация глюкозы в крови, мМ (экспресс-анализ) Концентрация глюкозы в крови, мМ (проточно-иижекционный анализ)

4.8±0.6 4.0+0.3

5.1+0.5 4.5±0.4

3.0+0.4 2.5+0.3

5.2+0.5 4.0+0.5

3.8±0.6 3.6+0.4

Таким образом, на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью, путем иммобилизации глюкозооксидазы на поверхности электрокатализатора, разработан глюкозный биосенсор, пригодный для анализа цельной крови. Линейный диапазон определяемых концентраций на данном биосенсоре составляет от 1 до 20 мМ глюкозы, чувствительность анализа -7.5 мАМ"'см"2. Разработаны методы изготовления тонкослойной ячейки на поверхности биосенсора и всасывания жидкости в данную ячейку. Показана применимость разработанной системы для анализа малых (1 мкл) объемов цельной крови в амперометрическом режиме.

Список цитируемой литературы

1. F. Ricci, A. Amine, G. Palleschi. //Biosensors &Bioelectronics. 2003. V.18. P.165.

2. A.B. Орлов, С.Г. Киселева, et al. // Высокомолекулярные соединения А. 2000. V.42. Р.2023.

3. A.A. Karyakin, Е.Е. Karyakina. // Sensors and Actuators В: Chemical. 1999. V.57(l-3). P.268.

4. A.A. Karyakin, E.A. Kotel'nikova, et al. // Analytical Chemistry. 2002. V.74(7). P.1597.

Выводы

1. Методом трафаретной печати созданы планарные трехэлектродные основы для (био)сенсоров. Электрохимические свойства данных структур по диапазону соответствия теоретической зависимости величины тока от скорости развертки потенциала не уступают коммерчески доступным аналогам, а по чувствительности к ферроцианиду в 2.5 раза превосходят последние.

2. Разработан метод межфазного бестокового синтеза берлинской лазури на поверхности электрода, позволяющий получать сенсоры на пероксид водорода, не уступающие ни по аналитическим, ни по электрохимическим свойствам электродам, модифицированным электрохимическим осаждением. Линейный диапазон определяемых концентраций Н202 в проточно-инжекционном режиме составляет 1-Ю"7 - 1-Ю"3 М, чувствительность анализа - 0.4 А М'1 см"2.

3. Предложены бестоковые методы стабилизации пероксидных сенсоров с использованием проводящих полимеров, полиэлектролитов и гексацианоферратов переходных металлов. Путем послойного синтеза берлинской лазури и гексацианоферрата никеля на поверхности планарного электрода получен высокостабильный сенсор, демонстрирующий неизменный сигнал в жестких условиях непрерывной регистрации 1 мМ пероксида водорода в течение 50 минут.

4. Показана применимость предложенных сенсоров на пероксид водорода в клинической диагностике для анализа конденсата выдыхаемого воздуха, в контроле качества пищевых продуктов для исследования антиоксидантной активности по регистрации кинетики разложения пероксида водорода, а также для создания биосенсоров на лактат и глюкозу.

5. Создан глюкозный биосенсор, рабочий диапазон которого составляет от 1 до 20 мМ глюкозы. Биосенсор адаптирован к работе в тонкослойной ячейке и применен для определения концентрации глюкозы в малом объеме (1 мкл) цельной крови; время анализа составило 10 с.

Публикации по теме диссертации

1. Yashina E.I., Borisova A.V.. Karyakina Е.Е., Shchegolikhina О.I., Vagin M.Y., Sakharov D.A., Tonevitsky A.G., Karyakin A.A. Sol-gel immobilization of lactate oxidase from organic solvent: towards the advanced lactate biosensor. Analytical Chemistry. 2010. V.82. PP. 1601-1604.

2. Anaev E.K., Apyari V.V., Puganova E.A., Borisova A.V.. Dmitriyenko S.G., Karyakina E.E., Vagin M.Y., Zolotov Y.A., Chuchalin A.G., Karyakin A.A. Pulmonary Oxidative Status in Norma and Pathologies on the Basis of Analysis of Exhaled Breath Condensate. American Journal of Biomedical Sciences. 2010. V.2(4). PP.365-372.

3. Корнеева Л. X., Борисова А.В.. Яшина Е.И., Карякина Е.Е., Воронин О.Г., Косниер С., Карякин А.А. Использование метода электрохимической полимеризации N-замещенных производных пиррола для разработки нового биосенсора на лактат. Вестник Московского Университета серия «Химия». 2010. №1. СС.62-70.

4. Karyakina Е.Е., Vokhmyanina D.V., Sizova N.V., Sabitov A.N., Borisova A.V.. Sazontova T.G., Arkhipenko Y.V., Tkachuk V.A., Zolotov Y.A., Karyakin A.A. Kinetic approach for evaluation of total antioxidant activity. Talanta. 2009. V.80. PP.749-753.

5. Borisova A.V.. Karyakina E.E., Cosnier S., Karyakin A.A. Current-Free Deposition of Prussian Blue with Organic Polymers: Towards Improved Stability and Mass Production of the Advanced Hydrogen Peroxide Transducer. Electroanalysis. 2009. V.21. PP.409-414.

6. Борисова А.В.. Трашин С.А., Карякина E.E., Карякин A.A. Планарные сенсоры для определения пероксида водорода на основе наноразмерных покрытий Берлинской лазури. Четвертый международный московский конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007, Москва, Россия. Материалы конгресса. 4.2. С.265.

7. Борисова А.В., Карякин А.А. Планарные сенсоры для определения пероксида водорода на основе наноразмерных покрытий Берлинской лазури. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007», 11 -14 апреля 2007 г., Москва, Россия. Материалы докладов на CD.

8. Karyakina Е. Е., Borisova A.V., Yashina E.I., Bolshakov I.A., Karyakin A.A. Food and Clinical Analysis. The 11th International and The 1st Sino-Japan Bilateral Symposium on Electroanalytical Chemistry, August 2007, Changchun, China. Program and Extended Abstracts. P. 182.

9. Борисова А.В., Трашин C.A., Карякина E.E., Карякин А.А. Разработка планарных сенсоров на основе наноразмерных покрытий Берлинской лазури для определения пероксида водорода. II Всероссийская конференция по аналитической химии с международным участием «Аналитика России 2007», 7-12 октября 2007 г, Краснодар, Россия. Материалы конференции. С.250.

10. Borisova A.V.. Chuchalin A.G., Anaev Е.Н., Karyakin A.A. Synthesis of electroactive films of Prussian Blue: improvement of selectivity and stability of the advanced H202 transducer. XVI international Meeting of the Electrochemical Section of the Polish Chemical Society - 3rd International Workshop, November 2007, Wlodowice, Poland. Book of Abstracts. P.13.

11. Большаков И.А., Борисова A.B.. Вагин М.Ю., Воронин О.Г., Вавилова H.A., Карякин A.A., Карякина Е.Е., Морозов C.B., Трашпн С.А., Яшина Е.И. Биокаталнтнческпе системы для создаиия бносенсорных технологий. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы», 6-7 декабря 2007 г., Москва, Россия. Сборник тезисов. С.224.

12. Борисова A.B., Яшина Е.И., Карякина Е.Е., Карякин A.A. Разработка экспресс-методов оределения пероксида водорода, глюкозы и лактозы с помощью электрохимических биосенсоров на основе Берлинской лазури для оценки качества пищевых продуктов. Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», 11-13 марта 2008 г., Москва, Россия. Материалы конференции. С.377.

13. Яшина Е.И., Борисова A.B. Биологические сенсоры для определения лактата па основе планарных электродов, модифицированных Берлинской лазурыо. II Научно-практическая конференция «Перспективы развития инноваций в биологии», 5-7 ноября 2008 г., Москва, Россия. Материалы конференции. С. 128.

14. Борисова A.B.. Карякин A.A. Новый метод синтеза напоразмерного электрокатализатора на основе Берлинской лазури для создания высокоэффективного сенсора на перокенд водорода. Применение для неинвазивной диагностики. Международный форум по нанотехнологиям, 3-5 декабря 2008г., Москва, Россия. Сборник тезисов докладов участников Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнолопш. С.567.

15. Яшина Е.И., Борисова A.B.. Большаков И.А., Корнеева Л.Х., Вагин М.Ю., Карякина Е.Е. Новый высокоэффективный лактатный биосенсор на основе комбинации новых методов иммобилизации биокатализатора (лактатоксидазы) и синтеза электрокатализатора (Берлинской лазури). Итоговая конференция по результатам выполнення мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы», 8-10 декабря 2008 г., Москва, Россия. Сборник тезисов. С. 153.

16. Борисова A.B., Вавилова H.A., Карякин A.A. Планарные сенсоры на основе Берлинской лазури, стабилизированной гексацианоферратом никеля, для определения пероксида водорода. III Всероссийская конференция по аналитической химии с международным участием «Аналитика России 2009», 29 сентября - 3 октября 2009 г, Краснодар, Россия. Материалы конференции. С.273.

17. Борисова A.B.. Карякин A.A. Планарные структуры для электрохимических измерений и сенсоры для определения пероксида водорода. Выставка инновационных проектов, 24 ноября 2009 г., Москва, Россия. Сборник тезисов. С.68.

18. Борисова A.B.. Большаков И. А., Вохмянина Д. А., Вагин М.Ю., Воронин О,Г., Дейко Д.А., Корнеева Л.Х., Карякина Е.Е., Лухнович A.B., Ситникова (Вавилова) H.A., Секретарева А.Н., Троценко В.А., Чуланова Т.О., Федотова О.С., Яшина Е.И. Разработка методов получения электрохимических сенсоров для индивидуальной диагностики уровня глюкозы в крови. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы», 25-27 ноября 2009 г., Москва, Россия. Сборник тезисов. С. 133.

19. Большаков И.А., Борисова А.В.. Вагин М.Ю., Карякина Е.Е., Карякин А.А., Лухнович А.В., Ситникова Н.А.. Федотова О.С., Яшина Е.И. Высокоэффективный биосенсор для неинвазивной оценки стрессовых состояний человека. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы», 25-27 ноября 2009 г., Москва, Россия. Сборник тезисов. С. 178.

20. Borisova A.V., Sitnikova N.A., Karyakin А.А. High-stable planar sensors for hydrogen peroxide detection based on Prussian Blue stabilized with nickel cyanoferrate. The International Conference "Modern Eleciroanalytical Methods 2009", December 9-13, Prague. Book of Abstracts. P. 260.

21. Yashina E. I., Borisova A.V., Karyakina E.E., Vagin M.Y., Karyakin A.A., Sakharov D.A., Tonevitsky A.G. Prussian Blue based planar boisensor for lactate determination in blood and sweat. The International Conference "Modern Eleciroanalytical Methods 2009", December 9-13, Prague. Book of Abstracts. P.281.

22. Борисова А.В. Планарные электрохимические сенсоры на основе берлинской лазури, стабилизированной гексацианоферратом никеля, для определения пероксида водорода и создания биологических сенсоров. Международный научный форум «Ломоносов - 2010», 12 -15 апреля 2010 г., Москва, Россия. Материалы докладов на CD.

23. Борисова А.В., Карякин А.А. Планарные электрохимические сенсоры на основе берлинской лазури, стабилизированной гексацианоферратом никеля, для определения пероксида водорода и создания биологических сенсоров. Съезд аналитиков России и Школа молодых ученых «Аналитическая химия - новые методы и возможности», 26-30 апреля 2010 г., Москва (пансионат «Клязьма»), Россия. Сборник тезисов. С.49.

24. Borisova A.. Sitnikova N., Karyakin A. Current-Free Deposition of Transition Metal Hexacyanoferrates for Chemical Sensors and Biosensors. The International Conference "Electrochemistry 2010: From microscopic understanding to global impact", September 13-15, 2010, Ruhr-Universitat Bochum, Germany. Book of Abstracts. P.223.

Заказ № 191-i/02/2011 Подписано в печать 24.02.2011 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Сенсоры для определения пероксида водорода.

1.1. Пероксид водорода как важный объект современного анализа

1.2. Электрохимические сенсоры для определения пероксида водорода

1.2.1. Платиновые электроды.

1.2.2. Электроды, модифицированные металлоорганическими медиаторами и оксидами переходных металлов.

1.2.3. Биосенсоры на основе пероксидаз и каталазы.

1.2.4. Электроды, модифицированные гексацианоферратами переходных металлов.

Глава 2. Гексацианоферрат железа как высокоэффективный электрокатализатор восстановления пероксида водорода.

2.1. Кристаллическая структура и электроактивность берлинской лазури

2.2. Электрокаталитические свойства берлинской лазури

2.3. Методы синтеза пленок берлинской лазури на поверхности электрода

2.3.1. Электрохимические методы синтеза.

2.3.2. Химические методы синтеза.

2.4. Стабилизация гексацианоферратов переходных металлов

2.4.1. Нанесение на катализатор неэлектроактивных покрытий.

2.4.2. Включение катализатора в матрицу полимера.

Глава 3. Электрохимические биосенсоры.

3.1. Биосенсоры первого поколения

3.1.1. Глюкозный биосенсор.

3.1.2. Лактатный биосенсор.

3.2. Биосенсоры второго поколения

3.2.1. Глюкозный биосенсор.

3.2.2. Персональные глюкометры.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Материалы

4.2. Оборудование

4.3. Методы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. Изготовление планарных сенсорных структур методом трафаретной печати

5.1. Дизайн сенсорных структур

5.2. Выбор оптимальных условий производства и материалов

5.3. Сравнение с коммерчески доступными электродами

Глава 6. Межфазный химический синтез берлинской лазури на поверхности электрода

6.1. Межфазный синтез берлинской лазури из смеси солей Fe2+ и Fe3+

6.2. Межфазный синтез берлинской лазури путем восстановления комплекса Feni[Feni(CN)6]

6.3. Аналитические характеристики сенсоров

Глава 7. Стабилизация сенсоров на основе берлинской лазури.

7.1. Операционная стабильность сенсоров на основе берлинской лазури

7.2. Стабилизация полиэлектролитной мембраной

7.3. Стабилизация путем совместного осаждения берлинской лазури с органическими полимерами

7.3.1. Электрохимические характеристики сенсоров.

7.3.2. Аналитические характеристики и операционная стабильность сенсоров.

7.4. Стабилизация гексацианоферратом никеля

7.4.1. Межфазный химический синтез гексацианоферрата никеля на поверхности электрода.

7.4.2. Послойное осаждение берлинской лазури и гексацианоферрата никеля.

7.4.3. Аналитические характеристики и операционная стабильность сенсоров.

Глава 8. Анализ реальных объектов при помощи разработанных сенсоров на Н202.

8.1. Анализ образцов конденсата выдыхаемого воздуха

8.2. Определение общей антиоксидантной активности пищевых продуктов

Глава 9. Биосенсоры на основе разработанных сенсоров на Н202.

9.1. Биосенсор для определения лактата

9.2. Биосенсор для определения глюкозы

9.2.1. Определение глюкозы в крови в проточно-инжекционном режиме.

9.2.2. Определение глюкозы в капле на поверхности биосенсора.

9.2.3. Глюкозные сенсоры для определения глюкозы в малых объемах цельной крови.

ВЫВОДЫ.

Требования современного анализа, - это чувствительность, избирательность, дешевизна, простота и экспрессность. Электрохимические методы, как нельзя лучше удовлетворяют указанным требованиям. По сравнению с другими аналитическими методами (спектрофотометрия, флуориметрия, люминесцентные методы) они просты и удобны в применении, не требуют пробоподготовки, а также позволяют осуществлять непрерывный мониторинг анализируемого вещества. Все эти преимущества позволяют отдавать предпочтение электрохимическим сенсорам в клинической диагностике, пищевой промышленности и контроле состояния окружающей среды.

С 80-х годов XX века для» изготовления электрохимических сенсоров используют трафаретную' печать. Этот дешевый и простой^ в исполнении метод обеспечивает простоту массового производства, низкую стоимость и высокую воспроизводимость получаемого продукта. За один шаг трафаретной печати можно получать целую матрицу не отличающихся' друг от друга по свойствам сенсорных структур, электрохимические характеристики которых при этом приближены к свойствам классических торцевых дисковых электродов, дорогих в изготовлении и неудобных в применении*.

• Современные медицина и биология рассматривают пероксид водорода как важнейший метаболит, являющийся индикатором окислительного стресса и воспалительных процессов в организме. Кроме того, сенсоры на пероксид водорода находят широкое применение при конструировании биологических сенсоров, содержащих иммобилизованные оксидазы в качестве биочувствительного элемента. Эти ферменты катализируют окисление специфического субстрата кислородом воздуха, при этом кислород восстанавливается до пероксида водорода, концентрация которого позволяет судить о концентрации исходного субстрата. Таким образом, потребность в чувствительных, стабильных и воспроизводимых сенсорах на пероксид водорода чрезвычайно велика.

Наиболее чувствительным и селективным методом определения пероксида водорода является1. амперометрия с использованием электрохимически модифицированных берлинской лазурью электродов, позволяющих определять концентрации Н202 в широком (до 7 порядков) диапазоне. Для реализации массового 6 производства пероксидных сенсоров возникает необходимость в исключении трудоемких электрохимических стадий модификации и в их замене на неэлектрохимический синтез берлинской лазури на поверхности электрода. Такой метод позволит модифицировать одновременно целую матрицу электродов и, следовательно, автоматизировать процесс изготовления сенсоров. Кроме того, существует необходимость в дополнительной стабилизации каталитического покрытия, связанная с недостаточной для некоторых приложений операционной и механической стабильностью берлинской лазури. Этот процесс также целесообразно проводить без привлечения электросинтеза, ориентируясь на массовое производство. Данная работа посвящена созданию научных основ технологии изготовления высокоэффективных амперометрических сенсоров и биосенсоров, пригодной для массового производства, то есть лишенной трудоемких электрохимических стадий.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Методом трафаретной печати созданы планарные трехэлектродные основы для конструирования (био)сенсоров. Электрохимические свойства данных структур по диапазону соответствия теоретической зависимости величины тока от скорости развертки потенциала не уступают коммерчески доступным аналогам, а по чувствительности к ферроцианиду в 2.5 раза превосходят последние.

2. Разработан метод межфазного бестокового синтеза берлинской лазури на поверхности электрода, позволяющий получать сенсоры на пероксид водорода, не уступающие ни по аналитическим, ни электрохимическим« свойствам электродам, модифицированным электрохимическим осаждением. Линейный диапазон определяемых концентраций Н202 в проточно-инжекционном режиме составляет МО"7 - МО"3 М, чувствительность анализа - 0.4 АМ"1 см"2.

3. Предложены бестоковые методы- стабилизации пероксидных сенсоров с использованием» проводящих полимеров, полиэлектролитов и гексацианоферратов переходных металлов. Путем послойного синтеза берлинской лазури и гексацианоферрата никеля на поверхности планарного электрода получен высокостабильный сенсор, демонстрирующий неизменный сигнал в жестких, условиях непрерывной регистрации 1 мМ пероксида водорода в течение 50 минут.

4. Показана применимость предложенных сенсоров на пероксид водорода в клинической диагностике для анализа конденсата выдыхаемого воздуха, в контроле качества пищевых продуктов для исследования антиоксидантной активности по регистрации кинетики разложения пероксида водорода, а также для создания биосенсоров на лактат и глюкозу.

5. Создан глюкозный биосенсор, рабочий диапазон которого составляет от 1 до 20 мМ глюкозы. Биосенсор адаптирован к работе в тонкослойной ячейке и применен для определения концентрации глюкозы в малом объеме (1 мкл) цельной крови; время анализа составило 10 с.

1. R. Hage, A. Lienke. Applications of Transition-Metal Catalysts to Textile and Wood-Pulp Bleaching. II Angewandte Chemie International Edition, 2006, V. 45(2), p. 206222.

2. A.W. Dohlman, H.R. Black, J.A. Royall. Expired breath hydrogen peroxide is a marker of acute airway inflammation in pediatric patients with asthma. II American Review of Respiratory Disease, 1993, V. 148, p. 955-960.

3. Q. Jobsis, H.C. Raatgeep, S.L. Schellekens, W.C. Hop, P.W.'Hermans, J.C. de Jongste. Hydrogen peroxide in exhaled air. of healthy children: reference values. II European Respiratory Journal, 1998, V. 12(2), p. 483-485.

4. S. Loukides, D. Bouros, G. Papatheodorou, P. Panagou, N. Siafakas. The relationships among hydrogen peroxide in expired breath condensate, airway inflammation, and asthma severity. II Chest, 2002, V. 121(2), p. 338-346.

5. Q. Jobsis, H.C. Raatgeep, P.W. Hermans, J.C. de Jongste. Hydrogen peroxide in exhaled air of healthy children: reference values. II European Respiratory Journal, 1997, V. 10(3), p. 519-521.

6. P.N. Dekhuijzen, Aben K.K., Dekker I., Aarts L.P., Wielders P.L., van Herwaarden

7. C.L., Bast A. Increased exhalation of hydrogen peroxide in patients with stable and unstable chronic obstructive pidmonary disease. II American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 1996, V. 154(3 Pt 1), p. 813-6.

8. M. Kasielski,. Nowak D. Long-term adminisp-ation of N-acetylcysteine decreases hydrogen peroxide exhalation in subjects with chronic obstructive pulmonary disease. II Respiratory Medicine, 2001, V. 95(6), p. 448-56.

9. WJ. van Beurden, Harff G.A., Dekhuijzen P:N., van den Bosch M.J., Greemers J.P., Smeenk F.W. An efficient and reproducible method for measuring hydrogen peroxide in exhaled breath condensate. И Respiratory Medicine, 2002, V. 96(3), p. 197-203:

10. W.B. Gerritsen, Asin J., Zanen P., van den Bosch J.M., Haas F.J. Markers of inflammation and oxidative stress in exacerbated chronic obstructive pulmonary disease patients. И Respiratory Medicine, 2005, V. 99(1), p. 84-90: . '

11. D. Nowak, Kasielski M.,.Pietras Т., Bialasiewicz P., Antczak A. Cigarette smoking does not increase hydrogen peroxide levels in expired breath condensate of patients with stable COPD. // Monaldi archives for chest disease, 1998, V. 53(3), p. 268-73.

12. F. De Benedetto, Aceto A., Dragani В., Spacone A., Formisano S;, Pela R., Donner C.F., Sanguinetti C.M. Long-term oral n-acetylcysteine reduces "exhaled hydrogen peroxide in stable COPD. II Pulmonary Pharmacology Therapies, 2005, V. 18(1), p. 41-7.

13. E.G. Lases, V.A. Duurkens, W.B. Gerritsen, F.J. Haas. Oxidative stress after lung resection therapy: A pilot study. И Chest, 2000, V. 117(4), p. 999-1003.

14. P. Niethammer, C. Grabher, A.T. Look, T.J. Mitchison. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. II Nature, 2009, V. 459(7249), p. 996-1000.

15. J.M. Cook-Mills. Hydrogen peroxide activation of endothelial cell-associated MMPS during VCAM-1-dependent leukocyte migration. II Cellular and Molecular Biology, 2006, V. 52(4), p. 8-16.

16. G.G. Guilbault, G.J. Lubrano. An enzyme electrode for amperometric determination of glucose. //Analytica Chimica Acta, 1973, V. 64(3), p. 439-455.

17. Э. Тернер, И; Карубе, Д. Уилсон, eds. Биосенсоры: основы и приложения. 1992, "Мир": Москва.

18. Y. Zhang, G.S. Wilson.' Electrochemical oxidation of H202 on Pt and Pt + Ir electrodes in physiological buffer and its applicability to H202-based biosensors. II Journal of Electroanalytical Chemistry, 1993, V. 345(1-2), p. 253-271.

19. S.A.G. Evans, J.M. Elliott, L.M. Andrews, P.N. Bartlett, P.J. Doyle, G. Denuault. Detection of Hydrogen Peroxide at Mesoporous Platinum Microelectrodes. II Analytical Chemistry, 2002, V. 74(6), p. 1322-1326.

20. A. Kicela, S. Daniele. Platinum black coated microdisk electrodes for the determination of high concentrations of hydrogen peroxide in phosphate buffer solutions. II Talanta, 2006, V. 68(5), p. 1632-1639.

21. D.J. Daly, C.K. O'Sullivan, G.G. Guilbault. The use of polymers coupled with metallised' electrodes to allow H202 detection in the presense of electrochemical interferences. II Talanta; 1999; V. 49(667-678).

22. S. Kozlovskaja, G. BaltrQnas, A. Malinauskas. Response of hydrogen peroxide, ascorbic acid, and paracetamol at a platinum electrode coated with microfilms of polyaniline. И Microchimica Acta, 2009, V. 166(3), p. 229-234.

23. S.A. Wring, J.P. Hart. Chemically modified carbon-based electrodes and their application as electrochemical sensors for the analysis of biologically important compounds. И Analist, 1992, V. 117, p. 1215-1229.

24. F. Mizutani, S. Yubuki, S. Iijinza. Carbon paste electrode incorporated with cobalt(II) octaethoxyphthalocyanine for the amperometric detection of hydrogen peroxide. II Electroanalysis, 1995, V. 7(8), p. 706-709.

25. C. Batchelor-McAuley. An electrochemical comparison of manganese di-oxide microparticles versus a and /? manganese dioxide nanorods: mechanistic and electrocatalytic behaviour. II New Journal of Chemistry, 2008, V. 32, p. 1195-1203.119t

26. M.S. Lin, H.J. Leu. A Fe30.rBased chemical sensor for cathodic determina-tion ofhydrogen peroxide. II Electroanalysis, 2005, V. 17(22), p. 2068 2073.

27. X.-M. Miao. Direct electrocatalytic reduction of hydrogen peroxide based on Nafion and copper oxide nanoparticles modified Pt electrode. // Journal of Electroanalytical Chemistry, 2008, V. 612, p. 157-163.

28. C. Batchelor-McAuley. The use of copper(II) oxide nanorod bundles for the non-enzymatic voltammetric sensing of carbohydrates and hydrogen peroxide. II Sensors and Actuators B, 2008, V. 135, p. 230-235.

29. A.I. Yaropolov, V. Malovik, S.D. Varfolomeev, I.V. Berezin. Electroreduction of hydrogen peroxide on an electrode with immobilized peroxidase. // Doklady Akademii Nauk SSSR, 1979, V. 249(6), p. 1399-1401.

30. Z. Wang, Q. Xu, H.Q. Wang, Q. Yang, J.H. Yu, Y.D. Zhao. Hydrogen peroxidebiosensor based on direct electron transfer of horseradish peroxidase with vapori deposited quantum dots. II Sensors and Actuators B-Chemical, 2009, V. 138(1), p. 2781 282.

31. E. Ekanayake, D.M.G. Preethichandra, K. Kaneto. Bi-functional amperometric ! biosensor for low concentration hydrogen peroxide measurements using polypyrroleimmobilizing matrix. II Sensors and Actuators B-Chemical, 2008, V. 132(1), p. 166-171.i

32. S. Yabuki, S. Fujii. Hydrogen peroxide biosensor based on a polyion complexmembrane containing peroxidase and toluidine blue, and its application to the l fabrication of a glucose sensor. II Microchimica Acta, 2009,' V. 164(1), p. 173-176.

33. S. Varma, B. Mattiasson. Amperometric biosensor for the detection of hydrogenperoxide using catalase modified electrodes in polyaerylamide. // Journal of 1 Biotechnology, 2005, V. 119(2), p. 172-180.»

34. A.A. Karyakin, O.V. Gitelmacher, E.E. Karyakina. A high-sensitive glucoseamperometric biosensor based on prussian-blue modified electrodes. II Analytical \ Letters, 1994, V. 27(15), p. 2861-2869.120

35. S.A. Jaffari, A.P.F. Turner. Novel hexacyanoferrate(III) modified graphite disc electrodes and their application in enzyme electrodes. II Biosensors & Bioelectronics, 1997, V. 12(1), p. 1-9.

36. S.A. Jaffari, J.C. Pickup. Novel hexacyanoferrate (III)-modified carbon electrodes: application in miniaturized" biosensors with potential for in vivo glucose sensing. II Biosensors & Bioelectronics, 1996, V. 11(11), p: 1167-1175.

37. A.A. Karyakin, E.E. Karyakina. Prussian Blue-based 'artificial peroxidase' as a transducer for hydrogen peroxide detection. Application to biosensors. II Sensors and Actuators B: Chemical, 1999, V. 57(1-3), p. 268-273.

38. J. Wang, X.J. Zhang, M. Prakash. Glucose microsensors based on carbon paste enzyme electrodes modified with cupric hexacyanoferrate. I I Analytica Chimica Acta, 1999, V. 395(1-2), p. 11-16.

39. J. Lin, D.M. Zhou, S.B. Hocevar, E.T. McAdams, B. Ogorevc^ X. Zhang. Nickel hexacyanoferrate modified screen-printed carbon electrode for sensitive detection of ascorbic acid and hydrogen peroxide. H Frontiers in Bioscience, 2005, V. 10, p. 483-91.

40. A.B. Bocarsly, S. Sinha. Chemically derivatized nickel surfaces synthesis of a new class of stable electrode interfaces. II Journal of Electroanalytical Chemistry, 1982, V. 137(1), p. 157-162.

41. K. Itaya, I. Uchida, V.D. Neff. Electrochemistry of polynuclear transition-metal cyanides prussian blue and its analogs. II Accounts of Chemical Research, 1986, V. 19(6), p. 162-168:

42. P.J. Kulesza, Z. Galus. Polynuclear transition-metal hexacyanoferrate films — in situ electrochemical determination of their composition. II Journal, of Electroanalytical Chemistry, 1989; V. 267(1-2), p. 117-127.

43. S.M. Chen. Electrocatalytic oxidation of thiosulfate by metal hexacyanoferrate film modified electrodes. // Journal of Electroanalytical Chemistry, 1996, V. 417(1-2), p. 145-153.

44. M.S. Lin, T.F. Tseng, W.C. Shih. Chromium(III) hexacyanoferrate(II)-based chemical sensor for the cathodic determination of hydrogen peroxide. II Analyst, 1998, V. 123(1), p. 159-163.

45. I.L. de Mattos, L. Gorton, T. Laurell, A. Malinauskas, A.A. Karyakin. Development of biosensors based on hexacyanoferrates. II Talanta, 2000, V. 52(5), p. 791-799.

46. R. Pena, J. Gamboa, T. Paixao, M. Bertotti. Flow injection amperometric determination of hydrogen peroxide in household commercial products with a ruthenium oxide hexacyanoferrate modified electrode. II Microchimica Acta, 2009, V. 166(3), p. 277281.

47. M.O. Salles, T. Paixao, M." Bertotti. Hydrogen peroxide monitoring in photo-Fenton reactions by using a metal hexacyanoferrate modified electrode. H International Journal of Electrochemical Science, 2007, V. 2(3), p. 248-256.

48. C.G. Tsiafoulis, P.N. Trikalitis, MX Prodromidis. Synthesis, characterization and performance of vanadium hexacyanoferrate as electrocatalyst of H2O2. 11 Electrochemistry Communications, 2005, V. 7(12), p. 1398-1404.

49. M.S. Lin, B.I. Jan. Determination of hydrogen peroxide by utilizing a cobalt(II) hexacyanoferrate-modified glassy carbon electrode as a chemical sensor. II Electroanalysis, 1997, V. 9(4), p. 340-344.

50. Z. Li, X. Cui, J. Zheng, Q. Wang, Y. Lin. Effects ofmicrostructure of carbon nanofibers for amperometric detection of hydrogen peroxide. // Analytica Chimica Acta, 2007, V. 597(2), p. 238-244.

51. A.A. Karyakin, E.A. Puganova, I.A. Bolshakov, E.E. Karyakina. Electrochemical sensor with record performance characteristics. II AngewandteChemie-International Edition, 2007, V. 46(40), p. 7678-7680.1

52. J'. Bartoll, B. Jackisch, M. Most, E. Wenders de Calisse, C.M. Vogtherr. Early Prussian Blue. Blue and green pigments in the paintings by Watteau, Lancret and: Pater in the collection of Frederick II of Prussia. II Techne, 2007, V. 25, p: 39-46.

53. V.D. Neff. Electrochemical Oxidation and Reduction of Thin Films of Prussian Blue. II Journal of the Electrochemical Society, 1978, V. 128(6), p. 886-887.

54. J.F. Duncan, P.W.R. Wigley. Electronic structure of the iron atoms in complex iron cyanides. //Journal of the Chemical Society, 1963, V. (FEB), p. 1120-1125.

55. J.F. Keggin, F.D. Miles. Structure and formulae of the Prussian Blue and related compounds. //Nature, 1936, V. 137(4), p. 577-578.

56. F. Hen-en, P. Fisher, A. Ludi, W. Halg. Neutron difraction study of Prussian Blue, Fe4Fe(CN)^3 XH2O. Location of water molecules and long-range magnetic order. II Inorganic Chemistry, 1980; V. 19, p. 956-959.

57. K. Itaya, T. Ataka, S. Toshima. Spectroelectrochemistry and electrochemical preparation method of prussian blue modified electrodes. II Journal of the American Chemical Society, 1982, V. 104(18), p. 4767-4772.

58. S. Ganguli, M. Bhattachar. Studies of different hydrated forms of Prussian Blue. II Journal of the Chemical Society. Faraday transactions, 1983, V. 79, p. 1513-1522.80