Электрохимические сенсоры для определения мочевины и креатинина в биологических жидкостях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

0046О3642

Деденева Светлана Сергеевна

►ЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЧЕВИНЫ И КРЕАТИНИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Специальность 02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

- 3 ИЮН 2019

Казань-2010

004603042

Работа выполнена на кафедре физики и химии ГОУ ВПО "Уральский государственный экономический университет"

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор химических наук, профессор Брайнина Хьена Залмановна

доктор химических наук, профессор Евтюгин Геннадий Артурович

кандидат химических наук, доцент Великанова Татьяна Валентиновна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии ш Институт органической и физической хиы (ИОФХ) им. А.Е. Арбузова Казансю научного центра РАН

Защита состоится %(]_ .нал, 2010 года в 14.30 на заседаю Диссертационного совета Д 212.081.03 по химическим наукам при Казанскс государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул.Кремлевская 18, Химический институт им. A.M. Бутлерова, КЛ Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.1 Лобачевского Казанского государственного университета. С авторефератом можи ознакомиться на сайте КГУ (www.ksu.ru).

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская 1 Казанский государственный университет, Научная часть, или по электронной поч! mkazymov@ksu.ru

Автореферат диссертации разослан «_» д^мд- 2010 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

щшМ,

М.А. Казымова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Решения, связанные с охраной здоровья населения и ранней диагностикой заболеваний, требуют развития новых и эффективных методов определения компонентов биологических жидкостей — маркеров функционирования органов и систем человеческого организма.

При ряде заболеваний, сопровождающихся нарушением работы почек, может возникнуть острая почечная недостаточность, ранняя диагностика которой способствует своевременному оказанию медицинской помощи и уменьшает риск развития хронической или тяжелой форм заболевания. Общепризнанными диагностическими показателями функциональной способности почек являются содержание креатинина и мочевины в сыворотке крови и в моче, так как именно в почках происходит выделение азотистых компонентов крови.

В современной лабораторной диагностике для мониторинга заболеваний почек используются фотометрические приборные методы, в которых в качестве распознающего элемента чаще всего применяются ферменты.

Для определения мочевины используют прямые фотометрические методы, основанные на реакции мочевины с диацетилмонооксимом или на каталитической реакции с уреазой. Фотометрическое определение креатинина, как правило, основано на реакции Яффе или, крайне редко, на реакции ферментативного гидролиза под действием иминогидролазы креатинина с использованием автоанализаторов. Чувствительность используемых методов зависит от устойчивости окраски анализируемых комплексов, собственной окраски исследуемого образца, устойчивости ферментов при хранении и эксплуатации, действия высоких и низких температур, бактериальных загрязнений и т.д. Как следствие, сложность методики анализа, а также высокая стоимость оборудования и расходных материалов исключают повсеместное проведение лабораторной диагностики почечной недостаточности, в частности в небольших клиниках.

Для решения проблемы требуется создание новых экспрессных, чувствительных и селективных методов и сенсоров для диагностики почечной недостаточности, исключающих применение ферментов.

Высокая чувствительность и селективность, оперативность получения результата, возможность работы в полевых условиях, относительная простота и доступность аппаратурного оформления позволяют предложить для определения мочевины и креатинина электрохимические методы анализа.

Настоящая диссертационная работа посвящена развитию новых подходов к созданию бесферментных амперометрических сенсоров для определения мочевины и креатинина с использованием в качестве чувствительного элемента наночастиц №0 или макроциклических комплексов никеля (П). Селективность определения обеспечивается применением либо анионообменной колонки (в случае мочевины), либо полимеров с молекулярными отпечатками (в случае креатинина). Разработанный сенсор не уступает по чувствительности и селективности ферментсодержащим биосенсорам и лишен недостатков последних.

Научным консультантом является кандидат химических наук, доцент кафедры аналитической химии Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н. Ельцина» Козицина Алиса Николаевна

Актуальность представленной работы определяется как изложенными выше соображениями, так и ожидаемым упрощением и удешевлением методики и аппаратурного обеспечения в диагностике почечной дисфункции.

Работа является частью исследований, проводимых на кафедре химии и физики и кафедре химии Уральского государственного экономического университета при поддержке грантов РФФИ-офи «Молекулярный дизайн металлсодержащих рецепторов биогенных аминов на основе макрогетероциклических систем, модифицированных азагетероциклами и создание на их основе бесферментных сенсоров» (2006-2007 гг.), РФФИ-Урал «Электродные процессы в системах: электрод-металлсодержащий рецептор биогенных аминов - определяемый амин» (2007-2009 гг.), а также в рамках заданий Министерства промышленности и науки Свердловской области «Нанотехнологии в био- и химических сенсорах для мониторинга окружающей среды и здоровья человека» (2008-2010 гг.)

Цель работы. Разработка бесферментных амперометрических сенсоров для прямого и селективного определения мочевины и креатинина на основе наночастиц N10 и хелатных комплексов никеля (II) как каталитических систем электрохимического окисления указанных аналитов, а также полимеров с молекулярными отпечатками (ПМО) креатинина, определяющих селективность определения.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

— выбрать оптимальный метод синтеза наночастиц N¡0 и исследовать влияние размера и способа иммобилизации полученных наночастиц на поверхности толстопленочного углеродсодержащего электрода на каталитическую активность электрохимического окисления мочевины и/или креатинина;

— выбрать материал толстопленочного электрода и способ иммобилизации каталитической системы на основе органических комплексов никеля (И) на рабочую поверхность толстопленочного электрода;

— изучить каталитические системы на основе органических комплексов никеля (II), способных генерировать воспроизводимый аналитический отклик в присутствии определяемого аналита;

— исследовать кинетику электрохимического каталитического окисления мочевины и креатинина в присутствии каталитической системы;

— охарактеризовать рабочие условия регистрации аналитического сигнала в присутствии определяемого аналита;

— исследовать способность полимеров с молекулярными отпечатками креатинина к селективной сорбции молекул креатинина из модельных растворов

— разработать новые сенсоры для хроноамперометрического определения мочевины и креатинина с высокими аналитическими и метрологическими характеристиками.

Научная новизна.

— Методом обратных микроэмульсий синтезированы наночастицы N10 сферической формы, средний диаметр которых составляет порядка 20 нм. Наиболее выраженная электрокаталитическая активность в электрохимическом окислении мочевины наблюдается при использовании образца наночастиц N¡0, синтезированных при 45 °С с использованием цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ) в качестве ПАВ.

— Установлен рост каталитической активности наночастиц N¡0 в электрохимическом окислении мочевины при увеличении содержания наночастиц в модифицирующей суспензии до 0,5 г/л (в пересчете на содержание N¡(11)). Выше этого значения наблюдается снижение каталитической активности из-за ускорения процессов

агломериции наночастиц и фазовых изменений. Получена линейная зависимость тока, регистрируемого при заданном потенциале, от концентрации мочевины в диапазоне концентраций аналита от МО'3 М до 8-10"3 М при использовании толстопленочных электродов, модифицированных наночастицами N10;

— в качестве каталитических систем в электрохимическом окислении мочевины и креатинина использованы органические комплексы никеля (II), способные к дополнительной координации с молекулами аналита, что позволило увеличить чувствительность определения указанных аналитов. Из 16-ти исследованных органических комплексных соединений никеля (II) лучшие аналитические характеристики при электрохимическом определении мочевины и креатинина были получены для пяти органических комплексов N1 (И): 1,1,1,7,7,7-гексафторгептан-2,4,6-трикетоната диникеля(П) тетрагидрата (II); 4,4,5,5,6Д7,7,7-нонафтор-1-фенилгептан-1,3-дикетоната никеля (II) (III); [(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-(бензотиазол-2-иламино)-Б-тегразинатоКацетилацетонато) никеля (II) (V); 4-тетрапиразинпорфиразина никеля (II) (XI) и 2,9,16,23-тетра(4-гептилфенил) тетрапиразинпорфиразина никеля (II) (XII);

— показано, что процесс электрохимического окисления мочевины или креатинина на модифицированных органическими комплексами толстопленочных углеродсодержащих электродах (ТУЭ) является каталитическим и лимитируется процессом диффузии аналита к поверхности ТУЭ;

— сопоставлены каталитические и метрологические характеристики ТУЭ, модифицированных наночастицами N¡0 или комплексами никеля (II). Определено, что на каталитическую активность модификаторов влияют: природа лиганда и растворителя, а также содержание N1 (II) в модифицирующих суспензиях или растворах;

— изучена возможность селективного определения мочевины в реальных образцах с использованием анионообменной колонки и креатинина в модельных растворах с использованием синтезированых ПМО креатинина;

Практическая ценность работы.

Разработанные бесферментные амперометрические сенсоры на основе толстопленочных электродов, модифицированных соединениями никеля (И), и анионообменной колонки или ПМО креатинина, позволяют ускорить и удешевить определение мочевины и/или креатинина в биологических объектах (сыворотке крови) при диагностике почечной дисфункции по сравнению с используемыми в клинической диагностике методами.

Автор выкосит на защиту следующие положения.

❖ Результаты исследования влияния условий синтеза наночастиц N10 на их каталитические свойства в электроокислении мочевины и креатинина

❖ Способы получения сенсоров на основе углеродсодержащих чернил или графитэпоксидной композиции с иммобилизованными органическими комплексами N1(11). Информацию о факторах, влияющих на вольтамперные характеристики модифицированных толстопленочных электродов

❖ Результаты исследования электрохимического поведения катализаторов (наночастиц N10 и органических комплексов никеля (II)), иммобилизованных на поверхности толстопленочных электродов. Информацию о факторах, влияющих на вольтамперные характеристики катализаторов и генерируемый ими аналитический сигнал.

❖ Выбор каталитической системы для электрохимического окисления мочевины и креатинина. Оптимальные условия регистрации максимального каталитического эффекта.

❖ Результаты исследования способности полимеров с молекулярными отпечатками креатинина к специфическому связыванию указанного аналита.

❖ Методики определения мочевины и креатинина на разработанных сенсорах.

Апробация работы.

Результаты исследований представлены на Международном конгрессе по аналитическим наукам ICAS-2006 (Москва, Россия, 2006 г.); на 7 Семинаре «Биосенсоры и биоаналитические ц-технологии в анализе окружающей среды и клинических анализах» (Кашадаси, Турция, 2006 г.); на Всероссийской научной конференции «Природные макроциклические соединения и их синтетические аналоги» (Сыктывкар, Республика Коми, 2007 г.); на Научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве» (Томск, Россия, 2007 г.); на VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА-2008» (Уфа, Башкортостан, 2008 г.); на третьей всероссийской конференции по наноматериалам «HAHÓ-2009» (Екатеринбург, Россия, 2009 г); на III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, Россия, 2009 г.)

Публикации. Основное содержание работы представлено в виде 1 статьи в журнале, рекомендованном ВАК, и тезисов 7 докладов на международных и всероссийских конференциях.

Личное участие автора состоит в решении основных задач исследования, планировании и проведении экспериментов, обработке, интерпретации и систематизации результатов исследования.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, трех глав результатов и их обсуждения, выводов, списка использованной литературы.

Материал диссертации изложен на 133 страницах, содержит 48 рисунков, 5 схем и 18 таблиц. Список литературы включает 107 наименований работ российских и зарубежных авторов.

Первая глава (литературный обзор) содержит описание методов определения мочевины и креатинина в современной клинической диагностике. Приведены примеры использования электрохимических сенсоров на основе соединений Ni (II) в анализе NH2— и ОН— содержащих органических веществ. Описаны особенности синтеза и применения в анализе органических соединений полимеров с молекулярными отпечатками (ПМО). Изложены задачи эксперимента. Во второй главе приведены условия проведения эксперимента. В третьей главе приводятся результаты исследования влияния условий синтеза наночастиц NiO на их каталитическую активность в электрохимическом окислении мочевины. Четвертая глава посвящена разработке амперометрических сенсоров на основе органических комплексов Ni (II). В пятой главе приведены результаты селективного определения мочевины в сыворотке крови и креатинина в модельных растворах с использованием анионообменной колонки и ПМО креатинина, соответственно.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

АППАРАТУРА И РЕАКТИВЫ

Вольтамперометрические и хроноамперомерические исследования проводили с использованием инверсионного вольтамперометрического анализатора «ИВА-5» (ООО 1.1ПВП «ИВА», Екатеринбург). Применяли трехэлектродную электрохимическую счейку с рабочим объемом 10 см3. В качестве вспомогательного электрода j использовали стеклоуглеродный стержень, электродом сравнения служил хлоридсеребрянный электрод (Ag/AgCl/нас. KCl). В качестве индикаторных электродов использовали одноразовые модифицированные толстопленочные электроды на основе углеродсодержащих чернил (ТУЭ) или эпоксидно-графитовой смеси (ТГЭ) (рис.1). ТУЭ и ТГЭ изготовлены методом трафаретной печати (ООО НПВП «ИВА»,

Вид сбоку Вид сверху

В качестве модификаторов использовали наночастицы NiO или органические комплексы никеля (II) (рис. 2): ацетилацетонат никеля (II) (I); 1,1,1,7,7,7-гексафторгептан-2,4,6-трикетонат диникеля(11) тетрагидрат (II); 4,4,5,5,6,6,7,7,7-нонафтор-1-фенилгептан-1,3-дикетонат никеля (II) (III); 4,4,5,5,6,6,6-гептафтор-1-j этоксигексан-1,3-дикетонат никеля (II) (IV); [(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-(бензотиазол-2-иламино)-з-тетразинато](ацетилацетонато) никеля (И) (V); N,N'-бис(этил-2-трифторацетилпропионат-3-ил)этилендиамин никеля (II) (VI); N,N'-бис( 1,1,2,2-тетрафтор-3-оксо-4-(п-диазатолил)-нонен-4-5-ил)-о-фенилендиамин i никеля (II) (VII); пятиядерный кластер состава №5(цз-ОН)2(ц-ООСС(СНз)з)4(|1-N,N',N"-3,5-Me2C3HN2C2(0)N4)4(CH3CN)2 (VIII); комплекс 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-ундециламино-1,2,4,5-тетразина с ацетатом никеля (И) состава NiitZííOHXHoOhíCHjCOO);, где tz - 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-ундециламино-1,2,4,5-тетразин (IX); комплекс 3,6-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-з-тетразин с кластером №9(НООССМез)4(ц4-ОН)з(ООССМез)]2 (X); 4-тетрапиразинпорфиразин никеля (II) (XI); 2,9,16,23-тетра(4-гептилфенил) тетрапиразинпорфиразин никеля (II) (XII); никелевый комплекс 1-(2-фенил)-2-(мезо-тетрафенилпорфирин-2-ил)-этанона ' (XIII); никелевый комплекс 1-(2-нитрофенил)-2-(мезо-тетрафенилпорфирин-2-ил)-этанона (XIV); мезо-тетрафенилпорфиринат никеля (II) (XV); октаэтилпорифиринат никеля (П) (XVI). Указанные комплексные соединения синтезированы сотрудниками ИОС им. И .Я. Постовского УрО РАН; чистоту реагентов проверяли методами ИК-, ЯМР-спектроскопии и элементного анализа.

¡ Екатеринбург).

Рис. 1 — Схема толстопленочного электрода:

1 — полимерная подложка из стеклотекстолита;

2 — токопроводящий слой (углеродсодержащие чернила (ТУЭ) или графит-эпоксидная композиция (ТГЭ))

3 — рабочая область;

4 — изоляционный слой.

Площадь рабочей зоны составляет 10 мм2.

уу

I

О. .о. ,о

II

/—ч

О /-N. .14-». О

1,1

к1

о ,о

«"О

IV С^, 0Е1

0. >-N^.N4 .О

Р ЕШр 0«<ср0Е1 К,НСГ2С Р1«РГ 1Ч=\ СР^НГ,

VI

н,с СН}

VII

о I ХЛоXV

о^у. \ / ..

ХССН,

ЖсНг

VIII

9й» 9й» п. о"Чо и 0 ,0

1зС*гжК I р^

^ К-«

+

N1,(110 О СС М «3)4(1114-0II )3(0 О С С М е^,, X

I)

он

"Ух

XI Л: н

хп Я:-ф-с,Иц

К

.. Ср

о N0,

XV И: II

Н5С,Ч-С1Н

XIII

XIV

Рис. 2 — Структурные формулы исследуемых комплексов никеля (II)

В качестве объектов исследования использовали мочевину и креатинин (рис. 3). Для приготовления растворов использовали деионизированную воду и реактивы квалификации ос.ч., х.ч. и ч.д.а.

Н о

У

О |

I

сн,

Рис. 3 — Структурные формулы мочевины (1) и креатинина (2).

1 2

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

Выбор каталитической системы осуществляли на основании результатов циклической вольтамперометрии и хроноамперометрии. Соответствие найденной концентрации введенной использовали в качестве критерия правильности результата.

Анализ включал две стадии: I стадия — формирование поверхности одноразового модифицированного электрода многократным циклированием в интервале потенциалов 0-0,7 (0,9) В, на фоне 0,25 М ЫаОН.; II стадия — хроноамперометрическое определение содержания аналита на фоне 0,25 М ЫаОН при потенциале, определяемом в зависимости от используемого модификатора. Концентрацию мочевины или креатинина рассчитывали по формуле:

Д1ДОб -ток окисления модификатора, полученный после введения в раствор стандартной добавки мочевины или креатинина;

Д1обр - ток окисления модификатора, полученный в присутствии стандартной добавки мочевины или креатинина (образца);

Сд0б- концентрация стандартной добавки мочевины или креатинина;

Улоб - объем стандартной добавки мочевины или креатинина, вводимый в ячейку;

У0бр - объем второй стандартной добавки (образца), вводимой в ячейку. 1. ИСЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НАНОЧАСТИЦ N¡0

Основное требование, предъявляемое к методу синтеза, - возможность получения наночастиц с заданными размерами и формой. Этому требованию наиболее соответствует метод образной микроэмульсии, позволяющий получить наночастицы с узкодисперсным распределением по размерам.

Синтез наночастиц №0 осуществляли в два этапа. На первом этапе синтеза получали прекурсоры — наночастицы оксалата никеля (II) (№С204-2Н20) методом осаждения в присутствии ПАВ: ЦТАБ или АОТ (диоктилсульфосукцината натрия) по схеме:

где Ас — ацетат анион.

На втором этапе синтеза осадок, очищенный от молекул ПАВа, высушивали при 120 °С в течение 1 часа, затем отжигали при 450 °С в течение 6 часов до образования темно-серых чешуек, содержащих наночастицы N¡0.

При синтезе прекурсора по первому способу, с использованием ЦТАБ в качестве ПАВ, проводили осаждение наночастиц №С204 путем добавления по каплям

где

1.1 Выбор метода синтеза наночастиц N¡0

ЩАс)2 + (МН,)2С204 -*№С20,Ц + 2 №ЦАс,

микроэмульсии 2 к микроэмульсии 1 (Таблица1) при интенсивном перемешивании. Реакционную смесь перемешивали в течение 6 часов при ~22 °С, 45 °С или 60 °С.

Таблица 1

Состав микроэмульсий, используемых для синтеза наночастиц прекурсора

Тип компонента микроэмульсии Состав микроэмульсии

Микроэмульсия 1 Микроэмульсия 2

водная фаза (10,05%вес.) 0,1МЩАс)2-4Н20 0,1 М (ШдЬСгОгНзО

ПАВ (16,76%вес.) ЦТАБ ЦТАБ

со-ПАВ (13,90% вес.) п-бутанол п-бутанол

органическая фаза (59,29 % вес.) октан октан

При синтезе по второму способу в качестве ПАВ использовали АОТ. К микроэмульсии, содержащей 1,5 г АОТ в 100 мл толуола и 5 мл 0,1 М водного раствора ацетата никеля (II) при интенсивном перемешивании по каплям вносили 10 мл 0,1 М раствора оксалата аммония. Полученную смесь перемешивали со скоростью 1000 об/мин в течение 1 часа при ~ 22 °С, 45 °С или 60 °С.

На конечной стадии в обоих способах полученные продукты, охлаждённые до комнатной температуры, осаждали путем центрифугирования со скоростью 20000 об/мин. Очистку от молекул ЦТАБ проводили смесью хлороформа с этанолом, а от молекул АОТ последовательно деионизированной водой и этанолом, с последующим центрифугированием для полного осаждения продукта. Для очистки прекурсора от молекул АОТ, также как и от молекул ЦТАБ, достаточно 10-12 циклов смены растворителя и центрифугирования.

1.2 Электронно-микроскопические и энергодисперсионные исследования

наночастицN¡0

Размер и форму полученных наночастиц N¡0 исследовали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Согласно данным ПЭМ, наночастицы N¡0 имеют сферическую форму, независимо от природы ПАВ. Средний диаметр наночастиц варьируется от 15 нм до 24 нм в зависимости от температурного режима синтеза.

Наночастицы с наиболее узким распределением по размерам и наименьшим средним диаметром, равным 15 нм, были получены при проведении синтеза в присутствии ЦТАБ в качестве ПАВ при -22 °С (рис. 4).

Для всех образцов наночастиц N¡0 были получены одинаковые данные по энергодисперсионному спектральному анализу и химическому составу, подтверждающие природу наночастиц. Согласно полученным данным рентгенофазового анализа, наночастицы №0 имеют ромбоэдрическую кристаллическую структуру с гексагональной сингонией.

Распределение наночастиц N¡0 на рабочей поверхности электрода исследовали с помощью растровой электронной микроскопии (РЭМ).

а Ь

Рис. 4 - Микрофотография (а) и гистограмма распределения по размерам (Ь) наночастиц N¡0 (синтез прекурсора осуществляли с использованием ЦТАЕ в качестве ПАВ при -22 °С)

Согласно результатам РЭМ, наночастицы N¡0 агломерируют на поверхности толстопленочного электрода, причем, форма агломератов и распределение частиц по ! размерам зависят от природы ПАВ и от температурного режима синтеза, соответственно. Исключение составляют наночастицы N¡0, синтезированные при 45 °С с использованием ЦТАБ в качестве ПАВ. Указанные наночастицы агломерируют на поверхности электрода не в виде стержней, а в виде агломератов неправильной формы с узким распределением по размерам с преобладающей фракцией до 500 нм (рис.5).

Рис. 5 - РЭМ микрофотография (а) и гистограмма распределения по размерам агломератов наночастиц (Ь) на рабочей поверхности ТУЭ, модифицированных наночастицами N¡0 (синтез прекурсора осуществляли с использованием ЦТАБ в качестве ПАВ при 45 °С).

1.3 Исследование каталитической активности наночастиц N¡0 при электрохимическом окислении мочевины

Регистрацию сигнала осуществляли методом, описанным в п. «Методика эксперимента».

На циклических вольтамперограммах, зарегистрированных после формирования рабочей поверхности ТУЭ, модифицированных наночастицами N¡0, наблюдаются характерные для системы N1 (И)М (III) пары анодно-катодных пиков. Однако, только в случае наночастиц N¡0, синтезированных при 45 °С с использованием ЦТАБ в качестве ПАВ, величины анодно-катодных пиков на порядок превышают соответствующие

величины зарегистрированные в случае применения остальных образцов наночастиц (рис. 6). Это свидетельствует о формировании на рабочей поверхности ТУЭ значительно большего количества каталитических центров, что вероятно, связано с узким распределением агломератов наночастиц №0 по размерам на рабочей поверхности электрода с преобладающей фракцией до 500 нм.

40.00

о.оо

Рис. 6 — Циклические вольтампер граммы, зарегистрированные пос; формирования поверхности модифиц: рованных ТУЭ. В качестве модификат ров использовали, наночастицы №~ синтезированные с использованием ЦТ/; ^ в качестве ПАВ при:

1--22° С; 2 — 45° С; 3 — 60° С.

Фон: 0,25 М ЫаОН. !

Циклические вольтамперограммы, зарегистрированные для ТУЭ, модифицированных наночастицами N10, синтезированными с использованием АОТ в качестве ПАВ, аналогичны циклическим вольтамперограммам 1 и 3, представленным на рис. 6.

Кроме того, электрохимический отклик в присутствии 1 мМ мочевины был получен только при использовании ТУЭ, модифицированных наночастицами N¡0, синтез которых осуществляли при 45° С с применением ЦТАБ в качестве ПАВ. Поэтому, дальнейшие исследования проводились с использованием в качестве модификаторов этих наночастиц N¡0.

Содержание наночастиц N¡0 варьировали нанесением на рабочую зону электродов по 3 мкл суспензии модификатора, содержащей: 0,06 г/л (ТУЭ - N¡0 (0,06)), 0,10 г/л (ТУЭ-№0(0,10)), 0,25 г/л (ТУЭ-N¡0 (0,25)), 0,5 г/л (ТУЭ -№0 (0,50)) или 1,00 г/л (ТУЭ - N¡0 (1,00)) наночастиц N10 (расчет на содержание N1 (II) в суспензии).

На рисунке 7 представлена зависимость тока анодного пика от содержания наночастиц в модифицирующей суспензии. Уменьшение величины анодного пика наблюдается в случае, когда содержание наночастиц превышает значение 0,50 г/л (в пересчете на содержание N1 (П)).

80

< 60 ¡е

* 40

д

20

м I I I

0,057 0,1 0,25 0,5 С(Ш(II)), г/л

Рис. 7 - Зависимость величины анодного пика от содержания наночастиц №0 в модифицирующей суспензии.

Вероятно, это связано с тем, что при увеличении содержания наночастиц ускоряется процесс агломерации (не только на поверхности электрода, но уже в исходном коллоидном растворе), что приводит к более плотной, но не равномерной

упаковке на рабочей поверхности электрода. Увеличение величины отношения объем -поверхность приводит к существенным фазовым изменениям, в результате чего такой модификатор начинает работать как фаза, т.е. из наносостояния происходит переход в макросостояние. Величина аналитического сигнала такого модификатора существенно ниже, чем ансамбля наночастиц.

В ходе исследования каталитической активности 'ГУЭ-МЮ в электрохимическом окислении мочевины были получены линейные зависимости хроноамперометрического сигнала окисления аналита от его концентрации:

I = 0,011 хС + 0,012 (11=0,9847) в случае ТУЭ - N¡0 (0,10);

I = 0,929*С + 1,472 (11= 0,9531) в случае ТУЭ - МО (0,50).

В случае ТУЭ - N10 (0,06) не было получено четких хроноамперометрических сигналов, а в случае ТУЭ - N¡0 (0,25) хроноамперометрические сигналы окисления мочевины в рассматриваемом диапазоне концентраций значительно отклоняются от линейности. Можно предположить, что этого количества наночастиц не хватает для регистрации выраженного электрокаталитического аналитического отклика.

Недостаточная чувствительность модифицированных ТУЭ по сравнению с чувствительностью в используемых методах определения мочевины, а также низкие значения коэффициентов корреляции зависимости аналитического сигнала от концентрации мочевины не позволяют использовать эти электроды для определения мочевины.

В связи с этим, в качестве катализаторов электрохимического окисления мочевины и креатинина были исследованы органические комплексы никеля (И), которые способны дополнительно координировать молекулы мочевины или креатинина вблизи каталитического центра за счет функциональных групп лиганда.

2. Органические катализаторы электрохимического окисления мочевины и

креатинина

2.1 Выбор материала толсто пленочного электрода

Выбор материала электропроводящего слоя и рабочей зоны электрода производили по величине и воспроизводимости величин тока при заданном потенциале, зарегистрированных в присутствии мочевины (табл. 2). В качестве катализаторов были выбраны комплексы II и III. Выбор этих комплексов продиктован их структурными особенностями. Наличие акцепторных (перфторметильных) групп повышает как каталитическую активность N1 (II), так и способность карбонильных групп, связанных с ионами №2+, координировать молекулы мочевины. Это позволяет получить четкие и различимые хроноамперометрические сигналы.

Таблица 2

Результаты хроноамперометрического определения мочевины на ТУЭ, модифицированных комплексами II или III, полученные методом «введено-найдено». Введено 1,00 мМ мочевины (п= 5, Р=0,95). Фоновый электролит: 0,25 М №ОН

Катализатор Электрод Сср ± 5, мМ 8Г,%

II ТУЭ 1,07 ±0,16 14,4 107

ТГЭ 1,12 ±0,17 15,3 112

III ТУЭ 1,01 ±0,15 13,0 101

ТГЭ 1,08 ±0,14 12,4 108

Результаты, полученные с использованием ТУЭ и ТГЭ равнозначны, поэтому в дальнейших исследованиях применяли толстопленочные электроды на основе углеродсодержащих чернил, технология изготовления которых более проста.

2.2 Выбор способа иммобилизации катализатора

Влияние способа иммобилизации на аналитический отклик каталитической системы в присутствии мочевины было исследовано с использованием комплекса I. Выбор комплекса I в качестве катализатора электрохимического окисления мочевины обусловлен отсутствием в структуре комплекса функциональных групп, способных к координации с молекулами мочевины, т.о. аналитический отклик в присутствии мочевины и каталитический эффект обусловлены только системой Ni (H)/Ni (III).

1 способ (объемное модифицирование): 20 мкл раствора ацетилацетоната никеля (II) в CHClj (C(Ni (II))=1,67 г/л) тщательно перемешивали с 0,2 г чернил «Metech». Концентрации исходных растворов подбирались таким образом, чтобы содержание Ni(II) в смеси составляло 10%, 20%, 30% или 40%. Полученную смесь наносили через маску на рабочую поверхность электрода. Сушили при 70" С в течение часа. Электроды использовали в работе через сутки.

2 способ (метод капельного нанесения): 3 мкл раствора ацетилацетоната никеля (И) в ДМФА (C(Ni (II))=5,85 г/л) шш в CH3CN (C(Ni (И))=2,50 г/л) наносили на рабочую зону ТУЭ. Сушили при комнатной температуре до полного испарения растворителя. Электроды использовали в работе через сутки.

Каталитическая активность комплекса I, внесенного в объем (/ способ) или нанесенного на поверхность (2 способ) ТУЭ, определялась по величине и воспроизводимости амперометрического сигнала в присутствии мочевины с заданной концентрацией. Больший по величине и более воспроизводимый амперометрический сигнал, а также наиболее правильные результаты определения мочевины с использованием метода «введено-найдено» были получены при использовании ТУЭ, модифицированных по методу капельного нанесения с использованием ДМФА в качестве растворителя (табл. 3). В случае объемного модифицирования ТУЭ полученные результаты практически не зависят от содержания Ni(II) в объеме чернил. При содержании Ni(II) в объеме чернил от 10 до 40% и введенной добавке мочевины, равной 1,00 мМ, было найдено 0,77±0,13 мМ мочевины (Sr = 22,9%, R = 77%, п = 7, Р = 0,95).

Таблица 3

Проверка правильности определения мочевины при использовании модифицированных методом капельного нанесения ТУЭ методом «введено-найдено». (Введено: I мМ мочевины; п = 7; Р= 0,95).

C(Ni (II)) в модифицирующем растворе, г/л (растворитель) Найдено: Сср±5, мМ Sr,% R,%

5,85 (ДМФА) 0,98±0,07 9,5 98

2,50 (CH3CN) 0,89±0,15 24,8 89

Таким образом, для модифицирования ТУЭ оптимальным является метод капельного нанесения. Следует отметить, что на правильность определения мочевины влияет не только метод модифицирования электрода, но и природа растворителя используемого для получения модифицирующего раствора.

В случае остальных комплексов никеля (II) модифицирование ТУЭ проводили по 2 способу с использованием растворов или суспензий комплексов никеля (II) в разных

¿створителях. Суспензии использовались только в тех случаях, когда из-за низкой астворимости комплекса в большинстве растворителей не удавалось получить астворов соответствующих модификаторов.

.3 Выбор каталитической системы для электрохимического окисления мочевины

и/или креагинина

Первичный отбор катализатора был осуществлен на основании величин анодно-атодного пиков и ДЕ, полученных с использованием циклической вольтамперометрии. Сияние природы органического лиганда и условий иммобилизации на нектрохимические характеристики модифицированных ТУЭ были исследованы методом циклической вольтамперометрии. Дальнейшие хроноамперометрические сследования подтверждают правильность выбора того или иного катализатора, дталитическая активность иммобилизованных органических комплексов никеля (II) сследовалась на примере электрохимического окисления мочевины. Каталитическую ктивность выбранных на основании вольтамперных характеристик (наибольшие еличины анодно-катодного пиков, близкие к 57 мВ значения ДЕ (обратимость системы П (П)/М1 (III)» органических комплексов никеля (II) определяли по соотношению саЛш где 1кат— каталитический ток окисления мочевины, регистрируемые в роноамперометрическом режиме, — ток окисления комплекса никеля (II).

Среди изученных 16-ти потенциальных каталитических систем электрохимического окисления карбонилсодержащих аминов, наиболее перспективными оказались только 5 органических комплексов N1 (II): II, III, V, XI и XII.

В табл. 4 и 5 приведены, соответственно, результаты оценки каталитической активности и правильности определения мочевины, полученные с использованием ТУЭ, модифицированных растворами или суспензиями органических комплексов никеля (II), структурные формулы которых приведены на рис. 2.

Таблица 4

Оценка каталитической активности ТУЭ, модифицированных выбранными комплексами никеля (II) в присутствии 1 мМ мочевины. (п= 5; Р=0,95)

Растворитель См (и), г/л Е0х±5, мВ; (8Г, %) Евзм±5, мВ; (8„ %)

ТУЭ-П

дмсо 8,56(' 0,51±0,05; (10,7) 0,55±0,05; (9,4) 1,81±0,18; (11,3)

ТУЭ-Ш

ДМФА 14,88(1) 0,52±0,01; (4,4) 0,56±0,01; (5,9) 1,78±0,21; (13,2)

ТУЭ-У

ДМФА 2,93й 0,53±0,01 (7,3) 0,55±0,01 (8,1) 3,96±0,48 (13,8)

ТУЭ-Х1

ДМФА 2,02й' 0,63±0,04; (3,7) 0,67±0,04; (3,0) 2,04±0,27; (14,9)

ТУЭ-ХЫ

ДМФА 0,8 0,51±0,02; (5,4) 0,54±0,02; (7,3) 3,66±0,36; (18,4)

1 — раствор модификатора; 2 — суспензия модификатора

Еох - потенциал окисления катализатора, зарегистрированный методом циклической вольтамперометрии;

Еюм - потенциал, при котором проводилась регистрация хроноамперометрического сигнала в присутствии мочевины.

Таблица 5

Проверка правильности определения мочевины с использованием ТУЭ, модифицированных выбранными комплексами никеля (II) методом «введено-найдено». (Введено 1 мМ мочевины; п = 5; Р = 0,95).

Растворитель Сшт,г/л Найдено: См±5, мМ s„ % R,%

ТУЭ-Н

дмсо 8,56<'> 0,97±0,08 9,7 97

ТУЭ-Ш

ДМФА 14,88(|) 0,97±0,07 7,9 97

ТУЭ-V

ДМФА 2,93w 1,00±0,01 1,7 _100

ТУЭ-Х1

ДМФА 2,02™ 1,03±0,02 9,6 103

ТУЭ-ХН

ДМФА 0,8г' 0,91±0,08 11,1 91

1 — раствор модификатора; 2 — суспензия модификатора

При использовании в качестве модификаторов остальных комплексов не было получено четких электрохимических откликов в присутствии мочевины.

2.4 Кинетика каталитического электрохимического окисления мочевины и

креатинина

На рис. 8 и 9 приведены циклические вольтамперограммы зарегистрированные с использованием ^модифицированного ТУЭ и ТУЭ, модифицированного комплексом III в отсутствии и в присутствии мочевины или креатинина соответственно.

Рис. 8 — Циклические вольтампе граммы, зарегистрированные на на дифицированном ТУЭ:

1 - в отсутствие мочевины в растворе,

2 - в присутствии 3 мМ мочевины в р творе,

инаТУЭ-Ш:

3 - в отсутствие мочевины в растворе,

4 - в присутствии 3 мМ мочевины в р творе.

Фон: 0,25М NaOH. Скорость развер потенциала 0,1 В/с

Отклик тока окисления мочевины или креатинина наблюдается только при использовании модифицированных комплексами ТУЭ, в частности,ТУЭ-Ш, что свидетельствует об электрокаталитическом окислении соответствующих аналитов.

Рис. 9 — Циклические вольтамперо-граммы, зарегистрированные на немоди-фицированном ТУЭ:

1 - в отсутствие креатинина в растворе,

2 - в присутствии 0,02 мМ креатинина в растворе,

инаТУЭ-Ш:

3 - в отсутствие креатинина в растворе,

4 - в присутствии 0,02 мМ креатинина в растворе.

Фон: 0,25М NaOH. Скорость развертки потенциала 0,1 В/с

Принимая во внимание, что соединения, содержащие аминогруппу, в процессе лектрохимического окисления образуют катион-радикалы1, процесс электрохимического каталитического окисления мочевины или креатинина можно представить следующей схемой:

ЩП)Ь ;-- N1(111)1, + е

т_

Ni(III) + R(R')NH

R(R')NH + Ni(II)

где R(R )NH2 — мочевина или креатинин, L — органический лиганд.

Кинетику электрохимического окисления мочевины и креатинина исследовали с использованием ТУЭ, модифицированных комплексом III в ДМФА

Изучена зависимость величины тока окисления катализатора (I, мкА) от скорости наложения потенциала (и, мВ/с) методом циклической вольтамперометрии на фоне 0,25 М NaOH. Линейная зависимость: I = 0,04хи + 0,25; R= 0,9997, указывает на то, что в электрохимическом процессе принимает участие электроактивное вещество, локализованное на поверхности ТУЭ. По всей видимости, этот процесс представляет собой процесс обратимого электрохимического окисления Ni (II)L/Ni (III)L.

Зависимость тока окисления мочевины (I, мкА) от обратного квадратного корня времени регистрации аналитического сигнала (t"0'5, с-0'5) в присутствии 1 мМ мочевины получена методом хроноамперометрии. Линейная зависимость в диапазоне времени регистрации аналитического сигнала от 30 до 70 секунд (I = 0,65* t'°5 + 0,25; R= 0,9971) подчиняется уравнению Коттрела. Это указывает на то, что процесс окисления мочевины лимитируется диффузией аналита из объема раствора. При исследовании процесса электрохимического окисления креатинина также получена линейная зависимость I от t'0,5.

Таким образом, можно предположить, что скорость процесса окисления исследуемых аминов лимитируется диффузией аналита к рабочей поверхности ТУЭ.

*Осетрова Н.В. Анодное окисление мочевины в нейтральных растворах /Н.В.Осетрова, A.M. Скундин //Электрохимия — 1994. Т. 30 № 10. — с. 1257-1259

2.5 Определение мочевины и креатинина с использованием модифицированных толстопленочных углеродсодержащих электродов

В таблице 6 приведены аналитические характеристики определения мочевины креатинина с использованием ТУЭ, модифицированных комплексами II, III, V, XI XII.

Таблица

Проверка правильности и аналитические характеристики хроноамперометрическог определения мочевины и креатинина с использованием ТУЭ, модифицировании выбранными органическими комплексами Ni (II). Фон: 0,25 М NaOH. (п =5, Р= 0,95

Электрод Самина» ММ sr, % R, % Уравнение регрессии, (1с„: цА; С: ^ мМ) г Диапазон концентрац мМ

Введено Найдено

Мочевина

ТУЭ-И 1 1,11±0,09 9,4 111 1=5,46><С + 9,08 0,9951 0,01-10,00

ТУЭ-Ш 1,09±0,09 8,5 109 1= 0,26хС +0,55 0,9991

ТУЭ-V 0,98±0,05 5,5 98 1= 18,71 хС + 20,62 0,9923

ТУЭ-Х1 0,85±0,12 6,7 85 1= 5,73 хС+9,57 0,9987

ТУЭ-Х11 [ 0,95±0,08 7.0 95 1=0,04хС +0,65 0,9947,

Креатинин

ТУЭ-П 0,5 0,54±0,09 13,6 108 1= 1,88хС + 0,38 0,9974 0,03- -0,51

1=1,45хС + 0,79 0,9877 0,03- -1,01

ТУЭ-Ш 0,58±0,20 27,7 116 1= 0,92хС + 0,12 0,9987 0,05- -0,5:

1= 0,72*С - 0,04 0,9544 0,03- -1,01

ТУЭ-V 0,46±0,04 7,8 92 1= 2,11 хС + 0,18 0,9972 0,03- -0,51

г — коэффициент корреляции

ТУЭ, модифицированные комплексом ХП, генерируют наименее выраженные (i представленной группы катализаторов) аналитические сигналы окисления мочевины диапазоне исследуемых концентраций аналита. Вероятно, это связано с частичны экранированием гептилфенильными заместителями Ni2+— центров катализатора < молекул мочевины.

Максимально близкие и воспроизводимые значения найденной добавки бьи получены при использовании ТУЭ, модифицированных комплексами II, III, V и XI.

Диапазон линейной зависимости аналитического сигнала от концентрат мочевины в случае указанных модифицированных ТУЭ составляет от 1,0x10" j 1,0*10"2 М. Предел обнаружения мочевины, равный 8,7-Ю"6 М (по Зс-критерию), ню предела обнаружения мочевины в сыворотке крови (Cmj„ = 2,0*10"4 М), полученно: при использовании стандартного ферментативного метода с применение колориметрического анализатора BUN/UREA Vitrous System (Johnson & Johnsc Великобритания).

При проведении электрохимического определения креатинина использовали ТУ модифицированные комплексами II, III, V, XI и XII. Известно, что каталитическ активность соединений никеля (И) в реакции электрохимического окислен; уменьшается при переходе от первичного к вторичному амину. Так как креатшп содержит иминогруппу, логично ожидать уменьшения электрокаталитического откл'

.исления креатинина для используемых модифицированных ТУЭ в сравнении с [ектрокаталитическим откликом при окислении мочевины. Действительно, в случае жменения модифицированных ТУЭ, на основе XI и XII, не были получены хорошо сраженные сигналы окисления креатинина.

Однако, в случае применения ТУЭ, модифицированных комплексами II, III и V, электрохимическом каталитическом окислении креатинина аналитический сигнал ■с аз алея достаточно выраженным, для его определения (табл. 6). При использовании сазанных модифицированных ТУЭ были получены оптимальные результаты гаксимально близкие и воспроизводимые значения найденной добавки). Диапазон шейности аналитического сигнала от концентрации креатинина составляет 5,0x10'5 э 1,0x10"3 М. Предел обнаружения, равный 2,7* 10"5 М, ниже минимального удержания креатинина в сыворотке крови взрослого здорового человека (4,4*10"5 М).

Линейная зависимость аналитического сигнала от концентрации креатинина с ээффициентом корреляции 0,999, а также низкий предел обнаружения подтверждают эзможность использования метода добавок для расчета концентрации креатинина в гальных объектах.

3. Селективное определение мочевины и креатинина с использованием

анионообмеиной колонки и полимеров с молекулярными отпечатками

креатинина.

Определение мочевины в модельных растворах, имитирующих сыворотку аови.

Для селективного выделения и концентрирования мочевины из модельного аствора использовали анионообменную колонку «НУРЕПЭЕР 1С-ОН» (производства Ме&оЬт», Швейцария). В качестве модельных использовали водные растворы гседующих веществ:

1) Мр1 — аланин (3,14-Ю"4 М), глицин (3,20-Ю"4 М), лейцин (1,87-10"4 М), спарагиновая кислота (0,22Т0'4 М), глутаминовая кислота (0,89Т0"4 М), глюкоза >,40Т0'3 М), аскорбиновая кислота (0,57-Ю"4 М), мочевая кислота (4,8Т0'4 М), реатинин (1,00-10'3 М);

2) Мр2, состав которого отличается от состава Мр1 содержанием мочевины, авным 5,00-10'3 М. Концентрации остальных веществ в Мр1 и Мр2 одинаковы.

Предварительно проводили регенерацию анионообменной колонки оследовательным пропусканием через колонку 10 мл 10%-го раствора ИаОН и 10 мл еионизированной воды. Затем, через колонку пропускали 2 мл модельного раствора 1р1 или Мр2 и проводили определение содержания мочевины в полученном фильтрате по описанной методике эксперимента. В качестве рабочих электродов использовали ТУЭ—П1.

Содержание мочевины в фильтрате после разделения компонентов модельных растворов Мр1 или Мр2 на анионообменной колонке составило (п=5; Р=0,95): (0,92±0,04)*10'3 М; Бг= 5,2% и (5,37±0,45)хЮ"3 М; 8Г= 9,6%, соответственно.

Согласно полученным результатам использование анионообменной колонки значительно повышает селективность определения мочевины в модельных растворах, имитирующих сыворотку крови. Таким образом, описанная методика является перспективной для хроноамперометрического определения мочевины в реальных объектах с использованием ТУЭ, модифицированных органическими комплексами никеля (II).

Определение мочевины в сыворотке крови.

Определение мочевины в реальном объекте (сыворотке крови) проводили предварительной регенерацией анионообменной колонки, как описано выше дл модельного раствора. Затем 0,1 мл сыворотки крови разбавляли 0,9 мл 0,9% раствор №С1. Полученный раствор пропускали через анионообменную колонку и проводил хроноамперометрическое определение мочевины в фильтрате. В качестве рабочи электродов использовали ТУЭ—III.

Таблица

Сравнительные результаты определения мочевины в сыворотке крови, полученные использованием разработанного сенсора (п= 5; Р= 0,95) и независимого метода*

№ Найдено, мМ С2/С„

Метод с применением уреазы* (СО ТУЭ-Ш (С2) %

1 13,3±0,2 12,4±0,7 93

2 4,8±0,1 5,3±0,6 109

3 2,30±0,04 2,3±0,3 99

4 4,0±0,1 4,0+0,2 100

* — стандартный уреазный метод (Vitros BUN/UREA Slide, Johnson&Johnson Clinic« Diagnostics, Inc.).

Результаты исследования сыворотки крови, полученные с применение; предлагаемого сенсора (таб.7), удовлетворительно согласуются с результатам! полученными с использованием стандартного уреазного метода.

Определение креатинина в модельных растворах, имитирующих сывороть крови.

С целью селективного определения креатинина в модельных раствора: исследовали синтезированные в Институте органического синтеза УрО РАН 3 образг ПМО креатинина:

1) на основе эпоксидной смолы (П1);

2) на основе сшитой дивинилбензолом акриловой кислоты (П2, ПЗ).

В случае П1 наблюдалось набухание в воде и частичное растворение в этаноле, случае П2 и ПЗ подобное не наблюдалось, поэтому эти полимеры были выбраны да дальнейших исследований. Отличие полимеров П2 и ПЗ друг от друга заключается мольном соотношении акриловая кислотажреатинин в предполимеризационно комплексе, которое для П2 составляет 4:1, а для ПЗ - 8:1.

Подготовка ПМО. Каждый полимер измельчили, и с помощью лабораторных а выделили фракцию с диаметром частиц от 40 до 80 мкм. Полученный порошок трижд промыли в ацетоне с последующим фильтрованием под вакуумом для удаления I прореагировавших мономеров;

Вымывание креатинина из структуры полимера провели при перемешиванк образцов П2 или ПЗ в смеси уксусная кислота/деионизированная вода (7/3 по объему с последующим промыванием деионизированной водой, несколько раз меш растворитель и фильтруя смесь под вакуумом. После сушки полимеров при 100° С последующего охлаждения образцы использовали в дальнейших исследованиях.

Регистрацию сигнала осуществляли методом хроноамперометрии предварительным циклированием потенциалов в интервале 0,0 — 0,8 В по методик

введенной в разделе «Методика эксперимента». В качестве рабочих электродов ¡пользовали ТУЭ-Ш.

Определение сорбционной способности полимера относительно креатинина

Эксперимент проводили следующим образом. В стакан вместимостью 25 мл эмещали полимер П2 или ПЗ. Затем добавляли 10 мл раствора креатинина с шцентрацией 0,10 М и перемешивали в течение 1 часа. Смесь фильтровали, мученный фильтрат анализировали на наличие креатинина электрохимическим етодом по разработанной методике. Содержание креатинина в фильтрате составило |,25±0,07)хЮ'1 М, 8Г=20,6%; п=3 в случае 112 и (0,26±0,07)х10"' М, 8Г=18,4%; п=3 в ¡учае ПЗ. Полимер промывали 10 мл этанола и сушили при 80 °С до полного лшрения этанола.

После сушки полимер помещали в стаканчик вместимостью 25 мл, добавляли ) мл деионизированной воды и выдерживали 1 час при интенсивном перемешивании леей. После фильтрования смеси на воронке Шотта проводили эоноамперометрическое определение креатинина в фильтрате но разработанной етодике. Содержание креатинина в полученном фильтрате составило (0,76±0,12)х10"' [, 8Г= 21,2%; п=3 в случае П2 и (0,82±0,12)хЮ"1 М, Йг=18,9%; п=3 в случае ПЗ.

Полученные результаты показывают, что выбранные ПМО сорбируют не менее 3-80 % креатинина.

Определение сорбционной способности полимера относительно креатинина в одельныхрастворах, имитирующих сыворотку крови

Для определения влияния основных компонентов сыворотки крови человека на глективность П2 и ПЗ использовали модельные растворы Мр1 и Мр2.

Определение селективности и сорбционной способности полимеров гносительно креатинина в модельных растворах проводили по следующей методике, 'олимер (П2 или ПЗ) помещали в стаканчик с мешалкой, вносили 2 мл модельного аствора и перемешивали 30 мин. Затем смесь фильтровали под вакуумом, промывали мл деионизированной воды и сушили при 75°С в течении 20 мин. Полимер ереносили в стаканчик с мешалкой, вносили 2 мл деионизированной воды, после еремешивания в течении 30 мин, фильтровали на воронке Шотта. Фильтрат сследовали на содержание креатинина по методике, приведенной в разделе «Методика ¡ссперимента». При использовании образца П2 найдено (п = 5; Р = 0,95): 1,45±0,28 мМ реатинина (Бг = 17,2%) и 1,53±0,35 мМ креатинина (8Г = 19,9%) при определении реатинина в Мр1 и Мр2 соответственно. При использовании образца ПЗ найдено 1 = 5; Р = 0,95): 1,43±0,30 мМ креатинина (8Г = 18,6%) и 1,55±0,34 мМ креатинина (8Г 19,2%) при определении креатинина в Мр1 и Мр2 соответственно.

Таким образом, полимеры П2 и ПЗ достаточно селективны к молекулам реатинина.

Кроме того, для выделения креатинина из модельных растворов могут быть также применены колонки заполненные ПМО креатинина. Схема проведения анализа на содержание креатинина методом хроноамперометрии представлена на рис. 10.

Модельный раствор

I

?

Определение содержания креатннпна методом хроноамперометрии

¡ЦК-

Рис. 10 — Схема проведения анализа на содержание креатинина метох;. хроноамперометрии. 1 — Сорбция креатинина (Кр) и удаление мешающего компоне! (МК) с помощью сорбционной колонки с ПМО. 2 — Десорбция креатинина (3 деионизированной водой.

Раствор исследуемого образца подаётся в сорбционную колонку, заполненную ПМО креатинина. В колонке происходит сорбция креатинина. Затем проводится выделение креатинина из структуры ПМО деионизированной водой и хроноамперометрическое определение этого биогенного амина в фильтрате с использованием модифицированного ТУЭ по алгоритму, описанному в разделе «Методика эксперимента».

ВЫВОДЫ

1. Методом обратных микроэмульсий синтезированы наночастицы N¡0 сферической формы, средний диаметр которых составляет порядка 20 нм. Лучшие вольтамперные характеристики и наиболее выраженная электрокаталитическая активность в электрохимическом окислении мочевины наблюдается при использовании образца наночастиц N¡0, синтезированных при 45°С с использованием ЦТАБ в качестве ПАВ. Получена линейная корреляция хроноамперометрического сигнала с концентрацией мочевины ( 11=0,9847, I = 0,011хС + 0,012; в случае ТУЭ-№0(0,10) и Я= 0,9531, I = 0,929хС + 1,472; в случае ТУЭ-№0(0,50)).

2. Сравнение ТУЭ и ТГЭ показало, что наилучшие результаты определения мочевины наблюдаются при использовании ТУЭ, на поверхность которого капельным способом нанесен органический комплекс № (II).

3. Выбраны оптимальные синтетические органические катализаторы на основе фторированных ди- и трикетонов, а также макрогетероциклических систем, модифицированных азагетероциклами: 1,1,1,7,7,7-гексафторгептан-2,4,6-трикетонат диникеля (II) тетрагидрат (II); 4,4,5,5,6,6,7,7,7-нонафтор-1-фенилгептан-1,3-дикетонат никеля (II) (III); [(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-(бензотиазол-2-иламино)-з-тетразин- ; то](ацетилацетонато) никель (II) (V); 4-тетрапиразинпорфиразин никеля (II) (XI) и 2,9,16,23-тетра(4-гептилфенил) тетрапиразинпорфиразин никеля (II) (XII). Найдена оптимальная концентрация никеля (II) на поверхности толстопленочного электрода для выбранных катализаторов (в пересчете на содержание № (И)): 8,56 г/л (ДМСО) в случае

.мплекса И; 14,88 г/л (ДМФА) в случае комплекса III; 2,93 г/л (ДМФА) в случае >млекса V, 2,02 г/л в случае комплекса XI и 0,81 г/л (ДМФА) в случае комплекса XII,

4. Электрокаталитическое окисление мочевины и креатинина происходит через адию образования каталитически активных частиц Ni (III), которые являются шьными окислителями. Лимитирующей стадией электрокаталитического окисления сазанных аминов является диффузия аналига к рабочей поверхности эдифицированного ТУЭ.

5. ТУЭ, модифицированные выбранными органическими комплексами Ni(Il), ¡пользованы для хроноамперометрического определения мочевины и креатинина. инейная зависимость аналитического сигнала от концентрации аналита наблюдается в ироком интервале концентраций: от 1 х 10"2 до 1><10"5 М для мочевины и от 1 * 10"3 до <10"5 М для креатинина. В случае модифицированных ТУЭ получены точные и «производимые результаты, а также низкий предел обнаружения (8,7* 10"6 М для эчевины и 2,7х 10"5 М для креатинина)

6. Разработан способ применения ПМО креатинина, позволяющий выделить не енее 70% креатинина из модельных растворов в режиме твердофазной экстракции.

7. Разработаны и успешно использованы бесферментные амперометрические :нсоры и методики определения мочевины в сыворотке крови и креатинина в одельных растворах, основанные на электрокаталитическом окислении зответствующих аналитов. Разработанные сенсоры не требуют особых условий эанения, обеспечивают устойчивость сигнала в течение длительного времени, просты

доступны в использовании. Хорошие аналитические и метрологические фактеристики ТУЭ, модифицированных органическими комплексами Ni (II), эзволяют применять указанные сенсоры и методики вместо используемых в тинической диагностике ферментативных методов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ:

1. Козицина А.Н. Каталитические системы на основе органических эмплексов никеля (II) в хроноамперометрическом определении мочевины и реатинина. /А.Н. Козицина, Ж.В. Шалыгина, С.С. Деденева, Г.Л. Русинов, С.Г. олщина, Е.В. Вербицкий, Х.З. Брайнина //Изв.АН, Сер.хим. — 2009. — № 6. — С. 091-1097

2. Kozitsina A.N. Electrochemical sensor based on metal-containing receptors for rea measurements /A.N. Kozitsina, Zh.V. Shalygina, S.S. Dedeneva, A.Z. Brainina, O.N. ¡hupakhin, V.N. Charushin, G.L. Rusinov, R.I. Ishmetova, E.V. Verbitsky, N.K. Ignatenko, .G. Tolshchina, O.V. Fedorova //International congress on analytical sciences ICAS-2006. loscow, Russia, 2006. —Book of abstracts, v. 1 —P. 291

3. Kozitsina A. Selection of catalytic systems for biomimetic sensors /А. Lozitsina, S. Dedeneva, Kh. Brainina, V. Charushin, O. Chupakhin, G. Rusinov // The 7th

Workshop on biosensors and bioanalytical (x-techniques in environmental and clinical analysis. Ka$adasi,Ti5rkiye, 2006. — Abstract Book — P. 115

4. Вербицкий E.B. Синтез производных мезо-тетрафенилпорфирината никеля (II) и исследование их взаимодействия с мочевиной. /Е.В.Вербицкий, М.С. Валова, О.В. Корякова, А.З. Брайнина, А.Н. Козицина, Ж.В. Шалыгина, С.С. Деденева, О.Н. Чупахин, В.Н. Чарушин, Г.Л. Русинов //Всеросс. научн. конф. «Природные макроциклические соединения и их синтетические аналоги». Сыктывкар, 2007. — Тез. докл. — с. 33-34

5. Глазырина Ю.А. Применение нанотехнологий в разработке биохимических сенсоров. /Ю.А. Глазырина, JI.B. Устинов, С.С. Деденева, А.Н. Козицин

A.З. Брайнина //Научн.-практич. конф. «Электрохимические методы анализа в контро. и производстве». Томск, 2007. — Тез. докл. — с. 48-49

6. Козицина А.Н. Комплексы никеля (И) - катализаторы амперометрическом определении креатинина. /А.Н. Козицина, Ж.В. Шалыгиь С.С. Деденева, Х.З. Брайнина //VII Всеросс.. конф. по электрохим. методам анализа междун. участием «ЭМА-2008», Уфа-Абзаково, 2008. — Тез. докл. — с. 53

7. Козицина А.Н. Применение наночастиц NiO в хроноамперометрическс определении креатинина. /А.Н. Козицина, С.С. Деденева, Ю.А. Квашнин, Г.Л. Русинс

B.Н. Чарушин, Х.З. Брайнина //Третья Всеросс. конф. по наноматериалам «HAHl 2009». Екатеринбург, 2009 — Тез. докл. — с. 830-831

8. Деденева С.С. Хроноамперометрическое определение креатинина использованием наночастиц NiO как катализаторов. /С.С. Деденева, А.Н. Козицир Ю.А. Квашнин, Г.Л. Русинов, В.Н. Чарушин, Х.З. Брайнина //III Всероссийск конференция с междун. участием «Аналитика России». Краснодар, 2009. — Тез. до» — С. 388.

Подписано в печать 06.04.2010. Формат бумаги 60 х 84 '/и. Бумага офсетная. Печать плоская. Печ. л. 1,5. Заказ 259. Тираж 130 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в подразделении оперативной полиграфии Уральского государственного экономического университета 620144, Екатеринбург, ул. 8 Марта/Народной воли, 62/45

Сокращения.

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Методы определения мочевины и креатинина в биологических жидкостях.

1.1.1. Оптические методы определения мочевины и креатинина в лабораторной диагностике.

1.1.2. Электрохимические методы определения мочевины и креатинина.

1.2. Катализаторы электрохимического окисления органических соединений на основе соединений никеля (II).

1.3. Полимеры с молекулярными отпечатками. Синтез и применение в анализе органических соединений.

1.3.1. Технология получения полимеров с молекулярными отпечатками.

1.3.2 Применение полимеров с молекулярными отпечатками в сенсорных устройствах.

1.3.3. Полимеры с молекулярными отпечатками и рецепторы креатинина и мочевины.

1.4. Постановка задачи.

Глава 2 Аппаратура и техника эксперимента.

2.1. Оборудование и средства измерений.

2.2. Реактивы и приготовление растворов.

2.3.Методика эксперимента.

Глава 3. Исследование каталитической активности наночастиц NiO.

3.1 Выбор метода синтеза наночастиц NiO.

3.2 Электронно-микроскопические и энергодисперсионные исследования наночастиц NiO.

3.2.1 Электронно-микроскопические исследования наночастиц NiO, синтезированных с использованием ЦТАБ в качестве ПАВ.

3.2.2 Электронно-микроскопические исследования наночастиц NiO, синтезированных с использованием АОТ в качестве ПАВ.

3.2.3 Энергодисперсионный и рентгенофазовый анализ наночастиц NiO.

3.2.4 Растровая электронная микроскопия наночастиц NiO, нанесенных на рабочую поверхность ТУЭ.

3.3 Каталитические и сенсорные свойства наночастиц NiO при электрохимическом окислении мочевины.

Глава 4 Органические катализаторы электрохимического окисления мочевины и креатинина.

4.1. Выбор материала толстопленочного электрода.

4.2. Выбор способа иммобилизации катализатора.

4.3. Выбор каталитической системы для электрохимического окисления мочевины и/или креатинина.

4.3.1 Комплексы никеля (II) с фторированными кетонами (группа 1).

4.3.2 Комплексы никеля (II) с производными 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-з-тетразина (группа 2).

4.3.3 Комплексы никеля (II) с производными вициналъных диаминов (группа 3)

4.3.4 Комплексы никеля (II) с производными порфирина (группа 4).

4.4. Кинетика каталитического электрохимического окисления мочевины и креатинина.

4.5. Определение мочевины и креатинина с использованием модифицированных толстопленочных углеродсодержащих электродов.

Глава 5. Селективное определение мочевины и/или креатинина в модельных растворах.

5.1. Селективное определение мочевины с использованием анионообменной колонки.

5.2 Селективное определение креатинина с использованием ПМО.

Выводы.

Актуальность темы. Решения, связанные с охраной здоровья населения и ранней диагностикой заболеваний требуют развития новых и эффективных методов определения компонентов биологических жидкостей — маркеров функционирования органов и систем человеческого организма.

При ряде заболеваний, сопровождающихся нарушением работы почек, может возникнуть острая почечная недостаточность, ранняя диагностика которой способствует своевременному оказанию медицинской помощи и уменьшает риск развития хронической или тяжелой форм заболевания. Общепризнанными диагностическими показателями функциональной способности почек являются содержание креатинина и мочевины в сыворотке крови и в моче, так как именно в почках происходит выделение азотистых компонентов крови.

В современной лабораторной диагностике для мониторинга заболеваний почек используются фотометрические приборные методы, в которых в качестве распознающего элемента чаще всего применяются ферменты.

Для определения мочевины используют прямые фотометрические методы, основанные на реакции мочевины с диацетилмонооксимом или каталитической реакции с уреазой. Фотометрическое определение креатинина, как правило, основано на реакции Яффе или, крайне редко, на реакции ферментативного гидролиза под действием креатинингидролазы с использованием автоанализаторов. Чувствительность используемых методов зависит от устойчивости окраски анализируемых комплексов, собственной окраски исследуемого образца, устойчивости ферментов при хранении и эксплуатации, действия высоких и низких температур, бактериальных загрязнений и т.д. Как следствие, сложность методики анализа, а также высокая стоимость оборудования и расходных материалов исключают повсеместное проведение лабораторной диагностики почечной недостаточности, в частности в небольших клиниках.

Для решения проблемы требуется создание новых экспрессных, чувствительных и селективных методов и сенсоров для диагностики почечной недостаточности, исключающих применение ферментов.

Высокая чувствительность и селективность, оперативность получения результата, возможность работы в полевых условиях, относительная простота и доступность аппаратурного оформления позволяют предложить для определения мочевины и креатинина электрохимические методы анализа.

Настоящая диссертационная работа посвящена развитию новых подходов к созданию бесферментных амперометрических сенсоров для определения мочевины и креатинина с использованием в качестве чувствительного элемента наночастиц NiO или макроциклических комплексов никеля (И). В качестве селективного элемента сенсорного устройства используются либо анионообменная колонка (в случае мочевины), либо полимеры с молекулярными отпечатками (в случае креатинина). Разработанный сенсор не уступает по чувствительности и селективности ферментсодержащим биосенсорам и лишен недостатков последних.

Актуальность представленной работы определяется как изложенными выше соображениями, так и ожидаемым упрощением и удешевлением методики и аппаратурного обеспечения в диагностике почечной дисфункции.

Работа является частью исследований, проводимых на кафедре химии и, с сентября 2008 г., кафедре физики и химии Уральского государственного экономического университета по следующим направлениям: РФФИ-офи «Молекулярный дизайн металлсодержащих рецепторов биогенных аминов на основе макрогетероциклических систем, модифицированных азагетероциклами и создание на их основе бесферментных сенсоров» (20062007 гг.), РФФИ-Урал «Электродные процессы в системах: электродметаллсодержащий рецептор биогенных аминов — определяемый амин» (2007-2009 гг.), в рамках заданий Министерства промышленности и науки Свердловской области «Нанотехнологии в био- и химических сенсорах для мониторинга окружающей среды и здоровья человека» (2008-2010 гг.)

Цель работы. Разработка бесферментных амперометрических сенсоров для прямого и селективного определения мочевины и креатинина на основе наночастиц NiO и хелатных комплексов никеля (II) как каталитических систем электрохимического окисления указанных аналитов, а также полимеров с молекулярными отпечатками (ПМО) креатинина, определяющих селективность определения.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи: выбрать оптимальный метод синтеза наночастиц NiO и исследовать влияние размера и способа иммобилизации полученных наночастиц на поверхности толстопленочного углеродсодержащего электрода на каталитическую активность электрохимического окисления мочевины и/или креатинина; выбрать материал толстопленочного электрода и способ иммобилизации каталитической системы на основе органических комплексов никеля (II) на рабочую поверхность толстопленочного электрода; изучить каталитические системы на основе органических комплексов никеля (II), способных генерировать воспроизводимый аналитический отклик в присутствии определяемого аналита; исследовать кинетику электрохимического каталитического окисления мочевины и креатинина в присутствии каталитической системы; охарактеризовать рабочие условия регистрации аналитического сигнала в присутствии определяемого аналита; исследовать способность полимеров с молекулярными отпечатками креатинина к селективной сорбции молекул креатинина из модельных растворов разработать новые сенсоры для хроноамперометрического определения мочевины и креатинина с высокими аналитическими и метрологическими характеристиками.

Научная новизна.

Методом обратных микроэмульсий синтезированы наночастицы NiO сферической формы, средний диаметр которых составляет порядка 20 нм. Наиболее выраженная электрокаталитическая активность в электрохимическом окислении мочевины наблюдается при использовании образца наночастиц NiO, синтезированных при 45°С с использованием цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ) в качестве ПАВ.

Установлен рост каталитической активности наночастиц NiO в электрохимическом окислении мочевины при увеличении содержания наночастиц в модифицирующей суспензии до 0,5 г/л (в пересчете на содержание Ni (И)). Выше этого значения наблюдается снижение каталитической активности из-за ускорения процессов агломериции наночастиц и фазовых изменений. Получена линейная зависимость тока, регистрируемого при заданном потенциале, от концентрации мочевины в диапазоне концентраций аналита от 1-Ю"3 М до 8-10"3 М при использовании толстопленочных электродов, модифицированных наночастицами NiO; в качестве каталитических систем в электрохимическом окислении мочевины и креатинина использованы органические комплексы никеля (И), способные к дополнительной координации с молекулами аналита, что позволило увеличить чувствительность определения указанных аналитов. Из 16-ти исследованных органических комплексных соединений никеля (И) лучшие аналитические характеристики при электрохимическом определении мочевины и креатинина были получены для пяти органических комплексов Ni (II): 1,1,1,7,7,7-гексафторгептан-2,4,6-трикетоната диникеля (И) тетрагидрата (II); 4,4,5,5,6,6,7,7,7-нонафтор-1 -фенилгептан-1,3 -дикетоната никеля (И) (III); [(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-(бензотиазол-2-иламино)-з-тетразинато](ацетилацетонато) никеля (II) (V); 4-тетрапиразинпорфиразина никеля (II) (XI) и 2,9,16,23-тетра(4-гептилфенил) тетрапиразинпорфиразина никеля (И) (XII); показано, что процесс электрохимического окисления мочевины или креатинина на модифицированных органическими комплексами толстопленочных углеродсодержащих электродах (ТУЭ) является каталитическим и лимитируется процессом диффузии аналита к поверхности ТУЭ; сопоставлены каталитические и метрологические характеристики ТУЭ, модифицированных наночастицами NiO или комплексами никеля (II). Определено, что на каталитическую активность модификаторов влияют: природа лиганда и растворителя, а также содержание Ni (II) в модифицирующих суспензиях или растворах; изучена возможность селективного определения мочевины в реальных образцах с использованием анионообменной колонки и креатинина в модельных растворах с использованием синтезированых ПМО креатинина;

Практическая ценность работы.

Разработанные бесферментные амперометрические сенсоры на основе толстопленочных электродов, модифицированных соединениями никеля (II), и анионообменной колонки или ПМО креатинина, позволяют ускорить и удешевить определение мочевины и/или креатинина в биологических объектах (сыворотке крови) при диагностике почечной дисфункции по сравнению с используемыми в клинической диагностике методами.

Автор выносит на защиту следующие положения. Результаты исследования влияния условий синтеза наночастиц NiO на их каталитические свойства в электроокислении мочевины и креатинина

Способы получения сенсоров на основе углеродсодержащих чернил или графитэпоксидной композиции с иммобилизованными органическими комплексами Ni (II). Информацию о факторах, влияющих на вольтамперные характеристики модифицированных толстопленочных электродов

Результаты исследования электрохимического поведения катализаторов (наночастиц NiO и органических комплексов никеля (II)), иммобилизованных на поверхности толстопленочных электродов. Информацию о факторах, влияющих на вольтамперные характеристики катализаторов и генерируемый ими аналитический сигнал.

Выбор каталитической системы для электрохимического окисления мочевины и креатинина. Оптимальные условия регистрации максимального каталитического эффекта. Результаты исследования способности полимеров с молекулярными отпечатками креатинина к специфическому связыванию указанного аналита.

Методики определения мочевины и креатинина на разработанных сенсорах.

Апробация работы.

Результаты исследований представлены на Международном конгрессе по аналитическим наукам ICAS-2006 (Москва, Россия, 2006 г.); на 7 Семинаре «Биосенсоры и биоаналитические (^-технологии в анализе окружающей среды и клинических анализах» (Кашадаси, Турция, 2006 г.); на Всероссийской научной конференции «Природные макроциклические соединения и их синтетические аналоги» (Сыктывкар, Республика Коми, 2007 г.); на Научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве» (Томск, Россия, 2007 г.); на VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА-2008» (Уфа, Башкортостан, 2008 г.); на третьей всероссийской конференции по наноматериалам «НАНО-2009» (Екатеринбург, Россия, 2009 г); на III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, Россия, 2009 г.)

Основное содержание работы представлено в виде 1 статьи в журнале, рекомендованном ВАК, и тезисов 7 докладов на международных и всероссийских конференциях

Выражаю искреннюю благодарность: научному руководителю д.х.н., профессору Брайниной Х.З.; научному консультанту к.х.н., доценту кафедры аналитической химии Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н. Ельцина Козициной А.Н.; директору института органического синтеза УрО РАН, зав. лаборатории гетероциклических соединений (ГС), академику РАН Чарушину В.Н.; научному руководителю лаборатории ГС, академику РАН Чупахину О.Н.; сотрудникам лаборатории ГС: д.х.н., в.н.с. Филяковой В.И.; к.х.н., в.н.с. Русинову Г.Л.; к.х.н., н.с. Болтачевой Н.С.; к.х.н., н.с. Вербицкому Е.В; м.н.с. Толщиной С.Г., м.н.с. Игнатенко Н.К.; к.х.н., с.н.с. Ишметовой Р.И.; к.х.н., н.с. Плеханову П.В.; К.Х.Н., с.н.с. ЧижовуД.Л. за предоставление органических комплексов никеля (II) и образцов ПМО креатинина; к.т.н., м.н.с. лаборатории структурного анализа и свойств материалов и наноматериалов при кафедре термообработки и физики металлов Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н. Ельцина Юровских А.С. за проведение ПЭМ, РЭМ и энергодисперсионных исследований наночастиц NiO; зав. лабораторным отделением ГУЗ СО «Клинико-диагностического центра «Кардиология» г. Екатеринбурга, к.м.н. Ослиной В.П. за предоставление образцов сывороток крови и данных биохимического анализа.

Выводы

1. Методом обратных микроэмульсий синтезированы наночастицы NiO сферической формы, средний диаметр которых составляет порядка 20 нм. Лучшие вольтамперные характеристики и наиболее выраженная электрокаталитическая активность в электрохимическом окислении мочевины наблюдается при использовании образца наночастиц NiO, синтезированных при 45°С с использованием ЦТАБ в качестве ПАВ. Получена линейная корреляция хроноамперометрического сигнала с концентрацией мочевины ( R=0,9847, I = 0,011><С + 0,012; в случае ТУЭ-Ni0(0,10) и R= 0,9531,1 = 0,929хС + 1,472; в случае ТУЭ-№0(0,50)).

2. Сравнение ТУЭ и ТГЭ показало, что наилучшие результаты определения мочевины наблюдаются при использовании ТУЭ, на поверхность которого капельным способом нанесен органический комплекс Ni (II).

3. Выбраны оптимальные синтетические органические катализаторы на основе фторированных ди- и трикетонов, а также макрогетероциклических систем, модифицированных азагетероциклами: 1,1,1,7,7,7-гексафторгептан-2,4,6-трикетонат диникеля (II) тетрагидрат (И); 4,4,5,5,6,6,7,7,7-нонафтор-1-фенилгептан-1,3-дикетонат никеля (II) (III); [(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-(бензотиазол-2-иламино)-з-тетразинто](ацетилацетонато) никель (II) (V); 4-тетрапиразинпорфиразин никеля (II) (XI) и 2,9,16,23-тетра(4-гептилфенил) тетрапиразинпорфиразин никеля (И) (XII). Найдена оптимальная концентрация никеля (И) на поверхности толстопленочного электрода для выбранных катализаторов (в пересчете на содержание Ni (II)): 8,56 г/л (ДМСО) в случае комплекса II; 14,88 г/л (ДМФА) в случае комплекса III; 2,93 г/л (ДМФА) в случае комлекса V, 2,02 г/л в случае комплекса XI и 0,81 г/л (ДМФА) в случае комплекса XII,

4. Электрокаталитическое окисление мочевины и креатинина происходит через стадию образования каталитически активных оксо-гидроксо-частиц Ni (III), которые являются сильными окислителями. Лимитирующей стадией электрокаталитического окисления указанных аминов является диффузия аналита к рабочей поверхности модифицированного ТУЭ.

5. ТУЭ, модифицированные выбранными органическими комплексами Ni (II), использованы для хроноамперометрического определения мочевины и креатинина. Линейная зависимость аналитического сигнала от концентрации аналита наблюдается в широком интервале концентраций: от 1x10"2 до 1x10"5 М для мочевины и от 1><10"3 до ЗхЮ"5 М для креатинина. В случае модифицированных ТУЭ получены точные и воспроизводимые результаты, а также низкий предел обнаружения (8,7x10"6 М для мочевины и 2,7хЮ"5М для креатинина)

6. Разработан способ применения ПМО креатинина, позволяющий выделить не менее 70% креатинина из модельных растворов в режиме твердофазной экстракции.

7. Разработаны и успешно использованы бесферментные амперометрические сенсоры и методики определения мочевины в сыворотке крови и креатинина в модельных растворах, основанные на электрокаталитическом окислении соответствующих аналитов. Разработанные сенсоры не требуют особых условий хранения, обеспечивают устойчивость сигнала в течение длительного времени, просты и доступны в использовании. Хорошие аналитические и метрологические характеристики ТУЭ, модифицированных органическими комплексами Ni (II), позволяют применять указанные сенсоры и методики вместо используемых в клинической диагностике ферментативных методов.

1. В.Г. Кобл, B.C. Камышников. Клиническая биохимия. / Пособие для врачей-лаборантов. .Изд.: «Беларусь».— 1976. 312 с.

2. В.В. Слепышева, М.Д. Балябина, А.В. Козлов. Методы определения мочевины. // Terra Medica Nova. 2007. Т. 16. № 4 URL http://www.terramedica. spb.ru (дата обращения: 18.01.2010)

3. Schurman S.J. Plasma creatinine results derived from an endpoint modification of the Jaffe method. / S.J. Schurman, Sh.A. Perlman, W. Chamizo. //Pediatr. Nephrol. 1998. V. 12. - p. 414-416

4. А.Я. Любина, JI.П. Ильичева, Т.В. Катасонова, С.А. Петросова. Клинические лабораторные исследования. М.: Медицина. — 1984, 288 с.

5. Lee W.-Y. Sol-gel-derived thick-film conductometric biosensor for urea determination in serum. / W.-Y. Lee, S.-R. Kim, T.-H. Kim, K.Sh. Lee, M.-Ch. Shin, Je-K. Park. // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 404. - p. 195-203

6. Lee W.-Y. Microfabricated conductometric urea biosensor based on sol-gel immobilized urease. / W.-Y. Lee, K.Sh. Lee, T.-H. Kim, M.-Ch. Shin, Je-K. Park. // Electroanalysis. 2000. V. 12. № 1. - p. 78-82

7. Streinschaden A. Miniaturized thin film conductometric biosensors with high dynamic range and high sensitivity. / A. Streinschaden, D. Adamovic, G. Jobst, R. Glatz, G. Urban. // Sens. Actuators. В 1997. V. 44. - p. 365-369

8. Walcerz J. Potentiometric enzyme electrode in flow injection system for the determination of urea in human serum samples. / J. Walcerz, S. Gl^b, R. Koncki. // Anal. Chim. Acta 1998. V. 369. - p. 129-137

9. Magalhaes J.M.C.S. Urea potentiometric biosensor based on urease immobilized on chitosan membranes. / J.M.C.S. Magalhaes, A.A.S.C. Machado. // Talanta 1998. V. 47. - p. 183-191

10. Wang J.-Qi. pH-Based potentiometrical flow injection biosensor for urea. / J.-Qi Wang, J.-Ch. Chou, T.-P. Sun, Sh.-K. Hsiung, G.-B. Hsiung. // Sens. Actuators. В 2003. V. 91. - p. 5-10

11. Eggenstein C. Potentiometric biosensor in double matrix membrane technology. / C. Eggenstein, M. Borchardt, Ch. Dumschat, B. Griindig, K. Cammann, M. Knoll, F. Spener, M. Knoll // Biosens. Bioelectronics. 1995. V. 10. - p. 595-600

12. Seki A. Biosensors based on light- addressable potentiometric sensors for urea, penicilline and glucose. / A. Seki, S.-I. Ikeda, I. Kubo, I. Karube. // Anal. Chim. Acta 1998. V. 373. - p. 9-13

13. Stred'ansky M. Amperometric pH-sensing biosensors for urea, penicillin and oxalacetate. / M. Stred'ansky, A. Pizzariello, S.Stred'anska, S. Miertus. // Anal. Chim. Acta 2000. V. 415. - p. 151-157

14. Bertocchi P. Amperometric ammonium ion and urea determination with enzyme-based probes. / P. Bertocchi, D. Compagnone, G. Palleschi. // Biosens. Bioelectronics. 1996. V. 11. №. 1/2. - p. 1-10

15. Osborne M.D. The liquid-liquid micro-interface for the amperometric detection of urea. / M.D. Osborne, H. Girault. // Electroanalysis 1995. V. 7. №8. -p. 714-721

16. Henze G. Determination of the phenylurea herbicidelinuron and its metabolites in environmental samples by HPLC with serial ultraviolet and amperometric detection. / G. Henze, A. Meyer, J. Hausen. // Fresenius J. Anal. Chem. 1993. V. 346. - p. 761-765

17. Vostiar I. Amperometric urea biosensor based on urease and electropolymerized toluidine blue dye as a pH-sensitive redox probe. / I. Vostiar, J. Tkac, E. Sturdik, P. Gemeiner. // Bioelectrochem. 2002. V. 56. -pp.113-115

18. A. Pizzariello. Urea biosensor based on amperometric pH-sensing with hematein as a pH-sensitive redox mediator. / A. Pizzariello, M. Stred'ansky, S. Stred'anska, S. Miertus. // Talanta 2001. V. 54. - p. 763-772

19. Yoneyama K. Amperometric sensing system for the detection of urea by a combination of the pH- state method and flow injection analysis. / K. Yoneyama, Yu. Fujino, T. Osaka, I. Satoh. // Sens. Actuators. В 2001. V. 76. -p. 152-157

20. Mizutani F. Voltammeric enzyme sensor for urea using mercaptohydroquinone modified gold electrode as the base transducer. / F. Mizutani, S. Yabuki, Yu. Sato. // Biosens. Bioelectronics. 1997. V. 12. № 4. -p. 321-328

21. Kazanskaya N. FET-based sensors with robust photosensitive polymer membranes for detection of ammonium ions and urea. / N. Kazanskaya, K. Kukhtin, M. Manenkova, N. Reshetilov, L. Yarisheva, O. Arzhakova, A.

22. Volynskii, N. Bakeyev. // Biosens. Bioelectronics. 1996. V. 11. № 3. - p. 253-261

23. Chen J.-Ch. Portable urea biosensor based on the extended-gate field effect transistor. / J.-Ch. Chen, J.-Ch. Chou, T.-P. Sun, Sh.-K. Hsuing. // Sens. Actuators. В 2003. V. 91. - p. 180-186

24. Rebriiev A.V. Enzymatic biosensor based on the ISFET and photopolymeric membrane for the determination of urea. / A.V. Rebriiev, N.F. Starodub. // Electroanalysis 2004. V. 16. № 22. - p. 1891-1895

25. Soldatkin A.P. A novel urea sensitive biosensor with extended dynamic range based on recombinant urease and ISFETs. / A.P. Soldatkin, J. Montoriol, W. Sant, C. Martelet, N. Jaffrezic-Renault. // Biosens. Bioelectronics. 2003. V. 19.-p. 131-135

26. Sant W. Development of chemical field effect transistors for the detection of urea. / W. Sant, M.L. Pourciel, J. Launay, T. Do Conto, A. Martinez, P. Temple-Boyer. // Sens. Actuators. В 2003. V. 95. - p. 309-314

27. Pijanowska D.J. pH-ISFET based urea biosensor. / D.J. Pijanowska, W. Torbicz. // Sens. Actuators. В 1997. V. 44. - p. 370-376

28. Walcerz I. Enzyme biosensors for urea determination based on an ionophore free pH membrane electrode. / I. Walcerz, R. Koncki, E. Leszczynska, S. Glqb. // Anal. Chim. Acta 1995. V. 315. - p. 289-296

29. Kanungo M. Studies on polymerization of aniline in the presence of sodium dodecyl sulfate and its application in sensing urea. / M. Kanungo, A. Kumar, A.Q. Contractor. // J. Electroanal. Chem. 2002. V. 528. - p. 46-56

30. Osaka T. High-sensitivity urea sensor based on the composite film of electroinactive polypyrrole with polyion complex. / T. Osaka, Sh. Komaba, M. Seyama, K. Tanabe. // Sens. Actuators. В 1996. V. 35-36. - p. 463-469

31. Jimenez C. Use of photopolymerizable membranes based on polyacrylamide hydrogels for enzymatic microsensor constraction. / C. Jimenez, J. Bartrol, N.F. de Rooij, M. Koudelka-Hep. // Anal. Chim. Acta 1997. V. 351. - p. 169-176

32. Komaba Sh. Potentiometric biosensor for urea based on electropolymerized elecrtoinactive polypyrrole. / Sh. Komaba, M. Seyama, T. Momma, T. Osaka. // Electrochim. Acta 1997. V. 42. № 3. - p. 383-388

33. Adeloju S.B. Pulsed-amperometric detection of urea in blood samples on a conducting polypyrrole-urease biosensor. / S.B. Adeloju, S.J. Shaw, G.G. Wallace. // Anal. Chim. Acta 1997. V. 341. - p. 155-160

34. Tinkilic N. Glucose and urea biosensors based on all solid-state PVC-NH2 membrane electrodes. / N. Tinkilic, O. Cubuk, I. Isildak. // Anal. Chim. Acta -2002. V. 452. p. 29-34

35. Hamlaoui M.L. Development of urea biosensor based on a polymeric membrane including zeolite. / M.L. Hamlaoui, K. Reybier, M. Marrakchi, N. Jaffrezic-Renault, C. Martelet, R. Kherrat, A. Walcarius. // Anal. Chim. Acta -2002. V. 466. p. 39-45

36. Schneider J. Hydrogel matrix for three enzyme entrapment in creatine/creatinine amperometric biosensing. / J. Schneider, B. Griindig, R. Renneberg, K. Camman, M.B. Madaras, R.P. Buck, K.-D. Vorlop. // Anal. Chim. Acta 1996. V. 325. - p. 161-167

37. Erlenkotter A. Biosensors and flow-through system for the determination of creatinine in hemodialysate. / A. Erlenkotter, M. Fobker, G.-Ch. Chemnitius. // Anal. Bioanal. Chem. 2002. V. 372. - p. 284-292

38. Walsh D.A. Comparison of electrochemical, electrophoretic and spectrophotometric methods for creatinine determination in biological fluids. / D.A. Walsh, E. Dempsey. // Anal. Chim. Acta 2002. V. 459. - p. 187-198

39. Shih Y.-T. A creatinine deiminase modified polyaniline electrode for creatinine analysis. / Y.-T. Shih, H.-J. Huang. // Anal. Chim. Acta 1999. V. 392.-p. 143-150

40. Madaras M.B. Microfabricated amperometric creatine and creatinine biosensors. / M.B. Madaras, I.C. Popescu, S. Ufer, R.B. Buck. // Anal. Chim. Acta 1996. V. 319. - p. 335-345

41. Kim E.J. Disposable creatinine sensor based on thick-film hydrogen peroxide electrode system. / E.J. Kim, T. Haruyama, Ya. Yanagida, E. Kobatake, M. Aizawa. // Anal. Chim. Acta 1999. V. 394. - p. 225-231

42. Khan G.F. A highly sensitive amperometric creatinine sensor. / G.F. Khan, W. Wernet. //Anal. Chim. Acta 1997. V. 351. - p. 151-158

43. Яковлева Г.Е. Ферменты в клинической биохимии.—Новосибирск: «Вектор-Бест», 2005. — 44 с.

44. Sirko A. Plant ureases: Roles and regulations. / A. Sirko, R. Brodzik// Acta Biochim. Polonica. 2000. V. 47. № 4. - p. 1189-1195

45. Mobley H.L.T. Molecular biology of microbial ureases. / H.L.T. Mobley, M.D. Island, R.P. Hausinger // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. № 3. -p. 451480

46. Beuth B. Crystal structure of creatininase from Pseudomonas putida: a novel fold and a case of convergent evolution. / B. Beuth, K. Niefind, D. Schomburg. // J. Mol. Biol. 2003. V. 332. № 1. - p. 287-301

47. Casella I.G. Amperometric determination of underivatized amino acids at a nickel-modified gold electrode by anion-exchange chromatography. / I.G.

48. Casella, M. Gatta, T.R.I. Cataldi. // J. Chromatogr. A 2000. V. 878. - p. 5767

49. Fleischmann M. The oxidation of organic compounds at a nickel anode in alkaline solution. / M. Fleischmann, K. Korinek, D. Pletcher. // J. Electroanal. Chem. 1971. V. 31.-p. 39-49

50. El-Shafei A.A. Electrocatalytic oxidation of methanol at a nickel hydroxide/glassy carbon modified electrode in alkaline medium. / A.A. El-Shafei. // J. Electroanal. Chem. 1999. V. 471. - p. 89-95

51. Давлетшина JI.H. Анодная вольтамперометрия биологически активных веществ на электродах, модифицированных гексацианометаллатами: Автореф. дис. канд. хим. наук.— Казань, 2006. — 26 с.

52. Ciszewski A. Kinetics of electrocatalytic oxidation of formaldehyde on a nickel porphyrin-based glassy carbon electrode. / A. Ciszewski, G. Milczarek // J. Electroanal. Chem. 1999. V. 469. - p. 18-26

53. Ferrer S.J. Amperometric detection of urea in aqueous solution by poly (Ni-cyclam) film-modified glassy carbon electrode. / S.J. Ferrer, S.G. Granados, F. Bedioui, A.A. Ordaz. // Electroanalysis 2003. V. 15. № 1. - p. 70-73

54. Liu Y. Nonenzymatic glucose sensor based on renewable electrospun Ni nanoparticle-loaded carbon nanofiber paste electrode. / Y. Liu, H. Teng, H. Hou, T You. // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 24. - p. 3329-3334

55. Noorbakhsh A. Amperometric detection of hydrogen peroxide at nano-nickel oxide/thionine and celestine blue nanocomposite-modified glassy carbon electrodes. / A. Noorbakhsh, A. Salimi // Electrochim. Acta 2009. V. 54. - p. 6312-6321

56. Salimi A. Direct electrochemistry and electrocatalytic activity of catalase immobilized onto electrodeposited nano-scale islands of nickel oxide. // A.

57. Salimi, E. Sharifi, A. Noorbakhsh, S. Soltanian // Biophys. Chem. 2007. V. 125.-p. 540-548

58. Salimi A. Immobilization of glucose oxidase on electrodeposited nickel oxide nanoparticles: Direct electron transfer and electrocatalytic activity. / A. Salimi, E. Sharifi, A. Noorbakhsh, S. Soltanian // Biosens. Bioelectron. -2007. V. 22.-p. 3146-3153

59. Дмитриенко С.Г. Использование полимеров с молекулярными отпечатками в процессах разделения и концентрирования органических соединений. / С.Г. Дмитриенко, В.В. Ирха, А.Ю. Кузнецова, Ю.А. Золотов. //Журн. анал. хим. 2004. Т. 59. № 9. - с. 902-912

60. Kugimiya A. Synthesis of castasterone selective polymers prepared by molecular imprinting. / A. Kugimiya, J. Matsui, H. Abe, M. Aburatani, T. Takeuchi. // Anal. Chim. Acta 1998. V. 365. - p. 75-79

61. Leung M.K.P. Molecular sensing of 3-chloro-1.2-propanediol by molecular imprinting. / M.K.P. Leung, B.K.W. Chiu, M.H.W. Lam. // Anal. Chim. Acta -2003. V. 491.-p. 15-25

62. Гендриксон О.Д. Молекулярно импринтированные полимеры и их применение в биохимическом анализе. / О.Д. Гендриксон, А.В. Жердев, Б.Б. Дзантиев. // Успехи биол. хим. 2006. Т. 46. - с. 149-192

63. Г.В. Лисичкин. Материалы с молекулярными отпечатками: синтез, свойства, применение. / Г.В. Лисичкин, Ю.А. Крутяков // Успехи химии -2006. Т. 75. № 10. с. 998-1017

64. Andersson L.I. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field. // J. Chromatogr. В 2000. V. 745. - p. 3-13

65. Martin-Esteban A. Molecularly imprinted polymers: new molecular recognition materials for selective solid-phase extraction of organic compounds. //Fresenius J. Anal. Chem. 2001. V. 370. - p. 795-802

66. Yan H. Characteristic and synthetic approach of molecularly imprinted polymer. / H. Yan, K.H. Row. // Int. J. Mol. Sci. 2006. V. 7. - p. 155-178

67. Holthoff E.L. Molecularly templated materials in chemical sensing. / E.L. Holthoff, F.V. Bright. // Anal. Chim. Acta 2007. V. 594. - p. 147-161

68. Poole C.F. New trends in solid-phase extraction. / C.F. Poole. // Trends in Anal. Chem. 2003. V. 22. № 6. - p. 362-373

69. Fuchiwaki Yu. 6-Chloro-N,N-diethyl-l,3,5-triazine-2,4-diamine (CAT) sensor based on biomimetic recognition utilizing a molecularly imprinted artificial receptor. / Yu. Fuchiwaki, A. Shimizu, I. Kubo. // Anal. Sci. 2007. V. 23. № l.-p. 49-53

70. Lai E.P.C. Molecularly imprinted solid phase extraction for rapid screening of cephalexin in human plasma and serum. / E.P.C. Lai, S.G. Wu. // Anal. Chim. Acta 2003. V. 481. - p. 165-174

71. Shiigi H. Highly selective molecularly imprinted overoxidized polypyrrole colloids: one-step preparation technique. / H. Shiigi, M. Kishimoto, H. Yakabe, Bh. Deore, T. Nagaoka. // Anal. Sci. 2002. V. 18. № 1. - p. 41-44

72. Lele B.S. Molecularly imprinted polymer mimics of chymotrypsin 1. Cooperative effects and substrate specificity. / B.S. Lele, M.G. Kulkarni, R.A. Mashelkar// React. Functional Polymers. 1999. V. 39. - p. 37-52

73. Meng Z. Enhancement of the catalytic activity of an artificial phosphotriesterase using a molecular imprinting technique. / Z. Meng, T. Yamazaki, K. Sode. // Biotechnol. Lett. 2003. V. 25. - p. 1075-1080

74. Piletsky S.A. Electrochemical sensors based. on molecularly imprinted polymers. / S.A. Piletsky, A.P.F. Turner. // Electroanalysis 2002. V. 14. № 5.-p. 317-323

75. Piletsky S.A. Molecularly imprinted polymers — tyrosinase mimics. / S.A. Piletsky, I.A. Nicholls, M.I. Rozhko, T.A. Sergeyeva, E.V. Piletska, A.V. El'skaya, I. Karube. // Укр. 6ioxiM. журн. 2005. Т. 77. № 6. - с. 63-67

76. Haupt К. Molecularly imprinted polymers: The next generation. / K. Haupt. // Anal. Chem. 2003. p. 377A-383A

77. Tan Y. A piezoelectric biomimetic sensor for aminopyrine with a molecularly j imprinted polymer coating. / Y. Tan, L. Nie, Shouzhuo Yao. //Analyst. 2001.1. V. 126. p. 664-668

78. Rao T. Prasada. Metal ion-imprinted polymers — Novel materials for selective recognition of inorganics. / T. Prasada Rao, R. Kala, S. Daniel. // Anal. Chim. Acta. 2006. V. 578. - p. 105-116

79. Chen J.-C. An enzymeless electrochemical sensor for the selective determination of creatinine in human urine. / J.-C. Chen, A.S. Kumar, H.-H. Chung, S.-H. Chien, M.-C. Kuo, J.-M. Zen // Sens. Actuators. В 2006. V. 115.-p. 473-480

80. Lakshmi Dh. Creatinine sensor based on a molecularly imprinted polymer' modified hanging mercury drop electrode. / Dh. Lakshmi, Bh. Bali Prasad, P.

81. Sindhu Sharma. // Talanta 2006. V. 70. - p. 272-280

82. Craw J.S. The structure and intermolecular interactions of a creatinine designed complex, studied by ab initio methods. / J.S. Craw, M.D. Cooper, I.H. Hillier. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1997. № 2. - p. 869-871

83. Bell T.W. Detection of creatinine by designed receptor. / T.W. Bell, Z. Hou, Y. Luo, M.G.B. Drew, E. Chapoteau, B.P. Czech, A. Kumar. // Science -1995. V. 269.-p. 671-674

84. Subad M. Synthetic creatinine receptor: imprinting of a Lewis acidic zinc(II)cyclen binding site to shape its molecular recognition selectivity. / M. Subad, A.S. Borovik, B. Konig. // J. Amer. Chem. Soc. 2004. V. 126. - p. 3185-3190

85. Ahmad T. Magnetic and electrochemical properties of nickel oxide nanoparticles obtained by the reverse-micellar route. / T. Ahmad, K.V.

86. Ramanujachary, S.E. Lofland, A.K. Ganguli // Solid State Sci. 2006. V. 8. -p. 425—430

87. Алфимов M.B. Имитационное моделирование процессов самоорганизации наночастиц / M.B. Алфимов, P.M. Кадушников, Н.А. Штуркин, В.М. Алиевский, П.В. Лебедев-Степанов // Российские нанотехнологии 2006. Т. 1. № 1-2. - с. 127-133.

88. Осетрова Н.В. Анодное окисление мочевины в нейтральных растворах / Н.В.Осетрова, A.M. Скундин // Электрохимия 1994. Т. 30 № 10. - с. 1257-1259