Фенольные соединения хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) и хмелепродуктов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Чеснокова Александра Николаевна

фенольные соединения хмеля обыкновенного

(нимиьт ьуриьиБъуа хмелепродуктов

02.00.03 - органическая химия

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

» ппЗ ал/.

Иркутск-2011

005007628

Работа выполнена в Национальном исследовательском университете ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный технический университет»

Научный руководитель:

кандидат химических наук, старшин

научный сотрудник

Луцкин Владислав Илларионович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, старшии

научный сотрудник

Семенов Аркадий Алексеевич

кандидат химических наук, доцент Рохинп Елена Филипповна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН

Защита состоится «25» января 2012 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.06 при Иркутском государственном университете по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 126, химический факультет ИГУ, каб. 430.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИГУ, с авторефератом диссертации - на сайтах ВАК http://vak.ed.gov.ru и ИГУ http://-www.isu.ru.

Автореферат разослан «» ОекОд.аЗ

2011 г.

Отзывы на автореферат высылать по адресу: 664003, Иркутск, ул. К. Маркса, 1, ИГУ, химический факультет, учёному секретарю диссертационного совета Ольге Александровне Эдельштейн.

Учёный секретарь диссертационного совета, к. х. н., доцент О.А. Эдельштейн

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фенолъные соединения, содержащиеся в растительном сырье, представляют интерес для науки и производства, поскольку их химическая структура обусловливает проявление различной физиологической активности.

Одним из источников фенольных соединений является хмель обыкновенный -важная техническая культура, которая широко применяется как в медицине, так и в пивоваренной промышленности. Значимость фенольных соединений хмеля для пивоварения состоит в их участии в замедлении окислительных процессов, благодаря чему увеличиваются сроки хранения пива. Но, с другой стороны, считается, что взаимодействие некоторых полифенолов с белками приводит к коллоидному помутнению напитка.

В настоящее время в промышленности используются преимущественно хмелепродукты (до 80% хмелевого сырья). Они представляют собой чрезвычайно сложные смеси химических соединений, причем технологии получения, а, следовательно, и состав отдельных видов резко отличается. Несмотря на то, что хмель подвергался довольно тщательному исследованию, фенольные соединения хмелепродуктов с химической точки зрения изучены недостаточно.

Среди фенольных соединений, содержащихся в хмелевом сырье, центральное место занимают пренилированные халконы, проявляющие высокую противоопухолевую, антиоксидзнтную, фитоэстрагенную, противовоспалительную и противовирусную активность. Во многих лабораториях мира ведется разработка методов выделения данных соединений. Однако, в связи с поликомпонентностъю и сложностью состава хмелепродуктов, существующие схемы не позволяют получать соединения высокой степени чистоты, а также довольно сложны в аппаратурном оформлении. Поэтому перспективным направлением является разработка схем выделения пренилированных халконов, лишенных этих недостатков, а актуальной задачей - изучение химического состава фенольных соединений хмелепродуктов.

Целью работы являлось исследование химического состава фенольных соединений хмелепродуктов, а также идентификация соединений, участвующих в образовании коллоидного помутнения пива.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- Проанализировать литературные данные по химическому составу фенольных соединений хмеля обыкновенного и их практическому применению;

- Разработать схемы выделения пренилированных халконов из гранулированного хмелепродукта;

- С помощью разработанных схем выделить доминирующие пренилированные халконы из гранулированного хмелепродукта и провести их идентификацию физико-химическими методами;

- Определить количественное содержание ксантогумола в российских хмелепродуктах из селекционного хмеля и дикорастущем образце (Иркутская область);

- Исследовать изомеризацию ксантогумола в изоксантогумол;

- Изучить состав фенольных соединений «Полифенольного экстракта хмеля» и идентифицировать соединения, участвующие в образовании коллоидного помутнения пива.

Научная новизна. Разработаны схемы выделения пренилированных халконов из гранулированного хмелепродукта, представляющие собой комплекс химических и хроматографических методов. Предложенные схемы позволили впервые выделить

1",2"-дигидроксантогумол С из хмелепродуктов. Впервые изучен состав фенольных соединений молотых брикетированных и прессованных шишковых хмелепродуктов российского производства, шишек дикорастущего хмеля (Иркутская область), а также «Полифенольного экстракта хмеля». В исследуемых хмелепродуктах идентифицирован ряд катехинов и фенолкарбоновых кислот, препаративно выделен и идентифицирован физико-химическими метод,ами 1-0-/Ш-глюкопиранозид (2-метилпропаноил)флороглюцина. Среди указанны?: соединений впервые обнаружены в хмелевом сырье н-гидроксибензойная, протоь:атеховая и феруловая кислоты. Определено количественное содержание пренилхалкона ксантогумола, впервые и зучена динамика его изомеризации в модельных условиях.

Практическая значимость. Предложенные в работе схемы выделения прспилированных халкопов позволяют получать соединения высокой степени чистоты (не менее 90%), которые ввиду их высокий физиологической активности, в том числе антиоксидантной и противоопухолевой, могут быть использованы для получения лекарственных средств, а также в качестве антиоксидантов для пищевой промышленности.

На основании проведенных исследований впервые установлено участие 1-0-/?-D-глюкопиранозида (2-метилпропаноил)флороглюцина в формировании белково-полифенольных комплексов, являющихся основной причиной обратимого коллоидного помутнения пива, ухудшающего его качественные показатели.

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в постановке цели и задач исследования, подготовке и проведении экспериментов, обсуждении результатов и написании научных статей.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Схемы выделения пренилированных халконов из гранулированного хмелепродукта;

- Спектральная идентификация пренилхалконов, выделенных при помощи разработанных в работе схем;

- Количественное содержание ксантогумола в хмелепродуктах из хмеля российской селекции и шишках дикорастущего хмеля, собранного в Иркутской области;

- Результаты изучения динамики изомеризации ксантогумола в изоксантогумол в зависимости от рН среды и времени процесса;

- Химический состав фенольных соединений «Полифенольного экстракта хмеля».

- Выделение, идентификация и результаты тестирования 1-O-^-D-глюкопиранозида (2-метилпропапоил)флороглюцина на образование обратимого коллоидного помутнения в модельных условиях.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на международных, всероссийских и региональных конференциях: "Перспективы развития технологии, экологии и автоматжиции химических, пищевых и металлургических производств" (Иркутск, 2007, 2008); Международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, Узбекистан, 2009); П Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово. 2009); Всероссийской молодежной научно-пракгаческой конференции с международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы» (г. Улан-Удэ, 2011), Международном конгрессе «33rd European Brewery Convention Congress 2011» (Глазго. Шотландия, 2011г.).

Публикации. Основное: содержание диссертационной работы отражено в 10 работах, включая 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК и б тезисов докладов международных, всероссийских и региональных конференций.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с паспортом специальности 02.00.03 - «Органическая химия», одной из основных задач которой является установление структуры и исследование реакционной способности органических соединений применительно к ее специальному разделу - химия лекарственных веществ, в диссертационной работе исследованы фенольные соединения хмеля обыкновенного {Hamulus lupulus L.) и хмелепродуктов, многие из которых обладают высокой физиологической активностью и могут быть использованы для получения новых лекарственных средств. Учитывая, что около 90% мирового производства хмеля и хмелепродуктов потребляется пивоваренной промышленностью, для формирования целостной системы комплексного использования ценных компонентов хмелевого сырья в диссертационной работе изучены также некоторые аспекты практического применения фенольных соединений хмеля в указанной отрасли.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы и трех приложений. Работа изложена на 131 странице, включает 32 рисунка, 8 таблиц. Список литературы содержит 114 источников, в том числе 95 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве объектов исследования были выбраны гранулированный хмелепродукт (тип 45) из хмеля сорта Магнум, молотые брикетированные и прессованные шишковые хмелепродукты из наиболее перспективных сортов российской селекции Крылатский, Подвязный, Сумерь, шишки дикорастущего хмеля (Иркутская область), а также «Полифенольный экстракт хмеля».

Методы исследования. Основными методами исследований, применяемыми в данной работе, являлись хроматографические и спектральные методы.

ТСХ анализ халконов осуществляли на пластинках «Sorbffl ПТСХ-АФ-А-УФ» и «Silufol UV 254», неподвижная фаза - силикагель. Подвижная фаза: гексан - ацетон (75:25) и хлороформ - метанол (98:2), % об. Обнаружение халконов проводили 3% водным раствором хлорида алюминия и 10% водным раствором карбоната натрия.

Выделение пренилхалконов проводили методами препаративной колоночной и флеш-хроматографии на силикагеле марки L. Препаративное разделение полифенольного экстракта хмеля осуществляли на жидкостном хроматографе Agilent 1200 (США). Хроматографирование выполняли на колонке 021 <250 мм, заполненной сорбентом NucleoSIL 5-С18 з градиентном режиме элюирования в системе: Н20-MeCN. Детектирование осуществляли при дайнах волн 210,250, 290, 310, 360 нм.

Количественное определение ксантогумола проводили методом ВЭЖХ на приборе МилихромА-02 (г. Новосибирск) с УФ детектором на колонке 02 > 75 мм, заполненной сорбентом ProntoSIL 120-5-C18AQ в градиентном режиме элюирования в системе: 0.05М КН2Р04-Ме0Н. Детектирование - при 360 нм.

Мониторинг изменения концентрации пренилфлавоноидов в ходе изучения динамики изомеризации ксантогумола в изоксантогумол осуществляли на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром 1» (г. Орел) е УФ-детектором на колонке 02*62 мм заполненной сорбентом NucleoSIL 5-С18 в изократическом режиме элюирования в системе: H20-MeCN-H3P04 (60:40:0.1).

5

Состав полифенольного экстракта хмеля исследовали. на жидкостном хроматографе Agilent 1100 (США) с диодно-матричным детектором. Хроматографирование проводили в режиме градиентного элюирования, мобильная фаза: 0.01% HjP04-MeCN. Колонка 04.6x150 мм, упакованная сорбентом Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 мкм). Детектирование - при 260.280, 325 нм.

УФ-епектры пренилхалконов записывали на спектрофотометре СФ-26; УФ-спектры изоксантогумола и 1-0-/?-В-глюкопиранозида (2-метилпропаноил)-флороглюцина - на жидкостных хроматографа?: «Милихром 1» и Agilent 1100, соответственно. ИК-спектры пренилхалконов записывали на ИК-Фурье-спектрометре IFS25. ЯМР спектры пренилфлавоноидов в CDC13 регистрировали на спектрометре «Bruker DPX 250» (250МГц), l-^-D-глюкопиранозида (2-метилпропаноил)-флороглюцина в CD3OD - на спектрометре Bruker АМ400 (400МГц). Масс-спектры высокого разрешения ксантогумола и кеантогумола D записывали на приборе JEOL SX 102А с двойной фокусировкой обращенной геометрии. Масс-спектр 1-/Í-D-глюкопиранозида (2-метилпропаноил)флороглюцина - на приборе НСТ Ultra ETD II HPLC-ESI-MS. ВЭЖХ-МС-хроматограммы суммы ксантогумола С и 1", 2"-дигидроксантогумола С - на хроматографе Agilent HP 1200 в сочетании с времяпролетным масс-спектрометром Agilent 6210 ионизацией методом электростатического распыления (ESI) в режиме регистрации отрицательных ионов при разделении образца на колонке 02x75 мм, упакованной сорбентом ProntoSIL-120-5-С18. в режиме градиентного элюирования: 0.1М (NH^CCb-MeCN.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В литературном обзоре рассмотрены состав и химическое строение фенольных соединений хмеля обыкновенного, а также приводятся данные по их физиологической активности.

1. Выделение преннлнровянных халкопов из гранулированного хмелепродукта

Разработка схем выделения. При подборе условий экстракции было установлено, что пренилированные халконы эффективно извлекаются хлороформом. Поэтому экстракцию гранулированного хмелепродукта осуществляли этим растворителем. После удаления растворителя из хлороформного экстракта, проводили его экстракцию системой гексан-метанол (7:4). В результате происходило распределение соединений, входящих в состав экстракта, между двумя несмешивающимися фазами: гексановой и меганольной. Полученные фракции разделяли и анализировали методом ТСХ. В метанольной фракции было установлено наличие халконов, в гексановой же фракции данные соединения отсутствовали.

В результате многократного препаративного разделения метанольной фракции на силикагеле методами колоночной и флеш-хроматографии, было выделено два пренилированных халкона: ксантогумол (1) и ксан гогумол D (2).

При выделении ксантогумола по вышеописанной схеме в хлороформном экстракте гранулированного хмелепродукта помимо целевого компонента содержалось также большое количество органических веществ различных классов, таких как углеводороды, эфирные масла, хмелевые смолы, липиды, хлорофилл. Для их отделения требовалось большое количество сорбента и растворителей. С целью оптимизации этих затрат и повышения выхода ксантогумола была разработана вторая схема выделения, основанная на последовательной исчерпывающей экстракции гранулированного хмелепродукта в аппарате Сокслета растворителями с

6

увеличивающейся полярностью: гексаном-этилацетатом- хлороформом - метанолом (рис. 1).

Рисунок 1 - Схема экстракции гранулированного хмелепродукта

В результате анализа полученных фракций методом ТСХ установлено наличие пренилхалконов в этилацетатной фракции. В гексановой фракции исследуемые соединения не были обнаружены, а в хлороформной и метанольной фракциях содержались их следовые количества.

Из этилацетатной фракции методами колоночной и флеш-хроматографии на силикагеле (рис. 2) мы вновь выделили ксантогумол (1'), а также смесь ксантогумола С (3) и 1", 2"-дигидроксантогумола С (4).

Рисунок 2 - Схема выделения пренилированных халконов из гранулированного

хмелепродукта

Идентификация выделенных соединений проведена методами ИК, УФ, ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии.

Методом ИК спектроскопии было установлено, что соединения 1 и 2 содержат ароматические фрагменты, карбонильные и гидроксильные группы, связанные водородными связями, а также метальные и метоксильные функциональные группы. УФ-спектры соединений имеют максимумы поглощения при 370 нм, что характерно для халконов. По масс-спектрам высокого разрешения были рассчитаны брутто-формулы С21Н2205 и C2iH2206 для соединений 1 и 2 соответственно.

Соединение 1 содержит паразамещенное фенильное кольцо В - это следует из спектра ЯМР 'Н (табл.1), содержащего два дублета (6.87 и 7.52 м.д.) интенсивностью в два протона каждый, с одинаковыми константами спин-спинового взаимодействия (КССВ) равными 8.1 Гц. Согласно данным НМВС спектра, первый дублет принадлежит протонам в положениях 3 и 5, а второй - в положениях 2 и 6. Кольцо А представлено в спектре ЯМР 'Н только одним сигналом - синглетом (5.96 м. д.) интенсивностью один протон, следовательно остальные пять положений этого кольца замещены. Этот единственный протон находится в положении 5'. Синглет интенсивностью три протона при 3.91 м.д. соответствует по величине ХС метоксильной группе. Положение этого заместителя определили по 2D ЯМР спектру NOES Y, в котором наблюдали ЯЭО протонов метоксильной группы с протонами Н-5'. Следовательно, -ОСН3 группа может быть равновероятно расположена в положениях 4' и 6'. Из спектра НМВС выяснили, что указанная группа находится в положении 6'.

В молекуле имеется фрагмент а,Р-ненасыщенного кетона. Карбонильная группа представлена сигналом четвертичного атома углерода при 192.91 м.д. п спектре ЯМР 13С и полосой валентных колебаний при 1622.6 см"1 в ИК-спектре. Двойная связь, сопряженная с карбонильной группой, подтверждается сигналами атомов углерода при 125.59 и 142.17 м. д в спектре ЯМР 13С и соответствующими им синглетами при 7.77 и 7.78 м. д. интенсивностью один протон каждый в спектре ЯМР'Н.

Строение алифатической части молекулы соединения 1 (пренильной группы) было установлено из анализа спектров ЯМР ]Н и 13С и сравнения полученных данных с литературными. В области сильного поля (1.78 и 1.84 м.д.) находятся два уширенных синглета интенсивностью в три протона каждый, соответствующие двум СНз-группам при двойной связи (положение С 3"). Уширение сигналов обусловлено аллильным расщеплением от Н-2" (5.30 м.д.). В свою очередь, Н-2" взаимодействует с двумя эквивалентными протонами при С1" (3.41 м.д.).

На основании вышеизложенного следует, что выделенное соединение 1 имеет строение, представленное на рис. 3, и является ксантогумолом.

.он

„он

1

2

Рисунок 3 - Структурные формулы соединений 1 и 2

Таблица 1 - Данные 'Н- и 13С-спектров соединений 1 и 2 _(растворитель - С ОСЬ, 5-шкапа, ТМС-0)_

Положение атома Ксантогумол (1) Ксантогумол D (2)

5 'Н, м.д. (тип сигнала; число протонов; J, Гц) 8 13С, м.д. 8 'Н,м.д. (тип сигнала; число протонов; J, Гц) 8 Х\м.д.

1 - 128.64 - 128.4

2.6 7.52 (д,2Н, 8.1) 130.36 7.37 (д,2Н, 8.07) 130.2

3.5 6.87 (д. 2Н, 8.1) 115.99 6.73 (д, 2Н, 8.07) 115.8

4 - 157.71 - 157.2

Г - 106.29 - 105.2

2' - 165.23 - 165.9

3' - 106.42 - 105.7

4' - 161.93 - . 163.6

5' 5.96 (с, 1Н) 91.28 5.91 (с, 1Н) 92.1

6' - 161.28 - 161.5

1" 3.41 (д, 2Н, 6.8) 21.74 (а) 3.00 (кв, 1Н) (Р) 2.65 (кв, 1Н) 28.2

2" 5.30 (т. 1Н. 7.3) 121.89 4.23 (кв, 1Н) 77.7

3" - 135.92 - 146.9

4" 1.84 (с, ЗН) 17.99 (а) 4.87 (с, 1Н) (Р)4.74(с,1Н) 110.3

5" 1.78 (с, ЗН) 25.91 1.87 (с, ЗН) 18.2

а 7.77 (с, 1Н) 125.59 7.63 (д,1Н,15.6) 125.5

(3 7.78 (с. 1Н) 142.17 7.65 (д,1Н,15.6) 142.1

с=о - 192.91 - 192.7

б'-ОСГО 3.91 (с, ЗН) 55.88 3.78 (с, ЗН) 55.5

Сравнение масс-спектров соединений 1 и 2 показало, что масса соединения 2 превышает массу соединения 1 на 16 единиц, соответствующих, согласно данным ЯМР, гидроксильной группе. Спектры ЯМР 'Н и 1ЛС доказывают идентичность замещения колец А и В и присутствие а,р-ненаеыщенного кетона в молекулах соединений 1 и 2 (табл. 1). Значительные различия в спектрах этих соединений наблюдаются только в величинах химических сдвигов сигналов боковой пренильной цепи. 2D ЯМР эксперименты (COSY, НМВС, HSQC) позволили идентифицировать спиновую систему этой цепи и определить местоположение четвертой гидроксильной группы (при С2") в соединении 2.

Группы -СН3 и =СН2 представлены в спектре ПМР соединения 2 сигналом 1.87 м.д. (синглет, интенсивностью в три протона) и двумя синглетами при 4.87 и 4.74 м.д. Из двухмерного корреляционного спектра ЯМР видно, что эти две группы связаны друг с другом (методики COSY и НМВС). Рядом с этими группами (наблюдаются кросс-пики между этими тремя сигналами) в положении при С-2", находится протон, геминальный к гидроксильной группе (сигнал при 4.23 м.д., интенсивностью один протон), который, в свою очередь, взаимодействует с двумя

1 Величины химических сдвигов 13С ЯМР спектров получены из корреляционных методик двойного резонанса НБОС и НМВС.

протонами в сильном поле при 2.6:5 и 3.0 м.д. Последние два протона находятся при С1" пренильной цепи.

Из вышеизложенных данных следует, что соединение 2 имеет строение, приведенное на рис. 3 и является ксантогумолом D.

После предварительной идентификации соединения 1' методом ТСХ, для него были записаны УФ-, ИК-, ЯМР- и масс-спектры, данные которых оказались очень близкими к таковым для соединения 1. Это позволило достоверно идентифицировать соединение 1' как ксантогумол.

Ввиду того, что соединения 3 и 4 обладали очень схожим хроматографическим поведением, их идентификация в смеси была проведена по ЯМР спектрам, включая двумерные корреляционные методики (HSQC, НМВС и COSY) и масс-хроматограмме, полученной методом ВЭЖХ-МС.

В УФ-спектре соединений 3 и 4 основной максимум поглощения, расположенный при 370 нм, указывает на принадлежность к халконам. Хроматограмма полного ионного гока, полученная методом ВЭЖХ-МС, содержит уширенный неоднородный пик (время удерживания 17.7 мин.). В составе данного пика регистрировали отрицательные ионы с соотношением m/z 351 и 353, принадлежащие соединениям 3 и 4, соответственно (рис. 4).

соединений 3 и 4

Спектр 'Н ЯМР суммы соединений 3 и 4 (табл.2) содержит несколько пар нерасщепленных сигналов с очень близкими величинами химических сдвигов, соотношения которых составляют 2:1, а именно синглеты при 14.83 и 14.65 м.д. (2'-ОН); синглеты при 5.94 и 5.90 м.д. (5'-Н); синглеты при 3.93 и 3.91 м.д. (6'-ОСН,), следовательно, в смеси присутствует два схожих по строению вещества.

Значительные различия в спектре ЯМР 'Н наблюдались в значениях химических сдвигов сигналов, относящихся к протонам диметилпирановых колец молекул соединений 3 и 4. В соединении 3 указанные сигналы располагаются в спектре ЯМР 'Н в области олефиновых протонов (дублеты при 6.70 и 5.48 м.д. интенсивностью один протон каждый с одинаковыми КССВ равными 10 Гц) и принадлежат протонам при двойной связи (Н1" и Н2"). В отличие от соединения 3, в соединении 4 протоны диметилпиранового кольца (Н1" и Н2") представлены в спектре ЯМР 'Н сигналами в области сильного поля (триплеты при 2.59 и 1.77 м.д. интенсивностью два протона каждый). Синглет при 1.47 м. д. интенсивностью шесть протонов в спектре ЯМР *Н соответствует двум метальным группам при СЗ" (СН3-4"

и СНГ5'") соединения 3. Сигналы этих групп соединения 4 представлены в спектре синглетом при 1.38 м.д. интенсивностью также шесть протонов (СН3-4" и СН3-5").

Оставшиеся сигналы в ЯМР 'Н спектре доказывают присутствие в молекулах соединений 3 и 4, как и в ксантогумоле, пара-замещенных фенильных колец В и фрагментов а.р-ненасыщенного кетона.

Таблица 2 - Данные *Н и ВС2 ЯМР-спектров соединений 3 и 4 _(растворитель - СРС13, 5-шкала, ТМС-0)__

Положение атома ксантогумол С (3) 1",2"-дигидроксантогумол С (4)

§ 'Н*, м.д. (тип сигнала, число протонов, Гц) 3 13С, м.д. 'Н 5, м.д. (тип сигнала, число протонов, I, Гц* 5 ИС, м.д.

1 - 128.6 - 128.6

2,6 7.53 (д, 2Н, 8.6) 130.40 7.53 (д, 2Н, 8.6) 130.40

3.5 6.88 (д, 2Н, 8.6) 116.04 6.83 (д, 2Н, 8.6) 116.04

4 - н. д. - 157.3

На 7.79 (с. 2Н) 125.34 7.79 (с, 2Н) 125.34

нр 7.79 (с, 2Н) 142.29 7.79 (с, 2Н) 142.29

С=0 - 192.7 - 192.7

1' - 105.9 - н. д.

2' - н. д. - н. д.

3' - 103.1 - 102.13

4' - 162.6 - 165.45

5' 5.94 (с, 1Н) 91.62 5.90 (с, 1Н) 91.84

в - 160.13 - 160.70

1" 6.70(д, 1Н, 10.0) 116.40 2.59(т, 2Н, 8.6) 16.32

2" 5.48 (д, 1Н. 10.0) 125.42 1.77 (т, 2Н, 8.6) 32.24

3" - 78.30 - 76.15

4"-СН,; 5м- СН3 1,47 (с, 6Н) 28.5 1.38 (с, 6Н) 26.8

2-ОН 14.83(с, 1Н) н.Д. 14.65(с, 1Н) н.Д.

б'-ОСНЗ 3.93(с, ЗН) 56.0 3.91 (с, ЗН) 55.67

Совокупность вышеприведенных данных позволила нам заключить, что соединение 3 является ксантогумолом С, а соединение 4 - 1", 2"-дигидро-ксантогумолом С, структуры которых представлены на рис. 5.

Рисунок 5 - Структурные формулы соединений 3 и 4

1 Величины химических сдвигов "С ЯМР спектров получены из корреляционных спектров двойного резонанса НБОС и НМВС.

Таким образом, в данной работе разработаны схемы выделения пренилированных халконов, представляющие собой комплекс химических и хроматографических методов. Основными преимуществами предложенных схем является высокая степень чистоты получаемых соединений (не менее 90%) и простота аппаратурного оформления процесса.

При помощи указанных схем выделены и идентифицированы современными физико-химическими методами четыре пренилированных халкона: ксантогумол, ксантогумол Б, ксантогумол С и 1" 2"-дигидроксантогумол С. Последнее соединение выделяли ранее только из отходов хмеля после проведения его сверхкритической углекислотной экстракции, однако его нативность не была установлена. Разработанная в нашей работе схема позволила впервые выделить нативный 1",2"-дигидроксантогумол С из гранулированного хмелепродукта.

2. Определение количественного содержания ксантогумола

Исследуемые хмелепродукты последовательно исчерпывающе экстрагировали в аппарате Сокслета гексаном, затем этанолом. Количественное определение ксантогумола в этанольной фракции проводили методом ОФ ВЭЖХ с УФ детектированием. В последнее время этот метод наиболее широко используется для идентификации фенольных соединений в сложных смесях, благодаря его высокой селективности.

В качестве элюентаА использовали водный раствор дигидрофосфата калия, подкисленный ортофосфорной кислотой. Элюентом Б являлся метанол. Элюирование осуществляли в градиентном режиме. Подкисление элюента осуществляли для уменьшения ионизации ксантогумола во время анализа. Идентификацию соединений осуществляли по относительным временам удерживания. В качестве стандартов использовали пренилхалконы, выделенные нами ранее.

Как видно на рис. б, в подобранных нами условиях достигнуто хорошее разрешение пика ксантогумола, пик гомогенен и симметричен.

О

0.5 Л

I 3-4Ц ; и

„_/ч__ЛА.

31

Рисунок б - Хроматограмма ВЭЖХ-УФ экстракта гранулированного хмелепродукта, этанольная

фракция. Пики: 1-ксантогумол'. 2-ксантогумол Б, 3- ксантогумол С; 4-Г',2"-дигидро-ксантогумол С

-1-'-1-»-1-'-г-................I—

2 4 6 8 10

Время, мин.

Кроме пика, принадлежащего ксантогумолу (1) на хроматограмме этанольной фракции гранулированного хмелепродукта (рис. 6) присутствуют пики, соответствующие ксантогумолу Б (2) и сумме ксантогумола С (3) и 1", 2"-дигидроксантогумола С (4).

Содержание ксантогумола в хмелепродуктах вычисляли по формуле:

S, ■ V

•100%,

(1)

где Сст - концентрация соответствующего стандартного раствора ксантогумола, мг/мл; - площадь пика ксантогумола в анализируемой пробе; 5ст - площадь пика стандарта ксантогумола; М - масса навески, мг; Г'-объем растворителя в анализируемой пробе, мл.

Результаты количественного определения ксантогумола в исследованных хмелепродуктах представлены в табл. 3.

Таблица 3 - Количественное содержание ксантогумола в хмелепродуктах

Содержание

№ Вид Сорт ксантогумола, % от

образца хмелепродуктов хмеля массы воздушно-сухого вещества

1 Шишковый прессованный Подвязный 0.06

2 Крылатский 0.70

3 Сумерь 0.51

4 Молотый брикетированный Подвязный 0.25

5 Крылатский 1.09

6 Сумерь 0.57

7 Шишковый Дикорастущий, Иркутская обл. 0.55

8 Гра нул про ва н н ы й Магнум 1.26

Найдено, что в прессованных шишковых хмелепродуктах всех исследованных сортов содержание ксантогумола находится в пределах 0.06 - 0.70% b.c.в, а в молотых брикетированных - 0.25-1.09 % в.с.в.

Показано, что в молотых брикетированных хмелепродуктах из хмеля сортов Подвязный и Крылатский содержание ксантогумола значительно выше, чем в прессованных шишковых образцах. В хмелепродуктах из хмеля сорта Сумерь количество ксантогумола не зависит от технологической переработки сырья.

В молотом брикетированном хмелепродукте из хмеля сорта Крылатский отмечено наибольшее содержание ксантогумола, сравнимое с содержанием этого соединения в импортом гранулированном хмелепродукте из хмеля сорта Магнум.

В шишках дикорастущего хмеля, собранного в Иркутской области содержание ксантогумола составило 0.55 %, что сравнимо с концентрацией этого соединения в хмелепродуктах из селекционного хмеля.

3. Исследование изомеризации ксантогумола в нзоксантогумол

Пренилхалкон ксантогумол вносит существенный вклад в повышение физиологической ценности пива. Однако при производстве светлого пива большая часть ксантогумола изомеризуется во флаванон - нзоксантогумол, обладающий значительно меньшей активностью. При производстве же темного пива изомеризации ксантогумола практически не происходит. Причина этого до настоящего времени не установлена. Изучение изомеризации ксантогумола в нзоксантогумол в модельных

условиях, проведенное в нашей работе, позволит получить важные данные для понимания природы данного процесса.

Получение стандарта изоксантогумола. Известно, что изоксантогумол содержится в хмеле очень небольшом количестве, поэтому его получали изомеризацией ксантогумола. ,Цля этого раствор кеантогумола в ацетоне (концентрация 10 мг/мл) смешивали с буферным раствором (рН=8) в соотношении объемов 1: 5, нагревали до температуры кипения растворителя и выдерживали при этой температуре в течение ¿0 минут. Полученную фракцию упаривали и перерастворяли в метаноле. Очистку фракции проводили методом препаративной ВЭЖХ в системе элюентов ацетон - вода - ортофосфорная кислота (50:50:0,1), % об., а затем препаративной ТСХ в системе хлороформ - метанол (98:2), % об. Идентификацию изоксантогумола проводили по УФ- и 'Н ЯМР-спектрам.

Изучение динамики изомеризации ксантогумола в изоксантогумол в зависимости от величины рН и времени. Динамику изомеризации ксантогумола в изоксантогумол изучали методом ВЭЖХ. Ксантогумол является халконом, а в процессе изомеризации он превращается во флаванон изоксантогумол (рис. 7). Вследствие прерывания цепи сопряжения между бензольными кольцами молекулы изоксантогумола в результате изомеризации, основной максимум его поглощения в УФ-области лежит в более коротковолновой части спектра (^.а* = 290 нм), чем у ксантогумола = 370 нм). Поэтому при изучении процесса изомеризации методом ВЭЖХ удобно применять УФ-детектор.

При производстве пива время кипячения сусла с хмелем составляет 1.5-2 часа. Поэтому температуру процесса мы выбрали постоянную (температуру кипения смеси), максимальное время кипячения - 2 часа, величины рН реакционной среды изменяли от сильнокислой (рН 2.0) до щелочной (рН 9.0).

Для проведения изомеризации ксантогумол, предварительно растворенный в ацетоне, смешивали с буферными растворами, имеющими различные значения рН. Затем полученные растворы нагревали до температуры кипения растворителя и выдерживали при этой температуре в течение 120 минут. Изменение состава реакционной смеси прослеживали методом ВЭЖХ, отбирая пробы каждые 20 минут.

Анализируя полученные данные (рис. 8) можно сделать вывод о том, что наибольшая конверсия ксантогумола в изоксантогумол происходит в слабощелочной среде. При значении рН=9.0 (рис. 8 Ж) происходит резкое уменьшение концентрации ксантогумола за первые 20 мин реакции при одновременном росте концентрации изоксантогумола. За 40 мин проведения реакции наблюдается практически полное превращение исходного соединения, а концентрация изоксантогумола достигает максимального значения. При дальнейшем проведении процесса концентрация изоксантогумола начинает уменьшаться и к окончанию времени реакции он полностью превращается в продукты гидролиза.

.он

Рисунок 7. Схема изомеризации ксантогумола в изоксантогумол

300 2Б0 200 150 100 50 0

20 40 60 80 100 120 Время, мин

X

I 200

«! 150 о

2 юо

ч

га

=г

50

20 40 60 80 100 120 Время, мин

250

120

Время, мин

100 120

Зремя, мин

250

100 120

Время, мин

Время, мин

30 100 120

А-рН=2.0; Б-рН=4.0; В-рН=5.0; Г-рН=5.5; Д-рН=6.0; Е - рН=8.0; Ж - рН=9.0.

Время, мин

Рисунок 8. Изменение состава реакционной смеси при проведении изомеризации ксантогумола (•) в изоксантогумол (■)

При рН 8.0 (рис. 8 Е) также наблюдается резкое уменьшение концентрации ксантогумола за первые 20 мин проведения реакции при одновременном росте концентрации изоксантогумола. Однако в отличие от рН 9, несмотря на практически полное превращение исходного соединения за 40 мин, концентрация изоксантогумола остается практически постоянной в интервале времени от 40 до 120 минут.

В кислых средах (рис. 8 А-Д), в том числе и при значении рН 5.5, близком к рН пивного сусла, несмотря на практически полное превращение ксантогумола в ходе проведения реакции, получен низкий выход изоксантогумола.

Сопоставление вышеизложенных результатов показало, что максимальная конверсия ксантогумола в изоксантогумол происходит при рН 8.0. и продолжительности реакции 40-60 минут. При значении рН 5.5., близком к рН сусла, получен низкий выход изоксантогумола, что плохо согласуется с литературными данными, согласно которым в процессе производства светлого пива большая часть ксантогумола изомеризуется в изоксантогумол.

Следует отметить, что в данной работе процесс изомеризации моделировался лишь по времени процесса и величине рН, не затрагивая состава среды. Компонентный состав реального сусла значительно отличается от модельного - в первом присутствуют неорганические ионы (кальций, магний, калий и т. д.) и органические соединения - горькие вещества, фенолы, белки, редуцирующие сахара и другие вещества, эстрагированные из солода и хмеля. Именно эта многокомпонентность состава сусла, по-видимому, играет определяющую роль в процессе изомеризации пренилхапконов в производственных условиях.

4. Изучение фенольных соединений «Полифенольного экстракта хмеля»

Для идентификации катехинов и фенолкарбоновых кислот предварительно растворенный в дистиллированной воде «Полифенольный экстракт хмеля» трехкратно экстрагировали диэтиловым эфиром. Объединенную эфирную фракцию анализировали методом ВЭЖХ. Детектирование проводили на трех длинах волн, соответствующих максимумам поглощения анализируемых соединений: 260 им - для производных бензойной кислоты, 280 нм - для катехина и эпикатехина, 325 нм - для производных коричной кислоты.

Предварительно для смеси стандартов исследуемых веществ были подобраны оптимальные условия разделения хроматографических пиков в режиме градиентного элюирования (рис. 9).

Хроматографирование эфирной фракции «Полифенольного экстракта хмеля» проводили в условиях, аналогичных таковым для стандартной смеси (рис. 10). Идентификацию катехинов и фенолкарбоновых кислот в указанной фракции проводили по относительным временам удерживания и УФ спектрам.

Применение двух параметров идентификации, а именно времен удерживания и УФ спектров, позволило достоверно идентифицировать анализируемые вещества в исследуемом экстракте.

Результаты определения состава катехинов и фенолкарбоновых кислот в «Полифенольном экстракте хмеля» представлены в табл. 4.

Время, мин

Рисунок 9 - Фрагмент хроматограммы емеси стандартов (280 нм) Пики: б - протокатеховая кислота; 7 - п-оксибензойная кислота; 8 - (±)-катехин; 9 - ванилиновая кислота; 10 - кофейная кислота; 11 - сиреневая кислота; 12 - (-)-эпикатехин; 13 - п-кумаровая кислота; 14 - феруловая кислота; 15 - коричная кислота

10 12 14 16 1Б 20 22 24 26 28 30 32 34

О 52

Время, мин

он он

Время, мин

Рисунок 10 - Фрагменты хроматограмм эфирной фракции полифенольного экстракта хмеля при различных длинах волн (обозначения пиков - см. рис. 8)

100

30 80

С 70 § 60 о 50 5 40

3 зо

а 20

| 10

Л О

Н0хг*

13

ноХХ

325 нм

А_

ю

50 52

10 12 14 16 18 20 22 24 26 23 30 32 34

Время, мин Рисунок 10 (продолжение)

Таблица 4 - Катехины и фенолкарбоновые кислоты «Полифенольного экстракта

хмеля»

Номер пика Название соединения Максимумы поглощения в УФ-спектрах, нм Время удерживания пиков в исследуемом образце, мин Время удерживания пиков стандартов, мин

6 протокатеховая кислота 260;294 15.288 15.203

7 н-оксибензойная кислота 256 20.232 20.183

8 (±)-катехин 280 22.982 22.984

9 ванилиновая кислота 260; 292 23.922 23.886

10 кофейная кислота 324; 236 (пл.*); 298 (пл.) 24.665 24.682

11 сиреневая кислота 274 н.о." 25.816

12 (-)-эпикатехин 278 27.373 27.331

13 оксикоричная (н-кумаровая) кислота 226;310 30.428 30.405

14 феруловая кислота 236; 322; 294 (пл.) 33.550 33.500

15 коричная кислота 278 н.о. 49.056

Таким образом, в «Полифенольном экстракте хмеля» методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием идентифицированы соединения группы катехинов: (±)-катехин (8) и (-)-эпикатехин (12), а также /г-оксибензойная кислота (7) и ее производные (ванилиновая (9) и протокатеховая (6) кислоты); оксикоричная (;г-кумаровая) кислота (13) и ее производные (кофейная (10), транс-феруловая (14) кислоты).

3 и.о. - не обнаружено

Среди указанных соединении впервые обнаружены в хмелевом сырье п-гидроксибензойная (7), протокатеховая (6) и транс-феруловая кислоты (14).

Несмотря на то, что в литературе имеются сведения о содержании в шишках хмеля коричной кислоты, в «Полифенольном экстракте хмеля» она не обнаружена. Сиреневая кислота также не найдена в исследованном объекте.

5. Идентификация фенольных соединений хмеля, участвующих в образовании коллоидного помутнения пива4 (практическая часть)

Одной из проблем пивоваренной отрасли является образование белково-полнфенольных комплексов, приводящее к возникновению коллоидного ломутнения пива, ухудшающего его качество.

Некоторые фенольные соединения, экстрагируемые из солода и хмеля, реагируют с пролшюодержащими белками, вызывая помутнение пива. Однако состав фенольных соединений хмеля, вступающих в это взаимодействие, изучен недостаточно. В связи с этим в задачу данной работы входила идентификация фенольных соединений хмеля, участвующих в формировании белково-полифенольных комплексов в условиях, приближенных к производственным.

Для решения этой задачи фенольные соединения адсорбировали на полиамиде из водного раствора «Полифенольного экстракта хмеля». Последующую десорбцию осуществляли смесью ацетон - вода (3:1). После удаления ацетона проводили экстракцию водной фракции гексаном для ее очистки от балластных липофильных веществ и последующее разделение методом твердофазной экстракции на картридже (Strata С 18-Е, Phenomenex), заполненном обращено-фазовым сорбентом. Картридж с исследуемой фракцией последовательно элюироЕ1али системами растворителей с увеличивающейся полярностью: метанол - вода (10:90), метанол - вода (20:80) метанол - вода (30:70), % об. и метанолом. Полученные фракции тестировали на образование коллоидного помутнения в модельных условиях. Метанольно-водные фракции, показавшие положительный результат в данном тесте, объединили и анализировали методом ВЭЖХ. Метанольная фракция на образование коллоидного помутнения пива не влияла.

На хроматограмме объединенной метанольнс-водной фракции полифенольного экстракта хмеля (рис. 11) имеется доминантный пик, принадлежащий соединению 16, максимумы поглощения которого в УФ-спектре составляют 222 и 286 нм. что указывает на принадлежность к полифенолам. Однако УФ спектр данного соединения не характеристичен для проантоцианидинов - фенольных соединений, участие которых в образовании коллоидного помутнения пива описано в литературе. Поэтому нам представилось интересным выделить данное соединение и провести его идентификацию.

Выделение l-O-fS-D-глюкопираиошда (2-метилпропаноил)флороглюцина (16). Мета но льно-водную фракцию разделяли методом препаративной ВЭЖХ. В результате многократного хроматографирования было выделено индивидуальное соединение 16, идентификацию которого провели методами 'Н, 13С и 2D ЯМР и МС.

4 ДанныЛ этап работы выполнен в рамках научной стажировки автора в Берлмнсхом техническом университете (Германия) под руководством профессора Ф.-Ю. №тнера

20

24 26 28 30 32 Время, мин

Рисунок 11 - Фрагмент хроматограммы метанолыю-водной фракции

полифенолыюго экстракта хмеля при 280 нм и УФ-спектр соединения 16

Идентификация l-O-ß-D-глюкопиранозида (2-метилпропаношг)-

флороглюцина (16). УФ-спектр. 1тм(нм): 222, 286, ВЭЖХ-масс-спектр (HPLC-ESI-MS/MS): m/z 357 [М-Н]": 195 [М-Н-С6Н|206]" . Спектр ЯМР 'Н (CD3OD; 5, м.д.; J, Гц): 1.13 (д, ЗН, 6.3; Н-4'); 1.14 (д, ЗН, 6.3; Н-3'); 3.38 (т, 1Н; Н-4"); 3.44 (м. 1Н; Н-3",5"); 3.50 (дд, 1Н, 9.0/7.3; Н-2"); 3.71 (дд, 1Н, 12.1/5.5; 6"ß); 3.91 (дц, 1Н. 12.1/2.0; Н-6"а): 3.98 (септ, 1Н, 6.3; Н-2'); 5.04 (д, 1Н, 7.3; Н-1"); 5.95 (д, 1Н, 2.3; Н-4): 6.17 (д. 1Н, 2.3; Н-6). Спектр ЯМР ,3С (CD3OD; 5, м.д.): 212.0 (С-1'); 167.5 (С-3); 165.6 (С-5); 161.6 (С-1); 106.2 (С-2); 101.5 (С-1"); 98.3 (С-4); 95.3 (С-6); 78.7 (С-3"); 78.4 (С-5"); 74.8 (С-2"); 71.2 (С-4"); 62.5 (С-6"); 40.5 (С-2'); 20.2 (3'-СН3); 19.5 (4'-СН3).

В масс-спектре (ESI) соединения 16 имеется молекулярный ион с m/z 357 и основной осколочный ион с m/z 195. Осколочный ион образуется при потере молекулярным ионом 162 единиц массы, соответствующих остатку гексозы.

В 'Н ЯМР спектре в слабом поле в области ароматических протонов при 5.94 и 6.17 м.д. располагаются два дублета (J = 2,3 Гц) интенсивностью каждый в один протон. Исходя из величины КССВ эти сигналы принадлежат двум протонам, находящимся в ароматическом кольце в мета-положении по отношению друг к другу. Следовательно, бензольное кольцо является тетразамещенным.

В сильном поле при 1.14 м.д. имеется триплет, интенсивностью 6 протонов, состоящий из двух дублетов, с КССВ 6.3 Гц. В 13С спектре этим сигналам соответствуют (HSQC) сигналы атомов углерода при 19.46 и 20.22 м.д. По данным корреляционных спектров НМВС и COSY дублеты при 1.14 м.д. связаны с сигналом при 3.98 м.д. (септет с J=6.3 Гц). Вышеприведенные сигналы доказывают наличие в исследуемом соединении изопропильной группы. Эта группа находится в сх-положении (НМВС) к кетогруппе (211.97 м.д.), которая, в свою очередь, присоединена к бензольному кольцу (106.21 м.д.).

Судя по положению в 3С ЯМР спектре сигналов трех оставшихся в бензольном кольце атомов углерода (161.63; 165.61 и 167.50 м.д.), они связаны с атомами кислорода. К одному из них присоединен углеводный остаток, место присоединения которого к бензольному кольцу (161.63 м.д.) следует из корреляционного спектра НМВС, в котором дублет аномерного протона (5.04 м.д., J=7.3 Гц) дает интенсивный кросс-пик с сигналом при 161.63 м.д. и слабые кросс-пики с сигналами при 165.61 и

21

167.50 м.д. Величина КССВ аномерного протона соответствует /?-ииранозной форме углевода. Величины ХС углевода в ВС ЯМР спектре (62.46; 71.17; '74.82; 78.38 и 78.68 м.д.) характерны для/>-0-глгокопиранозида.

Оставшиеся два заместителя бензольного кольца, опираясь на данные ЯМР ('Н и 13С) и масс-спектра, являются двумя гидроксильными группами в мета-положении.

На основании вышеизложенного следует, что выделенное соединение имеет структуру ЬО-^-Б-глюкопиранозида (2-метилпропаноил)флороглюцина,

Тестирование 1-О-Р-В-глюкопиранотда (2-метилпропаноил)флорогпюцина (16) на образование коллоидного помутнения пива проводили в среде ацетатный буфер - этанол (95:5), % об. с величиной рН 4.3, близкой к рН пива. В качестве модельного белка использовали пролинсодержащий белок глиадин.

Кроме того нам представилось интересным исследовать также влияние ионов железа (III) на образование белково-полифенольных комплексов, поскольку известна хелатообразующая способность некоторых полифенолов в присутствии ионов переходных металлов, таких железо, медь и др., способствующая усилению коллоидного помутнения пива.

Приготовленные модельные системы исследовали согласно общепринятой методике, используемой при тестировании пива на склонность к образованию коллоидного помутнения в производственных условиях.

Полученные результаты показали, что 1-0-/Ш-глюкопирапозид (2-метилпропаноил)флороглюцина (16) образует комплексы с глиадином, участвующие в формировании обратимого коллоидного помутнения пива. Присутствие ионов Бе3+ повышает интенсивность образования белково-полифенольных комплексов с участием исследуемого соединения по сравнению с холостым опытом.

Участие производных ацилфлороглюцина в образовании коллоидного помутнения пива ранее не изучалось, поэтому полученные нами новые данные позволят получить дополнительную информацию о природе образования коллоидного помутнения пива и разработать комплекс мер по его предотвращению.

представленную на рис. 12.

Рисунок 12 - Структурная формула соединения 16

Выводы

1. Разработаны схемы выделения пренилированных халконов из гранулированного хмелепродукта, представляющие собой комплекс химических и хроматографических методов.

2. Установлено присутствие в гранулированном хмелепродукте четырех пренилированных халконов (ксантогумола, ксантогумола Б. ксантогумола С и 1",2"-дигидроксантогумола С). Последний обнаружен впервые в хмелепродуктах. Идентификация соединений проведена современными физико-химическими методами (ИК-, УФ-, 'Н и 13С и 2Г) ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия).

3. Определено количественное содержание ксантогумола - одного из наиболее физиологически высокоактивных пренилхалконов, в хмелепродуктах из хмеля российской селекции и дикорастущем хмеле, собранном в Иркутской области методом ОФ ВЭЖХ. Найдено, что в прессованных шишковых хмелепродуктах всех исследованных сортов содержание ксантогумола находится в пределах 0.06 - 0.70% в.с.в, а в молотых брикетированных -0.25-1.09 % в.с.в. В шишках дикорастущего хмеля содержание этого соединения - 0.55 %.

4. Впервые изучена динамика изомеризации ксантогумола в изоксантогумол в зависимости от рН среды и времени. Показано, что максимальная конверсия ксантогумола в изоксантогумол происходит при значении рН 8 и продолжительности реакции 40-60 минут. В кислых средах (рН 2-6), несмотря на практически полнее превращение исходного соединения в ходе проведения реакции, получен низкий выход изоксантогумола.

5. Установлено, что в состав фенольных соединений «Полифенольного экстракта хмеля» входят катехины, а именно (±)-катехин и (->эпикатехин, а также п-гидроксибензойная кислота и ее производные ванилиновая и протокатеховая кислоты; оксикоричная (и-кумаровая) кислота и ее производные кофейная, феруловая кислоты. Среди указанных соединений впервые обнаружены в хмелевом сырье н-оксибензойная, протокатеховая и феруловая кислоты.

6. Впервые установлено участие 1 -0-/№-глюкопиранозида (2-метилпропаноил)-флороглюцина в образовании комплексов с глиадином, являющихся основной причиной образования обратимого коллоидного помутнения пива.

Основные публикации по теме диссертации

1. Чеснокова А.Н., Луцкий В.И., Громова A.C., Ушаков И.А. Пренилированные халконы хмеля - природные противоопухолевые, антиоксидантные и антимикробные соединения // Вестник Иркутского государственного технического университета.-№ 1, 2007-С. 55-60.

2. Чеснокова А.Н., Луцкий В.И., Горшков А.Г. Пренилированные халконы Humulus lupulus /.' Химия природных соединений, 2009, № 5, 597-598.

3. Чеснокова А.Н., Луцкий В.И., Ушаков И.А. Исследование полифенольного комплекса коммерческого хмелевого экстракта // Вестник Иркутского государственного технического университета, №4(51), 2011, с. 104-109.

4. Луцкий В.И., Баженов Б.Н., Молокова К.В., Финкельштейн Б.Л., Чеснокова А.Н. Исследование изомеризации ксантогумола в изоксантогумол // Химия растительного сырья. 2011. №3. С.75-80.

5. Чеснокова А.Н., Кузнецова С.А., Луцкий В.И. Фенольные биологически активные соединения гранулированного хмеля. // Перспективы развития технологии, экологии и автоматизации химических, пищевых и металлургических производств: Материалы докладов научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора И.К. Скобеева,-Иркутск:Изд.ИрГТУ, 2007 С. 107-108.

6. Чеснокова А.Н., Коносова М.В. Выделение ксантогумола из хмеля // Перспективы развития технологии, экологии и автоматизации химических, пищевых и металлургических производств: Материалы докладов научно-практической конференции. - ИркутсгсИзд.ИрГТУ, 2008 - С. 135-137.

7. Чеснокова А.Н., Луцкий В.И. Пренилированные халконы хмеля// Актуальные проблемы химии природных соединений: Тезисы докладов Международной конференции, Ташкент (Узбекистан), 2009, С. 95.

8. Чеснокова А.Н. Количественное определение ксантоп'мола в российских сортах хмеля методом ВЭЖХ Ж Всероссийская конференция студентов и аспирантов «Пищевые продукты и здоровье человека». 43 Кемерово,2009-С. 63-64

9. Чеснокова А.Н., Луцкий В.И. Фенольные соединения хмеля обыкновенного (Ilumulus lupulus L.) и хмелепродуктов //Экологобезопасные и ресурсосберегающие технолопш и материалы: материалы Всероссийской молодежной научно-практической конференции с международным участием (г. Улан-Удэ, 12-14 мая 2011 г.)/науч. ред. Е Г. Хайкина.Улан-Удэ: Изд-воБурятского госуниверситета,2011.-с. 148-150.

10.Chesnokova А., Kunz T., Lutsky V., Methner F.-J.. Acylphloroglucinol Glucoside from Hops: Isolation, Identification and Haze-activity // Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Glasgow, 2011, Fachverlag Hans Carl: Nürnberg, Germany, CD ROM, 2011, Contribution 64.

Подписано в печать 5.12.2011. Формат 60x90 / 16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1,75. Тираж 100 экз. Зак. 231. Поз. плана34н.

Лицензия ИД X» 06506 от 26.12.2001 Иркутский государственный технический университет 664074, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83

61 12-2/227

Министерство образования и науки РФ ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный технический университет»

На правах рукописи

Чеснокова Александра Николаевна

фенольные соединения хмеля обыкновенного

(нимиьт ьириьт ь.) и хмелепродуктов

02.00.03 - Органическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: к.х.н., с.н.с. Луцкий В.И.

Иркутск - 2011

Оглавление

Введение.......................................................................................5

Глава 1. Химический состав и физиологическая активность фенольных соединений хмеля обыкновенного (Нитгйш 1ири1ш Ь.) (Литературный обзор)..........................................................9

1.1. Химический состав.................................................................10

1.1.1. Флавонолы и их гликозиды................................................11

1.1.2. Лейкоантоцианидины.......................................................12

1.1.3. Антоцианидины..............................................................13

1.1.4. Катехины и проантоцианидины...........................................13

1.1.5. Стильбены....................................................................16

1.1.6. Флороглюциды .............................................................17

1.1.7. Пренилированные флавоноиды...........................................20

1.1.8. Фенолкарбоновые кислоты................................................30

1.2. Физиологическая активность ...................................................31

Глава 2. Фенольные соединения хмелепродуктов

(Обсуждение результатов).....................................................35

2.1. Выделение пренилированных халконов из гранулированного хмелепродукта........................................................................35

2.1.1. Подбор условий экстракции...............................................35

2.1.2. Разработка схем выделения.................................................37

2.1.3. Идентификация выделенных соединений...............................43

2.2. Определение количественного содержания ксантогумола.................52

2.3. Исследование изомеризации ксантогумола в изоксантогумол...........55

2.3.1. Изучение динамики изомеризации ксантогумола в изоксантогумол в зависимости от величины рН и времени..........55

2.3.2. Получение изоксантогумола................................................59

2.3.3. Идентификация изоксантогумола............................................59

2.4. Изучение состава фенольных соединений «Полифенольного

экстракта хмеля».................................................................61

Глава 3. Идентификация фенольных соединений хмеля, участвующих в

образовании коллоидного помутнения пива (Практическая часть)..............66

Глава 4. Экспериментальная часть.........................................................74

4.1. Характеристика объектов исследования..........................................74

4.1.1. Хмелепродукты..................................................................74

4.1.2. Другие объекты................................................................75

4.2. Методы исследования...............................................................76

4.2.1. Химические методы...........................................................76

4.2.1.1. Определение массовой доли влаги...................................76

4.2.2. Хроматографические методы.................................................77

4.2.2.1. Аналитическая тонкослойная хроматография......................77

4.2.2.2. Препаративная тонкослойная хроматография......................77

4.2.2.3. Препаративная колоночная и

флеш-хроматография.....................................................78

4.2.2.4. Аналитическая высокоэффективная жидкостная хроматография............................................................78

4.2.2.5. Препаративная высокоэффективная жидкостная хроматография............................................................80

4.2.3. Спектральные методы.........................................................81

4.2.3.1. УФ спектроскопия.......................................................81

4.2.3.2. ИК спектроскопия.......................................................81

4.2.3.3. ЯМР спектроскопия.....................................................81

4.2.3.4. Масс-спектрометрия....................................................82

4.2.3.5. Хроматомасс-спектрометрия..........................................82

4.3. Выделение пренилированных халконов из гранулированного хмелепродукта.........................................................................83

4.3.1. Подбор условий экстракции.................................................83

4.3.2. Выделение пренилхалконов по схеме 1.....................................84

4.3.3. Выделение пренилхалконов по схеме 2..................................86

4.4. Определение количественного содержания ксантогумола................88

4.5. Исследование изомеризации ксантогумола в изоксантогумол............89

4.5.1. Изучение динамики изомеризации ксантогумола в изоксантогумол в зависимости от величины рН и времени...........89

4.5.2. Получение изоксантогумола (5)...........................................89

4.6. Изучение состава фенольных соединений «Полифенольного экстракта хмеля»....................................................................90

4.7. Идентификация фенольных соединений, участвующих в образовании коллоидного помутнения пива...................................91

4.7.1. Выделение фракции фенолов из «Полифенольного

экстракта хмеля» и ее разделение........................................91

4.7.2. Выделение l-O-^-D-глюкопиранозида (2-метилпропаноил)-флороглюцина......................................................................................93

4.7.3. Тестирование на образование коллоидного

помутнения пива..............................................................94

Выводы.........................................................................................95

Благодарности.................................................................................97

Список цитируемой литературы............................................................99

Приложение А. Схемы исследований..................................................111

Приложение Б. Спектры ЯМР выделенных соединений.............................113

Приложение В. Массовая доля влаги в хмелепродуктах............................131

Введение

Фенольные соединения, содержащиеся в растительном сырье, представляют интерес для науки и практики, поскольку их химическая структура обусловливает проявление различной физиологической активности.

Одним из источников фенольных соединений является хмель обыкновенный (Нитъйт 1ири1ш Ь.) - важная техническая культура, выращиваемая во многих странах мира. Хмель, благодаря его уникальному химическому составу, с давних пор применяется как в народной, так и в научной медицине. Кроме того, он является незаменимым сырьем для пивоваренной промышленности. Значимость фенольных соединений для пивоварения состоит в их участии в замедлении окислительных процессов, благодаря чему увеличиваются сроки хранения пива [1,2]. Но, с другой стороны, некоторым полифенолам, приписывается негативная роль: считается, что в результате их взаимодействия с белками возникает коллоидное помутнение напитка [3-5].

Центральное место среди веществ фенольной природы, содержащихся в хмеле, занимают пренилированные флавоноиды и, особенно, пренилированные халконы. Данные соединения в последнее время представляют большой интерес для ученых в связи с установлением их значительной противоопухолевой [6-9], антиоксидантной [10,11], фитоэстрогенной [12-14], противовоспалительной [15,16] и противовирусной активности [17,18].

Результаты изучения качественного и количественного состава пренилхалконов в некоторых зарубежных сортах хмеля отражены в работах Р. Хэнсель и Ю. Шульц [19], Р. Табата с соавт. [20], Дж. Ф. Стивенса с соавт. [21-23], Л.Р.Чадвига с соавт. [24], В.-С. Ванг с соавт. [25] и др. Сведения же по содержанию данных соединений в хмеле российской селекции ограничены и представлены лишь в работах А.П. Арзамасцева и М.А. Алексеевой с соавт. [26,27].

Для сохранения ценных компонентов хмеля и повышения эффективности его промышленного использования вырабатывают различные виды хмелепродуктов. На долю последних приходится до 80% производимого хмелевого сырья. Хмелепродукты представляют собой чрезвычайно сложные смеси химических соединений, причем состав отдельных видов резко отличается. Несмотря на то, что хмель подвергался довольно тщательному исследованию учеными, изучению фенольных соединений хмелепродуктов с химической точки зрения внимания практически не уделялось.

В последние годы во многих лабораториях мира ведется разработка методов выделения пренилированных халконов из хмелевого сырья. Однако, учитывая поликомпонетность и сложность состава хмелепродуктов, существующие схемы [28,29] не позволяют получать соединения высокой степени чистоты, а также довольно сложны в аппаратурном оформлении. Поэтому перспективным направлением является разработка схем выделения пренилированных халконов, лишенных этих недостатков, а актуальной задачей - изучение химического состава фенольных соединений хмелепродуктов.

Целью работы являлось исследование химического состава фенольных соединений хмелепродуктов, а также идентификация соединений, участвующих в образовании коллоидного помутнения пива.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- Проанализировать литературные данные по химическому составу фенольных соединений хмеля обыкновенного и их практическому применению;

- Разработать схемы выделения пренилированных халконов из гранулированного хмелепродукта;

- С помощью разработанных схем выделить доминирующие пренилированные халконы из гранулированного хмелепродукта и провести их идентификацию физико-химическими методами;

- Определить количественное содержание ксантогумола в российских хмелепродуктах из селекционного хмеля и в дикорастущем образце (Иркутская область);

- Исследовать изомеризацию ксантогумола в изоксантогумол;

- Изучить состав фенольных соединений «Полифенольного экстракта хмеля» и идентифицировать соединения, участвующие в образовании коллоидного помутнения пива.

В качестве объектов исследования были выбраны гранулированный хмелепродукт (тип 45) из хмеля сорта Магнум, молотые брикетированные и прессованные шишковые хмелепродукты из наиболее перспективных сортов российской селекции Крылатский, Подвязный, Сумерь, дикорастущий образец хмеля (Иркутская область), а также «Полифенольный экстракт хмеля».

В работе разработаны схемы выделения пренилированных халконов из гранулированного хмелепродукта, представляющие собой комплекс химических и хроматографических методов. Предложенные схемы позволили впервые выделить 1",2"-дигидроксантогумол С из хмелепродуктов. Впервые изучен состав фенольных соединений молотых брикетированных, прессованных шишковых хмелепродуктов российского производства, коммерческого «Полифенольного экстракта хмеля», а также шишек дикорастущего хмеля (Иркутская область). В исследуемых хмелепродуктах идентифицирован ряд катехинов и фенолкарбоновых кислот, препаративно выделен и идентифицирован физико-химическими методами 1-0-/Ш-глюкопиранозид (2-метилпропаноил)флороглюцина. Среди указанных соединений впервые обнаружены в хмелевом сырье и-гидроксибензойная, протокатеховая и феруловая кислоты. Определено количественное содержание пренилхалкона ксантогумола, впервые изучена динамика его изомеризации в модельных условиях.

Предложенные в работе схемы выделения пренилированных халконов позволяют получать соединения высокой степени чистоты (не менее 90%), которые ввиду их высокой физиологической активности, в том числе

антиоксидантной и противоопухолевой, могут быть использованы для получения лекарственных средств, а также в качестве антиоксидантов для пищевой промышленности.

На основании проведенных исследований впервые установлено участие 1-0-/?-0-глюкопиранозида (2-метилпропаноил)флороглюцина в формировании белково-полифенольных комплексов, являющихся основной причиной обратимого коллоидного помутнения пива, ухудшающего его качественные показатели.

Диссертация состоит из четырех глав. В литературном обзоре рассмотрены состав и химическое строение фенольных соединений хмеля обыкновенного, основываясь на литературных источниках, опубликованных до 2011г. Отдельный раздел посвящен физиологической активности фенолов хмеля и включает новые данные, полученные в период с 1999 по 2010 гг.

Вторая глава «Обсуждение результатов» посвящена разработке схем выделения пренилированных халконов из гранулированного хмелепродукта, спектральной идентификации (ИК, УФ, ЯМР, МС) соединений, выделенных при помощи указанных схем, количественному определению пренилхалкона ксантогумола в хмелепродуктах методом ОФ ВЭЖХ и исследованию его изомеризации. В отдельном разделе обсуждается идентификация фенольных соединений в новом виде хмелепродуктов - «Полифенольном экстракте хмеля».

Третья глава включает результаты практической части исследования, посвященной идентификации фенольных соединений хмеля, участвующих в образовании коллоидного помутнения пива.

Методики проведения экспериментов, характеристика объектов и методов исследования приведены в четвертой главе «Экспериментальная часть».

Глава 1. Химический состав и практическое применение фенольных соединений хмеля обыкновенного (Нити1т 1ири1т Ь.)

(Литературный обзор)

Техническая культура - хмель обыкновенный (Нити1№ 1ири1т Ь.) находит практическое применение во многих отраслях. Как лекарственное растение она широко используется в научной и народной медицине. Кроме того хмель издавна культивируется для потребностей пивоваренной промышленности. Шишки хмеля придают пиву горечь и аромат, а также способствуют его консервации. Хмель также находит применение в косметической промышленности и в хлебопечении.

Такой широкий практический интерес обусловлен содержанием в составе хмеля различных органических соединений, среди которых особое место занимают фенолы. Данным соединениям в прошлом не уделялось достаточного внимания ученых и только в последнее время благодаря усовершенствованию хроматографических и физико-химических методов исследования стало возможным их широкое изучение. Современная хроматографическая техника позволяет выделить минорные соединения, содержание которых в сырье составляет сотые доли процента, а двумерные и мультиимпульсные методики ЯМР - установить структуру соединений с массой до 1000 е.м., имея несколько миллиграмм вещества. Все это ведет к интенсивному обнаружению химиками новых фенольных соединений и дает возможность биологам исследовать их физиологическую активность.

Представляемый литературный обзор посвящен рассмотрению состава и химического строения фенольных соединений хмеля обыкновенного, а также их физиологической активности, включая результаты последних научных достижений в этой области.

1.1 Химический состав фенольных соединений Нити1т 1ири1ш Ь.

Изучение фенольных соединений хмеля обыкновенного началось в конце 50-х - начале 60-х годов прошлого столетия [30-33].

В ранних работах (конец 1950-х - середина 1980-х гг.) внимание ученых было сосредоточено, главным образом, на таких широко распространенных в растениях группах фенольных соединений как флавонолы и их гликозиды, а также антоцианы, антоцианидины и катехины [30-35].

В настоящее время наблюдается большой интерес к изучению пренилированных флавоноидов в связи с установлением их широкого спектра физиологической активности, в том числе и противоопухолевой [6-8]. Хотя структуры доминирующих пренилфлавоноидов были определены во второй половине прошлого века [19,36], в последние 10-15 лет из хмеля был выделен ряд новых минорных халконов и флавоноидов с пренильными и геранильными заместителями и установлено их химическое строение [20-25].

Группа проантоцианидинов хмеля также была подробно изучена лишь недавно. В частности, в работах [37-39] установлены химические структуры ряда проантоцианидиновых димеров и тримеров.

В 2005 г. в хмеле были обнаружены представители стильбенов [40,41], среди которых присутствовал ресвератрол - соединение, обусловливающее кардиопротекторное действие красного вина.

Другой важной, но пока еще мало изученной группой хмелевых полифенолов являются ацилированные производные флороглюцина (флороглюциды), исследование химической структуры которых отражено в работах [42-44]. Два представителя этой группы - 2-(3-метилбутаноил)-1,3,5-тригидроксибензол (флороизовалерофенон) и 2-(2-метилпропаноил)-1,3,5-тригидроксибензол (флороизобутирофенон) являются, предположительно, первыми ароматическими интермедиатами в биосинтезе так называемых горьких кислот [45]. Последние являются специфическими соединениями

хмеля и, помимо обнаруженной у них физиологической активности, интересны еще и тем, что они участвуют в формировании горького вкуса пива.

Исследованию такой широко представленной в растениях группы соединений, как фенолкарбоновые кислоты, внимания практически не уделялось, и имеются лишь несколько работ, посвященных их изучению в хмеле [46-49].

1.1.1 Флавонолы и их гликозиды

Количество моносахаридных остатков во флавоноловых гликозидах варьируется от одного до трех. Молекулы с более длинными углеводными цепями находят редко [50].

В спиртовых и водных экстрактах соплодий хмеля обнаружены (рис. 1)3-О-глюкозиды и З-Орамноглюкозиды (рутинозиды) кемпферола и кверцетина (1-4) [30,34,51].

г*

р?

(1) кемпферол-З-0-глюкозид

(2) 11=ОН кверцетин-З-О-глюкозид

(3) Я=Н кемпферол-З-О-рутинозид

(4) Я=ОН кверцетин-З-О-рутинозид

Рис. 1. Флавонолгликозиды Нити1т 1ири1ш Ь.

Стивене с соавт. [21] при помощи метода жидкостной хроматографии -масс-спектрометрии предварительно идентифицировали 6"-0-малонилгликозиды кемпферола и кверцетина (5 и 6) в хмелевом экстракте

(рис. 2). Последующее выделение и за�