Хроматографическое определение фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

БЕРНИКОВСКАЯ НАТАЛЬЯ АНДРЕЕВНА

ХРОМАТОГРАФНЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ФЛАВОНОИДОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЯХ

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 4 НОЯ 2011

Краснодар - 2011

005003727

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Кубанского государственного университета

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Темердашев Зауаль Ахлоович

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Пирогов Андрей Владимирович

кандидат технических наук Якуба Юрий Федорович

Ведущая организация: Северный (Арктический) федеральный

университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «15» декабря 2011 г. в 14-00 часов в ауд. 234с на заседании диссертационного совета ДМ 212.101.16 в Кубанском государственном университете по адресу: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кубанского государственного университета.

Автореферат разослан «12» ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук, доцент

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Качество лекарственного растительного сырья, содержащего фенольные соединения и флавоноиды, в России регламентируется фармакопейными статьями, в которых установлены требования по содержанию дубильных веществ, эфирных масел, проазуленов, показатели влажности, зольности и т.д. Определение в фотоматериалах фенольных соединений и флавоноидов осуществляется методами титриметрии и спектрофотометрии, которые позволяют оценить суммарное содержание веществ, в то время как для медицины в большинстве случаев интерес представляют данные о концентрации индивидуальных фенольных соединений.

В этом отношении актуальная задача идентификации и определения индивидуальных фенольных соединений, как правило, решается с помощью методов хроматографии, позволяющих получить информацию о качественном составе растительного сырья. Поэтому перспективным направлением является разработка оригинальных методик определения фенольных соединений с учетом разнообразия их структуры и свойств. Представляет также несомненный научный и практический интерес зависимость содержания фенольных соединений в лекарственных растениях от условий их произрастания и хранения.

Диссертационная работа выполнена в рамках грантов РФФИ р_юг_а 06-03-96660 «Обоснование и разработка обобщенных показателей качества растительных материалов для оценки состояния экосистем» и 09-03-96529 «Теоретическое и экспериментальное обоснование обобщенного показателя качества пищевой и сельскохозяйственной продукции - антиоксидантной активности».

Целью настоящей работы является разработка методик идентификации и определения индивидуальных фенольных соединений в лекарственных растениях методами хроматографии и хромато-масс-спектрометрии.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

- разработка ВЭЖХ-методики идентификации и определения различных фенольных соединений в фитоматерилах;

- оптимизация условий идентификации фенольных соединений в лекарственных растениях методом газовой хромато-масс-спектрометрии;

- разработка схемы идентификации и определения фенольных соединений в лекарственном растительном материале;

- оценка содержания фенольных соединений в лекарственных растениях в зависимости от условий произрастания и хранения.

Научная новизна

Разработан методический подход к идентификации и определению фенольных соединений и флавоноидов в фитоматерилах, а также схема анализа, позволяющая проводить оценку их содержания в зависимости от условий произрастания и хранения лекарственных растений.

Практическая значимость работы

Предложена оригинальная схема идентификации и определения фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях.

Разработанные и оптимизированные хроматографические методики определения фенольных соединений в лекарственных растениях позволяют осуществлять контроль качества фитоматериалов на этапах их сбора, переработки, хранения и обращения.

На защиту выносятся следующие основные положения диссертации:

1. Результаты исследований по идентификации и определению различных фенольных соединений и флавоноидов в фитоматерилах методом ВЭЖХ;

2. Результаты экспериментальных и теоретических исследований по идентификации фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях методом ГХ-МС;

3. Схема идентификации и определения фенольных соединений в растительном материале методами хроматографии;

4. Результаты анализа ряда лекарственных растений по оценке содержания фенольных соединений в зависимости от условий произрастания и хранения фитоматериалов.

Публикации и апробация работы. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 15 печатных изданиях, включая 3 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК, и 12 тезисов докладов.

Результаты исследований докладывались на VII международной конференции "Instrumental methods of analysis. Modern trends and application" (г. Ханья, Греция, 2011), EI Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» с международным участием (г. Краснодар, 2011), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и

капиллярный электрофорез» с международным участием (г. Краснодар, 2010), 64 и 66 региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2009, 2011), Всероссийских конференциях «Аналитика России» с международным участием (г. Краснодар, 2007, 2009), IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул, 2009), Всероссийской конференции «Химический анализ» (г. Москва, 2008), VI Всероссийской научной конференции «Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах» (г. Анапа, 2009), научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, Украина, 2009).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы (215 наименований) и приложения.

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава включает обзор литературы, в котором обсуждаются основные методы качественного и количественного определения фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях, пищевых продуктах и напитках растительного происхождения, приводится анализ возможностей различных методов определения фенольных соединений. На основе анализа литературных данных сделаны выводы, сформулированы цель и задачи исследований.

Во второй главе приведен перечень используемых материалов, средств и методов исследования, а также результаты хроматографических исследований по разработке и применению методик определения фенольных соединений и флавоноидов в фотоматериалах.

Диссертационная работа изложена на 187 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 таблицами и 55 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разделение и определение фенольных соединений и флавоноидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Анализ литературных данных показал, что одним из самых надежных методов определения индивидуальных фенольных

соединений в сложных биологических объектах является высокоэффективная жидкостная хроматография, благодаря возможности варьирования состава подвижной фазы, режима элюирования, выбора модификаторов, сорбентов и способов детектирования.

Для анализа лекарственных растений нами проводились исследования по оценке возможности определения фенольных соединений и флавоноидов с использованием ВЭЖХ. При разделении определяемых веществ использовали колонки на основе силикагеля с привитыми группами С18 - сорбенте, положительно зарекомендовавшем себя в аналитической практике, обеспечивающем высокую эффективность разделения как полярных, так и малополярных фенольных соединений и их оптических изомеров. Удерживание веществ изучали на различных колонках с привитыми группами С18: Separon SGX (120 мм х 2.1 мм, 5 мкм), Zorbax SB CI8 (150 мм х 2.1 мм, 5 мкм), Hypersil ODS (200 мм х 2.1 мм, 5 мкм).

Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Shimadzu LC 20 Prominence с детектированием в УФ-области диодно-матричным детектором SPD-M20A. Использовали подвижную фазу состава ацетонитрил - вода с линейным увеличением концентрации ацетонитрила от 0 до 20%, скорость потока подвижной фазы составляла 0.25 мл/мин, диапазон детектирования 190-390 нм. Сравнивали эффективность колонок по значениям параметров удерживания {к, а) и высоте (Н), эквивалентной теоретической тарелке, при разделении галловой, кофейной кислот и рутина - основных представителей классов фенолкарбоновых, коричных кислот и флавоноидов (табл. 1).

Таблица 1 - Параметры удерживания фенольных соединений на различных колонках с обращено-фазовым сорбентом (Р = 0.95, п = Ъ)

Показатель Колонка Галловая кислота трансКофейная кислота Рутин

к Separon SGX 2.60 ±0.04 6.3 ±0.1 7.7 ±0.1

Zorbax SBC18 2.2 ±0.2 6.3 ±0.1 7.2 ±0.1

Hypersil ODS 2.12 ±0.03 4.84 ±0.04 5.59±0.04

а Separon SGX - 2.43 ±0.02 1.21 ±0.01

Zorbax SB CI8 - 2.9 ±0.2 1.15±0.03

Hypersil ODS - 2.28 ±0.04 1.16±0.03

Н Separon SGX 0.15 0.0015 0.0016

Zorbax SB CI8 0.10 0.0015 0.0016

Hypersil ODS 0.10 0.0016 0.0018

При попарном сравнении показателей разделения веществ установлено, что на колонке Zorbax SB CI8 фактор удерживания максимален для всех соединений, а высота, эквивалентная теоретической тарелке, минимальна. Таким образом, в дальнейшем при разработке ВЭЖХ-методики использовали колонку Zorbax SB С18, 150 мм х 2 мм, 5 мкм.

Для подбора оптимального режима элюирования варьировали состав элюента в широком интервале концентраций ацетонитрила (от 3 до 40%), в элюент Б добавляли дигидрофосфат калия (0.04 М) и подкисляли ортофосфорной кислотой. Оптимальный градиентный режим отрабатывали на модельной смеси фенольных соединений, в состав которой в равных соотношениях входили галловая, протокатеховая, транс-кофейная, транс-феруловая кислоты, рутин, кверцетин, дигидрокверцетин и (-)-эпикатехин (табл. 2). Изучали следующие режимы:

- градиент 1: элюент А 3% (3 мин), 3-40% (22 мин);

- градиент 2: элюент А 3% (3 мин), 3-5% (1 мин), 5% (4 мин), 540% (17 мин);

-градиент 3: элюент А 3% (3 мин), 3-10% (1 мин), 10% (4 мин), 1040% (17 мин);

- градиент 4: элюент А 3% (3 мин), 3-5% (1 мин), 5% (4 мин), 510% (7 мин), 10% (3 мин), 10-40% (7 мин);

- градиент 5: элюент А 3% (3 мин), 3-5% (1 мин), 5% (4 мин), 520% (7 мин), 20% (3 мин), 20-40% (7 мин), 40% (3 мин).

Таблица 2 - Факторы удерживания (к) фенольных соединений в различных градиентных режимах (Р = 0.95, п = 3)_

Соединение Градиент

1 2 3 4 5

Галловая кислота 0.95±0.02 0.9±0.1 0.9±0.1 0.92±0.02 0.93±0.01

Протокатеховая кислота 3.0±0.3 3.0±0.2 3.0±0.1 3.0±0.1 3.02±0.01

Дигидрокверцетин 5.4±0.1 6.7±0.3 4.7±0.2 7.4±0.1 6.8±0.2

Кофейная кислота 5.9±0.1 7.1±0.3 5.5±0.2 8.0±0.1 7.1±0.2

(-)-Эпикатехин 6.31±0.04 7.6±0.3 6.2±0.4 10.0±0.2 7.7±0.2

Рутин 7.6±0.1 8.8±0.4 7.8±0.3 11.2±0.2 8.7±0.2

Феруловая кислота 7.83±0.01 8.9±0.4 7.9±0.3 11.3±0.2 8.9±0.2

Кверцетин 10.6±0.1 11.2±0.5 10.7±0.4 12.6±0.2 12.0±0.3

Как видно из табл. 2, для разделения пиков кофейной кислоты, дигидрокверцетина и (-)-эпикатехина при градиенте 2 требуется увеличение концентрации ацетонитрила на второй ступени до 5%, при градиентах 3 и 4 - до 10%. Однако при увеличении содержания

ацетонитрила до 10% не разделялись пики рутина и феруловой кислоты. Оптимальное разделение веществ достигалось при увеличении концентрации ацетонитрила на второй ступени до 5%, на второй - до 20% (градиент 5).

При оптимизации условий определения в высокоэффективной жидкостной хроматографии необходимо учитывать природу и содержание органических модификаторов. Для увеличения селективности в аналитической практике используют подвижные фазы с различным содержанием органических модификаторов: 2.5-10% метанола (в элюенте А), а также 0.1-0.5% гидроксида тетрабутиламмония и 0.1-0.5% диэтиламина (в элюенте В). Однако при оценке разрешения пиков соединений установлено, что в данной хроматографической системе изученные модификаторы не способствовали улучшению разделения анализируемых соединений.

Одним из определяющих факторов, влияющих на разделение веществ фенольной природы, является величина рН подвижной фазы. Нестабильность сорбента колонки при рН ниже 2.0, с одной стороны, и диссоциация фенолкарбоновых и коричных кислот при рН выше 3.0, с другой стороны, ограничили выбор рН фосфатного буферного раствора диапазоном от 2.0 до 3.0. Установлено, что разрешение пар соединений (-)-эпикатехин - кофейная кислота, рутин - (-)-эпикатехин и кверцетин - феруловая кислота максимально при рН 2.3 (табл. 3). Но при этом одновременное определение рутина и феруловой кислоты затруднено из-за недостаточного разрешения пиков, более полное разделение этих веществ достигается при рН 2.8.

Таблица 3 - Величины разрешения (Дя) фенольных соединений при различных значениях рН фосфатного буферного раствора

Соединение рН 2.0 рН 2.3 рН 2.5 рН 2.8 рНЗ.О

Галловая кислота - - - —

Протокатеховая кислота 4.9 5.6 4.8 5.5 5.4

Дигидрокверцетин 11.2 13.2 11.3 13.4 14.0

/иранс-Кофейная кислота 2.0 2.3 2.0 2.3 2.0

(-)-Эпикатехин 3.0 3.5 3.1 3.4 3.6

Рутин 7.3 8.1 7.9 7.7 7.6

тра//с-Фсруловая кислота 1.3 1.4 1.3 1.4 1.2

Кверцетин 13.4 16.0 13.5 15.1 14.9

Для обеспечения стабильности протекания хроматографического процесса устанавливали оптимальную температуру и поддерживали ее на постоянном уровне с помощью термостата колонок. Температуру

хроматографирования варьировали в диапазоне от 25 до 60°С с шагом 5°С. С повышением температуры происходит ускорение процессов сорбции и десорбции, уменьшается время удерживания веществ и ухудшается разделение пиков, при 45°С перекрываются пики феруловой кислоты и рутина (факторы удерживания равны), а при более высоких температурах меняется порядок элюирования этих соединений (из-за увеличения скорости десорбции пик феруловой кислоты появляется на хроматограмме раньше пика рутина). С другой стороны, наши исследования показали, что величина Rs практически для всех пар веществ выше при 30°С, поэтому данная температура была выбрана как оптимальная.

Таким образом, оптимальными условиями хроматографирования являются: колонка Zorbax SB С18 (150 мм * 2.1 мм, 5 мкм), элюент А - ацетонитрил, элюент Б - 0.04 М водный раствор КН2Р04, подкисленный Н3Р04 до рН 2.80±0.01, расход подвижной фазы 0.25 мл/мин, термостатирование колонки при 30°С. Режим элюирования - градиентный, четырехступенчатый: элюент А 3% 3 мин; подъем до 5 % за 1 мин, 4 мин 5% А; подъем до 20% за 7 мин, 3 мин 20% А; подъем до 40% за 7 мин, 3 мин 40% А. Диапазон детектирования - 190-390 нм.

В указанных условиях удалось достичь разделения смеси девятнадцати фенольных соединений, наиболее распространенных в лекарственных растениях (рис. 1). Установлена зависимость удерживания фенольных соединений одной группы от количества гидроксильных и метоксильных групп: время удерживания соединений возрастает с уменьшением количества ОН- и увеличением СН30- групп. Таким образом, время удерживания фенолкарбоновых кислот возрастает в ряду: галловая кислота —► протокатеховая кислота—► 4-гидроксибензойная кислота (3, 2 и 1 гидроксигруппа соответственно), и в ряду: 4-гидроксибензойная кислота -> ванилиновая кислота —> сиреневая кислота (0, 1 и 2 метоксигруппы соответственно).

кислота, 5 - дигидрокверцетин, 6 - ванилиновая кислота, 7 - транс-кофейная кислота, в - сиреневая кислота, , 9 - (-)-эпикатехин, 10- л-кумаровая кислота, /1 - /и/инс-синаповая кислота, 12 - рутин, 13 -т/инс-феруловая кислота, /-/-салициловая кислота, 15- нарингин, 16- гесперидии-7-рутииозид, 17 - п-анисовая кислота, 1Н - кверцетин, 19 - коричная кислота. Условия хроматографирования приведены в тексте.

Идентификацию индивидуальных фенольных соединений осуществляли по параметрам удерживания, а также по УФ-спектрам, с учётом чистоты пиков и коэффициентов подобия (81), рассчитываемых на основе спектральных данных известного и определяемого фенольных соединений. Для определения фенольных веществ в экстрактах растений предварительно устанавливали уравнения регрессии, линейные в широком интервале концентраций, с коэффициентом корреляции в пределах от 0.99 до 1.00 (табл. 4).

С помощью разработанной ВЭЖХ-методики проводили качественное и количественное определение фенольных соединений в водных экстрактах лекарственных растений как наиболее распространенной форме их употребления. В качестве объектов исследования выбраны лекарственные растения, широко используемые в терапевтических целях: зверобой продырявленный, тысячелистник обыкновенный, календула лекарственная, полынь горькая, шалфей лекарственный, ромашка аптечная, подорожник большой, душица обыкновенная, тимиан обыкновенный.

Таблица 4 - Аналитические характеристики ВЭЖХ-методики определения фенольных соединений (Р = 0.95, п = 6)_

Соединение Ть мин Хвих, им Диапазон определяемых концентраций, мкг/мл Уравнение регрессии С„„ мг/л г

Галловая кислота 4.1 270 2.5-100 5=(13.5±0.3)*103 1.9 0.99

Протокатеховая кислота 8.7 260 2.5 - 100 5=(12.3±0.2)хЮ3хс 1.2 0.99

Миндальная кислота 12.4 190 5-100 5=(46.8±0.7)х103хс 3.9 0.99

4-Гидроксибезойная кислота 14.3 255 1-100 Я=(24.7±О.З)х103хс 0.4 0.99

Дигидрокаерцетин 16.3 280 2.5 -100 Х=(2.85±0.04)х103 хс 1.3 1.00

Ванилиновая кислота 16.7 218 2.5-100 Х=(26.5±0.3)хЮ3хс 1.5 0.99

транс-Коф ейлая кислота 17.1 322 1 - 100 5=(-7.5±5.9)Х10л+ (23.4±0.1)х103хс 0.2 1.00

Сиреневая кислота 17.7 275 1 -100 5=(11.6 ±0.1) х ю3хс 0.5 0.99

(-)-Эпикатехин 18.0 280 2.5-100 £=(2.80±0.03)хЮ3хс 0.8 1.00

л-Кумаровая кислота 19.7 308 1-100 5=(20.8±0.3)х103хс 0.3 0.99

Синаповая кислота 20.1 322 2.5-100 ^=(-5.6±1.0)х10',+ +(4.56±0.03)х103хс 1.5 0.99

Рутин 20.5 255 1-50 5=(6.32±0.06)х103хс 1.2 0.99

тракс-Феруловая кислота 20.9 322 1 - 100 5=(22.6±0.4)х103хс 0.4 0.99

Салициловая кислота 22.1 260 1-100 5 = (42.1±0.4)хЮ3хс 0.2 0.99

Нарингии 22.6 283 10-100 5=(5.17±0.05)х103х 1.8 0.99

Гесперидин-7-рутииозид 23.3 282 3-15 ¿•=(4.5±0.1)х103хг 2.6 0.98

и-Анисовая кислота 24.4 255 0.5-100 5=(20.9±3.2)хЮ3хс 0.2 1.00

Кверцетин 27.2 255 1 - 100 5=(13.6±2.1)х103хс 0.2 1.00

Коричная кислота 27.6 275 0.5-100 5=(29.0±0.1)хЮ3хс 0.2 1.00

При анализе лекарственных растений, приобретенных в аптечной сети, был идентифицирован ряд фенольных соединений и проведена оценка правильности их ВЭЖХ определения в водных экстрактах растительного сырья методом «введено-найдено» (табл. 5).

В зверобое продырявленном определены протокатеховая кислота (0.37±0.02 мг/г), (-)-эпикатехин (0.82±0.03 мг/г) и рутин (9.41±0.01 мг/г); в тысячелистнике обыкновенном - протокатеховая кислота (0.05±0.01 мг/г) и »транс-кофейная кислота (0.05±0.01 мг/г); в календуле аптечной - транс-кофейная кислота (0.11±0.03 мг/г) и рутин (0.09±0.03 мг/г); в шалфее лекарственном - транс-кофейная кислота (0.49±0.02 мг/г); в ромашке аптечной — протокатеховая кислота (0.057±0.005 мг/г) в пересчете на абсолютно сухое сырьё.

Таблица 5 - Результаты оценки правильности определения фенольных соединений и флавоноидов (Р = 0.95, п = 3) _

Вещество Концентрация в водном экстракте, мг/л Введено, мг/л Найдено с учетом добавки, мг/л Относительная погрешность, 5, %

Зверобой продырявленный

Протокатеховая кислота 2.1 3.0 5.0 3.3

(-)-Эпикатехин 7.0 7.5 14.4 1.3

Рутин 28.5 15.0 44.5 6.7

Тысячелистник обыкновенный

Протокатеховая кислота 1.7 1.9 3.3 15.8

транс-Кофейная кислота 5.6 3.6 9.1 2.8

Календула лекарственная

транс-Кофейная кислота 3.8 4.6 8.1 6.5

Рутин 3.0 3.6 6.1 13.9

Шачфей лекарственный

транс-Кофейная кислота 3.5 4.6 7.4 15.2

Ромашка аптечная

Протокатеховая кислота 2.0 4.6 6.9 6.5

Идентификация фенольных соединений и флавоноидов методом газовой хромато-масс-спектрометрии

При определении, особенно при идентификации, фенольных соединений и флавоноидов растительного происхождения все большее распространение получает газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием, обеспечивающая разделение компонентов сложных природных матриц.

Анализ водных экстрактов растительного сырья проводили на газовом хроматографе БЫтасЬи вС2010 с масс-спектрометрическим детектором ССМ8-(ЗР2010 Р1ш. Для повышения летучести исследуемых веществ, термической стабильности, снижения пределов обнаружения предварительно проводили дериватизацию соединений М,0-бис-(триметилсилил)-трифторацетамидом (БСТФА), являющимся наиболее реакционно-способным дериватизирующим агентом.

В результате проведенных исследований на модельных растворах удалось достичь эффективного разделения смеси из 15-ти веществ (рис. 2).

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 мин

Рисунок 2 - ГХ-МС хроматограмма смеси фенольных соединений

1 - миндальная кислота, 2 - салициловая кислота, 3 - и-анисовая кислота, 4 - коричная кислота, 5-4-гидроксибензойная кислота, 6 - ванилиновая кислота, 7 - протокатеховая кислота, 8 - сиреневая кислота, 9 - галловая кислота, 10 - /7-кумаровая кислота, 11 - трднс-феруловая кислота, 12 - транс-кофейная кислота, 13 - транс-синаповая кислота, 14 - (-)-эпикатехин, 15 - кверцетин. Режим полного ионного тока. Колонка HP Ultra-2 25 м х 0.32 мм, 0.52 мкм (Agilent, США), газ-носитель - гелий, скорость потока в колонке 2.41 мл/мин. Температурная программа 100°С(3 мин), 100-150°С 10.5°С/мин, 150°С(2 мин), 150-300°С 10.0°С/мин, 300°С (8 мин). Температура инжектора 280°С, интерфейса - 280°С, ионного источника - 200°С. Объем вкола 1 мкл.

Из полученных результатов видно, что элюирование триметилсилил-производных фенольных соединений происходит в следующем порядке: фенолкарбоновые кислоты (группа а) —> коричные кислоты (б) —> флавоноиды (в).

Для ускорения процесса дериватизации подбирали оптимальные условия для смеси 15-ти соединений термостатированием в диапазоне температур 20-120°С с шагом 20°С в течение 30 мин (соотношение БСТФА и смеси 1:1, об.). Силилирование для фенолкарбоновых и коричных кислот наиболее эффективно при 40°С, однако для флавоноидов температурный оптимум приходится на область 80-100°С. Для большинства фенолкарбоновых и коричных кислот эффективность дериватизации при 100°С резко уменьшается, что связано с частичным разрушением этих соединений. Поэтому для силилирования экстрактов лекарственных растений, в которых присутствуют как фенолкарбоновые и коричные кислоты, так и флавоноиды, была выбрана температура 80°С.

Анализ отваров лекарственных растений на содержание фенольных соединений методом ГХ-МС возможен только при отсутствии воды в пробе. Сравнивали два метода удаления воды: жидкость-жидкостную и твердофазную экстракцию фенольных веществ из водных отваров

растений. Использовали патроны с сорбентами двух типов: на основе силикагеля с привитой фазой С18 (Диапак С18, размер частиц 4060 мкм) и сверхсшитого полистирола (Диапак П, размер частиц 50100 мкм). Изучали удерживание водных растворов галловой и кофейной кислот на сорбентах в динамическом режиме. Контроль процесса осуществляли методом ВЭЖХ. Показано, что объем «до проскока» на патронах С18 и ССПС для галловой кислоты составил соответственно 6.0 и 3.5 мл, а для кофейной кислоты - 8.5 и 20.0 мл (рис. 3). Установлено, что степень извлечения галловой кислоты на сорбенте С18 составила 82.8% и 80.6% на ССПС; для кофейной кислоты - 71.2% и 67.0%; для кверцетина - 98.9% и 63.7% соответственно. Минимальный объем ацетонитрила, необходимый для наиболее полного извлечения фенольных соединений, составляет 30 мл.

V,m/i V, мл

0 40 80 120 160 0 40 80 120 160

V, мл V, мл

Рисунок 3 - Динамические кривые сорбции фенольных соединений а - галловая кислота на С18, б - кофейная кислота на С18, в - галловая кислота на ССПС, г - кофейная кислота на ССПС Эффективность извлечения фенольных соединений оценивали на примере отваров тысячелистника обыкновенного и зверобоя продырявленного твердофазной экстракцией на сорбентах С18 и ССПС, а также жидкость-жидкостной экстракцией этилацетатом по сравнению с первоначальной концентрацией веществ в отваре. Установлено, что для извлечения фенольных соединений из отваров

лекарственных растений оптимальным является сорбент С18: степень извлечения протокатеховой кислоты, (-)-эпикатехина и рутина из отвара зверобоя составила соответственно 50, 87 и 100%, транскофейной кислоты из отваров тысячелистника — 87%. Существенным преимуществом твердофазной экстракции, помимо высокой степени извлечения, является дополнительная очистка экстракта лекарственного растения от мешающих компонентов матрицы.

С помощью разработанной ГХ-МС методики проводили качественный анализ водных экстрактов ряда лекарственных растений: тысячелистника обыкновенного, зверобоя продырявленного, шалфея аптечного, крапивы двудомной, душицы обыкновенной, полыни горькой, чабреца кавказского, подорожника большого, ромашки аптечной и календулы аптечной. Практически во всех экстрактах были обнаружены простейшие фенолкарбоновые и коричные кислоты - салициловая, 4-гидроксибензойная, ванилиновая, протокатеховая и транс-кофейная. Кроме того, были обнаружены фенольные соединения, сведения о наличии которых в лекарственном сырье в литературе ранее не встречались, среди них 7-метоксикумарин-3-уксусная кислота в ромашке аптечной, 4-гидроксибензойная и гентизиновая кислоты в полыни горькой, 3,4-дигидроксиминдальная кислота в подорожнике большом и тысячелистнике обыкновенном, 4-гидроксибензойная кислота в шалфее аптечном.

Разработка схемы идентификации и определения фенольных соединений в лекарственном растительном материале

Для разработки схемы идентификации и определения фенольных соединений в лекарственных растениях интерпретировались данные, полученные методами ВЭЖХ, ГХ-МС и ВЭЖХ-МС. По результатам ВЭЖХ-исследований установлено, что в отваре тысячелистника обыкновенного присутствуют протокатеховая и транс-кофейная кислоты, остальные пики с высокой интенсивностью сигнала с учетом характерных полос в соответствующих УФ спектрах (соединения 2, 3, 4, 6, 7, 8) можно отнести к производным кофейной кислоты (рис. 4).

Рисунок 4 - ВЭЖХ-хроматограмма водного экстракта тысячелистника обыкновенного и УФ-спектры фенольных соединений (к = 325 нм).

1- протокатеховая кислота, 5- транс -кофейная кислота

Также методом ГХ-МС в экстракте тысячелистника идентифицированы три производных кофейной кислоты: 5-0-кофеилхинная, 4-0-кофеилхинная, 3-0-кофеилхинная (рис. 5).

Рисунок 5 - ГХ-МС хроматограмма водного экстракта тысячелистника

обыкновенного

По литературным данным, в тысячелистнике могут присутствовать димерные и тримерные формы кофеилхинных кислот, обладающие высокой молекулярной массой, однако их идентификация с помощью ГХ-МС лимитируется возможностями масс-спектрометра. Кроме того, определение структуры производных этих соединений по осколочным ионам может быть затруднено ввиду сходства путей их фрагментации.

Определение структуры димерных и тримерных форм

кофеилхинных кислот возможно с помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Исходя из данных о молекулярных и осколочных ионах, соединения 2, 3, 4, 6, 7, 8 были идентифицированы соответственно как З-О-кофеилхинная, 5-О-кофеилхинная, 4-0-кофеилхинная, 3,4-О-дикофеилхинная, 3,5-О-дикофеилхинная и 4,5-0-дикофеилхинная кислоты (рис. 6).

тысячелистника обыкновенного

(Условия хроматографироваиия: высокоэффективный жидкостный хроматограф Shimadzu LC 20 Prominence с МС-детектором LCMS2010EV; колонка Zorbax SB CI8 (5 мкм, 150х2.1 мм); предколонка Zorbax SB С8 (5мкм, 200х 2 1 мм); элюент А - ацетонитрил, элюент Б - 0,1% муравьиная кислота; термостатирование колоки при 40°С; режим иоиизации электро-спрей)

На основании полученных результатов для анализа водных экстрактов лекарственных растений на содержание фенольных соединений и флавоноидов методами хроматографии предложена следующая схема анализа:

По предложенной схеме определяли содержание моно- и дикофеилхинных кислот в образцах тысячелистника обыкновенного восьми различных ценопопуляций Краснодарского края: из Ботанического сада (БотСад), Биологической станции «Камышанова Поляна» (КамП) Кубанского государственного университета, с Ясенской косы (Ясен), Вербеной косы (Верб), Азишского перевала плато Лаго-Наки (Азиш), из окрестностей ст. Даховской (Дах), г. Армавира (Арм), г. Крымска (Кр).

Установлено, что во всех образцах концентрации протокатеховой и транс-кофейной кислот практически равны и составляют менее 0.1 и 0.1-0.3 мкг/г соответственно, поэтому сравнение образцов тысячелистника проводили по кофеилхинным кислотам. Оценку содержанйя кофеилхинных кислот в растениях осуществляли по внешнему стандарту - феруловой кислоте, имеющей в составе идентичные хромофорные группы и сопоставимый коэффициент экстинкции. Содержание кислот в тысячелистнике обыкновенном различных ценопопуляций варьировало в пределах 1.1-2.0 мкг/г для 4-О-кофеилхинной, 1.7-5.1 мкг/г для З-О-кофеилхинной, 7.1-11.0 мкг/г для 5-О-кофеилхинной, 3.2-7.1 мкг/г для 3,4-О-дикофеилхинной, 5.013.3 мкг/г для 3,5-О-дикофеилхинной и 8.1-16.0 мкг/г для 4,5-0-дикофеилхинной кислот (рис. 7).

Азиш КамП Дах БотСад Кр Арм Ясен Верб Рисунок 7 - Содержание кофеилхинных кислот в тысячелистнике обыкновенном различных ценопопуляций

ЗКХК - З-О-кофеилхинная кислота, 4КХК - 4-О-кофеилхинная кислота, 5КХК - 5-0-кофеилхинная кислота, 3,4-ДКХК - 3,4-О-дикофеилхинная'кислота, 3,5-ДКХК - 3,5-О-дикофеилхинная кислота, 4,5-ДКХК - 4,5-О-дикофеилхинная кислота

В целях выявления зависимости содержания веществ от условий произрастания и дифференциации образцов использовали метод главных компонент. Обработку данных и расчеты проводили в среде

программы «Statistics 8» (StatSoft). Установлено, что наибольшей значимостью характеризуются факторы 1, 2 и 3, соответствующие концентрациям З-О-кофеилхинной, 5-О-кофеилхинной и 4-0-кофеилхинной кислот. Несмотря на высокую значимость фактора 1, надежно классифицировать полученные данные позволяет комбинация факторов 2 и 3, поэтому все показатели проецировали на плоскость этих компонент (рис. 8).

2,5 2,0 1.5 1.0

I 0,5

rt 0,0

»

£

§ -0.5 -1,0 -1,5 -2,0 -2.5

-3-2-10 1 2 3

Фактор 2: 30.48%

Рисунок 8 - Проекция показателей на факторный план

В соответствии с полученными проекциями показателей, образцы были разделены на группы. Наиболее обширна группа I четверти, включающая образцы КамП, БотСад, Дах, в которую входят растения, принадлежащие к различным фитоценозам.

Тысячелистник БотСад относится к степному фитоценозу, но является интродуцентом КамП. Практически одинаковое содержание фенольных соединений и отнесение данных образцов к одной группе на факторном плане, по-видимому, связано с приспособлением данного экотипа к климатическим условиям Западного Кавказа и выработкой устойчивых наследственных биохимических признаков при смене фитоценоза.

Отдельную группу составляют образцы тысячелистника степных фитоценозов с континентальным климатом - Кр и Арм. Образцы Азиш, Ясен и Верб не образуют отдельных групп, что может быть обусловлено значительным влиянием климатических и эдафических факторов.

Ч4« |Арм| У JSSSB ---: |КамП1 С V

' ' • • • : ».-■ЕЭ * |Азиш| \ Тверб!

Оценка стабильности фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях в процессе их хранения

Для специалистов в области фитотерапии представляет научный и практический интерес стабильность фенольных соединений и флавоноидов в процессе хранения фитоматериалов. Для оценки стабильности изучались аптечные образцы календулы и зверобоя различных производителей, анализ материалов проводили через каждые 3 месяца. Параллельно определяли суммарное содержание дубильных веществ и антиоксидантную активность экстрактов. Исследования динамики изменения концентрации индивидуальных фенольных соединений, антиоксидантной активности и суммы дубильных веществ водных экстрактов зверобоя продырявленного, календулы аптечной показали, что при соблюдении стандартных условий хранения лекарственного растительного сырья значительных вариаций результатов в течение года не наблюдается (табл. 6), что объясняется стабильностью соединений.

Таблица 6 - Содержание индивидуальных фенольных соединений, дубильных веществ в лекарственных растениях и величины АОА (п=4, Р=0.95)_

Производитель Протокатс-ховая кислота, транс-Кофсйная кислота. Рутин, мкМ/г (0-Эпи-катехмн, мкМ/г АОА, мМ(АКУг Дубильные вещества, %

мкМ/т мкМ/г

Календула аптечная

ЗАО «Здоровье», г.Нахабино - 0,88 ±0.11 5.10 ±0.52 - 0.09 ±0.01 1.7± 0.1

«Зеленая Аптека», г.Горячий Ключ - 0.59 ± 0.04 6.13 ±1.45 - 0.08 ± 0.01 1.7 ±0,1

ЗАО «Иван-Чай», пос. Горки-Леиинские - 0.74 ± 0.04 5.61 ± 1.74 - 0.08 ± 0.01 2.0 ±0.1

ООО ГЖФ «Фитофарм», г.Анапа - 0.80 ±0,01 6.26 ± 0.04 - 0.09 ±0.01 1.9 ±0.1

ЗАО АПФ

«Фито-ЭМ», - 0,67 ±0,13 6.85 ± 0.85 - 0.08 ± 0.01 1.9 ±0.1

пос.Мамонтовка

ООО «Компания «Хорст»», г. Барнаул - 0.62 ± 0.04 7.94 ± 1.91 - 0.08 ± 0.01 2.1 ±0.2

Зверобой продырявленный

«Зеленая Аптека», г.Горячий Ключ 140 ±0.03 - 23.48 ± 4,52 6.65 ±0.11 0.25 ± 0.03 6.4 ± 0.6

ЗАО «Иван-Чай», пос. Горки-Ленинскис 2.27 + 0,65 - 5.59 ± 0.48 3,77 ±0.18 0.17 ±0,01 3.5 ± 0.4

ЗАО «Ст-Медифарм», г.Москва 1.35 ±0.16 - 23.30 ±0.21 6.67 ± 1.52 0.31 ± 0.02 6.3 ± 0.3

ООО ПКФ «Фитофарм», г.Анапа 2.53 ±0.48 - 19 90 ± 2.87 4.28 ± 0.86 0.21 ±0.01 4.9 + 0.8

ЗАО АПФ «Фито-ЭМ», пос.Мамонтовка 2.41 ±0.08 - 12.26 ± 1.30 4.88 ± 0.90 0.19 ±0.01 4.0 ± 0.6

выводы

1. Разработана методика идентификации и определения 19 фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Подобраны оптимальные условия хроматографирования, в том числе хроматографическая колонка, состав элюента, режим элюирования. Изучено влияние органических добавок в подвижную фазу, рН элюента, температуры хроматографирования на разделение ряда фенольных соединений. Установлены диапазоны определяемых концентраций аналитов и пределы их обнаружения.

Установлено, что в зверобое продырявленном содержатся протокатеховая кислота (0.37±0.02 мг/г), (-)-эпикатехин (0.82±0.03 мг/г) и рутин (9.41±0.01 мг/г); в тысячелистнике обыкновенном -протокатеховая кислота (0.05±0.01 мг/г) и транс-кофейная кислота (0.05±0.01 мг/г); в календуле аптечной - транс-кофейная кислота (0.11±0.03 мг/г) и рутин (0.09±0.03 мг/г); в шалфее лекарственном -да/зянс-кофсйная кислота (0.49±0.02 мг/г); в ромашке аптечной -протокатеховая кислота (0.057±0.005 мг/г).

2. Изучены процессы твердофазного и жидкость-жидкостного извлечения фенольных соединений и флавоноидов из водных экстрактов растений. Определена эффективная схема пробоподготовки лекарственных растений при идентификации фенольных соединений методом ГХ-МС с использованием твердофазной экстракции на патронах, заполненных силикагелем с привитыми группами октадецилсилана. Эффективность сорбции соединений различных классов составляет 50-100%.

3. Предложена методика идентификации фенолкарбоновых, коричных кислот, кумаринов и флавоноидов в лекарственных растениях методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Установлены оптимальные условия дериватизации веществ, позволяющие повысить чувствительность методики определения фенолкарбоновых, коричных кислот и флавоноидов. С помощью разработанной ГХ-МС методики показано, что в изученных фотоматериалах присутствуют простейшие фенолкарбоновые и коричные кислоты - салициловая, 4-гидроксибензойная, ванилиновая, протокатеховая и транс-кофейная. Также идентифицированы фенольные соединения, сведения о наличии которых в исследуемых растениях в литературе ранее не встречались (7-метоксикумарин-З-уксусная кислота в ромашке аптечной, 4-гидроксибензойная и

гентизиновая кислоты в полыни горькой, 3,4-дигидроксиминдальная кислота в подорожнике большом и тысячелистнике обыкновенном, 4-гидроксибензойная кислота в шалфее аптечном).

4. Предложена схема анализа лекарственных растений, включающая идентификацию компонентов методами газовой и жидкостной хромато-масс-спектрометрии и определение фенольных соединений и флавоноидов в фитоматериалах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Схема апробирована при анализе водных экстрактов тысячелистника. На основе предложенной схемы в тысячелистнике идентифицированы и определены протокатеховая, транс-кофейная, З-О-кофеилхинная, 4-0-кофеилхинная, 5-0-кофеилхинная, 3,4-О-дикофеилхинная, 3,5-0-дикофеилхинная, 4,5-О-дикофеилхинная кислоты.

5. Разработанная методика ВЭЖХ определения апробирована при оценке содержания кофеилхинных, кофейной и протокатеховой кислот в водных экстрактах тысячелистника обыкновенного восьми различных ценопопуляций. Содержание кислот в тысячелистнике различных ценопопуляций варьировало в пределах 1.1-2.0 мкг/г для 4-О-кофеилхинной, 1.7-5.1 мкг/г для З-О-кофеилхинной, 7.1-11.0 мкг/г для 5-О-кофеилхинной, 3.2-7.1 мкг/г для 3,4-О-дикофеилхинной, 5.0-13.3 мкг/г для 3,5-О-дикофеилхинной и 8.1-16.0 мкг/г для 4,5-0-дикофеилхинной кислот. По результатам этих исследований проведена дифференциация образцов тысячелистника с использованием метода главных компонент. Установлено, что образцы различных мест произрастания можно разделить на группы по концентрациям 5-0-кофеилхинной и З-О-кофеилхинной кислот.

6. Проведена оценка стабильности и содержания фенольных соединений и флавоноидов при хранении фотоматериалов различных производителей. Содержание индивидуальных фенольных соединений и флавоноидов, сумма дубильных веществ и антиоксидантная активность водных экстрактов растительного сырья в процессе хранения при постоянных температуре и уровне влажности без доступа света, остаются стабильными в течение одного года после заготовки сырья.

Основные положения диссертационного исследования опубликованы в следующих работах автора:

1. Темердашев З.А., Фролова (Берниковская) H.A., Колычев И.А. ВЭЖХ определение фенольных соединений в лекарственных растениях // Журнал аналитической химии. - 2011, Т. 66. - №4. - С. 417- 424.

2. Темердашев З.А., Фролова (Берниковская) H.A., Колычев И.А., Цюпко Т.Г. Определение фенольных соединений и флавоноидов в водных экстрактах лекарственных растений // Заводская лаборатория. Диагностика материалов, 2011. - №11. - С. 18-22.

3. Темердашев З.А., Фролова (Берниковская) H.A., Цюпко Т.Г., Чупрынина Д.А. Оценка стабильности фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях в процессе их хранения // Химия растительного сырья. - 2011. - № 4. - С. 179-184.

4. Chromatographie procedures for phenolic compounds and flavonoids determination in herbs [Текст] / Z.A. Temerdashev, N.A. Vernikovskaya, I.A. Kolychev, T.G. Tsypko // Instrumental methods of analysis. Modern trends and application: VII Intern, conf., Греция, 2011. - P. - 36.

5. Темердашев 3.A., Берниковская H.A., Киселева H.B., Милевская В.В., Коробков В.А. Сорбционное извлечение фенольных соединений из водных экстрактов лекарственных растений // Разделение и концентрирование: Материалы Ш Всерос. симпозиума с междунар. участием, г. Краснодар, 2011 г. - С. 142.

6. Киселева Н.В., Берниковская H.A., Милевская В.В. ВЭЖХ определение фенольных соединений календулы аптечной и шалфея лекарственного // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: 66-ая регион, конф. по фармации и фармакологии, г. Пятигорск, 2011 г. - Вып. 66. - С. 109-111.

7. Темердашев З.А., Колычев И.А., Фролова (Берниковская) H.A., Коробков В.А., Милевская В.В. Хроматографическое определение фенольных соединений в водных экстрактах лекарственных растений // Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез: I Всерос. конф. с междунар. участием, г. Краснодар, 2010 г. - С. 134.

8. Фролова (Берниковская) H.A., Цюпко Т.Г., Темердашев З.А. Экоаналитическая оценка содержания фенольных соединений в лекарственных растениях Северного Кавказа // Экологический вестник Северного Кавказа. - 2009, Т. 5. - №3. - С. 21-24.

9. Фролова (Берниковская) H.A. Разработка и оптимизация ВЭЖХ методики определения некоторых фенольных соединений в лекарственных растениях // Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах: VI Всерос. научн. конф. молодых ученых и студентов, Анапа, 2009 г. - С. 117-119.

10. Фролова (Берниковская) H.A., Колычев И.А., Цюпко Т.Г. ВЭЖХ

определение индивидуальных фенольных вещества в лекарственных растениях V/ Аналитика России: Материалы Ш Всерос. конф. с междунар. участием, Краснодар, 2009 г. - С. 427.

11. Фролова (Берниковская) H.A., Колычев И.А., Цюпко Т.Г., Темердашев З.А. Определение флавоноидов в фитоматериалах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: 64-ая регион, конф. по фармации и фармакологии, Пятигорск, 2009 г. - Вып. 64. -С. 349-351.

12. Фролова (Берниковская) H.A., Колычев И.А., Цюпко Т.Г., Темердашев З.А. ВЭЖХ определение веществ фенольной природы в растительных материалах // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: IV Всерос. конф., Барнаул, 2009 г. -С. 71.

13. Фролова (Берниковская) H.A., Колычев И.А., Цюпко Т.Г., Темердашев З.А. Оценка возможности определения антиоксидантов в лекарственном растительном сырье методом ВЭЖХ // Химический анализ: Всерос. конф., Москва, 2008 г. - С. 122-123.

14. Цюпко Т.Г., Воронова О.Б., Храпко Н.В., Фролова (Берниковская) H.A., Зуйченко Е.С. Оценка экологического состояния территории по величине обобщенных показателей качества растительных фитоматериалов // Аналитика России: Материалы П Всерос. конф. с междунар. участием, Краснодар, 2007 г. - С. 398.

15. Фролова (Берниковская) H.A., Колычев И.А., Цюпко Т.Г., Темердашев З.А. ВЭЖХ определение антиоксидантов в лекарственном растительном сырье // Аналитика России: П Всерос. конф. с междунар. участием, Краснодар, 2007 г. - С. 471.

Бумага тип. №2. Печать трафаретная. • Тираж 100 экз. Заказ № 894. от 08.11.11г. 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149, Центр «Универсервис», тел.21-99-551.

ВВЕДЕНИЕ.

1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1 Структура и классификация фенольных соединений растительного происхождения.

1.2 Методы определения фенольных соединений.

1.2.1. Качественные методы определения фенольных соединений.

1.2.2 Титриметрические методы определения фенольных соединений.

1.2.3 Спектроскопические методы определения фенольных соединений.

1.2.3.1 Колориметрические методы определения фенольных соединений.

1.2.3.2 ИК-спектроскопическое определение фенольных соединений.

1.2.4 Электрохимические методы определения фенольных соединений.

1.3 Хроматографические методы определения фенольных соединений.

1.3.1 Тонкослойная хроматография при определении фенольных соединений.

1.3.2 Электрофоретическое определение фенольных соединений.

1.3.4 Определение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.3.4.1 Особенности разделения фенольных соединений методом ВЭЖХ.

1.3.4.2 Детектирование фенольных соединений при их ВЭЖХ определении.

1.3.5 Газовая хромато-масс-спектрометрия при определении фенольных соединений.

1.4 Выводы к аналитическому обзору и постановка исследования.

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1 Материалы и методы исследования.

2.1.1 Исходные реактивы, материалы и используемая аппаратура.

2.1.2 Приготовление рабочих растворов.

2.1.3 Приготовление экстрактов лекарственных растений.

2.1.4 Определение влажности растительного сырья.

2.1.5 Определение суммы дубильных веществ методом перманганатометрии.

2.2 Разделение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2.2.1 Выбор оптимальной колонки для разделения фенольных соединений.

2.2.2 Выбор состава подвижной фазы для разделения фенольных соединений.

2.2.2.1 Выбор режима элюирования.

2.2.2.2 Влияние органических добавок на разделение фенольных соединений.

2.2.2.3 Влияние рН подвижной фазы на разделение фенольных соединений.

2.2.3 Влияние температуры на хроматографическое разделение фенольных соединений.

2.2.4 Параметры идентификации и количественного определения фенольных соединений методом ВЭЖХ.

2.3 Разделение фенольных соединений методом газовой хромато-масс-спектрометрии.

2.3.1 Выбор оптимальных условий разделения фенольных соединений методом газовой хромато-масс-спектрометрии.

2.3.2 Оптимизация техники силилирования фенольных соединений.

2.4 Определение фенольных соединений в лекарственных растениях.

2.4.1 Оценка содержания фенольных соединений в лекарственных растениях.

2.4.2 Фракционирование и экстракция лекарственного растительного сырья.

2.4.3 Идентификация фенольных соединений в водных экстрактах лекарственных растений методом ОФ-ВЭЖХ.

2.4.4 Определение фенольных соединений в водных экстрактах лекарственных растений методом ОФ-ВЭЖХ.

2.4.5 Сорбционное извлечение фенольных соединений для анализа лекарственных растений методом ГХ-МС.

2.4.6 Идентификация фенольных соединений в лекарственных растениях методом ГХ-МС.

2.5 Идентификация и определение фенольных соединений в тысячелистнике обыкновенном.

2.6 Оценка стабильности фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях в процессе их хранения.

ВЫВОДЫ.

Качество лекарственного растительного сырья, содержащего фенольные соединения и флавоноиды, в России регламентируется фармакопейными статьями, в которых установлены требования по содержанию дубильных веществ, эфирных масел, проазуленов, показатели влажности, зольности и т.д. Определение в фотоматериалах фенольных соединений и флавоноидов осуществляется методами титриметрии и спектрофотометрии, которые позволяют оценить суммарное содержание веществ, в то время как для медицины в большинстве случаев интерес представляют данные о концентрации индивидуальных фенольных соединений.

В этом отношении актуальная задача идентификации и определения индивидуальных фенольных соединений, как правило, решается с помощью методов хроматографии, позволяющих получить информацию о качественном составе растительного сырья. Поэтому перспективным направлением является разработка оригинальных методик определения фенольных соединений с учетом разнообразия их структуры и свойств. Представляет также несомненный научный и практический интерес зависимость содержания фенольных соединений в лекарственных растениях от условий их произрастания и хранения.

Целью настоящей работы является разработка методик идентификации и определения индивидуальных фенольных соединений в лекарственных растениях методами хроматографии и хромато-масс-спектрометрии.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

- разработка ВЭЖХ-методики идентификации и определения различных фенольных соединений в фитоматерилах;

- оптимизация условий идентификации фенольных соединений в лекарственных растениях методом газовой хромато-масс-спектрометрии; 6

- разработка схемы идентификации и определения фенольных соединений в лекарственном растительном материале;

- оценка содержания фенольных соединений в лекарственных растениях в зависимости от условий произрастания и хранения.

Диссертационная работа выполнена в рамках грантов РФФИ рюга 06-03-96660 «Обоснование и разработка обобщенных показателей качества растительных материалов для оценки состояния экосистем» и 09-03-96529 «Теоретическое и экспериментальное обоснование обобщенного показателя качества пищевой и сельскохозяйственной продукции - антиоксидантной активности».

выводы

1. Разработана методика идентификации и определения 19 фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Подобраны оптимальные условия хроматографирования, в том числе хроматографическая колонка, состав элюента, режим элюирования. Изучено влияние органических добавок в подвижную фазу, рН элюента, температуры хроматографирования на разделение ряда фенольных соединений. Установлены диапазоны определяемых концентраций аналитов и пределы их обнаружения.

Установлено, что в зверобое продырявленном содержатся протокатеховая кислота (0.37±0.02 мг/г), (-)-эпикатехин (0.82±0.03 мг/г) и рутин (9.41±0.01 мг/г); в тысячелистнике обыкновенном - протокатеховая кислота (0.05±0.01 мг/г) и гаранс-кофейная кислота (0.05±0.01 мг/г); в календуле аптечной - транс-кофейная кислота (0.11±0.03 мг/г) и рутин (0.09±0.03 мг/г); в шалфее лекарственном - транс-кофейная кислота (0.49±0.02 мг/г); в ромашке аптечной - протокатеховая кислота (0.057±0.005 мг/г).

2. Изучены процессы твердофазного и жидкость-жидкостного извлечения фенольных соединений и флавоноидов из водных экстрактов растений. Определена эффективная схема пробоподготовки лекарственных растений при идентификации фенольных соединений методом ГХ-МС с использованием твердофазной экстракции на патронах, заполненных силикагелем с привитыми группами октадецилсилана. Эффективность сорбции соединений различных классов составляет 50-100%.

3. Предложена методика идентификации фенолкарбоновых, коричных кислот, кумаринов и флавоноидов в лекарственных растениях методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Установлены оптимальные условия дериватизации веществ, позволяющие повысить чувствительность методики определения фенолкарбоновых, коричных кислот и флавоноидов. С помощью разработанной ГХ-МС методики показано, что в изученных фотоматериалах присутствуют простейшие фенолкарбоновые и коричные кислоты - салициловая, 4-гидроксибензойная, ванилиновая, протокатеховая и транс-кофейная. Также идентифицированы фенольные соединения, сведения о наличии которых в исследуемых растениях в литературе ранее не встречались (7-метоксикумарин-З-уксусная кислота в ромашке аптечной, 4-гидроксибензойная и гентизиновая кислоты в полыни горькой, 3,4-дигидроксиминдальная кислота в подорожнике большом и тысячелистнике обыкновенном, 4-гидроксибензойная кислота в шалфее аптечном).

4. Предложена схема анализа лекарственных растений, включающая идентификацию компонентов методами газовой и жидкостной хромато-масс-спектрометрии и определение фенольных соединений и флавоноидов в фотоматериалах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Схема апробирована при анализе водных экстрактов тысячелистника. На основе предложенной схемы в тысячелистнике идентифицированы и определены протокатеховая, транс-кофейная, З-О-кофеилхинная, 4-0-кофеилхинная, 5-0-кофеилхинная, 3,4-О-дикофеилхинная, 3,5-0-дикофеилхинная, 4,5-О-дикофеилхинная кислоты.

5. Разработанная методика ВЭЖХ определения апробирована при оценке содержания кофеилхинных, кофейной и протокатеховой кислот в водных экстрактах тысячелистника обыкновенного восьми различных ценопопуляций. Содержание кислот в тысячелистнике различных ценопопуляций варьировало в пределах 1.1-2.0 мкг/г для 4-О-кофеилхинной,

1.7-5.1 мкг/г для З-О-кофеилхинной, 7.1-11.0 мкг/г для 5-О-кофеилхинной,

3.2-7.1 мкг/г для 3,4-О-дикофеилхинной, 5.0-13.3 мкг/г для 3,5-0дикофеилхинной и 8.1-16.0 мкг/г для 4,5-О-дикофеилхинной кислот. По результатам этих исследований проведена дифференциация образцов тысячелистника с использованием метода главных компонент. Установлено, что образцы различных мест произрастания можно разделить на группы по

135 концентрациям 5-О-кофеилхинной и З-О-кофеилхинной кислот.

6. Проведена оценка, стабильности и содержания фенольных соединений и флавоноидов при хранении фотоматериалов различных производителей. Содержание индивидуальных фенольных соединений и флавоноидов, сумма дубильных веществ и антиоксидантная активность водных экстрактов растительного сырья в процессе хранения без доступа света при постоянных температуре и уровне влажности остаются стабильными в течение одного года после заготовки сырья.

1. Запрометов, M.H. Основы биохимии фенольных соединений. Учеб. Пособие для биол. специальностей ун-тов Текст] / М.Н. Запрометов. -М.: Высшая школа, 1974. 214 с.

2. Grotewold, Е. The science of flavonoids Текст] / E. Grotewold. -Ohio: Springer science and Business Media, 2006. 274 p.

3. Куркин, В.А. Современные аспекты химической классификации биологически активных соединений лекарственных растений Текст] / В.А. Куркин // Фармация. 2002. - №2. - С. 8-17.

4. Блажей, А., Шутый, JI. Фенольные соединения растительного происхождения Текст] / А. Блажей, Л. Шутый. М.: Мир, 1977. - 240 с.

5. Vermerris, W. Phenolic compound biochemistry Текст] / W. Vermerris, R. Nicholson. Springer, 2006. - 285 p.

6. Химический анализ лекарственных растений Текст] / под ред. Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронич. М.: Высшая школа, 1983. - 176 с.

7. Георгиевский, В.П. Биологически активные вещества лекарственных растений Текст] / В.П. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, С.Е. Дмитрук. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1990 - 333 с.

8. Hagerman, А. Е. Tannin chemistry Текст] / А. Е. Hagerman. -Miami, 2002.- 116 р.

9. Liao, X., Selective adsorption of tannins onto hide collagen fibers Текст] / X. Liao, Zh. Lu, B. Shi // Science in China (Series B). 2003, Vol. 46. -№5.-P. 495-504.

10. Лазуревский, Г.В. Практические работы по химии природныхсоединений. Выпуск 1. Методы выделения, разделения и идентификации137

11. Текст. / Г.В. Лазуревский, И.В. Терентьева, А.А. Шамшурин // М.: Высшая школа, 1961. 192 с.

12. Analgesic and antiinflammatory activities of the aqueous extract of Plantago major L. Текст] / M.E. Nunez Guillén, J.A. da Silva Emim, C. Souccar, A. José Lapa // Int. J. Pharmacogn. 1997, Vol. 35. -№ 2. - P. 99-104.

13. Федосеева, JI.M. Выделение некоторых фенольных соединений и идентификация арбутина из листьев бадана Текст] / Л.М. Федосеева, Т. С. Малолеткина / Химия растительного сырья. 1999. - №2. - С. 109-111.

14. Demchenko, D.V. Liquid extraction of ginseng and bilberry leaves Текст] / D.V. Demchenko, Yu.D. Papok, A.B. Legosteva // Pharm. Chem. J. RF. 2008, Vol. 42. - № 3. - P. 122-126.

15. Фармацевтическая химия. Учебн. Пособие для вузов Текст] / под ред. А.П. Арзамасцева // М.: ГЗОТАР-МЕД, 2004. 640 с.

16. Vishnevskij O.V. Quantitative determination of the total content of flavonoids in flavozid and immunoflazid syrups Текст] / O.V. Vishnevskij V.P. Atamanyuk // Pharm. Chem. J. RF. 2008, Vol. 42. - № 9. - P. 536-538.

17. Правдивцева, O.E. Исследования по обоснованию новых подходов к стандартизации сырья и препаратов зверобоя продырявленного Текст] / О.Е. Правдивцева, В.А. Куркин // Химия Растит. Сырья. 2008. -№1.-С. 81-86.

18. Kurkin, V.A. Comparative studies of the total flavonoids and anthracene derivatives contents of St. John's wort preparations Текст] / V.A. Kurkin, O.E. Pravdivtseva // Pharm. Chem. J. RF. 2008, Vol. 42. - № 10. -P. 589-592.

19. Chemical composition and pharmacological activity of the leaves of

20. Pueraria Hirsuta L. grown in Georgia Текст. / E.P. Kemertelidze, V.N. Syrov,138

21. M.D. Alaniya, N.Sh. Kavtaradze, Z.A. Khushbaktova // Pharm. Chem. J. RF. -2008, Vol. 42. № 6. - P. 340-343.

22. European pharmacopoeia Текст] / 5th edition, Aloe barbadensis 01/2005:0257 // British Pharmacopoeia Commission. 2005. - P. 947-948.

23. Прида, А.И. Природные антиоксиданты полифенольной природы. Антирадикальные свойства и перспективы использования Текст] / А.И. Прида, Р.И. Иванова // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 2004. -№2.-С. 76-78.

24. Study on Flavonoids in the Caryopsis of Indica Rice Rdh Текст] / L. Han, B.-Ch. Dong, X.-J. Yang, Ch.-B. Huang, X.-D. Wang, X.-J. Wu // Agricultural Sciences in China. 2009. - № 8(2). - P. 249-256.

25. Ferreira, E.C. Vanillin-condensed tannin study using flow injection spectrophotometry Текст] / E.C. Ferreira, A.R.A. Nogueira // Talanta. 2000, Vol. 51.-P. 1-6.

26. Goldstein, J.L. Changes in tannins in ripening fruits Original Research Article Текст] / J.L. Goldstein, T. Swain // Phytochemistry. 1963, Vol. 2. -1. 4. -P. 371-383.

27. Schofield, P. Analysis of condensed tannins: a review Текст] / P. Schofield, D.M. Mbugua, A.N. Pell // Anim. Feed Sci. Tech. 2001, Vol. 91. -P. 21-40.

28. Barua, D.N. Methods for the volumetric estimation of tea tannin in green leaf and black tea. A new alkaline permanganate method Текст] / D. N. Barua, E.A. Houghton Roberts // Biochem. J. 1940, Vol. 34. - № 12. - P. 15241531.

29. Государственная Фармакопея СССР. XI издание, Выпуск 2 Текст] / М.: Медицина, 1987. 386 с.

30. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Первое издание Текст] / Минск: Минздрав Республики Беларусь, 2006. 1345 с.

31. Kettle, A.J. Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid Текст] / A.J. Kettle, В. M. Clark, Ch.C. Winterbourn // J. Biol. Chem. 2004, Vol. 279. - № 18, Issue of April 30. - P. 18521-18525.

32. Киреева, Т.Б. Экологические и онтогенетические особенности накопления дубильных веществ в траве душицы обыкновенной в условиях Удмуртии Текст] / Т.Б. Киреева, Е.А. Китова // Вестник Удмуртского университета. Биология. 2006. - №10. - С. 85-96.

33. Оптимизация условий экстракции антиоксидантов из твердых частей лекарственных растений Текст] / Н.Ю. Грибова, Т.А. Филиппенко, А.Н. Николаевский, Н.И. Белая, А.А. Цыбуленко // Журн. аналит. химии. -2008, Т. 63. №11. - С. 1137-1140.

34. Dreaper, W.P. Allen's commercial organic analysis. Volume VII. Chapter 7. Gallic acid and its allies. Forth edition Текст] / W.P. Dreaper // Philadelphia: P. Blakiston's son and Co, 1917. P.525-539.

35. Estimation of tannins in different food products Текст] / S. Tabasum, S. Ahmad, N. Akhlaq, K. Rahman // Int. J. Agric. Biol. 2001. - P. 529-530.

36. Rai, B.K. Basic food analysis handbook. Chapter VI: Determination of natural pigments and related compounds Текст] / B.K. Rai // Dharan, 2006. -P. 83-88.

37. Singleton, V.L. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic140phosphotungstic acid reagents Текст. / V.L. Singleton, J.A. Rossi // Am. J. Enol. Vitic. 1965, Vol. 16. - №3. - P. 144-158.

38. Vinson, J.A. Phenol antioxidant index: comparative antioxidant effectiveness of red and white wines Текст] / J.A. Vinson, B.A. Hontz // J. Agric. Food Chem. 1995, Vol. 43. - P. 401-403.

39. Comparison of wine aromas with different tannic content aged in French oak barrels Текст] / E.M. Diaz-Plaza, J.R. Reyero, F. Pardo, M.R. Salinas // Analytica Chimica Acta. 2002, Vol. 458. - P. 139-145.

40. Li, W. Phenolic, flavonoid, and lutein ester content and antioxidant activity of 11 cultivars of Chinese marigold Текст] / W. Li, Y. Gao, J. Zhao, Q. Wang // J. Agric. Food Chem. 2007, Vol. 55. P. 8478-8484.

41. Спрыгин, В.Г. Метод оценки и стандартизации олигомерных проантоцианидиновых комплексов, полученных из различных видов растительного сырья Текст] / В.Г. Спрыгин, Н.Ф. Кушнарева // Химико-фармацевтический журнал. 2002, Т. 36. - №3. - С. 31-35.

42. Muetzel, S. Extractability and biological activity of tannins from various tree leaves determined by chemical and biological assays as affected by drying procedure Текст] / S. Muetzel, K. Becker // Anim. Feed Sci. Tech. 2006, Vol. 125.-P. 139-149.

43. Muchuweti, M. Analysis of phenolic compounds including tannins, gallotannins and flavanols of Uapaca kirkiana fruit Текст] / M. Muchuweti, A.R. Ndhlala, A. Kasiamhuru // Food Chem. 2006, Vol. 94. - P. 415-419.

44. Currants (Vitis vinifera L.) content of simple phenolics and antioxidant activity Текст] / A. Chiou, V.T. Karathanos, A. Mylona, F.N. Salta, F. Preventi, N.K. Andrikopoulos // Food Chem. 2007, Vol. 102. - P. 516-522.

45. Analytical determination of polyphenols in olive oils Текст] / A.141

46. Carrasco-Pancorbo, L. Cerretani, A. Bendini, A. Segura-Carretero, T. Gallina-Toschi, A. Fernandez-Gutierrez // J. Sep. Sci. 2005, Vol. 28. - P. 837-858.

47. Bramati, L. Unfermented rooibos tea: quantitative characterization of flavonoids by HPLC-UV and determination of the total antioxidant activity Текст] / L. Bramati, F. Aquilano, P. Pietta // J. Agric. Food Chem. 2003, Vol. 51.-P. 7472-7474.

48. Chludil, H.D. Soil quality effects on Chenopodium album flavonoid content and antioxidant potential Текст] / H.D. Chludil, G.B. Corbino, S.R. Leicach // J. Agric. Food Chem. 2008, Vol. 56. - P. 5050-5056.

49. Zheng, W. Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs Текст] / W. Zheng, Sh.Y. Wang // J. Agric. Food Chem. 2001, Vol. 49. -P. 5165-5170.

50. Шутова, А.Г. Оценка антиоксндантной активности экстрактов и эфирных масел пряно-ароматических и лекарсвтенных растений Текст] / А.Г. Шутова // Растительные ресурсы. 2007, Т. 43. - В.1. - С. 112-125.

51. Прида, А.И. Природные антиоксиданты полифенольной природы.

52. Антирадикальные свойства и перспективы использования Текст. / А.И.

53. Прида, Р.И. Иванова // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 2004.1422. С.76-78.

54. Лобанова, А.А. Исследование биологически активных флавоноидов в экстрактах из лекарственного растительного сырья Текст] / А.А. Лобанова, В.В. Будаева, Г.В. Сакович // Химия растительного сырья. -2004.-№1.-С. 47-52.

55. Чемесова, И.И. Определение содержания дубильных веществ в корневищах Comarum palustre L. И настойки из него спектрофотометрическим методом Текст] / И.И. Чемесова, Д.В. Чижиков // Растительные ресурсы. 2004, В. 3. - С. 122-129.

56. Данилова, Н.А. Количественное определение дубильных веществ в корнях щавеля конского методом спектрофотометрии в сравнении сметодом перманганатометрии Текст. / Н.А. Данилова, Д.М. Попов //

57. Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004. - №2. - С. 179182.

58. Cynkar, W. The effect of sample storage and homogenisation techniques on the chemical composition and near infrared spectra of white grapes Текст] / W. Cynkar, D. Cozzolino, R.G. Dambergs // Food Res. Int. 2009, Vol. 42.-P. 653-658.

59. Determination of phenolic compounds of grape skins during ripening143by NIR spectroscopy Текст. / R. Ferrer-Gallego, J.M. Hernandez-Hierro, J.C. Rivas-Gonzalo, M.T. Escribano-Bailon // LWT-Food Sci. Technol. 2011, Vol. 44.-P. 847-853.

60. Foo, L.Y. Proanthocyanidins: gross chemical structures by infra-red spectra Текст] / L.Y. Foo // Phytochemistry. 1981, Vol. 20. - № 6. - P. 13971402.

61. Leucaena forage analysis using near infrared reflectance spectroscopy Текст] / R.A. Wheeler, W.R. Chaney, K.D. Johnson, L.G. Butler // Anim. Feed Sci. Technol. 1996, Vol. 64. - P. 1-9.

62. Fingerprint of enological tannins by multiple techniques approach Текст] / L. Laghi, G.P. Parpinello, D. Del Rio, L. Calani, A.U. Mattioli, A. Versari //Food Chemistry. -2010, Vol. 121. P. 783-788.

63. Prediction of total antioxidant capacity of red wine by Fourier transform infrared spectroscopy Текст] / A. Versari, G. P. Parpinello, F. Scazzina, D. Del Rio // Food Control. 2010, Vol. 21. - P. 786-789.

64. Kaur, S.J. Modulatory eT>ects of a tannin fraction isolated from Terminalia arjuna on the genotoxicity of mutagens in Salmonella typhimurium Текст] / S.J. Kaur, I.S. Grover, S. Kumar // Food Chem. Toxicol. 2000, Vol. 38. -P. 1113-1119.

65. Liu, F. Adsorption of tannin from aqueous solution by deacetylated konjac glucomannan Текст] / F. Liu, X. Luo, X. Lin // J. Hazard. Mater. 2010, Vol. 178.-P. 844-850.

66. Evaluation of gas chromatography-Fourier transform infrared spectroscopy-mass spectrometry for analysis of phenolic compounds Текст] / D.T. Williams, Q. Tran, Ph. Fellin, K.A. Brice // J. Chromatogr. 1991, Vol. 549. -P. 297-311.

67. Kilmartin, P.A. Characterisation of polyphenols in green, oolong, and black teas, and in coffee, using cyclic voltammetry Текст] / P.A. Kilmartin, Ch.F. Hsu // Food Chem. 2003, Vol. 82. - P. 501-512.

68. Determination of tannins in tea by potentiometry and atomic absorption spectrometry Текст] / D. Coomans, J. Silberklang, Y. Michotte, L. Dryon, D.L. Massart // Fresenius Z. Anal. Chem. 1979, Vol. 294. - P. 140-144.

69. Durliat, H. Critical evaluation of potentiometric redox titrations in enology Текст] / H. Durliat, M. Comtat // Analytica Chimica Acta. 2005, Vol. 545.-№2.-P. 173 -181 .

70. Reichart, E. Determination of naringin in grapefruit juice by cathodic stripping differential pulse voltammetry at the hanging mercury drop electrode Текст] / E. Reichart, D. Obendorf// Analytica Chimica Acta. 1998, Vol. 360. -P. 179-187.

71. Ziyatdinova, G.K. Voltammetric determination of flavonols in parmaceuticals Текст] / G.K. Ziyatdinova, G.K. Budnikov // Pharm. Chem. J. -2005, Vol. 39. № 10. - P. 561-563.

72. Multivariate curve resolution of polarographic data applied to the study of the copper-binding ability of tannic acid Текст] / B.H. Cruz, J.M. Diaz-Cruz, C. Arico, R. Tauler, M. Esteban // Analytica Chimica Acta. 2000, Vol. 424. - P. 203-209.

73. Polarographic behavior of flavanoids from propolis and their potential carcinogenity Текст] / A. Vachalkova, L. Novotny, A. Solivajsova, V. Suchy // Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1995, Vol. 36. - P. 137-143.

74. Robbins, R.J. Phenolic Acids in Foods: An Overview of Analytical Methodology Текст] / R.J. Robbins // J. Agric. Food Chem. 2003, Vol. 51. -P. 2866-2887.

75. Ragazzi, E. Quantitative analysis of phenolic compounds after thin-layer chromatographic separation Текст] / E. Ragazzi, G. Veronese // J. Chromatogr. 1973, Vol. 77. - P. 369-375.

76. In vitro vasorelaxation mechanisms of bioactive compounds extractedfrom Hibiscus sabdariffa on rat thoracic aorta Текст. / M. Sarr, S. Ngom, M.O.146

77. Kane, A. Wele, D. Diop, B. Sarr, L. Gueye, R. Andriantsitohaina, A.S. Diallo // Nutr. Metab. 2009. - P. 45-57.

78. Ciesla, L. Two-dimensional thin-layer chromatography in the analysis of secondary plant metabolites Текст] / L. Ciesrla, M. Waksmundzka-Hajnos // J. Chromatogr. A. 2009, Vol. 1216. - P. 1035-1052.

79. Zhang, Q. Chemical analysis of the Chinese herbal medicine Gan-Cao (licorice) Текст] / Q. Zhang, M. Ye // J. Chromatogr. A. 2009, Vol. 1216. -P. 1954-1969.

80. Vovk, I. Separation of eight selected flavan-3-ols on cellulose thin-layer chromatographic plates Текст] / I. Vovk, B. Simonovska, H. Vuorela // J. Chromatogr. A. 2005, Vol. 1077. -1. 2. - P. 188-194.

81. Беленовская, JI.M. Разнообразие флавоноидных агликонов у видов секции Absinthium рода Artemisia (Asteraceae) Текст] / Л.М. Беленовская, А.А. Коробков // Растит, ресурсы. 2009, Т. 45. - В. 1. - С. 92105.

82. Сиднева, О.В. Сезонная динамика содержания флавоноидов в надземной части Astragalus membranaceus (Fabaceae) в восточном Забайкалье Текст] / О.В. Сиднева // Растительные ресурсы. 2005, Т. 41. - В. 4. - С. 8185.

83. Идентификация и количественная оценка флавоноидов в плодах черемухи обыкновенной Текст] / Е.В. Бекетов, А.А. Абрамов, О.В. Нестерова, С.В. Кондрашев // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2005, Т. 46.-№ 5.-С. 259-262.

84. Антиоксидантная и антирадикальная активности видов Rosa L. флоры Приморского края Текст] / И.В. Мельникова, Н.И. Кулеш, Е.А. Кольцова, П.Г. Горовой // Растит, ресурсы. 2002, Т.38. - В. 1. - С. 25-33.147

85. Галашкина, Н.Г. Флавоноиды почек Betula pendula roth Текст] /

86. H.Г. Галашкина, Д.Н. Ведерников, В.И. Рощин // Растит. Ресурсы. 2004, В. 1. -С. 62-67.

87. Коротаева, М.С. Содержание флавоноидов и гидроксикоричных кислотв надземной части Ledum palustre (Ericaceae) Текст] /М.С. Коротаева, М.В. Белоусов, Н.С. Фурса // Растит. Ресурсы. 2008, Т. 44. - С. 66-75.

88. Molnar-Perl, I. Chromatograpic, capillary electrophoretic and capillary electrochromatographic techniques in the analysis of flavonoids Текст] /

89. Analytical separation and detection methods for flavonoids Текст] / E. de Rijke, P. Out, W.M.A. Niessen, F. Ariese, C. Gooijer, U.A.Th. Brinkman // J. Chromatogr. A. 2006, Vol. 1112. - P. 31-63.

90. Horie, H. Application of capillary electrophoresis to tea quality estimation Текст] /Н. Horie, K. Kohata // J. Chromatogr. A. 1998, Vol. 802. -P. 219-223.

91. Lee, B.-L. Comparative analysis of tea catechins and theaflavins by high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis Текст] / B.-L. Lee, Ch.-N. Ong // J. Chromatogr. A. 2000, Vol. 881. - P. 439-447.

92. Analysis of antioxidant flavonoids from Asteraceae and Moraceae plants by capillary electrophoresis Текст] / Sz.T. Kristo, K. Ganzler, P. Apati, E. Szoke, A. Kery // Chromatographia. 2002, Vol. 56. - P. 121-126.

93. Analysis of aesculin and aesculotin in Cortex fraxini by capillary zone148electrophoresis Текст. / H. Zhang, Q. Li, Zh. Shi, Zh. Hu, R. Wang // Talanta. -2000, Vol. 52.-P. 607-621.

94. Wu, T. Determination of flavonoids and ascorbic acid in grapefruit peel and juice by capillary electrophoresis with electrochemical detection Текст] / Т. Wu, Y. Guan, J. Ye // Food Chem. 2007, Vol. 100. - P. 1573-1579.

95. Lue, B.-M. High-performance liquid chromatography analysis methods developed for quantifying enzymatic esterification of flavonoids in ionic liquids Текст] / B.-M. Lue, Zh. Guo, X. Xu // J. Chromatogr. A. 2008, Vol. 1198-1199.-P. 107-114.

96. Маркарян, A.A. Хроматографическое изучение фенольного состава сухого экстракта "Нефрофит" Текст] /А.А. Маркарян, А.А. Абрамов // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2003, Т. 44. - № 5. - С. 356-360.

97. Кочетова, М.В. Определение качественного состава коньячных изделий методом ВЭЖХ Текст] / М.В. Кочетова, О.Г. Ларионов, Е.В. Ульянова // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008, Т.8. -Вып.4. - С. 658-667.

98. Caccamese, S. Separation of cis and trans isomers of naturally occurring hydroxycinnamic acids by high-pressure liquid chromatography Текст] / S. Caccamese, R. Azzolina, M. Davino // Chromatographia. 1979, Vol. 12. -№8.-P. 545-547.

99. Hasler, A. High-performance liquid chromatographic determination of five widespread flavonoid aglycones Текст] / A. Hasler, 0. Sticher, B. Meier // J. Chromatogr. 1990, Vol. 508. - P. 236-240.

100. Method to assay the concentrations of phenolic constituents of biological interest in wines Текст] / D.M. Goldberg, E.Tsang, A.Karumanchiri, E.P.Diamandis, G.Soleas, E.Ng // Anal. Chem. 1996, Vol. 68. - P. 1688-1694.

101. Бубенчикова, B.H. Изучение состава фенольных соединений вероники простертой методом ВЭЖХ Текст] / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Кондратова // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006, Т.6. -В. 2.-С. 319-322.

102. Nikolova, М. External flavonoid aglycones from Veronica chamaedrys L. (Scrophulariaceae) Текст] / M. Nikolova, R. Gevrenova, S. Ivancheva // Acta Pharm. 2003, Vol. 53. - P. 145-149.

103. Phenolic and triterpenoid antioxidants from Origanum majorana L. herb and extracts obtained with different solvents Текст] / E. Vagi, E. Rapavi, M.150

104. Hadolin, К. Vasarhelyine Peredi, A. Balazs, А. В Текст. / lazovics, В. Simandi // J. Agric. Food Chem. 2005, Vol. 53. - P. 17-21.

105. Schulz, H. High-performance liquid chromatographic haracterization of some medical plant extracts used in cosmetic formulas Текст] / H. Schulz, G. Albroscheit // J. Chromatogr. 1988, Vol. 442. - P. 353-361.

106. Tamura, Y. Changes in the concentrations of bioactive compounds in plantain leaves Текст] / Y. Tamura, S. Nishibe // J. Agric. Food Chem. 2002, Vol. 50.-P. 2514-2518.

107. A universal HPLC method for the determination of phenolic acids in compound herbal medicines Текст] / D. Wen, Ch. Li, H. Di, Y. Liao, H. Liu // J. Agric. Food Chem. 2005, Vol. 53. - P. 6624-6629.

108. Characterization of flavonols in cranberry (Vaccinium macrocarpon) powder Текст] / I.O. Vvedenskaya, R.T. Rosen, J.E. Guido, D.J. Russeli, K.A. Mills, N. Vorsa // J. Agric. Food Chem. 2004, Vol. 52. - P. 188-195.

109. Сычев, C.H. Методы совершенствования хроматографических систем и механизмы удерживания в ВЭЖХ Текст] / С.Н. Сычев. Орел, 2000.-212 с.

110. Marwan, A.G. Identification of the hydroxycinnamtic acid derivatives in cranberries Текст] / A.G. Marwan, C.W. Nagel // J. Food Sci. 1982, Vol. 47. - P. 774-782.

111. Antioxidant activity of phenolics extracted from Olea europaea L. leaves Текст] / О. Benavente-Garcia, J. Castillo, J. Lorente, A. Ortun, J.A. Del Rio // Food Chem. 2000, Vol. 68. - P. 457-462.

112. Choi, Y.H. High performance liquid chromatography-electrosprayionization MS-MS analysis of Forsythia koreana fruits, leaves, and stems.

113. Enhancement of the efficiency of extraction of arctigenin by use of supercriticai151fluid extraction Текст. / Y. Hae Choi, J. Kim, K.-P. Yoo // Chromatographia. -2003, Vol. 57. №1-2. - P. 73-79.

114. Characterization of Calendula flower, milk-thistle fruit, and passion flower tinctures by HPLC-DAD and HPLC-MS Текст] / A. R. Bilia, D. Salvini, G. Mazzi, F.F.Vincieri // Chromatographia. 2001, Vol. 53. - № 3, 4. - P. 210215.

115. Extraction of hydrolysable tannins from Phyllanthus niruri Linn.: Effects of solvents and extraction methods Текст] / M. Markom, M.Hasan, W. R.W.Daud, H. Singh, J. Md Jahim. Kuala Lumpur, 2006. - 28 p.

116. Krafczyk, N. Characterization of phenolic compounds in rooibos tea Текст] / N. Krafczyk, M. A. Glomb // J. Agric. Food Chem. 2008, Vol. 56. -P. 3368-3376.

117. Сычев, C.H. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночных хроматографах серии «Милихром» Текст] / С.Н. Сычев, К.С. Сычев, В.А. Гаврилина. Орел, 2002. - 135 с.

118. Determination of naringin and hesperidin in fruit juices

119. Электронный ресурс. / S.Marten, J.Harms // Knauer /152www.sepscience.com/./8c64ecla-0ba7-4cb (05.09.2011).

120. Carando, S. HPLC coupled with fluorescence detection for the determination of procyanidins in white wines Текст] / S. Carando, R L. Teissedre, J. C. Cabanis // Chromatographia. 1999, Vol. 50. - № 3, 4. - P. 253-254.

121. Peyrat-Maillard, M.N. Determination of the antioxidant activity of phenolic compounds by coulometric detection Текст] / M.N. Peyrat-Maillard, S. Bonnely, C. Berset // Talanta. 2000, Vol. 51. - P. 709-716.

122. Robards, K. Analytical chemistry of fruit bioflavonoids. A review Текст] / К. Robards, M.Antolovich // Analyst. 1997. - Vol. 122. - P. 11R-34R.

123. Jaiswal, R. Determination of the hydroxycinnamate profile of 12 members of the Asteraceae family Текст] / R. Jaiswal, J. Kiprotich, N. Kuhnert // Phytochemistry. 2011, Vol. 72. - P. 781-790.

124. Simultaneous determination of phenolic acids and flavonoids in1531.cium barbarum Linnaeus by HPLC-DAD-ESI-MS Текст. / B.S. Inbaraj, H.Lu, Т.Н. Kao, B.H. Chen // J. Pharmaceut. Biomed. 2010, Vol. 51. - P. 549-556.

125. On-line HPLC analysis of the antioxidant activity of phenolic compounds in brewed, paper-filtered coffee Текст] / A. Stalmach, W. Mullen, Ch. Nagai, A. Crozier // Braz. J. Plant Physiol. 2006, Vol. 18. - № 1. - P. 253-262.

126. Лебедев, A.T. Масс-спектрометрия в органической химии Текст] / A.T. Лебедев М.: БИНОМ, Лаборатория знаний, 2003. - 501 с.

127. Characterization of cyanidin- and quercetin-derived flavonoids and other phenolics in mature saskatoon fruits (Amelanchier alnifolia Nutt.) Текст] / J.A. Ozga, A.Saeed, W. Wismer, D.M. Reinecke // J. Agric. Food Chem. 2007, Vol. 55.-P. 10414-10424.

128. Determination of caffeoylquinic acids and flavonoids in Cynara scolymus L. by high performance liquid chromatography Текст] / M. Hausler, M. Ganzera, G. Abel, M. Popp, H. Stuppner // Chromatographia. 2002, Vol. 56. -№7-8.-P. 407-411.

129. Characterization of Matricaria Recutita L. flower extracts by HPLC-MS and HPLC-DAD analysis Текст] / N. Mulinacci, A. Romani, E. Pinelli, E.E. Vincieri, D. Prucher // Chromatographia. 2000, Vol. 51. - № 5-6. - P. 301-307.

130. Combination of TLC and HPLC-MS/MS methods. Approach to a rational quality control of Chinese star anise Текст] / I. Lederer, G. Schulzki, J. Gross, J.-P. Steffen // J. Agric. Food Chem. 2006, Vol. 54. - P. 1970-1974.

131. High performance liquid chromatography in phytochemical analysis. Chromatographic science series. Vol. 102 Текст] / edited by M. Waksmundska-Hajnos, J. Sherma. New York, CRC Press, 2011. - 998 p.

132. UPLC-MS analysis for simultaneous determination of eight components in the 'Ge-Gen-Qin-Lian' tablets Текст] / R. An, Y. Wang, L. You,154

133. X. Wang // Chromatographia. 2009, Vol. 69. - № 9, 10. - P. 969-975.

134. Variation in artemisin and flavonoid content in different extracts of Artemisia annua L. Текст] / A.R. Billia, C.Gabriele, M.C. Bergonzi, P. Melillo de Malgalhaes, F.F. Vincieri // Natural product communication. 2006. - P. 1-5.

135. High selective purification of flavonoids from natural plants based on polymeric adsorbent with hydrogen-bonding interaction Текст] / X. Geng, P. Renl, G. Pi, R. Shi, Z. Yuan, Ch. Wang // J. Chromatogr. A. 2009, Vol. 1216. -P. 8331-8338.

136. Flavonoids, sugars and fruit acids of alpine bearberry (Arctostaphylos alpina) from furnish lapland Текст] / К. Linderborg, О. Laaksonen, H. Kallio, B. Yang // Food Res. Int. 2011, Vol. 44. - P. 2027-2033.

137. Fenner, G.P. Low-temperature treatment of soybean (Glycine max) isoflavonoid aglycon extracts improves gas chromatographic resolution Текст] / G.P. Fenner // J. Agric. Food Chem. 1996, Vol. 44. - № 12. - P. 3727-3729.

138. Zhang, K. GC-MS determination of flavonoids and phenolic and benzoic acids in human plasma after consumption of cranberry juice Текст] / К. Zhang, Y. Zuo // J. Agric. Food Chem. 2004, Vol. 52. - P. 222-227.

139. An alternative method for the determination of some of the antioxidant phenolics in varietal turkish red wines Текст] / R. Ertan Anli, R. Ertan Anli, N. Vural, E. Kizilet // J. I. Brewing. 2008, Vol. 114. - № 3. - P. 239245.

140. Loots, D.T. Aloe ferox leaf gel phytochemical content, antioxidant capacity, and possible health benefits Текст] / D.T. Loots, F.H. van der Westhuizen, L. Botes // J. Agric. Food Chem. 2007, Vol. 55. - P. 6891-6896.

141. A multiresidue derivatization gas chromatographic assay for fifteen phenolic constituents with mass selective detection Текст] / G.J. Soleas, E.P. Diamandis, A.Karumanchiri, D.M. Goldberg // Anal. Chem. 1997, Vol. 69. -P. 4405-4409.

142. Horvat, R.J. A Gas-liquid chromatographic method for analysis of phenolic acids in plants Текст] / R.J. Horvat, S.D. Senter // J. Agric. Foal Chem. -1980, Vol. 28.-P. 1292-1295.

143. Denisova, S. B. Isolation and GC-MS determination of flavonoids from Glycyrrhiza glabra root Текст] / S.B. Denisova, E.G. Galkin, Yu.I. Murinov // Chem. Nat. Compd. 2006, Vol. 42. - № 3. - P. 285-289.

144. Huang, H.-M. Phenolic acid content of food plants and possible nutritional implications Текст] / H.-M. Huang, G.L. Johanning, B.L. O'Dell // Food Technol. Biotechnol. 2008, Vol. 46. -№ 2. - P. 151-156.

145. Кашутина, M.B. Силилирование органических соединений

146. Текст. / M.B. Кашутина, C.JI. Иоффе, В.А. Тартаковский // Успехи химии.1561975.-№9.-С. 1620-1648.

147. Preparation of TMS derivatives for GC/MS Электронный ресурс] / Sessions Biogeochemistry Lab. 2009. - www.gps.caltech.edu (10.08.2011).

148. Takeoka, G.R. Antioxidant Constituents of Almond .Prunus dulcis (Mill.) D.A. Webb] Hulls [Текст] / G.R. Takeoka, L.T. Dao // J. Agric. Food Chem. 2003, Vol. 51. - P. 496-501.

149. Acidic pharmaceuticals in sewage methodology, stability test, occurrence, and removal from ontario samples Текст] / H.-B. Lee, K. Sarafin, Т.Е. Peart, M. L. Svoboda // Water Qual. Res. J. Canada. - 2003, Vol. 38. - № 4. -P. 667-682.

150. Profling changes in metabolism of isoïavonoids and their conjugates in Lupinus albus treated with biotic elicitor Текст] / P. Bednarek, R. Franski, L. Kerhoas, J. Einhorn, P. Wojtaszek, M. Stobiecki // Phytochemistry. 2001, Vol. 56.-P. 77-85.

151. ГОСТ 24027.1-80. Сырье лекарственное растительное. Методы определения подлинности, зараженности амбарными вредителями, измельченности и содержания примесей. Введен в действие 01.01.1981.

152. Шафигулин, Р.В. Физико-химические особенности сорбции гетероциклических соединений природного и синтетического происхождения в условиях ОФ ВЭЖХ Текст] : дис. на соиск уч. степ. канд. хим. наук / Р.В. Шафигулин. Москва, 2007.

153. Темердашев, З.А. Определение фенольных соединений в лекарственных растениях методом обращено-фазовой ВЭЖХ Текст] / З.А. Темердашев, Н.А. Фролова (Берниковская), И.А. Колычев // ЖАХ. 2011, Т. 66.-№4.-С. 417-424.

154. Malikin, G. Assessing HPLC peak purity with Shimadzu photodiode detector SPD -M lOAvp Электронный ресурс] / Malikin, G. // Shimadzu scientific instruments / http://www.ssi.shimadzu.com/search/searchresults.cfm? searchitem=detectors (10.08.2011).

155. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их157химический состав, использование; Семейство Asteraceae (Compositae) Текст. / под ред. П.Д. Соколова // СПб.: Наука. 1993. - 352 с.

156. Шарова, О.В., Куркин, В.А. Флавоноиды цветков календулы лекарственной Текст] / О.В. Шарова, В.А. Куркин // Химия растительного сырья. 2007. - №1. - С. 65-68.

157. Абдулбекова, В.Н., Разработка метода количественного анализа цветков календулы лекарственной Тект] / В.Н. Абдулбекова, А.А. Тулаганов // Хим.-фарм. Ж. 2001, Т.35. - №10. - С. 25-26.

158. Галкин, М.А. Дикорастущие полезные растения Северного Кавказа Текст] / М.А. Галкин, A.JI. Казаков // Ростов-на-Дону. 1980. -128 с.

159. Khare, С.Р. Indian Medicinal Plants. An illustrated dictionary Текст] / С.Р. Khare // New-Delhi; Springer. 2007. - 863 p.

160. Quantitative HPLC determination of phenolic compounds in yarrow Текст] / R. Benetis, J. Radusiene, V. Jakstas, V. Janulis, G. Puodziuniene // Pharmaceutical chemistry journal. 2008, Vol. 42. - №3. - P. 153-156.

161. Петков, В. Современная фитотерапия Текст] / В. Петков // София: Медицина и физкультура. 1988. - 504 с.

162. Ермаков, А.И. Методы биохимического исследования растений, 3-е изд., перераб. и доп. Текст] / А.И. Ермаков, В.В. Арасимович, Н.П. Ярош // Л.; Агропромиздат. Ленингр. отд-ние, 1987. 430 с.

163. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Paconiaceae Thymelaeaceae Текст] / под ред. П.Д. Соколова // Л.: Наука, 1985. - 336 с.

164. Anti-inflammatory, anti-tumor-promoting, and cytotoxic activities of constituents of marigold (Calendula officinalis) flowers Текст] / Ukiya M., Akihisa Т., Yasukawa K., Tokuda H., Suzuki Т., Kimura Y. // J. Nat. Prod. 2006, Vol. 69.-P. 1692-1696.

165. Определение фенольных соединений и флавоноидов в водныхэкстрактах лекарственных растений Текст. / З.А. Темердашев, Н.А. Фролова158

166. Берниковская), И.А. Колычев, Т.Г. Цюпко // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2011. - Т. 77. - № 11. - С 18-22.

167. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Hippuridaceae Lobeliceae Текст] / под ред. П.Д. Соколова // СПб.: Наука, 1991.-200 с.

168. Бубенчикова, В. Н. Изучение фенольных соединений шалфея мутовчатого (Salvia verticillata L.) Текст] / В. Н. Бубенчикова, Ю. А. Кондратова // Башкирский химический журнал. 2008, Т. 15. - № 2. - С. 102104.

169. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Caprofoliaceae -Plantaginaceae Текст] / под ред. П.Д. Соколова // JL: Наука, 1990. 328 с.

170. Горяев, М.И. Растения, обладающие противоопухолевой активностью Текст] / М.И. Горяев, Ф.С. Шарипова // Алма-Ата: Изд. Наука, 1983.- 174 с.

171. Plantain ( L.) Species as Novel Sources of Flavonoid Antioxidants Текст] / I.N. Beara, M.M. Lesjak, E. Jovin, K.J. Balog, G.T. Anackov, D.Z. Orcic, N.M. Mimica-Dukic // J. Agric. Food Chem. 2009, Vol. 57. - P. 92689273.

172. Smelcerovic, A. Comparison of methods for the exhaustive extraction of hypericins, flavonoids, and hyperforin from Hypericum perforatum L. Текст] / A. Smelcerovic, M. Spiteller, S. Zuehlk // J. Agric. Food Chem. 2006, Vol. 54. -P. 2750-2753.

173. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Rutaceae Elacagnaceae Текст] / под ред. П.Д. Соколова // Л.: Наука, 1988. - 357 с.

174. Flavonoids of Plantago species in Egypt Текст] / S.A. Kawashty, E. Gamal-El-Din, M.F. Abdalla, N.A.M. Saleh // Biochem. Syst. Ecol. 1994, Vol. 22.-№7.-P. 729-733.

175. Pyrzynska, К. Analysis of phenolic acids and flavonoids in honey Текст] / К. Pyrzynska, M. Biesaga // Trends Analyt. Chem. 2009, Vol. 28 -№7. - P. 893-902.

176. Oxidative reactions of caffeic acid in model systems containing polyphenol oxidase Текст] / V. Cheynier, M. Moutounet // J. Ark. Food Chem. -1992, Vol. 40. P. 2030-2044.

177. Chemical characterization of phenolic compounds in Erigeron injection by rapid-resolution LC coupled with multi-stage and quadrupole-TOF-MS Текст] / Y. Zhang, Q. Zhao, J. Ma, B. Wu, X. Zeng // Chromatographia. -2010, Vol. 72.-P. 651-658.

178. Identification of isomeric dicaffeoylquinic acids from Eleutherococcus senticosus using HPLC-ESI/TOF/MS and H-NMR methods Текст] / A. Tolonen, T. Joutsamo, S. Mattlla, T. Kamarainen, J. Jalonen // J. Phytochem. Anal. 2002, Vol.13.-P. 316-328.

179. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия (с основами биохимии лекарственных растений) Текст] / Д.А. Муравьева. М.: Медицина, 1987. -656 с.

180. Assessing African medicinal plants for efficacy and safety: agricultural and storage practices Текст] / C.W. Fennell, M.E. Light, S.G. Sparg, G.I. Stafford, J. van Staden // J. Ethnopharmacol. 2004, Vol. 95. - P. 113-121.

181. Тимофеев, Н.П. Оценка качества лекарственного сырья левзеисафлоровидной методом бромной антиокислительной емкости Текст. / Н.П.

182. Тимофеев, А.А. Лапин, В.Н. Зеленков // Бутлеровские сообщения. 2006,1601. Т.8. -№2. С. 36-41.

183. Школьникова, М.Н. Изучение возможности применения метода ускоренного старения для прогнозирования сроков хранения безалкогольных бальзамов Текст] / М.Н. Школьникова, Е.В. Аверьянова, И.В. Щеглова // Ползуновский вестник. 2007. - №3. - С. 184-187.

184. Stafford, G.I. Effect of storage on the chemical composition and biological activity of several popular South African medicinal plants Текст] / G.I. Stafford, A.K. Jager J.van Staden // J. Ethnopharmacol. 2005, Vol. 97. - I. 1. -P. 107-115.

185. Оценка стабильности фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растениях в процессе их хранения Текст] / З.А. Темердашев, Н.А. Фролова, Т.Г. Цюпко, Д.А. Чупрынина // Химия растительного сырья. -2011.-№4.-С. 179-184.