Химический состав экстрактивных веществ копеечника щетинистого тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

Неретина Ольга Владимировна

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ЭКСТРАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ КОПЕЕЧНИКА ЩЕТИНИСТОГО (Hedysarum setigerum Turcz. ex Fisch. Et Meyer)

02.00.03. - Органическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук -

Иркутск - 2004

Работа выполнена в Иркутском государственном техническом университете

Научный руководитель: Кандидат химических наук, ведущий

научный сотрудник, доцент Луцкий Владислав Илларионович

Научный консультант: Доктор химических наук

Семенов Аркадий Алексеевич

Официальные оппоненты: Доктор химических наук, профессор

Каницкая Людмила Васильевна

Кандидат химических наук, доцент Финкельштейн Борис Львович

Ведущая организация: Тихоокеанский Институт

Биоорганической химии (ТИБОХ)

Защита состоится " 24 " июня 2004 года в 1000 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.074.06 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата химических наук при Иркутском Государственном Университете по адресу: 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 126.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского государственного университета

Отзывы и замечания на автореферат просим направлять по адресу: 664003, Иркутск-3, ул. Карла Маркса 1, ИГУ, ученому секретарю Эдельштейн О .А

Автореферат разослан

мая 2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, к. х. н., доцент

Эдельштейн

Общая характеристика работы Актуальность работы. Химии принадлежит ведущая роль в деле создания новых лекарств. В последнее десятилетие, несмотря на огромное количество синтетических фармацевтических средств, неуклонно возрастает интерес к препаратам растительного происхождения, обладающим эффективным действием.

Одна из наиболее актуальных и нерешенных проблем медицины — лечение внутриклеточных инфекций. В настоящее время, практически нет надежных способов борьбы с такими инфекциями, как гепатит С и хламидиоз. Тем не менее, в народной медицине' накоплен значительный положительный опыт борьбы с заболеваниями вирусной природы с использованием лекарственных растений, в частности, растений рода Hedysarum (копеечник). Противовирусное действие копеечников секции Obscura обуславливает гликозилированный ксантон - мангиферин. Растения рода Hedysarum других секций (Fruticosa В. Fedtsch, Spinosissima В. Fedtsch., Multicaulia Boiss, Crinifera Boiss., Subacaulia Boiss), по литературным данным не содержащие мангиферин, также обладают противовирусным действием. Поэтому одной из актуальных задач является исследование химического состава копеечников этих секций и выявление вторичных метаболитов с противовирусным действием.

Целями работы являются: исследование химического состава и установление физико-химическими и спектральными методами структуры соединений, выделенных из надземной части копеечника щетинистого; изучение закономерностей фрагментации, выделенных гликозидов флавоноидов, «мягкими» методами масс-спектрометрии (FAB и MALDI); выявление биологически активных веществ обуславливающих противовирусное действие копеечника щетинистого.

Научная новизна. Впервые изучен химический состав надземной части копеечника щетинистого {Hedysarum setigerum Turcz. ex Fisch. Et Meyer, род Hedysarum, секция Multicaulia Boiss, семейство Fabaceae).

Из исследуемого вида растения выделены и идентифицированы двенадцать флавоноидов: агликонов флавонолов (3) и их гликозидов (4), гликозидов флавонов (2) и метоксифлавонов (3). Несмотря на большое число химически изученных ранее видов копеечника (более 40 видов), нами впервые в роде Hedysarum обнаружена группа флавонов. Из них один (необудоффицид) является вторым примером обнаружения этого соединения в природе. В

то

S&1

тонентов в

БИБЛИОТЕКА СПетср 09 ДО/

составе Ивйу8агит setigerum идентифицированы карбоциклический лигнан, тетрагидронафталинового и алкалоид протоберберинового типов, что является первым примером выделения представителей этих химических классов из растений рода Hedysarum. Среди ароматических соединений растения также идентифицированы 2 гидроксибензойные кислоты.

Изучены стерины продуцируемые копеечником щетинистым. Идентифицированы четыре стерина, два из которых впервые выделены из растений рода Hedysarum.

На основании полученных FAB+ и MALDI+ масс-спектров флавоноидов (9 соединений) выдвинуты следующие предположения по закономерности фрагментации флавоноидов в рамках этих методов: в FAB+ масс-спектрах гликозидов флавоноидов отсутствие 100% иона, соответствующего отрыву внутренней углеводной единицы, указывает на принадлежность флавоноидов к флавонам и флавонолам; отрыв терминального углеводного остатка вместе с атомом кислорода гликозидной связи наблюдается только в спектрах рамнопиранозил-глюкопиранозидов (рутинозидов), а не рамнопиранозил- -глюкопиранозидов (неогесперидозидов).

Выявлены компоненты растения, обусловливающие противовирусное действие копеечника щетинистого, на основе которых планируется создание средства для борьбы с вирусными инфекциями.

Апробация результатов. Материалы работы представлены на конференции молодых ученых Иркутского научного центра СО РАН и вузов Иркутска, Иркутск, 2001; П Всероссийской конференции по химии и технологии растительных веществ, Казань, 2002; Международной научной конференции по химии, технологии и медицинских аспектах природных соединений, Алматы, Казахстан, 2003. Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 1 схему, 20 таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 152 цитируемых работы. Используемые сокращения. Ш и 2В ЯМР - одно- и двумерный ядерный магнитный резонанс, ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера, HR-MC - масс-спектрометрия

высокого разрешения, FAB+-MC - масс-спектрометрия с ионизацией бомбардировкой быстрыми атомами (положительные ионы), MALDI+-MC - масс-спектрометрия с лазерной ионизацией из матрицы, ESI+-MC - масс-спектрометрия с ионизацией электро-спрэем, ДЭАЭ - диэтиламиноэтилцеллюлоза.

Основное содержание работы В литературном обзоре систематизированы сведения по химическому составу и фармакологическим свойствам растений рода копеечник. Поскольку при химическом изучении надземной части копеечника щетинистого большинство выделенных соединений относятся к гликозидам флавоноидов, в специальном разделе обзора рассмотрены особенности масс-спектральной фрагментации нелетучих гликозидов флавоноидов с применением современных масс-спектрометрических методов, использующих «мягкие» способы ионизации - FAB и MALDI.

1. Химическое изучение соединений Н. setigerum

Предметом химического изучения данной работы служила надземная часть копеечника щетинистого. Выделение веществ осуществляли из сконцентрированного водно-метанольного экстракта растения комбинацией хроматографических приемов на различных сорбентах (полиамид, силикагель, сервацел ДЭАЭ в ОН" в форме, сефадексы LH-20-100, G-10) при различных вариациях элюентных систем (вода-метанол, хлороформ-метанол, хлороформ-метанол-вода, гексан-бензол). В итоге было идентифицировано 20 соединений, представленные флавоно идами (12), фенолокислотами (2), лигнанами (1), алкалоидами (1) и стеринами (4).

Суммарное содержание флавоноидов от массы воздушно-сухого сырья составляет около 2%, при этом флавонолы и флавоны находятся примерно в равных долях. Среди флавонолов доминируют в количественном отношении кверцетин (I), кверцитрин (II) и авикулярин (VI), минорными являются изорамнетин (III), 3-метоксикемпферол (IV), 3-0-а^-арабинофуранозид кемпферола (V) и рутин (IX). У флавонов преобладают роифолин (VIII) и лоницерозид (X), минорные компоненты представлены необудоффицидом (VII), диосмином (XI) и линарином (XII).

Содержание стеринов в надземной части растения составляет порядка 0.09% от массы воздушно-сухого сырья. Фенолокислоты, лигнан и алкалоид относятся к минорным компонентам растения. ,

1.1. Флавоноидные соединения И. setigerum

Флавоноиды составляют доминирующую в качественном и количественном отношении группу изученных соединений копеечника щетинистого. Все флавоноиды содержат 5,7-дигидроксизамещенное кольцо А, но различаются характером и местоположением заместителей в кольце В и у-пироновом кольце С.

Флавоноидные соединения I-XII включают агпиконы (I, III, IV), 3-0-гликозиды в случае флавонолов (II, V, VI, IX) и 7-О-гликозиды в ряду флавонов (VII, VIII, X, XI, XII). Гликозиды представлены монозидами (II, a-L-Rha,,; V, VI, а-1^Агаг), биозидами (VIII, X, a-L-Rha,,-(l->2)-p-D-GiCp; XI, XII, a-L-Rhv(I->6)-P-D-GlCp) и триозидом (VII, a-L-Rhap-(l->6)-[a-L-Rhap-(l->2)]-P-D-GlCp). Некоторые из представителей являются гомологами по степени гидроксилирования (V-VI, VIII-X и XI-XII). 1.1.1. Флавоны

Из копеечника щетинистого выделено пять флавоновых гликозидов, из которых четыре являются биозидами (VIII, X, Х! XII) и один - триозидом (VII). Во всех соединениях углеводная цепь представлена P-D-глюкопиранозой и a-L-рамнопиранозой, которая является терминальной и присоединяется к глюкозе по второму или шестому положениям.

До наших исследований не было найдено в растениях рода Hedysarum флавоновых соединений ни в свободном, ни в гликозилированном виде. Нам впервые удалось обнаружить в составе Н. setigerum гликозиды флавонов (роифолин VIII, лоницерозид X) и метоксифлавонов (линарин XII, диосмин XI, необудоффицид VII). Необудоффицид - единственный флавоноид идентифицированный в составе Я. setigerum и роде Hedysarum, который является триозидом и имеет разветвленную углеводную цепь. До настоящего времени он был выделен только из вида Buddleia officinalis Maxim.

Структурный анализ гликозидов флавоноидов складывается из двух этапов, первым из которых является изучение агликона. Другим, не менее важным, а зачастую и решающим этапом исследования являются вопросы строения углеводной части молекулы, а также ее взаимосвязи с агликоном. Здесь задача сводится не только к установлению структуры, но и к стереохимическому изучению конфигурации заместителей.

R=a-L-Rhap-( 1 ->6)-[ a-L-Rhv(I->2)]-ß-D-GlCp, Ri=H, R2=CH3, необудоффицид (VII)

R=a-L-Rhap-(l->2)-ß-D-GlCp, Ri=R2=H, роифолин (VIII) R=a-L-Rhap-(l->2>ß-D-GlCp, Ri=OH, R2=H, лоницерозид (X) R=a-L-Rhap-(l->6)-P-D-GlCp, Ri=OH, R2=CH3, диосмин (XI) R=a-L-Rhap-( 1 ->6)-ß-D-GlCp, Ri=H, R2=CH3, линарин (XU)

Необудоффицид (VII) Этот флавоноид относится к малораспространенной группе триозидов флавоноидов. В HR-FAB масс-спектре наблюдали пик молекулярного 1 иона m/z 761.2283 [M+Na]+, соответствующий брутто-формуле C34H420,gNa.

Из спектров ЯМР 'Н и 13С соединения VII следовало, что его агликон имеет 5,7-дигидроксизамещенное кольцо А. Резонансные сигналы протонов Н-6 (7.02 м.д.) и Н-8 (7.08 м.д.) кольца-А в спектре ЯМР' Н наблюдали в виде двух дублетов с КССВ 1.8 Гц. По степени окисления у-пиронового кольца С соединение VII отнесли к флавонам, поскольку в спектре присутствовал сигнал протона Н-3 в виде синглета при 6.89 м.д. В УФ-спектре соединения VII имеются также два максимума поглощения при 269 и 326 нм, характерные для флавоновой структуры. Протоны кольца В Н-2',6' и Н-3',5' проявлялись в спектре ЯМР 1Н в виде двух пар дублет дублетов при 7.97, 7.14 м.д. (J=8.8, 1.9 Гц), интенсивностью в два протона каждый, следовательно кольцо В имеет пара-замещение. Синглет интенсивностью в три протона при 3.70 (атом углерода в спектре ЯМР ПС - 55.35) м.д. отнесли по значению ХС к ароматической метоксильной группе. Местонахождение этой группы в соединении VII по 4' положению кольца В установили из NOESY спектра, в котором присутствуют кросс-пики протонов ОСНз-группы с протонами Н-3',5'. Из вышеприведенных данных следует, что агликоном соединения VII является акацетин.

В 1D и 2D ЯМР спектрах гликозида VII присутствуют резонансные сигналы аномерных протонов (Н-1", Н-1"", Н-11") трех углеводных единиц и соответствующих им атомов углерода при 5.70 (99.89) м.д. (КССВ 7.5 Гц), 5.46 (102.40) (КССВ 1.2 Гц) и 6.42 (102.32) м.д. (КССВ 1.2 Гц), соответственно. О триозидном характере флавоноида VII также свидетельствует наличие в его FAB масс-спектре осколочных ионов при m/z 469 [M+Na-2xl46]+ и 273 [M+Na-2(OH)-2xl46-162]+, соответствующих отрыву двух остатков дезоксигексоз и блока из двух дезоксигексоз и гексозы. Причем дезоксигексозы имеют терминальное расположение. Сигналы метильных групп СНз-

6'"' при 1.63 (18.20) И СНз-6"' 1.93 (19.20) м.д. с константами 6.2 Гц давали основание сделать заключение о том, что в молекуле флавоноида находятся два остатка рамнозы. Значения ХС протонов и углеродов трех углеводных единиц в спектрах ЯМР 'И и 13С соединения VII соответствуют одной (З-Б-глюкопиранозе и двум - о-Ь-рамнопиранозам. Место гликозилирования агликона и последовательность присоединения углеводов между собой выяснили из НМВС и ЯОЕ8У спектров. Аномерный протон глюкозы Н-1" (5.70 м.д.) в НМВС спектре имеет кросс-пик с атомом углерода С-7 (163.71 м.д.), а в ЯОЕ8У спектре аномерный протон глюкозы Н-1" дает кросс-пики с протонами Н-6 (7.02 м.д.) и Н-8 (7.08 м.д.) кольца А. Аномерный протон рамнозы Н-1"" (5.46 м.д.) в НМВС спектре имеет кросс-пик с атомом углерода С-6" (67.32 м.д.) глюкозы, а в ЯОЕ8У спектре с протоном Н-6" (4.68 м.д.) глюкозы. Аномерный протон рамнозы Н-1'" (6.42 м.д.) в НМВС спектре дает кросс-пик с атомом углерода С-2" (77.52 м.д.) глюкозы, а в ЯОЕ8У спектре с протоном Н-2" (4.50 м.д.) глюкозы. Значения ХС атомов углерода глюкозы С-2" (77.52 м.д.) и С-6" (67.32 м.д.) также свидетельствуют об их гликозилировании. Полученные данные указывают на то, что остаток глюкозы присоединяется по 7 положению в агликоне, а два остатка рамнозы гликозилируют глюкозу по 2 и 6 положениям (рис. 1).

спектре соединения VII

Совокупность всех данных для соединения VII позволили нам

идентифицировать этот флавоноид как 7-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1-»6)-[а-Ь-

рамнопиранозил-(1—>2)]-Р-Б-глюкопиранозид 5,7-дигидрокси-4'-метоксифлавона (необудоффицид, рис. 1).

Биозиды флавонов. Копеечник щетинистый содержит четыре биозида флавонов: 7-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1 —>2)-р-0-глюкопиранозид5,7,4'-

тригидроксифлавона (роифолин, VIII), 7-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1—>2)-Р-13-глюкопиранозид 5,7,3',4'- тетрагидроксифлавона (лоницерозид, X), 7-О-а-Ь-рамнопиранозил- -глюкопиранозид 5,7,3-тригидрокси-4'-метоксифлавона

(диосмин, XI) и 7-0-а-1^рамнопиранозил-(1-*6)-|}-0-глюкопиранозид 5,7-дигидрокси-4'-метоксифлавона (линарин, XII). Агликоны этих флавонов представляют собой гомологи по степени гидроксилирования и метоксилирования кольца В. Все они являются 7-О-гликозидами и имеют одинаковый качественный состав биозидной цепи но отличаются порядком связи между

углеводами. В соединениях VIII, X рамноза присоединяется к глюкозе по 2 положению (неогесперидозиды), а в соединениях XI, XII - по 6 положению (рутинозиды).

Разделение этих флавонов провели на полиамидном сорбенте в системе вода-метанол и получили две фракции. В первой присутствовали

соединения VIII и X, а во второй (МеОН:НгО 30—>40%) - XI и XII. Такое хроматографическое поведение биозидов гидрокси- и метоксифлавонов свидетельствует о том, что хроматография проходит по распределительному механизму. Известно, что во флавонах пространственно-свободные 7 и 4' ОН-группы играют основную роль в их сорбционной способности, а 3' ОН-группа -минимальную. Соединения VIII и X отличаются между собой на 3' ОН-группу, поэтому такое структурное различие не позволило индивидуализировать оба соединения. Доминирующий компонент VIII выделили в индивидуальном виде и получили фракцию обогащенную компонентом X. Флавоноиды XI, XII'является минорными компонентами и имеют аналогичные структурные различия (З'-ОН группу), которые также не позволили нам разделить эти соединения.

Роифолин (VIII). лоницерозид (XV диосмин (XI). линарин (XII). Идентификацию соединений провели с помощью Н, 13С и 2D ЯМР спектроскопии и HR-FAB масс-спектрометрии. На рисунках 2 и 3 представлены фрагменты спектров ЯМР 1Н для каждой пары соединений.

1Н-2-

т-■-[-1-1-1——1-1-■-1-'-1-1-1 1 1 I-1-1-1-1-'-1-■-1-"-1--

6.0 7 8 7 6 74 72 70 68 6.6 6.4 6 2 6.0 5.8 5 6 5 4 ррл

Рис. 2. Фрагмент спектра ЯМР Н суммы соединений VIII и X (СБ3ОБ)

он

«а Ш I» *П » » То «» «м

Рис. 3. Фрагмент спектра ЯМР Н суммы соединений XI и XII (БМ8О-ё6)

1.1.2. Флавонолы

Флавонолы в Н. setigerum представлены как агликонами (I, III, IV) так и гликозидами (II, V, VI, IX): кверцетин (I), кверцитрин (II), изорамнетин (III), 3-метоксикемпферол (IV), З-О-а-Ь-арабинофуранозид кемпферола (V), авикулярин (VI), рутин (IX).

Идентификация флавонолов проведена на основании физико-химических и спектральных данных, которые приведены в таблице 1.

Таблица 1

Физико-химические и спектральные данные флавонолов, выделенных из копеечника щетинистого

Соединение НК-РАВ* УФ, ^•пшх, НМ Спектры ЯМР 'Н, 5 м.д., У/Гц; (I - Ш, VI - ОМБО-^, IV - (С03)20С, V - С0300, IX - С5051^)

Н-2',6' Н-3',5' Н-8 Н-6 Другие протоны заместителей

кверцетин (I), т. пл. 302°С 303.0501 [М+Н]+ 256 374 7.70 (д, 1.9), 7.54 (дд, 8.5,1.9) 6.86 (д, 8.5) 6.40 (д, 1.6) 6.19 (д, 1.6) - •

кверцитрин (II), т. пл. 181-183°С 449.1082 [М+НГ 256 353 7.27 (д, 2.1), 7.25 (дд, 8.2, 2.1) 6.86 (д, 8.2) 6.37 (д, 2.1) 6.18 (д, 2.1) 5.23 (д, 1.2, Н-1" Юм) 0.81-3.95 (7Н,ЯЬа)

изорамнетин (III), т.пл. 299-300°С 317.0665 [М+Н]+ 255 369 7.78 (д, 2.0), 7.72 (дд, 8.6, 2.0) 6.96 (д, 8.6) 6.50 (д, 2.0) 6.22 (д, 2.0) 3.86 (с, ОСНз-31) -

3-метоксикемпферол (IV), т.пл. 270-272°С 323.0536 [м+шГ 267 350 8.01 (д, 8.2) 6.99 (д, 8.2) 6 49 (д, 1.5) 6.25 (д, 1.5) 3.86 (с, ОСН3-3) -

З-О-а-Ь- арабннофуранозид кемпферола (V), т.пл. 226-227°С 441.0804 [М+Иа]* 266 354 7.95 (дд, 8.6,2.2) 6.92 (дд, 8.6,2.2) 6.41 (д, 2.2) 6.21 (д, 2.2) 5.46 (уш. е., Н-1" Ага) 3.41-4.31 (5Н, Ага)

авикулярин (VI), т.пл. 208-209°С 435.0927 [М+НГ 257 355 7.48 (д, 2.2), 7.53 (дд, 8.4,2.2) 6.86 (д, 8.4) 6.39 (д, 2.0) 6.20 (д, 2.0) 5.58 (д, 1.1, Н-1" Ага) 3.35-4.16 (5Н, Ага)

рутин (IX), т.пл. 190-192°С 633.1434 257 357 8.33 (д, 1.8), 8.09 (дд, 8.3, 1.8) 7.35 (д, 8.3) 6.66 (д, 1.7) 6.64 (д, 1.7) 5.96 (д 7.2, Н-1" Ос), 3.934.52 (6Н, ас) 5.29 (д, 1.2, Н-1" И1а), 1.48-4.39 (7Н, Ма)

Флавонолы

НО

ОН О

ОН

R=H, Ri=OH, кверцетин (I) RrHx-L-Rhap, Ri=OH, кверцитрин (II) R=H, Ri=OCH3, изорамнетин (III) R=CH3, Ri=H ,3-метоксикемпферол (IV) R=a-L-Araf, Ri=H, З-О-а-Ь-арабинофуранозид кемпферола (V)

R=a-L-Araf, Ri=OH, авикулярин (VI) R=a-L-Rhap-(l->6)-0-ß-D-GIcp, Ri=OH, рутин (IX)

Практически для всех изученных растений рода Hedysarum характерно наличие кверцетина и его 3-О-гликозидов. Присутствие кемпферола отмечено только для одного вида Я. caucasicum, а его 3-О-глюкозида (астрагалин) - для Я polybotrys. Флавонолы IV, III и V несмотря на их широкое распространение в природе, в роде Hedysarum идентифицированы впервые. Для моногликозидов флавонолов характерно наличие в фуранозной форме, что встречается в составе вторичных

метаболитов растений относительно редко.

На основании- полученного и литературного материала рассмотрены возможные пути биосинтеза некоторых фенольных соединений в растениях рода Hedysarum и предложены группы соединений ранее не выделенных, но ожидаемых по биогенезу. Так как в листьях Я. carnosum, Я. spinossisimum capitatum, Я. flexuosum, H. pallidum, H. coronarium. была обнаружена галловая кислота, а в составе Я. polybotrys метиловый эфир 3,4,5-триметоксикоричной кислоты, то следует ожидать, что в копеечниках должны синтезироваться халконы, флавоноиды и изофлавоноиды содержащие 3',4',5'-замещенное кольцо В. На настоящий момент подобные вторичные метаболиты в составе растений рода Hedysarum ещё не обнаружены. 2. Изучение флавоноидов, выделенных из Н. setigerum, методами FAB и MALDI масс-спектрометрии

В процессе исследования химического состава надземной части Hedysarum setigerum нами выделены и изучены методом FAB+ и MALDI+ масс-спектрометрии 12 флавоноидов (агликоны, гликозиды флавонолов и гликозиды флавонов).

В. FAB+ масс-спектрах практически всех флавоноидов присутствовали фрагментные ионы, соответствующие отрыву - ОН, Н2О, СО, СО2, НСО от молекулярных ионов [М+Н]+ и [M+Na] +

На рисунке 4 представлена фрагментация агликоновой и гликозидной частей на примере 7-О-гликозидов флавонов, которая аналогично протекает и для 3-0-гликозидов флавонолов. Для 7-О-замещенных флавонов и метоксифлавонов при распаде у-пиронового кольца наиболее характерен разрыв углерод углеродных связей по положениям 1-9, 4-10 (путь I) и 1-9, 3-4 (путь II), относительная интенсивность (1а„,) ионов 98-100%. Но в тоже время, в масс-спектрах этой группы флавоноидов наблюдали осколочные ионы, образующиеся по путям III, IV, VI, VII и VIII, с 1отн от 9 до 40 % (рис. 4). Фрагментация агликоновой части в 3-О-замещенных флавонолах протекала по направлениям: I, II, Щ, IV, VI, VII и VIII (рис. 4), с образованием ионов различной интенсивности. При этом в масс-спектрах этой группы флавоноидов не наблюдали общих закономерностей при фрагментации у-пиронового кольца.

Рис. 4. Пути фрагментации агликоновой и углеводной частей в масс-спектрах 7-О-

гликозидов флавонов

Таким образом, на основании собственных и литературных данных можно сделать вывод о том, что фрагментация у-пиронового кольца по пути I или IV, с образованием осколочных ионов различной интенсивности, протекает для большинства гликозидов флавоноидов и не зависит от их принадлежности к флавонам, флавонолам или флаванонам.

Распад агликоновой части флавоноида по другим направлениям, вероятно, зависит не только от химической структуры соединения, но и способа ионизации молекулы. Преобладающая фрагментация агликона по пути П и III наблюдается только в ES1+ масс-спектрах кемпферола и апигенина соответственно. В нашем случае, в FAB+ масс-спектрах производных кемпферола фрагментация у-пиронового кольца по пути II отсутствует, но наблюдается в масс-спектрах гликозидов акацетина (линарин, необудоффицид), апигенина (роифолин) и диосметина (диосмин). А распад

агликоновой части по пути III осуществляется не только для гликозидов апигенина (роифолин), но и гликозидов кверцетина (авикулярин, рутин), что согласуется с данными работы по ESI+.

Фрагментация углеводной части всех гликозидов флавоноидов, протекала с отщеплением углеводных единиц (рис. 4). При этом в масс-спектрах наблюдали типичные ионы - соответствующие отрыву всех углеводных остатков (Yo, агликон) и терминального углевода (Y). В масс-спектре кемпферол-З-О-а-Ь-арабинофуранозида присутствовал лишь ион Zo, соответствующий отрыву терминального остатка углевода вместе с атомом кислорода гликозидной связи. Ион Z1 присутствовал в масс-спектрах только рамнопиранозил- -глюкопиранозидов (рутинозидов), а не рамнопиранозил-(1—>2)-глюкопиранозидов (неогесперидозидов). Отсутствие интенсивного иона связанного с отрывом внутреннего углеводного остатка, в масс-спектрах всех выделенных из Hedysarum setigerum флавоноидов указывает на то, что агликоны представлены флавонами или флавонолами, но не флаванонами, в спектрах которых ион Y* основной (рис. 5).

Рис. 5. Установление строения агликоновой части в О-гликозидах флавоноидов

методом FAB+

Учитывая относительные интенсивности пиков ионов в соотношении Ч\Г(* (рис. 5), удалось проследить закономерности, способствующие установлению принадлежности агликонов флавоноидных гликозидов к флавонам (необудоффицид, роифолин, линарин, диосмин) и флавонолам (рутин). Закономерность в установлении межгликозидной связи во флавоновых гликозидах наблюдалась лишь только

в случае роифолина, но не линарина и диосмина, возможно это может быть связано с метоксилированием в кольце В.

МАLDI+ масс-спектры были» получены для. изорамнетина, авикулярина, роифолина, линарина и диосмина. В масс-спектрах флавоноидов наблюдали молекулярные ионы [М + Н]+ и их аддукты со щелочными металлами [M+Na(K)]+, а также осколочные ионы, образующиеся при отрыве молекул СОг и СО от молекулярного иона. В MALDI+ масс-спектре изорамнетина присутствовало большее число фрагментных ионов (отрыв кольца В по пути VI), по сравнению с его FAB+ масс-спектром. В MALDI+ масс-спектре монозида кверцетина - авикулярина, наблюдали меньшее число осколочных ионов по сравнению с его FAB+ масс-спектром, хотя как в том, так и в другом спектре присутствовали ионы Y0, Z1 и фрагментный ион, образующийся при расщеплении по пути II или VII. Таким образом, при FAB+ и МАLDI+ ионизации гликозидов флавоноидов происходит фрагментация агликоновой части с распадом -пирового кольца С и отщеплением кольца В. Фрагментация углеводной части в гликозидах флавоноидах определяется строением агликоновой части и порядком присоединения углеводов между собой. 3. Идентификация- 9'-0-р-1)-глюкопиранозида 4,9,4',9'-тетрагидрокси-3,3'-диметокси-р8, а8', ßT-циклолигнана [(+)-изоларицирезинол-9,-0-р-1)-глюкопиранозида]

Из бутанольной фракции с применением колоночной хроматографии на декстрановых гелях (Sephadex LH-20-100 и G-10) выделили соединение XV. Хроматографическое поведение его на силикагелевых пластинках Soibfil в системе 70:12:1 (CHCIjlMeOHlHjO) позволило предположить, что это вещество является гликозидом.

В HR-FAB масс-спектре соединения XXV наблюдали пик молекулярного иона m/z 545.2003, соответствующий брутто-формуле СгбНяОцЫа. На монозидный характер этого соединения указывал присутствующий в его FAB масс-спектре осколочный ион m/z 342 образующийся в результате отрыва от

молекулярного иона остатка гексозы, молекулы воды и иона натрия. Абсорбционные максимумы исследуемого соединения в УФ-спектре лежат при 230 и 283 нм. Характер поглощения в УФ-области свидетельствует о наличии в системе сопряженных двойных связей.

При анализе Ю ("С, 'н, АРТ) и 20 (НБдС) ЯМР спектров (табл. 2) соединения XV сделали вывод о том, что в его структуре содержатся два бензольных кольца (полосы поглощения в ИК-спектре 1516,1454 см"1). В спектре ЯМР 'Н протоны одного кольца наблюдали в виде двух дублетов при 6.18 (Н-5) и 6.65 (Н-2) м.д. с пара-КССВ 0.7 Гц, следовательно, оно имеет 1, 3, 4, 6-замещение. Протоны другого бензольного кольца проявлялись в спектре в виде трех сигналов (ЛБС-система), каждый интенсивностью в один протон при 6.78 м.д. (Н-21, КССВ 1.9 Гц), 6.73 м.д (Н-51, КССВ 8.1 Гц) и 6.62 м.д. (Н-61, КССВ 8.1,1.9 Гц). Значит, второе ароматическое кольцо имеет 1', 3', 4'-замещение. Также в спектрах ЯМР 13С и 1Н наблюдали резонансные сигналы двух ароматических метоксильных групп при 56.36 (3.80) и 56.45 (3.81) м.д. (полоса поглощения в ИК-спектре 2856 см-1). Кроме того, в структуре соединения XV присутствуют три метановые группы при 39.47 (Н-8, 2.03), 45.88 (Н-8', 1.86) и 47.87 (Н-7, 4.07) м.д., а также три метиленовые группы при 33.87 (2Н-7, 2.83), 65.15 (2Н-9, 3.70) и 69.45 (2Н-9' 3.29 и 4.06) м.д., две последние судя по величине ХС связаны с атомами кислорода. Сигнал аномерного протона в спектре ЯМР 1Н наблюдали при 4.13 м.д. (Н-Г'', 1=7.7 Гц). Значение его КССВ и величины ХС атомов углерода углеводного остатка в спектре ЯМР 13С соответствовали литературным данным для Р-1)-глюкопиранозида.

Таблица 2

Ш и 2Б ЯМР спектральные данные соединения XV(Stм.Д•« Л/Гц)

Атом "С 'Н СОвУ СОШС (С->Н) ШЕвУ

1 129.13 Н5.2Н7

2 112.35 6.65 (д, 0.7) Н 5, 7, Т Н2.2Н7 Н 7, ОМе-3

3 147.12 Н 5, ОМе-3

4 145.09 Н2

5 117.36 6.18 (д., 0.7) Н 2, 7, Т Н 5 Н2',6',7

6 134.35 Н2.2Н7

7 33.87 2.83 (м) Н 2, 5, 8, Т 2Н7 Н 2, 8,9, 8'

8 39.47 2 03 (м) Н 7, 9, 8' 2Н7 Н7,9,7

9 65.15 3.70 (м) Н 8 Н 7, 8, 8', 9'

1' 138 66 Н 5'

2* 114.27 6.78 (д, 1.9) НГ Н2' Н 5, Т, 8', ОМе-31

Таблица 2 (продолжение)

3" 148.88 Н 5', ОМе-3'

4' 145.78 Н 2', &

5' 116.06 6.73 (д., 8.1) Н6' Н6'

б' 123.11 6 62 (дц, 8.1,1.9) Н 5' НТ Н 5, 5', Г, 8'

Т 47.87 4.07 (м) Н 2, 5, 7, 2', 8' Н 5, 8, 2*, 6', 8'

8' 45.88 1.86 (уш.т, 10.2) Н 8, 7', 9' 2Н7 Н 7, 9,2', 6', 7, 9'

9' 69.45 4.06 и 3.29 (м) Н 8' Н 9, 8', 1"

1" 105.17 4.13 (д., 7.7) Н 2" Н 9'

2" 75.16 3.21 (м) Н 1", 3"

3" 78.08 3.47 (м) Н 2", 4"

4" 71.62 3.30 (м) НЗ", 5"

5" 77.85 3.66 (м) Н 4", 6"

6" 62.72 3.63 и 3.81 (м) Н 5"

ОМе-3' 56.36- 3.80(c) Н2'

ОМе-3 56.45 3.81 (с) СЗ Н 2

На основании 2D ЯМР спектров COSY, NOESY и COLOC (табл. 2) соединение XV отнесли к карбоциклическим лигнанам, тетрагидронафталинового типа. В двухмерном ЯМР корреляционном спектре 13С-'Н COLOC протоны 2Н-7 (2.83 м.д.) имели кросс-пики с атомом углерода С-7 (33.87 м.д.), а также с атомами углерода через две (С-1 129.13, С-8 39.47 м.д.) и три связи (С-2 112.35, С-6 134.35, С-8' 45.88 м.д.) (табл. 2). Полученные данные позволили нам - сделать заключение о том, что циклогексановое кольцо конденсировано с 1, 3,4,6-замещенным бензольным кольцом. Данные спектра COSY (таб. 2) не только не противоречили информации полученной из спектра COLOC, но и подтверждают предложенную тетрагидронафталиновую структуру соединения XV, а также однозначно свидетельствуют о том что, второе бензольное кольцо, имеющее 1', 3', 4'-замещение, присоединяется по 7 положению в циклогексановом кольце. Последний факт подтверждается также спектром NOESY, в котором присутствуют кросс-пики протонов Н-2',6' с протоном Н-7'.

Местоположение заместителей в молекуле соединения XV, а также пространственное расположение заместителей в циклогексановом кольце сделали на основании спектров NOESY (рис. 6, табл. 2) и COLOC (табл. 2). Протоны двух метоксильных групп (3.81 и 3.80 м.д.) в спектре COLOC имели кросс-пики с атомами

углерода С-3 (147.12 м.д,) и С-3' (148.88 м.д.), а в спектре КОЕ8У с протонами Н-2 (6.65 м.д.) и Н-2' (6.78 м.д.), соответственно. Следовательно, метоксильная группа при 3.81 (56.45 м д.) расположена в 3 положении, а при 3 80 (56.36 м.д.) - в 3' положении (табл. 2).

Определенную трудность представляло установление пространственного расположение заместителей в циклогексановом кольце, а также место присоединения остатка р-Б-глюкозы в молекуле. Сложность решения поставленной задачи заключалась в том, что Н-Т и один протон Н-9' агликоновой части, а также аномерный протон глюкозы Н-1", имели очень близкие химические сдвиги и частично перекрывались. Только на основании спектра ЖрС мы смогли выяснить значения химических сдвигов выше указанных протонов, что позволило нам однозначно интерпретировать спектр КОЕ8У. Резонансные сигналы этих трех протонов наблюдали в спектре в следующем порядке: Н-9' (4.06 м.д.), Н-7' (4.07 м.д.), а затем аномерный протон глюкозы Н-1" (4.13 м.д.). В спектре КОЕ8У протоны 2Н-7 (2.83 м.д., ушх) имели кросс-пики с протонами 2Н-9 (3.70 м.д., м). Один из протонов (2Н-7) давал кросс-пик с протоном Н-8' (1.86 м.д.), а другой - с протоном Н-8 (2.03 м д.), но оба не давали кросс-пики с протоном Н-Т (4.07 м.д.). Следовательно, один из протонов Н-7 сближен в пространстве с протоном Н-8', а другой - с протоном Н-8, но оба не располагаются рядом с протоном Н-Т. Характер сигнала в спектре ЯМР 1И протона Н-8' (уш. т., 1=10.2 Гц), а также его пространственное взаимодействие с протонами 2Н-9, 2Н-9' (3.29, 4.06 м.д.), Н-Т и протонами кольца С Н-2' (6.78 м.д.), Н-6' (6.62 м.д.) (рис. 6, табл. 2), свидетельствуют о том, что протоны Н-8' и Н-Т имеют аксиальное положение в циклогексановом кольце. Вопрос о пространственном расположении протона Н-8 решили следующим образом. Так как из данных КОЕ8У спектра следовало, что протон Н-Т находится в аксиальном положении, а наличие у него кросс-пика с протоном Н-8 свидетельствует об их пространственной сближености, следовательно, протон Н-8 также находится в аксиальном положении.

Таким образом, протоны Н-8, Н-8', Н-Т имеют аксиальное, а объемные заместители - экваториальное расположение в

циклогексановом кольце. При рассмотрении моделей Дрейдинга вышеописанные взаимодействия протонов в пространстве реализуются в случае, если циклогексановое кольцо В имеет конформацию полукресла (рис. 6).

Рис. 6. Наблюдаемые ЯЭО в NOESY спектре соединения XV (R,=p-D-GlCp, R2=C6H3 (ОН)ОСНз)

Расположение остатка p-D-глюкопиранозы в соединении XV также выяснили из NOESY спектра. Аномерный протон глюкозы Н-1" (4.13 м.д.) давал кросс-пики с протонами 2Н-9' (3.29, 4.06 м.д.), следовательно, глюкоза присоединяется по 9' положению в молекуле (рис. 6, табл. 2). Рассмотренные расположения заместителей в циклогексановом кольце возможны для двух оптических изомеров. Действительно, в литературе описаны оба этих изомера: (+)-изоларицирезинол-9'-0-Р-0-глюкопиранозид и (-)-изоларицирезинол- -глюкопиранозид.

Физико-химические константы выделенного нами соединения XV (Тпл137-138°С, aD +61.5°) соответствуют таковым для (+)-изоларицирезинол-9'-О-(3-О-глюкопиранозида (Тпл 137-138°С, do +46.1°). Сравнение спектра ЯМР 13С выделенного нами соединения XV с литературными данными для обоих изомеров подтвердило, что оно является (+)-изомером. Таким образом, соединение XV идентифицировали как 9'-0-Р-В-глюкопиранозид 4,9,4',9'-тетрагидрокси-3,3'-диметокси-р8,а8',р7'-циклолигнана [(+)-изоларицирезинол-9'-0-Р-Г)-

глюкопиранозид].

Из всего многообразия растительного мира циклолигнан тетрагидронафталиного типа - изоларицирезинол, и его гликозиды наиболее характерны для класса хвойных растений, хотя в настоящее время появляются сообщения о их выделении из древесных растений класса двудольных, в частности изоларицирезинол-9'-0-Р-0-глюкопиранозида из коры дерева Slemmadenia minima. В надземной части травянистых растений этот гликозид изоларицирезинола обнаружен

в Sauropus androgynus и нами в Н. setigerum, которые также относятся к классу двудольных. Ранее соединения класса лигнанов из растений рода Hedysarum не выделялись.

4. Гидроксибензойные кислоты

Из бутанольной фракции водно-метанольного экстракта Я. setigerum в результате многократной колоночной хроматографии на силикагеле и сефадексе G-10 выделили два соединения XXI и XXII, имеющие вид белых игольчатых кристаллов. По данным ИК-, ЯМР 1Н и 13С спектроскопии их идентифицировали как п-гидроксибензойную (XXI) и протокатеховую (XXII) кислоты.

5. Идентификация берберина

В процессе хроматографического деления бутанольной фракции на полиамидном сорбенте получили фракции, содержащие вещество XIII. В результате колоночной хроматографии на силикагеле из них выделили ярко-желтое кристаллическое соединение XIII, которое хорошо растворимо как в малополярных (хлороформ), так и в полярных растворителях (ацетон, вода, метанол). Интенсивный желтый цвет соединения и полосы поглощения в видимой области

спектра предполагают наличие в его структуре системы сопряженных двойных связей. В HR-EI спектре этого соединения наблюдали пик молекулярного иона m/z 337.1240, который соответствует брутто-формуле CzoHjsNO^ а нечетное число молекулярной массы предполагает наличие атома азота в структуре соединения X11I.

Из спектров ЯМР 13С и APT выяснили, что в молекуле этого соединения содержится 20 атомов углерода (табл. 3). Два атома углерода при 57.14 и 61.99 м.д. принадлежали метоксильным группам, а три атома углерода при 26.38 (С-5), 55.26 (С-6) и 102.12 м.д. входили в состав метиленовых групп, последняя из которых, исходя из величины ХС, является диоксиметиленовой. На присутствие этой группы указывает осколочный ион при m/z 45 (100) в EI масс-спектре. Остальные 15 атомов углерода по значениям их ХС отнесли к атомам углерода конденсированных ароматических систем (полосы поглощения в ИК-спектре 1634, 1601, 1568, 1505, 1479, 1458 см-1). Так как из них девять атомов углерода четвертичные, а шесть -третичные, следует предположить что, в структуре соединения XIII присутствуют три конденсированных ароматических кольца. В спектре ЯМР 1Н сигналы двух ароматических протонов наблюдали при 8.02 (Н-12) и 8.16 (Н-11) м.д. в виде

дублетов с КССВ в 8 Гц, а два протона при 7.07 (Н-4) и 7.78 (Н-1) м.д. проявлялись в виде синглетов (табл. 3). Два слабопольных синглета (8.94 (Н-13) и 9.88 (Н-8) м.д.) отнесли к протонам азотсодержащей гетероциклической ароматической системы.

Таблица 3

Ш и 2Б ЯМР спектральные данные соединения XIII (6, мл., Л/Гц)

Атом "С APT 'н COSY TOCSY НМВС (Н-+С)

1 105.50 СН 7.78 (с) Н 13 Н 4,13 С-2, 3,4а, 14

2 147.72

3 149.85

4 108.47 СН 7.07(c) Н 5 Н 1, 5, 6 С-2, 3, 5,14а

4а 130.72

5 26.38 СН2 3.19 (уш.с) Н 4, 6 Н 4,6, 8 С-4а

6 55.26 СН2 4.93 (уш.с) Н 5, 8 Н4, 5,8 С-4а

8 145.48 СН 9.88 (с) Н6, 12, 13 Н 5, 6, ОМе-9, 11,12,13 С А 8а, 9,12а, 14

8а 121.46

9 143.72

10 150.44

И 126.79 СН 8.16 (д., 8.0) ОМе-Ю, Н 12 Н8, ОМе-Ю, 12 С-9,10,12а

12 123.62 СН 8.02 (д.,8.0) Н 8, 11 Н 8, ОМе-Ю, 11 С-8а, 10,13

12а 133.05

13 120.25 СН 8.94(c) HI, 8 HI, 8 С-8а, 12,14,14а

14 137.51

14а 120.48

O-CHj-O 102.12 СН2 6.16(c) С-2, 3

ОМе-9 61.99 СН3 4.09 (с) НИ НИ, 12 С-9

ОМе-Ю 57.14 СНз 4 06(c) Н8 С-10

Дальнейшее выяснение структуры углеродного скелета молекулы и расположение функциональных групп сделали с применением 2D ЯМР спектроскопии.

Из спектров ЯМР Н-Н (COSY, TOCSY) установили последовательность взаимодействия протонов между собой (8, м.д.):

4 06(С>Ме-10)

8.16 (Н-11^ -1)

5

4.09 (ОМе-9) 3.19(Н-5)«*7.07(Н-4)

Совокупность вышеприведенных данных, а также принимая во внимание данные спектра ЯМР 'Н-13С (НМВС, табл. 3), позволили нам сделать вывод о том, что соединение XIII является алкалоидом протоберберинового типа.

Местоположение заместителей в молекуле - двух метоксильных и одной диоксиметиленовой групп определили с помощью спектра ЯМР НМВС (табл. 3) и гомоядерного эффекта Оверхаузера (NOESY, табл. 3, рис. 7). Наличие кросс-пиков протонов диоксиметиленовой группы в НМВС спектре с атомами углерода С-2 (147.72 м.д.) и С-3 (149.85 м.д.) свидетельствует о ее расположении в кольце А при этих атомах углерода. Протоны метоксильных групп (4.09 и 4.06 м.д) имели кросс-пики с атомами углерода С-9 (143.72 м.д.) и С-10 (150.44 м.д.) в НМВС спектре, а в NOESY спектре - с протонами Н-8 (9.88 м.д.) и Н-11 (8.16 м.д.), Н-12 (8.02 м.д.), соответственно. Следовательно, обе метоксильные группы расположены в кольце D: первая в положении 9, а вторая в положении 10. Исходя из вышеприведенных данных, соединение XIII идентифицировали как 5,6-дигидро-9,10-диметокси-бензоИ-2,3-бензодиоксоло[5,6а]хинолизиниум(берберин).

Рис. 7. Наблюдаемые ЯЭО в NOESY спектре соединения XIII

6. Качественный и количественный состав стеринов Н. setigerum

Из хлороформного экстракта методом флеш-хроматографии выделили фракцию стеринов (0.09 % от веса сухого сырья). Методом ГЖХ-МС во фракции в

виде ацетатных производных идентифицировали: Р-ситостерин (69.2 %), стигмастерин (14.1 %), кампестерин (11.7 %), стигмастанол (4.2 %). 7. Биологическая активность вторичных метаболитов Я. setigerum

Химическое исследования копеечника щетинистого было предпринято в связи с тем, что имелись сведения о применении его в современной практической народной медицине для лечения тяжелых, считающихся трудноизлечимыми, инфекций хламидиоза и вирусного гепатита С. В настоящее время борьба с этими инфекциями малоуспешна и требует больших (десятки тысяч рублей) затрат со стороны больного на приобретение лекарств. Решение проблемы создания эффективных лечебных препаратов — одна из важнейших задач химико-фармацевтической науки.

В результате литературного поиска установили, что 7 из 12, идентифицированных нами в копеечнике щетинистом, флавоноидов проявляют противовирусную активность (кверцетин, изорамнетин, 3-метоксикемпферол, кверцитрин, рутин, линарин, диосмин), причем рутинозидный остаток защищает клетку от инвазии вируса. Водные растворы хлорида берберина обладают непрямыми антихламидийными свойствами, подавляя развитие хламидий иммуностимуляцией организма.

Полученные данные дают нам основание полагать, что на основе идентифицированных в составе надземной части копеечника щетинистого представителей разных классов соединений мы в дальнейшем можем создать эффективный препарат для борьбы с вирусными инфекциями.

Выводы

1. Впервые изучен химический состав надземной части копеечника щетинистого (Hedysarum setigerum Turcz. ex Fisch. Et Meyer). Хроматографическими методами (аналитическая и препаративная хроматография на силикагеле, полиамиде, сервацеле, сефадексах) выделено и идентифицировано шестнадцать индивидуальных соединений: из них двенадцать флавоноидов, один лигнан, один алкалоид и две фенолокислоты. Идентификация всех соединений проведена химическими (получение производных) и спектральными методами: ID и 2D ЯМР спектроскопией, масс-спектрометрией высокого (HR-EI и HR-FAB) и низкого (EI, FAB, MALDI) разрешения, а также ИК- и УФ-спектроскопией.

Четыре стерина идентифицированы методами ГЖХ и хромато-масс-спектрометрией их ацетатных производных.

2.Установлено, что флавоноидный состав копеечника щетинистого представлен гидроксилированными и метоксилированными агликонами флавонолов и их гликозидами. В изученном виде растения идентифицированы 3,5,7,3',4' -пентагидроксифлавон (кверцетин), З-О-а-Ь-арабинофуранозид 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавона (авикулярин), З-О-а-Ь-рамнопиранозид 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавона (кверцитрин), -рамнопиранозил-глюкопиранозид 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавона (рутин) ранее обнаруженные в других видах рода Нвйу8агыт,

3.Из растений рода Hedysarum впервые выделены и идентифицированы следующие флавоноиды: 5,7,4-тригидрокси-З-метоксифлавон (3-метоксикемпферол), 3,5,7,4'-тетрагидрокси-З'-метоксифлавон (изорамнетин); З-О-а-Ь-арабинофуранозид З,5,7,4'-тетрагидроксифлавона (кемпферол-3-О-арабинофуранозид), 7-О-а-Ь-рамнопиранозил-(1 —>2)-Р-0-глюкопиранозид 5,7,4'-тригидроксифлавона (роифолин), 7-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1—>2)-Р-0-глюкопиранозид 5,7,3',4'-тетрагидроксифлавона (лоницерозид); 7-0-а-Ь-рамнопиранозил-( I —>6)-Р-Е)-глюкопиранозид 5,7-дигидрокси-4'-метоксифлавона (линарин), 7-О-а-Ь-рамнопиранозил-(1—>6)-Р-0-глюкопиранозид 5,7,3'-тригидрокси-4'-метоксифлавона (диосмин), и -рамнопиранозил-рамнопиранозил-(1—>2)]-Р-0-глюкопиранозид 5,7-дигидрокси-4'-метоксифлавона (необудоффицид). Выделение необудоффицида из изучаемого растения является вторым примером обнаружения этого соединения в природе.

4. Из растений рода Hedysarum впервые препаративно выделены представители класса алкалоидов и лигнанов. Идентифицирован алкалоид протоберберинового типа - 5,6-дигидро-9,10-диметокси-бензо[^]-2,3-бензодиоксоло[5,6а]хинолизиниум (берберин). Обнаружен карбоциклический лигнан, тетрагидронафталинового типа -9-О-Р-О-глюкопиранозид 4,9,4',9'-тетрагидрокси-3,3 -диметокси-р8,а8',р7-циклолигнана [(+)-изоларицирезинол-9'-0-Р-0 -глюкопиранозид].

5. Выделены и идентифицированы п-гидроксибензойная и протокатеховая кислоты. Изучен качественный и количественный состав стериновой фракции растения.

Идентифицированы стигмастерин, ß-ситостерин, кампестерин и стигмастанол. Кампестерин и стигмастанол обнаружены в растениях этого рода впервые.

6. Изучены FAB+ и MALDI+ масс-спектры выделенных агликонов и гликозидов флавоноидов. Показано, что отсутствие интенсивного иона, характерного для отрыва внутреннего углеводного остатка (ион Y*) в FАВ+-масс-спектрах гликозидов флавоноидов, позволяет провести отнесение агликона к группам» флавонов или флавонолов. Методом ЯМР подтверждено, что наличие или отсутствие в FАВ+-масс-спектрах осколочных ионов, соответствующих отрыву терминального углеводного остатка вместе с гликозидным атомом кислорода или без него (ионы Zt и Yt), позволяет определить порядок связи 1-6 или 1-2 в биозидах флавоноидов.

7. Выявлены компоненты растения, обусловливающие противовирусное действие копеечника щетинистого, на основе которых планируется создание средства для борьбы с вирусными инфекциями.

Основные публикации по теме диссертации

1. Неретина О.В., Громова А.С., Луцкий В.И. Исследование химического состава-копеечника щетинистого (Hedysarum setigerum) - перспективного лекарственного растения, обладающего противовирусными свойствами // Интеграция фундаментальной науки и высшей школы в устойчивом развитии Сибири: Материалы докладов конф. молодых ученых Иркутского научного центра СО РАН и вузов Иркутска. - Иркутск, 2001. - С. 81-84.

2. Неретина О.В., Федоров СВ., Громова А.С., Луцкий В.И., Елькин Ю.Н. Флавоноиды Hedysarum setigerum IIХимия природа, соедин. - 2002. - № 2. - С. 161. [Chem.Nat.Compd. - 2002. - 38. - № 2. - Р. 194-195 (EngLTransl.)]

3. Неретина О.В., Громова А.С., Луцкий В.И., Семенов А.А. Гликозиды метоксилированных флавонов надземной части Hedysarum setigerum < Turcz. Ex Fisch EtMeyllРастит, ресурсы. - 2002. - вып. 1. - С. 82-85.

4. Неретина О.В., Громова А.С., Луцкий В.И. Исследование химического состава копеечника щетинистого {Hedysarum setigerum) II Химия и технология растительных веществ: Материалы П Всероссийской конференции. - Казань, 2002. -С. 62.

5. Неретина О.В., Громова А.С., Луцкий В.И., Семенов А.А., Ушаков И.А., Макарьева Т.Н. Вторичные метаболиты Hedysarum sehgerum II Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений: Материалы международной научной конференции. - Алматы, Казахстан, 2003. - С. 169.

6. Neretina O.V., Gromova A.S., Lutsky V.L, Semenov A.A., Ushakov I.A., Makar'eva T.N., Noel L. Owen Secondary metabolites from Hedysarum sehgerum II Chem.Nat.Compd. - 2004. - 40. - №1. - P.91-92.

Формат 60x84 1/16. Бумага типографская. Печать офсетная. Усл. печ. л. /,0 Уч.-изд.л. Тираж -/00 экз. Зак.27?

ИД №06506 от 26.12.2001 Иркутский государственный технический университет 664074, Иркутск, ул. Лермонтова, 83

NÉ -98 90

Введение.

Глава 1. Химический состав растений рода Hedysarum (Литературный обзор)

1.1. Алифатические соединения

1.1.1. Углеводороды и производные циклогексана.

1.1.2. Спирты, кислоты и их производные.

1.2. Изопреноиды

1.2.1. Бициклические монотерпеноиды и сесквитерпеноиды.

1.2.2. Пентациклические тритерпеноиды.

1.2.3. Тритерпеновые гликозиды (сапонины).

1.2.4. Стерины.

1.3. Ароматические соединения

1.3.1. Фенолокислоты.

1.3.2. Аллильные фенилпропаноиды и другие производные бензола.

1.3.3. Халконы.

1.3.4. Бензофураны.

1.3.5. Ксантоны.

1.3.6. Кумарины.

1.3.7. Флавоноиды.

1.3.8. Изофлавоноиды.

1.3.9. Птерокарпаны.

1.3.10. Кумэстаны.

1.3.11. Антоцианидины и антоцианины.

1.4. Алкалоиды и другие азотсодержащие соединения.

1.5. Прочие продукты вторичного метаболизма.

1.5.1. Моносахариды, дисахариды и полисахариды.

1.5.2. Свободные аминокислоты и аминокислоты белка.

1.5.3. Витамины.

1.5.4. Неорганические элементы.

1.5.5. Другие продукты вторичного метаболизма.

1.6. Некоторые вопросы хемотаксономии рода Hedysarum.

1.7. Биологическая активность соединений растений рода Hedysarum.

1.8. Применение современных "мягких" ионизационных методов массспектрометрии в установлении строения флавоноидов.

Глава 2. Химический состав экстрактивных веществ из надземной части копеечника щетинистого Hedysarum setigerum Turcz. ex Fisch. Et Meyer (Обсуяадение результатов).

2.1. Флавоноиды Н. setigerum.

2.1.1. Флавонолы.

2.1.2. Флавоны.

2.2. Изучение флавоноидов, выделенных из Я. setigerum, методами FAB-. и MALDI масс-спектрометрии.

2.3. Идентификация берберина.

2.4. Идентификация 9'-0-р-0-глюкопиранозид 4,9,4',9'-тетрагидрокси-3,3'-диметокси-Р8,а8',р7'-циклолигнана.

2.5. Стерины Н. setigerum.

2.6. Идентификация гидроксибензойных кислот.

2.7. Возможные пути биосинтеза некоторых фенольных соединений в растениях рода Hedysarum.

2.8. Биологическая активность вторичных метаболитов Н. setigerum.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1 Методы исследования.

3.2. Хроматографические методы.

3.3. Экстракция Hedysarum setigerum и первичное разделение экстракта.

3.4. Выделение агликонов и гликозидов флавоноидов.

3.4.1. Кверцетин, кверцитрин.

3.4.2. Изорамнетин.

3.4.3. З-Метоксикемпферол, кемпферол-З-О-а-Ь-арабинофуранозид, авикулярин.

3.4.4. Необудоффицид, роифолин, лоницерозид, рутин.

3.4.5. Линарин, диосмин.

3.5 Выделение гидроксибензойных кислот.

3.6 Выделение берберина.

3.6.1. Получение йодида берберина.

3.7 Выделение 9'-0-Р-0-глюкопиранозид 4,9,4',9'-тетрагидрокси-3,3'диметокси-Р8,а8',Р7'-циклолигнана.

3.8. Выделение фракции стеринов.

3.8.1. Ацетилирование стеринов.

Выводы.

Химии принадлежит ведущая роль в деле создания новых лекарств. В последнее десятилетие, несмотря на огромное количество синтетических фармацевтических средств, неуклонно возрастает интерес к привлечению химии природных соединений для создания лекарственных препаратов на основе растительного сырья, обладающих эффективным действием.

Одна из наиболее актуальных и нерешенных проблем - лечение внутриклеточных инфекций. В настоящее время, практически нет надежных способов борьбы с хламидиозом и такими вирусными инфекциями, как гепатит С. Тем не менее, в народной медицине накоплен значительный положительный опыт борьбы с заболеваниями вирусной природы с использованием лекарственных растений, в частности, растений из рода Hedysarum (копеечник) [1-3].

Работами Куваева В.Б. и др. [4] и Смирновой Л.П. и др. [5] показано, что противовирусное действие копеечников секции Obscura обуславливает гликозилированный ксантон - мангиферин.

Виды растений рода Hedysarum других секций (Fruticosa В. Fedtsch, Spinosissima В. Fedtsch., Multicaulia Boiss, Crinifera Boiss., Subacaulia Boiss) no литературным данным не содержат мангиферин, но также обладают противовирусным действием. Поэтому актуальной задачей является изучение химического состава копеечников вышеперечисленных секций. Эти исследования позволят выделить и установить структуры вторичных метаболитов, которые определяют противовирусное действие копеечников, а также могут служить хемотаксономическими маркерами внутри секций.

В качестве объекта исследования был выбран ранее неизученный вид Н. setigerum Turcz. ex Fischer et Meyer (копеечник щетинистый), принадлежащий к малоисследованной секции Multicaulia Boiss. Этот вид имеет достаточно широкие ареалы обитания в Западной, Средней и Восточной Сибири.

Выделение индивидуальных соединений из экстракта надземной части Я. setigerum осуществляли методами препаративной хроматографии на различных сорбентах. Изучение их строения проводили спектральными методами с привлечением ID и 2D ЯМР спектроскопии, в ряде случаев с использованием необходимых химических превращений.

Для определения молекулярной формулы выделенных соединений использовали метод масс-спектрометрии высокого разрешения (HR-MC), а для изучения фрагментации труднолетучих гликозидов современные «мягкие» (soft) методы ионизации - FAB и MALDI масс-спектрометрии. Учитывая, с одной стороны, новизну интерпретации этими методами фрагментации агликоновой части гликозидов, и, с другой стороны, значительное число выделенных нами соединений -интересной задачей явилось изучение особенностей масс-спектрального распада гликозидов флавоноидов. Таким образом, целью нашей работы явилось:

- исследование химического состава и установление физико-химическими и спектральными методами структуры соединений, выделенных из надземной части копеечника щетинистого;

- изучение закономерностей фрагментации, выделенных гликозидов флавоноидов, «мягкими» методами масс-спектрометрии (FAB и MALDI); выявление биологически активных веществ обуславливающих противовирусное действие копеечника щетинистого.

В результате проведенных исследований нами в надземной части Н. setigerum идентифицировано 20 соединений. Доминирующими компонентами являются флавоноиды и их гликозиды, стерины и фенолокислоты. Несмотря на большое число химически изученных ранее видов копеечника (более 40 видов), нами впервые обнаружены в роде Hedysarum восемь флавоноидов и два стерина. Интересно отметить, что выделенный тригликозид метоксифлавона (необудоффицид) является вторым примером нахождения этого соединения в природе.

Об обнаружении в растениях рода Hedysarum алкалоидов и лигнанов ранее в научной литературе не сообщалось. Нам удалось препаративно выделить и идентифицировать алкалоид протоберберинового и лигнан тетрагидронафталинового типов.

В ходе масс-спектрометрического анализа гликозидов флавоноидов «мягкими» методами масс-спектрометрии исследованы некоторые закономерности их фрагментации.

В рамках биогенеза растений рода Нейувагит рассмотрены пути биосинтеза некоторых фенольных соединений растений этого рода. На основании полученных результатов предложены группы соединений, в частности флавоны, ранее не выделенные из этого рода, но ожидаемые по рассмотренным путям биосинтеза. Нами найдены представители этой группы соединений, ранее не обнаруженные ни в одном из растений рода Нес1у$агит.

Диссертация состоит из трех глав: литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части.

Литературный обзор посвящен химическому составу растений рода НеЛузагит и охватывает литературу вплоть до 2004 года. Кроме того, в него включены вопросы хемотаксономии рассматриваемого рода и раздел по применению «мягких» ионизационных методов масс-спектрометрии в установлении строения флавоноидов. В приложении приведена таблица по распределению вторичных метаболитов в растениях рода Нес1у8агит.

129 Выводы

1. Впервые изучен химический состав надземной части копеечника щетинистого {Hedysarum setigerum Turcz. ex Fisch. Et Meyer). Хроматографическими методами (аналитическая и препаративная хроматография на силикагеле, полиамиде, сервацеле, сефадексах) выделено и идентифицировано шестнадцать индивидуальных соединений: из них двенадцать флавоноидов, один лигнан, один алкалоид и две фенолокислоты. Идентификация всех соединений проведена химическими (получение производных) и спектральными методами: 1D и 2D ЯМР спектроскопией, масс-спектрометрией высокого (HR-EI и HR-FAB) и низкого (El, FAB, MALDI) разрешения, а также ИК- и УФ-спектроскопией.

Четыре стерина идентифицированы методами ГЖХ и хромато-масс-спектрометрией их ацетатных производных.

2.Установлено, что флавоноидный состав копеечника щетинистого представлен гидроксилированными и метоксилированными агликонами флавонолов и их гликозидами. В изученном виде растения идентифицированы 3,5,7,3',4' -пентагидроксифлавон (кверцетин), З-О-а-Ь-арабинофуранозид 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавона (авикулярин), 3 -O-a-L-рамнопиранозид 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавона (кверцитрин), 3-0-а-Ь-рамнопиранозил-( 1 —>6)-ß-D-глюкопиранозид 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавона (рутин) ранее обнаруженные в других видах рода Hedysarum.

3.Из растений рода Hedysarum впервые выделены и идентифицированы следующие флавоноиды: 5,7,4'-тригидрокси-3-метоксифлавон (3-метоксикемпферол), 3,5,7,4'-тетрагидрокси-З'-метоксифлавон (изорамнетин); З-О-а-Ь-арабинофуранозид 3,5,7,4'-тетрагидроксифлавона (кемпферол-З-О-арабинофуранозид), 7-O-a-L-рамнопиранозил-(1->2)-р-0-глюкопиранозид 5,7,4'-тригидроксифлавона (роифолин), 7-0-а-Ь-рамнопиранозил-( 1 ->2)-Р-0-глюкопиранозид 5,7,3 ',4'-тетрагидроксифлавона (лоницерозид); 7-0-а-Ь-рамнопиранозил-( 1 —>6)-ß-D-глюкопиранозид 5,7-дигидрокси-4'-метоксифлавона (линарин), 7-O-a-L-рамнопиранозил-( 1 ->6)-р-0-глюкопиранозид 5,7,3'-тригидрокси-4'-метоксифлавона (диосмин), и 7-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1->6)-[а-Ь-рамнопиранозил-(1-»2)]-Р-0-глюкопиранозид 5,7-дигидрокси-4'-метоксифлавона необудоффицид). Выделение необудоффицида из изучаемого растения является вторым примером обнаружения этого соединения в природе.

4. Из растения рода Неёузагит впервые препаративно выделены представители класса алкалоидов и лигнанов. Идентифицирован алкалоид протоберберинового типа - 5,6-дигидро-9,10-диметокси-бензо|^]-2,3-бензодиоксоло[5,6а]хинолизиниум (берберин). Обнаружен карбоциклический лигнан, тетрагидронафталинового типа -9-0- Р-Э-глюкопиранозид 4,9,4',9-тетрагидрокси-3,3'-диметокси- Р 8,а8', Р71-циклолигнана [(+)-изоларицирезинол-9'-0-Р-0-глюкопиранозид].

5. Выделены и идентифицированы п-гидроксибензойная и протокатеховая кислоты. Изучен качественный и количественный состав стериновой фракции растения. Идентифицированы стигмастерин, Р-ситостерин, кампестерин, и стигмастанол. Кампестерин и стигмастанол обнаружены в растениях этого рода впервые.

6. Изучены РАВ+ и МАЬ01+ масс-спектры выделенных агликонов и гликозидов флавоноидов. Показано, что отсутствие интенсивного иона, характерного для отрыва внутреннего углеводного остатка (ион У*) в ЕАВ+-масс-спектрах гликозидов флавоноидов, позволяет провести отнесение агликона к группам флавонов или флавонолов. Методом ЯМР подтверждено, что наличие или отсутствие в РАВ+-масс-спектрах осколочных ионов, соответствующих отрыву терминального углеводного остатка вместе с гликозидным атомом кислорода или без него (ионы Ъ\ и У]), позволяет определить порядок связи 1-6 или 1-2 в биозидах флавоноидов.

7. Выявлены компоненты растения, обусловливающие противовирусное действие копеечника щетинистого, на основе которых планируется создание средства для борьбы с вирусными инфекциями.

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность своим научным руководителям в.н.с., к.х.н. Луцкому Владиславу Илларионовичу, д.х.н. Семенову Аркадию Алексеевичу, являющимися соавторами всех работ, за неоценимую помощь и поддержку, при выполнении данной работы.

Также автор выражает глубокую признательность с.н.с., к.х.н. лаборатории химии и технологии новых лекарств ИрГТУ Громовой Александре Степановне, за помощь в работе, совместные дискуссии и обсуждение полученных результатов, внимание и поддержку.

Автор выражает признательность сотруднику лаборатории физических методов исследования ИрИХ СО РАН Федорову Сергею Викторовичу, и бывшему сотруднику этой лаборатории Зинченко Сергею Викторовичу, а также сотруднику Ушакову Игорю Алексеевичу за съемку ЯМР-спектров. Торяшиновой Тамаре Доржиевне, с.н.с. лаборатории физических методов исследования ИрИХ СО РАН, за съемку ИК- и УФ- спектров. Сотрудникам Тихоокеанского института биоорганической химии СО РАН, с.н.с., к.ф.-м.н. Глазунову Виктору Петровичу., с.н.с. Моисеенко Ольге Петровне, к.х.н. Денисенко Владимиру Анатольевичу, к.х.н. Дмитренок Павлу Сергеевичу, Полянскому Владимиру Андреевичу, к.х.н. Елькину Юрию Николаевичу за регистрацию ИК-, УФ-, масс- и ЯМР-спектров. Доктору Noel L. Owen, департамента химии BYU, за помощь в съемке FAB масс-спектров. Сотруднику Тихоокеанского института биоорганической химии СО РАН д.х.н. Макарьевой Татьяне Николаевне за помощь в работе со стеринами.

1. Гаммермаи А.Ф., Кадаев Г.Н., Яцеико-Хмелевский А.А. Лекарственные растения. -М.: Высшая школа. 1990. - С. 542.

2. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири. Новосибирск: Наука. - 1991. - С. 428.

3. Телятьев В.В. Полезные растения центральной Сибири. Иркутск. - 1985. - С. 118.

4. Куваев В.Б., Глызин, В.И., Глызина Г.С., Баньковский А.И. Перспективы поисков мангиферина в отечественной флоре. // Растит, ресурсы. 1972. - Вып. 3. - С. 367371.

5. Смирнова Л.П., Шейченко В.И., Тохтабаева Г.М. Изучение химического состава алпизарина из листьев манго. // Хим.-фарм. журнал. 2000. - Т. 34. - № 2. - С. 2225.

6. Флора Сибири Fabaceae (Leguminosae). Под ред. Положия А.В., Малышевой Л.И. -Новосибирск.: Наука. 1994. - Т.9. - С. 280.

7. Положий А.В. Флора Красноярского края. Бобовые Papilionaceae. Томск.: Изд-во Томского университета - 1960. - Вып. VI. - С. 93.

8. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. В 3 т. Л.:Наука. - 1987. - Т. 3 - С. 328.

9. Chriki АН, Harborne Leffrey В. Anthocyanins of Hedysarum coronarium and their contribution to flower colour variation. // Phytochemistry. 1983. - V. 22. - n. 10. - P. 2322-2323.

10. Soltani A., Briens M., Goas M. Carbohydrate metabolism of Hedysarum coronarium L. cultivated in the presence of sodium chloride. // C. R. Seances Acad. Sci. 1981. - Ser. 3. - V. 293. - n.5. - P. 297-300. // C.A. 1982, 96:49054s.

11. Soltani A., Bernard T. Nitrogen metabolism of Hedysarum coronarium L. growing in the presence of sodium chloride. // C. R. Seances Acad. Sci. 1978. - Ser. D. - V. 287. -П.12.-Р. 1123-1126. // C.A. 1979, 90:100182n.

12. Soltani A., Bernard T. Nitrogen metabolism of Hedysarum carnosum desfontaines, growing in the presence of sodium chloride. // C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. 1977. -Ser. D.-V. 284.-П.З.-Р. 175-178.//C.A. 1977, 86:117835t.

13. Maymone В., Bergonzini E. Essential amino acids content and biological value of proteins of some forage plants of Southern Italy Aliment. // Animale. 1964. - V. 8. -n.l.-P. 9-28. // С .A. 1965, 62:16685b.

14. Lotti G. Analytical characteristics of Leguminosae seed oils. // Ric. Sci., Rend. 1964. -Sez. В. - V. 4. - n.4. - P. 503-510. // C.A. 1965, 62:1852f.

15. Johnston A., Bezeau L.M. Chemical composition of range forage plants of the Festuca scabrella association. // Can. J. Plant Sci. 1962. - n.42. - P. 105-115. // C.A. 1962, 56:15905d.

16. Lin H.-H., Chang H.-L., Hou H.-Y. Chemical composition of oxylophilous, calciphilous and halophilous plants. // T'u Jang Hsueh Pao. 1957. - n.5. - P. 247-270. // C.A. 1959, 53:1241 li.

17. Fratteggiani-Bianchi R. Meaning and practical importance of the lignin determination in feedingstuffs. // Atti Soc. Ital. Sci. Vet. 1957. - n.ll. - P. 396-400. // C.A. 1958, 52:18955f.

18. Plouvier V. A new cyclitol, L-pinotol, isolated from Artemisia dracunculus. // Compt. Rend. 1956. - V. 243. - P. 1913-1915. // C.A. 1957, 52:5909c.

19. Hikino H. Constituents and physiological action of Astragalus and Hedysarum II Gendai Toyo Igaku. 1982. - V. 3. - n.2. - P. 46-50.

20. Комиссаренко A.H., Надежина Т.П., Комиссаренко Н.Ф. Флавоноиды и ксантоны Hedysarum connatum и Н. alpinum. II Химия природн. соедин. 1994. - № 4. - С. 564-565.//С.А. 1995,122:251377f.

21. Шаин С.С., Климакин Г.И., Кузнецова Г.К., Романенко В.И., Романов Ю.С., Ярош Е.А., Шемерянкина Т.Б., Вандушев В.В. Увеличение содержания мангиферина в Hedysarum alpinum II Изобретения. 1996. - № 13. - С. 131. // С.А. 1996, 124:Р 33902 In.

22. Агафонова О.В., Володарская С.Б. Продуктивность и содержание олигомерных катехинов у Hedysarum theinum Krasnob. в центральном и юго-западном Алтае. // Растит, ресурсы. 2000. - Вып. 4. - С. 47-52.

23. Хамидуллина Е.А., Зинченко С.В., Семенов А.А. Качественный состав сапониновой фракции из надземной части Hedysarum alpinum L. // Растит, ресурсы. -2002.-Вып. 1.-С. 78-82.

24. Xianglin Y., Yukui Z., Hanfa Z. Study on identification of traditional Chinese medicine-Radix Astragali by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry. // Yaowu Fenxi Zazhi. 2001. - V. 21. - n. 1. - P. 7-10.

25. Ma X.Q., Duan J.A., Zhu D.Y., Dong T.X., Tsim K.W.K. Chemical comparison of Astragali radix (Huangqi) from different regions of China. // Nat. Med.- 2000. V.54. -n.5. - P. 213-218. IIC.A. 2001, 134:227463.

26. Xing G., Hao J., Wang L. Relation of free amino acids and astragalin-I in callus of Hedysarum polybotrys Hand-Mass. // Lanzhou Daxue Xuebao, Ziran Kexueban. 1999. - V. 35. - n.4. - P. 90-93. // С .A. 2000, 133:56055.

27. Wang Y., Hou J., Zhang C., Ni G., Gao J. Spectrophotometric determination of trace selenium in Hedysarum polybotrys by catalytic kinetics. // Xibei Shifan Daxue Xuebao, Ziran Kexueban. 1999. - V. 35. - n.2. - P. 44-46. // C.A. 1999, 130:357268f.

28. Liu F., Li Z., Meng Y., Chen Y. Purification and structure of polysaccharide RHG from Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz. // Yaoxue Xuebao. 1997. - V. 32. - n.8. - P. 603-606.//C.A. 1998, 129:51122f.

29. Mizutani Т., Tanabe K., Watanabe K., Goto M. Selenium contents in Astragalus and uncultivated soils in Japan. // Jpn. J. Toxicol. Environ. Health. 1996. - V. 42. - n.4. - P. 360-366.//C.A. 1996, 124:327352h.

30. Zhou L., Hu G. Determination of y-aminobutyric acid in manyinflorescenced sweetvetch (.Hedysarum polybotrys) and its granular preparation. // Zhongcaoyao. 1995. - V. 26. -n.10.-P. 518-521.//C.A. 1996, 124:127257y.

31. Zhao C., Li G., Wang J. TLC-densitometric determination of hypotensive constituent y-aminobutyric acid in Hongqi. // Xibei Daxue Xuebao, Ziran Kexueban. 1995. - V. 25. -п.З.-Р. 277-278. // C.A. 1995, 124:66745g.

32. Anetai M., Katsura E., Katoh Y., Yamagishi T. Chemical evaluation of Astragali Radix. // Nat. Med. 1994. - V. 48. - n.4. - P. 244-252. // C.A. 1994, 120:56357f.

33. Tanner G.J., Moore A.E., Larkin P.J. Proanthocyanidins inhibit hydrolysis of leaf proteins by rumen microflora in vitro. // Br. J. Nutr. 1994. - V. 71. - n.6. - P. 947-958. //СЛ. 1994, 120:56357f.

34. Yang Z., Liu J., Wang F., Cui S., Le C. Chemical constituents of Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz. // Zhongguo Zhongyao Zazhi. 1992. - V. 17. - n.l0. - P. 615-616. II C.A. 1993,118:56211s.

35. Duan Z., Sun L., Zheng H., Yin W. Determination of inorganic elements and amino acids in the roots of Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz. // Lanzhou Daxue Xuebao, Ziran Kexueban. 1990. - V. 26. - n.2. - P. 79-82. // C.A. 1993, 118:19272s.

36. Saura-Calixto F. Carbohydrates and other major constituents in Spanish sainfoin {Hedysarum coronarium L.). // Agrochimica. 1989. - V. 33. - n.4-5. - P. 238-247. II C.A. 1990, 112:210453c.

37. Wang B., Pang Z., Yang Y. Determination of microtrace amounts of selenium in Radix Astragali seu Hedysari by chemiluminescence extinction. // Zhongguo Yaoke Daxue Xuebao. 1989. - V. 20. - n.6. - P. 360-362. II C.A. 1990, 112:204833q.

38. Jiang W. Comparative studies on quality between the wild and cultivated Hedysarum polybotrys roots from Sichuan province. // Zhongcaoyao. 1989. - V. 20. - n.8. - P. 373374. // C.A. 1990, 112:42313r.

39. Wang R., Chen Y. Analysis of the constituents of Hedysarum polybotrys. II Lanzhou Daxue Xuebao, Ziran Kexueban. 1988. - V. 24. - n.3. - P. 46-50.

40. Beji A., Boukef K., Biard J.F. Effects of artificially introduced autotetraploidy on the free phenolic acid proline in leaves of five species of the genus Hedysarum. II Biruniya. -1988.-V. 4.-n.2.-P. 133-144.//C.A. 1989, 110:209453j.

41. Chen Y., Wang R., Xue D., Li Z., Han H. Analysis of volatile constituents of Hedysarum polybotiys Hand.-Mazz by capillary gas chromatography-mass spectrometry. // Gaodeng Xuexiao Huaxue Xuebao. 1987. - V. 8. - n.6. - P. 538-541.

42. Lan Z., Zhang Z., Cheng G., Wang F., Xi S. Effects of radix hedysari polysaccharides on immunological function and transplanted tumors in mice. // Zhongguo Yaoli Xuebao.- 1987. V. 8.-n.3.-P. 275-277. II C.A. 1987, 106:17403j.

43. Saura-Calixto F. Dietary fiber complex in a sample rich in condensed tannins and uronic acids. // Food Chem. 1987. - V. 23. - n.2. - P. 95-103. II C.A. 1987, 106:6016j.

44. Pan J., Liu W., Wei D., Han G. Chemical constituents of Hedysarum polybotrys Hand-Mazz (Hong Qi). // Beijing Yixueyuan Xuebao. 1984. - V. 16. - n.3. - P. 248-250. // C.A. 1986,105:187579x.

45. Chriki A., Combes D., Marrakchi M. Genetic control of the conversion of dihydroflavonols into anthocyanins in flowers of Hedysarum carnosum Desf. // C. R. Acad. Sci. 1986. - Ser. 3. - V. 302. -n.16. - P. 585-588. // C.A. 1986, 105:39526n.

46. Katsura E., Katoh Y., Yamagishi T. Chemical studies on Astragali Radix. Part 2. Free amino acids in the roots of Astragalus membranaceus and other allied plants. // Hokkaidoritsu Eisei Kenkeushoho. 1984. - n.34. - P. 80-82. // C.A. 1984,100:82817s.

47. He K., Ouyang Z. Gas chromatographic analysis of selenium in Astragalus. // Zhongcaoyao. 1985. - V. 16.-n.2.-P. 54-55.//C.A. 1985, 102:172761q.

48. Miyase T., Fukushima S., Akiyama Y. Studies on the constituents of Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz. // Chem. Pharm. Bull. 1984. - V. 32. - n.8. - P. 3267-3270.

49. Hikino H., Funayama S., Endo K. Validity of Oriental medicines. 2.Hypotensive principle of Astragalus and Hedysarum roots. // Planta Med. 1976. - V. 30. - n.4. - P. 297-302. // C.A. 1977, 86:101061b.

50. Wang W., Chen H., Wang W., Zhao Y. Studies on flavonoid constituents of Hedysarum multijugum. II Yaoxue Xuebao. 2002. - V. 37. - n.3. - P. 196-198.

51. Li Y., Chen J., Liao X., Wang H., Luo S. Studies on flavonoid constituents of Hedysarum sikkimense // Zhongcaoyao. 2001. - V. 32. - n.6. - P. 489-490. II C.A. 2001, 136:17967.

52. Wang W., Chen W., Chen H., Liu J., Zhao Y. Studies on chemical constituents of Hedysarum multijugum // Beijing Daxue Xuebao, Yixueban. 2001. - V. 33. - n.3. - P. 205-208. // C.A. 2001,136:276025.

53. Wang W., An D.G., Chen H.B., Tu G.Z., Zhao Y.Y. Two new pterocarpenes from Hedysarum multijugum. // J. Asian. Nat. Prod. Res. 2003. - V. 5 - n.l. - P. 31-34.

54. Hai L.Q., Liang H., Zhao Y.Y., Du N.S. Studies on chemical constituents in the root of Hedysarum polybotrys. // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2002. - V. 27. - n.l 1. - P. 843845.

55. Hai L.Q., Zhang Q.Y., Liang H., Zhao Y.Y., Du N.S. Studies on chemical constituents of Hedysarum polybotrys. // Yao Xue Xue Bao. 2003. - V. 38. - n.8. - P. 592-595.

56. Блинова К.Ф., Стуккей K.JI. Качественное фитохимическое исследование растений тибетской медицины Забайкалья. В сб.: Вопр. фармакогнозии. JI. - 1961. -Вып. 1.-С. 135-155.

57. Глызин В.И., Николаева Г.Г., Даргаева Т.Д. Природные ксантоны. Новосибирск - 1986.-С. 173.

58. Глызина Г.С., Быков В.И. Фенольные соединения Hedysarum neglectum II Химия природн. соедин. -1969. № 4. - С. 322.

59. Алания М.Д. Флавоноиды Hedysarum sericeum и Н. caucasicum. II Химия природн. соедин. 1983. - № 5. - С. 646.

60. Денисова О.А., Глызин В.И., Русакова С.В., Пименов М.Г. Ксантоновые С-гликозиды Hedysarum denticulatum. II Химия природн. соедин. 1977. - № 2. - С. 283.

61. Глызин В.И., Баньковский А.И., Павлова Н.С. Фенольные соединения Hedysarum sachalinense и Н. brandtii. II Химия природн. соедин. 1970. - № 3. - С. 369.

62. Кривут Б.А., Федюнина Н.А., Кочерга С.И., Русакова С.В. Спектрофотометрическое определение мангиферина. // Химия природн. соедин.1976.-№ 1.-С. 44-46.

63. Русакова С.В., Нухимовский ЕЛ. Некоторые биологические особенности Hedysarum neglectum Ledeb. и содержание в нем мангиферина. // Растит, ресурсы.1977. Т. 13. - Вып. 3. - С. 478-480.

64. Фомина Л.И., Сацыперова И.Ф., Бандюкова В. А. Оптимизация хроматографического разделения мангиферина и гиперозида, выделенных из надземной части Hedysarum alpinum L. // Растит, ресурсы. 1990. - Вып. 3. - С. 431-437.

65. Русакова С.В., Глызин В.И., Кочерга С.И., Солдатова О.В., Мулевич В.М. Способ получения мангиферина. // Открытия, Изобретения, Промышленные образцы, Товарные знаки. 1978. - № 9. - С. 19.

66. Соловьева Е.В., Хоциалова Л.И., Кривут Б.А., Глызин В.И., Майсурадзе Н.И. Содержание мангиферина у видов Hedysarum L., выращиваемых в Московской области. // Растит, ресурсы. 1983. - Т.19. - Вып. 3. - С. 356-360.

67. Рыбаченко А.И., Кривут Б.А., Георгиевский В.П. Флуороденситометрическое определение мангиферина и изомангиферина в Hedysarum flavescens и Н. alpinum. II Химия природн. соедин. 1976. - № 4. - С. 448-450.

68. Borkowski В., Milkowska К. Selected polyphenols compounds. Part I. Xanthones. // Herba Pol. 1999. - V. 45. - n.l. - P. 33-42. // C.A. 1999, 132:216376.

69. Глызин В.И., Баньковский А.И., Пименов М.Г., Боряев К.И. Ксантоновые гликозиды Hedysarum flavescens. II Химия природн. соедин. 1973. - № 3. - С. 434435.

70. Захаров A.M., Боряев К.И. Химическое изучение растений флоры Тянь-Шаня // Аптечное дело. 1965. - Т. 14 - № 5. - С. 44-48. 132.

71. Волхонская Т.А., Ханминчун В.М., Фролова О.И. Обследование растений горного массива Монгун-Тайга и нагорья Сангилен (Южная Тува) на содержание флавоноидов // Растит, ресурсы. 1983. - Т.19. - Вып. 4. - С. 455-464.

72. Toker G., Turkoz S., Sener В. The determination of rutin in some plants by ultra violet spectroscopy. // J. Fac. Pharm. Gazi Univ. 1997. - V. 14. - n.l. - P. 51-54. // C.A. 1997, 128:8603 lg.

73. Toker G., Turkoz S., Erdemoglu N. High performance liquid chromatographic analysis of rutin in plants. Part 1. // Pharmazie. 1998. - V. 53. - n.7. - P. 494-495. // C.A. 1998, 129:1061 lOh.

74. Семенов A.A. Очерк химии природных соединений. Новосибирск: Наука. - 2000. - С. 664.

75. Skadhauge В., Gruber M.Y., Thomsen К.К., von Wettstein D. Leucocyanidin reductase activity and accumulation of proanthocyanidins in developing legume tissues. // Am. J. Bot. 1997. - V. 84.-П.4.-Р. 494-503.//C.A. 1997, 127:303In.

76. Амангельдин E.A. К фотохимическому изучению копеечника желтоватого // Труды Инст. Физиол. АН Каз. ССР. 1968. - Т. И. - С. 144-145. // С.А. 1969, 71:57609а.

77. Шухободский Б.А. К вопросу об алкалоидоносности флоры центральных Саян. // Труды Ботан. Института АН СССР. 1961. - Серия V. - Вып. 9. - С. 320-346.

78. Марина Т.Ф., Краснов Е.А., Никифоров Ю.В. Химико-фрмакологическое исследование копеечника южносибирского. В сб.: Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск. - 1983. - С. 127-129.

79. Павлова Н.С. Полисахариды дальневосточных видов Hedysarum L. и их хемотаксономическое значение. // Растит, ресурсы. 1971. - Т. VII. - Вып. 4. - С. 561-563.

80. Киселев В.Е., Пеккер Е.Г. Азотсодержащие вещества некоторых представителей рода копеечник. // Извест. Сиб. Отдел. Акад. Наук СССР. сер. Биол. - 1978. - № 1. -С. 75-82.

81. Ермаков А.И., Арасимович В.Е., Смирнова-Иконникова М.И., Ярош Н.П., Луковникова Г.А. Методы биохимического исследования растений. Л.: Колос. -1952. - С. 456.

82. Пеккер Е.Г. К биохимической характеристике растений рода Hedysarum L. Юго-восточного Алтая. В кн.: Актуальные вопросы ботанического ресурсоведения в Сибири. Новосибирск. - 1976. - С. 146-149.

83. Пеккер Е.Г. Аминокислотный состав видов Hedysarum L. при различных способах фиксации. // В книге: Актуальные вопросы ботанического ресурсоведения в Сибири, Новосибирск. 1975. - С. 193-197.

84. Мадоян О.О., Празян К.А. Содержание фитоэстрогенов в кормовых растениях Армянской ССР. // Изв. с.-х. наук. 1972. - № 12. - С. 53-61. // С.А. 1973, 78:133379п.

85. Birdsong В.А., Alston R., Turner B.A. Distribution of canavanine in the family Leguminosae as related to phyletic groupings. // Can. J. Bot. 1960. - V. 38 - n.4. - P. 499-505. // C.A. 1960, 54:19881g.

86. Бандюкова B.A., Шинкаренко А.Л. Определение методом бумажной хроматографии флавоноидов в высокогорных растениях Тибердинского района // Фармацев. журнал. 1965. - № 6. - С. 37-41. // С.А. 1967, 67:57253х.

87. Соколов П.Д. Таннидоносные растения центральных Саян. // Труды Ботан. Института АН СССР. 1961. - Серия V. - Вып. 9. - С. 270-290.

88. Глызина Г.С., Комиссаренко Н.Ф. Флавоноиды Hedysarum gmelini. II Химия природн. соедин. 1967. - № 2. - С. 138-139.

89. Глызин В.И., Быков В.И., Глызина Г.С. Фенольные соединения Hedysarum komarovii. И Химия природн. соедин. 1968ю - № 4. - С. 382-383. // С.А. 1969, 70:75090h.

90. Кузнецова М.А. Лекарственное растительное сырье и препараты. М.: Высшая школа.-1987.-С. 190.

91. Губанов И.А. Лекарственные растения. М.: Изд-во МГУ. - 1993. - С. 272.

92. Пленник Р.Я. и др. Полезные растения Хакасии. Ресурсы и интродукция. -Новосибирск: Наука. 1989. - С. 269.

93. Гринкевич Н.И. Лекарственные растения: Справочное пособие. М.: Высшая школа. - 1991.-С. 148

94. Wang W., You С., Wang С., Ни J., Zheng Н. Effect of Radix hedysari total saponins on mouse immunocytes and relation with CaM levels in cells. // Lanzhou Daxue Xuebao, Ziran Kexueban. 2000. - V. 36. - n.5. - P. 107-111.

95. Wang J., Ito H., Shimura K. Enhancing effect of antitumor polysaccharide from Astragalus or Radix hedysarum on C3 cleavage production of macrophages in mice. // Jpn. J. Pharmacol. 1989. - V. 51. - n.3. - P. 432-434. // C.A. 1990, 112:5805g.

96. Мао X., Wang J., Wang F. Effect of Hedysari and Astragali polysaccharides on humoral immune function in mice. // Zhongguo Mianyixue Zazhi. 1988. - V. 4. - n.3. - P. 158-161.//C.A. 1989, 110:463t.

97. Huang Z., Cui Z., Ren Y., Zhang J., Cran M. Antiaging effects of Hedysarum polysaccharide. // Zhongcaoyao. 1992. - V. 23. - n.9. - P. 469-473. // C.A. 1993, 118:774k.

98. Molan A. L., Waghorn G. C., Min B. R., McNabb W. C. The effect of condensed tannins from seven herbages on Trichostrongylus colubriformis larval migration in vitro. // Folia Parasitol. 2000. - V. 47. - n. 1. - P. 39-44. // C.A. 2000, 133:174873.

99. Stobiecki M. Application of mass spectrometry for identification and structural studies of flavonoid glycosides. // Phytochemistry. 2000. - V.54. - P. 237-256.

100. Wang J., Sporns P. MALDI-TOF MS analisis of food flavonol glycosides. // J. Agric. Food Chem. 2000. - V. 48. - P. 1657-1662.

101. Franski R., Bednarek P., Wojtaszek P., Stobiecki M. Identification of flafonoid diglycosides in yellow lupin (.Lupinus luteus L.) with mass spectrometric techniques. // J. Mass Spectrom. 1999. - V. 34. - P. 486-495.

102. Hughes J. R., Croley R. Т., Chris D. M., March E. R. A tandem mass spectrometric study of selected characteristic flavonoids. // International Journal of Mass Spectrometry.- V.210.-n.211.-P. 371-385.

103. Chen M., Song F., Guo M., Liu Z., Liu S. Analysis of flavonoid constituents from leaves of Acanthopanax senticosus Hams by electrospray tandem mass spectrometry. // Rapid communications in mass spectrometry. 2002. - V. 16. - P. 264-271.

104. Cuyckens F., Rozenberg R., Hoffmann de E., Claeys M. Structure characterisation of flavonoid O-diglycosides by positive and negative nano-electrospray ionization ion trap mass spectrometry. // J. of mass spectrometry. 2001. - V. 36. - P. 1203-1210.

105. Franski R., Matlawska I., Bylka W., Sikorska M., Fiedorow P., Stobiecki M. Differentiation of interglycosidic linkages in permethylated flavonoid glycosides from linked-scan mass specta (B/E). // J. Agric. Food Chem. 2002. - V.50. - P. 976-982.

106. Жунке А. Ядерный магнитный резонанс в органической химии М.: Мир. - 1974. -С. 175.

107. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas М.В. The systematic identification of flavonoids.- Berlin, Heidelberg, New York. Springer-Verlag. - 1970. - P. 354.

108. Ковалев И.П., Титов E.B. Инфракрасные спектры поглощения некоторых групп природных соединений. Харьков. — 1966 - С. 201.

109. Markham K.R., Ternai В., Stanley R., Geiger H., Mabry T.J Carbon-13 NMR of flavonoids-III. Naturally occurring flavonoid glycosides and their acylated derivatives // Tetrahedron. 1978. - V.34. - P. 1389-1397.

110. Li J.S., Zhao Y.Y., Wang В., Li X.L., Ma I.B. Separation and identification of the flavonoids from Buddleia officinalis Maxim. // Acta Pharmaceutica Sinica. 1996. - V. 31. - n.l 1.-P. 849-854.

111. Kim Y.C., Higuchi R., Kitamura Y., Komori T. Degradation of flavonoid glycosides. // Liebigs Ann.Chem. 1991. - P. 1285-1289.

112. Chari V.M., Jordan M., Wagner H., Thies P.W. A ,3C-NMR study of the structure of an acyl-linarin from Valeriana wallichii. II Phytochemistry. 1977. - V. 16. - P. 11101112.

113. Liao Y.-H., Houghton P.J., Hoult J.R.S. Novel and known constituents from Buddleja species and their activity against leukocyte eicosanoid generation. // J. Nat. Prod. 1999.- V. 62.-П.9.-Р. 1241-1245.

114. Blasko G., Cordell G.A., Bhamarapravati S., Beecher C.W.W. Carbon 13 NMR assignments of berberine and sanguinarine // Heterocycles. - 1988. - V. 27. - n.4. - P. 911-916.

115. Achenbach H., Lowel M., Wathel H., Cupta M., Solta P. New lignan glucosides from Stemmadenia minima. // Planta Med. 1992. - V. 58. - P. 270-272.

116. Thieme H., Benecke R. Isolation and clarification of a cyclolignan glucoside from the leaves of Populus nigra. II Pharmazie. 1969. - V. 24. - n.9. - P. 567-572. // C.A. 1970, 72:21908d.

117. Benecke R., Nishibe S., Kitagawa S., Hanschmann H. Structure of (+)-isolariciresinol-monoglucoside from Populus nigra. II Pharmazie. 1989. - V. 44. - P. 357-358. // C.A. 1990,112:56463b.

118. Kanchanapoom Т., Chumsri P., Kasai R., Otsuka H., Yamasaki K. Lignan and megastigmane glycosides from Sauropus androgynus II Phytochemistry. 2003. - V. 63.- P. 985-988.

119. Marinos V., Tate M.E., Williams P.J. Lignan and phenylpropanoid glycerol glucosides in wine. // Phytochemistry. 1992. - V. 31. - n.l2. - P. 4307-4312.

120. Еляков Г.Б., Стоник B.A. Стероиды морских организмов. М.: Наука. - 1988. -С. 208.

121. Ralph J. NMR database of lignin and cell wall compounds. www.acdlabs.com

122. Биохимия фенольных соединений. Под ред. Харборна Дж. М.: Мир. - 1968. - С. 451.

123. Yoshinori Т., Mineo S., Yoshiyuki Н., Kiyoshi I., Yoshinobu H. Antiviral activity of natural occurring flavonoids in vitro // Chem. Pharm. Bull. 1985. - V. 33. - n.9. - P. 3881-3886.

124. Plant flavonoids in biology and medicine II. Biochemical, cellular and medicinal properties. Edit. Cody V., Middleton E., Harborne J.B., Beretz A, Alan R. Liss. INC.: New York. - 1987.-P. 461.

125. Shi Y., Shi R.B., Liu В., Lu Y.R. Studies on antiviral flavonoids in Yinqiaosan powder. // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2001. - V. 26. - n.5. - P. 320-323.

126. Bae E.A., Han M.J., Lee M., Kim D.H. In vitro inhibitory effeect of some flavonoids on rotavirus infectivity. // Biol. Pharm. Bull. 2000. - V. 23. - n.9. - P. 1122-1124.

127. Mucsi I., Praigai B.M. Inhibition of virus multiplication and alteration of cyclic AMP level in cell cultures by flavonoids. // Experienta. 1985. - V. 41. - n.7. - P. 930-931.

128. Chiang L.C., Chiang W., Liu M.C., Lin C.C. In vitro antiviral activities of Caesalpinia pulcherrima and its related flavonoids. // J. Antimicrob. Chemother. 2003. - V. 52. -n.2. - P. 194-198.

129. Wacker A., Eilmes H.G. Antiviral activity of plant components. Flavonoids. // Arzneimittelforschung. 1978. - V. 28. - n.3. - P. 347-350. // C.A. 1978, 88:164029j.

130. Babbar O.P., Chhatwal V.K., Ray I.B., Mehra M.K. Effect of berberine chloride eye drops on clinically positive trachoma patients. // Indian J. Med. Res. 1982. - V. 76. - P. 83-82.

131. Khosla P.K., Neeraj V.I., Gupta S.K., Satpathy G. Berberine, a potential drug for trachoma. // Rev. Int. Trach. Pathol. Ocul. Trop. Subtrop. Sante Publique. 1992. - V. 69.-P. 147-165.

132. Cho J.Y., Kim A.R., Park M.H. Lignans from the rhizomes of Coptis japonica differentially act as anti-inflammatory principles. // Planta Med. 2001. - V. 67. - n.4. -P. 312-316.

133. Kapeli E., Erdemolu N., Yeayilada E., Sener B. Anti-inflammatory and antinociceptive activity of taxoids and lignans from the heartwood of Taxus baccata L. // J. Ethnopharmacol. 2003. - V. 89. - n.2-3. - P. 265-270.

134. Braca A., De Tommasi N., Di Bari L., Pizza C., Politi M., Morelli I. Antioxidant principies from Bauhinia tarapotensis. II J.Nat.Prod. 2001. - V. 64. - n.7. - P. 892-895.

135. Головкин Б.Н., Руденская P.H., Трофимова И.А., Шретер А.И. Биологически активные вещества растительного происхождения. В 3 т. М.: Наука. - 2001. - Т. И.-С. 350.

136. Георгиевский В.П., Комиссаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск.: Наука. - 1990. - С. 333.

137. Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г., Толкачев В.О. Флавоноиды почек Populus deltoides // Химия природн. соедин. 1990. - № 4. - С. 548-550.

138. Karrer W. Konstitution und vorkommen der organischen pflanzenstoffe. Birkhauser verlag basel. Stuttgart. - 1958. - P. 699.

139. Джанашия H.M., Глызин В.И. Флавоноловые гликозиды Eucaliptus viminalis II Химия природн. соедин. 1970. - № 6. - С. 764-765.

140. Wollenweber Е., Egger К. Methylather des myricetins, quercetins und kampferols im knospenol von aesculus hippocastanum. // Tetrahedron Letters. 1970. - n.19. - P. 16011604.

141. Спиридонов B.H. Изучение кверцетиновых гликозидов каштана конского СAesculus hyppocastanum L.) II Доклады АН СССР. 1966. - Т. 169. - № 1. - С. 126127.

142. Wagner Н., Aurnhammer G., Horhammer L., Farkas L. Endgultide konstitutionsaufklarung und synthese der flavonglykoside fortunellin, rhoifolin und isorhoifolin. // Chem. Ber. 1969. - V. 102. - P. 2083-2088.

143. Сальникова Е.И., Комиссаренко Н.Ф., Деркач А.И., Дмитрук С.Е., Калинкина Г.И. Фенолокислоты полыней рода Frigidae II Химия природн. соедин. 1993. -№ 5. - С. 759.

144. Каррер П. Курс органической химии. Л.: Изд-во хим. литер. - 1962 - С. 1216.

145. Dobhal М.Р., Goel V.K., Joshi B.C. Chemical investigation of Berberís chitria Ham. Isolation and characterization of some isoquinoline alkaloids. // Pharmazie. 1988. - V. 43. - n.9. - P. 659-660. // C.A. 1989, 129:287805g.

146. Таджибаев M.M., Заторская И.Н., Лутфуллин К.Л., Шакиров Т.Т. О выделении берберина // Химия природн. соедин. 1974. -№ 1. - С. 48-50.