Химический состав эфирного масла Achillea millefolium L. и его модификация тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ
|
Палей, Руслан Владимирович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Казань
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1998
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.03
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
OA
t Ц № ^
На правах рукописи
Палей Руслан Владимирович
ХИМИЧЕСКИИ СОСТАВ ЭФИРНОГО МАСЛА ACHILLEA MILLEFOLIUM L. И ЕГО МОДИФИКАЦИЯ.
02.00.03 - органическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Казань -1998
Работа выполнена на кафедре биоорганической и биофизической химии Казанского государственного медицинского университета
Научный руководитель
- доктор химических наук, профессор В.В.Племенков
- доктор химических наук,
Э.Х.Казакова,
Официальные оппоненты
Ведущее учреждение
- кандидат химических наук, доцент Т.Г.Маннафов
- Казанский государственный технологический университет (г.Казань)
Защита состоится Л 1998 г. в ±0 ч. на заседании
диссертационного совета К 053.29.02 по химическим наукам Казанского государственного университета по адресу: ул. Кремлевская 18, КГУ, Бутлеровская аудитория.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке КГУ. Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская 18, КГУ, Научная часть.
Автореферат разослан ноября 1998 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета,
кандидат химических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Химические исследования лекарственных растений относятся к интенсивно развивающейся области органической химии. Выделение и исследование новых биологически активных субстанций растительного происхождения, определение их строения, взаимосвязи, изучение стереохимии углеродного скелета, химическая модификация и синтез производных, а также поиски путей применения их в медицине представляют одну из важных задач современной органической химии. Интересными объектами в этом отношении являются растения семейства Астровых (Asteracaea), а именно Тысячелистники (Achillea L.).
Тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium L.) - самый распространенный вид рода Тысячелистников (Achillea L.), широко применяется в официальной и народной медицине при различных патологиях. Растение характеризуется ярко выраженным полиморфизмом, многокомпонентностью и непостоянством химического состава, в том числе эфирного масла, что. разумеется, сказывается на лечебных свойствах. В то же время имеются данные о наличии в составе эфирного масла указанного растения вещества с антифлогистическими свойствами -хамазулена (1,4-диметил-7-этилазулена). При этом содержание последнего в различных образцах далеко неодинаковое и зависит от количественного соотношения в нативном растении непрохамазуленовых и прохамазуленовых сесквитерпеновых лактонов (его предшественников), биосинтез которых зависит от набора хромосом и условий произрастания. Это создает необходимость изучения т. обыкновенного, произрастающего в конкретном регионе, разработке методов увеличения содержания биологически активного компонента - хамазулена, выделения его в индивидуальном виде для определения констант и разработки методики стандартизации сырья по его содержанию, а также синтеза производных на его основе - новых потенциальных биологически активных веществ. Химический состав Achillea millefolium L. Волжско-Камского региона в литературе неописан, а данные по компонентному составу его эфирного масла, модификации последнего и синтезу производных хамазулена отсутствуют.
Цель исследования.
1. Изучение химического состава эфирного масла Achillea millefolium L., произрастающего в Волжско-Камском регионе:
2. Выделение хамазулена (1,4-диметил-7-этилазулена) в индивидуальном виде, определение его констант и разработка на основе этих данных методики стандартизации лекарственного растительного сырья (л.р.с.) т. обыкновенного;
3. Разработка метода увеличения содержания в эфирном масле хамазулена ферментативной модификацией химического состава Achillea millefolium L.
4. Химическая модификация хамазулена - разработка нового эффективного синтеза сульфидов азуленового ряда реакцией природного хамазулена с сульфенилхлоридами.
Научная новизна.
Впервые проведено исследование химического состава эфирного масла т. обыкновенного и морфологически схожего тысячелистника щетинистого высокочувствительными методами ГЖХ-МС-спектроскопии, ИК-спектроскопии и ядерно-магнитного резонанса.
Впервые проведена и показана перспективность ферментативной модификации растительного сырья тысячелистника обыкновенного с целью увеличения содержания в эфирном масле биологически активного компонента - хамазулена.
Разработан высокоэффективный метод синтеза сульфидов 1,4-диметил-7-этилазулена потенциальных биологически активных соединений.
Установлены физико-химические константы хамазулена и на их основе разработана методика стандартизации лекарственного растительного сырья тысячелистников по его содержанию.
Практическая значимость. Расширены знания о химическом составе эфирных масел т. обыкновенного и щетинистого. Определены физико-химические константы хамазулена и ^разработаны методики стандартизации и ферментативной модификации л.р.с. тысячелистников. Синтезированы сульфиды хамазулена - потенциальные биологически активные вещества, которые могут быть использованы также и как синтоны в синтезе новых производных хамазулена с практически полезными свойствами.
Апробация работы. Основные результаты работы обсуждались и докладывались на III Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" ( г. Москва, 16-20 апреля 1996 г.). Научно-практической
конференции молодых учёных КГМУ (г. Казань, 19 июня 1997 г.) и на VI Международной конференции "Антибиооксидант" (г. Москва, 18-20 ноября 1998 г.)
Публикации. По материалам работы опубликованы 2 статьи и тезисы 3 докладов.
Структура работы. Диссертация изложена на 172 страницах, включает 58 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, четырех глав, трех выводов и списка литературных ссылок из 136 наименований. В первой главе рассмотрен литературный материал по общей характеристике рода Тысячелистник, фармакологических свойствах и применении, химическом составе растений и эфирных масел. Дано обсуждение результатов, полученных по компонентному составу эфирного масла т. обыкновенного и щетинистого, приведены их сравнительные характеристики и методы стандартизации л.р.с. по определению главной биоактивной компоненты - хамазулену. Вторая глава посвящена вопросу ферментативной модификации химического состава тысячелистников с целью увеличения содержания в них прохамазуленовых сесквитерпеновых лактонов и, как следствие, хамазулена в эфирном масле. В третьей главе описана химическая модификация хамазулена: высокоэффективный синтез потенциальных биологически активных соединений - сульфидов азуленового ряда. Экспериментальная часть представлена в четвертой главе. Строение выделенных и полученных соединений доказывалось с применением методов хромато-масс спектроскопии, спектроскопии ЯМР на ядрах 'К и 13С, ИК, УФ, элементного и рентгеноструктурного анализа.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Исследования химического состава эфирных масел тысячелистников Волжско-Камского региона.
Материал для исследования - соцветия тысячелистника обыкновенного заготавливали в июне - сентябре 1994-1996 гг. в фазе начала цветения и цветения. Места сбора: Республика Марий Эл - лесная опушка и садово-огородный участок близ поселка Илеть;. Республика Татарстан - пойма реки Казанки близ деревни Кульсеитово,
Высокогорского района; пойма реки Волги близ поселка Матюшино; лугг близ деревни Семиозерки, Высокогорского района; пойма реки Мёши бли: поселка Пестрецы, Пестречинского района; Приволжский район г. Казани (удаленность от промышленных предприятий более 20 км).
Соцветия тысячелистника щетинистого заготавливали в июле 199! года в период массового цветения на территории Приволжского района г Казани близ деревни Куюки.
Всё сырье сушили и хранили в соответствии с "Правилами сбора у сушки лекарственных растений"
Извлечение эфирного масла начинали проводить не ранее чем через 1.5-2 месяца после сбора образцов, т.е. исследования проводили не не свежесобранном, а на воздушно-сухом материале, максимально соответствующем заготавливаемому лекарственному растительном} сырью.
Эфирное масло . получали отгонкой с водяным паром ил» гидродистилляцией, которая наиболее близко моделирует явления происходящие при изготовлении настоев и отваров. Использовали« прибора с насадкой Клевенджера, предлагаемого действующе? Государственной Фармакопеей XI издания по способу 3 дл5 тысячелистника обыкновенного (Статья 53, том 2, стр.325), оказалоа невозможным вследствие больших потерь целевого продукта на стенка? прибора и простого улетучивания терпеноидов из-за конструктивны? недостатков.
Нами предлагается использование классического прибора длз отгонки летучих с водяным паром веществ в сочетании с вводол низкокипящего органического растворителя - гексана (т.кип.68°С) шп пентана (т.кип.36°С). Прибор (рис.1) состоит из паровика 1, рабоче* двугорлой обогреваемой колбы 2, насадки Вюрца 3 с пробкой 4 низходящего алонжированного холодильника 5 и приемника-делительно! воронки 6. Низкокипящий органический растворитель помещается ] приемник-делительную воронку перед отгонкой эфирного масла. Такт образом осуществляется защита от излишнего испарения терпеноидов и: дистиллята. К концу отгонки эфирного масла пробка 4 с насадки Вюрца ! заменяется капельной воронкой 7, в которую также помещаете) низкокипящий растворитель. Испаряясь в рабочей колбе, пары гексан;
(или пентана) полностью омывают систему при конденсации, сводя потери эфирного масла практически к нулю.
Рис.1. Прибор, предлагаемый для определения содержания и отгонки эфирного масла из растительного сырья тысячелистников и других эфироносов.
С целью обнаружения и установления как можно большего числа компонентов эфирного масла и определения минорных компонентов было решено использовать значительные количество исходного материала. Для этого сырье, собранное в период массового цветения на различных участках, объединили и отгоняли эфирное масло из описанного выше прибора. Объем рабочей колбы - 10 л, паровика - 2 л, скорость отгона дистиллята - 3-4 капли в секунду, время отгона - 12 часов, степень измельчения сырья 5 мм^. Полученный дистиллят экстрагировали гексаном 5x100 мл. Гексановые вытяжки объединили и сушили безводным сульфатом магния в течение 1 суток. Раствор эфирного масла в гексане имел интенсивно синюю окраску . Затем отгоняли растворитель и концентрировали в вакууме при остаточном давлении 30-40 мм рт. ст. и температуре не выше 20°С. Остаток - эфирное масло представляло собой маслянистую жидкость темно-синего цвета с резким запахом. Средний выход эфирного масла составил 0.25% в пересчете на воздушно-сухое сырьё т. обыкновенного. Полученное масло массой 30 г подвергли
7
хромата! -рафировагаоо на колонках с нейтральной окисью алюминия активности II по Брокману, силикагелями Silicagel L 40/60 и Merck Kieselgel 60. Элюировали гексаном, смесями гексана и дютилового эфира с возрастающим содержанием последнего и чистым диэтиловым эфиром. Полученные после колоночной хроматографии индивидуальные вещества и фракции анализировали хроматомасс-спектроскопически на масс-спектрографе Incos-50B в сочетании с газовым хроматографом Varian-3400. Капиллярная колонка - фаза SE-30, длина - 30 м, 0 0.25 мм. Энергия ионизирующих электронов - 70эВ. Температура инжектора - 250°С, ионного источника - 150°С. Полученные спектры соединений сравнивали компьютерным анализом с уже известными веществами, либо проводили анализ фрагментации. Также, проводили анализ полученных фракций и веществ методами протонно-магнитного (ПМР) и ядерно-магнитного (]3С-ЯМР и DEPT) резонанса, инфракрасной спектроскопии.
Компонентный состав эфирного масла Achillea millefolium L., произрастающего на территории Волжско-Камского бассейна, представлен следующими группами соединений: линейные насыщенные углеводороды; терпены и терпеноиды; азулены; ациклические и циклические кетоны (таблица 1).
В процессе сбора образцов т. обыкновенного был обнаружен близкий таковому вид т. щетинистый - Achillea setacea Waldst. et Kit. Высокая морфологическая схожесть, совместное произрастание и одинаковое использование в качестве лекарственного средства побудили нас провести сравнительные исследования химического состава эфирного масла этого вида в строгой параллели с т. обыкновенным.
В результате выявлены существенные различия химических составов этих двух видов. Из эфирного масла т. щетинистого выделена парафиновая фракция; в терпеновой фракции доминируют м-цимол и у-терпинен; пинены не обнаружены;'найдены 3- и 4-карены, сесквитерпены представлены большим разнообразием структур: лонгифолен, элемен, бурбонен, копаен, мууролен, кадинен; азуленовая фракция незначительна -хамазулен, носитель антифлогистических свойств, практически отсутствует; главный компонент эфирного масла - пиперитон (таблица 2).
Полученные данные свидетельствуют о необходимости корректировки вопросов заготовки и стандартизации представителей рода Achillea L.
Таблица 1. Компонентный состав эфирного масла тысячелистника обыкновенного Achillea millefolium L., полученного _. методом гидродистилляции._
Вещество Содержание вещества в %
'! 1 в эфирном масле | в 100 г возд.-сух. сырья
!'-.,, 1 2 з
; 1. Линейные углеводороды:
Генэйко'зан С21Н44 (46) 0.018 4.4х10"5
Докозан С22Н46 (47) 0.079 2.0x10"4
Трикозан С23Н48 (48) 0.112 2.8ХЮ"4
Тетракозан С24Н50 (49) 0.032 3.1х10"5
Пентакрзан С25Н52 (50) у 0.136 3.4Х10"4
Гексакозан С26Н54 (51) 0.014 3.5х10"5
Гептакозан С27Н56 (52) 0.027 6.7x10'5
2. Терпены
а-Пинен (53) 1.60 4.0x10°
Пинан (54) 0.05 1.2Х10"4
З-Пинен (55) 23.40 5.8х10'2
3-карен(56) 3.80 9.5х10'э
п-Цимол (57) 0.63 1.6x10'3
Камфен (58) 0.05 1.2Х10*4
транс-(3-Кариофиллен (59) 6.80 1.7x10"2
а-Гумулен (60) 0.31 7.7x10"4
транс-Р-Кубебен (61) 0.56 1.4x10"3
3. Азулены
Хамазулен - 1,4-диметил-7-этил-азулен(45) 20.60 5.2x10"2
Х-азулен - 1,4-диметил-7-винил- 0.01 2.5хЮ"5
азулен(62)
; 4. Терпеноиды
Цинеол 1,8 (63) 4.80 1.2x10"2
Линалоол (64) 0.07 1.7Х10-4
Вербенол(65) 2.20 5.5х10'3
Борнеол(66) 3.40 8.5х10"3
Пинена оксид (67) 0.15 З.бхЮ"4
Неролидол(68) 4.20 l.lxlO'2
Спатуленол (69) 0.55 1.4x10'3
а-Кадинол (70) 6.40 1.6x10'2
Продолжение таблицы 1.
1 2 3
Бисаболол (71) 0.60 1.5x10'3
Ci0H14O (72) 0.05 1.2Х10-4
Камфора (73) 4.80 1.2x10"2
Вербенон(74) 0.45 1.1 х 10"3
цис-Жасмон (75) 0.06 1.5Х10"4
а-Терпинеол (76) 1.90 4.7x10"3
транс-р-Кариофиллена оксид (77) 3.50 8.8x10"3
Фарнезол (78) 0.70 1.7x10'3
транс-Р-Кариофиллена диоксид (79) 0.70 1.7x10"3
а-Санталол 0.70 1.7x10"3
Ci зНзоО-б, 10,14-пентадекатриен-5,9,13-он 2 (81) 0.06 1.5Х10"4
цис-Миртанол (82) 0.50 1.2х10"3 .
Изоборнеол(83) 1.20 3.0x10"3
Лавендулол (84) 0.35 8.7x10-4
транс-Карвеол (85) 0.21 5.2Х10"4
Пинокарвеол (86) 0.20 5.0x10"4
Пиперитон(87) 0.30 7.5Х10"4
транс-Кубебол (88) 0.15 3.7x10"4
5-гептен-2-он, 6 метил (89) 0.20 5.0x10-4
а-Туйон (90) 0.12 3.0x10"4
Р-Туйон (91) 0.12 3.0x10"4
Таблица 2. Компонентный состав эфирных масел Achillea millefolium L. и Achillea setacea Waldst. et Kit.
Компонент Содержание в эфирном масле, % A. setacea | A. millefolium
1 2 3
Парафины 0.80 0.46
а-Пинен (53) - 1.6
Р-Пинен (55) - 23.4
З-Карен (56) 0.40 3.80
4-Карен (94) 0.30 -
п-Цимол (57) • 0.63
м-Цимол (92) 4.25 -
у-Терпинен (93) 1.75 -
транс-Р -Кариофиллен (59) 0.50 6.80
Продолжение таблицы 2.
1 2 3
а-Гумулен (60) - 0.31
транс- (5- Кубебен (61) - 0.56
Лонгифолен (95) 0.42 -
Элемен(96) 0.24 -
З-Бурбонен(97) 0.40 -
Валенсен (104) 0.23 -
Копаен(98) 0.25 -
у-Мууролен (99) 0.35 -
8-Кадинен (100) 0.50 -
Хамазулен (45) Следы 20.60
1.8-Цинеол (63) 2.67 4.80
Артемизиакетон (101) 9.60 -
цис-Сабинил ацетат (103) 1.07 -
Вербенол (65) 4.70 2.20
Борнеол(66) 2.78 3.40
Пиненоксид (67) - 0.15
Неролидол (68) 1.60 4.20
Спатуленол (69) 0.25 0.55
а-Кадинол (70) 2.40 6.40
Бисаболол (71) - 0.60
Камфора (73) 1.47 4.80
Вербенон (74) - 0.45
цис-Жасмон (75) 0.16 0.06
Х-вещества с М/.2=222 до 15.0 0.45
у-Терпинеол(102) 6.44 -
Изоборнеол(84) 0.20 1.20
Кариофилленоксид (77) 0.20 3.50
Кариофиллендиоксид (79) - 0.70
Фарнезол (78) - 0.70
а-Санталол (80) - 0.70
цис-Миртанол (82) - 0.50
Лавандулол (83) - 0.35
транс-Карвеол (85) - 0.21
транс-Пинокарвеол (86) - 0.20
Пиперитон (87) 26.8 0.30
Кубенол(88) - 0.15
а-,р-Туйоны (90,91) 1.7 0.24
Интересные физико-химические свойства хамазулена позволили нам разработать методику стандартизации л.р.с. тысячелистников по его содержанию в эфирном масле, а также косвенно оценивать содержание фармакологически важной группы соединений - прохамазуленовых сесквитерпеновых лактонов в растении по его же содержанию.
Из-за отсутствия литературных данных о значении молярного коэффициента экстинкции хамазулена, мы проводили его независимое определение. Для этого использовали хроматографически чистый хамазулен (по данным ГЖХ более 99,5%), измерения проводили- на спектрофотометре СФ-26М при длине волны равной 604 нм. Измеряли оптическую плотность гексанового раствора точной навески хамазулена. Толщина кюветы 1 см, раствор сравнения - гексан. Получено значение молярного коэффициента экстинкции е =390.
Предлагается следующая методика определения хамазулена в тысячелистниках:
В рабочую колбу прибора для отгонки эфирного масла тысячелистников (рис.1) помещают 20 г цветочных корзинок тысячелистника обыкновенного, проходящих сквозь сито 0 5 мм, заливают 100 мл дистиллированной воды, подсоединяют паровик, заливают в приёмник-делительную воронку 10 мл гексана и отгоняют эфирное масло в течение 3-х часов с момента появления первых капель дистиллята. Скорость отгона дистиллята - 2 капли в секунду. По окончании отгонки в рабочую колбу с помощью капельной воронки вводят 20 мл гексана и пар пропускают до полного перехода органического растворителя в приемник-делительную воронку. Затем полученный дистиллят экстрагируют в этой же делительной воронке гексаном 3x10 мл и доводят объем раствора до 50 мл в мерной колбе тем же растворителем. Содержание хамазулена (1,4-диметил-7-этилазулена (45)) определяют спектрофотометрически по показателю оптической плотности с использованием коэффициента экстинкции е = 390 при Кж= 604 нм, по формуле, в соответствии с законом Ламберта-Бера: Сцс
Нами также проводилось химическое исследование экстрактов т. обыкновенного. Хроматографией на колонках с окисью алюминия и силикагелем с последующей перекристаллизацией из эфирного экстракта сырья т. обыкновенного удалось выделить 2 сесквитерпеновых лактона -балханолид (21) и темизин (107). Балханолид - уже известный для т.
ооыкновенного, но его молекулярная структура подтверждена нами данными РСтА впервые (рис.2). Лактон имеет транс-сочленение лактонного кольца, двойные связи расположены во взаимноперпендикулярных плоскостях. Балханолид имеет 1(Я),2(11),10(8),11(8)-конфигурацию. В спектре ПМР второго лактона наблюдались сигналы резонанса винильных протонов - 5.0-6.0 м.д., сигналы метановых протонов - 4.0 и 2.5 м.д., сигналы метальных групп -1.0 - 2.0 м.д. ИК-спектр содержит полосы поглощения валентных колебаний карбонила лактонного цикла при 1740 см"1, ОС связи при 1650 см"1 и ОН-группы при 3500 см"1. Температура плавления - 227-228°С. На основании этих данных ему была приписана структура темизина (107). До нашего исследования он не был найден в тысячелистниках, но обнаружен у Полыней, что говорит о близости этих родов.
СН3
„^СНз
Темизин(107)
Н142
Рис.2. Молекулярная структура балханолида (21) по данным РСтА.
2. Ферментативная модификация химического состава тысячелистников
сесквитерпеновых лактонов гваянового ряда, содержащих кето-группу, навело на мысль о возможности увеличения содержания биоактивной компоненты - хамазулена, через их восстановление. А именно, восстановить карбонильную до гидроксильной группы, переводя непрохамазуленовый лактон в прохамазуленовый. Решили воспользоваться ферментной системой свежих пекарских дрожжей (Baker's yeast), известной как селективный восстановитель в таких реакциях.
Ферментативная модификация л.р.с. тысячелистников с целью увеличения в них целевых веществ осуществляли впервые, поэтому проводили подбор условий, питающих сред и оптимизацию методики. Оказалось, что 24-часовая экспозиция (с перемешиванием) сырья т. обыкновенного (20 г воздушно-сухого сырья) с.культурой пекарских дрожжей (20 г свежих хлебопекарских дрожжей) при 28°С, питающей среде - 10% растворе сахарозы (20 г сахарозы, воды дистиллированной до 200), дает увеличение содержания хамазулена в эфирном масле до 30% по сравнению с контролем (схема 1).
Наличие
У
тысячелистников
непрохамазуленовых
Схема 1.
" ОАс
in
28?С, 24 часа, питающая среда - 10% раствор сахарозы
BAKER'S YEAST
ОН
•ОАс
МАТРИКАРИН
ГИДРОКСИМАТРИКАРИН
loot (водяной пар),
3 часа —М-
lOOt (водяной hap),
-CHjCOOH, -H20,-C02
3 часа
ХАМАЗУЛЕН (45)
3.Синтез сульфидов азуленового ряда
В связи с тем, что хамазулен - носитель биологической активности, и известным фактом, что и сульфидные группы являются таковыми, мы предприняли синтез сульфидов азуленового ряда реакциями выделенного из т. обыкновенного хамазулена с сульфенилхлоридами.
Последние являются эффективными электрофильньши реагентами, позволяющими вводить сульфидную группу в ароматическую систему, и практически неописаны в литературе их реакции с азуленами.
Так как азуленовые системы отличаются высокой степенью электронодонорности (ПИ1=7.42 эВ), реакции сульфенилхлоридов с хамазуленом протекали столь активно, что потребовались определённые предосторожности во избежание осмоления реакционных смесей. Реакции проводили при достаточно низких температурах (-78°С), строго соблюдая эквимольность соотношения реагентов (ЯБС1 и хамазулена), при быстро?.! удалении выделяющегося хлористого водорода из реакционной среды вакуумированием. После хроматографирования на колонке с нейтральной окисью алюминня были получены индивидуальные продукты реакций с очень высокими выходами (> 95%).
Схема 2.
СН3
Я-
СН3
Хамазулен (45)
Сульфиды хамазулена (108-113) И,— СНз - (108), С2Н5 - (109), С6Н5 - (110), р-СН3-С6Н4 - (111), р-СН3-0-С6Н4 - (112),
По данным элементного анализа и данным спектроскопии ПМР все полученные продукты имеют одну сульфидную функцию, расположенную у атома С3 пяти-членного цикла азуленовой системы. Им приписаны структуры 3-К8-1,4-диметил-7-этил-азуленов (108-113).
Положение сульфидной группы в азуленовом бицикле соединений (108-113) было установлено при анализе их спектров ПМР в области резонанса ароматических протонов (7.0 - 8.3 м.д.). В спектре исходного хамазулена(45)имеются: дублетный сигнал протона Н8 (14=1.8 Гц), АВ-система сигналов протонов Н5 и Н6 (1Э=11.0 Гц) с дополнительным растеплением сигнала Н6 дальним взаимодействием с протоном Н8 (14==1.8
2 3 3
Гц), АВ-система сигналов протонов Н и Н (I =3.1 Гц). Во всех случаях при сравнении спектров ПМР хамазулена и соответствующих продуктов его сульфидирования наблюдалось исчезновение сигнала протона Н3, сопровождающееся вырождением дублетного сигнала Н" в синглет.
Структура продуктов была также подтверждена данными РСтА 3-(Ы-1-фенкл-тетразолил-5-тио)-1,4-диметил-7-этил азулена (113) (рис.3).
Рис.3. Молекулярная структура 3 -(Ы-1 -фенил-гетразолил-5-тио)-1,4-диметил-7-этил азулена (113) по данным РСтА.
Основные результаты и выводы
1. Установлен полный химический состав эфирного масла тысячелистника обыкновенного - Achillea millefolium L., и морфологически схожего вида тысячелистника щетинистого -Achillea setacea Waldst. et Kit., произрастающих в Волжско-Камском регионе России.
2. В составе тысячелистника обыкновенного впервые обнаружен сесквитерпеновый лактон - темизин, характерный для Полыней.
3. Разработана методика стандартизации л.р.с. тысячелистников по содержанию в эфирном масле хамазулена, основанная на спектрофотометрическом его определении и прямом расчете концентрации по молярному коэффициенту экстинкции.
4. Показана перспективность ферментативной модификации культурой пекарских дрожжей растительного сырья тысячелистников с целью увеличения содержания в них биологически активных компонентов, в частности - хамазулена в эфирном масле.
5. Изучены синтетические возможности хамазулена в реакциях сульфенилхлорирования.
6. На основе реакций хамазулена с сульфенилхлоридами разработан высокоэффективный синтез сульфидов азуленового ряда -потенциальных биологически активных соединений.
Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:
1. Палей Р.В., Племенков В.В., Артемова Н.П., Чугунов Ю.В., Фазлыева М.Г. Химический состав эфирного масла Achillea millefolium L., полученного методом гидродистилляции //Растительные ресурсы. -1996,- Т. 32,- Вып. 4.- С.37-44.
2. Палей Р.В., Племенков В.В., Артемова Н.П., Чугунов Ю.В., Фазлыева М.Г. Сравнительная оценка компонентного состава эфирных масел Achillea setacea Waldst. et Kit. и Achillea millefolium L. //Растительные ресурсы. - 1997. - Т. 33. - Вып. 2. - С.61-63.
3. Палей Р.В., Племенков В.В., Лодочникова О.П., Катаева О.Н., Литвинов И.А. Синтез сульфидов азуленового ряда реакциями хамазулена с сульфенилхлоридами //ЖОрХ. - 1998. - в печати.
4. Палей Р.В., Племенков В.В., Артемова Н.П. Ферментативная модификация химического состава эфирного масла тысячелистника обыкновенного Achillea millefolium L. //Тез. докл. Ш Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва. - 1996. -С.61.
5. Палей Р.В., Бакопки Б. Нго, Племенков В.В., Артемова Н.П. Тысячелистник обыкновенный. Ферментативное обогащение активной компонентой и состав эфирного масла //Тез. докл. Научно-практической конференции молодых ученых КГМУ. - Казань. - 1997. - С.54.
6. Палей Р.В., Племенков В.В., Нго Бакопки Б. Гваянолиды как источники природных и синтетических антиоксидантов //Тез. докл. V Международной конференции "Биоантиоксидант". - Москва. - 1998-С.69.
Соискатель
q.). : J"? /
yj r ^ .
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦДНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
ПАЛЕЙ РУСЛАН ВЛАДИМИРОВИЧ
Химический состав эфирного масла Achillea millefolium L. и его модификация.
Специальность 02.00.03 - органическая химия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель -доктор химических наук профессор В.В.Племенков
/
Казань -1998
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ...................................................... 4
ГЛАВА 1
Фитохимия тысячелистника обыкновенного - Achillea millefolium L. s. 1. и тысячелистника щетинистого Achillea setacea Waldst. et Kit. семейства Астровые (Asteraceae)
1.1. Литературные данные о химическом составе исследованных видов тысячелистников............................................. 10
1.2. Фотохимическое исследование Achillea millefolium L. s. 1. Волжско-Камского бассейна.............................................35
1.3. Фотохимическое исследование Achillea setacea Waldst. et Kit.
Волжско-Камского бассейна....................................84
1.4. Химическое сравнение и различия этих двух видов................. 101
1.5. Определение и содержание хамазулена в тысячелистниках...........103
t
ГЛАВА 2
Ферментативная модификация химического состава тысячелистников
2.1. Ферменты пекарских дрожжей ("В. Y." реагента)
в органическом синтезе.......................................106
2.2. Ферментативная модификация каранона......................... 110
2.3. Ферментативное восстановление растительного
сырья тетраплоидного тысячелистника обыкновенного..............113
2.4. Ферментативное восстановление растительного
сырья гексаплоидного тысячелистника обыкновенного и тысячелистника щетинистого...................................116
ГЛАВА 3
Синтез сульфидов азуленового ряда реакциями хамазулена с
сульфенилхлоридами
3.1. Хамазулен в реакциях сульфенилхлорирования
(обсуждение результатов)......................................124
ГЛАВА 4 Экспериментальная часть
Материал исследования (места сбора, подготовка, сушка)............... 138
Получение эфирных масел.........................................138
Хроматография эфирных масел.....................................139
Приготовление ферментной системы пекарских дрожжей .............: . .140
Ферментативная модификация каранона..............................141
Ферментативная модификация тысячелистника обыкновенного...........141
Разработка эфирного экстракта травы тысячелистника обыкновенного.....145
Получение сульфенилхлоридов .........................................148
Получение сульфидов 1,4-диметил-7-этил азулена....................... 148
ТАБЛИЦЫ.......................................................149
ВЫВОДЫ.......................................................162
ЛИТЕРАТУРА...................................................163
ВВЕДЕНИЕ
Мы живем в мире, который в немалой степени создан человеком и для человека. Но стремительный и всеохватывающий прорыв в области научного знания ведёт учёных и прогрессивных людей к неоспоримой приоритетности природных ценностей и мироощущения в единстве с Природой. Информационный взрыв в химии и биологии не оставляет сомнений в том, что новое столетие, в определённой мере, станет эпохой биотехнологий и биохимии, эпохой химии природных соединений и их синтетических аналогов - по крайней мере хотелось, чтобы это было так.
На протяжении всей истории жизнь человека - это борьба, стремление познать, подчинить себе растительный мир. Человек издревле использовал растения для реализации задачи выживания [1,2]. И первым объектом исследования человека без сомнения был и как видно остаётся именно растительный объект.
Актуальность. Успехи синтетической химии нашего столетия безусловно имеют важное значение для развития фармации и медицины. Однако, в последние два десятилетия установилась устойчивая тенденция к использованию в комплексном лечении различных патологий лекарственных растительных средств и фитопрепаратов, которые, по сравнению со многими химическими препаратами, лучше переносятся больными и не вызывают существенных побочных явлений. Из общего арсенала лекарственных средств, применяющихся в мировой медицинской практике для профилактики и лечения болезней, третью часть составляют препараты растительного происхождения [3]. Примерами могут служить широко применяемые аспирин, стероиды, сердечные гликозиды, алкалоиды, каротиноиды, витамины, антибиотики, цитостатики и многие другие лекарства, изначально выделенные из природных источников [4].
Достижения физико-химического анализа в установлении структуры природных соединений современными методами ядерно-магнитного резонанса
высокого разрешения, хромато-масс-спектроскопии высокой чувствительности, инфракрасной и ультрафиолетовой спектроскопии, ренгеноструктурного анализа позволяют получить исчерпывающую информацию о компонентах растения, их строении, а, следовательно, и свойствах, как химических, так и биологических [5]. И хотя данные по природным соединениям неустанно пополняются новыми, на сегодняшний день изучено лишь 5% представителей "зеленого" царства [6].
9
Заметим, что лекарственные растения всегда содержат гамму продуктов. Это от сотни до нескольких тысяч соединений в шкале измерений концентраций современными методами. Многие изученные к настоящему моменту растения можно считать ещё не изученными до конца, так как ведение исследования с применением все новых и новых методов анализа открывает вещества на уровне субмикроколичеств, нередко высоко биологически активных. Яркими примерами могут служить таксол и артемизинин, найденные недавно в достаточно распространенных и широко применяемых в народной медицине растениях. Интенсивное изучение этих соединений открыло их исключительную противоопухолевую и аэтимажрийную активность соответственно. Важным фактом является то, что данные вещества являются минорными компонентами своих растений [7-11].
Более того, к настоящему времени можно считать доказанным нецелесообразность использования растения целиком в качестве лекарственного средства по следующим причинам: во-первых, в одном растении содержатся вещества самого различного биологического действия, но какие из них ответственны за фармакотерапевтический эффект мы не видим ввиду их малых количеств, поэтому проявления действия некоторых биологически активных веществ нивелируется их антагонистами и маскирующим эффектом компонентов растения, содержащихся в значительных количествах; во-вторых, химический состав растений непостоянен и очень чувствителен к внешним и внутренним факторам [12,13]; в-третьих,
медицинская популярность некоторых видов растений может привести к тому, что запасы вида могут быть быстро истощены или вид будет практически уничтожен.
(Не следует забывать, что в последнее время много интересных и полезных природных соединений дают исследования морских организмов. Продукты морей и океанов также неисчерпаемы как растения на суше [14,15]).
В связи с этим возникает задача выделения и установления строения всего набора веществ, а не только доминирующих компонентов, лекарственных растений, а также потенциально лекарственных растений, их модификации, как методами ферментативного синтеза, с целью увеличения биологически активных компонентов, так и химического синтеза, для получения на основе природных веществ новых фармакологически активных соединений.
Исследования последних лет свидетельствуют о том, что самая интересная и плодотворная в этом отношении является достаточно молодая, разнообразная и широко распространённая группа растений - семейство Астровых (Asteraceae), а, именно, рода Полыни, Ромашки, Тысячелистники, богатые терпеноидами различного строения с высокой биологической активностью. Наиболее перспективны исследования растений рода Тысячелистники, которые относительно мало изучены, более "лабильны" среди растений своего семейства и богаты указанными соединениями [16,17].
Объектом научно-исследовательской работы был выбран тысячелистник обыкновенный - Achillea millefolium L., - ценное лекарственное растение. Близкие рода Ромашки (Matricaria) и Полыни (Artemisia) мало представлены на территориях средней полосы России и неплохо изучены. Тысячелистник обыкновенный - самый распространенный вид рода Тысячелистников (Achillea L.) [18], широко применяется в официальной и народной медицине при различных патологиях [19-22]. Растение характеризуется ярко выраженным полиморфизмом [23-25], многокомпонентностью и непостоянством
химического состава [12], в том числе эфирного масла [26], что, разумеется, сказывается на лечебных свойствах его препаратов. В то же время имеются данные о наличии в составе эфирного масла тысячелистников вещества с антифлогистическими свойствами - хамазулена (1,4-диметил-7-этилазулена) [26]. При этом содержание последнего в различных образцах далеко неодинаковое [12] и зависит от количественного соотношения в нативном
растении непрохамазуленовых и прохамазуленовых сесквитерпеновых лактонов
>
(его предшественников), биосинтез которых в свою очередь зависит от набора хромосом и условий произрастания. Это создает необходимость изучения тысячелистника обыкновенного, произрастающего в конкретном регионе, разработке методов увеличения содержания биологически активного компонента - хамазулена, выделения его в индивидуальном виде для определения физико-химических констант и разработки методики стандартизации сырья по его содержанию, а также синтеза производных на его основе - новых потенциальных биологически активных веществ, т.к. данные зарубежных исследователей, работающих над изучением соединений родственных азулену - получением ациламиногвайазуленов [27], азуленсульфонатов [28], и их противоязвенной активности [29,30], говорят о перспективности синтеза производных азулена. Химический состав Achillea millefolium L. Волжско-Камского региона в литературе практически неописан, а данные по компонентному составу его эфирного масла, модификации последнего и синтезу производных хамазулена отсутствуют.
Цель исследования:
1. Изучение химического состава эфирного масла тысячелистника обыкновенного - Achillea millefolium L., а также морфологически схожего вида -тысячелистника щетинистого - Achillea setacea Waldst. et. Kit., произрастающих в Волжско-Камском регионе России, с использованием современных физико-химических методов анализа.
2. Выделение хамазулена (1,4-диметил-7-этилазулена) из эфирного масла в индивидуальном виде, определение его констант и разработка на основе этих данных методики стандартизации лекарственного растительного сырья тысячелистника обыкновенного.
3. Разработка метода ферментативной модификации химического состава Achillea millefolium L. с целью увеличения содержания в его эфирном масле биологически активного компонента - хамазулена.
4. Химическая модификация хамазулена - изучение синтетических возможностей хамазулена в реакции сульфенилхлорирования, разработка нового эффективного синтеза сульфидов азуленового ряда реакцией природного хамазулена с сульфенилхлоридами, получение сульфидов хамазулена - новых потенциально биологически активных соединений.
Методы исследования. Современные химические и физико-химические методы. Строение выделенных и полученных соединений доказывалось с применением методов хромато-масс-спектроскопии, спектроскопии ЯМР на ядрах и ЬС, ИК-спектроскопии, УФ-спектроскопии, элементного и рентгеноструктурного анализа.
В первой главе настоящей работы рассмотрен литературный материал по общей характеристике рода Тысячелистники семейства Астровых, их фармакологических свойствах и применении, химическом составе растений и эфирных масел. Дано обсуждение результатов по компонентному составу эфирного масла тысячелистника обыкновенного и щетинистого, приведены их сравнительные характеристики и методы стандартизации лекарственного растительного сырья по определению главной биоактивной компоненты -хамазулену.
Вторая глава посвящена вопросу ферментативной модификации химического состава тысячелистников с целью увеличения содержания в них прохамазуленовых сесквитерпеновых лактонов и, как следствие, хамазулена в эфирном масле.
В третьей главе описана химическая модификация хамазулена: высокоэффективный синтез потенциальных биологически активных соединений - сульфидов азуленового ряда
Экспериментальная часть представлена в четвертой главе. Далее следуют таблицы, выводы и цитируемая литература.
Работа выполнена на кафедре биоорганической и биофизической химии Казанского государственного медицинского университета под руководством доктора химических наук, профессора В.В.Племенкова, была поддержана международным фондом ШТАБ (грант № 94-428) и входит в научную тематику кафедры.
10 Глава 1.
Фитохимия тысячелистника обыкновенного Achillea millefolium L. s. 1. и тысячелистника щетинистого Achillea setacea Waldst. et Kit.
1.1. Литературные данные о химическом составе двух исследованных
видов тысячелистников
Род тысячелистник Achillea семейства Астровых Asteraceae насчитывает в мировой флоре около 150 видов, из которых во флоре нашей страны встречается 50 [17].
Тысячелистник обыкновенный Achillea millefolium L. наиболее распространенный вид рода, встречающийся в Европе, Средней Азии, Северной Америке [23-25].
Тысячелистник обыкновенный - многолетнее травянистое растение с ползучим корневищем, развивающим прикорневые листья и цветоносные побеги высотой до 120 см (обычно 30 - 50 см). Прикорневые листья крупные, черешковые, длиной до 15 см, в очертании ланцетные, многократноперисторассеченные на многочисленные сегменты, в свою очередь надрезанные на 3 - 5 пар зубчатых долек. Стеблевые листья сидячие, более мелкие, также мелкорассеченные. Стебли заканчиваются соцветием - сложным щитком, состоящим из корзинок с белыми, реже кремовыми или малиновыми краевыми лепестками (рис.1). Часто встречается по окраинам полей, у дорог, в лесополосах [18].
Тысячелистник обыкновенный является оффицинальным видом и включен в X и XI Фармакопеи СССР [31,32]. Лекарственное сырьё в' соответствии с Государственной Фармакопеей СССР XI издания том 2 [32], статья 53 представляет собой:
А) Цельное сырьё - цельные или частично измельчённые цветоносные побеги, стебли округлые, опушепные, с очередными листьями, длинной до 15
Рис. 1. Тысячелистник обыкновенный - Achillea millefolium L. а - цветущее растение; б - соцветия; в - листья
-в
Рис.2. Тысячелистник щетинистый - Achillea setacea Waldst. et Kit. a - цветущее растение; б - соцветия; в - листья
см, листья дваждыперисторассеченные на ланцетные или линейные доли длиной до 10 мм, шириной до 3 мм, корзинки продолговато-яйцевидные, длиной 3-4 мм, шириной 1,5-3 мм, в щитковидных соцветиях или одиночные, обвертки корзинок из черепитчатых продолговато-яйцевидных листочков с перепончатыми буроватыми краями; краевые цветки пестичные, срединные -трубчатые обоеполые. Цвет стеблей и листьев серовато-зеленый, краевых цветков - белый, реже розовый, срединных - желтоватый. Запах слабый, ароматный. Вкус пряный, горьковатый.
Б) Измельченное сырьё - кусочки корзинок, отдельных цветков, листьев, стеблей различной формы, проходящих сквозь сито с отверстиями 0 7 мм. Цвет серовато-зеленый с беловато-желтоватыми вкраплениями. Запах слабый, ароматный. Вкус пряный, горьковатый.
Микроскопия. При рассмотрении листа с поверхности видны клетки эпидермиса, несколько вытянутые по длине дольки листа, с извилистыми стенками и складчатой кутикулой, эпидермис с нижней стороны отличается более мелкими клетками и сильно извилистыми стенками. Устьица с обеих сторон листа, преобладают на нижней, окружены 3-5 клетками эпидермиса (аномоцитный тип). На обеих сторонах листа, особенно на нижней, встречаются многочисленные волоски и эфирномасличные железки. Волоски простые, в основании имеют 4-7 коротких клеток с тонкими оболочками, конечная клетка волоска длинная, слегка извилистая, с толстой оболочкой и узкой нитевидной полостью, в сырье часто отломана. Железки состоят из 8 (реже 6) выделительных клеток, расположенных в 2 ряда и 4 (реже 3) яруса. Жилки листа сопровождаются секреторными ходами с желтоватым зернистым или маслянистым содержимым (рие.З).
Тысячелистник обыкновенный издавна применяют в народной и научной медицине как противовоспалительное при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и как кровоостанавливающее средство при маточных кровотечениях, геморрое [4,19,20].Трава тысячелистника обладает многосторонними
Рис.3. Препарат листа тысячелистника обыкновенного-Achillea mmefoHum L. х 280.
а - эпидермис нижней стороны; б - эпидермис верхней стороны.
1 -эфирномасличные железки; 2 - волоски; 3 - основание волоска; 4 проводящего пучка жилки; 5 - секреторные ходы.
сосуды
Рис.4. Препарат листа тысячелистника щетинистого-АсЫ11еа setacea Waldst. et Kit. x 280.
a - эпидермис нижней стороны; б - эпидермис верхней стороны. 1 -эфирномасличные железки; 2 - волоски; 3 - основание волоска; 4 - сосуды проводящего пучка жилки; 5 - секреторные ходы.
фармакологическими свойствами. Её употребляют для повышения аппетита, при желудочно-кишечных заболеваниях, желчек�
