Количественное определение микробных сообществ полости рта с использованием хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров

Струкова, Елена Геннадьевна

Количественное определение микробных сообществ полости рта с использованием хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Струкова, Елена Геннадьевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Красноярск МЕСТО ЗАЩИТЫ

2010 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Количественное определение микробных сообществ полости рта с использованием хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров»

Автореферат диссертации на тему "Количественное определение микробных сообществ полости рта с использованием хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров"

На правах рукописи

4843г1Л

СТРУКОВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ПОЛОСТИ РТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ МИКРОБНЫХ МАРКЕРОВ

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2упнз гт

Томск 2011

4843201

Работа выполнена на кафедре аналитической и органической химии Института цветных металлов и материаловедения Сибирского федерального университета и в лаборатории хроматографических методов анализа Центра коллективного пользования

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Ефремов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, доцент

Короткова Елена Ивановна

доктор химических наук, профессор Сидельников Владимир Николаевич

Ведущая организация: Химический факультет Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова

Защита состоится 9 февраля 2011 г. в 14.30 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.269.04 при Национальном исследовательском Томском политехническом университете по адресу: 634050 г. Томск, пр. Ленина, 30, ТПУ, 2 корпус, химико-технологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-технической библиотеке Национального Исследовательского Томского политехнического университета по адресу:

Томск, ул. Белинского, 53.

Автореферат разослан 15 декабря 2010 г.

Ученый секретарь совета, ГиндуллинаТ.М.

канд. хим. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Применение газовой хроматографии в биохимических целях сравнительно долго не получало должной оценки. Считалось, что биологические объекты недостаточно летучи и малоустойчивы к различным физико-химическим воздействиям, применяемым в газохроматографическом анализе. Успехи в разработке методов расщепления липидов, углеводов и белков до более простых компонентов и превращение их в летучие соединения открыли широкую область применения метода в биохимическом анализе.

Известно, что в процессе метаболизма микробные клетки производят низшие карбоновые кислоты, причем набор кислот является как бы «визитной карточкой» того или иного микроорганизма. Это способствовало появлению экспресс-метода на основе метода хромато-масс-спектрометрии (ХМС) определения микроорганизмов в биологических объектах. В основе метода лежит высокоточное определение специфических маркерных молекул, входящих в состав клеточных липидов микроорганизмов. Метод представляет собой идентификацию микроорганизмов по специфическим жирным кислотам в биологических объектах: крови, моче, биоптатах и других биологических жидкостях и тканях. К несомненным достоинствам метода относятся: информативность, чувствительность, определение труднокультивируемых микроорганизмов, возможность расширять перечень определяемых химических маркеров.

В данной работе проведен ряд исследований по созданию методики определения химических маркеров микроорганизмов в слизистой оболочке полости рта. Полость рта населена определенной микробиотой, которая несет защитные функции. Микробиота ротовой полости первой встречается с микроорганизмами и вирусами, попадающими в ротовую полость извне, и не пропускает их во внутреннюю среду, является показателем уровня «защитного порога» организма человека. Таким образом, слизистая оболочка ротовой полости является доступным объектом исследования и может использоваться для экспресс-диагностики ряда заболеваний.

Цель работы - создание методики хромато-масс-спектрометрического определения микроорганизмов по химическим маркерам в биологическом объекте с возможностью контроля подавления роста микроорганизмов эфирными маслами.

Задачи исследования:

1. Исследовать химические продукты метаболизма микроорганизмов (карбоновые кислоты, альдегиды, стерины, стеролы) населяющих слизистую оболочку полости рта и оценить возможности их использования в качестве специфичных маркеров микроорганизмов.

2. Разработать методику хромато-масс-спектрометрического определения состава микроорганизмов слизистой оболочки полости рта по количественному

Автор выражает искреннюю признательность д. б. н., профессору Осипову Г. А. за методическую помощь и постоянное внимание к диссертационной работе

содержанию специфичных химических микробных маркеров и провести оценку ее метрологических характеристик.

3. Определить химический состав эфирных масел растений Сибирского региона по данным хромато-масс-спектрометрического анализа с целью прогнозирования их бактерицидных свойств и выявления в них потенциально токсичных компонентов.

4. Оценить бактерицидную активность исследуемых эфирных масел при их прямом воздействии на чистые тест-культуры некоторых условно-патогенных микроорганизмов с использованием классического биохимического метода.

5. Оценить. антиоксидантную активность исследуемых эфирных масел по продуктам реакции ингибирования автоокисления низших альдегидов с использованием метода хромато-масс-спектрометрии.

6. Исследовать возможности разработанной методики хромато-масс-спектрометрического определения состава микроорганизмов на слизистой оболочки полости рта, для контроля подавления роста микроорганизмов эфирными маслами (оценки их бактерицидной активности).

Научная новизна полученных в работе результатов заключается в следующем:

1. Предложен способ определения микроорганизмов слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию химических микробных маркеров с использованием данных хромато-масс-спектрометрического анализа.

2. Установлена специфичная взаимосвязь между наличием определенных микроорганизмов, населяющих слизистую оболочку полости рта, и количественным составом выбранных химических маркеров.

3. Установлено влияние химического состава эфирных масел ряда дикорастущих растений Сибирского региона на их бактерицидную и антиоксидантную активность.

4. Предложено использование разработанного способа хромато-масс-спектрометрического определения микроорганизмов по количественному содержанию химических маркеров для контроля подавления роста микроорганизмов эфирными маслами.

Практическая значимость Разработана методика, позволяющая определить состав микробного сообщества слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию специфичных химических микробных маркеров с возможностью последующей оценки бактерицидной активности эфирных масел методом хромато-масс-спектрометрии, и оценены ее метрологические характеристики.

Создан электронный банк аналитических данных, содержащий масс-спектры электронного удара и хроматографические индексы удерживания по 157 соединениям - основным компонентам эфирных масел. Получены данные по антиоксидантной активности эфирных масел ряда дикорастущих растений Сибирского региона.

Определена минимальная бактерицидная концентрация этих эфирных масел по отношению к грамотрицательным и грамположительным условно-патогенным микроорганизмам.

Показана эффективность бактерицидного воздействия эфирного масла пихты сибирской на микрофлору слизистой оболочки полости рта лиц с хроническими заболеваниями верхних дыхательных путей, оцененная по результатам хромато-масс-спектрометрического анализа химических маркеров микроорганизмов. Все данные, полученные в работе, имеют многоцелевой характер и могут быть востребованы для прогноза воздействия эфирных масел на здоровье человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Специфические химические маркеры микроорганизмов населяющих слизистую оболочку полости рта.

2. Методику хромато-масс-спектрометрического определения состава микрорганизмов микробного сообщества слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию специфичных химических микробных маркеров и ее метрологические характеристики.

2. Компонентный химический состав эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона: пихты сибирской, сосны сибирской, дягиля лекарственного, мяты перечной, мелиссы лекарственной, укропа пахучего, тимьяна енисейского.

3. Бактерицидная активность эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона к чистым тест-культурам некоторых условно-патогенных микроорганизмов.

4. Антиоксидантная активность исследованных эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона, оцененная по продуктам реакции ингибирования автоокисления транс-2-гексеналя с использованием метода хромато-масс-спектрометрии.

5. Бактерицидное действие эфирного масла пихты сибирской на микроорганизмы слизистой оболочки полости рта путем отслеживания содержания химических маркеров микроорганизмов по хромато-масс-спе ктрометрическим данным.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на научных конференциях: на IV Всероссийской научной конференции «Новые достижение в химии и химической технологии растительного сырья» (2009 г., г. Барнаул), на III и IV научно-практической конференции «Химическая наука и образование Красноярья» (2009 г. и 2010 г., г. Красноярск), на Международной конференции «Экологии Южной Сибири и сопредельных территорий» (2009 г., г. Абакан), на симпозиуме с международным участием «Питание в профилактике социально-значимых заболеваний» (2009 г., г. Красноярск), на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010» (2010 г., г. Москва, Съезд аналитиков России «Аналитическая химия - новые

методы и возможности», (2010 г., г. Москва), на Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (2010 г., г. Краснодар).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе - 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, 3 глав, выводов, приложения и списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 184 страницах, включают 22 таблицы и 57 рисунков и 19 приложений. Список использованных источников включает 166 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, научная новизна и практическая значимость, сформулированы основные положения, выносимые на защиту. Приведены данные об апробации и публикации результатов исследования, а также о структуре и объеме диссертации.

Глава 1. Литературный обзор. Для изучения обмена веществ и химического состава микроорганизмов получили распространение различные способы хроматографии, масс-спектрометрия, метод изотопных индикаторов, электрофорез, электронная микроскопия и др. физические и физико-химические методы. Представлены данные об определении химических маркеров микроорганизмов методами хроматографии. Рассмотрены имеющиеся литературные данные в области хемодифференциации микроорганизмов, в частности, химические маркеры клеточных жирных кислот клеток микроорганизмов, история развития хемодифференциации в данной области. Приведена характеристика современного метода хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров и возможности оценки воздействия антимикробных препаратов в биологических объектах. Представлены данные об эфирных маслах, как о природных антимикробных средствах, приведены методы определения их бактерицидных свойств в модельных системах, определения химического состава и антиоксидантной активности. Предложен объект для исследования бактерицидной активности эфирных масел методом хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров на реальном объекте, обоснована актуальность проведения исследований в этой области.

Глава 2. Методическая часть. Представлены основные этапы разработки методики оценки и идентификации химических маркеров микроорганизмов слизистой оболочки полости рта, условия пробоподготовки, проведения анализа, а также, основные материалы и реагенты, используемые в данной работе. Подробно освещены методы определения бактерицидной активности эфирных масел методом серийных разведений в бульоне, антиоксидантной активности и установления химического состава эфирных масел методом хромато-масс-спектрометрии. Подробно описаны метрологические характеристики данной методики.

В работе использовали газо-жидкостный хроматограф Agilent Technologies 7890 А (США) с квадрупольным масс-спектрометром Agilent Technologies 5975 С в качестве детектора. Дано описание приемов работы с программными пакетами Chemstation и AMDIS.

Глава 3. Результаты и обсуждение. Анализ микробных сообществ слизистой оболочки полости рта человека методом хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров.

Известно, что микроорганизмы можно идентифицировать путем определения продуктов их метаболизма по входящим в их состав маркерам -жирным кислотам, альдегидам, стеринам. На основе имеющейся методики определения химических маркеров микроорганизмов методом хромато-масс-спектрометрии предложено разработать методику оценки химических маркеров слизистой оболочки полости рта человека.

Материал забора пробы. Показано, что наиболее универсальным зондом для отбора материала со слизистой оболочки полости рта является стерильный вискозный зонд, не имеющий мешающих примесей при дальнейшей пробоподготовке.

Отбор проб. Биологический материал слизистой оболочки полости рта отбирался квалифицированными медицинскими работниками с защечных пазух, так как по литературным данным, именно в этих точках локализуется наибольшее количество и видовое разнообразие микроорганизмов.

Пробоподготовка и анализ. Отобранный на стерильные зонды биологический материал подвергали серии химических превращений, в результате которых анализировали лишь метиловые эфиры жирных кислот, спирты и альдегиды. Пробу на зонде высушивали с добавлением 80 мкл метанола и подвергали кислому метанолизу в 1,2 н HCl в метаноле. Метанолиз проводили в 0,4 мл 1,2 н кислого раствора метанола в течение 45 мин при 80 °С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот и альдегидов из сложных липидов микроорганизмов и других клеток жидкости в виде метиловых эфиров и диметилацеталей. Для получения триметилсилильных эфиров оксикислот и стеролов сухой остаток обрабатывали - N,0-бис(триметил-силил)-трифторацетамидом в течение 9 мин при 80 °С. В качестве внутреннего стандарта использовали дейтерометиловый эфир тридекановый кислоты.

Условия хроматографического разделения: начальная температура 130 °С, выдержка при начальной температуре 0,5 мин, нагрев температуры со скоростью 7°/мин до 320 °С, выдержка при конечной температуре 6 мин. Газ-носитель гелий, поток 1,2 мл/мин в режиме без деления потока.

Для количественного определения химических маркеров микроорганизмов со слизистой оболочки полости рта предложено использовать режим регистрации селективных ионов (SIM), так как в результате проведенных исследований в сканирующем режиме по полному ионному току (SCAN) установлено, что в биологическом материале полости рта находится большое количество мешающих анализу примесей. Это хорошо заметно на

фрагментах хроматограмм одной пробы слизистой оболочки полости рта, записанной в разных режимах и представленной на рисунке 1.

Urne-а

Рисунок 1 - Фрагменты хроматограмм одной пробы, записанной при регистрации по полному ионному току (SCAN), и в режиме регистрации выделенных ионов (SIM)

Хроматограммы записывали в режиме регистрации выделенных ионов (SIM), при периодическом сканировании до тридцати ионов в пяти интервалах времени. Интервалы и ионы выбирали таким образом, чтобы селективно детектировать маркеры определяемых видов микроорганизмов. В том числе использовали характерный ион m/z = 87 в спектрах жирных кислот для детектирования малых количеств микробных кислот С12-С15, С17, С19. Ион 175 включают в каждый интервал, кроме пятого, для детектирования ß-оксикислот, для которых он специфичен и интенсивен в спектре. Также использование режима регистрации выделенных ионов позволяет значительно снизить «шум».

При хромато-масс-спектрометрическом исследовании фракций метиловых эфиров жирных кислот, альдегидов, стеринов в пробах слизистой оболочки полости рта найдены основные компоненты (на уровне содержания более 1% от максимального пика в хроматограмме) - кислоты с четным количеством атомов углерода: С 16:0, С18:0, С20:0 (в порядке уменьшения содержания в профиле жирных кислот), а также полиненасыщенные жирные кислоты: С20:п, С22:п, холестерин, ситестерол, насыщенные прямоцепочечные альдегиды и 2-гидроксикислоты. Кислоты с нечетным количеством С 15:0 и С 17:0 составляют около 1% каждая.

Перечисленные выше вещества являются липидными компонентами клеток организма человека и составляют естественный фон, на котором в исследованных пробах выявлены компоненты, специфичные для микробных клеток. На рисунке 2 представлен фрагмент хроматограммы, типичной для материала слизистой оболочки полости рта.

Зе+07

2.5е+07

2е-Ю7

1.5в+07

1е-Ю7

5000000

16:0

15:0 1

17:0

18:0

19:0

ц4

20:0 21:0 22:0 1,1 I

b-sitosterol

1 I ' ' 111 ■ 1 1 11 111 1 I 1 11 1 I * 1 1 ч ' 1 1 1 I ' 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00

Рисунок 2 - Типичная хроматограмма химических маркеров микроорганизмов слизистой оболочки полости рта по выделенным ионам

В результате проведенных исследований в пробах биологического материала слизистой оболочки полости рта идентифицировано 32 химических маркера микроорганизмов, в таблице 1 представлен качественный и количественный состав химических маркеров, соотнесенных с соответствующим типом микроорганизмов, приведены время удерживания и характерный ион, по которому вели регистрацию определяемых веществ. Таблица 1 - Качественный и количественный состав химических маркеров микроорганизмов (п-20)

№ Химические маркеры, (микроорганизм) Время удерживания Ион с, м кг/мл Проба, кл/гх10*5

1 Декановая кислота (Streptococcus) 4,36 87 0,92 212

2 Изолауриновая кислота (Peptostreptococcus anaerobius) 6,30 87 0,23 74

3 Антеизотридекановая кислота (Bacillus cereirs) 7,79 87 1,78 296

4 Изомиристиновая кислота (Streptomyces) 9,21 87, 270 7,31 296

5 Изотетрадеценовая кислота (Clostridium/Str. pneumonia) 9,32 87 0,64 48

6 Тетрадекановый альдегид (E.lentum 7741 (группа В)) 10,46 75 0,51 95

7 10-метил-тетрадекановая кислота (Actinomycetes) 10,46 87 0,13 22

Продолжение таблицы 1

8 Пентадеценовая кислота (Clostridium propionicum) 10,78 87 0,44 329

9 Антеизогептадекановый альдегид (Propionibacterium freudenreichii) 11,58 75 1,76 111

10 10-метилпентадекановая кислота (Актиномт/еты) 11,93 87 0,87 61

11 Изогексадеценовая кислота (Pseudonocardia) 11,82 87 0,73 43

12 7,8-гексадеценовая кислота (Clostridium ramosum) 12,37 87 1,29 698

13 9,10-гексадеценовая (Nocardia asteroides) 12,47 87 0,50 48

14 3-гидроксимиристиновая кислота (Fusobacterium/Haemophylus) 12,74 175, 315 0,09 33

15 10-метилгексадекановая кислота (Rhodococcus) 13,40 87 1,07 123

16 Изогептадекановая кислота (Staphylococcus intermedins) 13,60 87 1,41 356

17 Антеизогептадекановая кислота (Corineform CDC-group XX) 13,73 87 0,48 112

18 Гептадеценовая кислота (Mycobacterium/Candida) 13,81 87, 250 1,45 225

19 Гидроксипентадекановая кислота (Actinomyces viscosus) 14,18 175 0,16 129

20 Изооктадекановая кислота (Clostridium difficile) 14,99 298, 87 0,09 57

21 Цис-вакценовая кислота (Lactobacillus) 15,26 87 2,13 871

22 Гидроксипальмитиновая кислота (Prevotella) 15,54 175 0,70 51

23 Октадеценовый альдегид (Bifidobacterium) 15,80 75, 281 1,17 371

24 11,12-октадеценовый альдегид (Eiibacterium moniliforme, E.nodatum, E.sabureum) 15,93 75, 281 2,58 1278

25 Антеизотридекановая кислота (Staphylococcus) 16,49 87 0,07 35

26 11-эйкозеновая кислота (Streptococcus mutans) 17,96 87 0,77 113

Продолжение таблицы 1

27 Гидроксистеариновая кислота (Helicobacter pylori) 18,15 175, 273 0,05 51

28 10-гидроксистеариновая кислота (Clostridium perfringens) 18,11 273 0,09 32

29 Холестендиол (Herpes) 27,'78 456 0,66 67

30 Кампестерол (Микр грибы, кампестерол) 27,87 343 1,15 323

31 Холестадиенон (Цитомегачовирус) 28,10 382 0,27 60

32 Ситостерол-ß (Микр грибы, ситостерол) 29,45 396 16,9 7979

Предложенная методика была опробована на 20 здоровых добровольцах мужского пола, проживающих в Красноярске, в возрасте 18-20 лет, которая показала, что «среднестатистическая» микробиота выглядит следующим образом: преобладают такие химические маркеры микроорганизмов как Streptococcus, Eubacterium lentum (группа А), Clostridium propionicum, Staphylococcus intermedius, микроскопические грибы, ситостерол.

Существенно то, что некоторые микроорганизмы присутствуют в значительных количествах. К таким микроорганизмам относятся: Streptococcii spp, Clostridium propionicum, Lactobacillus spp, Corineform CDC-group XX, Mycobacterium/Candida, Eubacterium moniliforme, E.nodatum, E.sabureum, Staphylococcus spp, Bifidobacterium spp, Streptococcus mutans, Микр. грибы, ситостерол, Actinomyces viscosus. Самые опасный обитатель ротовой полости Streptococcus mutans, вызывающий кариес.

Метрологические характеристики методики определения химических маркеров микроорганизмов Подтверждением линейной зависимости между концентрацией определяемого соединения и площадью его хроматографического пика является близость по модулю к 1 коэффициентов корреляций соответствующих градуировочных графиков. Линейная зависимость сохраняется в диапазоне концентраций определяемых соединений 1 - 200 мкг/мл. В связи со спецификой определяемых компонентов (химические маркеры

микроорганизмов) верхняя граница диапазона в определяемых ■ метрологических характеристиках методики не является критической величиной. Так как количество микробных клеток, из которых непосредственно идет извлечение жирных кислот, альдегидов, оксикислот, стеринов в биологических материалах лимитируется общим числом клеток, химические маркеры которых локализируются в липидной оболочке в количестве 3-10%, не представляется возможным установить верхнюю границу диапазона.

Основные метрологические характеристики представлены в нижеприведенных таблицах.

Таблица 2 - Уравнения регрессии и значения коэффициентов корреляций градуировочных графиков для определения химических маркеров в МЭЖК (п = 10, Р = 0,95)___

Определяемое соединение Уравнение регрессии Коэффициент корреляции

Стеариновая кислота МЭ у=1,80-105х 0,998

Нанодекановая кислота МЭ у=2,42Т05х 0,998

Арахиновая кислота МЭ у=2,59 -Ю5х 0,998

Генейкозановая кислота МЭ у=2,6И05х 0,998

Бегеновая кислота МЭ у=2,40-105х 0,997

Таблица 3 - Предел обнаружения и ошибка определения метиловых эфиров (МЭ) жирных кислот

Определяемое соединение Предел обнаружения (Ш=3), м кг/мл Е,%

Стеариновая кислота МЭ 0,05 1,86

Нанодекановая кислота МЭ 0,05 2,83

Арахиновая кислота МЭ 0,05 3,14

Генейкозановая кислота МЭ 0,05 2,46

Бегеновая кислота МЭ 0,05 2,3

Таблица 4 - Контроль правильности количественного определения МЭЖК методом добавки определяемого компонента (п=5, Р = 0,95)__

Определяемое соединение Содержание (х), мкг/мл Б

введено найдено

х ± 5

Стеариновая кислота МЭ 5,0 5,0±0,2 0,16

20,0 20,0±0,1 0,08

Нанодекановая кислота МЭ 5,0 5,1±0,2 0,16

20,0 20,0±0,1 0,08

Арахиновая кислота МЭ 5,0 5,0±0,3 0,24

20,0 20,1±0,3 0,24

Генейкозановая кислота МЭ 5,0 5,0±0,3 0,24

20,0 20,0±0,2 0,16

Бегеновая кислота МЭ 5,0 5,0±0,2 0,16

20,0 20,2±0,1 0,08

Для оценки систематической составляющей погрешности методики был использован метод добавок. Для проверки правильности результатов анализа готовили холостые пробы с зондом пробоотбора и вводили известное количество модельной смеси и проводили анализ в соответствии с прописью методики (п=5) в условиях повторяемости.

Получение и изучение химического состава некоторых эфирных масел Сибирского региона

Для успешного применения эфирных масел в качестве антимикробных средств необходимо устанавливать их химический состав и особенно наличие или отсутствие ядовитых для организма человека веществ. В работе исследованы эфирные масла следующих дикорастущих растений Сибирского региона: пихты сибирской, сосны сибирской, можжевельника сибирского, дягиля лекарственного, мелиссы лекарственной, мяты перечной, укропа пахучего, тимьяна енисейского. Компонентный состав полученных масел установлен методом хромато-масс-спектрометрии по линейным индексам удерживания и масс-спектрам, а сами масла использованы для изучения их бактерицидной и антиоксидантной активности.

Для идентификации компонентов использовали стандартный алгоритм расчета индексов удерживания с использованием н-алканов в качестве внутреннего стандарта. Расчет индексов удерживания производили с использованием двух программных пакетов ChemStation и AMD1S. Программный пакет, выпускаемый фирмой Agilent Technologies, позволяет осуществлять поиск в базах масс-спектрометрических данных (в работе использовали коммерческие библиотеки N1ST08 и wiley07), выполнять расчеты соотношений компонентов в смеси, осуществлять количественный анализ и выполнять серии различных обработок.

В результате проведенных экспериментов создана библиотека масс-спектров электронного удара, содержащая 157 веществ, основных компонентов эфирных масел, проведено сравнение со справочными данными и определены индексы удерживания. Библиотека составлена в формате .MSL, позволяет использовать в программе AMD1S для расчета индексов удерживания, а также, идентифицировать компоненты сложных смесей эфирных масел.

С использованием электронной библиотеки исследован компонентный состав 8 эфирных масел Сибирского региона (компонент определялся при его содержании более 0,1 % от цельного масла):

- пихты сибирской - 53 компонента;

- сосны сибирской - 90 компонентов;

- можжевельника сибирского - 67 компонентов;

- дягиль лекарственный - 54 компонента;

- мелисса лекарственная - 26 компонентов;

- листья мяты перечной - 44 компонента;

- укроп пахучий - 21 компонент;

- тимьян енисейский - 59 компонентов.

Изучение бактерицидной активности эфирных масел на чистых тест-культурах условно-патогенных микроорганизмов методом серийных

разведений

В результате проведенных исследований определена минимальная бактерицидная концентрация эфирных масел по отношению к тест-культурам Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella 204, Acinetobacter calcoaceticus, Staphylococcus aureus 209, Staphylococcus aureus MRSA, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus. Для упрощенной оценки антисептической активности использовали фенольный коэффициент, который показывает, во сколько раз бактерицидность эфирного масла сильнее бактерицидное™ фенола, показатель последнего принят за единицу.

В результате проведенных исследований установлено, что различные эфирные масла обладают различной бактерицидной активностью по отношению в выбранным тест-культурам. Например, можжевельник сибирский проявляет бактерицидную активность к Acinetobacter calcoaceticus - 0,2 фенольного коэффициента, а по отношению к Escherichia coli фенольный коэффициент равен 10, таким образом бактерицидная активность изменяется в 50 раз. Установлено, что наибольшую активность эфирные масла проявляют к грамположительным микроорганизмам.

Следует отметить малые значения фенольного коэффициента эфирных масел, что свидетельствует о высокой бактерицидной активности в минимальных концентрациях.

Представляло интерес изучить воздействие эфирных масел в реальной модели (в слизистой оболочке ротовой полости человека), где существуют различные виды микроорганизмов в биопленке и определить тип воздействия эфирного масла на микроорганизмы. Для этой цели использовали эфирное масло пихты сибирской, бактерицидная активность которого варьируется в интервале 0,12 - 4 единиц фенольного коэффициента.

Хроматографическое исследование антиоксидантной активности эфирных масел

Зная химический состав масел и их бактерицидную активность, представляет интерес оценить антиоксидантную активность исследуемых эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона, получить наиболее полную информацию о влиянии вещества на процессы в организме.

Из существующего многообразия методов оценки антиоксидантной активности, нами выбран наиболее оптимальный, применимый для оценки эфирных масел - метод ингибирования автоокисления низшего альдегида в присутствии веществ - антиоксидантов.

Транс-2-гексеналь самоокисляется кислородом воздуха в течение 96 суток в соответствующую кислоту. При внесении в реакционную смесь с транс-2-гексеналем эфирного масла, можно оценивать антиоксидантную активность масла по замедлению процесса его самоокисления.

При оценке антиоксидантной активности эфирных масел тимьяна енисейского, мяты перечной и дягиля лекарственного обнаруживалось

появление спирта 2-гексенола, что может свидетельствовать о протекании также реакции восстановления транс-2-гексеналя.

Это свидетельствует о том, что при наличии эфирных масел тимьяна енисейского, мяты перечной и дягиля лекарственного часть альдегида окисляется, в часть восстанавливается:

[Н] „ [О]

Рисунок 3 - Одновременное окисление транс-2-гексеналя в 2-гексеновую кислоту и восстановление в 2-гексенол

Для оценки ингибирования окисления альдегида транс-2-гексеналя при концентрации 5 мкл/мл после 30 суток построен слудующий ряд активности эфирных масел: мелисса лекарственная > мята перечная > дягиль лекарственный > тимьян енисейский > укроп пахучий > пихта сибирская > можжевельник сибирский > сосна сибирская. Окисление замедляется в широком диапазоне от 99,1 до 38%. Сам транс-2-гексеналь окисляется до 50%, таким образом, пихта сибирская, сосна сибирская и можжевельник сибирский выступают прооксидантами. Наивысшей антиоксидантную активность в концентрации 5 мкл/мл обладают масла мелиссы лекарственной, мяты перечной, дягиля лекарственного и тимьяна енисейского. На рисунке 5 представлено замедление окисления транс-2-гексеналя в присутствии эфирного масла мелиссы лекарственной.

I -

св <

Си

<и

со

£ О.

и <4 о о

В Транс-2-гексеналь

0 Мелисса лекарственная 5 мкл/мл

В Мелисса лекарственная 25 мкл/мл

П Мелисса лекарственная 50 мкл/мл

О суток

20 суток

30 суток

Рисунок 4 - Содержание транс-2-гексеналя в модельных системах в присутствии различных концентраций мелиссы лекарственной

Ряд активности эфирных масел после 30 суток в концентрации 25 мкл/мл: тимьян енисейский > мелисса лекарственная = укроп пахучий > мята перечная > можжевельник сибирский > дягиль лекарственный > пихта сибирская > сосна сибирская. Окисление замедляется от 98% до 63,8%. Отмечено, что с

увеличением концентрации антиоксидантная активность возрастает. Максимальную антиоксидантную активность в концентрации 25 мкл/мл проявили эфирные масла тимьяна енисейского, мелиссы лекарственной, укропа пахучего и мяты перечной.

Ряд активности эфирных масел после 30 суток в концентрации 50 мкл/мл: мелисса лекарственная > мята перечная > сосна сибирская > укроп пахучий > тимьян енисейский > дягиль лекарственный > пихта сибирская > можжевельник сибирский. Окисление замедляется от 97,4% до 75,7%.

Таким образом, с увеличением концентрации эфирных масел увеличивается их антиоксидантная активность. Отмечена способность ингибировать окисление в минимальных испытуемых концентрациях для эфирных масел мелиссы лекарственной, мяты перечной, дягиля лекарственного и тимьяна енисейского.

Оценка бактерицидной активности эфирным масел на слизистую оболочку полости рта методом хромато-масс-спектрометрии микробных

маркеров

Предложено оценить бактерицидную активность эфирного масла пихты сибирской на химические маркеры микроорганизмов с применением разработанной методики оценки качественного и количественного состава химических маркеров микроорганизмов на слизистую оболочку полости рта.

Предложено рассматривать бактерицидное действие эфирного масла пихты сибирской на резидентную и условно-патогенную микробиоту полости рта: Lactobacillus, Mycobacterium/Candida, Eubacterium moniliforme, E.nodatum, E.sabureum, Nocardia asteroides, Actinomycete, Streptococcus, Clostridium ramosum, Rhodococcus, Staphylococcus, Streptococcus mutans, Propionibacterium reudenreichii, Staphylococcus intermedins.

На рисунке 5 представлены фрагменты хроматограмм, показывающих бактерицидное действие эфирного масла пихты сибирской на примере 7,8-

TlfTE-«-

Рисунок 5 - Фрагменты хроматограмм, показывающих уменьшение площади хроматографического пика 7,8-гексадеценовой кислоты химического маркера Clostridium ramosum

В результате проведенных исследований установлено, что у некоторых микроорганизмов снизилась концентрация химических маркеров, что свидетельствует о снижении численности микроорганизмов, данные представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Оценка бактерицидной активности 1%-го эфирного масла пихты сибирской на химические маркеры слизистой оболочки ротовой полости человека (п~5)____

Химический с, Микроорганизм Количество

маркер м кг/мл клеток в пробе

до после ДО после

х± 5 х± 5

Цис-вакценовая 2,12±0,01 1,02±0,03 Lactobacillus 867 489

кислота

9,10- 1,13±0,02 1,27±0,02 Nocardia asteroids 138 152

гексадеценовая

кислота

11-эйкозеновая 1,35±0,02 1,12±0,03 Streptococcus 311 256

кислота mutans

11,12- 1,80±0,04 0,65±0,02 Eubacterium 786 327

октадеценовый moniliforme

альдегид

7,8-гексадеценовый 1,9б±0,03 1,72±0,02 Clostridium 1004 979

альдегид ramosum

Из полученных результатов можно сделать следующие выводы:

- эфирное масло пихты сибирской оказывает бактерицидное действие как на чистые культуры условно-патогенных микроорганизмов, так и на микроорганизмы слизистой оболочки полости рта;

- отмечена закономерность снижения концентрации у химических маркеров: 11-эйкозеновой кислоты (маркер Streptococcus mutans), декановой кислоты (маркер Streptococcus), 11,12-октадеценовый альдегид (маркер Eubacterium moniliforme), антеизогептадеканового альдегида (Propionibacterium freudenreichii), цис-вакценовой кислоты (маркер Lactobacillus) и 7,8-гексадеценового альдегида (маркер Clostridium ramosum)\

- эфирное масло не изменяет состав нормальной микробиоту полости рта и способствует повышению защитного порога организма.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы хромато-масс-спектрометрические характеристики (времена удерживания и масс-спектры электронного удара) для специфических химических маркеров микроорганизмов населяющих слизистую оболочку полости рта, установлен качественный и количественный состав микробиоты включающий себя 32 микроорганизма.

2. Разработана методика хромато-масс-спектрометрического определения состава микроорганизмов микробного сообщества слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию специфичных химических микробных маркеров (жирных кислот, альдегидов, стеринов) и проведена оценка ее метрологических характеристик (линейный диапазон, повторяемость, точность, предел количественного определения и внутрилабораторная прецизионность).

3. Исследован химический состав использованных в работе эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона, создан электронный банк аналитических данных, содержащий масс-спектры электронного удара и хроматографические индексы удерживания по 157 соединениям, являющимся основными компонентами эфирных масел.

4. Изучена бактерицидная активность использованных в работе эфирных масел в зависимости от их концентрации по отношению к тест-культурам условно-патогенных микроорганизмов с использованием биохимического метода (путем) серийных разведений в бульоне. Установлено, что некоторые эфирные масла имеют бактерицидную концентрацию в 6-8 раз ниже значения фенольного коэффициента.

5. Установлено, что в случае модельной реакции автоокисления транс-2-гексеналя использованные в работе эфирные масла при концентрациях выше 25 мкг/мл обладают антиоксидантной активностью, которая достигает 97-98%, что свидетельствует о положительном воздействии эфирного масла при применении в ингаляциях.

6. Показана эффективность разработанной методики на примере изучения бактерицидной активности эфирного масла пихты сибирской к микробиоте слизистой оболочки полости рта, путем отслеживания содержания химических маркеров микроорганизмов по хромато-масс-спектрометрическим данным. Выявлено, что ингаляции эфирным маслом пихты сибирской приводит к снижению концентрации некоторых микроорганизмов (Streptococcus mutans, Streptococcus, Eubacteriiim moniliforme, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus, Clostridium ramosum), не изменяя состава нормальной микробиоты полости рта, способствует повышению защитного порога организма.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Е.Г. Струкова, А.А. Ефремов, А.А. Гонтова. JI.C. Соколова. Воздействие эфирных масел сибирского региона на условно-патогенные микроорганизмы // Химия растительного сырья. - 2009. -Вып.4.-С. 57-62.

2. А.А. Алякин, А.А. Ефремов, Е.Г. Струкова. Динамика выделения и компонентный состав эфирного масла тысячелистника обыкновенного пригорода Красноярска // Химия растительного сырья. - 2009. - Вып.4. -С. 51-56.

3. А.А. Ефремов, И.Д. Зыкова, Е.П. Федянина, Е.Г. Терещенко (Струкова). Компонентный состав эфирного масла лепестков роз / Мат. IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». - Барнаул. - 2009. -кН.2,-С. 115-117.

4. Е.Г. Терещенко (Струкова), А.А. Ефремов, С.В. Качин. Исследование бактерицидной активности эфирных масел некоторых дикорастущих растений Сибири / Мат. IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». - Барнаул. - 2009. - кН.2. - С. 143 - 145.

5. Е.Г. Струкова, А.А. Гонтова, А.А. Ефремов. Определение микрофлоры ротовой полости человека / Мат.международной конференции «Экология южной Сибири и сопредельных территорий». - Абакан. -2009.-Вып. 13.-Т.2.-С. 157- 158.

6. А.Н. Нарчуганов, Е.Г. Струкова, А.А. Ефремов. Сравнительное исследование компонентного состава эфирного масла Pinus Sibirica, полученного в разное время года / Мат.международной конференции «Экология южной Сибири и сопредельных территорий». - Абакан. -2009.-Вып. 13.-Т.1.-С. 38.

7. А.Н. Нарчуганов, Е.Г. Терещенко(Струкова), А.А. Ефремов. Идентификация компонентов эфирного масла лапки сосны сибирской методом хромато-масс-спектрометрии / Мат.Ш научно-практической конференции «Химическая наука и образование Красноярья». -Красноярск. - 2009. - С. 62 - 66.

8. Е.Г. Терещенко(Струкова), А.А. Ефремов, С.В. Качин. Минимальная подавляющая концентрация эфирных масел некоторых дикорастущих растений Сибири по отношению к тест-культурам Escherichia соИ, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris / Мат.Ш научно-практической конференции «Химическая наука и образование Красноярья». -Красноярск. - 2009. - С. 74 - 77.

9. Е.Г. Струкова, А.А. Ефремов. Определение микроэкологического статуса организма человека и диагностика инфекций с использованием метода масс-спектрометрии микробных маркеров / Мат.симпозиума с

международным участием «Питание в профилактике социально-значимых заболеваний». - Красноярск. - 2009. - С. 113-114.

10. Е.Г. Струкова, A.A. Гонтова. Разработка методики оценки микробных сообществ ротовой полости человека методом масс-спектрометрии микробных маркеров / MaT.XVII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - Москва. -2010.

11. Е.Г. Струкова, A.A. Ефремов, Г.А. Осипов, C.B. Качин. Определение микроэкологического статуса организма человека с использованием метода масс-спектрометрии микробных маркеров / Съезд аналитиков России и Школа молодых Ученых «Аналитическая химия - новые методы и возможности». - Москва. - 2010. - С. 285 - 286.

12. Е.Г. Струкова, A.A. Ефремов, A.A. Гонтова, Г.А. Осипов, Н.И. Сарматова. Возможности масс-спектрометрии микробных маркеров в определении микроэкологического статуса человека / Мат. IV Региональной научно-практической конференции «Химическая наука и образование Красноярья». - Красноярск. - 2010. - С. 115-119.

13. Е.Г. Струкова, A.A. Ефремов, A.A. Гонтова, Г.А. Осипов, Н.И. Сарматова. Определение микроэкологического статуса и диагностика инфекций организма человека с использованием метода хромато-масс-спектрометрии // Журнал Сибирского Федерального Университета. -Химия. - Т. 2. - Вып. 4. - 2009. - С. 351 - 358.

14. A.A. Ефремов, Е.Г. Струкова, А.Н. Нарчуганов. Компонентный состав эфирного масла лапки хвойных Сибирского региона по данных хромато-масс-спектрометрии // Журнал Сибирского Федерального Университета. - Химия. - Т. 2. - Вып. 4. - 2009. - С. 335 - 350.

15. Е.Г. Струкова, A.A. Ефремов. Антиоксидантная активность эфирных масел некоторых дикорастущих растений Сибирского региона / Мат. Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез». - Краснодар. - 2010. - 154 с.

16. Е.Г. Струкова, A.A. Ефремов, C.B. Качин. Метрологические характеристики методики хромато-масс-спектрометрического определения химических маркеров микроорганизмов // Журнал Сибирского Федерального Университета. - Химия. - Т. 3. - Вып. 3. -2010.-С. 278-284.

Подписано в печать 10.12.2010 Формат 60x84/16. Уч.-изд. л. 1,2 Тираж 110 экз. Заказ № 2786

Отпечатано:

Полиграфический центр Библиотечно-издательского комплекса Сибирского федерального университета

660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Струкова, Елена Геннадьевна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Применение метода масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) для идентификации микроорганизмов в биологических объектах

1.2. Природные антимикробные средства - эфирные масла, получение, химический состав

1.3. Бактерицидная активность эфирных масел

1.4. Антиоксидантная активность эфирных масел

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Оборудование

2.2. Материалы

2.3. Методы

2.3.1. Анализ химических маркеров микроорганизмов слизистой оболочки полости рта

2.3.2. Определение метрологических характеристик

2.3.3. Получение эфирных масел б

2.3.4. Определение состава эфирных масел по масс-спектрам и линейным индексам удерживания

2.3.5. Определение бактерицидной активности эфирных масел по отношению к чистым культурам микроорганизмов

2.3.6. Хроматографическое изучение антиоксидантной активности эфирных масел

2.3.7. Оценка эффективности бактерицидного действия эфирного масла на микробиоту полости рта

Глава 3. Результаты исследований

3.1. Хромато-масс-спектрометрическое исследование химических маркеров микроорганизмов слизистой оболочки полости рта

3.2. Метрологические характеристики аналитической методики определения химических маркеров микроорганизмов

3.3. Химический состав эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона

3.4. Бактерицидная активность эфирных масел по отношению к чистым культурам микроорганизмов

3.5. Антиоксидантная активность эфирных масел

3.6. Количественная оценка эффективности бактерицидного действия эфирного масла пихты сибирской на микробиоту слизистой оболочки полости рта

Выводы

Введение диссертация по химии, на тему "Количественное определение микробных сообществ полости рта с использованием хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров"

Актуальность.

Газовая хроматография используется во многих областях медицины и биологии: в экологии для определения содержания вредных примесей в воздухе, воде и пищевых продуктах: в токсикологии и судебной медицине - для диагностики отравлений техническими жидкостями (хлорпроизводными углеводородов, алкоголем и его суррогатами) и пестицидами самой различной структуры: в фармакологии и фармации для контроля качества препаратов, исследования метаболизма лекарственных средств [1 - 2].

Применение газовой хроматографии в исследовании биополимеров стало возможным после разработки методов расщепления липидов, углеводов и белков до более простых компонентов и превращение их в летучие соединения открыли широкую область применения метода в биохимическом анализе [3].

В исследовании липидов, в особенности жирных кислот, газовая хроматография произвела настоящую революцию и до настоящего времени не имеет альтернативы. Первым анализом, выполненным с помощью газовой хроматографии, стало определение Джеймсом и Мартином карбоновых кислот. В процессе метаболизма микробные клетки производят низшие карбоновые кислоты, причем набор кислот является как бы визитной карточкой того или иного микроорганизма [4-5].

Например, хотя культурально-биохимическим методом можно определять любые известные микроорганизмы, однако при рутинных клинических анализах оказывается практически не реальным оценить вклад трудно культивируемых микроорганизмов, прежде всего - анаэробов в инфекционно-воспалительном процессе из-за дороговизны и длительности процедуры. Иммуно-серологический метод является непрямым, поскольку выявляет не возбудителя, а иммунный ответ на него, который может иметь индивидуальные вариации. Известные молекулярно-биологические методы, при несомненных преимуществах - прямое определение возбудителя, высокие 5 специфичность и чувствительность, универсальность, скорость, возможность диагностики хронических и латентных инфекций — имеют такие серьезные недостатки, как частые ложноположительные результаты и невозможность адекватной количественной оценки [6, 7, 8].

Однако существует альтернативный способ определения микробных сообществ методом хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров. В основе метода лежит высокоточное определение специфических маркерных молекул, входящих в состав клеточных липидов микроорганизмов. Метод представляет собой идентификацию микробных сообществ по специфическим жирным кислотам методом хромато-масс-спектрометрии по селективным ионам [9].

Высокочувствительный и селективный метод газовой хроматографии -масс спектрометрии (ГХ-МС) позволяет одновременно измерять концентрации более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом материале: крови, моче, биоптатах и других биологических жидкостях и тканях, а также в небиологических пробах, минуя стадии предварительного посева на питательные среды или использование тестовых биохимических материалов [10].

Метод хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров является самым информативным и быстрым для оценки воздействия на большое количество микробных сообществ, например для оценки воздействия антимикробных средств на микробиоту. Существуют работы по оценке микробных сообществ методом хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров в различных экологических объектах [11, 12, 13], подробно исследована микробиота слизистой кишечника при различных заболеваниях [14, 15, 16], микроэкология кишечника и кожи [ 17, 18, 19, 20, 21, 22]. Метод разрешен Росздравнадзором для применения в качестве новой медицинской технологии (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010).

В данной работе проведен ряд исследований по созданию методики определения химических маркеров микроорганизмов в слизистой оболочке 6 полости рта. Полость рта населена определенной микробиотой, которая несет защитные функции. Микробиота ротовой полости первой встречается с микроорганизмами и вирусами, попадающими в ротовую полость извне, и не пропускает их во внутреннюю среду, является показателем уровня «защитного порога» организма человека. Таким образом, слизистая оболочка ротовой полости является доступным объектом исследования и может использоваться для экспресс-диагностики ряда заболеваний.

Ротовая полость густо заселена микроорганизмами, причем распределение микроорганизмов различно в зависимости от места локализации (миндалины, защечные пазухи, язык, зев) [23]. Слизистая оболочка полости рта является интересным объектом исследования, микробиота имеет большое количественное и видовое разнообразие. Микробная популяция полости рта выполняет двоякое значение: с одной стороны — роль биологического барьера, с другой потенциального резервуара аутоинфекции. Возможности проявления как защитных свойств этими микроорганизмами, так и их патогенности определяются состоянием всего организма и тканей полости рта [24, 25].

Задачи исследования:

2. Разработать методику хромато-масс-спектрометрического определения состава микроорганизмов слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию специфичных химических микробных маркеров и провести оценку ее метрологических характеристик.

5. Оценить антиоксидантную активность исследуемых эфирных масел по продуктам реакции ингибирования автоокисления низших альдегидов с использованием метода хромато-масс-спектрометрии.

Научная новизна полученных в работе результатов заключается в следующем:

Практическая значимость

Разработана методика, позволяющая определить состав микробного сообщества слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию специфичных химических микробных маркеров с возможностью последующей оценки бактерицидной активности эфирных масел методом хромато-масс-спектрометрии, и оценены ее метрологические характеристики.

Все данные, полученные в работе, имеют многоцелевой характер и могут быть востребованы для прогноза воздействия эфирных масел на здоровье человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Специфические химические маркеры микроорганизмов населяющих слизистую оболочку полости рта.

Апробация работы.

Работа выполнена на кафедре аналитической и органической химии и в в лаборатории хроматографических методов анализа Центра коллективного пользования Сибирского Федерального Университета.

По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе — 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

выводы

5. Установлено, что в случае модельной реакции автоокисления транс-2- -гексеналя использованные в работе эфирные масла при концентрациях выше 25 мкг/мл обладают антиоксидантной активностью, которая достигает 97-98%, что свидетельствует о положительном воздействии эфирного масла при применении в ингаляциях.

144

6. Показана эффективность разработанной методики на примере изучения бактерицидной активности эфирного масла пихты сибирской к микробиоте слизистой оболочки полости рта, путем отслеживания содержания химических маркеров микроорганизмов по хромато-масс-спектрометрическим данным. Выявлено, что ингаляции эфирным маслом пихты сибирской приводит к снижению концентрации некоторых микроорганизмов {Streptococcus mutans, Streptococcus, Eubacterium moniliforme, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus, Clostridium ramosum), не изменяя состава нормальной микробиоты полости рта, способствует повышению защитного порога организма.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Струкова, Елена Геннадьевна, Красноярск

1. Хроматография в биологии и медицине: сб. научн. трудов / под ред.

2. Р.Т. Тогузова, М.И. Савиной. Москва: 2-й МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова, 1985. — 158 с.

3. Яворская, С.Ф. Газовая хроматография — метод определения вредных веществ в воздухе и биологических средах: С. Ф. Яворская. М.: Медицина, 1972. - 236 с.

4. Митрука, Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине: Пер. с англ. / Б. М. Митрука. М.: Медицина, 1978. - 600 с.

5. Зеленин, К.Н. Газовая хроматография в медицине / К. Н. Зеленин // Соросовский образовательный журнал. — 1996. — № 11. — С. 20 — 22.

6. Литвинов, Л.Д. Газовая хроматография в биологии и медицине: Л. Д. Литвинов, Б. А. Руденко. М.: Медицина, 1971. - 280 с.

7. Persing, D. Н. Polymerase chain reaction: trenches to benches / D. H. Persing // J. Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29, № 7. - p. 1281 - 1285.

8. Пат. 2086642 Российская Федерация, C12N 1/00, 1/20, C12Q 1 /4. Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов / Г. А. Осипов ; Приоритет от 24 дек. 1993г.

9. Осипов, Г. А. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах / Г. А. Осипов, А. М. Демина // Вестник РАМН. 1996. - Т. 13, №2. - С. 52 - 59.

10. Турова, Е. С. Изучение структуры микробного сообщества, активного в биотрансформации минералов железа в каолине / Е. С. Турова, Г. А. Осипов // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 5. - С. 682 - 689.

11. Ручкина, И. Н. Роль острых кишечных инфекций и нарушений микробиоценоза в этиологии и патогенезе синдрома раздраженного кишечника: Диссертация доктора медицинских наук: 14.00.07 / Ручкина Ирина Николаевна. М., 2005. - 318 с.

12. Полеско, И. В. Клинико-патогенетические аспекты десквамативных поражений кожи: Диссертация доктора медицинских наук: 14.00.11 / Полеско Ирина Васильевна. М., 2009. - 169 с.

13. Ionescu, G. Abnormal fecal microflora and malabsorption phenomena in atopic eczema patients / G. Ionescu, R. Kiehl, L. Ona, R. Schüler // J. Adv. Med. 1990.-3.-p. 71-89.

14. Полеско, И. В. Спектрометрическое исследование состава микроорганизмов кишечника у больных себорейным дерматитом / И. В. Полеско, Ю. С. Бутов, Г. А. Осипов, В. В. Малиновская // Рос. журн. кож. и вен. бол. 2006. - № 3. - С. 23 - 27.

15. Ипатова, М. Г. Значение микробного фактора в развитии воспалительных заболеваний кишечника у детей / М. Г. Ипатова, Г. А. Осипов, С. С. Хромова // Четырнадцатая российская гастроэнтерологическая неделя. — Москва. — октябрь 2009. С. 29 — 32.

16. Парфенов, А. И. Коррекция микрофлоры кишечника пробиотиками у больных антибиотико-ассоциированной диареей / А. И. Парфенов, И. Н. Ручкина, Г. А. Осипов // Справочник поликлинического врача. — Т. 4. -№2.-2006.-С. 85-91.

17. Захаров, А. А. Анализ микрофлоры ротовой полости обследованных людей с различными заболеваниями / А. А. Захаров, Н. А. Ильина // Успехи современного естествознания. 2007. - № 12. - С. 353 - 355.

18. Хуснутдинова, JI.M. Микрофлора слизистой оболочки миндалин человека в норме при патологии / JL М. Хуснутдинова // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. — 2006. — №1. — С.60-63.

19. Chemical Methods in Bacterial Systematics: Eds M. Goodfellow. D.E. Minnikin. New York.: Academic Press. — 1985. — 410 c.

20. Осипов Г. А. Хромато-масс-спектрометрическое исследование микроорганизмов и их сообществ: Диссертация доктора биологических наук: 03.00.07 / Осипов Георгий Андреевич. — М., 1995. — 243 с.

21. Moss, С. W. Identification of microorganisms by gas chromatographic -mass spectrometric analysis of cellular fatty acids / C. W. Moss, S. R. Dees // ^Chromatography. 1985. - Vol.12. - P. 595 - 604.

22. Jantzen, E.Whole-cell and lipopolysaccharide fatty acids and sugars of gramnegative bacteria in Chem. methods in bacterial systematics: E. Jantzen, K. Bryn. NY.: Acad. Press. - 1985. - p. 145 - 172.

23. Andreev, L. V. Peculiarities of fatty acid composition of the genus Caulobacter/ L. V. Andreev, V. N. Akimov, D. I. Nikitin // Folia Microbiol -1986 Vol. 31 — p. 144- 153.

24. Вейант, Р. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий: Пер. с англ. / У. Мосс, Д. Холлис, Дж. Джордан, Э. Кук, М. Дейншвар. М. Мир, 1999. - с. 612 - 783.

25. Morgan, S.L. Profiling, structural characterization, and trace detection of chemical markers for microorganisms by gas chromatography mass spectrometry/ S. L. Morgan, A. Fox, J. Gilbart // J.Microbiol. Methods. -1989.-Vol. 9.-P. 57-69.

26. Larsson, L. Determination of microbial chemical markers by gas chromatography-mass-spectrometry potential for diagnosis and studies on metabolism in situ.// APMIS. - 1994. - 102. 3. - P. 161 - 169.

27. Maitza, S. K. Defermination of lipid A and endotoxin in serum by mass-spectroscopy / S. K. Maitza, M. C. Schotz, Т. T. Yoshikawa, L. B. Guze // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1978. - V.75. -P.3993.

28. Brandtzaeg, P. Meningococcal endotoxin in lethal septic shock plasma studied by gas chromatography, mass-spectrometry, ultracentrifugation and electron microscopy / P. Brandtzaeg, K. Bryn, P. Kierulf // J.Clin.Investig. 1992. -89.- P. 816-823.

29. Sud, I. J. Detection of 3-hydroxy fatty acids of picogram levels in biologic specimens. A chemical method for the detection of Neisseria gonorrhoael / I. J. Sud, D.S. Feingold // The Journal of Investigative Dermatology. — 1979. -V.73.-P. 521 -526.

30. Bronds, J. Chemotaxonomy at a crossroads? Gas chromatographic analysis of a single colony from the bacterium Haemophylus aphrophilus / J. Bronds, J. Olsen//J.Chrom.,Biomed.Appl. 1986. -Vol.374. -№1.- P. 119-124.

31. Larsson, L. Determination of ergosterol in organic dust by gas chromatography-mass spectrometry/ Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications // L. Larsson, A. Saraf, B. O. Axelsson. - 1995. - 666.1. - P. 77 - 84.

32. Larsson, L. Use of gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry for the detection and characterization of microorganisms in complex samples / L. Larsson, A. Saraf // Mol. Biotechnol. 1997. - 7.3. - P. 279 - 287.

33. Ferrando, R. 3-Hydroxy fatty acids in saliva as diagnostic markers in chronic periodontitis / R. Ferrando, B. Szponar, A. Sanchez, L. Larsson, and Valero-Guillen PL. // J Microbiol Methods. 2005. - Vol. 62. - 3. - P. 285 - 291.

34. Brondz, J. Microbial chemotaxonomy. Chromatography, electrophoresis and relevant profiling techniqnes / J. Brondz, J. Olsen // J. Chrom., Biomed. Appl. 1986.-Vol. 379.-P.367-411.

35. Goodfellow, M. Chemical methods in Procariotic Systematics: M. Goodfellow, A. G. O'Donnell. 1994. - UK.:John Willey and Sons. - P. 375411.

36. Stead, D. E. Evaluation of a commercial microbial identification system based on fatty acid profiles for rapid, accurate identification of plant pathogenic bacteria / D. E. Stead, J. E. Sellwood, J. Wilson, // J.Appl.Bacteriol. 1992. -72.- P. 315-321.

37. Nichols, P. D. Measurement of methanotroph and methanogen signature phospholipids for use in assessment of biomass and community structure in model system / P. D. Nichols, C. A. Mancuso, D. C. White // Org.Geochem. -1987. Vol. 11. - №6. - P. 451 - 462.

38. Shekhovtsova, N. V. Analysis of lipid biomarkers in rocks of the Archean crystalline basement / N. V. Shekhovtsova, G. A. Osipov, N. V. Verkhovtseva, L. A. Pevzner // Proceedings of SPIE. 2003. - Vol.4939. - P. 160 - 168.151

39. Schaechter, M. Mechanisms of Microbial Disease/ M. Schaechter, G. Medoff, B. J. Eisenstein // Williams & Wilkins. 1993. - P. 699.

40. McNabb, A. Fatty acid characterization of rapidly growing pathogenic aerobic actinomycetes as a means of identification / A. McNabb, R. Shuttleworth, R. Behme, W. D. Colby // J. Clin. Microbiol. 1997. - 35. - P. 1361 - 1368.

41. Manual of Clinical Microbiology. 5-th ed. Editor in Chief Albert Balows. -Washington: 1991.-P. 317-318.

42. Hattori, M. The Human Intestinal Microbiome / M. Hattori, T. D. Taylor //A New Frontier of Human Biology DNA RESEARCH. 2009. - №16. - P. 112.

43. Tsuchiya, H. Fligh-Perfomance Liquid Chromatographic analysis of bacterial fatty acid composition for chemotaxonomic characterization of oral streptococci / H. Tsuchiya, S. Masara, M. Kato // J. Clin.Microbiol. 1986. -Vol. 24.-№i.81 -85.

44. Томников, А. Ю. Микрофлора полости рта: учеб. методич. пособие / А. Ю. Томников, В. И. Корженевич ; Самара. — Самарский Государственный Университет. — 1996. — 17 с.

45. Николаев, Ю.А. Биопленка — «город микробов» или аналог многоклеточного организма? / Ю. А. Николаев, В. К. Плакунов // Микробиология. 2007. - Т. 76. - №. 2. - С. 149-163.

46. Медицинская микробиология : учеб. пособие для студ. мед. вузов ; под. ред. В. И. Покровского, О. К. Поздеева; Москва: ГЭОТАР МЕДИЦИНА. -1998.- 1200 с.

47. Шлегель, Г. Общая микробиология: Пер. с нем. / Г. Шлегель. М.: Мир. 1987-567 с.

48. Иоргенсен, Дж. X. Микробиологический справочник для клиницистов : Пер. с англ. / Дж. X. Йоргенсен, М. А. Пфайлер. М.: Мир. - 2006. - 243 с.

49. Janssen, А. М. Antimicrobial activities of essential oils / A. M. Janssen, J. J. Scheffer, A. Baerheim Svendsen // Pharmacy World & Science. — 2005. — №2. -P. 193 -197.

50. Faleiro, M.L., Antimicrobal activity of essential oils isolated from Portugese endemic species of THYMUS / Letters in Applied Microbiology // M. L. Faleiro, M. G. Miguel. 2003. - P. 35 - 40.

51. Sartoratto, Adilson. Composition and antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants sed in Brazil / Adilson Sartoratto, Ana Lucia M. Machado, Camila Delarmelina // Brazilian Journal of Microbiology. 2004. -№35.-P. 275-280.

52. Hammer, K. A. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts / K. A. Hammer, C. F. Carson , T. V. Riley // J. Appl. Microbiol. 1999. -Vol. 86. - №6. - P. 985 - 990.

53. Inouye, S. Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against respiratory tract pathogens by gaseous contact / S. Inouye, T. Toshio,

54. Yamaguchi // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. — 2001. — 47. — P. 565 -573.

55. Tabanca, N. Composition and antimicrobial activity of the essential oil of origanum&times / N. Tabanca, F. Demirci, T. Ozek //Chemistry of Natural Compounds.-2001.-37.-P. 238-241.

56. Beatriz, L. Antimicrobal activity of extracts, essential oil and metabolites obtained from Tagetes Mendocina / L. Beatriz // Journal of the Chilean Chemical Society. 2009. - vol.54. - №1. - P. 68 - 72.

57. Ezeugwu, Co. Antimicrobial Activity and Terpenoids of the Essential Oil of hyptis Suaveolens / Co. Ezeugwu, Okunji, R. Dale, M. S. Sanson, Tempesta // Pharmaceutical Biology. 1990. - Vol. 28. - №1. - P. 73 - 76.

58. Мишарина, Т. А. Антиоксидантные свойства эфирных масел лимона, розового грейпфрута, кориандра, гвоздики и их смесей / Т. А. Мишарина, A. JI. Самусенко // Приют, биохимия и микробиология. 2008. - Т. 44. -№4. - С. 482 - 486.

59. Мишарина, Т. А. Антиоксидантные свойства эфирных масел. Автоокисление эфирных масел лавра, фенхеля и их смеси с эфирным маслом кориандра / Т. А. Мишарина, А. Н. Полшков //Прикл. биохимия и микробиология. 2005. - Т.41. - №6. - С. 693 - 702.

60. Шутова, А. В. Оценка антиоксидантной активности экстрактов и эфирных масел пряно-ароматических лекарственных растений / А. В. Шутова // Растительные ресурсы. 2007. - Т. 43. - №1. - С. 112 - 125.

61. Лубосандоржиева, П. Б. Содержание биологически активных веществ в некоторых растениях Забайкалья и их антиоксидантная активность / П. Б. Лубосандоржиева // Химия растительного сырья. 2009. - №3. - С. 133 — 137.

62. Шилова, И. В. Антиоксидантная активность экстрактов надземной части лабазника вязолистного / И. В. Шилова, Е. А.Краснов, Е. И.Короткова, М. Г. Нагаев, А. Н. Лукина // Химико-фармацевтический журнал. 2006. - Т. 40.-№12.-С. 22-24.

63. Токин, Б. П. Фитонциды. Эксперимент. Исследования, вопросы теории и практики : Б. П. Токин. — М.: Госкультпросветиздат, 1975. — 176 с.

64. Токин, Б. П. Фитонциды : 2-е изд. / Б. П. Токин. М.: Изд-во АН СССР, 1951.-238 с.

65. Токин, Б. П. Фитонциды, их роль в природе : Б. П. Токин. — JL: Изд-во Ленингр. ун-та, 1957. 158 с.

66. Войткевич, С. А. Эфирные масла для парфюмерии и ароматерапии : С. А. Войткевич. — М.: Пищевая промышленность, 1999. — 284 с.

67. Ткачев, А. В. Исследование летучих веществ растений : А. В. Ткачев. -Н.: Изд-полиграф. пред. «Офсет», 2008. 969 с.

68. Обухов, А. Н. Дикорастущие лекарственные растения : А. Н. Обухов. -Краснод.: Краснодар, книж. изд-во, 1952. 347 с.

69. Солдатенков, А. Т. Основы органической химии душистых веществ для прикладной эстетики и ароматерапии : А. Т. Солдатенков, H. М. Колядина. М.: ИКЦ Академкнига, 2006. - 240 с.

70. Гринкевич, Н. И. Химический анализ лекарственных растений : Учеб. пособие для фармацевтических вузов / Н. И. Гринкевич, Л. Н. Сафранович. М.: Высш. школа, 1983. - 176 с.

71. Сур, С. В. Методы выделения, идентификации и определения терпеновых соединений / С. В. Сур // Химико-фармацевтический журнал. 1990. - Т. 24. - № 5. - С. 42 - 50.

72. Adams, R. P. Identification of Essention Oil by Gas Chromatography/ R. P. Adams // Mass Spectroscopy. — Allured publishing Corporation. — Illinois. — USA. 1995. -475 P.

73. Joulain, D. Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydracarbons : D. Joulain. -EB.: Verlag, 2001.-658 P.

74. Ткаченко, К. Г. Особенности переработки растительного сырья для увеличения выхода эфирных масел / К. Г. Ткаченко, И. Г. Зенкевич, М. М. Коробова // Растительные ресурсы. 1998. - Т. 34. - №3. - С. 129 -137.

75. Ткаченко, К. Г. Использование растворов неорганических солей для увеличения выхода эфирных масел методом гидродистилляции / К. Г. Ткаченко, И. Г. Зенкевич, М. М. Коробова // Растительные ресурсы. — 1998.-Т. 34. — №3. —С. 107-111.

76. Сур, С. В. Состав эфирных масел лекарственных растений / С. В. Сур // Растительные ресурсы. — 1993. Т.29. - вып.1. - С. 98 - 117.

77. Зюков, Д. Г. Технология и оборудование эфирномасличного производства : Д. Г. Зюков. — М.: Пищевая промышленность, 1979. — 191 с.

78. Pepeljnjaki, S. Antimicrobial activity of juniper berry essential oil (Juniperus communis L., Cupressaceae) / S. Pepeljnjaki, I. Kosalec, Z. Kalo // Acta. Pharm. 2005. - Vol.55. - P. 417-422.

79. Полуэктова, Т. В. Антимикробные свойства противоклиматического сбора / Н. Э. Коломиец, Г. И. Калинкина, М. Т. Джумаева // Бюллетень сибирской медицины. 2006. - Т.2. - С. 122- 125.

80. Малыхина, Т. В. Возможности применения эфирных масел в лечении и профилактике симптомов дисгормональной мастопатии и связанных с ней проблем / Т. В. Малыхина // Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2006. - Т.42. - №2. - С. 202 - 209.

81. Dunning, Trisha. Applying a quality use of medicines framework to using essential oils in nursing practice / Trisha Dunning // Complementary Therapies in Clinical Practice. 2005. - Vol.11. - Issue 3. - P. 172 - 181.

82. Schnaubelt, K. Essential oil therapy according to traditional Chinese medical concepts / K. Schnaubelt // International Journal of Aromatherapy. — 2005. — Vol.15.-Issue 2.-P. 98-105.

83. Wannissorn, B. Antibacterial properties of essential oils from Thai medicinal plants/ B. Wannissorn, S. Jarikasem, T. Siriwangchai, S. Thubthimthed // Fitoterapia. 2005. - Vol.76. - Issue 2. - P. 233 - 236.

84. Mantle, D. Comparison of methods for determination of total antioxidant status: application to analysis of medicinal plant essential oils / D. Mantle, G.156

85. John // Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 1998. - Vol.121. - Issue 4. - P. 385 - 391.

86. Hernandez, T. Antimicrobial activity of the essential oil and extracts of Cordia curassavica (Boraginaceae) / M. Canales, B. Teran, M. Canales, B. Teran // Journal ofEthnopharmacology.-2007.-Vol.111.— Issue l.-P. 137—141.

87. Maria, Rota C. Antimicrobial activity and chemical composition of Thymus vulgaris, Thymus zygis and Thymus hyemalis essential oils / Rota C. Maria, A. Herrera, Rosa M. Martinez //Food Control. 2008. - Vol.19. - Issue 7. - P. 681-687.

88. Shunying, Zhu. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oils of Chrysanthemum indicum / Zhu Shunying, Yang Huaidong, Zou Guolin // Journal of Ethnopharmacology. 2005. - Vol.96. - Issues 1-2. — P. 151-158.

89. Jianqing, Yu. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Scutellaria barbata / Yu Jianqing, Lei Jiachuan, Yu Huaidong, Cai Xuan, Zou Guolin // Phytochemistry. 2004. - Vol.65. - Issue 7 - P. 881 -884.

90. Gornemann, T. Antispasmodic activity of essential oil from Lippia dulcis Trev / T. Gornemann, R. Nayal, H. Pertz, F. Melzig // Journal of Ethnopharmacology. -2008.-Vol.117.-Issue 1.-P. 166-169.

91. Воробьёв, А. А. Медицинская и санитарная микробиология : А. А. Воробьёв, Ю. С. Кривошеин, В. П. Широбоков. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. 480 с.

92. Ozturk, Suzan. The chemical composition of essential oil and in vitro antibacterial activities of essential oil and methanol extract of Ziziphora persica

93. Bunge / Suzan Ozturk, Sezai Ercisli // Journal of Ethnopharmacology. — 2006. -Vol.106.-Issue 3.-P. 372-376.

94. Skocibusic, M. Antibacterial activity of Achillea clavennae essential oil against respiratory tract pathogens / M. Skocibusic, N. Bezic, V. Dunkic, A. Radonic // Fitoterapia. 2004. - Vol.75. - Issues 7-8. - P. 733 - 736.

95. Braca, A. Chemical composition and antimicrobial activity of Momordica charantia seed essential oil / A. Braca, T. Siciliano, M. D'Arrigo, M. Germano Paola // Fitoterapia. 2008. - Vol.79. - Issue 2. - P. 123 - 125.

96. George ,V. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil from the rhizomes of Amomum cannicarpum / V. George, J. Mathew, B. Sabulal, M. Dan, S. Shiburaj // Fitoterapia. 2006. - Vol.77. - Issue 5. - P. 392-394.

97. Коротяев, А. И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология : учеб. / А. И. Коротяев, Бабичев С.А. Спб.: СпецЛит, 2008. - 767 с.

98. Руководство к практическим занятиям по микробиологии : учеб. пособие / под редакцией Н. С. Егорова. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Изд-во МГУ, 1995. 224 с.

99. Tubaro, F. Analysis of plasma antioxidant capacity by competition kinetics / F. Tubaro, A. Ghiselli, P. Rapuzzi, M. Maiorino, F. Ursini // Free Radicals in Biology and Medicine. 1998. - Vol.24. - P. 1228-1234.

100. Lussignoli, S. A microplate-based colorimetric assay of the total peroxyl radical trapping capability of human plasma / S. Lussignoli, M. Fraccaroli, G. Andrioli, G. Brocco, P. Bellavite // Analytical Biochemistry. 1999. - № 269. -P. 38-44.

101. Krasovska, A. Chemiluminescence detection of peroxyl radicals and comparison of antioxydant activity of phenolic compounds / A. Krasovska, D. Rosiak, K. Czkapiak, M. Lukaszewicz // Current topics in Biophysics. — 2000. -Vol.24.-P. 89-95.

102. Cao, G. H. Oxygen Radical Absorbency Capacity Assay for Antioxidants /

103. G. H. Cao, H. M. Alessio, R. G. Cutler // Free Radicals In Biology And Medicine. 1993. - Vol.3. - №14. - P. 303 - 311.

104. Cao, G. H. Automated-Assay of Oxygen Radical Absorbency Capacity with the Cobas Fara-Ii / G. H. Cao, C. P. Verdon, A. H. B. Wu, H. Wang, R. L. Prior // Clinical Chemistry.- 1995. Vol.41. - P. 1738 - 1744.

105. Cao, G. H. Procyanidins, anthocyanins and antioxidant capacity in wines / G.

106. H. Cao, C. Sanchez-Moreno, R. L. Prior // Faseb Journal. 2000. - Vol.14. -P. A564-A564.

107. Cao, G. H. Hyperoxia-induced changes in antioxidant capacity and the effect of dietary antioxidants / G. H. Cao, B. Shukitt-Hale, P. C. Bickford, J. A. Joseph, J. McEwen, R. L. Prior // Journal of Applied Physiology. 1999. - V. 86.-P. 1817-1822.

108. Yang, X. F. Fe(II)-EDTA Chelate-Induced Aromatic Hydroxylation of Terephthalate as a New Method for the Evaluation of Hydroxyl Radical-Scavenging Ability / X. F. Yang, X. Q. Guo // The Analyst. 2001. - №126. -P. 928-932.

109. Labuda, J. Detection of Antioxidative Activity of Plant Extracts at the DNA

110. Modified Screen-Printed Electrode / J. Labuda, M. Buckovâ, L. Heilerovâ, A.160

111. Caniova-Ziakova, E. Brandsteterova, J. Mattusch, R. Wennrich // Sensors. — 2002.-Vol.2.-P. 1-10.

112. Korbut, O. Damage to DNA indicated by an electrically heated DNA-modified carbon paste electrode / O. Korbut, M. Buckova, P. Tarapcik, J. Labuda, P. Griindler // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2001. — Vol.506.-P. 143-148.

113. Короткова, E. И. Новый способ определения активности антиоксидантов/ Е. И. Короткова // Журнал физической химии. — 2000. — Т.74. №9. - С. 1544 - 1546.

114. Korotkova, Е. I. Study of antioxidant properties by voltammetry / E. I. Korotkova, Y. A. Karbainov, A. V. Shevchuk // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2002. - Vol.518. - № 1. - P. 56-60.

115. Yang, B. Estimation of the antioxidant activities of flavonoids from their oxidation potentials/ B. Yang, A. Kotani, K. Arai, F. Kusu // Analytical Sciences (Japan). 2001. - Vol. 17. - P. 599 - 604.

116. Psotova , J. Determination of total antioxidant capacity in plasma by cyclic voltammetry. Two case reports / J. Psotova , J. Zahalkova, J. Hrbac, V. Simanek, J. Bartek // Biomedical Papers. 2001. - Vol.145. - №2. - P. 81-83.

117. Ghiselli, A. A fluorescence- based method for measuring totalplasma antioxidant capability / A. Ghiselli, M. Serafini, G. Maiani, E. Azzini, A. Ferro-Luzzi // Free Radicals In Biology And Medicine. 1995. - Vol.18. - P. 29-36.

118. DeLange, R. J. Phycoerythrin fluorescence-based assay for peroxy radicals: a screen for biologically relevant protective agents / R. J. DeLange, A. N. Glazer // Analytical Biochemistry. 1989. - Vol.177. - P. 300 - 306.

119. Glazer, A. N. Phycoerythrin fluorescence-based assay for reactive oxygen species / A. N. Glazer// Methods of Enzymology. 1990. - Vol.186. - P. 161— 168.

120. Abella, A. A method forsimultaneous determination of plasma and erythrocyte antioxidant status. Evaluation of the antioxidant activity of vitamin161

121. E in healthy volunteers / A. Abella, C. Messaoudi, D. Laurent, D. Marot, J. Chalas, J. Breux, C. Claise, A. Lindenbaum // British Journal of Clinical Pharmacology. 1996.-Vol.42.- P. 737-741.

122. Benzie, I. F. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of «antioxidant power»: the FRAP assay / I. F. Benzie, J. J. Strain // Analitycal Biochemistry. 1996. - Vol.239. - P. 70 - 76.

123. Dasgupta, A. In vitro lipid peroxidation of human serum catalyzed by cupric ion: antioxidant rather than prooxidant role of ascorbate / A. Dasgupta, T. Zdunek // Life Sciences. 1992. - Vol.50. - P. 875 - 882.

124. Dat, J. F. Changes in Salicylic Acid and Antioxidants during Induced Thermotolerance in Mustard Seedlings / J. F. Dat, С. H. Foyer, I. M. Scott // Plant Physiology. 1998. - Vol.118. - P. 1455 - 1461.

125. Мишарина, Т. А. Антиоксидантные свойства эфирных масел / Т. А. Мишарина, М. Б. Теренина, Н. И. Крикунова // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. - Т.44. - № 4. - С. 482 - 486.

126. Мишарина, Т. А. Антиоксидантные свойства эфирных масел лимона / Т. А. Мишарина, М. Б. Теренина, Н. И. Крикунова, И. Б. Медведева // Прикладная биохимия и микробиология. — 2009. — Т.45. — №6. — С. 710 — 716.

127. Голубев, С. В. Компонентный состав эфирного масла пихты сибирской Красноярской лесостепи и Эвенкии / С. В. Голубев, И. Д. Зыкова, А. А. Ефремов // Мат. III конференции «Химическая наука и образование Красноярья». Красноярск. — 2009. - С. 12-15.

128. Федянина, Е. П. Химический состав эфирного масла тимьяна енисейского / Е. П. Федянина, А. А.Ефремов, JI. С. Соколова // Мат. III конференции «Химическая наука и образование Красноярья». — Красноярск. 2009. - С. 77 - 93.

129. Хасанов, В. В. Методы исследования антиоксидантов / В. В. Хасанов, Г. JI. Рыжова, Е. В. Мальцева // Химия растительного сырья. 2004. - №3. -С. 63-75.

130. Foti, М. С. Mechanism of inhibition of lipid peroxidation by y-terpinene, an unusual and potentially usefull hydrocarbon antioxidant / M. C. Foti, K. U. Ingold // J. Agric. Food Chem. 2003. - Vol.51. - № 9. - P. 2758 - 2765.

131. Huang, D. The chemistry behind antioxidant capacity assay / D. Huang, B. Ou, R. L. Prior // J.Agric. Food Chem. 2005. - Vol.53. - № 6. - P. 1841 -1856.

132. Lee, K. G. Determination of antioxidant potential of volatile extracts isolated from various herbs and spices / K. G. Lee, T. Shibamoto // J.Agric. Food Chem. 2002. - Vol.50. - № 15. - P. 4947 - 4952.

133. Yanagimoto, K. Antioxidative activity of fractions obtained from brewed coffee / K. Yanagimoto, H. Ouchi, K. G. Lee, T. Sibamoto // J.Agric. Food Chem. 2004. - Vol.52. - №3. - P. 592 - 596.163

134. Lee, S.-J. Identification of volatile components in basil (Ocinum basilicum L.) and thyme leaves {Thymus vulgaris L.) and their antioxidant properties / S.-J. Lee, T. Umano Shibamoto, K.-G. Lee // Food Chemistry. 2005. - Vol.91. -P. 131-137.

135. Акимов, Ю. А. Действие эфирных масел на патогенную микрофлору органов дыхания/ Ю. А. Акимов, И. Ф. Остапчук // «Симпозиум по эфиромасличным растениям и маслам». — Симферополь. — 1985. — кН. 2. — С. 42.

136. Леви, М. И. Быстрый метод определения чувствительности бактериальных культур к различным антибиотикам в жидкой среде / М. И. Леви, И. А. Горожанкина, Л. А. Сагатовская // Антибиотики. — 1967. — №1. С. 57-65.

137. Струкова Е.Г., Ефремов A.A., Гонтова A.A., Соколова Л.С. Воздействие эфирных масел сибирского региона на условно-патогенные микроорганизмы//Химия растительного сырья. 2009. № 4. С. 79-82.

138. ГОСТ Р ИСО 5725-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений . 6 частей — Введ. впервые; дата введ. 01.11.2002. М.: ИПК Издательство стандартов, 2002 - 350 с.

139. РМГ 61-2003 ГСИ. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки. Введ. впервые ; дата введ. 01.01.2005. — М.: ИПК Издательство стандартов, 2005. — 69 с.

140. ГОСТ Р 52361-2005 Контроль объекта аналитический. Термины и определения. Введ. Впервые ; дата введ. 01.01.2006. М.: ИПК Издательство стандартов, 2005. - 18 с.

141. Зозуля, Ю. А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга : Ю. А. Зозуля, В. А. Барабой, Д.

142. A. Сутковой. М.: Знание-М, 2000. - 344 с.

143. Донцов, В. И. Старение: механизмы и пути преодоления : В. И. Донцов,

144. B. Н. Крутько, А. А. Подколзин. М.: Биоинформсервис, 1997. - 89 с.

145. Осипов, А. Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А. Н. Осипов, О. А. Азизова, Ю. В. Владимиров //Успехи.биол.химии. -1990.-Т. 31.-С. 180-208.