Нивелирование влияния биологической матрицы при определении лекарственных препаратов в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

НИВЕЛИРОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ МАТРИЦЫ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Специальность 02.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

21 АВГ 2014

Санкт-Петербург 2014

005551856

005551856

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО "Санкт-Петербургский государственный университет"

Научный руководитель: Карцова Людмила Алексеевна

Доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты: Эпштейн Наталья Борисовна

доктор фармацевтических наук, доцент. Обнинский институт атомной энергетики Национального исследовательского ядерного университета МИФИ, кафедра фармацевтической и радиофармацевтической химии, заведующая кафедрой.

Стрельникова Елена Геннадьевна кандидат химических наук. Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, НИЛ хроматографии НИИ эндокринологии, старший научный сотрудник.

Ведущая организация: ФГБВОУ ВПО "Военно-медицинская академия

им. С.М. Кирова" МО РФ

Защита состоится 16 октября 2014 г., в 15:00 ч.

На заседании диссертационного совета Д 212.232.37 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43. Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета. Диссертация и автореферат размещены на сайте www.spbu.ru.

05 АВГ 2014

Автореферат разослан_2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

/ В.В.Панчук /

Актуальность:

При разработке методик определения лекарственных препаратов в плазме крови часто возникают проблемы, связанные с мешающим воздействием биологической матрицы на масс-спектрометрическое определение аналитов. Выявление подобных проблем и поиск путей их устранения весьма актуальны. Это связано, в первую очередь, с бурным развитием фармацевтической промышленности и, соответственно, возросшим интересом научного сообщества к изучению лекарственных веществ в биологических жидкостях.

Измерение концентрации лекарственных препаратов в биологических матрицах является важным аспектом получения фармацевтических данных. Они необходимы для регистрации в государственном реестре новых активных субстанций и дженериков. Результаты доклинических и клинических испытаний, включая исследования биоэквивалентности, используются для принятия важных решений, подтверждающих безопасность и эффективность лекарственного вещества.

Стремительное развитие фармацевтической отрасли требует разработки комплекса современных высокочувствительных валидированных методик определения как новых лекарственных препаратов, так и дженериков. Высокий уровень требований к подобным методикам строго регламентирован на международном уровне1. Однако наличие даже самой современной аналитической аппаратуры не гарантирует успеха без грамотного выбора процедуры пробоподготовки в связи с многокомпонентностью биологических матриц.

В современной практике определения лекарственных препаратов в биологических объектах наиболее предпочтительно использование методов ВЭЖХ и хромато-масс-спектрометрии. При этом компоненты биологической матрицы могут коэлюироваться с аналитами и обнаруживаться в виде различных мешающих эффектов: подавление ионизации, усиление аналитического сигнала, плохая сходимость для биообразцов различных доноров и др.

Большинство лекарственных веществ имеет высокую степень связывания с белками крови. Поэтому при изучении фармакокинетики определение лекарств рекомендуется проводить именно в плазме крови, которая имеет сложную матрицу, существенно отличающуюся по составу для разных доноров. Согласно международным рекомендациям Европейского Медицинского Агентства (ЕМА - European Medicines Agency) при

European Medicines Agency - Committee for Medicinal Products for Human Use. 2011.

использовании масс-спектрометрического детектирования матричный эффект должен быть оценен на образцах биологической матрицы не менее шести различных доноров.

В большинстве публикаций, посвященных определению лекарственных веществ в плазме крови, проблема влияния матрицы не нашла должного освещения.

Цель работы: Установление влияния матричных эффектов на результаты хромато-масс-спектрометрического определения лекарственных препаратов (цисплатина, сшденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина и 5-фторурацила) в плазме крови и поиск путей его устранения.

В данной работе в качестве аналитов представлены следующие фармацевтические средства: цисплатин и капецитабин - противоопухолевые препараты; силденафил -применяется при лечении эректильной дисфункции; циклосерин - антибиотик, включаемый в лекарственную терапию при лечении туберкулеза, ропинирол - средство против болезни Паркинсона. Их выбор обусловлен высокой терапевтической важностью и недостаточной изученностью.

Для реализации цели необходимо было:

1. Провести градацию матричных эффектов при хромато-масс-спектрометрическом определении лекарственных веществ в плазме крови.

2. Выявить характер матричного влияния при ВЭЖХ-МС определении цисплатина, силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина и 5-фторурацила в плазме крови.

3. Нивелировать матричные эффекты при определении всех упомянутых лекарственных веществ.

Научная новизна:

Предложен вариант устранения матричного эффекта, выражающегося в неудовлетворительной сходимости результатов для образцов плазмы крови различных доноров, при определении цисплатина в форме трехлигандного комплекса платины и диэтилдитиокарбамата (ООТС) - Р1(ООТС)з+; для обнаружения цисплатина в биологических жидкостях указанная аналитическая форма применена впервые.

Предложен способ устранения эффекта усиления аналитического сигнала при тандемном хромато-масс-спектрометрическом определении силденафила, основанный на выборе приемлемого осколочного иона (МЯМ-переход 475—>58).

Выявлена проблема нарушения линейности градуировочной зависимости, связанная с влиянием компонентов биологической матрицы на ионизацию в масс-спектрометрии, и предложены способы устранения указанного эффекта за счет снижения объема вводимой пробы при определения циклосерина и выбора сорбционного концентрирования на

катионообменном сорбенте Waters Oasis МСХ для пробоподготовки плазмы крови при определении ропинирола.

Применен прием перевода сорбента в аммонийную форму при сорбционном концентрировании циклосерина и ропинирола из плазмы крови на катионообменном сорбенте Waters Oasis МСХ. В предложенном приеме ионы аммония используются в качестве конкурирующего агента, который снижает потенциальную возможность взаимодействия молекул аналита с сорбентом, что облегчает элюирование и позволяет увеличить степень извлечения аналитов.

Установлено, что использование сверхсшитого полистирола PuroSep 200 при сорбционном концентрировании позволяет устранить матричный эффект подавления ионизации при одновременном определении капецитабина и 5-фторурацила в плазме крови, а также обеспечить высокие степени извлечения аналитов (98±2% - для капецитабина и 84±1% - для 5-фторурацила).

Практическая значимость работы:

Разработана и валидирована в соответствии с международными требованиями методика количественного хромато-масс-спектрометрического определения цисплатина в плазме крови. Предложенная методика апробирована при изучении общей токсичности при проведении изолированной перфузии легкого цисплатином (совместно с НИИ Онкологии им. Петрова).

Разработаны и валидированы в соответствии с международными критериями методики определения силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина и 5-фторурацила в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии. С применением разработанных методик проведены клинические исследования биоэквивалентности в биоаналитическом центре «ЦКП «Аналитическая Спектрометрия».

Положения, выносимые на защиту:

1. Способы устранения матричных влияний при хромато-масс-спектрометрическом определении цисплатина, силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина, 5-фторурацила в плазме крови;

2. Перевод сорбента Waters Oasis МСХ в аммонийную форму при сорбционном концентрировании как способ решения проблемы сильного связывания аналита с сорбентом при определении циклосерина и ропинирола.

3. Реализация найденных методических решений в фармакокинетических исследованиях лекарственных средств.

Публикации и апробация работы:

Материалы диссертации опубликованы в 4 статьях и 8 тезисах. Результаты исследований докладывались на V Всероссийской конференции студентов и аспирантов с международным участием «Химия в современном мире» (2011, СПб); XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (2011, Волгоград); VI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012» (2012, СПб); Всероссийском симпозиуме «Кинетика и динамика обменных процессов» (2012, Краснодарский край); XVII Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (2012, СПб); VII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2013» (2013, СПб); Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (2013, Краснодар); VIII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2014» (2014, СПб).

Структура и объём работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 3 глав с обсуждением полученных результатов, списка принятых сокращений и используемых биомедицинских терминов, заключения и списка цитируемой литературы (135 наименований). Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 62 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении дано обоснование актуальности темы и сформулированы цели исследования. Отмечена необходимость изучения матричных эффектов, возникающих при определении лекарственных препаратов в биологических жидкостях (плазма крови) методом хромато-масс-спектрометрии и обоснована важность поиска путей устранения мешающего влияния компонентов биологической матрицы при разработке методик для проведения клинических испытаний.

1-ая глава (Обзор литературных данных) включает разделы, содержащие общие требования к физико-химическим методам, применяемым при проведении клинических исследований (иммунологических, хроматографических, масс-спектрометрических); преимущества ВЭЖХ-МС/МС перед остальными методами при получении фармакокинетических данных и проблемы количественного определения лекарственных средств, вызванные мешающим влиянием компонентов биологической матрицы.

Во 2-ой главе описываются экспериментальные характеристики и процедуры разработанных и валидированных методик анализа плазмы крови для определения лекарственных препаратов цисплатина, силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина и 5-фторурацила.

В 3-ей главе предметом обсуждения является выявление и устранение матричных эффектов, приводящих к неудовлетворительной сходимости результатов анализа при

хромато-масс-спектрометрическом определении цисплатина, силденафила, капецитабина и 5-фторурацила в плазме крови различных доноров.

При разработке методики хромато-масс-спектрометрического определения противоопухолевого препарата цисплатина для его идентификации в плазме крови на основании литературных [I]2 рекомендаций получен двухлигандный комплекс платины и диэтилдитиокарбамата (ОЭТС) по реакции:

В ходе предварительных экспериментов для извлечения комплекса Pt(DDTC)2 из плазмы крови разработана процедура сорбционного концентрирования комплекса на гидрофильно-липофильном сорбенте Oasis HLB, включающая стадии промывки сорбента 50%-ым раствором метанола после загрузки образца для удаления компонентов биологической матрицы и элюирования комплекса платины ацетонитрилом.

При этом возникла проблема, связанная с проявлением матричного эффекта: наблюдалась плохая сходимость значений матричного фактора MF для комплекса Pt(DDTC)2 при его определении в плазме крови различных доноров (табл.1). Для оценки эффекта матрицы вычисляли значение матричного фактора MF как отношение площади аналита при вводе пробы в присутствии матрицы и в её отсутствии с использованием 12 образцов плазмы крови различных доноров:

, где 5] - площадь пика для пробы с добавкой аналита в матрицу после её пробоподготовки, Бг - площадь пика для стандартного раствора аналита.

[1] P.A.Andrews, W.E.Wung, S.B.Howell. A high-performance liquid chromatographic assay with improved selectivity for cisplatin and active platinum (II) complexes in plasma ultrafiltrate // Analytical Biochemistry. 1984, V.143, P. 46-56.

MF= —

S2

По величине показателя MF судят о влиянии матрицы на итоговый результат. Если значения MF близки к единице, матричные эффекты отсутствуют. Если этот параметр меньше 1, имеет место подавление ионизации. Если же величина матричного фактора превышает 1, наблюдается усиление аналитического сигнала.

При определении цисплатина матричное влияние выражалось высоким значением коэффициента вариации (CV - coefficient of variation) при сопоставлении показателей MF для образцов плазмы крови 12 различных доноров, определяемый по формуле:

Согласно международным критериям, установленным Европейским Медицинским Агентством, значение СУ не должно превышать 15%.

В поисках решения описанной проблемы предпринята попытка усовершенствования процедуры комплексообразования. А именно, получен трёхлигандный комплекс платины и диэтилдитиокарбамата Р1Ш1УГС)з+, который образуется в ходе реакции:

В результате предварительных экспериментов найдены условия получения данного комплекса. При усовершенствовании процедуры получения комплекса цисплатина и диэтилдитиокарбамата варьировали: концентрацию раствора реагента ДДТК (5-50%) в 0,2 М растворе №ОН, соотношение объемов раствора цисплатина и реагента, температуру (20-50°С) и время реакции (20 - 70мин), природу органического растворителя (хлороформ, гексан, гептан, этилацетат) и его объем для проведения жидкостной экстракции комплекса. При выборе соотношения объемов пробы и раствора ДДТК учитывали, что минимальный объём плазмы крови, необходимый для анализа, составляет 500 мкл.

Наилучшим соотношением раствора цисплатина и раствора ДДТК в 0,2 М растворе КаОН, при котором площадь хроматографического пика аналита максимальна, а влияние примесных компонентов минимально, оказалось соотношение 1:1 (объемн.), а концентрация раствора реагента - 25% (рис. 1).

CV(%) = = -100,

- среднеквадратическое отклонение.

2PtCl2(NH3)2 + 6Na(DDTC) + 2Н20 + 02

2Pt(DDTC)3+ ОН" + 2NaOH + 4NH3 + 4NaCl

Й SESSUBffii =Я!ЙК:

- 30% DDTC

25% DDTC

„ 20% DDTC

Рис. 1. Влияние концентрации ДЦТК в растворе на площадь хроматографического пика образующегося комплекса Pt(DDTC)3+

Условия: хромато-масс-спектрометр Agilent 1100, колонка REPROSYL-PUR С18-AQ, п.ф. 85% CH3CN, 15мМ аммонийно-ацетатный буфер (рН 4), скорость потока 300 мкл/мин, объем ввода 10 мкл, SIM: 639,2

Установлено влияние температуры и времени проведения реакции на площадь хроматографического сигнала комплекса РЦОШ"С)з+ (рис.2). Так при проведении реакции при комнатной температуре (25°С) достигнутые площади пика аналита были существенно ниже, чем при 45°С. Однако уже при 50°С через 30 минут начинался процесс разрушения комплекса Р1:(ООТС)з+, о чем свидетельствует снижение значений площади пика аналита. В результате выбраны наиболее подходящие время и температура реакции - 45°С и 50 мин.

Подтверждение структуры комплекса проведено с

600000 500000

[

' 400000 I 300000

о 200000

5

40 50

Время, мин

использованием тандемного масс-

спектрометрического анализа на приборе Shimadzu IT-TOF

—•— 25'С —•— 45'С 50'С

(рис.3). В масс-спектре

Рис. 2. Зависимость площади хроматографического детектируется ион СИГНала комплекса Pt(DDTC)3+ от времени реакции при m/z 638,9 (Pt(DDTC)3+), различных температурах.

который в тандемном режиме фрагментируется с образованием осколка с m/z 490,9, содержащего платину и две молекулы DDTC (рис.3, а). Спектр на рисунке 3 (б) дает информацию о более глубокой фрагментации - осколочного иона m/z 490,9. В нём сигнал m/z 343,9 соответствует протонированному остатку после отрыва ещё одного лиганда DDTC, т. е. [Pt(DDTC)+H]+, а сигнал та/г 419,9 характеризует протонированный осколок после потери фрагмента N(C2H5)2. Предполагаемое строение трехлигандного комплекса платины и диэтилдитиокарбамата представлено на рис.4.

В результате такого подхода матричный эффект был устранен, что надежно подтверждено на образцах плазмы крови 12-ти различных доноров. Коэффициент вариации уменьшен с 34% для комплекса Р^ОТСЬ до 5% в случае комплекса Р1:(ООТС)з+ (табл. 1). Кроме того, судя

по отклонению среднего значения матричного фактора MF от 1 (MF=0,67) при определении цисплатина в форме двухлигандного комплекса наблюдалось подавление ионизации. При регистрации трехлигандного комплекса для

определения цисплатина подобный Рис. 3. МС/МС-спектры ионов m/z 638,9

.г , . , (А) и m/z 490,9 (Б)

эффект не обнаруживался (табл. 1).

Вероятно, это связано с меньшим влиянием коэлюирующихся матричных компонентов в ионном источнике масс-спектрометра на ионизацию комплекса Pt(DDTCb+ по сравнению с двухлигандным комплексом.

УЧ.

v < I

Рис. 4. Предполагаемая структура комплекса

Таким образом предложен неописанный ранее вариант устранения матричного

эффекта при определении цисплатина в плазме крови с помощью получения

трехлигандного комплекса платины и диэтилдитиокарбамата. Подобный подход может

10

Таблица 1. Сравнение матричных факторов и коэффициентов вариации для двух аналитических форм определения цисплатина

Аналитическая форма MF (среднее) (n=12) Коэффициент вариации, %

Pt(DDTC)2 0.67±0.23 34

Pt(DDTC)3+ 0.93±0.05 5

быть применен при проявлении матричного эффекта и при определении близких по строению и свойствам цисплатину препаратов, таких как карбоплатин, оксалиплатин и др.

Разработанная методика валидирована в соответствии с международными требованиями и применена при исследовании общей токсичности при проведении изолированной перфузии легкого раствором цисплатина на 15 добровольцах. Дозировка препарата составила 250 мг.

Проблема плохой сходимости результатов обнаружилась и при тандемном хромато-масс-спектрометрическом определении препарата силденафила, несмотря на тщательно разработанную процедуру пробоподготовки. Для извлечения силденафила из плазмы крови предпочтение было отдано сорбционному концентрированию. Испытаны различные сорбционные материалы - гидрофобный Sep-Pak tC18, катионообменный Oasis МСХ, гидрофильно-липофильный Oasis HLB - и элюирующие системы. Во всех случаях достигнуты высокие степени извлечения препарата (90-100%) (табл.2).

Таблица 2. Сравнение степеней извлечения силденафила из плазмы крови с применением различных сорбционных материалов

Сорбционный материал Sep-Pak tC18 (гидрофобные взаимодействия) Oasis МСХ (катионообменные взаимодействия) Oasis HLB (гидрофильно-липофильный баланс)

Степень извлечения, % (п=10) 95 ±4 98 ±6 90 ±6

Степень извлечения аналита вычисляли по формуле:

с^ , где Я - степень извлечения (%), 81 - площадь пика в пробе с добавкой

К =—1-. Ю0 аналита до пробоподготовки, Э1 - площадь пика в пробе с добавкой аналита после пробоподготовки.

Однако чистота полученных экстрактов заметно отличалась (рис.5).

Лучшая селективность извлечения силденафила достигнута с использованием сорбента

Бер-Рак Ю18 - эндогенные компоненты матрицы не обнаруживались при УФ-контроле.

Несмотря на то, что возможное влияние матрицы максимально устранено уже на данном

этапе, проблема возникла и в этом случае. Коэффициент вариации при тандемном

определении силденафила с детектированием по МЯМ-переходу т/г 475 —» 282 оказался

11

большим - 46%. Предпринят поиск другого осколочного иона, образующегося при MRM-переходе m/z 475 —> 58, при котором обозначенный эффект не наблюдался (рис.6).

1 1

1 / i

/ Oasis HLB

1

к.

-——-— ______

1

Sep-Pak (Cte

» 3 > , i

Рис. 5. Хроматограммы экстрактов плазмы крови после извлечения и очистки на сорбентах Oasis HLB - гидрофильно-липофильный (/), Oasis МСХ - катионообменный (2) и Sep-Pak tC18 - гидрофобный (3) (увеличен диапазон времени удерживания силденафила S).

Условия: жидкостный хроматограф Agilent с УФ-яетектором, колонка Agilent Eclipse Plus С18, подвижная фаза 40 об. % CH3CN - 60 об. % 40 мМ ацетатно-аммонийного буферного раствора (рН 7), скорость потока 300 мкл/мин, длина волны детектора 290 нм.

Для оценки матричного эффекта при определении силденафила для каждого из MRM-переходов вычисляли значение матричного фактора MF по приведенной ранее формуле для 12 образцов плазмы крови различных доноров, а также оценивали коэффициент вариации (табл.3).

Таблица 3. Сравнение матричных факторов и коэффициента вариации при определении силденафила в плазме крови при использовании двух различных МЯМ-переходов.

MRM-переход Среднее значение матричного фактора MF Коэффициент вариации CV, %

m/z 475—>282 1,34±0,62 46

m/z 475—>58 0,89±0,04 4

Разработанная методика включала процедуру сорбционного концентрирования на сорбенте Бер-Рак 1С 18 со степенью извлечения силденафила 95±4%, который был выбран на основании получения экстракта с наименьшим содержанием сопутствующих компонентов.

Рис. 6. Масс-спектр силденафила в режиме scan 470-480 m/z (А); МС/МС-спектр силденафила (scan 50-60 m/z) (Б); МС/МС-спектр силденафила (scan 280-290 m/z) (В)

Разработка методики одновременного определения противоопухолевого препарата капецитабина и его основного метаболита 5-фторурацила (рис.7) представила наибольшие трудности: матричные эффекты проявлялись как в подавлении ионизации, так и в плохой повторяемости значений матричных факторов для образцов плазмы крови различных доноров.

Рис. 7. Структурные формулы капецитабина (слева) и 5-фторурацила (справа)

Существенное различие в свойствах этих аналитов затрудняло их совместное извлечение из биологической жидкости. Варьировались природа (метанол, ацетонитрил, трихлоруксусная кислота) и количество реагентов для осаждения белков, условия жидкостно-жидкостной экстракции (этилацетат, гексан, метилт^етбутиловый эфир) и сорбционного концентрирования. Тем не менее после пробоподготовки плазмы крови с добавкой капецитабина и 5-фторурацила при масс-спектрометрическом анализе образцов наблюдалось сильное подавление ионизации вплоть до полного отсутствия аналитических сигналов (MF—>0). Ни один из опробованных сорбционных материалов (Sep-Pak tC18, Oasis HLB, Oasis WCX, Oasis MCX, Oasis MAX) не обеспечил полного и одновременного удерживания капецитабина и 5-фторурацила при загрузке образца.

Проблема была решена в процессе сорбционного концентрирования на сверхсшитом полистироле Purosep 200: достигнуты высокие степени извлечения - 98±2% для капецитабина и 84±1% для 5-фторурацила, и практически полностью устранен матричный эффект.

4-ая глава посвящена еще одному обнаруженному нами эффекту проявления матрицы - нарушению линейности градуировочной зависимости, что выявлено на высоких концентрационных уровнях при определении ропинирола — препарата, применяемого при болезни Паркинсона (рис.8).

Следует подчеркнуть, что это вызвано не перегрузкой колонки. Данный эффект проявлялся исключительно для образцов плазмы крови, в то время как для водных стандартных растворов линейность градуировки не нарушалась. Причиной могли быть конкурентные процессы за ионизацию между молекулами аналита и компонентами матрицы.

На рис. 8 сплошной обозначена линия тренда, вычисленная по методу наименьших квадратов.

Пунктирная линия соединяет экспериментальные градуировочные точки. При увеличении концентрации ропинирола линейность градуировочной зависимости нарушается. Решение этой проблемы независимо осложнялось еще и крайне низким требуемым пределом определения аналита - 10 пг/мл.

От жидкостно-жидкостной экстракции при извлечении ропинирола из плазмы крови мы отказались в пользу сорбционного концентрирования на катионообменном сорбенте Oasis МСХ, обеспечившим получение экстрактов с минимальным содержанием сопутствующих компонентов. Эффект нарушения линейности градуировочной зависимости в этом случае уже не проявлялся (рис. 9).

Подобная проблема -нарушение линейности возникла и при хромато-масс-спектрометрическом определении препарата

циклосерина (рис. 10).

Подготовка пробы к анализу включала, как и в предыдущем случае,

сорбционное

концентрирование на катеоните Oasis МСХ - полимере со смешанной обращенно-фазовой

Рис. 8. Проявление «эффекта нарушения линейности» градуировочной зависимости при определении ропинирола в плазме крови

Рис. 9. Градуировочная зависимость после устранения «эффекта нарушения линейности градуировочной зависимости» при определении ропинирола в плазме крови

Агеа Рано

у = 0,4542 х + 0,213

3- 1*2 = 0,9651

25- Л

7У

[Л. ^^

2 , А-6__

15

5

1 4 /

*/

0 5- /

V

0 ?

2 Л Агтигй

и катион-обменной функциональностью (рис.11). Поверхностные сульфогруппы обеспечивали избирательность по отношению к катионным аналитам. При этом молекулы циклосерина столь прочно связывались с функциональными группами сорбента, что последующее элюирование лекарственного вещества оказалось затруднительным. Нами применен способ перевода сорбента в аммонийную форму.

А именно: перед загрузкой образца через сорбент пропускался аммонийно-формиатный буфер, ионы аммония ЫН4+

Рис. 10. Градуировочная зависимость при проявлении «эффекта нарушения линейности» при определении циклосерина в плазме крови

связывались с функциональными группами, ослабляя взаимодействия молекул циклосерина с сорбентом. Затем вводили плазму крови с добавкой циклосерина, подкисленную муравьиной кислотой. Далее проводили элюирование 5%-ным раствором аммиака в метаноле.

Установлено, что на степень извлечения циклосерина влияет концентрация аммонийно-формиатного буфера (рис.12). Если она незначительна - около ЮмМ -молекулы циклосерина прочно удерживаются на сорбенте. Если, наоборот, она слишком большая - 1М раствор - сульфогруппы сорбента максимально дезактивированы, и удерживание аналита не происходит.

Оптимальным оказался

промежуточный вариант - концентрация 100 мМ. Достигнутая степень извлечения -77%.

Итоговая схема пробоподготовки

0*2 "тйС

/Г у X

V

МОуБ

Рис. 11. Фрагмент структуры плазмы крови для извлечения циклосерина сорбента 0аж МСХ

представлена на схеме 1.

90

aR so

го

1 70

(U

i60 1 /

X

1 40 /

5 30 / s л 1 5 20 Т с 1

и 10 J 0

0 100 200 300 400 500 600 700 800 Концентрация формиатно-аммонийного буфера, мМ 900 1000

Рис. 12. Влияние концентрации формиатно-аммонийного буфера на степень

извлечения циклосерина из плазмы крови. _ , .

Схема 1. Зтапы процедуры

подготовки плазмы крови к анализу

при определении циклосерина

Наиболее подходящим при

хроматографическом определении

циклосерина оказался режим HILIC -Hydrophilic interaction liquid chromatography, т. е. разделение с участием гидрофильных взаимодействий и трехкомпонентной элюирующей системой состава

метанол: пропанол-2 :ТФУ (метанол: пропанол-2:0,15% ТФУ, (67:28:5; объемн.)).

Несмотря на достигнутое, и здесь при хромато-масс-спектрометрическом определении аналита мы столкнулись с нарушением линейности, которое устранено уменьшением объема вводимой пробы, что позволило избежать попадания в ионный источник значительного количества матричных компонентов (рис.13).

В 5-ой главе обсуждается применение предложенных

методических решений при

фармакокинетических исследованиях лекарственных препаратов. Все разработанные методики валидированы в соответствии с международными требованиями и апробированы нами в клинических исследованиях.

Получены сравнительные данные, позволившие сопоставить общую токсичность при внутривенном введении и при перфузии изолированного органа (легкого) раствором цисплатина. На диаграмме (рис.14) представлены фармакокинетические кривые - зависимости концентрации лекарственного вещества в плазме крови от времени для пациентов, подвергнувшихся перфузии. Пунктирной линией обозначено максимальное содержание цисплатина при внутривенном введении. Видно, что процедура изолированной перфузии позволяет добиться значительно меньших концентраций в плазме крови, а значит и снизить общую токсичность препарата. Для всех остальных

4500

с

< 4000 — _

X

I 3500

т

о

3000

(и

т 2500

<ч

с

с 2000

§■ 1500

Время, мин

у = 1,0081 х-0,072 Я2 = 0,9988

X

0-Р

Рис. 13. Градуировочная зависимость после устранения «эффекта нарушения линейности» при определении циклосерина в плазме крови

Рис. 14. Фармакокинетические кривые цисплатина при проведении изолированной перфузии легкого у 10 пациентов

лекарственных препаратов проведены открытые рандомизированные перекрестные исследования сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности при пероральном приеме взрослыми добровольцами.

На рис.15, в качестве примера, представлены полученные нами фармакокинетические кривые циклосерина после приема референтного и тестируемого лекарственного средства. Согласно установленным требованиям, если фармакокинетические кривые для референтного и тестируемого препарата совпадают более, чем на 90%, они могут считаться биоэквивалентными, что и было показано для исследованных лекарств.

В рамках апробации разработанных методик проведено 7 клинических исследований в сотрудничестве с российскими и европейскими фармацевтическими компаниями. Проанализировано более 6000 образцов плазмы крови.

Рис. 15. Фармакокинетические кривые циклосерина после перорального приема 250 мг референтного и тестируемого препаратов 23 добровольцами

В таблице 4 представлены данные о линейных диапазонах разработанных методик, степени извлечения аналитов, видах матричных эффектов, обнаруженных нами, и способы их устранения.

Таблица 4. Обнаруженные матричные эффекты и способы их устранения

Аналит Линейный диапазон Степень извлечения,% (п=10) Вид матричного эффекта Решение проблемы CV, % (п=12)

Силденафил 1-1000 нг/мл 95±4 усиление аналитического сигнала (плохая сходимость) Выбор подходящего осколочного иона (MRM-переход 475->58) 4

Цисплатин 10-400 нг/мл 92±3 подавление ионизации (плохая сходимость) Дериватизации с образованием трехлигапдного комплекса Pt(DDTC)3+ 5

Капецитабин 20-4000 нг/мл 98±2 Применение сверхсшитого полистирола Purosep 200 1

5-фторурацил 20-800 нг/мл 84±1 2

Ропинирол 10-2000 пг/мл 89±5 Нарушение линейности градуировочной зависимости Переход от ЖЖЭ к ТФЭ на катионообменном сорбенте Oasis МСХ 4

Циклосерин 0,3-30 мкг/мл 77±2 Уменьшение объема вводимой пробы 1

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По итогам выполненной работы можно сделать ряд выводов:

1. Проведена градация матричных эффектов при хромато-масс-спектрометрическом определении лекарственных веществ в плазме крови: подавление или усиление ионизации, нарушение линейности градуировочной зависимости, неудовлетворительная сходимость результатов для биообразцов разных доноров, влияние на процессы фрагментации.

2. Предложен способ устранения матричного эффекта при определении цисплатина с образованием трехлигандного комплекса платины и диэтилдитиокарбамата Pt(DDTC)3+.

3. Обоснован выбор осколочного иона (MRM-переход m/z 475—>58) для решения проблемы плохой повторяемости значений матричного фактора при МС/МС-определении силденафила.

4. Обнаружено и устранено нарушение линейности градуировочной зависимости, вызванное влиянием биологической матрицы на процесс ионизации в масс-спектрометрии при хромато-масс-спектрометрическом определении циклосерина и ропинорола.

5. Установлено, что сорбционное концентрирование капецитабина и 5-фторурацила на сверхсшитом полистироле PuroSep 200 позволяет снизить матричный эффект, проявляющийся в подавлении ионизации и плохой повторяемости значений матричного фактора.

6. Показано, что перевод функциональных групп сорбента Oasis МСХ в аммонийную форму при сорбционном концентрировании способен решить проблему сильного связывания аналита с сорбентом на примере определения циклосерина и ропинирола.

7. Найденные методические решения реализованы при проведении реальных клинических исследований по изучению фармакокинетики лекарственных препаратов.

Работа изложена в следующих публикациях:

1. Ярошенко Д. В., Григорьев А. В., Сидорова А. А., Карцова JI. А. Определение цисплатина в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии // Журнал аналит. химии, 2013. Т. 68. № 2. С. 170-174.

2. Ярошенко Д.В., Григорьев A.B., Сидорова A.A., Карцова JI.A. Хроматографическое определение силденафила в плазме крови с использованием спектрофотометрического и масс-спектрометрического детектирования // Журнал аналит. химии. 2013. Т. 68. № 9. С. 1-9.

3. Ярошенко Д.В., Карцова J1.A. Матричный эффект и способы его устранения в биоаналитических методиках, использующих хромато-масс-спектрометрию // Журнал аналит. химии, 2014, Т. 69. № 4. С. 1-8.

4. Yaroshenko D.V., Grigoriev A.V., Sidorova A.A. Development and validation of a LC MS/MS method for d-cycloserine determination in human plasma for bioequivalence study // Anal. Bioanal. Chem. 2014. V. 406.1.3. P. 923-927.

5. Ярошенко Д. В., Григорьев А. В., Карцова А. А. Разработка метода определения лекарственных препаратов цисплатин и налоксон в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии // Тезисы докладов. V Всероссийская конференция студентов и аспирантов с международным участием «Химия в современном мире». Санкт Петербург, 18-22 апреля 2011. С. 48-49.

6. Ярошенко Д. В., Григорьев А. В., Карцова А. А. Разработка методов хромато-масс-спектрометрического определения цисплатина и налоксона в плазме крови // Тезисы докладов. XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Волгоград, 25 -30 сентября 2011. С. 445.

7. Ярошенко Д. В., Григорьев А. В., Сидорова А. А., Карцова А. А. Разработка методов ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС определения силденафила в плазме крови для проведения клинических исследований // Тезисы докладов. VI Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012». Санкт-Петербург, 18 - 21 апреля 2012. Секция 1. Аналитическая химия. С. 315-316.

8. Ярошенко Д. В., Григорьев А. В., Сидорова A.A., Карцова А. А. Разработка хромато-масс-спектрометрического метода определения циклосерина в плазме крови для проведения клинических исследований // Тезисы докладов. Всероссийский симпозиум «Кинетика и динамика обменных процессов». Краснодарский край, 25 ноября - 2 декабря 2012. Доклад № 10.

9. Ярошенко Д. В. Разработка методов определения лекарственных препаратов в плазме крови с использованием хромато-масс-спектрометрии для решения биоаналитических задач И Тезисы докладов. XVII Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. Санкт-Петербург, 2012. С. 94.

10. Ярошенко Д. В., Григорьев А. В., Сидорова А. А., Карцова А. А. Разработка метода хромато-масс-спектрометрического определения циклосерина в плазме крови с целью проведения клинических исследований // Тезисы докладов. VII Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2013». Санкт-Петербург, 1 - 5 апреля 2013. С. 87-88.

11. Ярошенко Д. В., Григорьев А. В., Сидорова А. А., Карцова А. А. Разработка хромато-масс-спектрометрического метода определения циклосерина в плазме крови для проведения клинических исследований // Тезисы докладов. 2-я Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез». Краснодар, 26-31 мая 2013. С.134.

12. Ярошенко Д. В., Карцова А. А. Влияние компонентов биологической матрицы на определение лекарственных препаратов в плазме крови // Тезисы докладов. VIII Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2014». Санкт-Петербург, 1 - 4 апреля 2014. С. 347-348.

Автор выражает глубокую благодарность "Центру Коллективного Пользования "Аналитическая Спектрометрия" за предоставленную возможность проведения экспериментальной работы и лично Григорьеву Александру и Сидоровой Алле за неоценимую помощь и надежную поддержку при выполнении диссертационного исследования.

Подписано в печать 03.07.2014 г. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 1420.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Типографии Политехнического унверситета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29, Тел.:(812)550-40-14