Исследование дофаминергической системы головного мозга млекопитающих IN VIVO методом хромато-масс-спектрометрии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

1-0 Г) 3 9$

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПО РАЗРАБОТКЕ И ВНЕДРЕНИЮ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ПЕЧЕНИЯ

На правах рукописи

ЮДИНЦЕВ Александр Сергеевич

УДК 512.82.088.3:543.544 •

ИССЛЕДОВАНИЕ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ М \ZJVO МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных соединений и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических неук

Москва -1992

Работа выполнена во Всесоюзном научном центре по разработке и внедрению современных методов молекулярной да агностики и лечения МЗСССР.

Научные руководители:

доктор химических наук Ишкоо А.Г.,

кандидат физико-математических наук Семенов С.Ю.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, заведующий лабораторией Коган Б.М., кандидат химических наук, вед. научный сотрудник Оноприенко В.В.

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины РФ.

Защита состоится 2 апреля 1992 г. в 10°® часов на заседании специализированного совета Д 074.51.01 при Всесоюзном научном центре по разработке и внедрении современных методов молекулярной диагностики и лечения, Москва, Симферопольский бульвар, д. 8.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Всесоюзного научного центра по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики и лечения. -.

Автореферат разослан 2-$ 1992 г.

Ведущая организация:

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

, . ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

•Т«ал j

.арт.-ДктУапьностъ проблемы. Исследования последних лет показывают, что дофаминергмческая система ЦНС играет важную роль в развитии ряда патологий. В настоящее время существуют несколько патофизиологических гипотез, в основе которых лежат нарушения функций дофаминергической системы, с помощью которых делаются попытки объяснения механизмов развития целого ряда заболеваний в кардиологии (гипертемзид, кардиомиопатия и др.), психиатрии (депрессия и шизофрения) и нейрслогим (семейная вегетативная дисфункция, болезнь Пэркмнсокз, эпилепсия и др.) (Winlow, Markstein,198S; Greese, Fraser, 1987'r Kagsdsl, Goldstein, 1983). Имеются данные о ззаимодействкн катехоламиноэ головного мозга и эндокринной системы. Эта гипотезы опираются на разнообразный, часто небесспорный экспериментальный материал и требуют дальнейших исследований. Практическое использование этих гипотез и контроль за функционированием дофаминергической системы возможны при наличии надежных периферических индикаторов ее Функционального состояния.

Усилия по описанию катахопаминергических систем рег/ляции привели к разработке клинических методов, основанных на количественных измерениях содержания :сатехоламяноз и их метаболитов в плазма, моче, цереброспинальной жидкости. 3 настоящее ереми определение содержания котехоламинов, их метаболитов и предшественников в различных биологических жидкостях и тканях является обшей стратегией, используемой при оценке гипотез, касающихся этиологии психиатрических заболеваний, з та.'ске при изучении нейроииркулятормой регуляции, в нейроэндокринологии, при исследованиях механизмоз стресса (Kagedal, Goldstein,198S).

Наиболее доступным клиническим и лабораторным биологическим материалом являются моча и кровь. Однако к интерпретации результатов, в основе которых лежат концентрации катехопэмпюв, в частности, дофамина (ДА), и их метаболитов в плазме и моче, сязаует подходить с,, осторожностью в силу ряда причин. Как отмечаот Sri, Кгиег, 1985; Goldstein, 1936; н Gelpi, 1587, и другие на базальное содерксине катехоламиноз плазмы у экспериментальных животных оказызают влияние такие факторы как время дня, окружающая температура, экологический или физиологический стресс, г также пол, возраст, вес, состояние здоровья, применение химиотерапии, степень прирученности и услсеия выполнения процедуры двгялктации и взятия проб крови. Приин'этиальная причина

неоднозначности при интерпретации таких результатов заключается в существовании в живом организме нескольких "источников" ДА м его метаболитов, определяющих суммарное содержание этих соединений в плазме и моче. (Buhler el al., 1978; Hjemdahl, 1987). Условно эти "источники", можно разделить на центральные и периферические. Измеряя концентрации ДА и его метаболитов в плазме крови, необходимо знать вклад периферии в общее содержание. Разграничение вкладов ШС и периферии является актуальной и достаточно сложной задачей, решение которой к тому же затруднено низкими - на уровне нано- и пикомолей -концентрациями ДА и его метаболитов в плазме крови и моче.

I к»гш и аяпачи чслпепованцд. В настоящей работе для исследования дофаминергической системы головного мозга млекопитающих ¡n vivo предлагается . использовать маркерный метод, позволяющий по метаболитам-индикаторам дофаминергической активности ШС, содержащимся в плазме крови, проводить оценку функционального состояния дофаминергической системы головного мозга в норме и при воздействии нейротропных препаратов. В качестве вещества-маркера предлагается использование меченного стабильными изотопами ДА, который, являясь изотоп омером эндогенного медиатора, интегрируется в процессы нейропередачи и метаболизма. Индикаторами актданости дофаминергической системы мозга при этом служат метаболиты меченого ДА. Целью исследования явилась разработка указанного метода исследования и демонстрация его работоспособности и возможностей.

Для выполнения работы были поставлены следующие конкретные задачи. 1. Синтезировать меченные дейтерием препараты дофамина и L-ДОФА, пригодные для использования в указанных целях.

2. Разработать высокочувствительный газохроматографическмй-масс-спектрометрический метод количественного анализа метаболитов дофамина в плазме крови лабораторных животных и человека.

3. Выявить в плазме крови метаболиты дофамина, отражающие процессы метаболизма дофамина в головном мозге.

4. Показать возможность использования меченых метаболитов дофамина в плазме в качестве индикаторов активности дофаминергической системы UHC при введении дейтерированного дофамина в мозг лабораторных животных.

Научная новизна. Синтезированы дейтерированные препараты ДА и L-ДОФА и установлена их пригодность для использования в качестве вводимых 8 организм маркеров, надежно отличающихся от эндогенных аналогов. Впервые с помощью введения меченого дофамина в головной

мозг кролика в плазме животного ошоэначно определены метаболиты,отражающие метаболизм ДА в головном мозге. Впервые для диагностики дофаминергической системы ЦНС человека применено периферическое введение меченого предшественника нейромедиатора (L-ДОФА) в организм человека совместно с ингибитором периферической декарбоксилазы (бенсеразидом). Показано, что мониторинг меченых метаболитов в плазме крови после введения меченого дофамина (либо L-ДОФА) отражает активность дофаминергической системы UHC. Метод продемонстрирован при воздействии галоперидола и ингибиторов МАО на дофаминергическую систему фолика и при воздействии малых доз этанола на дофаминергическую систему человека. Усовершенствован газохроматографический-масс-слектрометрический метод

количественного определения метаболитов дофамина в плазме крози.

Научно-практическая ценность работы. Установлены метаболиты-индикаторы активности дофаминергической системы головного мозга. Создан метод определения активности дофаминергической системы ¡n vivo. Получена оценка соотношения центральной и периферической гомованилиновой кислоты в плазме кролика. На основе перорального или внутривенного введения меченого предшественника ДА (L-ДОФА) вместе с ингибиторами процессов метаболизма на периферии . возможно проведение диагностики и лечения человека нейротропными препаратами.

Апробация работы. Апробация работы состоялась на межлабораторном коллоквиуме ВНЦМДЛ 28 января 1992 г. Материалы диссертационной работы доложены на Конкурсе молодых ученых химфака МГУ в 1987 г., на Конкурсе молодых ученых НЦМД МЗ СССР в 1988 г., на 35-м Международном конгрессе по алкоголизму и лекарственной зависимости (Норвегия, Осло, 1988), на Международном совещании по медицинской биохимии (Москва, 1988 г.), на 2-м Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991).

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем н структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей результаты собственных исследований и их обсуждение, общего заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на $2 страницах машинописного текста, содержит 2.Í рисунка и " таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу выполняли на кроликах-самцах поросы Шиншилла весом 2-3 кг, содержащихся в стандартных условиях вивария. За сутки до начала эксперимента животных лишали пищи без ограничения воды. Ряд экспериментов выполнен на здоровых добровольцах в условиях лаборатории.

Введение дейтерированного дофамина в головной мозг кролика осуществляли через металлическую канюлю, вживленную в третий желудочек головного мозга местно анестезированного животного и зафиксированную на черепе кролика с помощью зубного цемента. Факт попадания канюли в третий желудочек мозга устанавливали визуально по появлению прозрачной жидкости из капилляра и в результате декалитацш животного и извлечения головного мозга после окончания эксперимента.

Введение нейротропных препаратов кроликам осуществляли путем внутрибрюшинных инъекций этих препаратов, растворенных в физиологическом растворе или кукурузном масле, за определенное время до введения дейтерированного дофамина в мозг.

Отбор крови (1-2 мл) кролика через определенные временные интервалы производили из ушной вены животного посредством ее прокола. Кровопотери животного .в процессе эксперимента восполняли внутрибрюшннными инъекциями физиологического раствора (10-20 мл).

„ Введение L-ДОФА, его дейтерированного аналога и бенсеразида добровольцам осуществляли перорально. Отбор крови производился из среднего и безымянного пальцев рук (1 мл).

Обработка плазмы для ГХ-МС-анализа метаболитов ДА гомованилиновой и 3,4-пиоксифенилуксусной кислот (ГВК и ДОФУК соответственно), заключалась в добавлении меченных стабильными изотопами внутренних стандартов (10 нг), антиоксидантов (аскорбиновой кислоты и ЭДТА), депротеннизировании с помощью 10%-ной сульфосалициповой кислоты, центрифугированием и отбором супернатанта. Супернатант насыщали хлоридом натрия, ДОФУК и ГВК экстрагировали в этилаиетат (2 раза по 2 мл). Комбинированные экстракты переносили в дериватнзациоиные стеклянные микропробирки, упаривали досуха в потоке азота при 50-80°С. Следовые количества воды удаляли добавлением бензола и повторным упариванием. Описанная методика в основном соответствует методике (Davis et al., 1986).

Дериватизацию (за основу взята методика Wood, 1982) ГВК и ДОФУК осуществляли добавлением к сухому остатку 100 мкл пентафтор-

пропмонового ангидрида и 50 мкл гексафториэопропилового спирта, после чего пробирки запечатывали и выдерживали при температуре 70°С в течение 45 мин. По окончании реакции пробирки охлаждали, содержимое упаривали азотом до 25 мкл. К раствору добавляли 200 мкл гексана, дважды промывали 100 мкл 1М фосфатного буфера (рН 6.0), гексановый слой осторожно отбирали, переносили в коническую стеклянную микропробирку и концентрировали азотом до 5 мкл. 0.5-1 мкл этого раствора вводили в капиллярную колонку ГХ.

ГХ-МС - анализ проводили на хромато-масс-спектрометре с двойной фокусировкой "М-80В" фирмы Hitachi (Япония) и квадрупольном хромато-масс-спектрометре "НР-5988А" фирмы Hewlett-Packard (США). Разделение анализируемых соединений проводили на кварцевой капиллярной колонке фирмы Hewlett-Packard серии ULTRA 2 с химически привитой фазой 5%-фенилметмлсиликон длиной 25 м и внутренним диаметром 0.32 мм, толщина пленки 0.52 мкм. Ввод пробы в колонку осуществляли без деления потока. Конец колонки входил непосредственно в источник ионов масс-спектрометра. Газ-носитель - гелий с расходом около 1 мл/ммн. Масс-спектрометрическую регистрацию соединений проводили в режиме электронного удара (70 Эв) методом селективного ионного детектирования.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение дейтерированных производных лофамина и L-ДОФА, Синтез дейтерированных соединений 2,5,6-283-ДА (ДА-Dj) и 2,5,6-^5-1.-ДОФА (L-ДОФА-Оз) осуществлен растворением соответствующих количеста немеченых аналогов в 10%-ном растворе DCI в D^O и инкубированием полученных растворов в течение 24 час при температуре 130°С. За основу взята методика (Lindstrom et al., 1974).

2,5,6-2Нз-ГВК (ГВК-Оз) была приготовлена растворением 50 мг немеченого аналога в 2 мл 9% DCI в DjO и инкубированием этого раствора в течение 6 час при температуре 80°С. Затем ГВК-Dj была экстрагирована в этнлацетат после насыщения раствора хлоридом натрия. Методика приготовления близка (Muskietet al., 1978).

2^-?Нг-2-(215,6-2Нз)-ГВК (ГВК-Dj) была приготовлена растворением 300 мг ГВК в 2 мл 16% DO в D2O и инкубированием этого раствора в течение 30 час при температуре 120-130°С. Затем следовала экстракция в этилацетат подобно ГВК-Dj. Методика близка (Lindstrom el а!., 1974).

Химическая чистота дейтерированных препаратов была не хуже чистоты исходных вешеств и контролировалась с помощью ВЭЖХ,

изотопный состав препаратов определялся с помощью ГХ-МС. Изотопный состав всех использованных лейтерированных соединений представлен в Табл.1.

Табпииа1.

Изотопное распределение дейтерированных производных после обмена в растворе РО/ОтО.

Относительная интенсивность, % Положение

Соединение Оо 01 02 о3 04 Оэ метки

ДА-Оз 0,5 1,5 16 100 - - 2.5,6

ЬДОФА-О} 1 4 17 100 - - 2,5,6

гвк-Оз 1 5 28 100 - - 2,5,6

гвк-о$ 0,1 0,1 0,1 1 11 100 2,5,6,^

ДОФУК^ 0 0 0 1 14 100 2,5,6

Примечание: ДС>ФУК-0$ поставлен фирмой ЮЛ (США).

На Рис. 1 и 2 приведены масс-спектры и схемы фрагментации ДА, дейтерированного ДА-Оз, ЬДОФА и дейтерированного ЬДОФА-О}.

—^ Синтез химических производных метаболитов дофамина. Метаболиты ДА, как и сам ДА, являются нелетучими полярными соединениями, что не позволяет проводить их ГХ-МС - анализ. Уменьшение попярности соединений достигается путем химической зацщты их функциональных групп (Табл. 2). Характер групп и их количество определяют выбор реакций дериватизации.

Таблица 2.

Функциональные группы ЬДОФА, ДА и их метаболитов.

СоепДгруппа 3-ОН 4-ОН нн2 СООН

ЬДОФА ' + + + +

ДА + + + -

ДОФУК + + - +

ГВК - + - +

Критерии выбора способа дериватизации.

1. ГХ-требования. Производные должны обладать высокой летучестью и устойчивостью к высоким температурам.

(165 - 168) Бсап 8.729 пмп.-о* ВЯТЯ2:П»г.О

'28

300 400

Мвзя/СЬагде

О л

Р5с2-с-о г с -с

5 2 |

дб1 иге

г

1Тб

о и

-ян-с

119

Рнс. I. Масс-спектры и схема Фрагментации ПФП-ГФИП-производных 2

дофамина (А) и 2,5,6- Н,-дофамина (Б).

г5с2-с-о о

622

100

4о6 1 ' '¿¿оГ| ' 'тбо' и 18 1»5в

I

I I

800

р с 5 2

О " , \

-с-о-/ >-снг}-сн-сЫос(н)сггб _ - У"^ ян Ч.

г5с2-с-0 в

нн

I

с=о

I

с г

685

Рис. 2. Уасс-спектры и схема фрагментации ПФП-ГФИП-производных ь-ДОФА и 2,5,6-2Н3-ь-ДО$А (А и Б соответственно).

2. МС-требования. Производные должны давать малолинейчатые масс-спектры с интенсивными характеристическими ионами, не совпадающими с интенсивными фоновыми значениями масс хромато-масс-спектрометра.

3. Дериватизация должна быть одностадийной, непродолжительной, проходить в мягких условиях, что минимизирует деградацию легко окисляемых соединений (особенно ДОФУК).

4. Эксплуатационные требования. Приготовленные производные должны быть устойчивы не менее 4-5 часов, в течение которых проводится ГХ-МС - анализ многих образцов.

Были опробованы триметилсилип'ьные, трифторуксусные-трифтор-зтипьные, трифторуксусные-гексашторизопропильные, пентафторпропио-новые-гексафторизопропильнь;е, гелтафтормасляные-гексафторизолро-пильные производные. Благодаря оптимальному сочетанию летучести (она выше у легких производных этой группы) и величины МС-шума, (который заметно снижается в области высоких масс для . более тяжелых производных данной группы) нами были выбраны пентафторпропионсвые (ПФП) -гексафторизопропильные (ГФИП) произзопкые для количественного определения ДОФУК и ГВК з плазме крови. Для зтех производных нами проведены дополнительные исследования по определению оптимального времени дернзатизации (Рис. 3). В качестве внутреннего стандарта при определении выхода продуктов испольгозался октафторнафталин. В этих экспериментах К ТОО нг ДОФУК н ГВК добавляли 100 нгВС, 100 мкл ПФПАн 50 мкл ГФИП (реагенты брались в избытке). Запечатанные пробирки

и ----1-1-1-1-1-1-1-1

О 10 20 30 40 ' 50 60 70 80

время, мин

Рис. 3. Зависимость выхода ДОФУК-2ПФП-ГФИП (П)иГВК-ПФП-ГФИП (П) от времен:) дернзатизации. По оси ординат - отношение сигнала ДОФУК (ГВК) к сигналу внутреннего стандарта (октафторнафтелина).

выдерживались при температуре 70°С в течение 15; 30; 45; 60 и 75 мин. Исходя из результатов экспериментов, мы выбрали время дериватизации ДОФУК и ГВК 45 мин, что короче времени, предложенного Вудом.

Был исследован еще один способ дериватизации ДОФУК, ГВК и L-ДОФА, заключающийся в последовательных стадиях этерификации карбоксильной группы с помощью HCI/MeOH и ацилирования гидроксильных и аминогрупп с помоиью любого из фторированных ангидридов, например, пентафторпропионового. Получаемые в результате этого ПФЛ/Мет-производные имеют удовлетворительные ГХ-МС-качества и могут Быть рекомендованы нами к использованию тогда, когда необходимо получить производные соединений, в состав которых кроме карбоксильной группы входит больше двух гидроксильных или аминогрупп. В этом случае введение метальной группировки вместо ГФИП-группы уменьшает молекулярную массу соединения, выросшую чрезмерно за счет введения большого количества заместителей. Поэтому данный двухстадийный способ дериватизации имеет преимущества перед ПФП-ГФИП-дериватизацией при количественном определении L-ДОФА и некоторых метаболитов норадреналина, что должно быть учтено при развитии предлагаемого трейсерного подхода и применении его для исследования других нейромешаторных систем.

На Рис. 4 и 5 представлены масс-спектры и схемы фрагментации ПФП-ГФИП-производных ДОФУК и ГВК, а также их внутренних стандартов Д0ФУК-05иГВК-'*С$.

Опенка влияния обратного дейтерообмена.

Синтез дейтерированных препаратов осуществлен обменом протонов, принадлежащих молекулам ДА и L-ДОФА, на атомы.дейтерия в среде DCI/D2O. Обратный дейтерообмен - процесс потери атомов дейтерия молекулами ДА и L-ДОФА путем замены их на протоны в организме и в процессе пробоподготовки - может исказить результаты исследований. Поэтому необходима кошчественная оценка процесса обратного дейтерообмена in vivo и ¡n vitro. Для получения такой оценки в серии экспериментов мы регистрировали весь набор дейтерированных ионов для ДОФУК* и ГВК*: D3, Di, D) и Dj. Увеличение интенсивности иона, соответствующего фрагменту молекулы, включающему два атома дейтерия (Dj-фрагмекг), за счет уменьшения интенсивности Оз-фрагмента вследствие потери им атома дейтерия не превышало 5% для дейтерированных препаратов, после нахождения их в организме и процесса пробоподготовки. Рост интенсивности Di-фрагмента за счет потери атомов

(255 - 267) Зсвп 5.500 ппп. of ВЯТЯ:ПНЗ.П

10880

« 8000 и

5 В 000

с э .о ее

4 000 2000 . 0

/ 119

Ш

415 \

151 /

240

г > , . •» ■'

ц

447 610 <»+>

100 200' 300 400 500 Б00 МаБз/СЬагде

1П5

Р5с2-с-о-^_^^-сн21со-ос(н)с2Рб

Г5С2-

100

50

Гип'ПГщ III ||| || I п7|'П I гп >11 щ 1111 щ 1П П1IIIIII О 100 _ 200 300 400 . 500 600 700

^ Н&8 5/С11агве

1»20

р5с2-с-о-

р5С2-(}-О

О

•сн.

-СО-ОСШС^

Рис. 4. Масс-спектры и схема фрагментации ПФП-ГФИП-производных ДОФУК (А) и ДОФУК- Н& (Б). -

(294:295 8000:

6В00:

4000:

2000: 0

308) Ауд 5.863:5.882 ппп. *гот ПВТЯ^ЯЗ.П 283 478 (М+)

107'

ь

119

261

.....

331

359 /

П-1-

50 100 150 280 250 300 350 400 450

МагБ/СЬагде

331

283

О II

г5с2-с

о-р-сн,

СО-ОС(Н)С2Г6

н3с-о

С2 8В - 303 ) 5с ап 5.84? им п . о* БЯТЯ:НУПС13.й

283 484

тз с

Э

40006] 300001 20030-] 1ВВВ0-]

э-

113

/

266

337

410

I) > Гг

X

5В 100 150 200 250 .300 350 400 450 МаБв/СЬагд с

ЗЗТ

2&9

г5с2-с

-снл

СО-ОССЮС^

113С-0

Рис

гвк

5. Масс-спектры и схема фрагментации ПФП-ГФИП-производных (А) и ГЕК-13С6 (Б).

дейтерия фрагментами Эг и Рз был еще меньше. Проверка ¡п \Лго (ДОФУК-

и ГВК-О} были инкубированы в физиологическом растворе при температуре 36°С в течение 8 час, после чего были обработаны по принятой схеме) показала близкие результаты. Таким образом установлено, что обратный дейтерообмен не имеет сколь-нибудь существенного значения."

Изотопный эффект меченных стабильными изотапзми препаратов.

Использование в биомешиинских исследованиях препаратов, меченных стабильными изотопами, имеет пока не столь широкое применение (если не считать привлечение их в качестве ВС) и требует выполнения определенных условий. Прежде всего необходимо учитывать существование изотопного эффекта, проявляющегося в изменении скоростей биохимических реакций, если в них принимают участие меченные стабильными изотопами препараты (изотопомеры) (НаэИпз, 1982). Изотопный эффект, вызванный наличием дейтерия, наиболее значителен по сравнению с другими изотопами и обусловлен гораздо более прочной химической связью С-О, О-О и N-0 по-сравнению о С-Н, 0-Н и N-4. Однако использование дейтерия вполне оправдано, если он находится в метаболически неактивном положении, когда он не влияет на скорости реакций. Именно в таких метаболически неактивных положениях 2-, 5- и 6-бенэольного кольца находятся атомы дейтерия в используемых в работе дейтерировэнных препаратах ДА и ЬДОФА.

Относительная подвижность атомов дейтерия (как и протонов) приводит к полному выведению этого изотопа из организма, какие бы метаболические превращения ни претерпела молекула, несущая изотоп. . Токсичность дейтерия. для млекопитающих проявляется лишь в случае замены им протонов в 15% воды тела. Смерть наступает, если этот уровень повышается до 35-40% (НазМте, 1982). Таким образом, те количества изотопа, которые содержатся во вводимых препаратах, не могут оказать какого-либо токсического действия на организм.

Количественное определение ДОФУК. ГВК и их дейтерированных

аналогов.

Кряичественнное определение ГВК, ГВК*, ДОФУК и ДОФУК* в плазме крови проводилось по методу внутреннего стандарта (ВС). Для •предеяения ГВК н ГВК* в качестве ВС использовался меченный углеродом «С аналог ГВК (ГВК-1гС6), для определения ДОФУК и ДОФУК* -

дейтерированный аналог ДОФУК (ДОФУК-Dj). Для селективного ионного детектирования этих соединений использованы следующие значения масс: ГВК -478 а.ел1. ДОФУК - 41$ а.ем ГВК* -481 а.ем. ДОФУК* -418 а.е.м. ГВК-"С$ - 484 а.е.м. ДОФУК-05 - 420 а.ем.

Стандартные смеси были приготовлены добавлением различных количеств определяемых соединений (ГВК и ДОФУК) к растворам, содержащим равное количества (10 нг) ВС (ГВК-13С£ и ДОФУК-Dj). Калибровочные кривые для определения ГВК и ДОФУК линейны в диапазоне 10 пг - 10 нг для ГВК и 25 пг -10 нг для ДОФУК. Пределы обнаружения ГВК и ДОФУК составляют 5 пг и 15 пг соответственно. Концентрации определялись как произведение отношения площадей пиков на концентрацию ВС по следующим формулам: ^tc^J^tc

Схш----- для эндогенных ГВК и ДОФУК;

К

С«с S VSK

с% = 1.17------- для ГВК* и ДОФУК*.

К

где Сх, С*, и Ск - концентрации эндогенных метаболитов, дейтерированных метаболитов и ВС соответственно; SXlS*j¡HS,t- площади пиков эндогенных метаболитов, дейтерированных метаболитов и ВС соответственно; К • коэффициенты наклона калибровочных кривых. Коэффициент 1.17 в формуле для вычисления концентраций ГВК* и ДОФУК* учитывает неоднородность дейтерирования препаратов ДА* и L-ДОФА* и наличие в них определенной доли flA-D^ и L-ДОФА-О? (см. Табл. 1).

Определенна лозы РА* для введения в мозг кролика.

Типичный пример кривых изменения концентраций ГВК* и ДОФУК* в плазме крови кролика от времени после введения в мозг 266 мкг ДА* представлен на Рис. 6. Здесь же представлены значения концентраций эндогенных метаболитов ГВК и ДОФУК. На Рис. 7 и 8 представлены кривые зависимости концентраций ГВК* и ДОФУК* в плазме крови от времени для разных доз ДА*. В Табл. 3, составленной по данным Рис. 7 и 8, отражены максимальные концентрации ГВК* и ДОФУК* в плазме кроликов в зависимости от дозы ДА*.

. Линейный характер роста максимума концентрации ДОФУК* в плазме и насыщение по ГВК* говорит о наличии дзух независимых путей метаболизма поступившего в мбзг ДА*.

С, нг/мл

90-. 80.1 70.

Время, мае

Рис. 6. Типичные кривые зависимости концентраций ГВК*, ДОФУК*, ГВК и ДОФУК от времени в плазме крови кролика при интравентрикулярном введении дейтерированного ДА*. Введено 286 мкг ДА*. По оси ординат -концентрация метаболитов, нг/мл плазмы. ГВК*-а , ДОФУК*-ф ,ГВК-а .ДОФУК-4 .

С.нг/мл

450 400 350 300 250 200 150 10С 50

I I I 4-1

4 5 6 7 6 9

О

0 12 3

Время, мае

Рис. 7. Зависимость концентрации ДОФУК* в плазме крови кролика от времени при интразентрикулярном введении различных доз дейтерирозанного ДА* (вес кроликов 2,4 кг). По оси ординат - концентрация ДОФУК*, нг/мл плазмы.

Ш -ЮООмкг; а-266мкг; ф - 108мкгДА*/мозг.

С, иг/мл

Время, час

Рис. 8. Зависимость концентрации ГВК* в плазме крови кроликов от времени При интравентрихулярном введении различных поз пейтерированного ДА" (вес кроликов 2,4 кг). По оси ординат - концентрация ГВК*, нг/мл плазмы. ■ - 1000 мкг; а - 266 мкг; ф -106 мкг ДА'/мозг.

ТаблмцаЗ.

Максимальные значения концентраций ГВК* и ДОФУК* в плазме крови кроликов (нг/мл) при интравентрикулярном введении различных доз дейтерированного ДА*.

ДА* ГВК* ДОФУК* ГВК'/ДОФУК*

мкг/мозг нг/мл нг/мл

1000 55 450 0,12

266 48 67 0,72

106 25 6,8 3,68

Отсутствие ПА* в крови кролика.

Для дополнительного доказательства центрального происхождения ДОФУК* и ГВК* нами были проведены исследования с целью обнаружения дейтерированного ДА* в плазме крови кроликов. Дейтерированного ДА* в плазме животных после интравентрикулярного введения препарата нами не обнаружено.

Влияния гяпопярилола на концентрация метаболитов дофамина.

Для демонстрации работоспособности метода исследовано воздействие галоперидола - блокатора рецепторов ДА - на концентрации эндогенных ГВК и ДОФУК и концентрации трейсерных ГВК* и ДОФУК* в плазме крови одного и того же животного и установлено заметное различие в действии препарата на эндогенные и меченые метаболиты. Результаты представлены в Табл. 4.

Таблица 4.

Влияние галоперидола на изменение концентраций эндогенных метаболитов ДА и концентраций метаболитов-маркеров в плазме крови кроликов после интравентрикулярного введения 200 мкг ДА* в мозг животного.

ДСдофук Д С дофук* АСгвк ДСгвк*

+38% + 25% ' +24% +47%

Примечание: галопершюл введен за 1 час 50 мин до введения ДА*.

.i

Влияние ннгибнтороп МАО.

С той же целью демонстрации работоспособности и возможностей нового метода мы исследовали действие на дофаминергическую систему ряда ингибиторов МАО: мы выбрали депренил, паргилин, транипципромин и 8-оксихинолин (8-ОХ). Во всех случаях ингибиторы оказали более глубокое

снижение концентраций меченых, а не эндогенных метаболитов (кроме транилципромина, который сильнее повлиял на снижение концентрации эндогенной ГВК). Результаты представлены в Табл. 5.

Таблица 5.

Влияние ингибиторов МАО на изменение концентраций эндогенных метаболитов ДА и концентраций метаболитов-маркеров в плазме крови кроликов после интравентрикулярного введения 200 мкг ДА* в мозг животных.

Препарат ДСдофук ¿Рдофук* ДСгвк Дсгвк* - Сщ/ Срвк*/

Сдофук Сдофук*

8-ОХ -70% -84% -53% -79% 2,42 1,56

Депренил -82% -87% -74% -78% 2,16 2,04

Паргилин -25% -56% -53% -58% 0,98 1,14

Траннлцил. -71% -82% -68% -27% 1,69 4,77

Примечание: ингибиторы МАО введены за 1 час до введения ДА*.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы и охарактеризованы дейтерированные аналоги дофамина и L-ДОФА, пригодные для трейсерного исследования дофаминергической системы головного мозга животных и человека in vivo.

2. Установлено, что величина обратного дейтерообмена для дейтерированных дофамина, L-ДОФА и их метаболитов в организме и в процессе пробоповготовки не превышает 5% и может не учитываться при количественном анализе.

3. Усовершенствован метод газохроматографического-масс-спектро-метрического количественного определения следовых количеств метаболитов дофамнна ДОФУК и ГВК в плазме крови животных и человека, в частности; исследованы различные талы химических производных и выбраны наилучшие для количественного анализа ДОФУК и ГВК.

4. Изучена кинетика образования ДОФУК* и ГВК* в плазме крови при интравентрккулярном введении меченого ДА кролику. Показано, что изменение концентрации этих метаболитов во времени отражает функциональное состояние дофаминергической системы головного мозга и может быть использовано для диагностики состояния этой системы.

5. Показано, что ДОФУК* плазмы крови отражает пресинаптмческий метаболизм дофамина. ГВК* плазмы крови отражает постсинагттический метаболизм дофамина и является показателем функциональной активности дофаминергических нейронов.

5. Показано, что мониторинг меченых ДОФУК* и ГВК* в плазме крови животных может ислользораться для проведения in vivo испытаний фармакологических препаратов кейротрояного действия.

7. Получена оценка количественного соотношения нейрональной н периферической гомовакилиновой кислоты - одного из основных метаболитов дофамина - в плазме крови кроликов. В норме это соотношение составляет величину, близкую к 50:50.

8. Показано, что при пероральном взеаении меченого L-ДОФА человеку с одновременным ингибированием периферической дофадекарбоксилазы с помощью бенсеразида меченые метаболиты препарата ДОФУК* и ГВК* отражают функциональное состояние аофгмикергической системы головного мозга чепозека и могут быть использоаакы для диагностики этого состояния, в частности, при алкогольном воздействии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семеноз С.Ю., Юдчнцев A.C. Определение содержания катехопамиков " и их метаболитов в мозге крыс методом хромато-масе-спк.чтрометрии. - Материалы кочф. молодых ученых, химфак МГУ, Москва, 5CS7/M..1937, Дел. в ВИНИТИ, N 5072-007, ч. 3, с. ¡21-124.

2. ishkov A.G., Semenov S.Yu., Yudintsev A.S. The study oí dopamine bioíreniformaíion ¡л human brain. - Abstracts oí 14-!h In!. Congress oí Biochemistry, Pregue, Chechoslovakia, 1288.

3. Ishkov A.G., Semenov S.Yu., Ytidinisev A.S. The study of dopamine metabolism. - Abstracts of 35-th Int. Congress in alcoholism and drug dependence, Osio, Norway, 1938.

4. Юдинцев A.C., Семенов С.Ю., Ишков А.Г. Новый подход к изучению дофаминергичссой системы головного мозга in vivo. - 2-й Всесоюзный симп. "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологин", Самарканд, 1991/М., 1991, с. 216.

5. Морозова Н.В., Юш.чцез A.C. Техника проведения экспериментов с использованием стабильных изотопов на примере изучения лофаминергичгской системы. -2-й Всесоюзный симп. "Теоретически® и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 1991/М., 1S91, с. 137.