Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Кузина Екатерина Сергеевна

УБИКВИТИН-НЕЗАВИСИМЫЙ ПРОТЕОЛИЗ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА И ЕГО РОЛЬ В РАЗВИТИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АУТОИММУННОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА

02.00.10 - бпоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ

2 9 АПР 2015

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2015

005567837

Работа выполнена в лаборатории биокатализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук и на кафедре химии природных соединений Химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Дзаптиев Борис Борисович, д.х.н., профессор, заместитель директора Института по научной работе, заведующий Лабораторией иммунобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук

Тоневицкин Александр Григорьевич, д.б.н., профессор, чл.-корр.РАН, заведующий Отделом трансляционной онкологии Федерального государственного бюджетного учреждения Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена

Ведущая организации: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга Российской академии наук (ИМБРАН)

Защита диссертации состоится 9 июня, в 16.00 на заседании Диссертационного совета Д501.001.41 по химическим наукам при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждешш высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, НИИ ФХБ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова и на сайте Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова www.chem.msu.ru.

Автореферат разослан Ученый секретарь

Доктор химических наук, профессор, чл.-корр. РАН, Габибов Александр Габибович

Кандидат химических наук Белогуров Алексей Анатольевич

Диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Смирнова И.Г'.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рассеянный склероз (PC) — одно из наиболее социально и экономически значимых неврологических заболеваний современности. Особенностью PC является возникновение заболевания в основном у лиц среднего возраста, то есть молодой и трудоспособной части населения, ведущей активную социальную жизнь. Последствия заболевания за 10-15 лет приводят практически к полной потере трудоспособности, а при недостаточно эффективном и своевременном лечении - и к летальному исходу. К сожалению, пробелы в знании этиологии PC приводят к отсутствию эффективной терапии данного заболевания.

Актуальность изучения протеолиза основного белка миелина связана с тем, что он является одним из основных аутоантигенов, на которые направлен иммунный ответ при рассеянном склерозе, а также его экспериментальной животной модели — экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЕАЕ). Изучение протеолитической деградации аутоантигенов имеет важное значение для современной биохимии и иммунологии, в особенности для понимания молекулярных механизмов патогенеза аутоиммунных заболеваний и выявления новых терапевтических мишеней. Пептиды, образующиеся в результате протеолиза внутриклеточных антигенных белков, прзентируются на поверхности клетки на молекулах главного комплекса гистосовместимости I класса и могут распознаваться цито-токсическими Т-лимфоцитами, что приводит к уничтожению таргетной клетки. Ключевую роль в протеолизе внутриклеточных белков до антигенных пептидов играет протеасома - многосубъединичный белковый комплекс, обладающий широкой субстратной специфичностью. Качественный и количественный состав пептидов, презентируемых на поверхности клетки, во многом зависит от каталитических свойств протеасомы. Механизм деградации основного белка миелина протеасомой и особенности протекания этого процесса в норме и при развитии аутоиммунных патологий ЦНС до сих пор не были изучены.

Цели и задачи исследования. В данной работе была изучена роль протеа-сомного гидролиза МВР в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (experimental autoimmune encephalomyelitis £АЕ), животной модели рассеянного склероза.

Для этого были поставлены следующие задачи:

- Изучение необходимости модификации убиквитином для гидролиза МВР протеасомой.

- Сравнение субъединичного состава и субстратной специфичности протеасомы в ЦНС в норме и при развитии ЕАЕ. Сравнение качественного и количественного

спектра пептидов, образующихся при протеасомном гидролизе МБР в норме и при развитии аутоиммунной патологии ЦНС.

- Изучение направленного подавления гидролиза МБР протеасомой как потенциального метода терапии ЕАЕ

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые описан факт убиквитин-независимого протеолиза аутоантигенного белка. Полученные в настоящей работе данные расширяют знания об убиквитин-независимой деградации белков 26S протеасомой, указывают на возможную связь между протеолитической активностью иммунопротеасомы и развитием аутоиммунных патологий ЦНС, а также на перспективность специфических ингибиторов иммунопротеасомы как потенциальных лекарственных средств. Диссертационная работа имеет чётко выраженный фундаментальный характер и вносит существенный вклад в прояснение этиологии и патогенеза рассеянного склероза. Детальное изучение данной проблемы позволит в дальнейшем использовать полученные данные для создания новых методов терапии рассеянного склероза и создания лекарственных препаратов, направленных на подавление протеолитической активности иммунопротеасомы в центральной нервной системе.

Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 5 статей. Результаты диссертации были представлены на 6 российских и международных конференциях: конференции «Ломоносов-2010» (Москва, 2010), IV Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» (Московская обл., 2010), 38-ом конгрессе FEBS «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, Россия, июль 2013), XXVI Зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", (Москва, 2014), конференции «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург-Колтуши, 2014), VII Всероссийской конференции «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция» (Петрозаводск, 2014).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, заключение, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 35 рисунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 187 цитированных работ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1.Изучение необходимости модификации убиквитином для гидролиза МВР протеасомой

1.1.Деградация МВР протеасомой в клетках млекопитающих

Внутриклеточный протеолиз МВР изучали с использованием клеток НЕК, трансфицированных генетической конструкцией, кодирующей рекомбинантный МВР человека, слитный с FLAG-эпитопом. Вестерн-блоттинг лизатов клеток, обработанных циклогексимидом в течение различного количества времени (Рис. 1А), показал,.что в клетках НЕК МВР достаточно быстро подвергается протеоли-зу со средним временем полужизни около 1 часа. При этом протеолиз МВР очевидно осуществляется протеасомой, т.к. в присутствии ингибитора PS-341 его протеолиз практически полностью останавливается. Количество GFP, не являющегося субстратом для протеасомы, с течением времени остается практически неизменным. Для анализа протеолиз а внутриклеточного МВР протеасомой в условиях, более приближенных к физиологическим, была получена первичная культура олигодендроцитов. Иммуноцитохимический анализ подтвердил наличие значительного количество OSP-позитивных клеток (олигодендроцит-специфический белок), при этом процентное содержание GFAP-позитивных клеток (glial fibrillary acidic protein, маркер астроцитов) не превышало 10% (Рис. 1Б). Для усиления экспрессии эндогенного МВР клетки обрабатывали 0.2 мкМ раствором бензотропина в течение двух суток перед анализом. Важно отметить, что внутриклеточный МВР заметно накапливался под действием ингибитора протеасомы PS-341 (Рис. 1В), что свидетельствует о протеасомной природе метаболизма МВР в олигодендроцитах.

Чтобы определить, подвергается ли МВР убиквитинилированию в клетках, рекомбинантный MBP-FLAG иммунопреципитировали из гомогената клеток НЕК, котрансфицированных генетическими конструкциями, кодирующими rhMBP-FLAG и убиквитин, слитный с НА-эпитопом (HA-Ub) (Рис. 2). В качестве положительного контроля использовали прекурсор NF-xB белок рЮ5, слитный с FLAG-эпитопом. В качестве отрицательного контроля использовали белок Ubc6. После обработки клеток ингибитором протеасомы MG132 в преципитатах, содержащих MBP-FLAG, отсутствовали даже следовые количества полиубиквити-новых конъюгатов, в то время как в преципитатах, содержащих pl05-FLAG, по-лиубиквитиновые конъюгаты явно присутствовали. Таким образом, можно предположить, что в клетках млекопитающих МВР подвергается гидролизу протеасомой в отсутствии полиубиквитинилирования.

CHX, мин

0 60 120

— --

— -

1 1

Д."

ф

О не трансфиц.

v^K jtr ч f_40мкм , HST+OSP HST+GFAP

, 20МКМ , HST+OS HST+OSi>+GFAP

В

олигодендроциты

2 цМ

Бензотропин + + PS-B41 - +

о.

0Q

2

>

о -О

О 60 120 CHX, МИН

МВР actin

Рисунок 1. А. Определение скорости протеолиза белков в клетке с использованием циклогексимида (CHX). Б. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры зрелых олигодендроцитов. HST - ядерный краситель Hoechst 33342, OSP - анти-OSP антитело, GFAP - анти-GFAP антитело В. Протеолиз МВР в культуре олигодендроцитов. Вестерн-блоттинг лизатов культуры зрелых олигодендроцитов, обработанных и необработанных PS-341 и бензтропином. Гибридизация с антителами, специфичными к МВР и актину.

Чтобы определить, необходимо ли полиубиквитинилирование для гидролиза МВР протеасомой, были проведены дополнительные эксперименты с использованием генетической конструкции, кодирующей вариант убиквитина КО (UbKO), в котором все остатки лизина заменены на остатки аргинина, а также малыми интерферирующими РНК, блокирующими экспрессию убиквитин-лигазы El (El siRNA). Клетки линии НЕК были трансфицированы генетическими конструкциями, коди-

рующими UbKO или убиквитин дикого типа (Ub WT), слитных с туе эпитопом (Рис. ЗА и ЗБ).

11Ьсб + - + -

HA-Ub + + - +

Flag-p105 - + - -

rhMBP-Flag - - - +

12 3 4

Рисунок 2. Полиубиквитинилирова-ние МБР в клетках млекопитающих. Исходные лизаты клеток (слева) и соответствующие им элюаты после иммунопреципитации (справа) анализировали методом вестерн-блоттинга с окрашиванием анти-НА антителами. ГТААГ - полиакриламидный гель, - присутствующее в элюате анти-НЬАС антитело, к'С Не - его тяжелая цепь, ^О Ьс - его легкая цепь. рШ> -полиубиквитиновые коньюгаты.

8% ПААГ WB: анти-НА

лизат анти-FLAG

имунопреципитация

Во втором случае клетки были трансфицированы El siRNA или иррелевантной siRNA в качестве контроля (Рис. ЗВ и ЗГ). Спустя 24 часа клетки были повторно трансфицированы генетическими конструкциям, кодирующими белки МВР, с-Мус (контроль, убиквитин-зависимый субстрат) или орнитиндекарбоксилазу (ODC, контроль, убиквитин-независимый субстрат). Еще спустя 24 часа анализировали внутриклеточный протеолиз с использованием циклогексимида. Как и ожидалось, котрансфекция как UbKO, так и El siRNA к Е1 блокировала протеа-сомальный гидролиз белка с-Мус и способствовала его накоплению, в то время как протеолиз ODC протеасомой в этих условиях не изменялся по сравнению с контрольной трансфекцией. МВР подвергался протеолизу с одинаковой скоростью во всех условиях, что свидетельствует об отсутствии необходимости в модификации МВР убиквитином для его гидролиза протеасомой. 1.2. Протеолиз МВР 26S протеасомой in vitro

26S протеасому выделяли из головного мозга мыши по методике, включающей осаждение 40% сульфатом аммония, гель-фильтрацию и анионообменную хроматографию, что исключает присутствие каких-либо компонентов системы убикви-тинилирования.

myc-Ub KO mye-Ub WT

СНХ.Ч 0 1 2 3 0 1 2 3

rhMBP-Flag актин

не код. SiRNA

СНХ, ч 0 rhMBP-Flag

OOC-flag

НА-с-Мус

ODC-Flag НА-с-Мус

1 2 3 0 I

х .

у * 75 О О »= С

M SO

Б myc-l)b КО myc-Ub WT

СНХ, ч 0 1 2 3 0 1 2 3

ÔDC

rhMBP* Мус \

+UbWT

трансфекция rhMBP О DC не код. siRNA

с-Мус

WB: туе

+ - + -- + - + + " +

faMi »

Рисунок 3. Изучение необходимости модификации убиквитином для протеасо-мального гидролиза МВР в клетках млекопитающих.

МБР подвергался гидролизу in vitro в отсутствии каких-либо компонентов системы убиквитинилирования подобной высокоочищенной 26S протеасомой, в отличие от других белков - BSA, тиоредоксина и лизоцима, которые не подвергались протеолизу даже после 24 часов инкубации (Рис. 4А).

Чтобы изучить влияние заряда МВР на эффективность убиквитин-независимого протеолиза, были получены ацетилированая и деиминированая формы МВР, обладающие меньшим положительным зарядом. Скорость гидролиза как ацетилированного, так и деиминированного МВР очищенным препаратом 26S протеасомы существенно замедляется по сравнению с немодифицированным природным МВР (Рис. 4Б), что свидетельствует о том, что возможность убикви-тин-независимого протеолиза МВР по-видимому в первую очередь обусловлена большим положительным зарядом этого белка. Другим очевидным способом нейтрализации высокого положительного заряда МВР является образование ком-

плексов МБР с различными белками, которые частично компенсируют его высокий заряд.

Н 26S+ATP+...

26S - + + + Время, ч 24 1 4 24

+BSA

+тиоредоксин +bovMBP

+ЛИЭОЦИМ

немодифицированиый МБР

ацетилированный N

AcjO, моль

(РА700)2СР_ РА700-СР —

нативный электрофорез

флуоресценция

Suc-LLVY-AMC

Регуляторная субчастица (РА700)

20S субчастица (CP)

aHTO-Rpt6WB

анти-al,2,3,5,6,7 WB

деиминированныи МВР

остаточный МВР,%

остаточный М8Р. %

Рисунок 4. А.Электрофоретическое разделение в ПААГ гидролизатов различных белков очищенным препаратом 26S протеасомы. Анализ состава субъединичного состава очищенных препаратов протеасомы, сверху-вниз электрофоретическое разделение в нативном и денатурирующих ПААГ, вестерн-блоттинг с использованием соответствующих антител. Б. Снижение поверхностного положительного заряда МВР путем ацетилирования (слева) и деиминирования (справа) и гидролиз полученных модифицированных форм МВР очищенным препаратом 26S протеасомы.

Скорость гидролиза МВР протеасомой в присутствии различных белков определяли электрофоретическим разделением реакционных смесей в ПААГ с последующим денситометрическим анализом (Рис. 5А). Ни тетраубиквитин, ни моноубиквитин не влияли на скорость гидролиза МВР протеасомой, что позволяет предположить, что взаимодействие МВР с убиквитин-связывающими доменами 19S регуляторной субчастицы не является необходимым для его протеасомно-го гидролиза. Присутствие GST, BSA или лизоцима не влияло на скорость гидролиза МВР, в то время как актин, кальмодулин, гистон HI .3 и глатирамера ацетат (GA) ингибировали протеолиз МВР протеасомой. В дальнейшем методом поверхностного плазмонного резонанса было установлено, что МВР взаимодействует с актином, но не связывается с GA и гистоном HI .3, в то время как 26S протеасома

взаимодействовала с вА и гистоном Н1.3, но не взаимодействовала с актином (Рис. 5Б). Таким образом, белки, способные ингибировать гидролиз МБР, поделились на 2 подгруппы по механизму своего действия - взаимодействующие с МБР и взаимодействующие с протеасомой.

А i 26S - - + + МВР - + + + — -^¡ми i

МВР — —•

1500 МВР+ актин 2000

q 0) S 1500

СС 1000 о. со f СС 8з 1000

5 500 / с г 5оо

о 0 GA гистон Н1.3 О

-'

100 200 300 400 500 Время, с

100 200 300 400 500 Время, с

Рисунок 5. А. Электрофореграммы разделения в ПААГ продуктов гидролиза МБР 26S протеасомой in vitro в присутствии различных концентраций ряда белков. Б. Анализ связывания актина, гистона HI .3 и GA с МБР и 26S протеасомой.

2. Анализ физиологической значимости деградации МБР иммуно-протеасомой

2.1. Изучение баланса протеасома-иммунопротеасома в ЦНС при развитии ЕАЕ.

Нами было исследовано содержание субъединиц конститутивной лротеасо-мы (31/|35, и соответствующих им иммуносубъединиц |3li/|35i в различных отделах головного мозга контрольных мышей линии BALB/c, мышей линии SJL, предрасположенных к развитию ЕАЕ, и мышей линии SJL, развивающих ЕАЕ вследствие иммунизации (Рис. 6А). Выяснилось, что содержание иммуносубъединиц протеа-сомы во всех отделах головного мозга значительно повышается у мышей линии SJL при развитии ЕАЕ. Кроме того, статистически значимое увеличение содержания иммуносубъединиц протеасомы в коре, стриатуме и медиабазальном гипоталамусе (МБГ) наблюдалось у неиммунизированных мышей линии SJL в сравнении с мышами линии BALB/c.

ВАЬВ/с

ЭЛ.

ЕАЕ 5Л

Р1 (311 Р5 (351

¿£¿520

А

V (\

\ V...

4 1. ; , ='

„„.Л

Рисунок 6. А. Вестерн-блоттинг гомогенатов различных отделов головного мозга мышей на предмет наличия субъединиц конститутивной (|31/|35) или иммунной протеасомы ((3п/|351). МБГ - медиабазальный гипоталамус. Б-Д. Иммуноги-стохимический анализ срезов головного мозга неиммунизированных мышей линии БЛ. (Б) и мышей линии 81Ь, развивающих ЕАЕ (В,Г,Д).

Для локализации иммунопротеасомы в ЦНС было проведено иммуно-гистохимическое исследование срезов головного мозга экспериментальных мышей. У мышей, больных ЕАЕ, повышение экспрессии субъединицы fili в тканях ЦНС коррелирует с пониженной окраской на NeuN (Рис. 6Б и 6В), что свидетельствует о апоптотических процессах в нейронах. Данное наблюдение прямо указывает на связь между нейродегенерацией и активностью иммунопротеасомы. Интересно, что дальнейшее изучение локализации pli и |35i в ЦНС мышей с ЕАЕ, показало, что (3li накапливается в олигодендроцитах - резидентных клетках ЦНС, a (35i скорее всего привносится в ЦНС извне Т-клетками, проникающими через поврежденный гематоэнцефалический барьер (Рис. 6Г и 6Д).

22. Сравнение спектров деградации МБР конститутивной протеасомой и иммунопротеасомой

Процесс ферментативной деградации основного белка миелина может протекать по двум основным путям — с помощью протеасомы и протеаз. Чтобы выяснить, как отличается гидролиз МБР протеасомой в норме и патологии, мы провели in vitro гидролиз МБР протеасомами из головного мозга здоровых мышей и мышей, развивающих ЕАЕ, а также рядом протеолитических ферментов, которые, как полагают, ассоциированы с развитием рассеянного склероза. Продукты гидролиза анализировали методом тандем-масс-спектрометрии (Рис. 7). Под действием протеолитических ферментов в основном образовывались пептиды, относящиеся к фрагменту МВР1|0_,30, в то время как в гидролизатах протеасомой обнаруживались пептиды, относимые практически ко всей аминокислотной последовательности МБР. Особо необходимо отметить, что спектры пептидов, образуемые под действием протеасомы из головного мозга здоровых и развивающих ЕАЕ мышей, заметно отличаются друг от друга. Пептиды, полученные под действием протеасомы из головного мозга развивающих ЕАЕ мышей, существенно перекрывались с основными Т-клеточными эпитопами МБР. Для количественного сравнения относительного содержания пептидов МБР в протеасомных гидролизатах был разработан метод, основанный на применении воды, содержащей нуклид кислорода 180 (Рис. 8А). Пептиды, полученные при гидролизе МБР протеасомами из различных источников, отличались друг от друга на 2 единицы молекулярной массы, но обладали одинаковым временем удерживания на обращенно-фазовом сорбенте и одинаковой эффективностью ионизации. Это позволило осуществить количественный анализ образования более чем 250 фрагментов МБР под действием про-теасом из мышей линий BALB/c и SJL с и без ЕАЕ (Рис. 8Б).

Трипсин

Рисунок 7. Паттерны деградации МВР иротеасомами из головного мозга мышей, а также рядом протеаз, ассоциированных с развитием аутоиммунных патологий ЦНС. Сверху представлена аминокислотная последовательность МВР, каждая стрелка соответствует пептидному фрагменту этой аминокислотной последовательности, детектируемому масс-спектрометрически. Толщина стрелок соответствует количеству того или иного пептида по результатам безметочного (labelfree) анализа.

Из этого количества 5 пептидов по структуре подходили для загрузки на МНС I. Количество двух из этих пептидов. DTGILDSL (МВРзз.^) и ENPVVHFF (МВР83„9()) увеличивалось в 10 раз при гидролизе МВР протеасомой из мозга ЕАЕ SJL в сравнении с гидролизом МВР протеасомой из мозга мышей линии BALB/c.

Пептид МВР83.90 является частью энцефалитогенного фрагмента МВР, поэтому мы более детально изучили его образование при действии различных типов протеасомы на МВР. Для этого был синтезирован химически идентичный пептид с С-концевым фенилаланином, все атомы углерода и азота которого обладали массовыми числами 15 и 13, соответственно. Скорость образования пептида МВР83_90, рассчитанная исходя из известного количества внутреннего стандарта, оказалась до 8 раз больше при гидролизе МВР протеасомой из мозга ЕАЕ SJL. чем при гидролизе протеасомой из мозга неиммунизированных мышей линии SJL и мышей линии BALB/c (Рис. 9). За 24 часа под действием протеасомы из головного мозга EAE-SJL образуется порядка 0.83 моль пептида ENPVVHFF на 1 моль изначального МВР.

ьЕАЕ5Л("01:ВЛ.е/с('801 («^ь 5Л ' "'О'. ВЛ1 В-П "О!

>С,60">0Н

Рисунок 8. А.

Схематичное изображение метода количественно анализа паттернов деградации МБР протеа-сомой с использованием воды, содержащей нуклид кислорода |80. Б. Пример участка масс-спектра, полученного данным методом. В. Количественная оценка некоторых пептидов МБР, образующихся под действием протеасом.

265 протеасома • ЕАЕБЛ V 5Л в ВА1.В/С

23. Свидетельство презентации пептида МВР83-90 на МНС I и анализ цито-токсического действия МВРи.9()-специфических Т-клеток на олигодендроци-ты.

Для изучения возможности презентации пептида Е№УУНРБ на молекулах главного комплекса гистосовмечстимости первого класса (МНС I) были выделены мононуклеарные клетки из периферической крови мышей линии Б-ГЬ, интересующего нас гаплотипа Н-2\ СЗН (Н-2к) - в качестве положительного контроля и ВАЬВ/с (Н-2и) в качестве отрицательного контроля. Мононуклеарные клетки инкубировали с синтетическим пептидом ЕЫРУУНББ в течение 5 часов, тщательно отмывали, лизировали и определяли содержание ЕЫРУУНРР методом количественной масс-спектрометрии с мониторингом множественных реакций (МЯМ)

А

. Оч

1. исследуемый пептид ЕИРУУНЯЯ г внутренний стандарт ЕКРУУНРЯ(''Сд15!^

2.5 2.0 1.5 1.0 ' 0.5 О

26Б протеасома

• ЕАЕ5Л V 5Л

• ВАЬВ/с

у

Йб О . В О $

5 10 15

100 1

26Б протеасома

Рисунок 9. Участок масс-спектра (А), зависимость количества образовавшегося пептида ЕЫРУУНЕЕ от времени протеолиза (Б) и количество ЕКРУУНЕР, образовавшегося за 24 часа гидролиза МБР протеасомой из головного мозга мышей ВАЬВ/с, БЛЬ и ЕАЕ БЛЬ (в процентах от количества исходного МБР) (В).

10,000

5,000

, 11БА МНК+МВР83-90 18 33

ВАЬВ/с МНК+МВР83-90

время, мин 33

МНК+МВР83-90 олигодендроциты

хроматотрамма по полному ионному току, пик 18.3 мин

5Л

Рисунок 10. Анализ связывания пептида ЕЫРУУНРР с МНС I мыши методом МЯМ масс-спектрометрии. Хроматограммы по полному ионному току (слева) и пик, соответствующий данному пептиду (время удерживания 18,3 мин) для 5 МЯМ транзиций (справа).

(Рис. 10). В результате анализа исследуемый пептид был обнаружен в образцах клеток с гаплотипами Н-2к и H-2S , но не обнаружен в клетках с гаплотипом H-2d. Методом MRM также было показано, что количество ENPVVHFF, образованного из эндогенного МБР, увеличивается в культуре олигодендроцитов при обработке интерфероном-гамма.

На следующем этапе работы из мышей линии SJL методом активации ex vivo были получены цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к ENPVVHFF. В качестве контроля использовались цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к пептиду вируса энцефалита Тейлера FNFTAPFI. Цитотоксические ENPVVHFF-реактивные Т-лимфоциты специфически лизировали олигодендроциты, полученные из мышей линии SJL, при этом этот процесс ингибировался анти-МНС I антителами и его эффективность значительно увеличивалась в случае олигодендроцитов, обработанных интерфероном-гамма (Рис. 11).

IFNy- • - Л - к..

HST »» • . ^ ■ 9 20мкм TÍ* i

~ Л X.

bl¡ J * >■ у ■ Г / 1 !, ¿ OÍ+b*Íi . к-

А

- . , 4§£ *

FNFTAPFI ENPWHFF

Пептид, которым были активированы Т-лимфоциты

Рисунок 11. А. Иммуноцитохимия культуры зрелых олигодендроцитов, обработанных (внизу) и не обработанных (вверху) интерфероном-гамма. Гибридизация с антителами к 04 (маркер олигодендроцитов) и иммуносубъединице протеасомы |ЗН. Б. Лизис олигодендроцитов, обработанных (№N7+) и не обраотанных (№N7-) интерфероном-гамма, цитотоксическими Т-лимфоцитами.

3. Подходы к направленному подавлению гидролиза МБР протеасомой для терапии ЕАЕ

Как показали результаты предыдущих экспериментов, протеолиз МБР им-мунопротеасомой может быть одним из этапов СТЬ-опосредованного разрушения миелиновой оболочки нервных волокон и развития аутоиммунных патологий ЦНС. Если блокировать этот процесс, то это, возможно, остановит или замедлит аутоиммунную демиелинизацию. Подавление экспрессии иммуносубъединиц про-теасомы с помощью соответствующих вПША является способом воздействия на процесс протеолиза МБР иммунопротеасомой. Проведение предварительной трансфекции клеточной культуры в^ЫА к иммуносубъединицам протеасомы |ЗН и |351 в сравнении с контрольной $1КМА не только понижало уровень экспресии соответствующих иммуносубъединиц, но и ингибировало внутриклеточный протеолиз МБР (Рис. 12).

А Б

ядерный краситель анти-FLAG мАт наложение

Рисунок 12. А. Иммуноцитохимический анализ клеток линии HeLa, трансфици-рованных генетической конструкцией, кодирующей МБР, слитный с Flag эпито-пом. Контрольная трансфекция - НА-с-Мус. Б. Вестерн_блоттинг лизатов клеток линии HeLa, экспрессирующих рекомбинантный МБР, обработанных (IFNy+) и необработанных (IFNy-) интерфероном у, а также клеток, в которых понижен уровень иммуносубъединиц (3li и (35i в результате воздействия малых интерферирующих РНК.

Другой подход к блокированию протеолитической активности иммунопроте-асомы заключается в применении низкомолекулярных ингибиторов. Для этого были проанализированы 3 ингибитора протеасомы: PS-341, воздействующий на все каталитические субъединицы конститутивной и иммунопротеасомы; MG-132, ингибирующий преимущественно химотрипсин-подобную активность конститу-

тивной и иммунопротеасомы, и (М i-специфический пептидилэпоксикетон, необратимо ковалентно связывающий остаток треонина в активном центре данной субъединицы. Констнты ингибирования для PS-341 и MG-132 (Табл. 1) соответствовали ранее опубликованным данным. Константа ассоциации kobs/[I] для (35i-специфического пептидилэпоксикетона составила около 240 М 'сек"1. PS-341 и MG-132 одинаково воздействовали на протеасому из головного мозга здоровых и развивающих ЕАЕ мышей. В случае pi ¿-специфического пептидилэпоксикетона, как и следовало ожидать, эффективность ингибирования напрямую зависела от количества конститутивных и иммуносубъединиц протеасомы. Наиболее эффективно данный ингибитор подавлял активность протеасомы из головного мозга EAE-SJL мышей, при этом он практически не воздействовал на протеасому из головного мозга мышей линии BALB/c (Рис. 13А). Все три протестированных ингибитора существенно замедляли гидролиз MBP 26S протеасомой in vitro (Рис. 13Б).

Таблица 1. Ингибирование химотрипсин-подобной активности протеасомы из головного мозга мышей.

26S протеасома из головного мозга PS-341'К„нМ MG-132' Kt, нМ (31 i-PEk wm.MV

BALB/c 7±2 28±8 не определена

Контрольные SJL 10±3 35±8 230±60

ЕАЕ SJL 6±2 26±4 250±40

На конечном этапе была протестирована способность ингибиторов Р8-341 и (311-специфического пептидилэпоксикетона подавлять развитие ЕАЕ у мышей линии БЛЬ. Указанные препараты вводили внутривенно в хвостовую вену 2 раза в неделю с первого по 21й день после иммунизации. Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что Р1 ¡-специфический пептидилэпоксикетон снижает тяжесть протекания заболевания эффективнее, чем Р8-341 в той же дозировке (0.5 мг/кг) (Рис. 13В).

«JL

' активность,0/

loo XiX

80 60 4020

mm ¿х^ i-ui

ДМС0 PS-341 MG132 pii-PEk

Г*. ™ —

Ш m 4- m

МБР EAE SJL 26S + MBP

Рисунок 13. А. Химотрипсин-подобная активность протеасомы (в процентах от активности протеасомы, не обработанной ингибиторами) при воздействии 1% ДМСО (контроль), 1 мкМ PS-341, 1 мкМ MG-132 и 1 мкМ [31 ¡-специфического пептидилэпоксикетона Б. Воздействие ингибиторов протеасомы на гидролиз МБР in vitro 26S протеасомой из головного мозга мышей SJL-EAE. В. Терапия ЕАЕ ингибиторами протеасомы у мышей линии SJL

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

На основании полученных в работе данных можно сделать предположение о роли убиквитин-независимого гидролиза МБР иммунопротеасомой в развитии аутоиммунных патологий ЦНС (Рис. 14). Рассеянный склероз и ЕАЕ характеризуются повреждением гематоэнцефалического барьера и развитием воспаления в ЦНС, что приводит к активному траффику аутореактивных лимфоцитов в ЦНС. Секре-тируемые ими провоспалительные цитокины, в частности интерферон-гамма, взаимодействуют с соответствующими рецепторами на поверхности олигодендроци-тов и посредством сигнальных каскадов активируют экспрессию в этих клетках иммуносубъединицы протеасомы pli. Под действием иммунопротеасомы образуется повышенное количество пептида МВР83_9(, [ENPVVHFF1, который в контексте МНС I эффективно распознается CD 8+ Т-лимфоцитами. Непосредственное взаимодействие олигодендроцитов с эффекторными клетками, обусловленное

В

I

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

0

иммунизация

этими событиями, приводит к их гибели, разрушению миелиновой оболочки и, как следствие, нарушению проведения нервного импульса.

Рисунок 14. Предполагаемая патологическая роль убиквитин-независимого гидролиза МВР иммунопротеасомой в развитии аутоиммунных заболеваний ЦНС

ВЫВОДЫ.

1. На основе проведенных экспериментов показано, что один из наиболее важных аутоантигенов при рассеянном склерозе, основной белок миелина (МВР), при физиологически значимых концентрациях гидролизуется 26S протеасомой по убиквитин-независимому пути. Возможность убиквитин-независимого протеоли-за МВР как минимум частично обусловлена его аномально высоким положительным зарядом.

2. Продемонстрировано, что количество каталитических иммуносубъединиц протеасомы значительно возрастает в ЦНС животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЕАЕ). При этом субъединица |3li локализована преимущественно в олигодендроцитах - резидентных клетках ЦНС, a |35i локализована преимущественно в Т-лимфоцитах, проникающих в ЦНС через поврежденный гематоэнцефалический барьер.

3. При гидролизе МВР иммунопротеасомой, выделенной из головного мозга мышей, развивающих ЕАЕ, образуется повышенное количество ряда пептидов, в том числе пептида MBPS3.90 [ENPVVHFF], являющегося частью энцефалитоген-ного фрагмента МВР. CD8+ Т-клетки, специфичные к данному пептиду, лизиру-ют обработанные интерфероном-гамма олигодендроциты ex vivo, что указывает на возможную роль иммунопротеасомы в аутоиммунной демиелинизации.

4. Специфический ингибитор иммуносубъединицы (311 селективно воздействует на иммунопротеасому in vitro, а также эффективно подавляет развитие ЕАЕ in vivo у экспериментальных животных. Это свидетельствует о перспективности применения ингибиторов иммунопротеасомы, в том числе (3li-специфических пептидилэпоксикетонов, в качестве терапевтических средств против аутоиммунных заболеваний ЦНС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи:

1) Бачева А.В., Белогуров А.А., Кузина Е.С.. М.В. Серебрякова, Н.А. Поно-маренко, В.Д. Кнорре, В.М. Говорун, А.Г. Габибов. Функциональная деградация основного белка миелина. Протеомный подход. // Биоорганическая химия. — 2011. — Т. 37, № 1. — С. 39-47.

2) Кузина Е.С.. Черноловская Е.Л., Кудряева А.А., Зенкова М.А., Кнорре В.Д., Сурина Е.А., Пономаренко Н.А., Бобик Т.В., Смирнов И.В., Бачева, А.В. Белогуров А.А., Габибов А.Г., Власов В.В. Ускорение внутриклеточного протео-лиза основного белка миелина иммунопротеасомой. // Доклады Академии наук, серия Биохимия и биофизика. — 2013. — Т. 453, № 4. — С. 446-449.

3) Belogurov, A. Jr, Kudriaeva А., Kuzina jL, Smirnov I. , Bobik Т. , Ponoma-renko N., Kravtsova-Ivantsiv Y., Ciechanover A. , and Gabibov A.. Multiple sclerosis autoantigen myelin basic protein escapes control by ubiquitination during pro-teasomal degradation. // Journal of Biological Chemistry. — 2014. — Vol. 289, no. 25.

- P.17758-17766.

4) Kuzina E„ Kudriaeva A., Smirnov I., Dubina M., Gabibov A., Belogurov A. Jr. Glatiramer acetate and nanny proteins restrict access of the multiple sclerosis autoantigen myelin basic protein to the 26s proteasome. // BioMed Research International.

- 2014. - P. 2014:926394-2014:926394.

5) Belogurov A.Jr*, Kuzina E.*, Kudriaeva A., Kononikhin A.,Kovalchuk S, Surina Y„ Smirnov I., Lomakin Y„ Bacheva A., Stepanov A., Karpova Y., Lyupina Y., Kharybin O., Melamed D„ Ponomarenko N„ Sharova N„ Nikolaev E., Gabibov A. Ubiquitin-independent proteosomal degradation of myelin basic protein contributes to development of neurodegenerative autoimmunity. // FASEB Journal. - 14-259333 — 2015, Jan 29. 2015. * - equal contribution

Опубликованные тезисы конференций и доклады:

1) Кузина Е.С, Бачева А.В., Белогуров А.А., Габибов А.Г. Влияние состава каталитических субъединиц 26S протеасомы мыши на ееферментативную активность. Конференция «Ломоносов-2010» (Москва, 2010)

2) Кузина Е.С.. Кононихин А.С., Белогуров А.А., Бачева А.В., Харыбин О.Н., Пономаренко Н.А., Николаев Е.Н., Габибов А.Г.. Изучение протеолиза основного белка миелина при аутоиммунных патологиях ЦНС методом масс-спектрометрии. IV Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» (Московская обл., 2010).

3) Kuzina Е.. Kudriaeva A.,Bacheva A.,Gabibov A.,Belogurov A.. Brain-derived immunoproteasome generates increased amounts of encephalitogenic mbp peptide epitope. The 38th FEBS Congress, Санкт-Петербург, 2013

4) Кузина E.Cj, Кудряева A.A., Сурина E.A., Кононихин А.С., Бачева А.В., Белогуров А.А., Габибов А.Г. Патогенное значение иммунопротеасом субъединичного состава (3lihlghp5ilow при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите. XXVI Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2014

5) Кузина Е.С.. Кудряева А.А., Сурина Е.А., Кононихин А.С., Бачева А.В., Белогуров А.А., Габибов А.Г. Убиквитин-независимый гидролиз основного белка миелина протеасомой и его роль в развитии аутоиммунных патологий ЦНС. Конференция «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург-Колтуши, 2014)

6) Кузина Е.С.. Кудряева А.А., Сурина Е.А., Кононихин А.С., Бачева А.В., Белогуров А.А., Габибов А.Г. Убиквитин-независимый гидролиз основного белка миелина протеасомой и его роль в развитии аутоиммунных патологий ЦНС. VII Всероссийская конференция "Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция", Петрозаводск, 2014.

Подписано в печать:

07.04.2015

Заказ № 10687 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \vww.autoreferat. ги