Механизмы взаимодействия производных тетрагидро-γ-карболинов с митохондриями тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ВИНОГРАДОВА Дарья Викторовна

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕИСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ТЕТРАГИДРО-у-КАРБОЛИНОВ С МИТОХОНДРИЯМИ

02.00.10 - биоорганическая химия 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

5 КОН 2014

005549632

Черноголовка - 2014

005549632

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологически активных веществ Российской академии наук (ИФАВ РАН)

Научный руководитель:

Научный консультант:

Шевцова Елена Феофановна

кандидат химических наук, заведующая лабораторией молекулярного скрининга ИФАВ РАН

Бачурнн Сергей Олегович

доктор химических наук, член-корреспондент РАН, директор ИФАВ РАН

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Санина Наталия Алексеевна

доктор химических наук, заведующая отделом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем химической физики Российской академии наук, Гусаров Дмитрий Алексеевич кандидат химических наук, старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-

исследовательский институт эпидемологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Защита состоится « 24_» июня 2014 г. в 14 на заседании диссертационного совета Д 002.102.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологически активных веществ Российской академии наук по адресу: 142432, Московская обл., г. Черноголовка, ул. Северный проезд, д. 1. С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИФАВ РАН.

Автореферат разослан > мая 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.002.102.01,

кандидат химических наук

^¡туч

С.В. Афанасьева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В связи с ростом средней продолжительности жизни в развитых странах одш из самых актуальных проблем здравоохранения является проблема обусловленных возрастом нейродегенеративных заболеваний. Наиболее распространенной формой деменции является болезнь Альцгеймера (БА). По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире проживает более 35 миллионов человек с БА, на лечение людей с деменцией и уход за ними ежегодно расходуется более 600 миллиардов долларов США. До сих пор не разработана эффективная нейропротекторная терапия, а препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний являются симптоматическими и направлены на компенсацию специфического для данного заболевания медиаторного дефицита, а также не решена проблема ранней медицинской диагностики данного заболевания.

Было установлено, что важным звеном патогенеза БА является нарушение митохондриальных функций и, в том числе, снижение их способности регулировать гомеостаз кальция в клетке и устойчивости к процессу скачка митохондриальной проницаемости (СМП). Процесс СМП обусловлен открытием комплекса пор, что является ключевым этапом каскадов гибели клеток. Именно поэтому митохондрии, и особенно процесс СМП, являются крайне перспективной мишенью для поиска нейропротекторных препаратов. Было показано, что нейропротекторное действие в различных моделях токсичности отечественного препарата димебон (3,6-диметил-9-(2-метилпиридил-5)-этил-1,2,3,4-тетрагидро-у-карболина дигидрохлорид),

являющегося одним из перспективных лекарственных средств лечения БА, по меньшей мере частично обусловлено именно взаимодействием с митохондриями - с его способностью увеличивать их устойчивость к индукции СМП. Однако конкретные митохондриальные мишени димебона до конца не известны. В связи с этим возникает необходимость детального исследования влияния и механизмов взаимодействия димебона с основными компонентами поры СМП. Одновременно с этим, принимая во внимание нейропротекторное действие димебона, особый интерес представляет направленный синтез и

Рисунок I. Структурная формула димебона.

последующий скрининг активности ряда его структурных аналогов.

Целью настоящей работы являлось исследование механизма влияния димебона на процесс СМП и кальциевый гомеостаз митохондрий, а также поиск потенциальных эффективных нейропротекторов в ряду его новых структурных аналогов.

Основными задачами настоящей работы являлись:

1. Разработка комплексной системы скрининга на проявление митопротекторной активности и ее практическая проверка на примере оригинальных аналогов димебона в ряду производных тетрагидро-у-карболинов.

2. Исследование механизма действия димебона на явление скачка митохондриальной проницаемости митохондрий мозга крыс.

3. Исследование действие димебона на кальциевый гомеостаз митохондрий мозга крыс.

4. Анализ взаимосвязи структуры и влияния на функциональные характеристики митохондрий для серии оригинальных аналогов димебона в ряду производных тетрагидро-у-карболинов.

Научная новизна работы

Впервые исследованы механизмы влияния димебона на процесс СМП митохондрий мозга крыс. Показано, что способность димебона увеличивать устойчивость митохондрий к СМП зависит от энергизации митохондрий, при полном ингибировании работы дыхательной цепи димебон не подавляет СМП. Также показано, что, в отличие от известного ингибитора СМП циклоспорина А, димебон не влияет на информационные переходы переносчика адениновых нуклеотидов. Способность димебона увеличивать кальциевую ёмкость митохондрий зависит от характера увеличения кальция в среде.

Был разработан комплекс методик для скрининга активности потенциальных

нейропротекторных препаратов, основной мишенью которых являются митохондрии.

С применением разработанного комплекса методов впервые был проанализирован

ряд новых структурных аналогов димебона, содержащих тетрагидро-у-карболиновую

фармакофорную группировку. Установлено, что биологическая активность

соединений зависит не только от природы заместителей в тетрагидро-у-карболиновой

группировке, но и от структуры фрагмента, связанного через этильный линкер,

2

присоединенный к атому азота пиррольного цикла. Обнаружены соединения, которые повышают устойчивость митохондрий к индукции СМП эффективнее, чем димебон. Показан нейропротекторный эффект соединения-лидера в моделях глутаматной эксайтотоксичности и в модели свободнорадикального окислительного стресса на первичных культурах гранулярных клеток новорожденных крыс.

Практическая значимость

Исследованные в настоящей работе соединения перспективны в качестве эффективных препаратов для лечения, в том числе предупреждения, нейродегенеративных расстройств (в первую очередь, БА). В настоящее время одно из выявленных соединений-лидеров выбрано для доклинических исследований в рамках Федеральной целевой программы Министерства образования и науки. Помимо этого, методологические находки при разработке совокупности методов скрининга ТГК также представляют практический интерес в области поиска потенциальных лекарственных препаратов, основной мишенью которых являются митохондрии.

Личный вклад автора

Диссертант принимал активное участие в постановке целей и задач работы, выборе методов исследования и их апробации. Экспериментальные исследования, анализ и интерпретация полученных результатов, а также подготовка научных статей к публикации выполнены непосредственно автором.

Апробация работы

Основные результаты были доложены на следующих Российских и международных конференциях: 1ая Российская конференция по медицинской химии «MedChem Russia-2013» (г. Москва, 2013), 17ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, 2013), 26th ECNP Congress (г. Барселона, Испания, 2013), 4ая международная научная конференция «Химия, структура и функция биомолекул» (г. Минск, Белоруссия, 2012), 24th ECNP Congress (г. Париж, Франция, 2011), 8th IBRO Word Congress of Neuroscience (г. Флоренция, Италия, 2011).

Публикации

По материалам работы опубликовано 3 научные статьи в российских и международных журналах, 1 статья в электронном виде на сайте журнала и 7 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем н структура работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 123 страницах, включает 26 рисунков и 10 таблиц. Список литературы содержит 240 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность и практическая значимость работы, сформулированы цели исследования и показана его научная новизна.

В литературном обзоре рассмотрены основные гипотезы механизмов патогенеза БА, а также проанализирована роль митохондрий в развитии нейродегенеративных заболеваний. Проанализированы механизмы запуска процесса скачка митохондриальной проницаемости (СМП) и выделены основные потенциальные мишени действия митохондриально-направленных нейропротекторов. Приведены сведения о существующих лекарственных средствах, используемых при лечении больных с БА, и об основных тенденциях развития данной группы препаратов. Обсуждены имеющиеся к настоящему моменту данные литературы о биологической активности и о применении гамма-карболинов и их производных.

В заключительной части главы сделаны выводы и обоснован выбор объектов и методов исследования.

Экспериментальная часть содержит описание используемых объектов и методов их исследования.

Экспериментальные животные

Для опытов in vitro использовали самцов нелинейных беспородных белых крыс, массой 200-300 г в возрасте 3.5 - 4 месяца. Помимо этого, были использованы трансгенные 5xFAD мыши, которые содержат обнаруживаемые при наследственных формах болезни Альцгеймера мутации: тройную мутацию в гене, кодирующем белок-предшественник бета-амилоида, и двойную мутацию пресенилина (линия

Тв(АРР8\уР1Ьоп,Р8ЕМ1*М146Ь*Ь286У)6799Уа5/.1). Эти мыши были предоставлены сотрудниками лаборатории генетического моделирования нейродегенеративных процессов ИФАВ РАН. Мышей использовали в возрасте 7-8 месяцев.

Животные содержались в условиях стандартного вивария с 12-ти часовым световым режимом и свободным доступом к воде и пище. При выделении митохондрий печени крыс, животные переводились на голодную диету за 24 часа до начала эксперимента. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с решениями комиссии по Биоэтике ИФАВ РАН.

Соединения

Тетрагидро-у-карболины и их соли (гидрохлориды) были синтезированы в лаборатории синтеза физиологически активных веществ ИФАВ РАН.

Выделение субклеточных фракций

При изучении влияния тетрагидро-у-карболинов на митохондрии использовали препараты изолированных митохондрий печени, неочищенной синаптосомально-митохондриальной фракции (р2) и очищенных на градиентах Перколл несинаптосомальных митохондрий мозга крыс. Все виды фракций получали по стандартным методикам дифференциального центрифугирования. Определение выхода митохондрий проводили при помощи определения белка в препаратах микробиуретовым методом. Для сохранения функциональной активности митохондрии хранили при 4°С и использовали в течение 3-4 часов с момента выделения.

Трансмембранный потенциал митохондрий измеряли по флуоресценции потенциал-зависимого индикатора сафранина О в 96-луночных планшетах на многофункциональном анализаторе Укк>гЗ компании "РегклпЕ1тег". Регистрировали флуоресценцию при 485 нм / 590 нм.

Действие соединений на скачок митохондриалыюй проницаемости (СМП) оценивали по их влиянию на набухание митохондрий. Процесс набухания митохондрий регистрировали спектрофотометрически в 96-луночных планшетах при 530 нм на планшетном анализаторе У1с1огЗ компании "Рег1апЕ1тег". Действие соединений исследовали как на препаратах энергизованных митохондрий (в присутствии субстратов дыхательной цепи митохондрий), так и на препаратах деэнергизованных митохондрий (в условиях ингибирования дыхательной цепи

митохондрий). В качестве индукторов неспецифической проницаемости использовали растворы хлорида кальция и атрактилозида.

Кальциевую емкость несинаптосомальных митохондрии мозга определяли спектрофлуориметрически с использованием непроникающего кальциевого зонда четвертого поколения - Calcium Green-5N (CaG5N). Измерения проводили в 24-луночных и 96-луночных планшетах на анализаторе Victor3 компании "PerkinElmer". Измерения проводили в 3 различных режимах: режиме единственной добавки, режиме болюсов и режиме насоса. При скрининге активности структурных аналогов димебона оценивали их действие на кальциевую ёмкость митохондрий при добавлении раствора хлорида кальция в режиме болюсов.

Конформационные изменения переносчика аденнновых нуклеотидов (ANT) оценивали спектрофотометрически по методике Halestrap А.Р. при 530 нм на планшетном анализаторе Victor3 компании "PerkinElmer". Смотрели действие атрактилозида и катионов кальция на конформацию ANT в присутствии димебона и циклоспорина А.

Образование активных форм кислорода митохондриями оценивали при помощи флуоресцентного зонда 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата. Флуоресценцию регистрировали в 96-луночных планшетах на планшетном анализаторе Victor3 компании "PerkinElmer" при 485 нм / 535 нм.

Перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс оценивали по накоплению ТБК-реактивных продуктов спектрофотометрически на планшетном анализаторе Victor3 компании "PerkinElmer".

Исследование нейротоксичности и нейропротекторных свойств тетрагндро-у-карболинов. Нейроны получали из коры мозга новорожденных крыс (1-2 сут) способом трипсинизации. Также использовали гранулярные клетки новорожденных крыс, полученные аналогичным методом. Эксперименты проводились на 8-10 суточных культурах. Нейротоксичность индуцировали, добавляя к культуре клеток глутамат (Глу) или трет-бутилгидроксипероксид (тБГП). Выживаемость нейронов определяли с помощью МТТ теста по методике Niks и Otto.

Анализ и статистическую обработку всех полученных данных проводили с помощью программ OriginPro 8, Microsoft Excel 2007 и Statistica 5.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Действие димебона на пору скачка митохондриальной проницаемости

В присутствии субстратов дыхательной цепи димебон снижает скорость открытия пСМП независимо от типа используемого субстрата как на митохондриях мозга, так и на митохондриях печени крыс (рис. 2). Степень ингибирования СМП в присутствии димебона не различается значительно в зависимости от источника митохондрий. Несмотря на различия между процессами СМП в митохондриях печени и мозга, димебон является модулятором пСМП, а его ингибирующая способность не меняется.

Также оценивали действие димебона на СМП деэнергизованных митохондрий. В условиях модели деэнергизованных митохондрий окислительное фосфорилирование заблокировано и невозможен активный транспорт кальция в митохондриальный матрикс, при этом кальций свободно диффундирует в/из митохондрий. В данных условиях димебон, в отличие от циклоспорина А, не способен ингибировать СМП, вызванный катионами кальция, как в митохондриях мозга, так и в митохондриях печени крыс.

10 .4) 40 50

С (СяСу, мкМ

Рисунок 2. Действие димебона на калъций-индуг^рованное набухание митохондрий мозга (А) и печени (В) крыс при энергизации субстратом комплекса II ДЦ и ингибировании комплекса I.

Нами было показано, что на изолированных митохондриях мозга крыс на

модулирующую СМП активность димебона, в отличие от циклоспорина А, не

оказывает влияние добавление экзогенного АДФ. Поэтому анализировали

зависимость ингибирования СМП димебоном от активности переносчика адениновых

нуклеотидов, который либо играет регуляторную роль в процессе образования пСМП,

7

либо принимает непосредственное участие в формировании пор. Димебон не способен ингибировать СМП, вызванный добавлением 200 мкМ атрактилозида -специфического ингибитора переносчика адениновых нуклеотидов (рис. 3). Однако в присутствии 5 мкМ атрактилозида - концентрации, достаточной для полного ингибирования переносчика и для его перевода в ц-конформацию, димебон снижает скорость открытия пСМП, вызванного катионами Са2+(рис. 3).

25 мкМ CaCI, 5 мкМ АтР 200 мкМ Атр 25 мкМСаС!

Рисунок 3. Действие димебона и циклоспорина А на набухание митохондрий мозга крыс в присутствии атрактилозида (Атр). * - р<0.05 по сравнению с кнтролем в присутствии того же индуктора СМП. # - р<0.05 по сравнению с Са2+-индуцированньш СМП.

Атрактилозид в концентрации 5 мкМ не вызывает открытия пСМП, но потенцирует Са2+-индуцированное открытие пСМП. Степень ингибирования димебоном и циклоскпорином А не меняется при добавлении атрактилозида, значения скорости набухания увеличиваются пропорционально увеличению скорости контрольных проб.

В отличие от ЦсА, димебон не оказывает влияния на конформационное равновесие переносчика адениновых нуклеотидов (рис.4). Ни димебон, ни циклоспорин А не способны смещать устанавливающееся в присутствии атрактилозида и катионов Са2+ стационарное равновесие между конформациями ANT в митохондриях. Однако циклоспорин А, в отличие от димебона, снижает скорость

установления нового стационарного равновесия конформаций ANT в присутствии атрактолозида. Полученные данные свидетельствуют о том, что димебон не оказывает влияния на сам информационный переход ANT, и косвенно - на то, что его СМП-направленное действие не зависит от конформации ANT.

— контроль

— 5 мкМ атрактнлозид •— Дмб + 5 мкМ Атр

ЦсА + 5 мкМ Атр

Рисунок 4. Действие димебона и циклоспорина А на конформационные изменения переносчика адениновых нуклеотидов.

Время, мни

Таким образом, впервые было обосновано, что димебон не взаимодействует непосредственно с основными компонентами модельной пСМП, по крайней мере в том ее составе, в каком она образуется в рассмотренных в настоящей работе условиях. Действие димебона на пСМП может зависеть от дыхательной активности митохондрий, либо быть направлено на регуляцию кальциевого гомеостаза.

Влияние димебона на кальциевый гомеостаз митохондрнй

Эффективность димебона по отношению к процессам накопления и выброса кальция митохондриями зависит от используемой экспериментальной модели. В литературе описано 3 варианта добавления кальция в систему с изолированными митохондриями: в режиме однократного пульса, в режиме болюсов и в режиме насоса. В настоящей работе было впервые произведено сравнение действия димебона на кальциевую емкость митохондрий в условиях различных экспериментальных методов определения кальциевой емкости митохондрий. Димебон не вызывает достоверного увеличения кальциевой емкости митохондрий при добавлении раствора хлорида кальция в режиме насоса. С другой стороны, димебон увеличивает кальциевую емкость митохондрий в режимах болюсов и однократного пульса независимо от того, какой субстрат дыхания митохондрий использован (рис. 5).

Известно, что на молекулярном уровне передача сигналов с участием кальция имеет дискретный характер, поскольку требуются очень высокие значения концентрации катионов кальция для запуска тех или иных кальций-зависимых процессов. Также известно, что при БА уровень внутриклеточного свободного Са2+ повышен, поэтому принципиально важно для поддержания когнитивных функций и для повышения общей жизнеспособности нейронов увеличение устойчивости митохондрий к новым пульсам Са2+ на фоне повышенного содержания данного катиона в среде. Увеличение буферной емкости митохондрий, а точнее - увеличение пороговой концентрации кальция для индукции СМП, потенциально снижает риск индукции апоптоза при функциональной активности нейронов.

Рисунок 5. Действие димебона на способность митохондрий мозга накапливать Са2' в присутствии различных субстратов дыхательной цепи: А -5 мМ глутамат + 2 мМ малат; В - 5мМ пируват + 2 мМ мачат; С - 5 мМ сукцинат + 1 мкМротенон. Представлены результаты типичного опыта.

Помимо того, димебон способен увеличивать кальциевую емкость митохондрий в присутствии бета-амилоида ('А/},.40 и Добавление бета-

амилоида к суспензии митохондрий приводит к снижению их кальциевой емкости. Более того, у трансгенных животных 5xFAD с мутациями, которые приводят к повышенному содержанию А/5, в возрасте 7 месяцев кальциевая ёмкость митохондрий мозга достоверно (р < 0.05) ниже по сравнению с контролем дикого типа того же возраста (рис.бА). Димебон достоверно (р < 0.05) увеличивает кальциевую емкость митохондрий в присутствии экзогенного бета-амилоида in vitro, как и без бета-амилоида. Однако при исследовании действия димебона на митохондрии мозга

5хРАО мышей со значительным уровнем выраженности амилоидной патологии достоверного эффекта димебона на кальциевую емкость митохондрий выявить не удалось (рис.бБ).

Рисунок 6. Кальциевая ёмкость митохондрий мозга 5хГАИ мышей. А. Сравнение кальциевой ёмкости митохондрий мозга модельных БА 5хРАй мышей (1) и мышей дикого типа (2). Б. Действие димебона (2) и циклоспорина А (3) на кальциевую ёмкость митохондрий мозга 5хРАО мышей в сравнении с контролем (1). Приведены характерные кривые. Значение флуоресценции нормировано на максимальный сигнал.

Влияние димебона на перекисное окисление липидов (ПОЛ) гомогената мозга крыс

Ранее в лаборатории нейрохимии ИФАВ РАН было показано, что на митохондриях печени крыс димебон способен снижать уровень ПОЛ, инициированного тБГП. Чтобы оценить действие димебона на редокс процессы в мозге, в данной работе было исследовано его влияние на процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенатах мозга крыс. В качестве инициаторов перекисного окисления использовали трет-бутилгидропероксид (т-БГП) -

непосредственный источник свободных радикалов, и РеНН4(804)2х12Н20 -катализатор реакции Фентона.

Было установлено, что димебон ингибирует ПОЛ, вызванное т-БГП, лишь в концентрациях выше 500 мкМ. При этом димебон ингибировал ПОЛ не более чем на 20% (рис. 7А). При использовании в качестве инициатора ПОЛ соли железа димебон снижал ПОЛ в концентрациях свыше 200 мкМ. Степень ингибирования ПОЛ в присутствии димебона при этом не превышала 35% (рис. 7Б).

ГЧ-

Ч

Рисунок 7. Действие димебона на перекисное \ • окисление липидов в

гомогенате мозга крыс. А. Инициатор - т-БГП. Б. Инициатор -РеЫН4(804)2х12Н20. ■ * -р<0.05 по Ыеь1.

с(Дмб), мкМ с(Дый). МкМ

С другой стороны, установлено, что димебон в концентрациях 50-100 мкМ существенно снижает самопроизвольное перекисное окисление липидов, то есть в отсутствии внешних индукторов (рис. 8). При этом степень самопроизвольного окисления по истечении 2 часов инкубации гомогенатов мозга при 37°С сопоставима с уровнем т-БГП-вызванного ПОЛ.

Рисунок 8. Перекисное

- контроль

- 50 мкМ димебон

- 100 мкМ димебон

- 1мкМ Цс

окисление липидов в гомогенате мозга крыс в отсутствие индукторов. За 100% принимали концентрацию ТБК-реактивных продуков в гомогенатах мозга через 120 минут инкубации при 37'С.

Таким образом, димебон, не являясь прямым антиоксидантом, способен подавлять перекисное окисление липидов в мозге.

Поиск потенциальных нейропротекторов в ряду структурных аналогов димебона

С целью поиска новых потенциальных мультитаргетных нейропротекторов, обладающих также когнитивно-стимулирующим действием, в лаборатории синтеза физиологически активных веществ ИФАВ РАН было синтезировано 30 новых структурных аналогов димебона, содержащих фармакофорный тетрагидро-у-карболиновый фрагмент. Нами была разработана совокупность методик для поиска потенциальных нейропротекторных препаратов по их влиянию на функции митохондрий. Все методы были адаптированы для проведения скрининга в планшетном формате. Для первичного скрининга использовали соединения в концентрации 30 мкМ, исходя из диапазона эффективных концентраций димебона на препаратах изолированных митохондрий и литературных данных для большой совокупности препаратов.

Синтезированные соединения отличаются заместителями у атома азота пиррольного цикла, а также заместителями в положении 2- и 8-тетрагидро-у-карболиновой системы. В зависимости от природы заместителя у атома азота пиррольного цикла было условно выделено 3 группы соединений: монофторированные структурные аналоги димебона (группа 1), трифторметилсодержащие аналоги (группа 2) и амидоэтилкарболины (группа 3). В настоящей работе использовали гидрохлориды тетрагидро-у-карболинов.

Группа 1 Группа 2 Р Группа 3

Рисунок 9. Общие структурные формулы исследованных классов аналогов димебона. Все соединения были получены в виде гидрохлоридов. 13

Соединения группы 1 являются водорастворимыми, растворимость соединений групп 2 и 3 в воде значительно ниже, поэтому в работе предварительно готовили их растворы в ДМСО. При этом содержание ДМСО не превышало 1% при добавлении растворов соединений к биологическим объектам.

Скрининг биологической активности модифицированных пропионамидными кластерами тетрагидро-у-карболинов

С целью поиска новых нейропротекторов, действующих на митохондрии мозга, были синтезированы структурные аналоги димебона - гидрохлориды Ы-замещенных 3-(1,2,3,4-тетрагидропиридо[4,3-Ь]индол-5-ил)пропионамидов (таблица 1). Таблица 1. Структуры аналогов димебона группы 3.

Шифр я. X

3-1а Н с2н5 -ЫН-5-С1-Рупс1т-2-у1

3-1Ь СН3 сн3 -ЫН-5-С1-РупсИп-2-у1

3-2Ь сн3 снз -МН-3-С1-С Н 6 4

3-2ё н СА -ЫН-3-С1-СНИ 6 4

З-За н снз -ЫН-З-ОСН -С Н 3 6 4

з-зё н С2Н5 -ЫН-З-ОСН -с н 3 6 4

3-4а н сн3 -ыи-з-сн-с н 3 6 4

3-4Ь снз сн3 -нн-з-сн ,-сн, 3 6 4

3-5Ь сн3 снз -ос2н5

Все вещества этой группы, за исключением соединения 3-1а, не оказывали существенного влияния на митохондриальный потенциал как при энергизации митохондрий субстратами комплекса I, так и комплекса II. Следовательно, данные соединения не оказывают разобщающего действия на дыхательную цепь митохондрий и не являются митотоксичными.

Соединения группы 3 (за исключением 3-5Ь) достоверно (р < 0.05) снижали скорость Са2+-индуцированного набухания митохондрий мозга крыс. Скорость набухания митохондрий уменьшается в ряду 3-5Ь > 3-1а > димебон > 3-2ё = З-За = 3-Зg > 3-4а = 3-4Ь > 3-1Ь > 3-2Ь > ЦсА. Соединение 3-5Ь, в молекуле которого вместо ариламидного заместителя содержится алкоксикарбонильный заместитель, связанный с тетрагидро-у-карболиновым фрагментом через этильный мостик, не оказывало влияния на скорость Са2+-индуцированного набухания митохондрий. На основании

этого был сделан вывод, что наличие ароматической группы, присоединенной через линкер к у-карболинопой группировке, также принципиально важно для ингибирования СМП. Данное предположение было подтверждено при исследовании влияния на СМП М-замещенных-тетрагидро-у-карболинов, содержащих алкиновую группировку (пропаргильную). Степень ингибирования СМП в присутствии исследованных амидоэтилкарболинов зависела от природы заместителей в карболиновогм цикле, и вида ароматической группы, присоединенной к фармакофору через этильный мостик. Так, соединения, содержащие в положении 8 метальный заместитель, проявили большую степень ингибирования по сравнению с остальными веществами.

Изучение влияния соединений группы 3 на кальциевую ёмкость митохондрий мозга крыс показало, что исследуемые соединения следует разделить на три группы по активности (таблица 2). Первую группу составляют соединения, для которых не показано значительного влияния на кальциевую емкость митохондрий: З-За, 3^, 3-4а, 3-5Ь. Вторая группа соединений (вещества, понижающие кальциевую емкость митохондрий) включает в себя единственное соединение 3-1а, которое приводило к деполяризации митохондрий и соответственно, к нарушению транспорта кальция в митохондрии. Особый интерес представляет третья группа - соединения 3-1Ь, 3-2Ь, 3-2g, 3-4Ь, увеличивающие кальциевую ёмкость митохондрий. Таким образом, на данном этапе скрининга среди исследуемых модифицированных пропионамидными кластерами тетрагидро-у-карболинов были выявлены 4 соединения, более активные, чем исходный препарат димебон.

Таблица 2. Относительный коэффициент кальциевой емкости веществ группы 3 (по сравнению с контрольной пробой, содержащей равный объём ДМСО).

Соединение 3-1а 3-1Ь 3-2Ь 3-2ё З-За 3-3ё 3-4а 3-4Ь 3-5Ь ЦсА Дмб

Са-ёмкость 0.9 1.5 1.8 | 1.4 1.0 1.0 1.0 1.5 1.0 1.9 1.3

Все соединения группы 3 в концентрации до концентрации 400мкМ не оказывали достоверного влияния на ПОЛ в гомогенатах мозга при индукции с помощью т-БГП.

Исходя из структурных особенностей и активности веществ данной группы по отношению к митохондриям, смотрели действие соединений 3-2b, 3-2g и 3-3g на процесс образования активных форм кислорода митохондриями in vitro. Соединения в концентрации 30 мкМ не оказывали достоверного влияния на образование АФК митохондриями мозга в присутствии субстратов как комплекса I дыхательной цепи, так и комплекса II (в присутствии ротенона). Была получена тенденция увеличения образования АФК в присутствии соединения 3-2Ь, в наибольшей степени увеличивающего кальциевую емкость митохондрий. Однако на митохондриях печени соединения достоверно снижали образование АФК в присутствии субстрата комплекса II, как в случае ингибирования комплекса I ротеноном, так и в присутствии избытка субстратов обоих комплексов дыхательной цепи митохондрий. Аналогичным эффектом обладает и исходный препарат — димебон.

Для соединений 3-2b, 3-2g и 3-3g также проводили оценку потенциальной цитотоксичности на первичных культурах нейронов коры головного мозга и на гранулярных клетках мозжечка новорожденных крыс, используя МТТ-тест. Было показано, что в концентрации выше 30 мкМ соединения снижают дегидрогеназную активность в клетках.

Скрининг биологической активности фторсодержащих тетрагидро-у-карболинов

Проведено исследование биологической активности 19 фторсодержащих структурных аналогов димебона: двенадцати 5-фторпиридинсодержащих аналогов (группа 1, таблица 3) и семи 2-трифторметилпиридинсодержащих аналогов (группа 2, таблица 4). При работе с соединениями первой группы изучали действие на аппарат митохондрий мозга крыс как гидрохлоридов, так и гидробромидов. Однако было показано, что гидробромиды не обладают митонаправленной активностью, в отличие от гидрохлоридов. Поэтому дальнейший скрининг проводили только для гидрохлоридов.

Согласно разработанной схеме скрининга, на первом этапе оценивали действие соединений на явление Са2+-индуцированного открытия пор скачка митохондриальной проницаемости и на митохондриальный мембранный потенциал. Все вещества группы 1 и группы 2 в концентрациях до 100 мкМ (500 нмоль/мг) не

оказывали существенного влияния на митохондриальный мембранный потенциал как при энергизации митохондрий субстратами как комплекса I, так и комплекса II.

Таблица 3. Структурные формулы монофторнрованных аналогов димебона.

Структурная формула Шифр Я2

1а н СНз

1Ь СН3 СНз

1с Р СНз

1с1 С1 СНз

N 1е СНз с2н5

к Н С1 С2Н5

1 н С2Н5

А с2н5 С2н5

и С2Н5 СНз

н СН3 -СН(СНз)2

1к СН3 С3Н7

11 -СН(СН3)2 СН3

Таблица 4. Структурные формулы СР¡-содержащих аналогов димебона.

Структурная формула Шифр Я2 Яз

г 2а Н СНз Н

2Ь СН3 СНз Н

2с Б СНз Н

2й С1 СН3 Н

2Г С1 с2н5 Н

2т ОСНз СНз Н

2п Б СНз р

Среди соединений группы 1 были выявлены вещества, не оказывавшие

достоверного влияния на процесс индуцированного добавлением раствора хлорида

кальция открытия пСМП. Обнаружено, что соединения и II, содержащие объемный

изопропильный заместитель в тетрагидро-у-карболиновом фрагменте молекулы.

Соединение 1к (содержит н-пропильную группу в положении 112) также не оказывает

существенного влияния на процесс Са2+-индуцированного открытия пСМП. Степень

ингибирования СМП в присутствии соединения ^ была минимальной (12% ± 1%),

соединение 1а не оказывало достоверного влияния на СМП. Таим образом, было

предположено, что наличие заместителя в положении Яг снижает митохондриально

17

направленную активность тетрагидро-у-карболинов. Соединения, которые ингибировали набухание митохондрий, обладали количественно близкой к димебону активностью. Наиболее активным являлось соединение 1Ь.

Все соединения группы 2 достоверно (р < 0.05) снижали скорость индуцированного добавлением раствора хлорида кальция набухания митохондрий. Скорость набухания митохондрий в присутствии 30 мкМ исследуемых соединений изменяется следующим образом в зависимости от вещества: 2а = 2т > 2Ь = 2с > И = 2п = 2<1. Соединения 2с1, 2^ 2п снижают скорость набухания митохондрий в 2 раза. Если оценивать процесс открытия пСМП по ушах (кривой изменения оптической плотности при длине волны 530 нм от времени после добавления раствора СаС12) соединения 2с1, Н, 2п ингибируют его на (54%±6%), (44%±2%) и (48%±2%) соответственно. Стоит отметить, что все наиболее активные соединения содержат атом галогена в качестве заместителя.

На основании данных о действии фторсодержащих структурных аналогов димебона на явление СМП для дальнейшего исследования активности были отобраны соединения 1Ь, 1е, 1Ь, П, 11, 2Ь, 2с1, 2е, 2£ 2п. Было показано, что все отобранные соединения достоверно увеличивают кальциевую емкость митохондрий мозга крыс (таблица 5). При этом были выявлены соединения, увеличивающие кальциевую ёмкость в большей степени, чем димебон. В большей степени, чем димебон, увеличивали кальциевую емкость соединения 1е, Н, 11 группы 1 и соединение 2(1 группы 2. Наиболее активные соединения 1е, П, 11 увеличивают кальциевую емкость на 50% по сравнению с контролем (в присутствии соответствующего растворителя, используемого для приготовления исходных растворов веществ).

Таблица 5. Относительный коэффициент кальциевой емкости (по сравнению с контролем в присутствии соответствующего растворителя).

Соединение 1Ь 1е 1Г 111 И 11 2Ь 2с1 2е 2{ 2п

Са-ёмкость 1.3 1.5 1.3 1.3 1.5 1.5 1.2 1.4 1.3 1.3 1.3

На основании полученных результатов для дальнейшего исследования были отобраны 6 соединений, по 3 из каждой группы, с идентичным строением тетрагидро-

у-карболинового фрагмента внутри пар (1Ь, 1е, 1Г и 2Ь, 2е, 21). Отобранные соединения не оказывали статистически достоверного эффекта на генерацию АФК митохондриями т укго ни при использовании митохондрий мозга, ни при использовании митохондрий печени крыс. Также сравнивали действие этих соединений на индуцированное т-БГП перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс. Было показано, что соединения 1Ь и 2Ь, как и димебон, в диапазоне концентраций 0.05 - 0.4 мМ не оказывают достоверного влияния на перекисное окисление липидов гомогенатов мозга крыс. Соединения 1е, 2е достоверно ингибировали ПОЛ в концентрациях 0.2 и 0.4 мМ, в то время как соединения Н, 2f уже в концентрации 0.1 мМ при добавлении их к гомогенату мозга крыс снижали уровень инициированного т-БГП перекисного окисления липидов (рис. 10).

Таким образом, среди исследованных аналогов димебона были выявлены соединения, проявляющие более активное антиоксидантное действие, чем димебон. Способность соединений ингибировать ПОЛ зависит как от типа заместителей в тетрагидро-у-карболиновой группировке в положениях Я] и так и от вида заместителя у атома азота пиррольного цикла. Было показано, что СРз-содержащие соединения 2е и 21" активнее соответствующих монофторированных аналогов группы 1 - 1е и \{.

А Б

<М-■-1-■-1-■-1-■-1-' -.-1-■-.-■-1-•-1-1

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

концентрация соединения, мМ концентрация соединения, мМ

Рисунок 10. Действие соединений на вызванное т-БГП перекисное окисление липидов

в гомогенате мозга крыс. А. Соединения 1Ъ (~я~), 1е 1/(~А~ группы 1.

Б. Соединения 2Ъ (~и~), 2е 2/(~~Л'~) группы 2.

19

Для оценки потенциальной цитотоксичности исследовали действие соединений на первичные культуры нейронов коры головного мозга и мозжечка новорожденных крыс. Было показано, что в концентрации 30 мкМ соединения не влияют на выживаемость клеток, соответствующую общей дегидрогеназной активности клеток (тест МТТ), при инкубации клеток с веществами в течение суток. Соединения группы 1 в концентрации 100 мкМ также не проявляют цитотоксического действия на клетки коры головного мозга новорожденных крыс, в то время как вещества группы 2 при повышении концентрации до 100 мкМ снижают дегидрогеназную активность.

Для соединения 1Ь была проведена оценка нейропротекторного действия в условиях тБГП-токсичности и глутаматной эксайтотоксичности. Было показано, что соединение 1Ь в концентрации 10 мкМ достоверно увеличивает выживаемость клеток в использованных моделях нейротоксичности (рис. 11).

Рисунок 11. Действие соединения 1Ъ (10 мкМ) на выживаемость нейронов (МТТ-mecm) через 24 часа в условиях нейротоксичности. * - р<0.05 по t-test.

оез токсина

200 мкМ Глу

7.5 мкМ тБГП

Таким образом, соединение 1Ь способно оказывать нейропротекторное действие как в условиях оксидативного стресса, так и в условиях глутаматной эксайтотоксичности.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Разработана комплексная система скрининга соединений на проявление митопротекторной активности как основа создания мультитаргетных нейропротекторных препаратов. Проведено исследование активности свыше тридцати новых тетрагидро-у-карболинов с использованием разработанной системы методов скрининга.

2. Впервые установлено, что митохондрии мозга мышей линии 5xFAD (трансгенной модели болезни Альцгеймера) обладают значительно сниженной кальциевой ёмкостью.

3. Обнаружено, что способность димебона увеличивать устойчивость митохондрий мозга крыс к СМП проявляется в условиях энергизации митохондрий, не зависит от присутствия в среде АДФ и не связана с влиянием на конформационные переходы переносчика адениновых нуклеотидов. Димебон одинаково эффективно ингибирует скачок митохондриальной проницаемости in vitro как на митохондриях мозга, так и на митохондриях печени крыс.

4. Показано, что в ряду структурных аналогов димебона способность влиять на устойчивость митохондрий к индукции СМП зависит не только от вида заместителей в тетрагидро-у-карболиновом фрагменте молекулы соединения, но и от группы, связанной с пиррольным атомом азота через этильный мостик. Соединения, содержащие алифатический заместитель, в указанных экспериментах не активны.

5. В ряду структурных аналогов димебона выявлены соединения-хиты, представляющие интерес для дальнейшей разработки в качестве потенциальных лекарственных препаратов с целью лечения нейродегенеративных заболеваний. Соединение-лидер (вещество lb) передано для доклинических испытаний в рамках Федеральной целевой программы Министерства образования и науки.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1.Бачурин С.О., Виноградова Д.В., Шевцова Е.Ф., Горева Т.В., Епишина Т.А., Аксиненко А.Ю., Соколов В.Б., Модификация гамма-карболинов N-замещенными

пропионамидами — новый подход к созданию митопротекторных препаратов. Изв. АН. Сер. хим. 2013. №3. С. 815-819.

2. Виноградова Д.В., Неганова М.Е., Серкова Т.П., Шевцова Е.Ф. Митопротекторные свойства производных гамма-карболинов. Естественные и технические науки. 2013. №6, С.73-78.

3.Sokolova N.V., Nenajdenko V.G., Sokolov V.B., Vinogradova D.V., Shevtsova E.F., Dubova L.G., Bachurin S.O. "Synthesis and biological activity of N-substituted-tetrahydro-Y-carbolines containing peptide residues". Beilstein Journal of Organic Chemistry. 2014. V.10. pp. 155-162.

4. Shevtsova E.F., Vinogradova D.V., Kireeva E.G., Reddy V.P., Aliev G., Bachurin S.O. Dimebon Attenuates the Ар-induced Mitochondrial Permeabilization. Current Alzheimer Research. 2014. V.ll. ID 24801220.

Тезисы докладов:

1.E.F. Shevtsova, S.G. Klochkov, D.V. Vinogradova, E.G. Kireeva, L.G. Dubova, S.O. Bachurin "Mitochondria as the test system for primary screening of new neuroprotector and drugs toxicity prediction". MipTec - The Leading European Event for Drug Discovery. Basel. 2010.

2.E. Shevtsova, D. Vinogradova, E. Kireeva and S. Bachurin "Mitochondria as the target for neuroprotection". 2011. 8 th IBRO Word Congress of Neuroscience. B375.

3.E. Shevtsova, D. Vinogradova, E. Kireeva, S. Bachurin. "Importance of targeting mitochondria in the search for new neuroprotectors". European Neuropsychopharmacology. 2011. V.21 Suppl 3. pp.S288-S289

4.Д.В. Виноградова, Т.П. Серкова, В.Б. Соколов, Е.Ф. Шевцова. "Влияние Новых Амидосодержащих Гамма-Карболинов На Функциональные Характеристики Митохондрий" Химия, структура и функция биомолекул: материалы IV междунар. науч. конф., Минск, 17-19 октября 2012 г. /Ин-т биоорг. хим. НАН Беларуси, редкол.: С.А.Усанов [и др.]. - Минск, 2012. - С. 33.

5. Виноградова Д.В., Дубова Л.Г., Шевцова Е.Ф. "Действие димебона на неспецифическую проницаемость митохондрий мозга крыс" БИОЛОГИЯ - НАУКА

XXI ВЕКА: 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 21-26 апреля 2013 г. Пущино, 2013. С.262.

6.D. Vinogradova, E.F. Shevtsova, S.O. Bachurin "Evaluation of the effects of gamma-carboline derivatives on the brain mitochondria". European Neuropsychopharmacology. 2013. V.23 Suppl 2. pp.S211.

7.Д.В. Виноградова, Е.Г. Киреева, А.Ю. Аксиненко, В.Б. Соколов, Е.Ф. Шевцова, С.О. Бачурин «Поиск нейропротекторов в ряду тетрагидро-гамма-карболинов». Первая Российская конференция по медицинской химии (MedChem Russia-2013) с международным участием (сборник тезисов). Москва, 2013. С.211.

Заказ № 64-Р/05/2014 Подписано в печать 21.05.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", г. Москва, Большой Чудов пер., д.5

тел. (495) 797-75-76 \)) www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологически активных веществ Российской академии наук

04201459811 На правах рукописи

Виноградова Дарья Викторовна МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ТЕТРАГИДРО-у-КАРБОЛИНОВ С МИТОХОНДРИЯМИ

02.00.10 - биоорганическая химия 03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: Кандидат химических наук Шевцова Елена Феофановна Научный консультант: член-корр. РАН, доктор химических наук Бачурин Сергей Олегович

Черноголовка 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ..............................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................7

Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..............................................................................9

1. Механизмы нейродегенеративных процессов и роль митохондрий в них.............9

1.1. Биомолекулярные основы болезни Альцгеймера............................................10

1.2. Роль митохондрий в патогенезе болезни Альцгеймера..................................19

1.2.1. Нарушение работы дыхательной цепи и продукция свободных радикалов как патогенетический фактор нейродегенеративных заболеваний.............................19

1.2.2. Накопление амилоида митохондриями............................................................24

1.2.3. Открытие поры скачка митохондриальной проницаемости...........................25

1.2.4. Роль митохондрий в регуляции кальциевого гомеостаза клетки...................34

1.3. Митохондрии как мишень терапии нейродегенеративных заболеваний.......36

1.3.1. Модуляторы кальциевого гомеостаза клетки и митохондрий........................36

1.3.2. Митохондриально-направленные соединения................................................38

1.3.3. Ингибиторы СМП.............................................................................................40

1.3.4. Димебон и его аналоги......................................................................................41

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................45

2.1. Приготовление гомогената мозга крыс................................................................46

2.2. Выделение субклеточных фракций полушарий головного мозга крыс.............46

2.3. Выделение митохондрий печени крыс................................................................47

2.4. Определение белка в препаратах митохондрий при помощи микробиуретового метода.......................................................................................................................48

2.5. Определение трансмембранного потенциала митохондрий...............................48

2.6. Исследование скачка митохондриальной проницаемости..................................49

2.7. Скачок митохондриальной проницаемости энергизованных митохондрий......50

2.8. Скачок митохондриальной проницаемости деэнергизованных митохондрий .. 50

2.9. Исследование накопления кальция митохондриями и кальциевой ёмкости митохондрий мозга..................................................................................................50

2.10. Исследование конформационных переходов АИТ...........................................51

2.11. Исследование образования АФК митохондриями............................................52

2.12. Определение интенсивности перекисного окисления липидов........................53

2.13. Определение цитотоксичности и цитопротекторных свойств тетрагидро-у-карболинов на первичных культурах нейронов крысят.......... ..............................53

2.14. Исследование процессов распределения в несмешивающихся средах............55

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................56

3.1. Исследование действия димебона на митохондрии........................................56

3.1.1. Действие димебона на скачок митохондриальной проницаемости энергизованных митохондрий................................................................................56

3.1.2. Действие димебона на скачок митохондриальной проницаемости деэнергизованных митохондрий.............................................................................58

3.1.3. Влияние АДФ на ингибирование СМИ димебоном........................................60

3.1.4. Переносчик адениновых нуклеотидов как вероятная мишень действия димебона..................................................................................................................61

3.1.5. Влияние димебона на кальциевый гомеостаз митохондрий...........................65

3.1.6. Исследование действия димебона на кальциевую ёмкость митохондрий в моделях болезни Альцгеймера...............................................................................72

3.1.7. Влияние димебона на перекисное окисление липидов гомогената мозга крыс................................................................................................................75

3.2. Поиск потенциальных нейропротекторов в ряду структурных аналогов димебона..................................................................................................................80

3.2.1. Разработка системы методов скрининга аналогов димебона.........................82

3.2.2. Скрининг биологической активности модифицированных пропионамидными фрагментами тетрагидро-у-карболинов.................................................................84

3.2.3. Скрининг биологической активности М-замещенных-тетрагидро-у-карболинов, содержащих пептидные остатки........................................................88

3.2.4. Скрининг биологической активности фторсодержащих тетрагидро-у-карболинов...............................................................................................................91

3.2.5. Влияние молекулярной структуры монофторированных аналогов димебона на свойства распределения в системе октанол/буфер...........................................98

ВЫВОДЫ...................................................................................................................101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

АФ А - активные формы азота

АФК - активные формы кислорода

АХЭ - ацетилхолинэстераза

БХЭ - бутирилхолинэстераза

БА - болезнь Альцгеймера

БАС - боковой амиотрофический склероз

БП - болезнь Паркинсона

БХ - болезнь Хантингтона

ДД - долговременная депрессия

ДП - долговременная потенциация

ДЦ - дыхательная цепь

мДНК - митохондриальная ДНК

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид

НДЗ - нейродегенеративное заболевание

пНКМ - первичная культура нейронов коры головного мозга

ПОЛ - перекисное окисление липидов

пСМП - пора скачка митохондриальной проницаемости

СМП - скачок митохондриальной проницаемости

т-БГП - трет-бутилгидроксипероксид

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ЦсА - циклоспорин А

ЭР - эндоплазматический ретикулум

3xFAD - мыши с 3 мутациями, ассоциированными с известными наследственными формами болезни Альцгеймера

5xFAD - мыши с 5 мутациями, ассоциированными с известными

наследственными формами болезни Альцгеймера

ADAS-cog - оценка болезни Альцгеймера, когнитивная подшкала

AICD - пептид - внутриклеточный домен АРР

АМРА - а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота

ANT - переносчик адениновых нуклеотидов

АРР - белок-прекурсор амилоида

ВАСЕ - ß-секретаза

DMB - диметоксибензил

FCCP - трифторметоксифенилгидразон

GFP - зелёный флуоресцирующий белок

НК - гексокиназа

HNE - гидроксиноненаль

MCU - митохондриальный кальциевый унипортер MMSE - минимальная оценка психического состояния NEM - N-этилмалеимид

NMDA - N-MeTiui-D-acnapTaT

ORAC - Oxygen Radical Absorption Capacity, адсорбционная емкость по отношению к кислородным радикалам РАО - оксид фениларсина РМВ - р-метоксибензил

sAPPa - растворимый фрагмент предшественника амилоида ТРР+ - трифенилфосфоний

TSPO - Белок-транслокатор с молекулярной массой 18 кДа VDAC - потенциал-зависимый анионный канал Д*Рт - митохондриальный мембранный потенциал

ВВЕДЕНИЕ

В связи с ростом средней продолжительности жизни в развитых странах одной из самых актуальных проблем здравоохранения является проблема обусловленных возрастом нейродегенеративных заболеваний. Наиболее распространенной формой деменции является болезнь Альцгеймера (БА). По данным Всемирной организации здравоохранения в мире проживает более 35 миллионов человек с БА, на лечение людей с деменцией и уход за ними ежегодно расходуется более 600 миллиардов долларов США. До сих пор не разработана эффективная нейропротекторная терапия, а препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний являются симптоматическими и направлены на компенсацию специфического для данного заболевания медиаторного дефицита. Также не решена проблема ранней медицинской диагностики данного заболевания.

Важным звеном патогенеза БА является нарушение митохондриальных функций и, в том числе, снижение их способности регулировать гомеостаз кальция в клетке и устойчивости к процессу скачка митохондриальной проницаемости (СМП). Процесс СМП обусловлен открытием комплекса пор, что является ключевым этапом каскадов гибели клеток. Именно поэтому митохондрии, и особенно процесс СМП, являются крайне перспективной мишенью для поиска нейропротекторных препаратов. Ранее сотрудниками лаборатории нейрохимии ИФАВ РАН было показано, что нейропротекторное действие в различных моделях токсичности отечественного препарата димебон (3,6-диметил-9-(2-метилпиридил-5)-этил-1,2,3,4-тетрагидро-у-карболина дигидрохлорид), являющегося одним из перспективных лекарственных средств лечения БА, по меньшей мере частично, обусловлено именно взаимодействием с митохондриями - с его способностью увеличивать их устойчивость к индукции СМП. Существуют различные способы увеличения устойчивости митохондрий к СМП, одним и перспективных подходов является регуляция кальциевого гомеостаза митохондрий - модуляция процессов входа и выхода кальция, а также действие на кальциевую емкость митохондрий. В частности, увеличение кальциевой емкости митохондрий особенно привлекательно в мозге.

Конкретные мнтохондриальные мишени димебона и детальные механизмы взаимодействия димебона с митохондриями до конца не известны. В связи с этим возникает необходимость исследования взаимодействия димебона с основными компонентами поры СМП. Одновременно с этим, принимая во внимание нейропротекторное действие димебона, особый интерес представляет направленный синтез и последующий скрининг ряда его структурных аналогов.

Целью настоящей работы являлось исследование механизма влияния димебона на процесс СМП и кальциевый гомеостаз митохондрий, а также поиск потенциальных эффективных нейропротекторов в ряду его новых структурных аналогов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка комплексной системы скрининга на проявление митопротекторной активности и ее практическая проверка на примере оригинальных аналогов димебона в ряду производных тетрагидро-у-карболинов.

2. Исследование механизма действия димебона на явление скачка митохондриальной проницаемости митохондрий мозга крыс.

3. Исследование действия димебона на кальциевый гомеостаз митохондрий мозга крыс.

4. Анализ взаимосвязи структуры и влияния на функциональные характеристики митохондрий для серии оригинальных аналогов димебона в ряду производных тетрагидро-у-карболинов.

Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1. Механизмы нейродегенеративных процессов и роль митохондрий в них

Нейродегенеративные заболевания (НДЗ) - это свыше 600 заболеваний, возникающих в результате прогрессирующей и необратимой дегенерации и гибели нейронов, и приводящих к разрыву связей между отделами центральной нервной системы. Наиболее распространенными нейродегенеративными заболеваниями являются болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), болезнь Хантингтона (БХ) и боковой амиотрофический склероз (БАС) [1].

Нейродегенеративные заболевания являются основной причиной деменции и различных расстройств движений. И то и другое оказывает инвалидизирующее действие на людей, страдающих этими заболеваниями, а также негативно воздействует на семьи и тех, кто осуществляет уход за больными.

Согласно оценочным данным Всемирной Организации Здравоохранения, в 2010 году в мире страдали от деменции 35,6 миллионов человек. Россия входит в число девяти стран с наибольшим числом людей с деменцией (1,2 млн.). По прогнозам общее число людей с деменцией будет практически удваиваться каждые 20 лет [2]. Наиболее распространенной причиной деменции является болезнь Альцгеймера, предположительно на нее приходится 60-70% всех случаев. В связи с этим изучение механизмов патогенеза и поиск потенциальных лекарств против БА является важной социально значимой задачей.

Как ранее было сказано, НДЗ обладают рядом отличительных черт. Большинство НДЗ не объясняются мутациями одного или даже нескольких генов. Процессы развития НДЗ включают множество известных и не известных сигнальных каскадов, нарушение фолдинга специфических для каждого заболевания белков с образованием их протофибрилл - агрегации, нарушение функций системы убиквитин-протеосома, чрезмерное образование активных форм азота и кислорода, повреждение митохондрий и т.д. В литературе также можно встретить данные о том, что важными патофизиологическими событиями, способствующими возникновению и развитию НДЗ, являются воспаление и иммунный ответ [3,4].

1.1. Биомолекулярные основы болезни Альцгеймера

Точный механизм патогенеза БА в настоящее время остается неизвестным, также не разработано эффективного лечения БА. Основным фактором риска данного заболевания является старение, однако при этом важно подчеркнуть, что БА не является нормальной составляющей процесса старения. На основании многочисленных исследований, посвященных изучению молекулярных основ патогенеза БА, можно предположить, что ключевыми факторами, играющими важную роль в гибели нейронов, являются нарушение синаптической функции, окислительный стресс, нарушение функции митохондрий, нарушение кальциевого гомеостаза, воспаление, образование гиперфосфорилированного тау-белка и бета-амилоида. Однако не представляется возможным выделить первопричину данного заболевания, в связи с чем существуют различные объяснения того, какие из факторов являются причинами, а какие — следствием. В настоящее время существует несколько ключевых гипотез механизма Б А (Рисунок 1).

Амилоидная гипотеза Са2+ гипотеза Митохопдриальная гипотеза

Образование амилоидных отложений в результате чрезмерного образования Ар и недостаточной его деградации

Образование токсичных растворимых олигочеров Ар Нарушение Са3+ юмеооаза и ¡-.¡а старения, окислительного ст ресса, Ар и/или пресенилина Дисф) икция миточондрмй

Обусловленная А|5

с и наш о- и иейротоксичнос гь

I

С'а-*"-вычнанная синалто-и исйротоксичиость

Окислительный стресс» нарушение Саг+ гомеостача, еннанго- и и нейроюксичиость

РКИ|ОД|ГЕНЕРАЦИЯ

Синатическая дисфч нкцияи иейротоксичнос гь

Нарушение про) еостаза и а катального транспорта

Синап гическая дисфункция и нейро токсичность

I (арушемие функций пресенидииа

Пресеинлпповая гипотеза

Нарушение функций липосом/аутофагии

Лппосомиая гипотеза

Агрегация гилсрфосфоратарованноло тау-белка

Тау гипотеза

Рисунок 1. Основные гипотезы механизмов патогенеза болезни Альцгеймера.

Одной из наиболее развитых в настоящее время теорий механизма БА является так называемая «амилоидная гипотеза». Как понятно из названия, в рамках данной теории принято считать, что основной вклад в патогенез Б А вносит бета-амилоид (Ар), присутствующий в избыточных количествах в мозге больных, вызывающий образование амилоидных бляшек и индуцирующий аномальное гиперфосфорилирование тау-белка с последующим образованием нейрофибриллярных клубков, разрушение синапсов и гибель нейронов - так называемый «амилоидный каскад». За годы своего существования «амилоидная гипотеза» претерпела некоторые видоизменения. Если изначально было принято считать, что нейротоксичное действие проявляют амилоидные отложения, то сейчас наиболее токсичными принято считать растворимые амилоидные микроагрегаты (олигомеры), состоящие, в первую очередь, из Ар42 [5,6].

Основными фактами, подтверждающими данную гипотезу, являются нейротоксичное действие Ар, сверхэкспрессия предшественника амилоидного белка практически во всех случаях наследственной формы БА и увеличение образования и содержания токсичной формы АР42 в мозге больных с БА.

Амилоидная гипотеза БА постулирует два пути протеолитического процессинга белка-предшественника амилоида (АРР): амилоидогенный и неамилоидогенный (Рисунок 2). Процессинг АРР происходит в несколько этапов: сначала при участии а- и Р-секретаз, а далее при участии у-секретазы [7]. Протеолиз под действием а- и р-секретаз происходит всегда в одном и том же месте, в то время как у-секретаза может расщеплять пептидные связи последовательно в нескольких местах с образованием пептидов различной длины. У млекопитающих секретазы также деградируют белки АРЬР! и АРЬР2 (АРР-подобные белки 1 и 2).

Амилоидогенный путь процессинга АРР инициируется под действием секретазы (ВАСЕ1 и 2), которая расщепляет АРР по внеклеточному домену [8-10]. После чего у-секретаза расщепляет АРР в центре внутримембранного домена. В состав у-секретазного комплекса входят несколько различных белков - в том числе пресенилин 1, пресенилин 2 и никастрин [11-13]. Все образующиеся в результате протеолиза АРР молекулы