Определение некоторых моно- и сесквитерпенов в растительном сырье и продуктах его переработки методом хромато-масс-спектрометрии

Нарчуганов, Антон Николаевич

Определение некоторых моно- и сесквитерпенов в растительном сырье и продуктах его переработки методом хромато-масс-спектрометрии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Нарчуганов, Антон Николаевич АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Красноярск МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Определение некоторых моно- и сесквитерпенов в растительном сырье и продуктах его переработки методом хромато-масс-спектрометрии»

Автореферат диссертации на тему "Определение некоторых моно- и сесквитерпенов в растительном сырье и продуктах его переработки методом хромато-масс-спектрометрии"

Шьгщшттттт

fí J

Ш'

НАРЧУГАНОВ АНТОН НИКОЛАЕВИЧ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ MOHO- И СЕСКВИТЕРПЕНОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ И ПРОДУКТАХ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

02.00.02 — аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

6 КЮН ¿Ü13

Томск, 2013

005061234

Работа выполнена на кафедре аналитической и органической химии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет»

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Ефремов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты:

Ткачёв Алексей Васильевич доктор химических наук, профессор, Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН, заведующий лабораторией

Короткова Елена Ивановна доктор химических паук, доцент, Национальный исследовательский

Томский политехнический университет, кафедра физической и аналитической химии, профессор

Ведущая организация: Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 26 июня 2013 года в 14:30 часов на заседании диссертационного совета Д 212.269.04 при ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» по адресу: 634050 г. Томск, пр. Ленина, 30, ТПУ, 2 корпус, химико-технологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-технической библиотеке ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» по адресу: г. Томск, ул. Белинского, 55

Автореферат разослан 24 мая 2013 года.

Ученый секретарь А $

диссертационного совета '1сС/ „. Т.М. Гиндуллина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Биологически-активные вещества (БАВ), выделяемые из растительного и животного сырья, составляют основу современной медицины. Большинство новых медицинских препаратов основано на веществах, выделяемых из природных объектов, и их доля по сравнению с полностью синтетическими препаратами неуклонно возрастает. В связи с этим, аналитическая задача, связанная с установлением качественного и количественного состава сложных смесей БАВ, выделяемых из растительного сырья, является актуальной.

Одним из основных классов БАВ, выделяемых из древесного растительного сырья, являются терпеновые соединения (терпены и терпеноиды). Для их определения чаще всего используется метод газовой хромато-масс-спектрометрии. Существующие библиотеки масс-спектральной информации позволяют экспрессно идентифицировать большинство терпеновых соединений. Кроме того, хромато-масс-спектрометрия позволяет быстро установить количественный состав с использованием метода внутренней нормировки. Однако, надёжный качественный и количественный анализ осложнён рядом факторов: во-первых, распространены ошибки идентификации, связанные с наличием большого количества изомерных терпеноидов близких по своим физико-химическим свойствам. Во-вторых, отклик масс-спектрометра на различные соединения не одинаков, что приводит к значительным погрешностям при расчёте методом внутренней нормировки. Также важно отметить, что метод внутренней нормировки дает не абсолютные, а относительные значения концентрации того или иного компонента.

Для более точного количественного анализа терпеноидов методом хромато-масс-спектрометрии необходимо использовать метод внутреннего стандарта или метод добавок. Но в таком случае на каждое определяемое соединение необходимо иметь соответствующий стандартный образец. В вытяжках из растительного сырья может содержаться 50-100 и более компонентов, при этом промышленностью выпускается ограниченный ассортимент стандартов терпеноидов (не более 5 индивидуальных соединений). Получение стандартов терпеноидов в лаборатории также затруднено.

Таким образом, цель данной работы - разработка методики количественного определения не менее 30 индивидуальных терпеноидов в объектах сложного состава с улучшенными метрологическими характеристиками, без использования стандартного образца на каждое определяемое соединение. Задачи исследования: 1) Подбор оптимальной методики пробоподготовки, позволяющей осуществить наиболее полное извлечение биологически активных терпеноидов из древесного растительного сырья.

2) Разработка методики идентификации отдельных терпеноидов в объекта сложного состава, позволяющей повысить надежность идентификации исключить связанные с этим ошибки.

3) Выделение групп изомерных терпеноидов, подобранных таким образом чтобы при количественном определении исключить необходимост использования стандартного образца на каждое определяемое вещество.

4) Экспериментальное определение факторов отклика для каждого и определяемых терпеноидов, разработка методики количественног определения терпеноидов и оценка её метрологических характеристик.

5) Разработка методики для количественного определения низки концентраций терпеноидов с использованием режима селективног ионного детектирования.

6) Апробация разработанных методик на реальных образцах эфирны масел, экстрактов, пробах воздуха.

Научная новизна.

- Подобраны условия для полного и воспроизводимого извлечения летучих терпеноидов из древесного и недревесного растительного сырья методом исчерпывающей гидропародистилляции.

- Впервые предложен подход к идентификации терпеноидов с использованием хроматографических и масс-спектрометрических точек идентификации, обеспечивающий надежную безошибочную идентификацию.

- Впервые предложен подход к количественному определению с использованием одного стандарта для определения нескольких терпеноидов, основанный на схожести строения и закономерностей их фрагментации, с расчётом факторов отклика для каждого индивидуального терпеноида.

- Разработан подход для количественного определения летучих монотерпенов в воздухе с применением режима селективного ионного детектирования.

- Впервые установлено абсолютное количественное содержание ряд моно- и сесквитерпенов в некоторых эфирных маслах древесных недревесных растений.

Практическая значимость.

- Разработана методика одновременного количественного определения 30 индивидуальных терпенов в объектах сложного состава, не требующая наличия стандартных образцов на каждое определяемое соединение.

- Разработана методика количественного определения монотерпенов в воздухе при содержаниях на уровне нескольких нанограммов на литр воздуха.

- Определено количество моно- и сесквитерпенов в эфирных маслах, используемых в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности.

- Определено количество летучих монотерпенов в воздухе, насыщенном веществами, эмитированными свежесобранной древесной зеленью. Основные положения, выносимые на защиту:

1) Методика пробоподготовки древесного и недревесного растительного сырья с использованием исчерпывающей гидропародистилляци.

2) Подход к качественному анализу, предполагающий использование хроматографических и масс-спектрометрических точек идентификации.

3) Методика количественного определения 30 индивидуальных моно- и сесквитерпенов в объектах сложного состава, предполагающая использование двух стандартных образцов.

4) Количественное содержание ряда моно- и сесквитерпенов в эфирных маслах; экстрактах, полученных из растительного сырья; образцах воздуха, содержащих терпены, эмитированные свежесобранной древесной зеленью.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на следующих научных конференциях: Всероссийская научно-практическая конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», Барнаул (2009); Региональная научно-практическая конференция «Химическая наука и образование Красноярья», Красноярск (2009, 2010); Международная школа-конференция студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий», Абакан (2009); Международная конференция «Современные достижения в химии природных соединений и биотехнологии», Новосибирск (2010); Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар (2010); Международная конференция «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine», Санкт-Петербург (2011); Всероссийская с международным участием научно-практическая конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», Барнаул (2012); Всероссийская конференция «Аналитика Сибири и Дальнего Востока», Красноярск (2012). Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, 3 глав, выводов, приложения и списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 135 страницах, включают 36 таблиц, 26 рисунков и 2 приложения с масс-спектрами всех определяемых соединений. Список использованных источников включает i 15 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы, научная новизна и практическая значимость, сформулированы основные положения,

выносимые на защиту. Приведены данные об апробации и публикаци результатов исследования.

Глава 1. Литературный обзор. Подробно описан химический соста биологически активных веществ растений. Отмечено, что углеводородь растений, как правило, относятся к классу терпенов, а большая част спиртов, альдегидов и кетонов - к классу терпеноидов. Терпены терпеноиды обладают высокой биологической активностью, в том числе антиоксидантной и противораковой активностью, иммуномодулирующим противовоспалительным эффектом, и другими полезными свойствами.

Для выделения терпеноидов из растительного сырья чаще всег применяют экстракцию и перегонку с водяным паром. Приведень технологические тонкости каждого из указанных методов, отмечено, чт выбор конкретного метода неоднозначен и определяется рядом факторов, том числе типом сырья и его составом.

Для анализа большинства терпеноидов чаще других используется мето газовой хроматографии. Подробно рассмотрены теоретические основь метода и вопросы его практического применения при анализе растительног сырья. Сочетание газовой хроматографии и масс-спектрометрии дас практически неограниченные возможности для качественного полуколичественного анализа терпеноидов.

Глава 2. Экспериментальная часть. Подробно рассмотрены различны варианты выделения биологически-активных веществ из растительног сырья, проведён сравнительный анализ компонентного состава продуктов получаемых различными методами. Указана методика подготовки про воздуха для определения содержания в нём летучих терпеноидов.

Для определения терпеноидов использовали метод хроматомасс спектрометрии, реализованный на газовом хроматографе Agilent 7890 А квадрупольным масс-спектрометром Agilent 5975 С Inert MSD. Анализ вел на кварцевой капиллярной колонке HP-5ms длиной 30м и внутренни диаметром 0,25 мм, неподвижной фазой служил 5%-дифенил-95// диметилсилоксан, толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мкм Использовали несколько вариантов программирования температуры зависимости от перечня определяемых соединений, общее время анализ' варьировалось от 24,6 до 43,5 минут.

На рисунке 1 представлен пример, иллюстрирующий разделени определяемых терпенов: хроматограмма эфирного масла пихты сибирской.

При определении высоких концентраций моно- и сесквитерпеноидов масс-спектрометр функционировал в режиме регистрации полного ионного тока (SCAN). В данном режиме диапазон сканирования масс составил 50-500 а.е.м. Режим селективного ионного детектирования (SIM) использовали для анализа образцов, содержащих низкие количества терпеноидов. В этом режиме регистрировали одновременно 5 ионов с массами 69, 79, 91, 93, 121 а.е.м.

9000000 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 о

111.

5 10 15 20 25 ЗО

Рисунок 1. Хроматограмма эфирного масла пихты сибирской.

SIM-режим оказывается незаменим в случае анализа проб, содержащих незначительные количества терпеноидов. Примером могут служить пробы воздуха, богатого летучими монотерпенами. Вследствие низкого содержания определяемых соединений в образцах, методика, предусматривающая детектирование полного ионного тока, оказалась непригодна. На рисунках 34 приведены масс-хроматограмма и масс-фрагментограмма, подтверждающие этот факт.

Abundance

14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000

TIC: Е561.D\data.ms

Рисунок 3. Хроматограмма спиртового концентрата воздуха соснового бора, снятая в режиме сканирования полного ионного тока (SCAN).

Abundance

Time—=»

Рисунок 4. Хроматограмма спиртового концентрата воздуха соснового бора, снятая в режиме регистрации отдельных ионов (SIM).

Для идентификации сравнивали линейный индекс удерживания компонента (хроматографическая точка идентификации) и относительные интенсивности пиков ионов в полном масс-спектре компонента (масс-спектрометрические точки идентификации) с литературными данными, полученными при идентичных условиях анализа и приведёнными в библиотеках масс-спектров. Совпадение хроматографической точки идентификации предполагает, что индекс удерживания пика попадает в диапазон ± 3 единицы индекса по отношению к индексу удерживания, приведённому в литературных данных. Для определения масс-спектрометрических точек идентификации сравнивали масс-спектр анализируемого соединения с библиотечными данными. При этом интенсивности пиков как минимум четырёх ионов должны лежать в диапазоне, указанном в таблице 1 (данные значения рекомендованы решением Европейской комиссии).

Таблица 1. Допустимые интервалы отклонения интенсивности пиков от библиотечного значения в зависимости от их относительной интенсивности.

Относительная интенсивность, % от основного пика >50% 20-50% 10-20% <10%

Допустимые интервалы изменения интенсивности пика ±10% ±15% ±20% ±50%

Для идентификации предпочтительно выбирали ионы, относительная интенсивность которых составляла не менее 10 %. Пример идентификации представлен на рисунке 5.

fitxrtísrcB

SOCO aooo 7COO

eoco

5000 40QD 3000 2COO 1000 o-

Sdan 343 <6368 rii-i): габО-1.СХсНа.гТБ SQO

530

JÜÜU

67.0

104.9

.lili,,

/ЧтЁтэ

#3218Q .А_|=Н<\-НМЗ\е (->SSBcy3c(3.1.1)hTcpt-2-er© (O^ Rrere 3S 2-Hrsre $S.

SQO

90QD

aooo 7000 6000 aooo

4000 ЭООО 20ГО 1СЮО

67.0

jJL.

Рисунок 5. Масс-спектр а-пинена, RT = 6,4 мин, и библиотечный масс-спектр. Хроматографическая точка идентификации: RI = 933; RIiib=932; ARI=1. Масс-спектрометрические точки идентификации: ионы с m/z= 93, 77,

105, 121, 136.

Пример разделения и идентификации моно- и сесквитерпенов в образце эфирного масла сосны сибирской приведён на рисунках 6-7.

Главной трудностью при количественном определении терпеноидов с использованием метода хромато-масс-спектрометрии является отсутствие стандартных образцов на большинство терпеноидов. В данной работе выдвинута гипотеза, что отклик масс-спектрометра на изомерные терпеновые соединения, закономерности фрагментации которых при масс-спектрометрическом детектировании одинаковы, является приблизительно равным. Это позволит использовать только один стандартный образец для количественного определения нескольких изомерных терпенов.

120000 100000 30000 60000 40000 20000 0

¡2

Рисунок 6. Хроматограмма тестового образца эфирного масла сосны сибирской, область монотерпенов. Цифрами обозначены: 1 -трициклен, 2 — а-пинен, 3 - камфен, 4 - Р-пинен, 5 - а-фелландрен, 6 - 3-карен, 7 - Р-

фелландрен.

1200000 1000000 800000 600000 400000 200000

ь-А

2 И

-лЛИ

іЦидИд!^'

Н П

Рисунок 7. Хроматограмма тестового образца эфирного масла сосны сибирской, область сесквитерпенов. Цифрами обозначены: 1 - а-копаен, 2 -Р-кубебен, 3 - Р-фунебрен, 4 - Р-копаен, 5 - цис-мурола-3,5-диен, 6 — транс-мурола-3,5-диен, 7 - цис-мурола-4(14),5-диен, 8 - транс-кадина-1(6),4-диен, 9 - гермакрен Д, 10 - бициклосесквифелландрен, 11 - у-аморфен, 12-5-аморфен, 13 -у-кадинен, 14 - 8-кадинен.

Среди множества терпеновых соединений выделяли группы, члены которых имеют схожую структуру и одинаковые закономерности масс-фрагментации (анализировали по схожести их масс-спектров, в том числе наличию одинакового основного иона). Было выделено две группы таких соединений: 10 монотерпенов с основным ионом в масс-спектре с т/г=93, и 25 сесквитерпенов с основным ионом в масс-спектре с т/2=161. В каждой группе был определён один из терпенов, который использовали в качестве стандарта для определения остальных (методом внешнего стандарта). Для группы монотерпенов был выбран а-пинен, весьма распространённый терпен, на который в продаже имеются ГСО, -для группы сесквитерпенов -у-кадинен, широко распространённый в природе и сравнительно легко выделяемый из эфирного масла можжевельника сибирского.

Для снижения систематической составляющей погрешности при определении терпенов, не калиброванных с использованием соответствующих стандартных образцов, были экспериментально определены поправочные коэффициенты (факторы отклика). Для этого сопоставляли масс-хроматограммы, полученные на масс-спектрометре, с хроматограммами, полученными на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором, отклик которого на определяемые терпены можно считать одинаковым. Полученные факторы отклика (таблица 2) использовали при расчёте концентрации. Установлено, что отклик соединений из определяемых групп действительно близок (факторы отклика лежат в диапазоне от 0,8 до 1,2), а для соединений другой структуры отличается более значительно. Поэтому исходную гипотезу о близости отклика масс-спектрометра для соединений схожей структуры считали подтверждённой.

Таблица 2. Факторы отклика для моно- и сесквитерпенов, определяемых

по предлагаемой методике.

№ Компонент Стандарт Фактор отклика к

1 Трициклен а-пинен 0,88

2 а-пинен а-пинен 1,00

3 Камфен а-пинен 0,92

4 Сабинен а-пинен 0,95

5 Р-пинен а-пинен 0,99

6 а-фелландрен а-пинен 1,05

7 3-карен а-пинен 0,87

8 р-фелландрен а-пинен 0,89

9 у-терпинен а-пинен 1,07

10 Терпинолен а-пйнен 0,91

11 а-Кубебен у-кадинен 1,05

12 а-Копаен у-кадинен 1,01

13 Р-Кубебен у-кадинен 0,89

14 Р-Фунебрен у-кадинен 0,95

15 Р-Кедрен у-кадинен 1,06

16 Р-Копаен у-кадинен 1,10

17 Р-Гурьюнен у-кадинен 0,94

18 Изогермакрен Д у-кадинен 0,89

19 цис-Мууролй-3,5-диен у-кадинен 0,91

20 транс-Муурола-3,5-диен у-кадинен 0,92

21 цис-Муурола-4(14),5-диен у-кадинен 0,92

22 Р-Неокловен у-кадинен 1,11

23 транс-Кадина-1 (6),4-диен у-кадинен 0,91

24 у-Мууролен у-кадинен 1,12

25 Гермакрен Д у-кадинен 0,87

26 Бициклосесквифелландрен у-кадинен 0,95

27 у-Аморфен у-кадинен 0,90

28 5-Аморфен у-кадинен 1,10

29 у-Кадинен у-кадинен 1,00

30 5-Кадинен у-кадинен 0,88

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

Определены метрологические характеристики предлагаемой методики в двух вариантах: SCAN- и SlM-режиме. В SIM-режиме калибровались только по а-пинену в связи с тем, что в пробах воздуха, которые анализируются в данном режиме, как правило присутствуют только наиболее летучие соединения - монотерпены. Результаты калибровки и диапазон линейности предлагаемой методики представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты калибровки

Аналит

Диапазон линейности

Уравнение калибровочной кривой

Коэффициент регрессии

а-Пинен

5-200 мг/л

S=l,5-10sC-3,2T05

S=2,8T05C+2,2T05

0,9993

у-Кадинен

5-200 мг/л

S=3,9-104С+1,2-103

0,9998

а-Пинен, S1M-режим

0,008-1 мг/л

0,9994

При оценке метрологических характеристик методики для установления приписанных характеристик погрешности руководствовались ГОСТ Р ИСО 5725-2002. В качестве образцов для оценивания для а-пинена и у-кадинена использовали аттестованные смеси, приготовленные на основе ГСО - для а-пинена и на основе СОП - для у-кадинена.

Для а-пинена и у-кадинена установили границы диапазонов, в которых значения характеристики случайной погрешности, соответствующие верхней и нижней границе диапазона, являются однородными. Получили 4 диапазона, внутри которых приняли постоянство показателей прецизионности. Полученные значения приписанной характеристики случайной погрешности для данных диапазонов представлены в таблице 4.

Для остальных терпенов в качестве образцов для оценивания использовались однородные и стабильные рабочие пробы, и в качестве показателя точности выступало среднее квадратическое отклонение погрешности результатов анализа, таким образом производили точечную оценку приписанной характеристики случайной погрешности. Результаты представлены в таблице 5. Аналогичные показатели повторяемости и воспроизводимости (интервальные для а-пинена и точечные для остальных 9 монотерпенов) определены для варианта методики в 81М-режиме. Результаты представлены в таблицах 6-7.

Таблица 4. Значения показателей повторяемости и воспроизводимости в зависимости от содержания определяемого соединения (БСАТ^-режим)._

Номер Диапазон определяемых содержании, мг/л Показатель повторяемости сг Показатель воспроизводимости cR

а-Пинен у-Кадинен а-Пинен у-Кадинен

1 5-30 0,2 0,2 0,3 0,2

2 30-65 1,1 1,2 1,3 1,2

3 65-110 1,7 1,8 1,9 2,0

4 110-160 2,5 2,4 2,7 2,8

5 160-200 3,5 3,6 3,9 3,8

Таблица 5. Среднеквадратическое отклонение результатов анализа, полученных в условиях повторяемости и воспроизводимости, для определяемых моно- и сесквитерпенов (SCAN-режим)._

№ Компонент С, мг/л о r,m г m с„ R,m R m

1 Трициклен 28,0 0,7 2,3 0,8 2,2

2 Камфен 9,6 0,4 1,3 0,5 1,4

3 Сабинен 5,5 0,4 1,3 0,4 1,1

4 Р-Пинен 37,5 0,9 3,0 1,0 2,8

5 а-Фелландрен 4,1 0,4 1,3 0,4 1,1

6 З-Карен 12,0 0,5 1,7 0,5 1,4

7 Р-Фелландрен 189,9 3,2 10,6 3,5 9,7

8 у-Терпинен 6,5 0,4 1,3 0,4 1,1

9 Терпинолен 6,4 0,4 1,3 0,4 1,1

10 а-Кубебен 4,5 0,4 1,3 0,4 1,1

И а-Копаен 13,0 0,5 1,7 0,5 1,4

12 р-Кубебен 4,8 0,4 1,3 0,4 1,1

13 Р-Фунебрен 15,3 0,5 1,7 0,6 1,7

14 Р-Кедрен 20,6 0,6 2,0 0,7 1,9

15 Р-Копаен 11,2 0,5 1,7 0,5 1,4

16 Р-Гурьюнен 5,4 0,4 1,3 0,4 1Д

17 Изогермакрен Д 6,2 0,4 1,3 0,4 1,1

18 цис-Муурола-3,5-диен 4,8 0,4 1,3 0,4 1,1

19 транс-Муурола-3,5-диен 6,3 0,4 1,3 0,4 1,1

20 цис-Муурола-4( 14),5-диен 5,4 0,4 1,3 0,4 1,1

21 Р-Неокловен 20,1 0,6 2,0 0,7 1,9

22 Кадина-1 (6),4-диен 10,4 0,5 1,7 0,5 1,4

23 у-Мууролен 11,4 0,5 1,7 0,5 1,4

24 Гермакрен Д 12,1 0,5 1,7 0,5 1,4

25 Бициклосескви-фелландрен 7,2 0,4 1,3 0,5 1,4

26 у-Аморфен 6,5 0,4 1,3 0,4 1Д

27 8-Аморфен 8,5 0,4 1,3 0,5 1,4

28 5-Кадинен 18,7 0,6 2,0 0,6 1,7

Таблица 6. Значения показателей повторяемости и воспроизводимости в

зависимости от содержания а-пинена, 81М-режим.

Номер Диапазон определяемых содержаний, мг/л Показатель повторяемости сг Показатель воспроизводимости оя

1 0,008-0,15 0,001 0,001

2 0,15-0,4 0,02 0,02

3 0,4-0,8 0,04 0,05

4 0,8-1,0 0,06 0,07

Таблица 7. Среднеквадратическое отклонение результатов анализа, полученных в условиях повторяемости и воспроизводимости, для определяемых в 81М-режиме монотерпенов. ___

№ Компонент С, мг/л о г, m г m о R,m R m

1 Трициклен 0,008 0,001 0,003 0,001 0,003

2 Камфен 0,11 0,01 0,03 0,01 0,03

3 Сабинен 0,008 0,001 0,003 0,001 0,003

4 ß-Пинен 0,042 0,003 0,010 0,004 0,008

5 а-Фелландрен 0,011 0,001 0,003 0,001 0,003

6 3-Карен 0,022 0,002 0,006 0,002 0,006

7 ß-Фелландрен 0,072 0,005 0,015 0,006 0,014

8 у-Терпинен 0,012 0,001 0,003 0,001 0,003

9 Терпинолен 0,015 0,001 0,003 0,001 0,003

Правильность методики оценивали только для а-пинена и у-кадинена. Для каждого из диапазонов (в которых значения характеристики случайной погрешности являются однородными) готовили рабочую пробу, в качестве которой использовали эфирное масло сосны сибирской для оценки методики в режиме SCAN, и спиртовой концентрат воздуха, насыщенного терпенами сосны сибирской — в режиме SIM. Разбавление пробы подбирали таким образом, чтобы содержание определяемого терпена в рабочей пробе с учётом добавки не превышало верхней границы поддиапазона. Значение добавки определяли по рекомендациям, приведённым в ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002. Результаты представлены в таблицах 8-9.

Таблица 8. Метод «введено-найдено», режим SCAN.

Определяемое соединение Диапазон определяемых содержаний Величина добавки, мг/л Экспериментально найденная величина добавки, мг/л

а-пинен 5-30 10 10,1±0,3

30-65 15 15,2±0,7

65-110 20 20,6±2,5

110-160 30 32,2±3,4

160-200 30 31,4±4,2

у-кадинен 5-30 10 9,8±0,3

30-65 15 14,5±0,8

65-110 20 19,8±1,9

110-160 30 30,5±3,8

160-200 30 31,2±4,9

С использованием ^критерия было установлено, что оценка систематической погрешности незначима на фоне случайного разброса для обоих вариантов методики, и её значение было принято равным нулю.

Точность анализа оценивали, определяя границы, в которых погрешность результатов единичного анализа находиться с заданной вероятностью Р=0,95. Результаты представлены в таблицах 10-11.

Таблица 9. Метод «введено-найдено», режим SIM.

Диапазон определяемых Величина добавки, Экспериментально

содержании мг/л наиденная величина добавки, мг/л

0,008-0,15 0,1 0,12±0,01

0,15-0,4 0,1 0,13±0,02

0,4-0,8 0,2 0,23±0,05

0,8-1,0 0,1 0,14±0,07

Таблица 10. Интервальная оценка точности методики анализа, режим SCAN.

Номер Диапазон определяемых содержаний, мг/л Оценка показателя точности анализа Л, мг/л

а-Пинен у-Кадинен

1 5-30 0,9 0,8

2 30-65 1,8 1,7

3 65-110 3,2 3,5

4 110-160 4,1 4,3

5 160-200 5,2 5,6

Таблица 11. Интервальная оценка точности методики анализа, режим

SIM.

Номер Диапазон определяемых содержаний, мг/л Оценка показателя точности анализа Д, мг/л

1 0,008-0,15 0,002

2 0,15-0,4 0,03

3 0,4-0,8 0,05

4 0,8-1,0 0,08

Представленные методики были использованы для анализа различных образцов товарного эфирного масла, производимых на территории РФ. Были проанализированы пользующиеся широким спросом среди потребителей

эфирные масла пихты сибирской, укропа пахучего и розмарина. Результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12. Содержание моно- и сесквитерпенов в товарных эфирных маслах пихты сибирской, укропа пахучего и розмарина.__

№ Компонент tr, мин Содержание, г/л, в эфирных маслах:

пихты сибирской укропа пахучего розмарина

1 Трициклен 6,02 20,5 <0,2 <0,2

2 а-Пинен 6,40 92,9 1,5 <0,2

3 Камфен 6,87 197,1 0,2 <0,2

4 Сабинен 7,53 <0,2 <0,2 <0,2

5 Р-Пинен 7,65 16,4 0,2 <0,2

6 а-Фелландрен 8,56 2,0 87,5 0,2

7 З-Карен 8,77 98,1 0,2 <0,2

8 Р-Фелландрен 9,42 86,8 17,6 0,2

9 у-Терпинен 10,42 1,7 0,2 0,2

10 Терпинолен 11,45 11,6 <0,2 <0,2

11 а-Кубебен 20,50 <0,2 <0,2 0,5

12 а-Копаен 21,34 <0,2 <0,2 1,3

13 Р-Кубебен 21,82 <0,2 <0,2 0,4

14 Р-Фунебрен 22,30 0,9 <0,2 <0,2

15 Р-Кедрен 22,50 <0,2 <0,2 <0,2

16 Р-Копаен 23,04 <0,2 <0,2 <0,2

17 Р-Гурьюнен 23,15 <0,2 0,3 <0,2

18 Изогермакрен Д 23,51 <0,2 <0,2 <0,2

19 цис-Муурола-3,5 -диен 23,59 <0,2 <0,2 <0,2

20 транс-Муурола-3,5 -диен 23,71 <0,2 <0,2 2,4

21 цис-Муурола-4( 14),5-диен 24,10 <0,2 <0,2 5,7

22 Р-Неокловен 24,30 <0,2 <0,2 <0,2

23 транс-Кадина-1 (6),4-диен 24,46 <0,2 <0,2 <0,2

24 у-Мууролен 24,56 <0,2 <0,2 0,8

25 Гермакрен Д 24,69 <0,2 1,6 18,1

26 Бициклосескви-фелландрен 25,00 0,2 <0,2 <0,2 .

27 у-Аморфен 25,10 0,3 0,4 <0,2

28 8-Аморфен 25,49 <0,2 <0,2 <0,2

29 у-Кадинен 25,69 <0,2 8,3 28,9

30 5-Кадинен 26,00 0,2 7,4 14,6

Вариант методики, при котором масс-спектрометр работает в Б1М-режиме, использовали для изучения эмиссии монотерпенов из древесной зелени хвойных растений. Данные для образцов древесной зелени разных пород представлены в таблице 13. Из полученных данных видно, что древесная зелень сосны сибирской эмитирует в 9 раз больше а-пинена, по сравнению с древесной зеленью пихты сибирской.

Таблица 13. Содержание монотерпенов в спиртовых концентратах.

№ Компонент мин Содержание в спиртовом концентрате, мкг/л

Пихта сибирская Сосна сибирская Сосна обыкновенная

1 Трициклен 6,03 3,0 <0,2 <0,2

2 а-Пинен 6,25 13,0 112,9 7,7

3 Камфен 6,86 18,3 4,5 0,2

4 Сабинен 7,54 <0,2 <0,2 <0,2

5 Р-Пинен 7,67 2,7 35,0 3,0

6 а-Фелландрен 8,55 <0,2 1,1 <0,2

7 З-Карен 8,77 4,1 3,6 0,9

8 (З-Фелландрен 9,43 4,3 70,7 3,6

9 у-Терпинен 10,41 <0,2 0,1 <0,2

10 Терпинолен 11,44 2,0 0,4 <0,2

ВЫВОДЫ

1) С использованием метода хромато-масс-спектрометрии изучен компонентный состав эфирных масел и экстрактов, выделяемых из растительного сырья с использованием различных методов, установлены оптимальные условия пробоподготовки.

2) Предложен подход к качественному анализу биологически активных терпеноидов с использованием масс-спектрометрических и хроматографических точек идентификации, исключающий ошибки идентификации.

3) Разработан подход к количественному определению ряда терпеновых соединений методом хромато-масс-спектрометрии, предполагающий использование одного вещества в качестве стандартного образца для определения нескольких, с экспериментальным определением факторов отклика.

4) Разработана методика одновременного количественного определения 30 терпеноидов в объектах сложного состава: 10 монотерпенов и 20 сесквитерпенов, предполагающая использование двух веществ в качестве стандартных образцов.

5) Разработана методика количественного определения низких концентраций монотерепенов в воздухе с использованием режима селективного ионного детектирования.

6) Определены метрологические характеристики разработанных методик. Показана возможность использования разработанных методик для количественного анализа сложных смесей БАВ, выделяемых из растений, а также образцов воздуха.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. А.Н. Нарчуганов, А.А.Ефремов. Нативные компоненты и артефакты эфирного масла Сосны Сибирской (Pinus Sibirica) /Мат. IV регион, научно-практ. конф. «Химическая наука и образование Красноярья». - Красноярск. -2010.-С. 92-96.

2. Е.Г. Струкова, А.Н. Нарчуганов, A.A. Ефремов. Компонентный состав эфирного масла лапки хвойных Сибирского региона по данным хромато-масс-спектрометрии //Журнал Сибирского федерального университета. - Химия. - Т. 2. - Вып. 4. - 2009. - С. 335-350.

3. А.Н. Нарчуганов, A.A. Ефремов, Е.Г. Струкова. Компонентный состав эфирного масла сосны сибирской (Pinus Sibirica) // Химия растительного сырья. -№ 4. - 2011. - С. 103-108.

4. А.Н. Нарчуганов, A.A. Ефремов, К.Б. Оффан, Е.П. Федянина. Закономерности экстракции лапки хвойных из Эвенкии спиртовым раствором при ультразвуковой обработке / Мат. IV всерос. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». — Барнаул. - 2009. - С. 111-113.

5. А.Н. Нарчуганов, Е.Г. Терещенко, А.А.Ефремов. Идентификация компонентов эфирного масла лапки Сосны Сибирской методом хромато-масс-спектрометрии / Мат. IV межвуз. научно-практ. конф. «Химическая наука и образование Красноярья». - Красноярск. - 2009. - С. 62-66.

6. А.Н. Нарчуганов, Е.Г. Струкова, А.А.Ефремов. Сравнительное исследование компонентного состава эфирного масла PinusSibirica, полученного в разное время года /Мат. XII межд. школы-конф. студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий». — Абакан.-2009.-С. 38.

7. А.Н. Нарчуганов, A.A. Гонтова, А.А.Ефремов.Contrastive Analysis of Composition and Bactericidal Activity of Various Fraction of Siberian Pine Essential Oil /Мат. II междунар. конф. «Current Issues of Natural products Chemistry and Biotechnology». - Новосибирск. - 2010. - C.28.

8. А.Н. Нарчуганов, A.A. Ефремов, К.Б. Оффан. Экстрактивные вещества лапки хвойных Эвенкии, извлекаемые при спиртовой обработке с использованием ультразвука // Химия растительного сырья. - № 1. - 2010. -С.105-108.

9. А.Н. Нарчуганов, A.A. Ефремов. Применение хромато-масс-спектрометрии для качественного анализа минорных компонентов эфирных масел растений/Мат. всеросс. конф. «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез». - Краснодар. - 2010. — С.119.

10. А.Н. Нарчуганов, A.A. Ефремов. Comparison of Some Technologies of Extraction of Terpenoids from the Plant Materials / Мат. междунар.конф. «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine». - Санкт-Петербург. — 2011— С. 145-146.

11. А.Н. Нарчуганов, A.A. Ефремов. Исчерпывающая экстракция терпеноидов из древесной зелени с использованием растворителей различной полярности /Мат. V Всерос. с межд. участием конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». - Барнаул. - 2012. -С. 300-302.

12. А.Н. Нарчуганов, A.A. Ефремов. Определение монотерпенов в растительном сырье методом хромато-масс-спектрометрии / Мат. IX всерос. конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока». - Красноярск. - 2012. - С. 163.

13. А.Н. Нарчуганов, A.A. Ефремов. Количественное определение двух групп терпеновых соединений методом хромато-масс-спектрометрии // Химия растительного сырья. -№ 1. -2013. - С.114-116.

Подписано в печать 23.05.2013 Формат 60x84/16 Бумага «Svetocopy». Печать XEROX. Усл.печ.л. 11,89. Уч.-изд.л. 10,47. Заказ 23.05.13/2 - 19. Тираж 110 экз

ООО «СКАН», Студенческий центр, 634050, Томская область, г. Томск, Ул. Советская,80, тел.: (3822) 56-17-26.

Scan

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Нарчуганов, Антон Николаевич, Красноярск

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет»

04201 3^051 7 Ш права*фукописи

Нарчуганов Антон Николаевич

Специальность: 02.00.02 - аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д-р. хим. наук, профессор A.A. Ефремов

Красноярск, 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Содержание 2

Список сокращений 4

Введение 5

Глава 1. Литературная часть 10

1.1. Классификация биологически активных веществ

древесного растительного сырья 10

1.2. Классификация, строение и свойства терпеновых соединений 13

1.3. Нахождение терпеноидов в растительном сырье 17

1.4. Методы выделения терпеноидов из растительного сырья 22

1.5. Анализ терпеноидов методом газовой хроматографии 29

1.6. Качественная и количественная идентификация в газовой хроматографии 33

1.7. Масс-спектрометрия в анализе терпеновых соединений 40 Глава 2. Экспериментальная часть 45

2.1. Оборудование 45

2.2. Материалы 45

2.3. Пробоподготовка при анализе препаратов, полученных из растительного сырья 46

2.4. Пробоподготовка при определении содержания терпеноидов

в растительном сырье 47

2.5. Пробоподготовка при определении содержания терпеноидов

в воздухе 60

2.6. Газохроматографический анализ терпеноидов 60

2.7. Количественное определение терпеноидов 67

2.8. Количественное определение нескольких терпенов с использованием одного стандарта 69

2.9. Определение факторов отклика с использованием газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием 73

Глава 3. Результаты и их обсуждение 79

3.1. Методика хромато-масс-спектрометрического определения моно-

и сесквитерпенов в области высоких концентраций 79

3.2. Методика хромато-масс-спектрометрического определения моно-

и сесквитерпенов в области низких концентраций 91

3.3. Количественное определение терпеноидов в товарных

эфирных маслах 95

3.4. Оценка содержания биологически-активных веществ терпеновой природы в растениях Сибирского региона 103

3.5. Определение содержания монотерпенов в образцах с низким содержанием 105 Выводы 109 Список литературы 110 Приложение А 122 Приложение Б 128

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАВ - биологически активное вещество (-ва)

IUPAC - международный союз чистой и прикладной химии

ГХ, ГЖХ - газожидкостная хроматография

ХМС - хромато-масс-спектрометрия

ПИД - пламенно-ионизационнный детектор

RI - индекс удерживания

СИД, SIM - режим селективного ионного детектирования ПИТ, SCAN - режим регистрации полного ионного тока ХЧ - химически чистый

ГСО - государственный стандартный образец СОП - стандартный образец предприятия ОО - образец для оценивания

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Биологически активные вещества, выделяемые из растительного и животного сырья, составляют основу современной медицины. Большинство новых медицинских препаратов основано на веществах, выделяемых из природных объектов, и их доля по сравнению с полностью синтетическими препаратами неуклонно возрастает. При этом предсказать или априорно рассчитать биологическую активность того или иного соединения с высокой надежностью практически невозможно. Существующие компьютерные модели имеют множество ограничений и не всегда адекватно оценивают биологическую активность по структуре соединения. Поэтому единственный возможный путь для поиска новых лекарственных препаратов - это анализ сложных смесей БАВ, выделяемых из растительных веществ, их последующее разделение и оценка свойств полученных индивидуальных соединений. Очень важным в связи с этим становится вопрос установления качественного и количественного состава биологически активных веществ, содержащихся в растении. Именно на основании этой информации можно принять решение о перспективности использования данного вида растения для получения из него тех или иных индивидуальных БАВ и их дальнейшего использования для синтеза на их основе медицинских препаратов.

Для анализа компонентного состава растительного сырья чаще всего

используется хроматография: газовая для определения летучих соединений и

жидкостная для определения различных классов нелетучих соединений.

Газовая хроматография наиболее часто используется в варианте хромато-

масс-спектрометрии. Этот метод, обладая высокой чувствительностью и

надежностью, даёт одновременно качественную и количественную

информацию о составе анализируемой пробы. По существующим

библиотекам масс-спектральной информации для газовой хроматографии

можно быстро и надежно идентифицировать большинство компонентов сложной смеси. Однако, из-за кажущей простоты распространены ошибки идентификации, связанные с наличием большого количества изомерных терпеноидов, близких по физико-химическим свойствам.

Количественный анализ сложных смесей БАВ, выделяемых из растительного сырья, также связан с рядом трудностей. Хромато-масс-спектрометрия позволяет быстро установить количественный состав растительных экстрактов с использованием метода внутренней нормировки. Этот метод основывается на допущении, что отклик детектора на все анализируемые компоненты смеси одинаков, при этом в качестве количественной характеристики используется площадь пика на хроматограмме, построенной по полному ионному току. Однако, отклик масс-спектрометра на различные соединения не одинаков, что приводит к значительным погрешностям, к тому же метод внутренней нормировки дает не абсолютные, а относительные значения концентрации того или иного компонента.

Для более точного количественного анализа необходимо использовать метод внешнего или внутреннего стандарта или метод добавок. Но в таком случае на каждое определяемое вещество необходимо иметь соответствующий стандартный образец. В экстрактах, полученных из растительного сырья может содержаться 50-100 и более индивидуальных компонентов. Из них лишь небольшое количество широко используются в промышленности или медицине в чистом виде, и поэтому на них имеются стандартные образцы. Например, из огромного класса терпеноидов в продаже имеются не более пяти стандартов различных монотерпеноидов, и ни одного стандарта на сесквитерпеноиды. Получение стандартов в лаборатории очень затруднено, поскольку терпеновые соединения очень схожи по своим физико-химическим свойствам. Получить их в чистом виде из сложной природной смеси практически невозможно.

Задачи исследования:

1) Подбор оптимальной методики пробоподготовки, позволяющей осуществить наиболее полное извлечение биологически активных терпеноидов из древесного растительного сырья.

2) Разработка методики идентификации отдельных терпеноидов в объектах сложного состава, позволяющей повысить надежность идентификации и исключить связанные с этим ошибки.

3) Выделение групп изомерных терпеноидов, подобранных таким образом, чтобы обеспечить исключить при количественном определении необходимость использования стандартного образца на каждое определяемое вещество.

4) Экспериментальное определение факторов отклика для каждого из определяемых терпеноидов, разработка методики количественного определения терпеноидов и оценка её метрологических характеристик.

5) Разработка методики для количественного определения низких концентраций терпеноидов с использованием режима селективного ионного детектирования.

6) Апробация разработанных методик на реальных образцах эфирных масел, экстрактов, пробах воздуха.

Научная новизна данной работы заключается в следующем:

- Впервые предложен подход к идентификации терпеноидов с

использованием хроматографических и масс-спектрометрических точек

идентификации, обеспечивающий надежную безошибочную идентификацию.

- Впервые установлено абсолютное количественное содержание ряда моно-и сесквитерпенов в некоторых эфирных маслах древесных и недревесных растений.

Практическая значимость данной работы заключается в следующем:

- Определено количество летучих монотерпенов в воздухе, насыщенном веществами, эмитированными свежесобранной древесной зеленью.

Основные положения, выносимые на защиту:

3) Методика количественного определения 30 индивидуальных моно- и сесквитерпенов в объектах сложного состава, предполагающий использование двух стандартных образцов.

4) Абсолютное содержание ряда моно- и сесквитерпенов в эфирных маслах, экстрактах, воздухе.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих научных конференциях: Всероссийская научно-практическая конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», Барнаул (2009); Региональная научно-практическая конференция «Химическая наука и образование Красноярья», Красноярск (2009, 2010); Международная школа-конференция студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий», Абакан (2009); Международная конференция «Современные достижения в химии природных соединений и биотехнологии», Новосибирск (2010); Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар (2010); Международная конференция «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine», Санкт-Петербург (2011); Всероссийская с международным участием научно-практическая конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», Барнаул (2012); Всероссийская конференция «Аналитика Сибири и Дальнего Востока», Красноярск (2012).

Работа выполнена на кафедре аналитической и органической химии ИЦМиМ СФУ в лаборатории хроматографических методов анализа Центра коллективного пользования СФУ.

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНАЯ ЧАСТЬ.

1.1 Классификация биологически активных веществ древесного растительного сырья.

Состав древесного растительного сырья является сложным и непостоянным и зависит от ряда факторов [1,2], среди которых:

- видовой состав древесных растений;

- природно-климатические условия произрастания древесных растений;

- экологическая характеристика окружающей среды.

Биологически активные вещества древесного растительного сырья

имеют большое значение для жизнедеятельности самого растения: участвуют в процессе фотосинтеза (хлорофилл); служат резервными питательными веществами (крахмал, жиры и др.); обладая фунгицидным, бактерицидным и инсектицидным действием, обеспечивают устойчивость к вредоносным грибкам, микроорганизмам и насекомым (фенольные соединения, терпеноиды); защищают при повреждениях, являются сигнальными веществами [3].

Для определения биологически активных веществ древесного сырья используют термин «экстрактивные вещества». Экстрактивными веществами называют органические соединения, которые могут быть извлечены из растительных тканей нейтральными растворителями (вода, диэтиловый эфир, петролейный эфир, толуол, метанол, этанол, ацетон и др.).

Содержание экстрактивных веществ в разных частях древесного

растения существенно отличается. В древесине пород умеренной

климатической зоны экстрактивных веществ немного, их массовая доля

обычно не превышает 3-4% (за исключением дуба и лиственницы, в составе

древесины которых много водорастворимых веществ). Значительно больше

экстрактивных веществ содержится в древесной зелени, однако это в

существенной степени зависит от видовой принадлежности конкретного

растения. Максимальное количество экстрактивных веществ, определяемое по ГОСТ 24027.2-80, найдено в древесной зелени пихты (до 42% от абсолютно сухой навески). В древесной зелени сосны и кедра этих продуктов содержится 1,5-2 раза меньше. Остальные древесные растения содержат меньшее количество экстрактивных веществ.

Содержание экстрактивных веществ различно в разных частях древесной зелени [4,5]. Наиболее богата ими хвоя, практически наполовину состоящая из экстрактивных веществ. В коре молодых побегов их в 2-4 раза меньше. Меньше всего экстрактивных веществ находится в одревесневших побегах - в 4-8 раз меньше, чем в хвое.

Экстрактивные вещества, извлекаемые из одного растения, как правило, весьма разнообразны по составу. Среди экстрактивных веществ древесины выделяют следующие основные классы соединений: углеводороды (главным образом, терпеновые); спирты (многоатомные, высшие алифатические, циклические, в том числе терпеновые и стерины); альдегиды и кетоны (в том числе, относящиеся к терпеноидам); кислоты высшие жирные и их эфиры (жиры и воски); смоляные кислоты (производные дитерпенов); углеводы (моно- и олигосахариды, водорастворимые полисахариды, полиурониды) и их производные (гликозиды и др.); фенольные соединения (таннины, флавоноиды, лигнаны, гидроксистильбены и др.); азотсодержащие соединения (белки, алкалоиды и др.); соли неорганических и органических кислот [6].

Эта классификация в определенной мере условна. Из-за полифункциональной природы многих биологически активных веществ четкое отнесение их к той или иной группе не всегда возможно. Часто одно и то же соединение по этой причине может входить в несколько групп.

Для упрощения классификации экстрактивные вещества древесины по

совокупности физико-химических свойств подразделяют на три большие

группы: алифатические соединения; терпеноиды; фенольные соединения.

Эти группы соединений значительно отличаются по своему поведению, а

также локализации в древесине. Алифатические соединения и терпеноиды экстрагируются малополярными растворителями (гексан, бензины); для извлечения фенольных соединений требуются полярные органические растворители, способные образовывать водородные связи. Алифатические соединения концентрируются главным образом в лучевой и древесной паренхиме, фенольные соединения - в ядровой древесине, а терпеноиды (в основном, монотерпены и смоляные кислоты) - в смоляных ходах [4,5].

В зависимости от метода выделения экстрактивные вещества древесных растений получают в виде эфирных масел, древесных смол или экстрактов водорастворимых веществ. Эфирные масла представлены веществами с высокой летучестью, способными отгоняться с водяным паром. В их состав входят преимущественно моно- и сесквитерпены и другие летучие терпеноиды, а также ряд низкомолекулярных соединений различных классов (летучие кислоты, сложные и простые эфиры, фенолы и др.).

Древесные смолы - группа нелетучих веществ, нерастворимых в воде и экстрагируемых из древесины органическими растворителями. Это гидрофобные вещества, находящиеся в смолообразном состоянии (в основном, из-за взаимного ингибирования кристаллизации). В смолах выделяют свободные органические кислоты (смоляные и жирные) и нейтральные вещества. Последние, в свою очередь, подразделяют на омыляемые (жиры, воски) и неомыляемые (фитостерины, терпеновые спирты, высшие алифатические спирты, нелетучие терпеновые углеводороды и др.) [7].

Водорастворимые вещества древесины экстрагируются холодной или горячей водой. Они сод�