Ферментативные способы получения пектина, альфа-D-галактуроновой кислоты и их применение тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ШРШЗСГАН ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукашю'л

ФШЛЩТАТИВШЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГГйЖТША, ¿> -в -ГА1АКТУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

02.00.06-химш' Еноокомаяакулярных соединений

Авторе ере1.? диссертации на соискание ученой степени кандидата .хшичзских на,, к

Бишкек - 1992

Работа гдао/шеяа e Институте органической химии Академии наук Республики Кыриазстен к Институте биохимии им. А.Н.Баха Российской Академии наук

Научные pyi ^водители: доктор технических наук, профессор

Айзцухамедова М.Б.,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Родионова H.A.

0£ ¡циальные оппоненты: доктор химических наук Кудайберге-

нов С;Е.

кандидат химических-наук Мельникова Г.Г.

Ведущее предприятие: Казахский государственный университет, химический факультет

Защита состоится 1992 года н часоЕ на

зас&г тип Спедиализвроранного совета К 009.02.01' в Института органической химии Академии наук Республики Кыргызстан, г.- Бишкек. проспект Чуй, 267.

С диссертацией можно■ознакомиться е'центральной научной библиотеке Академии наук Республики Кыргызстан.

Автореферат разослан " ^ " ^JtLj I9g2 года

Ученый секретарь специализированного сонета rf'^ t

кандидат химических наук уД/ъ^ КожахметоЕа Р. И.

' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТШСА РАКШ

Актуальность работу. Пектиновые Ееш"ства находят широкое применение ю многих отраслях, особенно е пищевой и кондитерской прошшлекностях, как 'гсуднеобразующео вещество. В последнее время интерес к деотияоЕШ веществам возрос е связи с последствиями аварий на Чернобыльской и Санкт-Петербургской АЗС, благодаря способности пектинов связывать и выводить из организма тяжелые металлы и радионуклида» Однако не удовлетворяются дачсе потребности кондитерской промышленности, j юмотря на большую доступность сырья дая производства пектиновых веществ. Зто связано с отсутствием прогрессивных технологий и технологического оборудования, квалифицированных кадров и неэффективность» использования имеющегося сырья.

Совершенствование способов получения пектияоЕых веществ является актуальной зада^й и на сегодняшний день.. Одним из приоритетных направлений исследований в области разработки способов получения пектиновых Еещеотв а «о—3D -гачактуроновой кислоты .яч-ляется ферментативный способ и поиск соответствующих культур, необходимых для этих целей,

Цедъ .иг задата исследрванкя. Целью работы был подбор микроорганизмов, its изучение и исяользоврчие дося оэрмект&тиЕНОго способа получения пектиновых веществ, ¿с-ь -галактуроновой кислоты, увеличение экстрактивных веществ кофе из кофейного шлама; перспективы их использования. Исходя аз цели работы, были поставлены следухщ j задачи:

1. Изучаете лектолитическях и целлюлолетических активностей гриба Geotrichura candidiun ЗС И полученного ИЗ НеГО штамма "У- ( т ант a Geotriohua oandiiium" 3G-I06, выделение и очистка эндо-по-лигалактуроназы из G. eand. 'ЗС до гомогенного состояния с последующим использованием дая мацерации клеточных стене.., нкяпча-. ющих пектиновые вещества., ■

2. Разработ^ ферментативного способа получения пектина,

Д- - d -галактурононой кислоты с использованием фильтратов . /ль-туралышх жидкостей и ферментных препаратов из мицеляиальных грвбоЕ G. с and. ЗС и мутанткого штамма G.Cend. 3C-I06, а также культуры Trichosporon ШвЪвЬпИ.

3. Изучение возможности использования пектиновых.веществ в качества полисахаридных. сорбентов для разделения алкячоидов и . для связывания лекарственных веществ. • - '

4. Изучение -слияния ферментных систем гриба G. о and. ЗС-106 дая увеличения экстрактивных веществ кофе из кофейного шлама.-

Гаучная новизна работы состоит в изучении и характеристики пектолитических и. целдюлолитических активное.-)й гриба G.cand. ЗС и мутантного штамма о. cand. 3C-I06, подбор услоеий культивирования с целые регулирования ферментативных активностей применительно к целям его .использования.

Разработана схема выделения и очистки эндо-полигалактурона-зы из гриба G. cand. ЗС и изучены ее физико-химические свойства.

Предложен ферментативный способ получения пектиноЕфс веществ и ct- -ю -галактуроновой хшедоты» Определены необходимые количеств венные соотношения ферг/.знтов и их участие е получении пектина а ot- -d -галакгуроноЕо£ кислоты на основе модельных ферментных раствороЕ, составленных из гомогенно очищенной полигапакт урона-вы, фракций глюканаз и золигалактуроназ, полученных, аффинной хроматографией на микрокристаллической целлюлозе ферментных растворов гриба G. cand. ЗС.

Использование пектиновых ' ¿щестЕ в качэстве сорбентов дая ■ разделения смеси алкалоидов и полимера носителя дая сеязьшяния лекарственных ьеществ с целью увеличения их пролонгирующего

СТЕИЯ.

Практическое значение работы. Разработаны ферментативные способы получения пектина, d -D -галактуроновой кислоты и уеобличен . экстрактивных веществ кофе,с использованием комплекса ферментов из гриба Geotrichum cendidum ЗС и ыутантного штамма Geotrichum candidum 3C-I06, не требующие • сложного оборудования,

Разработана схема выделения и очистки эндо-полигалактурона-зы из гриба f lotriobum candidum ЗС, позволяющая получить гомогег-но очищенный белок, который может быть использован при изучении а выделении полисахаридов.

Показана возможность использования сшитой neid-oEofl кислоты СПК-2 дая разделения смеси алкалоидов, а также использование пектиновых веществ в качестве полимеров носителей для сЕязывания лекарственных вещаптЕ с целью пролонгирования их действия.

На защиту выносятся:

- результаты исследований целлзололитических и пектолитичес-ких активностей ферментов гриба Geotrichum "candidura ЗС и мутант-ного штамма Geotrichum candidum ЗС—106;.

- способ выделения и очисти» эндо-полигалактуроназы из Geo-

tric'num candidun ЗС до гомогенного состояния, с целью использования вх для изучения гидролиза полисахаридов клеточных стенок высших растений;

- результаты использования ферментных систем гриба G. caudi-йшп ЗС, мутантного waMMa G.candidum 3G-I06 И Trichosporon kle~ bsOmii дая получения пектиновых веществ, еС-Т) -галактурсноной кислоты и увеличения экстрактивных ЕещестЕ кофе;

- возможность использования пектиновых веществ как сорбентов для разделения алкалоидов и как полимеров носителей для связывания лекарственных веществ о целью пполонгирсшания их действия.

Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на'ТОбилейной конференции, посвященной памяти И.И.ГоряеЕа" (Алма-Ата, 1985 г.), 1У Всесоюзном Сшйоаиум- по молекулярной аид-костной хроматографии {Алма-Ата, 1987 г.), 1-ом Всесоюзном симпозиуме "Препаративная хроматография физиологически активных веществ на полимерных сорбента" (Ленинград, 1988 г.), Всесоюзной конференции "Метода получения, анализа и применения ферментое (Юрмала, 1990 г.), Всесоюзной научно-пр этической конференции "Ферменты - народному хозяйству" (Черновцы, 1990 г.), И Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов меточной стенки" (Казань, I9S0 г.). VL-ом Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзкмология" (Москва, 1991 т.), Республиканской конференции "Химические превращения пищевых полимеров" '"Светлогорск, 1991 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ»

Структура и объем работу. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, 7 глав обсуздеш полечен--них экспериментальных данных, з.шшчения, выводов, списка цитированной литературы, 2 приложения. Работа изложена нг? /¿^страницах машинописного текста, содержит J Q рисунков и //> Список лигератург включает 196 ншшетгованки, е том числе иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОШ

Во введении обоснованы цели и задачи исследования и кратко изложено состояние изучаемой проблемы. В первой главе_ дан анализ заруб ел ной и отечественной литературы по вопросам отроения и химического, состава клеточной стенки, локализации в гои пектшюЕЫх

' ьещестн и системь ферментов, мацеркруащих ткани высших растений с целью получения пектиновых веществ, а также их строения, состава, сеойсте и .методам получения,, особенно по ферментативному v-лособу.

Материалы и методы исследования

В работе был: использованы фильтраты культуральных жидкостей и ферментные препараты мицеллиальзых грибов Geotrichum candi dum ЗС (g. coud» ЗС) И мутаиНОГО шхаша Geotrichuni candidum 5C-I06 ( G. caaid.3G-I0G), технический препарат целлюлазы из гриба G.candiduBi ЗС - "Целл01сащдан ШОХ" производства НПО "Био-лар" (г. Олайне); кулмура TricL,sporon klebehntiBKM Р 2926, ' получении,! из Всесоюзной коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАЯ. В качество субстратов использовали свекловичный пектин, пакт оную кислоту производства Олайаенского завода химреактивов, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы .(КМЦ), Sigma, США; предварительно обработанное хлопковое волокно; цел-лобиозу (ñpofb, ЧССР), авицзл. (Kcoh-biight ГаЪ., Англия); ара-бвдоглюкуропокеилан. (АГК) пшеничной соломы Tritic-am vulars сорта ОД-51, молекулярная масса 19400 Да, соотношение ксилоза: арабино^глюкуроновая кислота ~ 79:12:6,6 /сбп-нитр?-ф.енил-^6-D-глыкопиранозад (п-КФГ), п-нитрофенил-íi-D -галакго-пиракознд, п-нитрофэши-J>-D -гаяакгопиранозид (serva', ФРГ), Активность эндоглюканаз и полигалактуроказ определяли вискозиметра-чески о отношению к »ОД ..и к пектину по методу Ватакера в моди-. фикаши Н.А.Родаоновой и др. с использованием О.,3$-ного раствора . ЕМЦ в 0,1 M ацетатном, буфера рН 4,Я или 1%-ного раствора пектина в 0,1 Ы ацотатном буфере рН 4,2. За; единицу активности принимали количество фе~мента, вызывающего возрастание обратной величины относительной вязкости ка единицу за I шн е данных условиях.

Для установления активности ка обработанном хлопковом волокне (АХВ) реакционную смесь, содержащую 50 мг субстрата, 2,75.мл Qjl M ацетатного буфера рН 4,7 и 0,25 м* раствора фермента, инкубировала в течение 1,24 .или 72 ч при 40°С, после чего определяли восстанавливающие сахара методом Шомодьи-Нельсона.

Осахарпвание КМЦ проводили в среде 0,5 ил 2.,5^-ного раствора К/Ц в 0,1 M ацетатном буфере рН 4,7 ж .0,5 вд раствора фермента Е течение. 1С,. 30 или 60 мин при 40°С, затем измеряли количество восстанавливающих Сахаров. Способность ферментов расщеплять полисахариды определяли как описано ранее Родаоновой. Во Есех случаях'

за единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование I мшоль-экЕИваленга глюкозы за I мин я заданных условиях опыта.:.

Активности по отношению к п-нитрофенилгликозидам определяли, инкубируя 0,5 т ЮьМ раствора' субстрата в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,2 0,5 кл раствора фермента 30 мин при 40°С. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализировало образование 1 метла® нитрофенола за I мин в условиях опыта.

Содержание белка измеряли до методу Лоури, а также по поглощению при 280 нм, восстанавливающие сахара - по методу Шомодьи--Нельсона. Анализ углеводов проводили хроматографией на вИиГо! ■ ш 864 (ЧССР) в системе растворителей - этикацетат-уксусная кислота-вода в соотношении 2:2:1,

Выделение и очистку" фермента полигалактуроназы из целлюлаз-яого ферментного препа, дта"Целлокадц1щ ГВДХ" осуществляли на колонках с сефздексом 0-25, зефарозой',СЕАЕ-33®, 1ВК-ЗР-5В7(РЬепуХ Бирегозэ , на Еысокоэффективном жидкостном хроматографе (ШЗ, Швеция). .

Изоэлектрическое форсирование цроводиди 2 хрехя&тв плот-поста хдацзрша в диапазоне р'Н 3~Щ, используя аналогическую колонку и ачфояиш фщш ьКВ (Швеция:' ,

Гомогенность выделенной полигалактуроназы доследовали методом влехстрофореза в 7,5^-нок полхшрвашдаом геле (ПАДГ) в присутствии дсдецилсульфата натрия (ДОН) и ё-меркаптоэч'анола при рН 3,3 КЗФ и гелбгфяаьтрада через ульт'г ,гель АсА 34,

Молекулярную массу 3440-1,4-^-полигалактуроназы определяли методом электрофореза 2 ПААГ в присутствии- ДОН -и 2-Мбрг'-птоБ_ано-* ла, с. ксдользованием реперных белков и гельфильтрацхш через уль-трогель АсА 34,- Характеристику пекганоЕых веществ проводили по метод- описанным в работах Кертеша, Караколева. Г, и А^чс. .Бовина В.В. При изучении разделения алкалоидов на слштом пектиновом сорбенте, использовали жидкостной хроматограф фарш '\7ео1 " (Япония). ,

Результаты исследований а их обсуждение

I. Биосинтез целяшюдигичвоких и пектолитических ферментов микроорганизмов

Проведена работа по изучению биосинте&'а цаллюлолдтических и пектолити^еских активностей гриба й. сапа. ЗС .и найдена оптималъ-

¡пая для синтеза ферментативного комплекса полусинтетическая среда, составленная кэ 2% жома, 2% -пшеничных отрубей и набора солей.

Для изучения возможности регулирования уровня ферментативных активностей провели серию выращиваний гриба е. сапа. ЗС и е. сапй. ЗС-106 на различных источниках углерода, сохраняя постоянным состав и количество солей. Результаты показали, что гриб мутант по сравнеш 5 о исходным штаммом обладает в 3-4 раза бслзе высокими цедшалолитическими и пектолитическими активностями. Добавление к питательной среде 7% МКЦ приводит к увеличению целлю™ лолитическои активности, а пектолитическне не изменяются, а исключение свекловичного жома - к снижению этих активностей. Поэтому оптимальными в случае необходимости понижения пекталитической активности,считается выращивание на жоме, из которого извлечен пектин. Проявление пбкткназяой активности в варианте выращивания без свекловичного жома свидетельствует о невозможности исключить образование полигалактурсназ. Для подтверждения этого предположения провели сравнительное, выращивание гриба б. сапа.. ЗС на срэ' дах, содержащих чистую глюкозу и галактозу, где снова проявляется незначительная полигачактуроаазная активность по сравнению с обычной средой - жом и отруби (табл. I)

■ Таблица I -.

Характеристика культуральяых жидкостей гриба Оео1;г1с1шт сапа1йит ЗС, выращенных в различных условиях'

У еле ш выращивания ' : Сх, ед/мл/мин : ПГА, ед/мл/мин 2% свекловичного жома,

2% пшеничных отрубей . 2,23; . 0,0045

4% глюкозы ' /,.'.' 0,14 0,0009

4% галактозы ' . 1,00 0,0006

Сх -эндоглшоказнал активность, ,

ПГА -асшигалактуроназная активность .' ,

Таким образом достичь выращивания гриба а. сапа. ЗС без проявления пектиназной активности, путем создания соответствующих условий внешней среды - не удалось, но уменьшать ее можно путем подбора средк культивирования. Следовательно, проявление псяига-лактуроназиой.и эндоглякаказкой активностей зависит от среды культивирования. , .'-"V-■'

2. Выделение к очистка полигалактуроназы из в. сапа. ЗС

В связи с тем, что по современным пррдставяениям в процессе расщепления клеточных стенок .принимают участие не только целлю-яотические ферменты, но и пектина вы, мы-поотавяли перед собой цата -выделить в гомогенном состоянии пояягалактуроназу и изучить ее свойства. Выделение и очистку полигалактуроназы осуществили из целлюлолитического ферментного препарата "Целлокандин Г10Х", производимого в НПО "Бволар" г. Олайне.

олк*аа)

*м

07Sr

OS

025

о.} А/а а[м]

OÍS

Рис. I. Очистка полигалактуроназы на колонке "ТвК-8?-5РГ\

2 мл/мин.

1 ~ профиль алюции

белков (280 ям)

2 -профиль 8люцик

полигалактуроназы (280 км)

3 - градиент ЫаС1

- 0,5 М, б 0,02 Ч натрий-ацетатном буфере рН 4,1

ео по

i Mt-M

Выделение л очистку полигалактуроназы осуществляли по схе-ie, приведенной в таблице 2, на B3IX (HRLC, фирма LKB, Швекл). Результаты разделения на двух последних стадиях на 1SK-6P-5RV и Ьеюу!-superóse, представлены на рисунках I и 2.

ЩSv/SñJj «»*1 I

o.ss

Рис. 2, Очистка

полигалактуроназы

на колонке "Phenyl-

Superosa"

V=: 0.05 ш/мин

1 - профиль элюции

белков (280 ям)

2 - профиль элюции

полигалактуроназы (280 им)

3 - градиент 1,7 М

(Ш4)2Б04 В 0,02 М калий. фосфатном буфере рН 6,5 ;

i*

Табливд Z

Очасхка полигакактуроназы из гриба Geotriobum csadidum 50

Стадии очистки

Белок

Активность

О0ЩИИ,,

ыг

\ж/т

общая! удедъ-í ¡т -

Выход: Степещ по ак; очистщ ТИБ- ; (раз) \

нооти :

Препарат носяс центрифугирования

Сафздекс 0-25

Ce|ajj03a ДЕАЕ-

lSK-SP-5Fff .

600 4S2

285

я,

аь' 1,2

15

• 4,9 1,8 О,Б

18,0 17,1

15,3 12,6 10,8

0,03 0,0340,055 0,35 9,0

100 95

86 70 60

1,13

1,83 • 11,67 300

Такшл образом, в результате шши этапов очиотки выделена полигаяагсЕурвваза с удельной аетквносгыа 9 ед/мг белка, что составляет» по сравнении с удельной активностью полигагактуроназн в препарате "Пакгокандян ИСК", очасгку в 300 раз (табл. 2).

ft

• 3. Физико-химические свойства полигалактурояазв

Молекулярная масса пшшгаяаятуроиаз из G. с and. по данным электрофореза в присутствии ДСП и 2-мзркаятоэтайада и найденная аналитической гельфих травдей т колонке с ультрогелем " Ye-fcrogei АсА 34" составила 32 кДа. Величина молекулярной гассы из других источников колеблется в пределах 20-80 кДа*

Исследования субстратной тлзфячяоетк пояиталактуроназы показали, что фермент обладает Si.-сокоЙ удельной активностью по от-ношенгш к пектату. Однако, s течеряе 72 ч яэ расщепляет арабшго-глюкуроноксилан, галактомашан, ка!?б02СО»^«та"П©ллюяозу, арабино-галактая, целлобяозу,' авяи&й, арабзй и хлопковое волокно, В следовых количествах полигал'актуроназа гадролизовала п-нитрофеяил-гликозиды: п-нитрофенил~ - в-гала:стопир чозял, п-нитрсфенил- -D-галактопиранозид, п-нитрофенил- - D-глюкопиранозид, Отсутст-' вне активностей по отно'-энию к выше указанным субстратам свидетельствует о высокой степени очистки белка и паяном отделении от Присутствовавших в асходногл ферментном препарате активностей,

Ркс. 3. Схема электрсй>ореграммы белков i 7,5$ ПААГ в присутствии

дан - 155.

Реперные белка: I - фосфорилаза (98 кДа), 2 - бычий сывороточная альбумин (С"1 кДа), 3 - яичный альбумин (45 кДа), 4 - химатрипсин (26 зсДа), 5 - полягалактут -наза

í «g£5s>

2 <Й£25

«ЖЗ S

Гомогенность белка видна на приведенной элехтрофорегракма [рис. 3). Выделенная полигалактуроназа проявила типичные свойства рермента эндо-действия: снижая вязкость раствора пектина на 50?, ша осахаривала этот субстрат только на 0,455?. Очиценн&гпалига-гактуроназа имеет рН0ПТ> 5,0, ^01И>=55°С. Пги температуре от 20 ;о 55°С белок сохраняет'от 100 до 80$ первоначальной активности,

вшш 60°0 аштнссть ревко падает, при ?0°С полностью шакмш-руез?» При действии фермэкта ш пектин бшт определена константа Михаелиоа, она равна 0,23 мг/ш (табл. 3).

■ Таблица 3

Свойства видало ¡шей поякгадактуроназы из гриба беойгЛсЬищ еа&сЦйща

Показатель : Значения показате^

Молекулярная масса 32 яДа.

Изозлектричеекая точка 4,55 .

рН оптимум 5,0

температурный оптимум • 55°С

температурная устойчивость 20-50°

% гидролиза свекловичного пектина за время, в течение которого вязкость раствора пектина снижается на 50$ ■ 0,45

Ку при действии на пектин , ' 0,23 ж/т

По сравнению с исходным раствором фермента гомогенно очищенная полигалактуроназа не" проявлЛзт мацерируших свойств. Это можно, по-видимому , объяснить участием в расщеплении растительной ткани комплекса ферментов, хотя ряд авторов приоритетным ечктаг? дейотше пектешгеячееких фармантов. - ,

4« Ферментативный способ получения пектиновых веществ

.Ферментативные способы получения полисахаридов условно мож-. но разделить на биохимический, где для ферментативного гидролиза используются фильтраты культуральнше жидкостей или -ферментные прэпараты, и мтсробаодогический, где ферментативный гидролиз совмещается о прс косом роста самой культуры, т.е. происходит совмещение двух отдельных стадий птзоцесса.

■ 4.Х, Биохишчеокий способ.получения пектиновы; * вещеотв

Пектиновые вещества - пацисахарады. локализованы в срединных пластинках в первичных меточных стенках растительных тканей и для их выделения требуется действие комплекса ферментов, таких, " которыми обладает культура ОбойгХсЬиа ашииаша зс, включающая в' себя целлшавитшшокнз, гешпдадштшотеокие-и пектолитичеекке' активности. Получение пектаа о использованием фильтрата -культу- , ральной жидкости проводит следующим образом: в колбы на 750 мл. вносили по 20 г цитрусовой цедр, 20 ш фильтрата Культуральной

аидкоотн а 280 т 0,1 И ецотатноаго буфйра рй 4,1. Скесъ оогавдя-' ли-при тешвратуро на 4 ч, 24, 48 к 72 ч. По неточеная временя гздроляза осадок отделяли фяладроаанввм *ервэ х/<5 ткань, раствор кшшшш 10-16 вдй'датя инактивации фермента, далее упари-Ьгхап на вакуумном испарителе, подкисляли соляной молотой, осаждали 86°-ййм оякртом ¿до ацетоном в о'оотпеш'щш 1:2,5» Осадок вромываяя 70°-шл спиртом, отшвая о? соляной кяолоти до отрицательной рвашш на кош хяора н сушки«;' .•

2в-

Рис. 4. Хроматография препарата цаллюяазы "Целлош .ин 11UK" на колонке о микрокристаллической цаялюдозей 1ЛЩ (6,3x6) I - поглощение при 280 ■ ни;, 2 - профиль злзоцш э'^оглвкавазн, , 3 - профиль аяюции полигалантуроназы, AggQ - погло ml.j при 280 ш. I ¿ и Ад - активность зддоглюкапазы и пшптхии-:--туроназы соответственно, ед/мл.

Использование для получения пектина фильтратов хультурадь-нх жидкостей, и ферментов гриба G. cand. ЗС и G. cand. 30-106, ыращенных на традиционной среде жом + отруби, нз дало желаешх езультатов. Полученные препараты обладали очень йиэкой-урояцд-. ой составляющей и молекулярной массой. Это,- по-видимому, связа-о со значительным содержанием пектешатйчвеких ферментов, которда

i;e¿ радируют пектиновые вещества. В связи с этим было проведено разделение пектсиштическшс и цштдашшгческих фракций ферментов на микрокристаллической целлюлозе (МКЦ), хде происходит сорбция цаялшс. лтических ферментов, а пектояятическяэ ферменты выходят из колонки о первыми фракцйяш фильтрата (рис. 4). Лдя изучения процесса получе¡гая ПВ использовали модальные растворы, составленные на основа фраки**! гомогенно очищенной полигалактуронази и ферментных растворов с различными эндоглвканазними и полигалахту-роназнкш активностями, снятых с МКЦ после афТинноЛ хро?,5атогра$1ш. При этом сырьем слукюш отхода производства безалкогольных налитков ~ апельсиновая цедра, составляющая 20-25^ от веса плодов ("Черномор", Украина). Гидролиз пр леди с зндоглюканазнымя активностями ра^.шыя 1,06 ¿д/мя/шн и 0,55 ед/мл/мин, и полигалакзсуро-назной активностью от следовых количеств до 0,3 ед/ш/мин. Активность определяли вискозиштрнчгски по снижению вязкости соответ-' ствувщих субстратов (табл. 4).

Таблица 4

Характеристика пектиновых веществ, полученных из цитрусовой цедры при действии х®3£шх kú,ячеств полкгалактуроназной и зндоглюканазнсй активностей. Условия: 20 г цитрусовой цедры, 200 ms ферментного раствора М 1:Ю,рН 4,1, температура 40°С, время гидролиза 4 ч

С_, 5 ПГА : СООИ : 0СН„ {Уронив: Ст.Э ;Быход :Молеку-:Крепость

. ♦ , ' _ : ■ ;ное со: ■ ; „ :лярная : геле,

ед/ця í л/тг % i % :дерка~: % : % :масса„ гш.рт.ст

шк : ш : ; :нае, %'. : :М 10 ° :

1,06 следы 6,52 12,55 76,0 65,0 62' . 50 650

1,05 0,0038 6,38 12,20 74,2 65,8 65 50 600

.1,06 0,03 ' п,11 13,60 81,0 63,4 60 45 500

1,06 0,16 7,05 13,СО 80,2 65,0 46 20 320

1,05 0,3 6,30 13,00 77,5 64,8 35 10 200

0,55 следы 6,93 12,10 ,76,7 63,0 62 50' 600

0,55 0,0038 7,05 11,89 75,7 62,3 60 50 600

0,55 0,СЗ 7,07 11,90 75,9 62,7 55 43 500

0,55 0,16 6,90 11,80 74,8 63,2 38 18 300

0,55 0,30 б,ег/ 11,70 74,3 62,6 35 10 200

Сх - эядоглвканазная активность, ПГА - цовшгалзктуровазная активность, Ст.З- степень зтерифЕкадая

Из анализа проведенной работы следует, что для экстракции •

пектиновых веществ из цитрусовой цедры необходимо и достаточно присутствие следозюс количеств полигалактуроназы. Повышение ео якттжосгк с гпрсшгзущзй систймз в количестве 0,16-0,3 ед/мл/мпн приводят к снижении как вихода, так и его желирузшх свойств. Объяснись это можно только распадом молекул пектина в присутствий зттогейьыос количеств ибявгалактурояази.

Дальяейпке исследования бша кааразшш на изучение зависи-мсЪт Ферментативного гидролиза цитрусовой цедры от продолжителъ-но«т?' экстр&кгога, Дня отсго время грярслиза .увеличили до 12 часов (табл. 5). . .

Таблица 5

Характеристика пектиновых веществ, полученных в зависимости от продолжительности гидролиза. Условия гидролиза:. 20 г ' цитрусовой цедры, 200 мл ферментного раствора рН 4,1; температура 40°С (полигалактуронйзная активность равна 0,005 ед/мл/мин) " ....

Л/мл мин :Время:Вкход, :гидр о: :лиза,: % С00Н,: а! осна,.: % \ Ст, Э, ;Уронид-:яое оо-^ % :детека~ :ниё, % :Молеку :Кре-:ляшая:пость М 10 -.ш.рт.ст

1,26 4 53,2 6,88 11,32 62,2 72,8 47,5 500

1,26 6 54,0 6,-70 10,50 61,1 63,8 47,5 500

Т х о 12 55,0 10,20 7,3 41,7 70,0 43,0 450

0,55 4 52,0 6,г/0 .11,4 62,0 72,5 46,3 5С0

0,55 е 58,0 7,20 10,5 58,7 70,8 46,5 500

0,55 12 54,0 9,20 8,0 46,5 65,8 42,0 400

Из таблицы 5 вдцно, что увеличение вретж окстракщш до 12 ч ко дав! значительного повышения выхода пзктияа, но при этом наблюдается понижение степени этврифйиацйя (Ст.Э), Так, например, за 4 часа гидролиза Ст.Э составила 62,2$, а га 12 ч эта веэвтшнг снизилась до 41,?Я. Это можно объяснить там, что в ферментативном комплексе используемого гриба веоЬг1аЪит вгуьЦЛия присутствуют в следовых количествах пектинэстеразд, которая яз-за низкого- содержания определяется только качественно. Это свойство ферментной систрш гриба &эоЪг1сЬи» се»11йиз шз©х бтъ помаши и перспективным для получения низкометаксилировзлянх пектиновых веществ.

В резул. гате сравнительного язучеквн $>ер!/ттш активностей культуральных жидкостей.гриба вво<;г1сЬгаа еажШип' и'««гамма

мутанта Geotrichuia caadidum SG-I06 пришли К выводу о том, что • у последнего цоллшазныэ и пзктолитдче'окиа активности в 3-4 раза выше, чем у,исходного гриба и его целеоообразнр использовать для получения et -D -галактуроновой кислоты1, где требуется прохозде- • ние более глубокого гидролиза до мономернше звеньев. А походный штамм Gsotrlchum о audi dum ЗС можно применить для выделения пектиновых веществ, где. деллшшштичеокие и пектолвтнчеокие актив?-ности ниже. Для этого следует гриб выращивать' на среде обеспекти-ненного жома, что позволяет уменьшить содержание пектолитических ферментов, или проводить предварительное разделение целлшолити-ческих и пектолитических ai "квностей sä МКЦ.

4.2. Микробиологический способ получения пектиновых веществ

Для проведения микробиологического способа получения пектиновых веществ наш подобраны две культуры; с. кешлекодонным номеров ВКМ Р 206 из слизетечения тиса ягодного Еахиз baoeota типовая культура Oospora tlebaimli и вторая культура .с коллекцион- . НЫМ номером ВКМ Б 2926, типовая культура Trichosporon kleb ahull из слизетечения вяза Толано sp.

Результаты Быращишния этих культур на свеяей апельсиновой педре для получения пектина приведены в: таблице'6.

•." : Таблида'6 . Выращивание культур Р 206 и. 3? 2926 на свежей апельсиновой цедре для получения пектина. Условия выращивания: 30 г свежей апельсиновой цедры, 100 мл стерилизованной воды, 25°С, 19 ч, перемешивание 180,-об/мин

Культура : . : 'ИГА,', 's Выход, :, Способнооть

' •• : едДл/шн|ед/ш/мин J г ; желирования

Г 20" . - ' ' 0,0124 0,0124 ' 0,1 слабая .

Г 206 с солями 0;0078' 0,0033.. 0,1' слабая

Г 2926 0,0088 0¿0178 0,5 средняя

Г Lj26 с солгали ' 0,0230 • 0,0167 ; .- 0,о '•' средняя ■

контроль : . - . : 0,1 -

В варианте (табл. 6) с использованием культуры Р 2926 с солями и без солей яаблвд этея сильная мацерация ткани, она прак- . • тически превращена' в .»шшицеобразную массу и выход пекткна в Е раз выше контрольного опыта и варианта- выращивания с испол зованием . культуры F 206. .В результате...выбрана, .культура Р 2926.' Установив-

но, что вырашшшэ на дадро .в течение 19 ч ср:шода к сильной малевании ткана к кочщашому к нежелательному гидролизу пек-тиноыпс вешеств» я резудътато которого сюзаются и.!.и и выход продукта. Било установлено, -что оптимальное время гттдролсза до

6 часов.

Проведены исследования микробиологического способа получения пектиновых вепестн из евовей и сухой цитрусовой цедры и сушенных яблочных ЕНШ1М0К. Результаты использования культуры ? ¿226 -дад получения: пектина из разных источников сведены в табл. 7.

•А /

Получение пектина о использование)« культуры ЕПсЬоарогоп 3£1еЪвЬа11 ВШ Р 2926. Условия: штада 2926 , 27-280С, гидролиз 6 ч; 100 мд ст ериллкзоеанной воде, 5 т культуральной суспензий

.'к-ео, :С00Н:0СН_ : От.Э. :Уронвд-:^олоку: Йыход

Сырье : : : 1а : . ;ноа со-:лярная: . • •

: г I % ! % ! % здержа- шасса.: %

: : : :ниэ, % :М 10

Свежая апельсиновая цедра 30 6,75 11,7 6$,4 73,8 35 60

Сухая апельсиновая цедра 20 6,30 11,7 55,0 72,0 20 40

Сухие яблочные

енкгалки 20 4,65 7,65 6 5.3 46,3 19,6 40

Из экспериментальных данных следует, что микробиологически;* способ получения пектина имеет ряд преимуществ:

, - исквючаотся использование сильных кислот для получения пектина; » .:■...

- пронесся гзщролкза-^кстршсцан цектвясодераащего ешръя и гнршшайРя щгвщш согадЫаахся, тогда как при биохимическом зпособе эти процессы проходят в две стадии:, сначала выращивается сульгура, а аптем полученныо фильтрата яудаоураяьшх вдуюстей игл Ферментное препарати кслсдъйуэтся для Еыделенгщ дектлиа,

5. Получение элементарной структурной едшшда пектиновых веществ''<£-5-галактуроиовой кислоты

Галактуроковая кислота как элементарная, едш-шца пектиновых, ещеотв имеет эширнческу» формулу сб%0®7* Наиболее распростра-анным способом их: получения является кислотный гндролзп с глу-

' б окой химической деструкцией йейменовах $ещестЕ до мояомерного звена. :

Для б^рментатиького способа получения йепшгьзоЕади фильтраты культуральных жидкостей и ферментШе típetíapüfa болей акгйвШ-»' го шташа-вдташ.'а G. cand. 3C-I06. № этого 40 г кош.юрчвеКС-го свекловичного пектина суспендировали е ШО ьт ОД Й аЦйга*й&" го буфера рН 4,1, тщательно перемешивали и в образовавшуюся су еносили 4 г ферментного препарата, обладающего 32,13 ед/мя эндоглюканазной и 0,40 ед/мл псшигалактуроназной'активностями, далее помещали е термостат при. 40°С на 72 ч.

Разделение кислых и i йгральных с'ахчров гвдролизата проводили о Даузксом 1x8 (фирмы "Serva ", ФРГ), сорбированную <¿ -D -галактурононую кислоту снимали 0,5 М раствором муравьиной кислоты, Полученный продукт идентифицировали хроматографией на "SJAu-fol OV 254" (ЧССР) в системе растворителей - этилацетат:уксус-щ £ кислота:Еода в соотношении 2:2:1, В. качестве метчиков использовали растворы моно- и дигалакгуронидов фирмы "serva " ФРГ. Исследуемый продую давал одно, пятно по даету и К идентичное с метчиком - моногалактуронидом (рис.. 5).

Рис. 5, Идентификация на 311и-

£о1 ш254 сС -Т> -галактуро-

новой кислоты

I ~ моногалактуроновая кислота,

2 - дигалакгуроноЕая кислота,

Л- /У •3 г анализируемый продукт

V,' V

п

KJ

—— —т-ы— — с--

1 Г" ~ 3

АахоД ередукта составил 66% от уронвдной состащг тощей исходного сйеляоЕИчиого пектина и представляет собой порошок белого цвета» хорошо рай.лоришй в воде.

Преимущества ферментативного способа tro сравнению с кислотным заключается в том» что исключается использование сильных кислот, Ередных для здоровья а существенно осяоннающах производственный процесс, увеличивается выход конечного продукта» поскольку протекает регулируемый процесс гидролиза.

6. Пуименениэ пектиновых веществ

6.1. Сорбента на основа пектиновых веществ для разделения "' алкалоидов*' .'...'

Пектиновые- сорбенты, основой которых являются молекулы пола-галактуроновой кислоты» имеют линейную структуру с .большим количеством карбоксильных групп. Их гидрофильная матрица предотвращает гидрофобное взаимодействие в системе сорбент-оорбат, что по,, воляет осуществить препаративные процессы сорбции и десорбции биоорганических соединений, в частности алкалоидов j водными рас-ТЕорами электролитов без добавок органических растворителей.

Исследования по разделения смеси алкалоидов опиакопой кислоты, норкотина и стиптицина, проводили на. хроматографе "Joel " (Япония)'с УФ детектором (260 нм) а стеклянными колонками, которые заполняли подготовленными сорбентами обычным образом при комнатной температуре. В качестве сорбентов использовали СЭ-сефадеко К-25 и Ш-сефадекс К-25 ("Фармация", Швеция), молселекзг СЭ-25 ("Резная", Венграя) и карбоксильный пектиновый сорбент, сшитая пеетовая кислота (СПК-2). Были езятн рас-творн с концентрацией ат-кадоидоЕ Ю^М е 0,1 н соляной кислоте. Вводимая в хроматограф проба содержала смесь этих трех алкалоидов в соотношении 1:2:2 соответственно (2-4,10""3М). Элщроаанио атгалкзкруемых смесей проводилось 0,1 к натрий фосфатным буфером pH 7,0 со скоростью 2025 мл/ч. На рис. 6 представлено сравнительное разделение, полученное на всех четырех сорбентах. Как видно из приведенных хрома-тограмм, сорбент СПК-2 не уступает со разделяющей способности СЗ--сефадексу K-¿5, в то - -реик, как шлселсят СЗ-25 не даэт удовлетворительных результатов. Такка гадно, что по сравнению с КИ-се-фадексом К-25 на СПК-2 разделение происходит бнетрее. Высокая динамшеа процесса в случае с G1ÍK-2 колот быть объяснена только значительно лучшими кинетическими характеристиками данного сорбента что, видимо, связано с макроструктурой пектиновой матрицы.

* Работа выполнена.под руководством д.х.н., проф. ГлагчшеЕа П.П.

VtMJl

'Рис. .6, Разделение смеси опиановой кислоты (I), наркотина (2) и котарнина (3) на колонке Ц 0,9 см) о I г сорбента? а - СЭ-сефа-декс К-25, б - молселект СЕ 25, в - 'СПК-2 v - КМ-сефадекс К-25

К

ОО

2S

К

Л1

-о-о—о. ^ •ir-ö-o- £

10

за so so ггг>

I II II

1 3S73 "С сутки

,7

8 $

tÜ

А 2

j_l.

-? so so щиапо

Тмин

0 30 SO SO 120 Z" пи»

pH

7

8

9

10

i Ui l. 13573

t сутки

SO

В 3

-I_I_L.

120 780 Z мин

120 180 t TtNVH

Рис. 7. Кинетика йонного обмена алкаловдоЕ (А) и неорганических ионов (В). На BI, В2 и ВЗ показана зависимость рЫ титруемой сус-пенздии сорбента от времени (» - в вода, о - е 0,2 н KDI5. Кинетические единые . сорбции алкалоидов наркотина (1-3) и котарнина (4-5) соответствует следующим внешним растворам: ,1 - 0,1 н . HagB407 в воде, 2 - н Ш1 в воде, 3 - 0,1 в KagB407 в 80 % штилцеллозольве, 4 - 0,01 н HCl в воде, 5 - 0,01 ч натрий-фосфатный буфер pH 7,3 •

о

Поэтому провела сравнительное исследование кинетики сорбции ' неорганических и органических ионов на СЭ-сефадексе К-25 и пектиновом сорбенте СПК-2, Полученные-результаты приведены на рис. ?♦ Как видно из рисунка 7, сорбент СПК-2 действительно отличается более высокой кинетикой сорбции как неорганических, так и более крупных органических ионов.

Таким образом показана возможность применения пектиноЕых сор-б.ентоЕ е аналитической хроматографии природных соединений,. Учитывая ДОСТУПНОСТЬ И НИЗКУЮ СТОИМОСТЬ СЫРЬЯ МЯ ПрОИЗЕОДСТНа 1I0KTI1"

нов. х сорбентов, следует полагать, что они могут успешно конкурировать с рядом катионообмешта сефадексов и их аналогов.

6.2. Иммобиллизация изониазида на пектиновых веществах

Пектиновые вещества (ПВ) нашли применение как полимеры носители дан связывания лекарственных веществ (ЛВ), особенно применяемых дая лечения хронических заболеваний, которые требуют многократного приема медпрепаратов. К таким,, например, относятся противотуберкулезные препараты, в частности, взониазид.

В 'сеязи с этим исследованы возможности использования пектина пекговой кислоты и ах карбоксил- к' альдегидпроизЕОдных в качестве полимеров-носителей изониазида и изучены некоторые свойства полученных полимерных соединений. Реакция между функциональными группами ЛВ и иолйэлегстролйтов протекала в мягких условия по следующей схеме:

Ri Нгг/-гм-с=0

;00%Й-ШН==0

. I - пектин, Р - COOCHg',' Pj - СООН, П - пектоЕая кислота, Р иРт - СООН, И - изониазид'.

Полученные производные изокаазада на основе пектина, альде-гидпекгша, световой и альдегздвекгоЕОй кислот, представляют собой густ,ой раствор или гидрогель', I г которого поглощает 1012 мя воды.

Исследования пролонгирующего лечебного действия малых доз изонаазида, иммобилизованного на. сшитой пекговой кислоте, в эксперименте, на животных показало, что лечение полимерным изониааи-дом, который Енодатся однократно в-неделю, эффективнее лечения, проводимого ежедневно свободам изониазидом. Пролонгирующий лечебный аффект монно объяснить, созданием лекарственного депо, способного дозироданно .осибоадать 'актигчое начало и поддерживать терапевтическую концентрацию в течение длительного времени.

. , В Ы.Б ОДЫ

1. Проведено сравнительное изучение активностей внеклеточное целлюлолитических и пёктолвтичерких ферментов Geotrichum сап-Д1ф1ш ЗС и полученного из .него методом химического ыутогенеза мутантного штамма Geotrichum oandidum 3C-I06. Установлено, что

£ живности целлюлолитических и пекголитических ферментов у мутагенного штамма Geotricbum caadldu® 3C-I06 в 3-4 раза Еыше, в сраЕиении с активностями исходного гриба.

2. ПроЕедено разделение пекголитических и целлюлолитических активностей из ферментного -препарата "Целлокандин П02" с примеиенйум аффинной хроматографии на микрокристаллической целлюлозе; полученные фракции ферментоЕ использовались ,для выделения пектиновых веществ,

3. Разработана схема выделения ь очистки зццо-полигалакту-роназн со степенью очистки. 300 раз и выходом активности 60%. Молекулярная масса , по данным ганьхроматографии и электрофореза

в присутствии ДОН, равна 32 кДа, ЮТ 4,55, рН оптимума 5,0 температурный оптимум 55°С, К = .0,23 ж/т. Очищенный гомогенный белок проверен на субстратную специфичность. Показано, что по-лигалактуроназа при пониженна вязкости субстрата на 50$ гвдро-лизует 0,45$ связей, что ,сЕидетеда<-.'Вует. о.эндо-дейсг-ии фермента. : '''•..'.'■'-'-'

4. Разработаны.на,гчвде основы ферментативного способа получения пектиноЕнх • еществ биохимическим путем с использованием фильтратов культуральных. жидкостей или ферментных препаратов грлба Geotrichum candidum ЗС, а также микробиологичьоким спо-

• собои о применением щ, .жнедодобнкх: гря. os Trichosparoa к1еЪаЬл±1,

'принципиальное отличие и преимущества которого заключавтся в совмещении двух процессов - ЕыращиЕакия и ферментативного гидролиза.

5. Фильтрата культуральных жидкостей мутантного штамма Gsotriohiua candiduia 3C-I06 использовали ДЛЯ получения «С - D-галактуроновой кислоты и увеличения экстрактивных веществ из кофейного шлама - отхода производства растворимого кофе на 25-30$.

6. Показана возможность использования сшитой пекгоЕой касло-«я (СПК--2) для раэдеяепяя смеси олзановоЗ шалоты," наркотина и otf тинина, а также поетгагегых веществ и их ароизводных в качестве полимеров-носителей для связывания лекарственных препаратов

с целью пролонгирования их.действия,.

Список работ, опубликованных, го материалам диссертации

1. Нурадиега А., Гладншэв П.П. ,■ Бектенова Г.А., А~мухаме-доЕа Г.Е. Сравнительное исследование хроматографкческих свойств пектинсЕЫХ и декстрановых ионное //В сборнике "Совреметпыэ

проблемы биоорганической химии и химии природных соединений" Деп. в «КазНИИНТИ И Ка-Д-84, 1984.- С. 393-398.

2. НурадкеваА., Аймухамедов.аТ.Б., Бектенова Г.Б. Исследование хроматографлческих сеойстл различных полиоахаридных сорбентов //1У Всесоюзн, симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии: Тез.докл.- Алма-Ата, 16-20 июня 1087, М,, 1987.Г Т Г-2Т

vj < .luj. »

3. Бектенова Г.А., йурадиеЕа А., Аймухамедова Г.Б., Гладц-шев П.П. Сорбенты на основе пектиновых веществ для препаративной жидкостной хроматографии //I Всесоюз. симпозиум Препаративная хро^атограссия физиологически активных веществ на полимерии* сорбентах. Тез .докл.- Л.ч, I9BS,. .

4. НурадвеЕа А,, Гладашев П.П.> Бектенова Т.Д., Айгдааме-цова Г.Б. Хроматография алкалоидов на полиоахаридных сорбентах //Известия А! Кая.ССР серия химическая.- 1988.- № I,- С. 51-г '.

5. ЩрадквЕа А., Мартикояич Я.И., Загустила H.A., Родионова H.A., .Аймухамедова Г.Б., Шелуиша Ц.П. Пеетолитические фер-лептв Gootrichura candifium 30 и перспективы их применения //ie-:одн получения,. анализа и яршенения ферментов: Тез.Докл. Есег,о?к-аднф.- Юрмала, 10-14 декабря 1990г.- Рига, IS80.- С. 151.

6. Шипунова О.В., Майкевич O.A., Нурадиева.А»; Гладашев ¡.П., Туркебаева A.A., Кривцова А.Е., Аймухамедова Г.Б., Зуба-

нов Е.Л. Иммобилизация изониазвда на пектиновых веществах //Известия Ж КазССР, серия химическая,- .1990,- & 2,- С, 83-88.

7 Родионова H.A., Мартшкшич Л..И», „Загустина H.A., Нура-диена А,, Аймухамедова Г.Б,Г Шелухина Н.Д., Кацрельянц Л,В., Се редшщкий П.я», Безбородой АЛ. Препараты целлюлозы, "Целлокан-дин" и перспективы их применения. //Ферменты - народному хозяйству. Тез.докд. Всесоюз. научно-практической конф,- 12-16 ноября .1990 г,- Черновцы, .1990,- С, 35,

8., Нурадиеьа.А,, Аймухамедова Г.Б., Шелухина Н.П., Марти-Н0Е2Ч Л.И,, Родионова H.A. Растительная клеточная стенка и ее ферментативное расщепле на: Роль' пект^литических ферментов // Биосинтез цеялвдоаы и других компонентов клеточной стенки. Тез, докл. Ш Всёсоюз, крнф.-: Казань, 1990 г. С. 25,

9, Бадаева А/, йаргтовт Л.И., Загустит H.A., Айм^ха-медоЕа Г,Б,, Родионова H.A. Дект.олитические фермеягы üeotriobu oandidum ЗС и полученного из него мутанта Geotricfcum candidum 30-106. //УП Всесоюз.симпозиум Инженерная энзммология (получение и применение биокатализаторов в народном хозяйстве и медицина): -Тез.докл,- апрель 7.991 г.-т М., .1991.- С.. 155-156.

10, Нурадазва А.,. Родионова H.A., Мартинович Л.И., Загусти-на H.A., Аймухамедова Г.Е., Шелухица Н.П. Получение ¿-с -га-лактурояоЕой кислоты из свекловичного пектина ферментативным гидролизом пектслитической системой ферментов Gootrichxua oandi-

dua Г М06. /Л1рикааашая биохимия и мшфобиологая,-1991.г том 27,- Я 5.- С. 751-755.

11, НурадаеваА., Мартиновач Л.И., Загустина H.A.,..Аймуха: медова Г.Б., Шелухина Н.П, Ферментативное превращение пектиновых Еещб^тв пектслитической системой ферментов Geotrlchun саи-dldum. ''Перспективы применения, //Всесоаз.конф. Химические

превращения пищевых полимеров: Тез.докл.- Светлогорск, 1991,-С, 77, • .

12, Голубев A.I.L, Нурадиела А., РодионоЕа H.A., Неустроев

Полигалактуроназа из, Geotrichum candldum ЗС: Очистка и

СЕо^уТЕа //Биохимия, I9S3 г. (в nu jain).