Ферроценилалкилирование нуклеиновых оснований тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.08 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ имени А Н. Несмеянова

Жилина Жанна Вячеславовна

УДК 542. 957 : 547. 854 : 547. 857

ФЕРРОЦЕНИЛАЛКИЛИРОВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ

02.00.08 — химия элементоорганических соединений

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Ю.С. Некрасов кандидат химических наук, н.с. В В. Гуменюк консультант, кандидат химических наук ст.н.с. В Н. Бабин

Москва —

1999

Содержание.

Введение................................................................................................................................................2

Глава 1. Алкилирование ДНК и ее компонентов.................................................................................4

(литературный обзор)............................................................................................................................4

1.1. Алкилирование нуклеиновых оснований...................................................................................5

1.1.1. Аденин..................................................................................................................................5

1.1.2. Гуанин...............:.................................................................................................................11

1.1.3. Пиримидиновые основания................................................................................................12

1.2. Взаимодействие алкилирующих реагентов с нуклеозидами...................................................15

1.2.1. Реакции по гетероциклическим основаниям.....................................................................16

1.2.2. Реакции по углеводному фрагменту..................................................................................24

1.3. Алкилирование нуклеотидов.....................................................................................................27

1.4. Свойства алкилпроизводных нуклеиновых оснований...........................................................30

1.4.1. Реакционная способность алкильных производных нуклеиновых оснований в реакциях с алкилирующими агентами...........................................................................................................30

1.4.2.Перегруппировк и.................................................................................................................32

1.4.3.Спектральные характеристики алкилпроизводных нуклеиновых оснований...................35

1.5. Ферроценилалкилирование.....................................................................................................37

1.5.1. Ферроценилалкилирующие агенты и методы введения ферроценового фрагмента в нуклеофильные субстраты...........................................................................................................37

1.5.2.Ферроценилалкилирование нуклеиновых оснований и нуклеозидов................................38

1.6. Алкилирование ДНК.................................................................................................................41

1.6.1. Ферментативное алкилирование ДНК...............................................................................41

1.6.2. Молекулярный механизм противоопухолевого действия алкилирующих препаратов.... 42

1.6.3. Основные принципы разработки противоопухолевых препаратов алкилирующего типа.43 Глава 2. Обсуждение результатов.......................................................................................................51

2.1 Ферроценилалкилирование нуклеиновых оснований...............................................................51

2.1.1 а-Ферроценилалкилирование с использованием (а-гидроксиалкил)ферроценов.............51

2.1.2. Ферроценилалкилирование с использованием N,N,14-

триметил(ферроценилметил)аммонийиодида............................................................................54

2.2. Ферроценилалкилирование нуклеозидов и нуклеотидов.........................................................59

2.3. Изучение строения ферроценилалкильных производных нуклеиновых оснований..............62

2.3.1. Рентгенострукгурные исследования..................................................................................62

2.3.2. Данные ПМР- и ИК-спектров............................................................................................82

2.3.3. Масс-спектральные данные................................................................................................83

2.3.4. Исследование оптической активности...............................................................................86

2.4. Алкилиругощая способность ферроценилалкильных производных нуклеиновых оснований.89

2.4.1. Алкилирование и ферроценилалкилирование нуклеиновых оснований..........................93

2.4.2. Сравнение ферроценилалкилирования нуклеиновых оснований и других субстратов... 94

2.4.3. Анализ некоторых факторов, влияющих на направление атаки

ферроценилалкилирующего агента по отношению к нуклеиновым основаниям......................95

2.5. Биологическая активность 9-К-(а-ферроценилэтил)аденина..................................................98

Глава 3. Экспериментальная часть...................................................................................................107

3.1. Синтез исходных соединений.................................................................................................107

3.1.1. Синтез К,К,К-триметил(ферроценилметил)аммонийиодида 77.....................................107

3.1.2. Синтез карбинолов...........................................................................................................107

3.1.3. Синтез ферроценилалкилазолов.......................................................................................108

3.2. Синтез производных нуклеиновых оснований и нуклеозидов..............................................109

3.3 Ферроценилалкилированьз нуклеофилов производными бензотриазола..............................117

3.4.Ферроценилалкилирование нуклеофилов производными пиразола......................................122

3.5.Ферроценилалкилирование нуклеофилов производными нуклеиновых оснований.............122

Выводы..............................................................................................................................................125

Литература........................................................................................................................................126

Введение

Актуальность темы Реакция ферроценилалкилирования в различных вариантах широко используется для синтеза разнообразных ферроценсодержащих соединений, в том числе ферроценилалкилазолов, обладающих выраженным противоопухолевым эффектом в сочетании с низкой токсичностью. Вместе с тем реакционная способность такого важного в биологическом отношении класса молекул, как нуклеиновые основания, в условиях протекания этой реакции практически не изучена. Необходимость постановки такого исследования обусловлена тремя основными причинами: первая из них заключается в выявлении закономерностей реакций субстратов, имеющих несколько нуклеофильных реакционных центров, с ферроценилалкилирующим агентом, вторая — в поиске подходов к изучению молекулярного механизма противоопухолевого действия ферроценилалкилазолов, одной из вероятных мишеней которых является ДНК опухолевой клетки, а третья — в поиске новых противоопухолевых препаратов на основе нуклеиновых оснований, содержащих ферроценовые заместители.

Цель работы — синтез ферроценилалкильных производных нуклеиновых оснований, изучение их строения, реакционной способности и биологической активности. Научная новизна и практическая ценность

Установлены основные закономерности взаимодействия различных ферроценилалкили-рующих агентов с нуклеиновыми основаниями. Сопоставлена алкилирующая способность ферроценилалкильных производных различных азотистых гетероциклов и найден новый эффективный ферроценилалкилирующий агент l-N-(a-

ферроценилэтил)бензотриазол. Осуществлен синтез 14 новых соединений, в том числе 12 моно- и бис-ферроценилалкильных производных нуклеиновых оснований и нуклеозидов. Методами РСА, 1Н- ЯМР, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии установлено их строение. Найдены условия разделения рацемической смеси 9-N-(a-ферроценилэтил)аденина на энантиомеры. Установлена способность 9-N-(a-ферроценилэтил)аденина в условиях in vitro подавлять синтез ДНК в опухолевых клетках и ингибировать рост некоторых злокачественных новообразований в опытах in vivo. Предложены возможные молекулярные механизмы противоопухолевого действия ферроценилалкильных производных азотсодержащих ароматических гетероциклов.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на VI Всероссийской конференции по металлоорганической химии (Нижний Новгород, 1995 г.), Российско-Корейском семинаре по химическим технологиям (Москва, 1996г.), Всероссийской конференции по современным проблемам и новым достижениям металлоорганической химии (Нижний Новгород, 1997 г.).

Публикации По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 3 статьи и тезисы 2 докладов на конференциях.

Объем и структура работы Диссертация изложена на 130 страницах, содержит 25 рисунков и 22 таблицы. Состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (120 наименований).

Глава 1. Алкилирование ДНК и ее компонентов (литературный обзор).

Реакция ферроценилалкилирования в различных вариантах широко используется для введения ферроценилалкильной группы в различные органические и элементоорга-нические субстраты. Однако, к началу наших исследований имелось лишь незначительное число публикаций [1,2] по получению ферроценилалкильных производных аденина и некоторых нуклеозидов. Поэтому, приступая к исследованию реакционной способности нуклеиновых оснований в условиях проведения реакций ферроценилалкилирования, уместно рассмотреть как различные варианты ферроценилалкилирования азотистых гетеро-циклов, так и традиционные методы алкилирования нуклеиновых оснований.

В работе используется следующая нумерация атомов в нуклеиновых основаниях:

тимин цитозин урацил

При этом нумерация гетероатомов экзоциклических групп та же, что и атомов углерода в кольце, к которому они присоединены. Записывается она верхним индексом: И6 (в адени-не), О2 (в тимине, урациле) и т.д. в отличие от кольцевых гетероатомов 7-М и т.д. Атомы углерода в рибозе обозначены штрихами:

О

НО он

ВН— нуклеиновое основание

Замещение по кислороду гидроксильных групп отмечается как 2'-О- и т.д. Мы не рассматриваем радикальное и окислительное алкилирование, т.к. в 1998 году вышел большой обзор по окислительной модификации нуклеиновых оснований, ведущей к нитевым разрывам ДНК [3].

1.1. Алкилирование нуклеиновых оснований.

Нуклеиновые основания являются полифункциональными молекулами, содержащими атомы азота, кислорода и углерода, которые могут подвергаться атаке электро-фильными реагентами. Однако алкилирование по углероду в пуриновой системе происходит только в производных с несколькими активирующими заместителями (ксантины и метилзамещенные ксантины) и только в положение 8. О-алкилирование также осуществляется очень редко. Наиболее характерным является N -алкилирование.

1.1.1. Аденин

Основными продуктами реакции аденина (кипячение в ДМФА) с различными ал-килгалогенидами (от высокореакционноспособных бензилхлорида и аллилбромида до малоактивного н-пропилбромида) являются З-ГЧ- и 9-1М-производные [4, 5, 6, 7]. При этом в большинстве случаев преимущественно образуется 3-М-изомер (табл. 1).

Таблица I

алкилгалоид время общий выход выход отношение

реакции, выход, 3-Ы- 9-1УГ-

ч % продукта, продукта,

% %

РЬСН2С1 41 53 78 12 6.5

РЬСН2Вг 41 73 84 11 7.6

Ме! 168 63 56 30 1.9

Алкилирование по ¡-И и 7-Ы практически не происходит и соответствующие продукты присутствуют лишь в следовых количествах. Эти результаты интерпретированы [5] в рамках концепции активности амбидентных нуклеофилов и 8^2-механизма. При этом учитывается возможность алкилирования обеих таутомерных формаденина 1 и2_(схема 1).

5

4

Схема 1

Кинетически контролируемое направление алкилирования должно зависеть от относительной стабильности переходных состояний, возникающих в результате начальной атаки по нуклеофильным центрам 1-1Ч, 3-М, 7-1М, 9-М Незначительное количество 7-Ы-алкилированного продукта объясняется возможным стерическим влиянием экзоцикличе-ской 1МНг группы, низким электростатическим потенциалом при 7-Ы в таутомере I и низкой стабильностью изначально образовавшейся катионной системы 3 . Небольшой вклад

1-N- изомера объясняется в основном стерическим затруднением из-за 6-NH2 группы, поскольку вычисленные значения молекулярного электростатического потенциала и электронной плотности при 1-N, а также известная способность аденина протонироваться именно по этому атому азота, предполагают его высокую активность. Для 3-N- и 9-N-замещений стерических препятствий не существует. Больший выход 3-N-изомеров обусловлен образованием термодинамически более устойчивых переходных состояний 4 и 5 с делокализованным положительным зарядом [5].

Предположение о стерических препятствиях, создаваемых экзоциклической NH2-группой, не согласуется на наш взгляд с тем, что в 1^6-метиламино-9-М-метил-пурине даже HNMe-группа не мешает алкилированию в положения 1-N и 7-N [8]. Кроме того, нук-леофильность и основность понятия неравнозначные.

Аномальные результаты при использовании бензилхлорметильного эфира объясняются [5] первоначальным образованием 3-]М-бензилоксиметиладенин гидрохлорида, который затем превращается в 9-М-алкиладениновую соль. По-видимому, в этом случае имеет место термодинамический контроль. Поэтому преобладают более стабильные 9-N-замещенные соли аденина. Термодинамически контролируемая изомеризация наблюдалась и в случае полиметилированных иодидов аденина [9].

Алкилирование [10] аниона аденина, генерированного in situ, тетрахлорэтиленом (гексаметилфосфотриамид, 60°С, 15 часов) приводит, в основном, к 9-N-алкилированному продукту (выход 25-30%), тогда как выход 7-1Ч-производного составляет w 5% Полученные таким образом трихлоренамины аденина 6а,б превращаются под действием бутиллития в соответствующие инамины 8а,б, каталитическое гидрогенирова-ние (Pd/C, EtOH) которых дает 9-1М-этиладенин в качестве основного продукта (схема 2 ).

вн

^в—Et

6 а-г

7 в,г

8 а-г

i ГМФА, 60° С ii LiBu, ТГФ, 70°С

6—8 а: ВН = адения

б: ВН = 2-аминоаденин в: ВН = тимин г: ВН = цитозин

iii Pd/C, EtOH

Взаимодействие аденина с (г)-1,2- или 1,1-дихлорэтиленом приводит к {Т)-хлоренамину. Реакция с трихлорэтиленом включает промежуточное образование дихлор-ацетилена и, следовательно, транс-стереохимию. Аналогичный механизм реакции (элиминирование-присоединение) предполагается и с дихлорэтиленами [11]. Установлено также, что аденин может взаимодействовать с 1,1-дихлорэтиленом в условиях фазового переноса с использованием ЫаОН и МЗир? в диметилформамиде [12].

Галогеналкилирование аниона аденина 1,2-дихлор-, 1,2-дибром- или 1-бром-2-хлорэтаном в системе бензол/тв.КОН/0,1 экв. триоктилметиламмоний-хлорида также приводит к 9-]М-(2-галогенэтил)производным аденина с выходами 54-76% [13]. Использованный метод по выходу и простоте значительно превосходит ранее применявшийся для синтеза 9->Ц2-хлорэтил)аденина (гидрид натрия -ДМФА) [14]. В случае Т^-диметил- или -диэтилпроизводных аденина применялась двухфазная система бензол/ 50% водный ШОН/ 0.1 экв. тетрабутиламмонийбромида.

Взаимодействие натриевой соли аденина с диметилпропаргилхлоридом в гексаме-тилфосфорамиде при 60° в течение 36 часов [15] приводит к образованию смеси 9-Ы-(диметилпропаргил)аденина 9а и 9-Ы-(3-метил-1,2- бутадиен-1-ил)аденина 10а с выходом 24%, а также небольшого количества 7-Ы-изомера Ца (вых. 9%), (схема 3).

К2С=С=СНВг {или Ш

т

Ш2

НС=С—ся2

9 а,б,в

Соотношение алленового 10а и ацетиленовых продуктов 9а и Ца сотавляет 7:3 и резко меняется до 1.5:8.5 при проведение этой реакции в ДМФА в присутствии К2СОз в течение 3 дней. При этом соотношение 9-ТЧ- и 7-М-изомеров оставалось неизменным (30% и 5% соответственно). Смена реагентов и растворителей практически не влияет на соотношение аллен : ацетилен в реакциях с диэтилпропаргилхлоридом, но в этом случае заметна разница в соотношении 9-1М- и 7-]М-изомеров ацетиленовых производных. Взаи-

Ш2

1 к сн==с—С112х

М^йгД (а, б, в)

ш2

N

Н

N

к2с=с=сн

10 а,б

Г Г \ (а, б, в) Цч 1 или и

Па,б

г. ШН, ГМФА и:К2С03 , ДМФА

ш: ИаН, ДМФА

а: Я=СН3 б: Я=СН2СН3

в:

Схема 3

модействие пропаргилхлорида с аденином в ДМФА (К2СОз) при комнатной температуре в течение 15 часов приводит к образованию только 9-М-пропаргиладенина 9в с 75% выходом, тогда как реакция с 1-бром-З-метил-1,2-бутадиеном в течение 3 часов дает лишь два ацетиленовых продукта 9а и Ца в равных количествах.

Таким образом, при алкилировании аниона аденина основным продуктом является его 9-К-производное, 7-1Ч-изомер образуется в малых количествах, а З-И-замещение не происходит.

В целом, реакции прямого алкилгалоидирования аденина или его аниона приводят к З-И- и 9-1М-изомерам как основным продуктам, 7-К-производные получаются в малых количествах. Поэтому был предложен общий метод синтеза 7-]М-алкиладенинов путем региоселективного алкилирования с предварительной защитой 3-]М-положения [16,17] бензильной группой (схема 4, верхняя строка).

f*2 l)PhCH2Br

N'" >-Д 2)NH4OH n

H

1)BrCH2CH=C(R)2

2) NH4OH

nh2

\ CM N

h2ch=cr2

nh2

R

nh2 r

■N+

\ - Pd-C/H9> N У или

N H2S04/PhMe "N'

12а-в

Pd-C/Ш 4

h2ch=cr2

nh2 çh3

,n+

jn

¿h2ch=cr2

NH2 СНз ,n

12 a: R=CH3; 6: R= C2H5 ; в: R= PhCH2; X=I, C104,C1, Br

Схема 4

В результате с выходом более 70% выделены 7-Ы-метиладенин 12а и 7-N-этиладенин 126. В случае 3,7-1М,М-дибензиладениновой соли также получено 7-N-бензильное производное аденина 12в (вых. около 40%). В системе конц. НгБО^толуол выход целевого продукта повышается до 82% [17]. Применение аллильной группы в качестве защиты З-М-положения дает значительно худшие результаты (схема 4, нижняя строка).

Использование в реакциях с аденином других алкилирующих агентов приводит к аналогичным результатам. Так алкилсульфонаты и алкилсульфаты атакуют 3-14- и положения. Например, с помощью метил-п-толуолсульфоната в диметилацетамиде с выходом 95% получают З-И-метиладенин [18]. В реакции адени�