Физико-химические методы в экспресс-диагностике возбудителей хирургической инфекции тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИНСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Рб О по ВЬ1СШЕЛ\У ОБРАЗОВАНИЮ

ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

2 8 МЛР да»

На правах рукописи

М ая к о в а Татьяна Ивановна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ХИРУРГИЧЕСКОЙ,

ИНФЕКЦИИ

02.00.03 — органическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Иркутск—1994

Работа выполнена в лаборатории экспресс-диагностики и лекарственной терапии научно-исследовательского института хирургии ВСНЦ СО РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Р. Г. Сайфутдшшв

, кандидат медицинских наук, старший

научный сотрудник Э. Э. Кузнецова

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Г. А. Калабин

доктор биологических наук, старший научный сотрудник В. Б. Дорогова

Ведущая организация: Иркутский институт органической химии СО РАН

Защита состоится 30 марта 1994 г. в__.час. на заседании

специализированного Совета Д 063.32.02 но защите диссертаций на соискание ученой степени доктора химических наук при Иркутском государственном университете по адресу:; г. Иркутск, 33 -ул. Лермонтова, 126г комн. 430.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке университета.

Отзывы просим направлять по адресу: 664033, Иркутск, а/я 4020, ИНУС, учёному секретарю специализированного Совета.

Автореферат разослан 28 февраля 1994 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат химических иаук

Т. Л. Петрова

ОЫЦДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТА Актуальность темы Проблема гнойной хирургической инфекции > перестаёт быть актуальной, что обусловлено ростом инфекция з пшике, частой её генерализацией а, как следствие, - высокой не-эудоспособностью и летальностью такого контингента больных. 3 пос-шгае года на фоне превалирования аэробной гоэ:/,положительной иик-хглоры наблюдается значительная распространенность аяазробоа, слючаэдах в свой состав неклостридаальше бактерия.

При деструктивных заболеваниях легких, составлявших значительна часть гнойно-септических заболевании, неооходямо проведение а$ференциальной диагностики возбудителей янфеююя, зклннаящел не элько верификации аэробной я анаэробной микрофлоры, но также л глл— обактернй туберкулёза.

Хемотаксоношгаеское изучение бактерий, основанное на цспользо-акйн ■.. химического состава их мэтаболатов для классификации и дентнфикация микроорганизмов, является перспективным направлением разработке методов хроиатографлчаской диагностик;! зозбудителей >ш-екции. Таксономическим маркёром кехлострадиалышх анаэробных бак-ерий слулат летучие жярнае кислоты /ЛШ./, ваделяамые микроорганизмами в среду культивировался. Аэробныз прокариоты выделяют лишь ук-уснуш, дрошЕонову» кислоты я низшие спирты. Однако, обнаружение т;и метаболитов недостаточно для диагностики вызываемого ими за-олеваниз, т.к. она малоспецифичяы для аэробов. Таксономический ризяак мякобактерлй туберкулёза - содержание туберкулостеариновой яслоты /ТСК/, эндогенного метаболита палочки Коха.

Традиционно применяемая бактериологическая даагностика трудоемка, длительна и недостаточно чувствительна, поэтому всё большее гименение в микробиологии и клинической практике находят хромаго-рафяческие методы обнаружения возбудителей заболевания. Соврзглен-ый уровень исследования слоаных смесей требует комплексного примерная этих методов. 3 последнее время большое распространение полу-

;нла хромато-масс-спектрометрня /ШС/, сочетающая такой способ раз-."ело н;1я как хрссзатография с одням ¡а наиболее информативных мэтодо! ояроделаная структуры органических соединений - масс-спектрометрие;

Очевэдю, только пойся л систематизация химических компонентен присуди данному ;.п:крооргай:1з:лу ни группе шкреорганазмов, а уста.. цовленае :иг количественных комбинаций сможет помочь з разработке не тодик, позволяющих проводите идентификация бактерий не только в б;; де частых культур, но а з слояшх смесях биологической природы. Осо оенно перспективно данное направленно, когда выделение ксследуьыо-го млдроблологэтескэго материала з достаточном для анализа количестве невозможно.

Для лечения нехлострддладьнол анаэробной и вызываемой отдельном;! з;гдамл азробов инфекции. используется ьгзгронндазол. Применяем ш: в настоящее зремл препарат не сбеспеннвает оптимального уровня ан-т;г.:ахробного средства з гнойном очаге а равномерной интенсивности его де.:стз;1я в течение длительного времени. Получение оягамаяьаа снолстз лекарственного средства требует соответствующих подходов.

Цель данного доследования - разработка комплекса хроматогра-флческих методов экспресс-диагностики возбудителей, хирургической инфекции, основанных на определения продуктов метаболизма ьпжроорганл• змов, ¡1 ховтролч эятоектнвностн антабакгерлальноД терапия гнойно-сея-тяческях заболеваний. Для достякеная изложенной цели &ш поставлены следующие задачи

1. анализ экзогенных продуктов штабояазма неклоотовдпал&нкх анаэробных 5окрооргани5йгоз - и внедрение метода кх быстрой д;:атноскпн:

з клинику; 7° такозяешю. закономерностей оадеркзжк метаболитэз з б;:с-

субстоаш

2. изучение экзогенных продуктов мэтаооллзма клмчпчзск:: аэрооккх бактерий;

5. дсследслашге хкал'гоокого состава липадше: компонентов клеточка:

текки клинически значимых аэробных микроорганизмов; . анализ ллпэдной фракции экстракта мнкобактерип туберкулеза, разработка и внедрение в клиническую практику метода экспресс-диагностики палочки Коха; . . разработка и внедрение в клиническую практику ВЭЖХ-метода количественного определения метронадазола и его аналога пролонгированного действия в бяосубстратак; . установление основных йарчаяокинетических показателей и <Тарг.:а-кологнческнх характеристик метронздазола л его аналога пролонгированного действия.

Научная новизна исследованкя заключается в изучения тригерпе-:ового состава липндоз клинически значимых аэробных микроорганизмов : обнаружении ■ сквалена, холесгер ша,стлгмастчрпна,кл*-

>настерина я фрцделан-З-она. Обнаружение или отсутствие этих сое-;иненнй мокет слугить ключом к определению аэробного ила анаэробно-'о характера прокариот. Основанием чему является анализ 'данных, уста [авливащих биогенетический путь образования тритерпенозых соединена из сквалена через его оксид или прямой циклизацией. Данные ис-ледования могут быть использованы в хемотаксономической снсте:лэтп-:е микроорганизмов.

Разработан способ экспресс-диагностики туберкулеза, основанный [а хромато-масс-спектрометрдческом определении туберкулостеариновой :яслоты в мокроте больного.

Установлены основные .фармакологические характеристики нового секарстзенного препарата пролонгированного действия ыетронидазол-[оливинилпирралидон и определены его некоторые фармакокинетические [араметрн.

ПРАКШЕСКАЯ ЗНА'-ШОСТЬ Внедренный в клиническую практику хроматографяческий метод ко-

лячаственного определения экзогенных метаболитов неклострвдиальных аяазрооов - летуча; жирных кпслох-иоает быть использован з клиниках хирургического профиля /общая хирургия, стоматология,отолараягологй гинекология, онкология/.

Предложенный газохроматографлчвсяяй метод определения возбудите ля аэробной ияйекцаш такке хохно яспользовахъ в стационарах хирурга ческого проталя.

3. Разработанный кетод хролзаточаасс-спек-громегряческого обнаружения ТСК для менгафккецзи мжобактерий туберкулёза мохет быть приманен з гшааческоЯ практике протавогуберкулёзнах диспансеров и ц ш г.:онслогическ2х отделеьвщ.

4. Количественное определение аетронкдазола к препарата пролонгированного действия на его основе методам 33ЖХ позволяет осуществить этаотропяу» тзрашш к копгроль за ходом её проведения в торакальных и пульмонологических отделениях клдкш:, хирургических стационарах

и з экспериментальной практике.

5. Предложенное усовершенствование способа мегхлцрованая ТСК и других высших яарных кислот мохет бить использовано как з научных исследованиях, так и з практической деятельности биохикичееклх лабораторий.

Оскоакке вмюевния лжссеотадкя, вкяоскуио на зениту:

1. Псгмвкеякэ в кгетаичзопой практике газохроматограгёМЕского метода экспресс--Д1!с'-гаостща1 векяострлдаельЕой инфзкдак, позвашхкего анализировать .собой биосуботра? организма и дешдьзозакпе газохооаатог-рафпяеекого геста' определения аэробной м'Срофкорх , ссксваядого на дзгекщровашш укоускол, лропионовой кисло? к

2. Рассмотрение данных исслэдованкл грлтэрлонс-зэл) . л., кяанлтесва значжисх аэробких прокариотов для хро~и^..'-'-агностики возбудителей щгфехцпи,

3. -оздогазлонао результатов разработки п клшшческс!: -л "-.г

хромато-масс-спектромзтрического метода диагностика возбудителя туберкулёза легких.

4'. Обсуждение основных фармакологических характеристик им\;об;1лизо-ванного метронидазола а его фармакокинетических параметров, установленных при использовании количественного определения препарата в.блосубстратах методой ЗЭЖХ.

Внедрение в практику На основания проведенных исследований внедрены в клиническую практику:

1. метод экспресс-диагностика неклостридиадьной анаэробной флоры, основанный на обнаружении ЖК з любых блосубстратах /рац. предложение В 32 от 23i.09.I985 и акт внедрения/;

2. метод экспресс-диагностики возбудителей аэробно:-: хирургической кнфекцги, основанный на обнаружении уксусной, проплонозой кислот и низших спиртов в биосубстратах /акт внедрения/;

3.. метод быстрой диагностики возбудителя туберкулёза по хромато-«асс-спехтрометркческому определении туберкулостэариновой кислоты в мокроте / патент по заявке на изобретение & 4934091/14 от 5.05.Э1/.

.метод количественного определения метронидазола в биосубстратах I акт внедрения/, а тахне препарата мэгронидазол-аодивинилаирролпдон > азт. св. £1603715 от 1.07.1990/. Апробация работы

Результата работы долояаны и обсукдены на: [. Конференции "Применение мэдац. техники в хирургии", Иркутск, 1985. I. Зтором Зсесоюз. симпозиуме "Раны и ранэвая инфекция",¡/¡осква, 1Э83. !. Первом съезде пульмонологов Сибири, Дальнего Востока и крайнего !евера "Диагностика,особенности лечения и профилактика болезней ор-■аноз дыхания в Дальневосточном регионе"',Благовещенск, 1986. :. 1У итоговой научной сессии С5 ВНЫХ АяН СССР, Иркутск, 1Э85. . У итоговой научной сессии СФ ЗНЦХ АМН СССР, Иркутск, 1987. . Конференция молодых ученых "Использование технически средств в эконструктнзяон и восстановительной хирургии", Иркутск, 1986.

-с-

J. jcscoh3. семинаре общества мнкроолологоз, эпидемиологов а паразитологов "Зопросы антлоакгэрлалънол терапии инфекционных ослэ.-;не-ллл е н^лн!зкционнол клинике", ...оскза, ÍJ37.

В. Объединенной научно;: сессии 1Ш и ЗУБов медако-биологнчсского профиля, Лркутск ,1990.

У Зсесозд. симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии, Рига, 13Э0.

Публикации lio материалам диссертации опубликовано 36 работ з международной, центрально;; и цветной печати, 2 работы направлены з печать. Глкне полнены авторское свидетельство я право приобретена патента по з&*зкаи на лзоорегенле.

Ось?:л ;; структура ллоседтацлл ¿ассергацля состоит из введения, обзора литературы, 5 глаз раоогы, зхяачащах описание методов и материал оэ исследования, результатов я их обсуждения, диссертационная pacora такге содержит зызодц, практические рекомендации, список попользованной литературы, состоящий из ссылок на 24 отечественных автора л 125 иностранных. Диссертация изложена на 123 стр., имеет 33 рисунка и 13 таблиц, приложение - II сгр.

СОДЗКАНЯЗ РАБОЫ • М'ГЕР'Ш Л AiüTOJU йССЛЕДОЗАЕИЯ 3 этом разделе подробно оплсаны услозия зыращизания и экстрак- ■ дни оактерзах&нше культур и клин-гаеекого м&герлаш, разделения л идентификации компонентов олосуйстрагоз л бактериальные; экстрактов с помоььэ ГЕХ, 33IX и ХУС дая каждого из способов экспрасс-даагностаки возбудителя инфекции, а гаккз приведены мзгодака дерлзатнзацни ароб л контоля за этим процессом с ломс:;ьз тсякослолкои хроматографии.

Пл-акализ ШС для диагностики зозоудителел :íhí«kibeí, вызванной явклоогогзлачьаой анаэробной и аэрсснол мнкроФторсн, л нлзпнх спиртов осунгеотвдяля на газовом хроматограете "Хром-5" с изнлзацлонко-пламен-Я1й! детектором. Содерхалле кгслот в образце определили с точностью

' -э-

до 0,0001 мкмоль/мл при использовании растворов аутентичных кислот.

Лсследованае трятерпенозого состава аэробных бактерий про ^о/или после разделения хлорофошенно-метанольного экстракта бакториалъ-нкх культур на гликозилкрозанные гопаноиды и зтериТицарованнио высшими нирныма кислотами стераны а ах последующего гадролаза.

Выделанные ¿гракции анализировали на хролшто-масс-спактрометре .¡КБ 2091/152 с ЭВ:<1 ВДД-П34 /ызецая/, способ яонлзацаа - электродный удар. Ди здент.;<Т-акацая компонентов использовали сястоиу оп:,л.:о-течного поиска а сразнания масс-спектров.

для диагностики возбудителя туберкулеза по обнару:::епн.о :\Ж отработана новая .методика, зключавдая замену процесса л.;ол лллзацли. Определяли ТСК на зьппэ описанном приборе - хроглаго-ч/лсс-спектромогре-в режиме селективного ионного мониторинга по иону с массой Ы2, соответствующему молекулярному нону метилозого эйара ГСК.

проведена совместная работа с областным протлвотуберкулэзнцм диспансером, поззоливпая сопоставить данные исследования культуры палочки Коха и натизяого материала бактериологическим и хромато-'.шсс-спекгрометраческжл методами.

Установление времени царкуларозаиля препарат"1 пролонгированного действия на основе мэтронддазола в организме л распределение его в эрганах животных, а такав коррекцию лечения больных мзтрошиазолом >существляли по количественному определению препарата в оиосусст-)ате методом 3313 на жидкостном хроматографе "..¡алахром" в оелиме >бращенно-'газнол хроматографии. Количественное содержание метронид-13ола в бносубстрате определяла по калибровочной кривой, предел »бнаруженая - 0,01 глкг/мл.

. РЕЗУЛЬТАТА И >11 ОЕС/^ДЕЖЕ 3 течение 1988-1932 гг. з лаборатория экспресс-диагностики и екарственяол теракта" Ш хирург ли оыло обследозако ИЗО больных хирургической лайекцаэй. Анаэробная наклосгрлдиальяая иняе:сцаа

опрг-делялась з крови, содержимом абсцессоз, нэкротизированной ткани, раневом и дреналшом отделяемом, келчи, тампонах из ран, лаваж-нол жидкости, смывах бронхиапьного дерева, экссудатах плевральной и ор.-опдпп полостей, лим^е.

црп хро:«атогра'"ическогл иоалсдованил мокроты больных и слюны здоровье: людей установлено, что этот клинических"материал нельзя использовать для диагностики анаэробной инфекции, т.к. контаминация его сапрофитными анаэробами происходит в верхних дыхательных путях и рогозов полости.

Нередко гнойно-воспалительные процессы осложняются сепсисом, з результате чего трудно определять входные ворота анйсхции и выявить септический очаг. 3 такой ситуации еданствонша доступным для аналлза материалом слукат врозь. С целью установления фонового содержания в крови была обследовала группа доноров из 35 человек, излучение таких данных давата представление о нормальной концентрации коро1,хоцедо5ечкых горлах кислот в крозп. Лзучепдо 50 больных с хирургическим и гинекологическим сепсисом показало, что содержание этих кислот у них в.крози значительно / 10-30 раз/ превышало таковой показатель у доноров./гаол.Г./. Двадцати больным с нагнон-тельнаш заболеваниями грудной и оршной полостей проведено одновременно микробиологическое и хроматографическое обследование. Пляничсс-ким материалом служха содержимое абсцессов,гнойное отделяемое и судаты плевральной и брхакой полостей. 3 50/1 случаев результаты оов-пацали. У 35^ больных при обнаружении К. Л б2К?«р:*.ологйчесй2 анаэробы не выделены, оде у 1Ъ% больно при а-.;:_ру;лс:-:и.: анаэробов микробиологически на хроматограммах отсутствовали лики, соответствуй*:®

Установлены причины позЕлшозеЕйя лемкополо^птельных и лото-отрицательных результатов при ГдХ детектировании анаэробов.

Наблюдение за сольными проводили в динамике, -гто позволяло судить об эр'Зктивностл применяемого лечения: в случае адекватности

Таблица I.

Содержание ДЖ (в шшоль/мл) в крови здоровых людей и больно с хирургическим и гинекологически.! сепсисом

Название

Лна- ДШ лизнруе-мкй материал

Кровь доноров (п=50)

Кровь сснтл-ческ.больных (п=50)

Со

иСу,

0,0752+ 0,0032+

0,0033 0,0009

1,1168+ 0,0371+ 0,0590+

0,0785 * 0,0076' 0,0031'

иСк

пС5

0,0009+ 0,000о+ 0,0032+ 0,0041+ 0,0085+

0,0001 0,0001 0,0010 0,0004 0,0015

0,0288+ 0,0321+ 0,0016+ 0,0536+ 0,0444+

0,0072' 0,0005" 0,0101" 0,0097' 0,0087"

Р г. О ОО!

с

о

:: логического а химаоторапевтического пособия происходило уменьше-;..;:■.- количественного и из.у.эненне качественного состава ЛЬК з исследу-V.,:;!.-.: сносубстрате до полного их исчезновения при выздоровлении/габл.2

Таблица 2

1±'К /икдолъ/мл/э содержимом плевральной полости больного 1;. с диагноз о:.:: острый абсцесс легкого / В истории болезни 2784 /

- К-о i: ц е а т р а ц i я Л Ж К

плг-тп^а

16.II.90. IS.II.90. Ci.II.90. 3 J. 11.90.

ГигУлл оораьо", Udroj' ПК позволяет сокьдтизд вра:.:л дааг-

цсс-гикн анаэробно* инфекции, нспояг-зоз^ь ддл угого любой бяологп-

а wacse проводить контроль за ходом лечение больных, ¿ри лро:.:атогра:;пчоскон диагностике не требуется соблюдение особых условий забора и достав:-:;! клинического материала. Экспэрц-ленгаль-но установлено, что пробы инфицированного биосубстрата аотуг храккть-

ся при те.ллэратуре +4-6°0 а течение 2-3 цедзль.

Kai: kskj: показано, при анаэробной инфекции з оиосубстратах присутствует вое дли почта все ÜEX. 3 то вреаг иак ойнарукегш гпшго уксусной нсошюнозой кислот позволяет цредцахолл* ¿.окга^гкадза образца азроОнаул оактериямл.

Для кдеы2П'|акащи аэробной :лнкроглорк гселгдозал:: нхгззо Едкничесйй зх&чжю: аэробна:: культур . Усганоглоко, что все ексллк зэдакеэг метровый, :: бу?::лзз:п; сслрх:. : ' "r'-^T::-:;^

о аарзЕфоз&лгка zx содзрзгоз: з разных пта:с.:а:: .....•'•

ра. Учсгаьзг: соо^ценгх о арсдупкрсвазгг аэроба:.:.: у;.../ : .-:- : ... йО£Ой кислот и, отдельно, -- силэтоз, а тггке соосгзг:::.;-; •:•.:--.-. "л.:-.¡о использовать тест на созхзотаое пргсугсгвгз Со ^s :

Jz_°о '^4 С4 gC5 С5______

1,7 0,4 0,003 0,02 0,003 - 0,003 0,009

г,5 0,3 ,г 0,02 -

0,1 0,02 - - -0,13 - - 0,004 0,003 -

ЕЯХ спиртов для предварительной диагностики аэробной инфекции. Одка-ко, следует учитывать недостаточную специфичность и, следовательно, надежность этого теста в силу того, что некоторые анаэробные микроорганизмы выделяют з среду обитания эти не метаболиты, поэтому на;.:;! проведен поиск бионаркёроз аэробоа, для чего был исследован тритер-пенозый состав хигглдов аэробных прокариотов.

Пкгаииея 20 внимание научно-практичесху» направленность данного исследования, изучал! клинически значите штаммы аоробов: '-.ли-ч-кую и синегкойкую палочки, золотистый стафилококк и вульгарны,'-. протей. Липиднке экстракты разделяли на стериновке и- гопановые соединения. По дакнн-л ХМС гопановьз соединения з приведенных нгаммах обнаружены кэ был;!. Б стериновой фракции присутствовали сквален, .грлделан-, 3-он, стигмастерин и клионастерин. Перечисленные культуры, за исключением вульгарного протея, изучали по схеме выделения и идентифкк.1цги стеринов после изменения условий выращивания. При этом в стериноьых фракциях обнаружена екзален, холестерин и неиденткфицированкое соединение. Несмотря на варьируеиость тритерлекового состава липидоз рассматриваемых аэробов, в их лнпидной фракции отсутствуют гопаноида. Обязательное присутствие екзалена свидетельствует о его неполном превращении з тритерпенолн и всегда имеющейся потенциальной возможности Ьщклизозаться либо з трнгеппеновые производные с кислородсодержащей функциональной группой в З-пряожении структурной формулы /стериновые соединения/, либо - в соединения группы гопака, не имеющие кислородсодержащих групп з этом положении структуры молекулы.

Как известно, в гопакоидсодергашвс прокариотах-циклизация екзалена происходит под действие:.: сквалекциклазы из о.?-энанткомера, з то время как З^-гидрокситритерпены образуются под действием сшзалс-иэлок-сиднои цгалазы из 3$-энангаокера скваденэпоксида. ¡¿ели бактериальный штамм помечен в безккслородную атмосферу, з которой невозможно образование эпоксида сквалена, то, естественно, биосинтез тритерптов

по.'дет в направлении оорагов&чпя гопановых соединений. В присутствии кислорода более вероятен другой путь биосинтеза. Вполне допустимо, что в прокариотах с незакрепленным генетическим механизмом синтеза тритерлэнов спосо^циклнзации схвалена зависит от внешних условий роста микроорганизмов.

Следует отметить, что в бактериях тритерпеновые соединения, иг-рглцпе роль каркаса клеточной мембраны, жизненно необходимы. Этими соединениями являются либо гопаноиды, либо стерины. Следовательно, ключом к определении аэробной или анаэробной природы прокариотов мо-мет слухпть присутствие тех или других соединений, которые могут быть использованы для хроматографической диагностики аэробов.

С цель» дифференциальной диагностики возбудителей инфекции при бактериальных деструкциях легких каш модидициров&к и отработан метод определения ?СК с помощью ыасс-фрагментографии в мокроте больного Так как верификахуш возбудителя туберкулёза при бакте-

риологическом исследовании длится до 2 месяцев, то очевидна необходимость предлагаемого метода.

При Х.',1С-иселедовании лшгадного. экстракта культуры палочки Коха получена хроматографа с записью масс-спектра на калдый хроматогра-фический пик и проведена расшифровка спектров с помощью библиотеки масс-спектров. В порядке вмхода пиков на хроматограмме идентифицированы следующие вещества: гексгдэка-Н-енозая кислота, а также пальмитиновая, ллноленая, олеиновая, стеариновая, Ю-метилоктадеканован /туберкулостеаринозая/кислоты, фуранокдное соединение с молекулярной массой 318, метилэйкозаковая кислота, су":;:о;:дчое соединение с молекулярной массой 315, тетракозановая кисекзален, гексакозанозая кислота и холестерин.

Установлено, что при подготовке анализируемого образца длитель-процесс лиофклнзации клеточной культура и (Следовательно, био-•:мбстрата больного монет быть заменен высушиванием органической фаз^

экстракта образца безводной неорганической солью. Кроме того, гидролиз н метилирование экстракта следует сократить с 20 часов до 15 минут. Последнее доказано изучением некоторых: кинетически;: аспектов реакции метилирования стеариновой кислоты и подтверждено при дерива- -тизации образца культуры бациллы Коха. Предложенным способ обнаружения ТСК ХМС-методом задицен правом приобретения патента по заявке № 49340Э1/14 от 5.05.1991.

Апробирование ноаого метода и сравнение его результатов с бактериологическими данными осуществляли на больных с неспеиифнчзскими заболеваниями и туберкулёзом легких. Обследованы три группы больных, состоящие из: I - больных с диагнозом туберкулёз легких Л-;9 человек/, 2 - пациентов с бактериальными деструкциямп легких нетуберкулезной •этиологии /II человек/ и 3 - пациентов противотуберкулезного диспансера, находящихся на обследовании на туберкулёзной процесс. В таблице 3 проведено сравнение этих методов, У всех больных туберкулёзом в мокроте обнаружена ТСК, результаты бактериологического и Х\;С-мето-дов полностью совпадали. Во второй группе ТСК найдена в трёх>случаях. После дополнительного рентгенологического и бактериологического обследования эти больные переведены в тубдиспансер. Для 8-ми больных

Таблица 3

Результаты сравнения ХМС- и бактериологического методов, • применяемых для обследования' больных

Номер группы Количество обследованных больных, хи :С-нотодрк бактериолог тодом" 'ПЧ6СКПЫ мэ-

п/п из них: резу положит. льтаты ооследования отрицательн. .чолемкт. отрпцательн.

т 29 29 0 ' 29 0 .

2 II 3 со ел -

3 3 ' 5 о 1 ' 7

с деструктивными заболеваниями лёгких нетуберкулёзной этиологии, у который' ШС-методом'не выявлен туберкулёз, бактериологическое обсле дование не требовалось. Наблюдалось несовгвдеше результатов в 3-эй группе. Однако, в отдаленном периоде у 5 пациентов после углублённого обследования был подтворндён туберкулёз лёгких» Первоначальное носов-падение данных г этой группе меже? быть объяснено низкой чувствительностью бактериологического метода и его большой зависимостью от условий роста туберкулёзной палочки.

Дли лечения анаэробной и некоторых видов аэробной инфекции на основе метрокидазола в Иркутской институте органической химии СО РАН получена иммобилизованная форма препарата, пргд.игавляюцая комплекс метронидазола /'Л/ с полизкнылгтарроли;цоном /ПВП/,-

Н.С-СН-

У

и,с1-'сн*.

Х ¿НгСНг.04

И \VJ\- ¡1

НС.-'СНг $ ¿НгСНгРН

Л а

П6Л л| Н/ПйП

а

который! сохраняет оптимальный уровень антимикробного средства в гной-.. ном очаге и крови, е также равномерную интенсивность действия в течение длительного времен:;. Удя выяснения вопросов всасывания и распределен;!.: мзтронидезояа пролонгированного действия в организме кивотнкх проведена сер;.? огклоз. Из даннзх эксперимента ся> дует, что концентрация !,;/ПВП в течение первых шести часов нчме, чем концентрация к вследствие изд.-енного шевебождзния молекул препарата из полимерной матрицы. Коьцгатрацля М/ГВП в крови нарастаю, в течение часа, к 6-ти часам уроЕеы^ препарата стабилизировался, его высока.-; к ей цент рация прддсрзгаалась в течение 24 часов к постепенно сни:.--'.; :. -з часам. Обычный не М циркулировал в крови на протяжении л иль £•./„•::., чзеез сутки он присутствовал в следовых количествах. '

Изучили зависимость содержания препарата в крови жиеотньх от молекулярного веса полимерной матрица и её процентного количества в инъекционном растворе. При использовании ПЫ1 с бсл^ата иолекуляргшч весом наблюдалось медленное снижение концехгарации препарата при сё большем значении по сравнению с концентрацией препарата, аилмобилизоган-ного на катрще мекьсего молекулярного веса. Воли концентрация введенного в комплексе с ЯШ мол, веса 8*10 ООО, в течение 6 часов бняе. выше, «ей прзяаратг, введённого г ксиягексв с ГСП нол»веса £&»30 000г а через 30 часов она становилась тлллз ж-вцгглыгой икгяблру;о;зй аон-цектрггпн A Ti'/ препарата, то поа л леденел лглобпзл'зозанного на ПЗП пол, веса ООО,ко-щзнгрзц;гх его подааржзаке'«- va уряки? о'ак-

"-;р;!цт'дной едкие >13 часов.

Устакоргсно, что па со,гср::алко препарата. л ".риги и врп.:я л: о цпр-луаировзгая влияет и прсцантьоа кол^-'естяо :.:аар'!л;. которое .(л-ла-ася ептилалькж щгл 15?.'.

?асрлаоаг.ккак hej.s; кета;; коккласг^акноге алкалал елка к п ;':/„7оп с яслоцьа ВЗкл лнедран з клинически практику центра хкрултллаекол лкфадц';:;; ¡Гркутокойч-областной клинической болы;'!"7» Бтот катод лаало-жая такла: чоглчр.с^зешо ог^двзкгл и другие лтогяеоав&оро&гло дозза- ■ ратп i'pyirглл ;-::1г:дрс0Л03 /та;ргдалолл •■ /1^2~ллклаульД }Кллелк?;/"2-ллоткл--З-нк^рокг'л лазала/' к группы тклаалт:: /икказела •- л-аплл;ллл\л;ко--3-::;кл--' ротиааола/ с цаллл> ницивидугЛ-'еа1.,тлг1 а1:л,глкплсл;л1ел терапии.

После лкспардленлгльчого определения лнтпбактар ;:{ií/Tríor,-i действия ксклллкеа У/ГЕП к его тскстностп, с уклеек того, кто ое; аоллгл-ллкапе кссладуенот комплекса лакаются фагллаколелтааа лрепалаклкк проведено лачсппе '.ютрачлдалоллк; пролозгчрсггшог'о дексккля аслкл'к с нега:ос!5РИД'Л2.-ь:-:ой ал/аэробной кклургической лкЛекцке::, Одлккадкат;; асльчкк с едпткк&х н кло^лственк'л-л! абсцессам лагках лпеаею' кое-рзкгизн з схему лечения пп:; введении им Н/ПЗП в полость абсцзееа через дронаднуя трубку, "'сточек ЕЕХХ : хитролдродал л уровень г.с-гроьид-

азола в гнойном очаге к крови пациентов в течение всего курса антибактериальной терапии, повышая эффективность её проведения. У ряда больных дозировки иетронидазола, предусмотренные фармакопеей, были кедос-•га^очншк для создания в гнойном очаге ШК препарата. В этих случаях либо увеличивали пациента!.! дозу препарата, либо уыеныиали временные интервалы мзмду введениями, руководствуясь индивидуальными особенностями организма.

Метронкдазол метаболизируется в печени путём окисления боковой цепи с образованием кислотного и спиртового метаболитов, которые наряду с самим препаратом обусловливают его свойства. Б наших экспериментах в преобладающих количествах и в крови, и в паренхиматозных органах присутствовал только метронкдазол. Содержанию его метаболитов было незначительным.

ВЫВОДИ

1. Исследованы конечные продукты метаболизма неклостридиальных анаэробных микроорганизмов, на основе количественного газсхроматогра^и-чзского определения которых разработан и внедрен в клиническую практику метод экспресс-диагностики возбудителей анаэробных инфекций,. Ус- . тановлены количественные соотношения этих метаболитов в крови и других биосубсбратах при септических патологиях и в норме.

2. Предложен для предварительной экспресс-диагностики аэробной инфекции быстры"; тест, основанный на детектировании экзогенных метаболитов: уксусной., пропионовой кислот I. низших спиртов.

3. Установлен трчтерленовнй состав липидов клеточной стенки клинически значимых аэробов: квшзчной палочки, золотистого стафилококка, вульгарного протея и синегнойыой палочки, который представлен клиона-стеринсм, йриделан-3-оном, стигмастерином и скваленом. Состав этих эндогенных метаболитов вариабелен и зависит от условий выра;;;,

состава культуральной среды.

4. Изучен липздкый состав эндогенных метаболитов микобакг:;..

кулёза, в который наряду с туберхулоетеариновой кислотой /ТСК/ вхоЦят восемь мирных кислот, два фуракоидных соединения, скзален и холестерин. Разработан и апробирован в клинической практике быстрый метод хроыато-ыасс-спектрометричгского обнаружения ТСК, являющейся биомаркёром микобактерий туберкулёза.

5. Разработан способ количественного определения метрочидазола и комллекса нетроищазол-поливинилпиррслидон методом ВЗЖХ в биосубстратах, с помоцью которого установлены фармакологические и фармано-ккнетические параметры нового препарата пролонгированного действия.

6. Исследосаш осясвшхв фармакологические характеристики иммобилизованного на ЛВП метронидазола; олтикаяызгй молекулярный вес полимерной матрица и её лроцзнтнсе содержание в шяьзкцконаом растворе, 71 Определен:: |7-~к«акокш1етачес::иб_ параметру иетронидзоола пролонгированного действия: степень метаболических превращений, время грфЗулирояашп з организме и распределение препарата в паренхиматозных органах.

ОСНОШЗ РАБОТЫ, ОйЖШНСШШЫЕ ЛО ТЕМЕ ДКСС^ЛЩй:

1. Количественное определение лзтучпх торное кислот газохроматог-раф'.чсским летодсы для экспресс-диагностики возбудителей неклостри-Лкальпой анаэробной инфекции. Т.П..Чаянова, Э.Э.Кузнецова, [,!.3..Лазарева, Г,С.Долгухлка // Гопр. мод, »сети-1939,С.71-75.

2. _ Острие аназробше деструкции лёгких. 3.Г.Грчгорьев* В.В.Пак,

3, 3. Кузнецова, Т.Н. Юрченкова, А.Ю. Иродова, Т.Н. Чаянова, Н.8. Регата, К.В.Лазарева // Кллн.хир, - 1589.-- ИО,- С.3-5.

о. О таксоно:.ши сблигатаых анаэробных бактерий. З.П.Кочемасова, Л.Э.'.'нроков, В.Г.Истратов, Т.И.Шшкоза // Н.Ш.- 1989,- ГО.-СЛУ-Й

4, контроль э#г?жзносзя лекарственной терапии методом 2ЭХХ при лечении хирургической инфекции. Т.й'.'.'аякозг, 3.5.Кузнецова //лурн. и:зич. химик.- 1991.- т.65.- РЮ.-С.23?2-237о.

5. Использование физико-химических методов для быстрой диагностики гнойной хирургической инфекции Т.И.Маякова, Э,Э. Кузнецова,Г.С.Долгушина, С.А.Плюснин //Тез. докл. 5 Европейского конгресса по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, 9-И сент., 1991.-Осло, Норвегия.- С.106.- реф.1239.

6. Газожидкостная хроматография в диагностике острых бактериальных деструктивных заболеваний лёгких, Т.И.Маякова, Э.Э.Кузнецова.М.В.Лазарева, Е.Г.Григорьев //Диагностика; особенности течения и профилактика болезней органов .дыхания.- Тез.докл. Iсъезда пульмонологов Сибири, Дальнего Востока и Крацнаго Севера.- Благовещенск.-1986.- 4.1 С.173-174.

7. Методы диагностики и лечения анаэробной неклоорряди&льной флоры у больных с гнойной хирургической инфекцией. Т.И.>"аякова,Э.Э.Кузнецо ва,М.В.Лазарева, Е.Г.Григорьев //Тез.докл.II Всесоган. конф.'-Раны и раневая инфекция, Москва.- 1986.- С.225-226.

8. Изучение уровня средних молекул и метаболитов анаэробной инфекции при острых абсцессах легких. Э.Э.Кузнецова, Т.И.Маякова, Л.А.Аге* ева, Ц.В.ЛазареЕа //Тез.докл. конф. "Вопросы антибактериальной терапии инфекционных осложнений в кекнфекционной клинике".Москва.- 1967.--С.128-131,

9. . Экспресс-диагностика неклостридиальной анаэробной и аэробной инфекции при заболеваниях желчных путей. С.П.Чикотеев.Э.Э.Кузнецова, Т.И.Маякова //Тез.докл.П Всесоюзн. конф. "Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике". Москва,- 1983.-

чЛ .- С.39-100.

10. Лечение острых анаэробных заболеваний лёгких. Е.Г.Григорьев,В. Е.Пак, Г.Н.Юрчешсова,АЛО.Фролова,Э.Э.Кузнецова,Т.И.Маякова,г,<'иВ.Даза-ревд //Тез.докл. Всесоюзн. симп. "Анаэробная неклостридиалгная инфекция в шойной хирургии".Тернбполь.- 1989,- С„ 79-80.

11. Применение метода экспресс-диагностики для верификации возбудителей анаэробного хирургического сепсиса. М.В.Лазарева,Т.И.Майкова, Г.С.'Доягушина,Э.З.Кузнецова, А.Ю,Фродова //Тез.докл.II Всесоюзн. конф."Хирургический сепсис".Тула.- I989.-C.60-62.

12. Контрол^эффективности лекарственной терапии с помощью ВЗЖХ в гнойной хирургии. Т.Н.Маякова, З.Э.Кузнецова.//Тез.дои. У Всесоюзн. гашп. по молекулярной жидкостной хроматографии. Рига.- 1990.-С.197.

13. Газожидкостная хроматография в экспресс-диагностике анаэробных инфекцип. Э.Э.Кузнецова, Т.Н. маякова,С.А.Ллюснин,А.Г.Горшков //Тез. докл."Применение медицинской техники з хирургии",Иркутск.- 1985.-С.224-226.

14. Определение метаболитов неклостридиальной анаэробной инфекции

'и уровня средних молекул при' острых бактериальных деструкция* лёгких Т.И.Маякова,Э.Э.Кузнецова,М,В.Лазарева,Л.А.Агеева //Тез.докл. 1У итоговой сессии "Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии", Иркутск.- 1986.- ч.11.-С.264-266.

15. Применение газокидкостной хроматографии для диагностики и контроля лечения кеклостридиальной анаэробной инфекции. Т.И..маякова //Тез.докл. I конф. молод, ученых "Использование технических среден

з реконструктивной и восстановительной хирургии". Иркутск.-1966.-С* 97,

16. Применение газскидкосткой хроматографии в диагностике кеклост-рядиалького анаэробного хирургического сепсиса. Э.Э.Кузнецова,

Т.И.Маякова, П.Б.Лазарева, Е.Г.Григорьэв // Тезисы докладов У итоговой научной сессии С.З BHUX АШ СССР "Актуальные допросы реконструктивной и восстановительной хирургии" , Иркутск 1087 ч.Г .- 199-201.

17. Роль ассоциации нбгслострсдкальнзх анаэробов и стафилококков в развитии острис oojtoásshhík дострукцян легких. ?J.B,Лазарева, В.Г.Григооьее,Э,Э.>5угкат;ова, ?.И.Иэяяова // Тоз. докл. 7 я-гсгов.

научн. сессии СФ ВНЦХ "Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии", Иркутск 1087, -ч. I. - С. 196-198 .

18. Метод количественного определения метронидазола с помощью ВЭЕХ

< j m fr i , . II ГП — - . ___ 1 ЛАТ ЛЛЛ

в оиосуостратах. г.млаякова // i&m л.« о.йих-лил.

19. Масс-спехтрометричоский анализ клеточных компонентов аэробных бактерий. С.А.Плюснин, Т.И.Маякова // Тез. докл.УТ итогов, научн. сессии СФ ВНЦХ АМН СССР "Акт. вопр. реконстр. и воют, хирургии", Иркутск. -1983. - ч.И. - С.22-23.

20. Аспекты использования метода ГЖХ для экспресс-диагностики хирургической инфекции. Т.И.Маякова, Э.Э.Кузнецова, Г.С.Долгушина, Т.И.Трубникова // Тез..„докл, итогов, научн. сессии 05 ВНЦХ АМН СССР "Акт. "вопр. реконстр. и восст. хирургии", Иркутск.- IS88. -- ч.11 .С. 18-19.

21. Использование физико-химических матодоз исследования длз идентификации возбудителей хирургической инфекции. Э.Э.Кузнецова, Т.И. Манкоеа. // Тез. докл. конф. хирургов "Пути интенсификации внедрения научных разработок в практику хирургической службы", Барнаул.-1988, - С.120-121.

22. Экспресс-диагностика нэклоотридиальной анаэробной и аэробной инфекции у хирургических больных Т.И.Маякова, С.А.Плюсьик,Г.С.Долгушина // Тез. докл. конф. молод, ученых "Медико-биологические проблемы Восточной Сибири"i Иркутск, - 1988, - С.89-90*

23. Иепол'.зование лабораторной техники в диагностике анаэробного хирургического сепсиса Э.Э.Кузнецова, Т.И.Маякова.Г.С.Долгушина,Л.А. Лгеегл, М.В.Лазарсва.-А.ЭЛролова, Е.Г.Грпгорьев // Тез.докл.Зее-сокзп. kohTi, по сепсису.- Тбилиси. - 1989.- С.95-97.

24. Использование хроматографических методов исследования з гнойной хирургии Т.И.Маякова,- Г.С.Долгушина, Э.Э.Кузнецоза // Тез. докл. итогов, научн. сессии CS ВНЦХ АШ СССР "Акт. вопр. реконстр. и Босов хирургии ", Иркутск. - 1989. - ч. I. -C.II6-II6.

-2325. Комплекс 1-/2-гидроксиэтил/-2-мегил-5-Н!1тро]Шидазола с водорастворимым полимером для хир/ргической практики Э.Э.Кузнецова, Т.И.Каткова, Г.В.Козлова, А.й.Фзолова //Тамяе., С. 114-116. - ч. I.

26. Диагностика и лечение острых анаэробных деструкции легких М.З. Лазарева, Т.И.Маякова, Э.Э.Кузнецова, Г.С.Долгулша // Там ке , ч.П. - С.22-24 .

27. Использование хроматографическюс методов длн быстрой диагностики и контроля эффективности проводимой терапии Э.3.Кузнецпва,ТЛ..Уа-• якова, // Тез. докл. II объединенной паута, сессия КЖ1 и ВУЗов меда-ко-блологического дрорхля , Иркутск. - 1989. - С. 205-207.

28. Применение ПК и ВЗНХ в- гнойной гнрургли ТЛ.Маякотза, Г«С Долгу-лика // Тез. докл. кон р. колод, учених "Молодае учешге-модшси -науке н практике здравоохранения" Новосибирск, •• 1990. - С.143-144

29. ГНХ-анализ продуктов катаболизма анаэробных л азробллх бактерий с целью разработки методов эколрссо-дцогнсстикл хирург:-«-..с кой ллрэк-ияя Г.С.Долгушина, Г.Я.Иаякова // Там ;;:е , 0.100-101 .

30. Антибактериальная активность комллзлеоъ полкглкллллорзлкдона с имкдазольнкли производными Царзз 3,Н.,?оз.тнояа Я,Г., Увшсв ?.3»,Ло~ пнрез В.А.»Кузнецова Э.З..УаакоЕа Т.В,, У.аякоял Т.И. // Тез. докл. Всесовзн. конф."Водорастворимые полимзрц п нх применение'', Иркутск.«• - 1991. - С.232.

31. Лспользозакиз нетодоз экспресс-диагностик*'! при лайтеолл илго: десгрукцлях легких 3.3.Кузнецова, М.5.4азлр?.г.« Т.IIМайкова. Я.Б.Ру-днх, Л. 1,Аггела // Тсз.дсллц IX Упршкско! н'у чно-дракт, кон?, ло грудке" хирургки, Кпеп. •• 1990. - С.У1-ЬЗ.-

32. Пгллгнэкке лромлт^графлчэзкнх нетодез з клинической К'-дллкке Г.С.Долгушина, Т.К.«Л1Яова, С.А.Плг-нхн, .4, Р.Ксвалзпа // Тел, докл. 17 Всссоэзи. конф. молод, учшгос в области прикладной хреллтелрллил, Краснодар. - 1591. -3.44 .

33. Исследование химического состава клеточных метаболитов аэроб-пых бактерий и туберкулезной палочки для ускоренной диагностики возбудителей инфекции в хирургической клинике Т.И.Маякова, И.Г.Кова-.лева, С.А.Плчснич // Тез.докл. итогов, научн. сессии НЖХ"Акт.вопр. реконстр, и восст. хирургии" , Иркутск. -1990. -ч.1 .- С.166.

34. Хромато-масс-слектромзтрпческая диагностика туберкулеза легких Т.й.Манкова, С.А.Илюснин, М.Г.Ковадзза // Там se , 1991. -С. 235 .

35. Кллнпко-лабораторные с-сновы ранней диагностики к лечения хирургического сепсиса J.о.Кузнецова, М.М.Лазарева, Т.И.л'^аякоза, Г.С .Долгушина // Там .та , С. 12-13.

36. Экспресс-диагностика возбудителей хирургической инфекции хро- -матограачческими методами Т.И.Маякова, Г.С .Долгушина,?!.Г.Ковалева, Э.Э.Кузнецова, С-Л.Пласшш // Тез.докл. итогов, научн. сессии НИИХ "Акт. вопр, реконстр. и восс т. хирургии", Иркутск. - 1992. -С. 156 .. V -

37. Быстрая диагностика туберкулеза легких методом Ж- селективного ионного мониторинга Т.И.Маякова, Э.Э.Кузнецова, М.Г.Ковалева, ■■ С.А.Плмсгаш, Н.А.Сокольникова, М.С.Мазутова // ШЭИ / напр. в печ./

38. Хромато-масс-спектрометряческое исследование липвдов и экспресс-диагностика туберкулезной палочки Т.И.Маякова, Э.Э.Кузнецова,' М.Г.Ковалева, С.А.Ядоснин // Дурная хроматографии /налр. в яеч./